›

Khóa luận Khảo sát thành phần hoá học của lá xa kê Artocarpus altilis (Park.) Fosberg thuộc họ dâu tằm moraceae

pdf 81 trang thiennha21 15/04/2022 3740
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát thành phần hoá học của lá xa kê Artocarpus altilis (Park.) Fosberg thuộc họ dâu tằm moraceae", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhao_sat_thanh_phan_hoa_hoc_cua_la_xa_ke_artocarpus_altilis.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát thành phần hoá học của lá xa kê Artocarpus altilis (Park.) Fosberg thuộc họ dâu tằm moraceae

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  CỬ NHÂN HOÁ HỌC NGÀNH: HOÁ HỮU CƠ Đề tài: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA LÁ XA KÊ Artocarpus altilis (Park.) Fosberg THUỘC HỌ DÂU TẰM MORACEAE GVHD: ThS. Phùng Văn Trung SVTH: Lê Thị Việt Hoa Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2012 1
  2. LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật, ngành hóa học đóng một vai trò rất quan trọng trong sự phát triển của xã hội. Các nhà hóa học, bằng nhiều con đường khác nhau, đã tạo ra những sản phẩm có ứng dụng trong các lĩnh vực như: Y học, Dược học, Sinh học, Nông nghiệp, Tuy nhiên, những sản phẩm được tạo ra bằng cách tổng hợp mặc dù có kết quả tốt nhưng lại gây ra nhiều tác dụng phụ cho con người và môi trường. Vì thế, hóa học các hợp chất thiên nhiên ngày càng được quan tâm hơn. Các nhà hóa học đã tiến hành tách chiết, cô lập, bán tổng hợp ngày càng nhiều những hợp chất có hoạt tính sinh học để tạo ra những sản phẩm hữu ích từ cây cỏ thiên nhiên nâng cao chất lượng cuộc sống. Có rất nhiều loài, nhiều cây đã được các nhà hoá học nghiên cứu trong nước và ngoài nước, cây Xa kê là một trong những số đó. Một số nghiên cứu trước đây cho thấy rằng Xa kê có chứa một số chất có hoạt tính cao như triterpenes, flavones, dihydroflavonols, chalcones. Tuy nhiên cây Xa kê ít được nghiên cứu và ứng dụng vào thực tế ờ Việt Nam. Cây Xa kê, loại cây miền nhiệt đới được trồng phổ biến ở nước ta với nhiều hoạt tính sinh học thú vị như kháng vi khuẩn, kháng virus, kháng oxi hoá, ngừa ung thư, kháng đái tháo đường. Với những thuận lợi về mặt địa lý thì Xa kê sẽ là nguồn nguyên liệu vô cùng quí giá. Do vậy, chúng tôi tiến hành “Khảo sát thành phần hoá học trên lá Xa kê Artocarpus altilis (Park) thuộc họ dâu tằm Moraceae” ở Việt Nam, mục tiêu cô lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ có trong lá Xa kê (được thu hái ở Cần Thơ). Hy vọng rằng kết quả nghiên cứu sẽ góp phần mang lại những hiểu biết mới về mặt hóa thực vật của cây Xa kê nhằm làm tăng giá trị ứng dụng của cây vào thực tế cuộc sống. 2
  3. LỜI CẢM ƠN  Luận văn này được thực hiện tại phòng Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên -Viện Công Nghệ Hóa Học - Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam; số 1 Mạc Đĩnh Chi, phường Bến Nghé, quận 1, thành phố Hồ Chí Minh. Với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến: PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hạnh Cô đã truyền cho em những kiến thức chuyên môn, luôn động viên và luôn tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận. ThS. Phùng Văn Trung Thầy đã truyền đạt cho em kiến thức chuyên môn, tận tình hướng dẫn kỹ thuật cũng như những kinh nghiệm hết sức quý báu và đầy tâm huyết trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Các Thầy Cô của Bộ môn Hóa - Trường Đại Học Sư Phạm TP. Hồ Chí Minh và các Thầy Cô của Viện Công nghệ Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình dạy bảo, tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Và tất cả các bạn cùng lớp đã quan tâm, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập. Cử nhân Nguyễn Tấn Phát Anh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em những việc nhỏ nhặt từ những ngày đầu cho đến hết quá trình thực hiện luận văn. Cử nhân Võ Thị Bé, cùng các anh chị học viên trường Đại học Cần Thơ, các bạn sinh viên đến làm đề tài nghiên cứu đã tận tình hướng dẫn, góp ý, cung cấp tài liệu, tạo điều kiện giúp đỡ em làm tốt công việc của mình. Cuối cùng con rất cảm ơn gia đình đã giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện từ vật chất đến tinh thần cho con học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn! Lời cảm ơn i 1
  4. Mục lục ii Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt iv Danh mục các bảng vi Danh mục các sơ đồ, đồ thị vii Danh mục các hình ix Danh mục các phụ lục xi Lời mở đầu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Đại cương về cây Xa kê 1.1.1. Mô tả thực vật 1 1.1.1.1. Khái quát 1 1.1.1.2. Mô tả 1 1.1.2. Phân bố và sinh thái 2 1.2. Y học dân gian của cây Xa kê 1.2.1. Thành phần hoá học 4 1.2.2. Hoạt tính sinh học 5 1.2.3. Công dụng của Xa kê 5 1.2.4. Bài thuốc có Xa kê 6 1.3. Công trình nghiên cứu trên cây Xa kê 1.3.1. Thành phần hoá học 8 1.3.2. Hoạt tính sinh học 20 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Phân lập và tinh chế 2.1.1. Phương pháp sắc kí bản mỏng 25 2.1.2. Phương pháp sắc kí cột 25 2
  5. 2.1.3. Phương pháp phổ 26 2.2. Thử hoạt tính 28 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1. Hoá chất thiết bị 3.1.1. Hoá chất 30 3.1.2. Thiết bị 30 3.2. Phân lập và tinh chế chất 3.2.1. Điều chế cao thô từ lá Xa kê 33 3.2.2. Phân lập các chất từ lá Xa kê 35 3.2.2.1. Phân lập 35 3.2.2.2. Tinh chế 43 3.3. Thử hoạt tính kháng đái tháo đường 44 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 4.1. Thành phần hoá học 46 4.2. Hoạt tính sinh học 4.2.1. Xác định độ ẩm cao 52 4.2.2. Dựng đường chuẩn 52 4.2.3. Hoạt tính sinh học 52 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận 57 5.2. Kiến nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 3
  6. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT A Analytic CDCl3 Deuteuri Chloroform CHCl3 Chloroform CH2Cl2 Dichloromethane CH3COCH3 Acetone COSY Correlation Spectroscopy 13C–NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance d Doublet (NMR) dd Doublet of doublets (NMR) DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimethyl Sulfoxide EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol 1H–NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence HPLC High Performance Liquid Chromatography HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation IR Infrared J Coupling constant (NMR) m Multiplet (NMR) MeOH Methanol mg Milligram 4
  7. mp Melting point MPLC Medium Pressure Liquid Chromatography PA Pure analytic PHPLC Preparative High Performance Liquid Chromatography PNP p-nitrophenol PNP-Glc p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside ppm Parts per million Rf Retention factor s Singlet (NMR) t Triplet (NMR) T Technical TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) U Đơn vị hoạt độ enzym UV Ultraviolet (Tia tử ngoại, tia cực tím) δ Chemical shift (NMR) 5
  8. DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1: Kết quả cột trung áp phân đoạn V 35 Bảng 2: Kết quả cột trung áp phân đoạn VG 36 Bảng 3: Kết quả cột trung áp phân đoạn VG4 36 Bảng 4: Điều kiện chạy P-HPLC cao EtOAc 37 Bảng 5: Kết quả cột trung áp cao EtOAc 37 Bảng 6: Kết quả cột trung áp phân đoạn ED 38 Bảng 7: Kết quả cột trung áp phân đoạn ED1 39 Bảng 8: Tóm tắt các chất đã phân lập và tinh chế từ lá Xa kê 43 Bảng 9: Dựng đường chuẩn PNP 44 Bảng 10: Pha mẫu ức chế thử hoạt tính 44 13 Bảng 11: Dữ liệu phổ C NMR, DEPT 90 và DEPT 135 của AA01 49 13 1 Bảng 12: Dữ liệu phổ C NMR, H NMR, COSY và HMBC của AA01 50 Bảng 13: Kết quả xác định độ ẩm cao 52 Bảng 14: Dựng đường chuẩn PNP 52 Bảng 15: Kết quả đo mật độ quang AA03 53 Bảng 16: Kết quả đo mật độ quang cao EtOH 54 Bảng 17: Kết quả đo mật độ quang cao hexan 54 Bảng 18: Kết quả đo mật độ quang cao EtOAc 55 Bảng 19: Kết quả đo mật độ quang cao MeOH 55 Bảng 20: Kết quả so sánh IC50 56 6
  9. DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Trang SƠ ĐỒ Sơ đồ 1: Qui trình chiết xuất cao từ lá Xa kê 34 Sơ đồ 2: Tóm tắt các chất đã phân lập 40 ĐỒ THỊ Đồ thị 1: Đường chuẩn PNP 52 Đồ thị 2: Kết quả % ức chế của chất AA03 53 Đồ thị 3: Kết quả % ức chế cao EtOH 54 Đồ thị 4: Kết quả % ức chế cao hexan 55 Đồ thị 5: Kết quả % ức chế cao EtOAc 55 Đồ thị 6: Kết quả % ức chế cao MeOH 56 Đồ thị 7: Kết quả so sánh giữa các cao 56 7
  10. DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1: Lá Xa kê 2 Hình 2: Hoa Xa kê 2 Hình 3: Quả Xa kê 2 Hình 3.1: Artocarpus altitis var. seminifera 2 Hình 3.2: Artocarpus altitis var. non seminifera 2 Hình 4: Biểu đồ phân bố cây Xa kê 3 Hình 5: Biểu đồ nguồn gốc cây Xa kê 3 Hình 6: Máy cô quay chân không 32 Hình 7: TLC 32 Hình 8: MPLC 32 Hình 9: Sắc kí điều chế P-HPLC 32 Hình 10: Máy đo mật độ quang 32 Hình 11: Máy đo pH 32 Hình 12: Lá Xa kê tươi đem chiết 33 Hình 13: Lá Xa kê héo không chiết 33 Hình 14: TLC phân đoạn V 35 Hình 15: Hình dạng AA01 41 Hình 16: TLC AA01 41 Hình 17: Hình dạng AA02 42 Hình 18: TLC AA02 42 Hình 19: Hình dạng AA03 42 Hình 20: TLC AA03 42 8
  11. Hình 21: Kết quả thử hoạt tính AA01 53 Hình 21.1: Trước khi bỏ enzym 53 Hình 21.2: Sau khi bỏ enzym 53 Hình 22: Kết quả thử hoạt tính AA03 53 Hình 22.1: Trước khi bỏ enzym 53 Hình 22.2: Sau khi bỏ enzym 53 Hình 23: Kết quả thử hoạt tính trên các cao 54 Hình 23.1: Trước khi bỏ enzym 54 Hình 23.2: Sau khi bỏ enzym 54 Hình 23.2.1: Cao EtOH 54 Hình 23.2.2: Cao hexan 55 Hình 23.2.3: Cao EtOAc 55 Hình 23.2.4: Cao MeOH 56 9
  12. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY XA KÊ 1.1.1. Mô tả thực vật 1.1.1.1. Khái quát Tên Việt Nam: cây Xa kê. Tên khác: cây bánh mì. Tên khoa học: Artocarpus altilis (Park.) Fosberg. Tên đồng nghĩa: Artocarpus communis J. R. et G. Foster, A. camansi Blanco [1]. Tên nước ngoài: Breadfruit (Anh); Arbre à pain (Pháp); Sukun (Indonesia, Malaysia); Rimas (Philipin). Họ: Dâu tằm Moraceae. Bộ: Urticales. Lớp: Magnoliopsida. Ngành: Magnoliophyta. Giới: Plantae [16]. Cây Xa kê có giống không hạt và giống có hạt. Giống không hạt được dùng phổ biến hơn. Căn cứ vào màu sắc và hình dạng của quả mà chia Xa kê làm 2 loại [32]. - Artocarpus altitis var. non seminifera: quả màu xanh, không hạt và nhiều thịt. - Artocarpus altitis var. seminifera: quả màu hạt dẻ, chứa nhiều hạt ăn được. 1.1.1.2. Mô tả Cây thân gỗ, cao 10-20m có thể tới 15-20m. Thân cây có đường kính 90cm. Lá to, mọc so le chia 3-9 thuỳ, dài 30-50cm, có khi đến gần 1m, gốc tròn, đầu nhọn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt và nháp lá kèm sớm rụng. Cụm hoa mọc ở kẽ lá, đực và cái riêng; cụm hoa đực hình chuỳ hoặc tụ họp thành đuôi sóc dài tới 20cm, hoa có 1 nhị; cụm hoa cái hình cầu, có khi hình ống. 10
  13. Quả phức hình cầu, có gai, to bằng quả dưa bở, màu lục hay vàng nhạt thịt màu trắng chứa nhiều bột, hạt màu vàng nhạt [1]. Quả Xa kê là một quả kép to, gần như tròn hoặc hơi trứng có đường kính 12-20cm, vỏ màu xanh lục nhạt hay vàng nhạt, thịt quả rất nạc và trắng. Quả Xa kê mọc thành từng chụm vài ba quả một ở đầu cành. Có những quả không có hạt, nhưng cũng có những quả có hạt chìm ngập trong thịt quả [2]. Hình 1: Lá Xa kê Hình 2: Hoa Xa kê Hình 3.1: Artocarpus altitis var. seminifera Hình 3.2: Artocarpus altitis var. non seminifera Hình 3: Quả Xa kê 1.1.2. Phân bố và sinh thái Từ một số đảo thuộc Indonesia đến Papua New Guinea. Vùng nhiệt đới Đông Nam Á, Nam Á và nhiều đảo ở Thái Bình Dương. Nguồn gốc ở các đảo phía nam Thái Bình Dương, Châu Đại Dương (Châu Úc). Hiện được di thực vào các đảo Giava, Sumatra (Indonesia) Malaysia, các vùng đảo đông nam Châu Á [1]. Từ xa xưa cây Xa kê đã được kể là cây tinh bột truyền thống quan trọng trong cuộc nổi dậy trên tàu HMS Bounty vào năm 1789. Hầu hết các giống Xa kê là xuất hiện từ Polynesia (Pháp) và Melanesia (Úc) qua nhiều thế hệ nhân giống 11
  14. sinh dưỡng và lựa chọn, sau đó được vận chuyển ra nhiều nơi và phụ thuộc vào con người phân tán, dữ liệu được so sánh với lý thuyết về các thuộc địa của con người Châu Đại Dương [27]. Ngoài ra, Xa kê còn được vận chuyển đường dài từ miền đông Melanesia vào Micronesia. Ở Việt Nam, Xa kê mới chỉ được trồng rải rác trong vườn cây ăn quả của các gia đình từ Đà Nẵng trở vào. Cây không trồng được ở các tỉnh phía bắc. Đó là loại cây gỗ, ưa sáng và ưa khí hậu của vùng nhiệt đới nóng và ẩm; nhiệt độ trung bình từ 23-30oC. Cây có thể chịu được thời tiết nắng nóng đến 40oC, lượng mưa từ 2000-3000 mm/năm, độ ẩm không khí trung bình là 70-90%. Xa kê sinh trưởng phát triển kém ở những vùng có nhiệt độ trung bình năm dưới 20oC hoặc có mùa đông lạnh kéo dài. Cây mọc từ hạt sau 4-5 năm bắt đầu có hoa quả, vào những năm sau cây sẽ cho nhiều quả hơn. Hoa Xa kê thụ phấn nhờ gió hoặc côn trùng, số hoa cái đậu quả thường đạt 75%. Quả non sễ bị rụng khi gặp mưa nhiều. Hạt tươi có tỉ lệ nảy mầm rất cao khoảng 95%. Cây con ưa bóng và ưa ẩm. Từ gốc cây mẹ hàng năm mọc ra nhiều chồi rễ. Cây trồng từ chồi rễ sẽ chóng cho thu hoạch [2]. Hình 4: Biểu đồ phân bố cây Xa kê Hình 5: Biểu đồ nguồn gốc cây Xa kê 12
  15. 1.2. Y HỌC DÂN GIAN CỦA CÂY XA KÊ 1.2.1. Thành phần hóa học Quả: Quả Xa kê có 70% phần ăn được, trong 100g quả chứa protein 1,2-2,4g, chất béo 0,2-0,5g, carbohydrat 21,5-31,7g, Ca 18-32mg, P 52-88mg, sắt 0,4-1,5mg, vitamin A 26-40 đơn vị quốc tế, thiamin 0,10-0,14 mg, riboflavin 0,05-0,08mg, niacin 0,7-1,5mg và vitamin C 17-35 mg [1]. Trong bột quả Xa kê có 2-3 hoặc 6% nước, 3,2% muối vô cơ, 0,2-1,17% chất béo, 1,10-4,09% chất đạm, 64-85% tinh bột, đường, dextrin, 2-3% độ tro [2]. Hoa: Fujimoto Yasuo và cộng sự [1] đã nghiên cứu hoa Xa kê và thấy hoa chứa 5 chất 2-geranyl-2',3,4,4'-tetrahydroxyldihydrochalcon hay còn gọi là AC-5-1 (1), AC-5- 2, AC-3-1, AC-3-2, AC-3-3. Các chất này đều có tác dụng ức chế 5-lipooxygenase. Chất AC-5-1 không có tác dụng với prostaglandin synthase. OH OH O HO OH (1) Thân: Có các flavonoid isocyclomorusin, isocyclomulberin, cycloaltilisin, cyclomorusin, cyclomulberin, angeletin, cycloartomunin và dihydroisocycloartemunin. Gỗ: Chứa chất artocarben, (3,2′,4′-trihydroxy-6″,6″-dimethylpyrano (3″,2″,4,5)- trans-stilben. Ruột gỗ chứa chất ức chế tyrosine không độc, dùng để chế mỹ phẩm [2]. Vỏ cây: Có các artonol A, B, C, D và E, 2-prenylflavon artonin E và F và cycloartobiloxanthon [1]. Rễ: Chứa Artonin V, cyclomulberrin, cyclocomunol, cyclocomunin, dihydroisocycloartocomunin, pyranodihydrobenzoxanthon, epoxyd, artomunoxanthotrion epoxyd, cycloartomunin, dihydrocycloartomunin, cycloartomunoxanthon, artomunoxanthon, artomunoxanthetrion, β-sitosterol, cudraflavon A, lupeol acetate [1]. 1.2.2. Hoạt tính sinh học 13
  16. Quả: Có tác dụng bổ tỳ, ích khí. Ngoài ra, trong dân gian còn lấy trái Xa kê nghiền nát rồi đắp vào khối u để làm “chín” chúng [26]. Hạt: Có tác dụng bổ trung ích khí, lợi trung tiện [1]. Mủ: Được sử dụng trên các bệnh ngoài da và được băng bó trên cột sống để giảm đau thần kinh tọa. Mủ pha loãng uống trị tiêu chảy [26]. Vỏ cây: Có tác dụng sát trùng [1]. Hoa: Nướng lên dùng cọ xát vào nướu răng xung quanh răng đau [26]. Lá: Có tác dụng kháng sinh, tiêu viêm, lợi tiểu [1]. Ở Trinidad và Bahamas, nước sắc của lá Xa kê giúp làm giảm huyết áp, và giảm bệnh hen suyễn. Lá nghiền được ngậm trên lưỡi điều trị bệnh tưa miệng. Nước ép lá được dùng làm thuốc nhỏ tai. Tro của lá bị bôi lên giảm các nhiễm trùng da. Bột lá rang lên được dùng như một phương thuốc trị bệnh phù lá lách [26]. Ở Ấn Độ, trong một nghiên cứu sàng lọc tác dụng dược lý của cao khô, chiết từ vỏ và lá cây Xa kê bằng cồn 50o các tác giả thấy có tác dụng: - Tác dụng lợi tiểu: Thí nghiệm được tiến hành ở chuột cống trắng, cho uống với liều 20mg/kg, cao khô Xa kê có tác dụng lợi tiểu rõ rệt so với lô đối chứng. - Độc tính cấp: Thí nghiệm trên chuột nhắt trắng dùng đường tiêm phúc mạc, đã xác định được LD50 là 80mg/kg, cao khô Xa kê có độc tính khá mạnh. Cần xác định lại, vì súc vật thích ăn lá Xa kê [1]. 1.2.3. Công dụng của Xa kê [26] Quả: Trái cây chín hoặc chưa chín hẳn dùng để ăn như các loại trái cây khác. Ở Samoa, quả Xa kê còn xanh bóc vỏ, rửa, cắt đôi, bỏ lõi, đặt trong lò hầm đá lót bằng lá Cordylme terminalis Kunth, được axit hóa và bảo quản trong nhiều năm thành món “po poi” giống pho mát ăn có vị như bánh mì. Ở Micronesia, New Hebrides, Ấn Độ cũng có món “po poi”. Hạt: Luộc, hấp, rang, nướng, hoặc than nóng và ăn kèm với muối. Ở Tây Phi, đôi khi chúng được giã nhuyễn. Ở Costa Rica, hạt nấu chín được bán trên đường phố. Các hạt giống được ép gói trong lá Heliconia ố với nước cốt dừa và được nướng trong 2 giờ, có mùi giống như pho mát, cứng, được rất nhiều người bản xứ thích. Lá: Tại Ấn Độ, họ lấy lá Xa kê làm thức ăn cho gia súc, dê. Ở Guam, làm thức ăn cho gia súc, ngựa và lợn. 14
  17. Mủ: Mủ Xa kê đã được người Hawaii sử dụng từ xa xưa như một loại nhựa bẫy chim. Sau khi đun sôi với dầu dừa, mủ Xa kê dùng để hàn tàu thuyền, hay trộn với đất màu để sơn tàu thuyền. Thân: Ở miền Nam nước ta dùng làm gỗ đóng đồ dùng. Gỗ Xa kê màu vàng nhạt hoặc vàng xám với những mảng đen hoặc đốm màu da cam, gỗ nhẹ, cứng, đàn hồi và chống mối mọt (trừ gỗ khô) và được sử dụng để xây dựng và đồ nội thất. Ở Guam và Puerto Rico, gỗ Xa kê được sử dụng làm ván lướt sóng. Ở Hawaii gỗ dùng làm trống đánh trong điệu múa Hula. Sau khi đem chôn vùi trong bùn, gỗ có giá trị để làm đồ gia dụng, làm giấy. Giấy thô ráp ban đầu đánh bởi san hô và dung nham, nhưng làm mịn cuối cùng được thực hiện với lá khô cây Xa kê. Chất xơ: Chất xơ từ vỏ cây rất khó trích ly, nhưng độ bền cao. Người Malaysia làm trang trí cho nó vào quần áo. Ở Việt Nam, nó được làm bộ yên cương cho trâu nước. Hoa: Cụm hoa đực được pha trộn với các chất xơ của quả dâu tằm ở Broussonetia papyrifera Vent. để làm khố. Gai hoa khô cũng được dùng làm mồi lửa. Ở Jamaica, Puerto Rico và Nam Thái Bình Dương, cụm hoa đực được đun sôi, lột vỏ và ăn như rau quả với kẹo recooking. 1.2.4. Bài thuốc có Xa kê [1,3] Chữa bệnh mụn rộp: Lá Xa kê đốt thành than, tán mịn, phối hợp với dầu dừa và nghệ tươi, giã nát, làm thành bánh, đắp [1]. Chữa hưng sáng, mụn nhọt áp xe: Lá Xa kê và lá đu dủ để tươi, lượng bằng nhau, giã với vôi tôi cho đến khi có màu vàng, rồi đắp [1]. Trị bệnh gút, sỏi thận: Dùng lá Xa kê tươi 100g ( khoảng 2 lá), dưa leo 100g, cỏ xước khô 50g, cho vào nồi nấu tất cả, lấy nước uống trong ngày.[3] Chữa viêm gan vàng da: Lá Xa kê tươi 100g, diệp hạ châu tươi 50g, củ móp gai tươi 50g, cỏ mực khô 20-50g. Nấu chung, lấy nước uống trong ngày [3]. Trị tiểu đường loại 2: Lấy lá Xa kê tươi 100g (khoảng 2 lá), quả đậu bắp tươi 100g, lá ổi non 50g, cho vào nồi nấu lấy nước uống hằng ngày [3]. Trị chứng tăng huyết áp dao động: Dùng lá Xa kê vàng (vừa rụng) 2 lá, rau ngót tươi 50g, lá chè xanh tươi 20g, nấu chung lấy nước uống trong ngày [3]. 15
  18. Trị đau răng: Lấy rễ cây Xa kê, nấu nước ngậm và súc miệng [3]. 1.3. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN CÂY XA KÊ 1.3.1. Thành phần hoá học Trong nước Năm 2010, Nguyễn Thanh Tùng, Dương Thị Kim Yến, Nguyễn Ngọc Mai Trâm, Hoàng Sa, Nguyễn Trung Nhân [5] đã cô lập được 5 chất từ trái khô cây Xa kê thu hái ở Hóc Môn 2-formyl-5-hydroxymetylfural (2), acid gallic (3), 4-hydroxy-3,3- dimethoxycyclopenta-1,4-diencarbaldehyd (4), 5-hydroxy-7,4″-dimetoxyflavon (5) và epifriedelanol (6) COOH H3CO OCH3 O HO O OH HO OH OH CHO (2) (3) (4) OCH3 H3CO O HO OH O (5) (6) Cùng lúc đó thì Nguyễn Hữu Duy Khang, Trần Thụy Thanh Xuân, Nguyễn Trung Nhân [4] cũng cô lập được 2 chất là 8-gerany-4′,5,7-trihydroxyflavon (7) và 2- geranyl-2′,3,4,4′-tetrahydroxyldihydrochalcon hay còn gọi là Dihydrochalcone AC-5-1 (1) trong lá cây Xa kê được thu hái ở Bình Dương. 16
  19. OH HO O OH O (7) Năm 2011, Phạm Ngọc Ẩn, Phạm Thị Nhật Trinh, Mai Đình Trị, Lê Tiến Dũng [9] đã cô lập được 3 chất là 2-geranyl-2',3,4,4'-tetrahydroxyldihydrochalcon (1), và Quercertin (8), Rutin (9) từ cao acetone của lá Xa kê được thu hái ở Đồng Nai. Kết quả cho biết 2 chất Quercetin và Rutin ở dạng bột màu vàng có khả năng giảm nguy cơ ung thư, giúp ngăn ngừa bệnh tim, chống oxi hoá, có hoạt tính kháng viêm, kháng vi rút, ngăn ngừa và điều trị suy thoái xương. Còn chất Dihydrochalcon AC 5-1(1) cô lập được ở dạng dầu màu cam là 1 dẫn xuất phenolic có khả năng ức chế Cathepsin K trị bệnh loãng xương. OH OH OH HO HO O O OH OH O OH O OH O O H3C O O HO (8) HO HO HO OH OH (9) Nước ngoài Năm 1973, Gowsala Pavanasasivam và M.Uvais S.Sultanbawa [19] cô lập được 2 chất thuộc họ triterpenes là Cycloartenone (10) và Cycloartenylacetate (11) từ cao ether dầu của vỏ cây Xa kê. 17
  20. H H H H O O O H H (10) (11) Năm 1992, Chun-Nan Lin và Wen-Liang Shieh [15] tách được Cyclomulberrin (12) từ cao acetone của rễ cây xa kê và tìm ra 3 chất mới thuộc họ pyranoflavonoids là Cyclocommunol (13), Cyclocommunin (14), Dihydroisocycloartomunin (15). OH OH HO O HO O O O OH O OH O (12) (13) O OH OH HO O HO O O O OH O OH O (14) (15) Năm 1993, McIntosh và Manchew [27] đã tách các axit béo trong quả Xa kê palmitic, oleic, lauric, linoleic, myristic, caprylic, capric, stearic và arachidic. Cũng vào năm đó, Chien-Chih Chen, Yu-Lin Huang, Jun-Chih Ou, Chwan-Fwu Lin, Tzu- Ming Pan [14] đã tách được 3 chất của rễ và thân cây Xa kê là Cyclomorusin (16), 18
  21. Cyclomulberrin (12), Engeletin (17) từ cao MeOH và 3 chất mới là Isocyclomorusin (18), Isocyclomulberrin (19) và Cycloaltilisin (20) từ cao CHCl3. OH OH HO O O O H O O O OH OH O OH O HO OH (16) (17) OH O O O OH O (18) OH OH OCH3 HO O HO O O O OH O OH O (19) (20) Năm 2000, K. Shimizu, Ryuichiro Kondo, Kokki Sakai, Supanida Buabarn, Uraiwan Dilokkunanant [23] cùng cô lập được 3′-geranyl-2′,3,4,4′- tetrahydroxychalcone (21) trong cao acetone của lá xa kê. 19
  22. HO OH OH O O H (21) Năm 2002, Ashok D. Patil, Alan J. Freyer, Lew Killmer, Priscilla Offen, Paul B. Taylor, Bartholomew J. Votta, và Randall K. Johnson [11] đã tách được Dihydrochalcone AC 5-1 (1) và 2 chất mới là Cycloaltilisin 6 (22) và Cycloaltilisin 7 (23) trong cao MeOH/CH2Cl2 của chồi hoa Xa kê. OH OH HO OH OH OH O O HO OH (22) OH O O OH O (23) 20
  23. Năm 2006, Jing-Ru Weng, Sheng-Ching Chan, Yi-Huang Lu, Hsien-Cheng Lin, Horng-Huey Ko, Chun-Nan Lin [20] cùng tìm tách được Dihydroartomunoxanthone (24), Artomunoisoxanthone (25), Cyclocomunomethonol (26), Artomunoflavanone (27), Artochamins B (28), Cyclocommunol CC (29) có trong vỏ rễ Xa kê. HO OCH3 HO OH HO O O O OH HO H OH O OH O (24) (25) OCH3 OH HO OCH3 HO O HO O O OCH3 OH O OH O (26) (27) OH OH OH HO O O O O O OH O OH O OH (28) (29) Năm 2007, Yanbin Lu, Cuirong Sun, Yu Wang, Yuanjiang Pan [43] dùng phương pháp HPLC đánh giá hàm lượng các chất trong cao tổng của cây Xa kê và thấy hàm 21
  24. lượng 3 chất Dihydrochalcone AC-5-1 (1), Lespeol (30), Isolespeol (31) chứa nhiều trong cao EtOH. OH O OH O (30) OH O OH O (31) Cùng năm 2007, N.R. Amarasinghe và U.L.B. Jayasinghe [29] cô lập được (E)- 2,4,3′,5′-stilbenetetrol (32), 4′-[3-methyl-1(E)-butenyl]-(E)-2,4,3′,5′-stilbenetetrol (33), (3-methyl-2-butenyl)-(E)-2,4,3′,5′-stilbenetetrol (34), 3′,5′,6-trihydroxy-2- phenylbenzofuran (35), 2′,4′,5,7–tetrahydroxylflavanone (36), 2′,4′,5,7-tetrahydroxyl flavones (37), 2′,4′,5,7-tetrahydroxy-6-[3-methyl-1(E)-butenyl]flavones còn gọi là isoartocarpesin (38), 2′,4′,5,7-tetrahydroxy-6(3-methyl-2-butenyl) flavones (39), 3β- acetoxyolean-12-en-11-one (40), cycloartenylacetate (11), β-sitosterol (41), stigmasterol β-D-glucopyranoside (42) trong cao buthanol chiết từ quả Xa kê. HO OH HO OH HO HO OH OH (33) (32) 22
  25. OH HO OH O HO HO OH OH (35) (34) HO OH HO OH HO O HO O OH O OH O (36) (37) HO OH HO OH HO O HO O OH O OH O (38) (39) CH2CH3 H3C CH3 O H H CH3 CH3 CH3 H O H H H O HO (40) (41) CH2CH3 H3C CH3 H CH3 H H H O HO O HO OH (42) OH 23
  26. Cùng năm 2007, Lotulung PDN., S.Fajriah, M.Hanafi, E.Filaila [25] cô lập được một tinh thể vàng 1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-[8-hydroxy-2-methyl-2-(4-methyl-3- pentenyl)-2H-1-benzopyran-5-yl] 1-propanone hay còn gọi là AC-GF (43) có trong cao CH2Cl2 của lá Xa kê. OH O O (43) HO OH Tiếp đó, Yu Wanga, Kedi Xua, Lin Lin, Yuanjiang Pan, Xiaoxiang Zheng [44] cùng tìm ra 5 chất mới là 1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-{4-hydroxy-6,6,9-trimethyl- 6a,7,8,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-5-yl}-1-propanone (44), 1-(2,4- dihydroxyphenyl)-3-[3,4-dihydro-3,8-dihydroxy-2-methyl-2-(4-methyl-3-pentenyl)- 2H-1-benzopyran-5-yl]-1-propanone (45), 1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-[8-hydroxy-2- methyl-2-(3,4-epoxy-4-methyl-1-pentenyl)-2H-1-benzopyran-5-yl]-1-propanone (46), 1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-[8-hydroxy-2-methyl-2-(4-hydroxy-4-methyl-2-pentenyl)- 2H-1-benzopyran-5-yl]-1-propanone (47), 2-[6-hydroxy-3,7-dimethylocta-2(E),7- dienyl]-3,4,2’,4’-tetrahydroxydihydrochalcone (48) và 4 chất cũ là AC-GF (43), Dihidrochalcone AC-5-1 (1), Cycloaltilisin 6 (22) và (E)-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3- (8-hydroxy-2-(4-hydroxy-4-methylpent-2-en-1-yl)-2-methyl-2H-chromen-5-yl) propan-1-one (49). OH HO OH O OH O OH O (44) (45) O HO OH 24
  27. OH O OH O O OH O O HO OH HO OH (46) (47) OH HO OH OH OH OH HO O HO O OH O (49) (48) Năm 2008, Song-Chwan Fang, Chin-Lin Hsu, Yu-Shen Yu, Gow-Chin Yen [37] cùng tìm ra Isolespeol (31), 5′-geranyl-2′,4,4′-trihydroxychalcone (50), 3′-geranyl- 2′,3,4,4′-tetrahydroxydihydrochalcone (21), Lespeol (30) và Xanthoangelol (51) trong lá cây Xa kê. OH HO OH O (50) OH HO OH O (51) 25
  28. Năm 2009, Kai-Wei Lin, Chiung-Hui Liu, Huang-Yao Tu, Horng-Huey Ko, Bai- Luh Wei [21] cùng tìm ra Cyclogera-Communin (52), Artoflavone A (53), Artomunoisoxanthone (25), Artocommunol CC (29), Artochamin D (54), Artochamin B (28) và Dihydroartomunoxanthone (24) trong vỏ rễ Xa kê. HO OCH3 OH O O HO O OH O OH O OH O (52) (53) HO OCH3 HO O OH OH O (54) Gần đây, vào năm 2011, Victor Kuete, Patrick Y Ango, Ghislain W Fotso, Gilbert DWF Kapche, Jean P Dzoyem, Arlette G Wouking, Bonaventure T Ngadjui, Berhanu M Abegaz [39] đã nghiên cứu khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên cao MeOH của vỏ cây Xa kê của vùng Cameroon và cô lập được 5 chất peruvianursenyl acetate C (55), α-amyrenol còn gọi là viminalol (56), sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside (42), artonin E (57) và 2-[(3,5-dihydroxy)-(Z)-4-(3-methylbut-1-enyl)phenyl]benzofuran-6- ol (58). 26
  29. H H H O H HO O H H (55) (56) HO OH OH O O HO OH O OH O OH (57) (58) Theo đó, Lin JA, Fang SC, Wu CH, Huang SM, Yen GC [24] nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm làm giảm bạch cầu đơn nhân S100B trên quả Xa kê và cô lập được chất 5,7,4′-trihydroxy-6-geranylflavanone (59). OH HO O OH O (59) 27
  30. 1.3.2. Hoạt tính sinh học Nước ngoài Theo tài liệu [38] thì cây Xa kê có rất nhiều chất có hoạt tính sinh học thú vị như: - Trị bệnh sốt rét [12]: Một báo cáo của Boomphong và cộng sự chỉ ra rằng khả năng trị sốt rét của rễ cây Xa kê từ 9 prenylated flavones: Cycloartocarpin, Artocarpin và Chaplashin được cô lập từ cao CH2Cl2 của thân và rễ, morusin, Cudraflavone B, Cycloartobiloxanthone, Artonin E và Artbiloxanthone trong vỏ rễ Xa kê có khả năng kháng trùng sốt rét ở IC50 từ 1.9-4.3 µg/ml. - Chống lao [12]: Là khả năng chống vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis H37Ra trong bài báo Microplate Alamar Blue (MABA) của Collin và Franzblau cho biết tất cả 9 prenylated flavones: cycloartocarpin, artocarpin, và chaplashin phân lập từ cao CH2Cl2 của thân và rễ cây Xa kê, cũng như morusin, cudraflavone B, artonin E, artobiloxanthone, IC50 tương ứng là 9,9; 6,9; 7,7; 4,5; 5,2; 6,4; 6,9 mM và cudraflavone C, cycloartobiloxanthone cô lập từ rễ cây Xa kê có khả năng kháng lao với nồng độ ức chế tối thiểu MIC từ 3.12-100 µg/ml. - Kháng tế bào gây độc [37]: 9 hợp chất thuộc họ prenylated flavones được phân lập được từ rễ cây Xa kê là cycloartocarpin, artocarpin, chaplashin, morusin, cudraflavone B, cycloartobiloxanthone, artonin E, cudraflavone C, artobiloxanthone có khả năng phát hiện ra tế bào độc hại chống lại tế bào KB, BC và Vero ở IC50 khoảng 2.9-14.7 µg/ml. Lotulung PD, Fajriah S, Hanafi M, Filaila E [25] đã nghiên cứu hoạt tính kháng tế bào gây độc trên lá cây Xa kê trồng ở Indonesia và thấy chất (43) có khả năng gây độc cao trên tế bào bạch cầu của chuột P-388. - Kháng tế bào ung thư [37]: 3 dẫn xuất geranyl của chalcone là chất Isolespeol (31), 5′-geranyl-2′,4,4′-trihydroxychalcone (50), 3,2′,4,4′-tetrahydroxy-3′- geranyldihydrochalcone (21), Lespeol (30) và Xanthoangelol được phân lập từ lá Xa kê nghiên cứu bằng in vitro có khả năng kháng ung thư. Các chất này có khả năng phát hiện tế bào ung thư gồm tế bào liposarcoma (SW 872) trong mô mỡ, colorectal carcinoma (HT-29, COLO 205), hepatocellullar carcinoma (PLC5, Huh7) và tế bào hepatoblastoma (HepG2, Hep3B) một loại ung thư gan ác tính. Trong đó thì Isolespeol hoạt động ức chế cao nhất với IC50 = 3.8 µM trong SW 872 tế bào mô mỡ. Isolespeol 28
  31. phản ứng với SW 872 làm mất khả năng của màng ty thể (DeltaPsim). Western còn chỉ ra rằng isolespeol kích thích sự gia tăng protein. Tỉ lệ giữa protein và chất thuộc họ kháng tế bào chết Bcl-2 được thay đổi do Isolespeol làm hoạt hoá caspase-9 và caspase-3, những chất bị cắt bởi poly (ADP-ribose) (PARP). Kết quả là Isolespeol đem lại tế bào chết trong mô SW 872. - Huỷ tiểu cầu [43]: những flavones dihydroartomunoxanthone, artomunoisoxanthone, cyclocomunomethonol, artochamins B và artocommunol CC ,được phân lập từ vỏ rễ cây xa kê có tác dụng ức chế mạnh sự kết hợp các tiểu huyết cầu trong huyết thanh PRP của người 300 µM so với aspirin. Ngoài ra dihydroartomunoxanthone (24), artochamins B (28) và artocommunol CC (29) ức chế quan trọng do kết hợp adrenaline và hiệu quả của việc huỷ tiểu cầu làm ức chế hoạt động của men cyclooxygenese-1 (COX-1) làm giảm sự hình thành thromboxane. Sự kết hợp tiểu cầu là nhân tố sinh bệnh quan trọng trong sự phát triển chứng xơ vữa động mạch cùng với chứng huyết khối ở người. Vì vậy, dihydroartomunoxanthone, artochamins B và artocommunol CC có khả năng là tác nhân chống huyết khối. - Kháng đái tháo đường [10]: Người ta nghiên cứu cao nước của vỏ rễ rất nhạy khi nồng độ glucose trong máu tăng quá mức ở chuột Wistar và dẫn đến phá huỷ sự trao đổi sinh hoá của tuyến tuỵ và gan ở chuột. - Kháng viêm [40]: Những hợp chất flavonoids cycloartomunin, cyclomorusin, dihydrocycloartomunin, dihydroisocycloartomunin, cudraflavone A, cyclocommunin, artomunoxanthone, cycloheterohyllin, artonin A, artonin B, artocarpanone, artocarpanone A, and heteroflavanones A, B, C có khả năng ức chế chất trung gian được đào thải từ tế bào lớn, bạch cầu trung tính, đại thực bào. Chất dihydroisocycloartomunin ức chế sự đào thải β-glucuronidase và histamine từ tế bào màng bụng của chuột hoạt động bởi P-methoxy-N-methylphenethylamine. Artocarpanone ức chế sự đào thải lysozyme từ bạch cầu trung tính của chuột nhờ formyl-Met-Leu-Phe (fMLP). Artonin B và Artocarpanone ức chế anion superoxide tạo thành fMLP trong khi cyclomorusin, dihydrocycloartomunin, cudraflavone A, và cyclocommunin kích thích sự phát sinh anion superoxide. Hợp chất artocarpanone còn ức chế các sản phẩm NO và iNOS (inducible nitric oxide synthase). 29
  32. Đặc biệt Lin JA, Fang SC, Wu CH, Huang SM, Yen GC [24] thử hoạt tính trên chất 5,7,4′-trihydroxy-6-geranylflavanone (59) cô lập được từ quả Xa kê với hoạt tính kháng viêm và kháng oxi hoá cao nồng độ ≤ 2.5 μM. Một nghiên cứu sử dụng phương pháp tảo carrageenan gây bệnh phù chân chuột [34] thử nghiệm trên thuốc sắc cao nước lá Xa kê so với nước muối bình thường cũng khảo sát tính kháng viêm. Kết quả cho thấy nước sắc từ lá Xa kê có hoạt tính kháng viêm mạnh 60 mg/kg thể trọng trong 0.5-4 giờ. - Ức chế hoạt động men tyrosinase [17]: Cao diethyl ether hay cao methanol từ ruột gỗ cây xa kê ở tỉnh Phitsanulok, Thái Lan chứa nhiều artocarpin có khả năng ức chế tyrosinase, ức chế quá trình tổng hợp melanin và khả năng kháng oxi hoá. Bên cạnh đó, Shimizu, K. Fukuda, M. Kondo, R. Sakai, K. [33] cũng nghiên cứu hoạt tính ức chế men tyrosinase của 23 loại gỗ ở Papua New Guinea trong đó có cây Xa kê và kết quả cho biết chất isoartocarpesin có trong cao MeOH của ruột gỗ cây Xa kê hoạt động ức chế mạnh nhất tương đương với acid kojic. Cao MeOH ức chế sinh tổng hợp melanin của tất cả các tế bào khối u ác tính B16 mà không gây bất kỳ độc tính nào thử trên lưng của con lợn nâu. Do đó, cao ruột gỗ cây Xa kê là nguyên liệu cho tác nhân làm trắng da và khắc phục chứng rối loạn sắc tố. - Ức chế hoạt động 5-lipoxygenase [22]: Được cô lập từ cây Xa kê ở Indonesia, chất AC-5-1 (1) có khả năng ức chế mạnh 5-lipoxygenase của u tế bào bón được thử nghiệm trên chuột. Bệnh phù tai chuột do acid Arachidonic trong một mẫu thử hoạt tính kháng viêm là do leukotriene gây ra. Chất AC-5-1 ở nồng độ 10-5M ức chế 96% C4 leukotriene tổng hợp tế bào phúc mạc chuột nhờ Canxi-ionophore. Đó còn là một phát hiện thú vị về leukotriene đối với hoạt tính kháng viêm và các hoạt tính sinh học khác. - Ức chế Cathepsin K [11]: Dihydrochalcon AC-5-1, Cycloaltilisin 6, Cycloaltilisin 7, AC-3-1, AC-3-3, trong đó Cycloaltilisin 6 ức chế mạnh nhất với IC50 = 98nM, còn Cycloaltilisin 7 với IC50 = 840nM. - Ức chế hoạt động của 5-α reductase [23]: Artocarpin được cô lập từ cao diethyl ether của ruột gỗ cây xa kê có khả năng ức chế 5-α reductase ức chế sự chuyển hoá testosterone thành 5-α-dihydro-Testosterone (IC50 = 37µM). Cùng lúc đó, Shimizu, K. Fukuda, M. Kondo, R. Sakai, K. [33] đã thử hoạt tính trên 9 chất cô lập được từ dịch chiết cao MeOH của ruột gỗ cây Xa kê và kết quả cho thấy Chlorophorin (IC50 = 30
  33. 37µM), Artocarpin (IC50 = 85 µM) ức chế mạnh hơn hẳn so với acid α-linoleic, chất ức chế mạnh trong tự nhiên. Trong đó chất prenylated stilbene được cô lập từ cao acetone của lá Xa kê [31] là 2′,3,4,4′-tetrahydroxy-3′-geranylchalcone (21) cũng có hoạt tính ức chế 5-α reductase với IC50 = 104µM. Cấu trúc của hợp chất cho thấy rằng sự hiện diện của một nhóm thế isoprene (prenyl hay geranyl) sẽ tăng khả năng ức chế 5α- reductase. - Giảm thiểu chứng xơ vữa động mạch [41]: Việc bảo vệ tế bào bình thường khác khi sử dụng hoá chất trị liệu được đánh giá trên tế bào U937 của người nuôi cấy bằng OxLDL dùng 4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1) oxi hoá. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong cao ethyl acetate của cây Xa kê có chứa thành phần của chất bảo vệ tế bào bình thường khác là β-sitosterol và 6 flavonoids. - Kháng oxi hoá: Kai-Wei Lin, Chiung-Hui Liu, Huang-Yao Tu, Horng-Huey Ko, Bai-Luh Wei [21] đã chứng minh hợp chất cyclogeracommunin, artoflavone A, artomunoisoxanthone, artocommunol CC, artochamin D , artochamin B , dihydroartomunoxanthone được cô lập từ vỏ rễ cây Xa kê có khả năng ức chế chất xúc tác phá huỷ DNA, chống lão hoá. - Trị chứng cao huyết áp: Siddesha J. M., D’Souza C. J. M., Viswanath B. S., Govil, J. N.,Singh, V. K [35] nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme chuyển hoá angiotensin làm tăng huyết áp từ các cây thuốc, kết quả cho thấy trong cao ethanol và cao methanol của lá Xa kê có hiệu quả cao hơn so với cao nước và cao acetone. - Kháng vi sinh: Victor Kuete, Patrick Y Ango, Ghislain W Fotso, Gilbert DWF Kapche, Jean P Dzoyem, Arlette G Wouking, Bonaventure T Ngadjui, Berhanu M Abegaz [39] dùng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC và nồng độ thấp nhất tiêu diệt vi sinh MMC để đánh giá. Kết quả là giá trị MIC thấp nhất trên cao tổng 64 μg/ml đối với khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 25922 và khuẩn Escherichia coli ATCC 8739. Tương ứng MIC đạt 32 μg/ml khi thử cả 2 chất (58), (59) trên khuẩn Pseudomonas aeruginosa PA01và thử (59) trên khuẩn E.coli ATCC 8739. - Trừ giun sán: Carine Marie-Magdeleine, Maurice Mahieu, Marie-Laure Lastel, Harry Archimede [13] đã đưa ra đánh giá dựa trên thí nghiệm đối với lá của quả Xa kê có hạt và không hạt thử trên loài giun đỏ Haemonchus contortus, kết quả định lượng cho thấy hàm lượng polyphenol và tannin chứa trong cao nước, cao MeOH của lá già 31
  34. và lá tươi của cây Xa kê có hạt và không hạt rất nhiều, do đó lá Xa kê có khả năng diệt trừ giun sán. - Diệt côn trùng: Nghiên cứu khả năng diệt côn trùng trên vỏ lá Xa kê của Williams, L.A.D.; Mansingh, Ajai [42] bằng cách sử dụng loài bọ trưởng thành Cylas formicarius. Kết quả cho biết trong vỏ lá có chứa một triterpene pentacyclic có liên kết đôi ở vị trí 12 và 13 có khả năng chống côn trùng và độc tính giảm theo mỗi phân đoạn chiết cao. LC50 (mg/g thể trọng) trong 48 giờ của các cao tương ứng, cao tổng 3,9 mg/g; cao Hexan 5,5 mg/g; cao MeOH 7,8 mg/g; chất triterpene 11,5mg/g. Còn trong cao EtOAc thì lại không có khả năng ức chế, người ta thử với liều trên 10,0 mg/g nhưng chỉ cho hiệu quả ức chế 20%. Đặc biệt hiệu quả tăng gấp 6 lần khi pha dẫn xuất triterpene 1% DMSO trong acetone kết quả cho LC50 = 1,9 mg/g. 32
  35. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ 2.1.1. Phương pháp sắc ký bản mỏng [7] Sắc ký bản mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography) dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ. Bình sắc ký là bình bằng thủy tinh trong suốt, hình dạng đa dạng, có nắp đậy. Pha tĩnh là một lớp mỏng silica gel khoảng 0,25mm phủ lên bề mặt một tấm nhôm phẳng. Pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển chầm chậm dọc theo tấm bản mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển lên cao nhờ vào tính mao quản. mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mức dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào hiện tượng hấp thu của pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi. Mẫu cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1μl dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình. 2.1.2. Phương pháp sắc ký cột [7] Sử dụng phương pháp sắc ký cột hấp thu (Adsorption chromatography). Pha tĩnh là hạt silica gel thường và hạt silica gel pha đảo C18 được nạp nén chặt vào cột inox hoặc cột thuỷ tinh. Pha động là chất lỏng, dung môi hoặc hệ các dung môi khác nhau. Trong sắc kí hấp thu, các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu lên bề mặt của chất rắn pha tĩnh. Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh, hệ quả là trong quá trình pha động di chuyển chúng sẽ tách xa nhau ra. Sự hấp thu xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực (tương tác lưỡng cực - lưỡng cực), do sự tương tác giữa những phân tử có mang những nhóm phân cực đối với pha rắn là chất rất phân cực. Trong sắc ký cột hấp thu pha rắn thường 33
  36. là những hạt silica gel. Trên bề mặt những hạt này có mang nhiều nhóm -OH nên đây là những pha tĩnh có tính rất phân cực. 2.1.3. Phương pháp phổ [7] Sử dụng phổ cộng hưởng từ để xác định cấu trúc của một hợp chất hữu cơ. Phổ 1H-NMR Cho thông tin về các proton 1H có trong phân tử. Các thông số của phổ 1H-NMR cho biết độ dịch chuyển hóa học δ, hình dạng tín hiệu và hằng số tương tác (J) spin - spin giữa các proton không tương đương kế cận nhau sẽ cho các kiểu ghép vân phổ (tín hiệu bội), cường độ tích phân của tín hiệu thể hiện số lượng proton tương ứng với tín hiệu đó. Phổ 13C-NMR Cho thông tin về các cacbon có trong phân tử. Các tín hiệu phổ 13C-NMR xuất hiện trong khoảng thang chia độ rộng (0 - 250 ppm) (có thể đến 600ppm cho trường hợp đặc biệt) nên các tín hiệu tách rõ ràng, mũi đơn dễ quan sát. Mỗi loại cacbon trong hợp chất hữu cơ có độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học của cacbon trong phổ 13C-NMR, có thể dự đoán được loại cacbon và liên kết của cacbon đó. Kỹ thuật ghi phổ 13C-NMR khử ghép DEPT cũng là một dạng phổ 13C-NMR, thực hiện đồng thời trên cả 2 kênh 1H-NMR và 13C-NMR. Phổ 13C-NMR DEPT cho các tín hiệu cacbon gắn với 1, 2 hoặc 3 hydro. - DEPT-45 mỗi cacbon có mang hydrogen đều cho hiện 1 mũi trên phổ đồ. - DEPT-90 chỉ những cacbon loại metin -CH cho mũi dương. - DEPT-135 cho xuất hiện mũi dương các cacbon metin -CH và metil -CH3, xuất hiện mũi âm các cacbon metilen CH2, cacbon tứ cấp không cho mũi trong phổ. Phổ 2 chiều gồm HSQC, HMBC và COSY Phổ HSQC: khảo sát hạt nhân 1H ghép cặp với 13C, cho tín hiệu của cacbon gắn trực tiếp vào proton, nghĩa là tương tác ngang qua 1 nối hóa trị. 34
  37. Phổ HMBC: cho biết tương tác xa, ngang qua 2 hoặc 3 nối hóa trị và không xuất hiện tín hiệu tương tác ngang qua 1 nối hóa trị. Phổ COSY: cho biết mối liên quan giữa các proton với nhau: proton gem (2 proton gắn trên cùng một cacbon), proton vic (2 proton gắn trên 2 cacbon kề nhau), mối liên quan giữa các nguyên tử H trong một phân tử. 2.2. THỬ HOẠT TÍNH Phương pháp nghiên cứu hoạt tính ức chế men α-glucosidase trong điều trị đái tháo đường loại 2 là phương pháp được chúng tôi ưu tiên sử dụng vì cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hoá chứ không tham gia vào quá trình chuyển hoá đường hay cải thiện chức năng của insulin hoặc kích thích sự sản sinh insulin của tế bào beta tuyến tuỵ như các phương pháp khác. Phương pháp dựa trên nguyên tắc : - Men α-glucosidase khi gặp nối α-D-glucose sẽ cắt đứt liên kết để giải phóng đường D-glucose - Sử dụng chất nền có liên kết α với đường D-glucose như p-nitrophenyl-α-D- glucopyranoside, dưới tác dụng của men α-glucosidase sẽ bị thuỷ phân cho ra đường D-glucose và p-nitrophenol. - p-nitrophenol hấp thu trong ánh sáng nhìn thấy được nên tiến hành đo độ hấp thu A ở bước sóng λ= 405nm. Từ đó xác định lượng D-glucose sinh ra. - p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside  α-D-glucopyranoside + p-nitrophenol OH OH O OH HO α-glucosidase O HO HO + H OH O O OH OH NO2 NO2 Theo phản ứng lượng glucose sinh ra tỉ lệ với PNP. Vì vậy có thể đo độ hấp thu A của PNP ở bước sóng 405nm để xác định lượng glucose sinh ra. So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu ức chế và không ức chế để xác định % ức chế. Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50. 35
  38. Phần trăm ức chế và chỉ số IC50 Phần trăm ức chế I% Hoạt tính ức chế của các cao chiết và chất sạch được tính theo công thức: [Glc]o – [Glc]i I % = x 100% [Glc]o Do [Glc] = [PNP] nên [PNP]o – [PNP]i I % = x 100% [PNP]o Vì [PNP] tuyến tính bậc 1 với A nên [A]o – [A]i I % = x100 [A]o Trong đó: [PNP]o nồng độ PNP sinh ra khi không sử dụng chất ức chế (mM) [PNP]i nồng độ PNP sinh ra khi sử dụng chất ức chế ở nồng độ i (mM) [A]o độ hấp thu trung bình khi không sử dụng chất ức chế [A]i độ hấp thu trung bình khi sử dụng chất ức chế ở nồng độ i. Chỉ số IC50 Chỉ số IC50 là nồng độ của một mẫu ức chế mà tại đó nó ức chế 50% enzym α- glucosidase. Giá trị IC50 là giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế (mạnh hay yếu) của hoạt chất. Mẫu có hoạt tính ức chế ức chế càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. Có thể tính chỉ số IC50 dựa vào đồ thị hoặc từ phương trình đường cong phần trăm ức chế theo nồng độ chất ức chế. 36
  39. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1. HOÁ CHẤT THIẾT BỊ 3.1.1. Hoá chất Chloroform (T) Trung Quốc. Ethyl acetate (T) Trung Quốc. Methanol (T) Trung Quốc. n-Hexan(T) Trung Quốc. Ethanol 96o (T) Việt Nam. DMSO (A) Merck. Nước tinh khiết HPLC. Acid Formic (A) Prolabo Thuốc thử hiện hình bản mỏng: dung dịch H2SO4 10% trong EtOH. Pha 50ml H2SO4 đậm đặc trong 500ml EtOH 95%. p-nitrophenol (PA) Merck. p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PA) Merck. α-glucosidase 0,9 U/ml (Sigma). Na2HPO4 (PA) Prolabo. KH2PO4 (PA) Prolabo. Nước khử ion. Thuốc viên trị tiểu đường Arcabose 50mg. 3.1.2. Thiết bị Máy siêu âm Elma S100 H Elmasonic. Máy cô quay chân không BUCHI Ratavapor R-200. Sắc ký bản mỏng (TLC) Merck-GF60 F254, kích thước 20x20cm, độ dày lớp hấp phụ 0,2mm (Merck, Germany). Bình phun xịt thuốc thử. Bếp điện dùng nướng bản mỏng Blacker®. 37
  40. Máy soi UV: MINERALIGHT ® LAMP, U.S.A dùng bước sóng 254nm. Cột sắc ký trung áp dùng silicagel 60, Merck, đường kính hạt 0,040-0,063 mm. Cột sắc ký điều chế cột pha đảo dùng silicsgel 60, Merck, cỡ hạt: 15 µm. Cân điện tử TANITA KD-200 và PRECISA XB 220ª. Máy đo mật độ quang Elx800 Bio Tek, dùng máy đọc đĩa 96 giếng. Máy đo pH inoLab 720. Tủ sấy UE 400. Micropipette 20-200 µl và 100 – 1000 µl. LC-MS đo trên máy Agilent 1260/6120. Phổ cộng hưởng từ đo trên máy Brucker Advant 500 MHz. 38
  41. Hình 6: Máy cô quay chân không Hình 7: TLC Hình 8: MPLC Hình 9: Sắc kí điều chế P-HPLC Hình 10: Máy đo mật độ quang Hình 11: Máy đo pH 39
  42. 3.2. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CHẤT 3.2.1. Điều chế cao thô từ lá Xa kê Nguyên liệu Thu thập mẫu: lá Xa kê tươi được thu hái ở Cần Thơ vào tháng 8 năm 2011. Lá được thu hái phải còn xanh nguyên không bị úa vàng. Xử lý mẫu: cắt bỏ phần héo úa, dập nát, đem rửa sạch với nước. Hình 12: Lá Xa kê tươi đem chiết Hình 13: Lá Xa kê héo không chiết Điều chế cao Lá Xa kê tươi (5kg) sau khi được xử lí đem chiết với EtOH 96% theo phương pháp siêu âm, phần dịch chiết đem cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cao EtOH (276 g) ở dạng sệt. Toàn bộ cao EtOH đem đi siêu âm nhiều lần với n-hexan chia làm hai phần: Phần tan trong n-hexan đem lọc lấy dịch cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp được cao Hexan (54 g) ở dạng sệt. Phần không tan trong n-hexan tiếp tục siêu âm nhiều lần với dung môi EtOAc thu được hai phần: Phần tan trong EtOAc đem lọc lấy dịch cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp được cao EtOAc (17 g) ở dạng sệt. 40
  43. Phần không tan trong EtOAc tiếp tục được siêu âm nhiều lần với dung môi MeOH, thu được hai phần: Phần tan trong MeOH đem lọc lấy dịch cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp được cao MeOH (3,5 g) ở dạng sệt. Còn lại phần không tan. Qui trình chiết xuất cao: Sơ đồ 1 : Qui trình chiết xuất cao từ lá Xa kê Lá Xa kê tươi (5 kg) Chiết với ethanol 96o Lọc. Cô loại dung môi. Cao EtOH 96o (276 g) Chiết với n-hexan. Lọc. Cô loại dung môi. Cao Hexan (54 g) Phần không tan Chiết với ethyl acetate. Lọc. Cô loại dung môi. Cao EtOAc (17 g ) Phần không tan Chiết với methanol. Lọc. Cô loại dung môi. Cao MeOH (3,5 g) Phần không tan 41
  44. 3.2.2. Phân lập các chất từ lá Xa kê 3.2.2.1. Phân lập AA01 và AA02 Trong khi lắc cao Hexan thì thấy xuất hiện lớp huyền phù màu vàng tách lớp nằm giữa cao EtOH và dịch n-Hexan, đem lọc và rửa bằng n-Hexan. Đặt tên là phân đoạn V. Ta tiến hành cô lập AA01 và AA02 từ phân đoạn V. Hình 14: TLC phân đoạn V Bước 1: Tiến hành sắc kí cột trung áp đẳng dòng phân đoạn V. Khối lượng mẫu: 427,6 mg Kích thước cột: 15 x 400 (mm) Tốc độ dòng: 5 ml/phút Hệ dung môi: CHCl3 – MeOH (70:30) Kết quả thu được 7 phân đoạn. Bảng 1: Kết quả cột trung áp phân đoạn V Phân đoạn Hệ dung môi TLC VA CHCl3 – MeOH = 70:30 Vết dơ VB CHCl3 – MeOH = 70:30 Nhiều vết VC CHCl3 – MeOH = 70:30 Vết dài VD CHCl3 – MeOH = 70:30 Vết vàng dơ VE CHCl3 – MeOH = 70:30 Nhiều vết VF CHCl3 – MeOH = 70:30 Nhiều vết kéo dài VG CHCl3 – MeOH = 70:30 Có 3 vết tròn 42
  45. Bước 2: Từ phân đoạn VG tiếp tục tiến hành sắc kí trung áp đẳng dòng. Khối lượng mẫu: 95 mg Kích thước cột: 15 x 250 (mm) Tốc độ dòng: 2 ml/phút Hệ dung môi: CHCl3 – MeOH – H2O (70:30:5) Kết quả thu được 5 phân đoạn. Bảng 2: Kết quả cột trung áp phân đoạn VG Phân đoạn Hệ dung môi TLC VG1 CHCl3 – MeOH – H2O = 70:30:5 Vết dơ VG2 CHCl3 – MeOH – H2O = 70:30:5 Nhiều vết VG3 CHCl3 – MeOH – H2O = 70:30:5 2 vết vàng VG4 CHCl3 – MeOH – H2O = 70:30:5 1 vết vàng 1 vết đen VG5 CHCl3 – MeOH – H2O = 70:30:5 1 vết đen mờ Bước 3: Từ phân đoạn VG4 tiếp tục tiến hành sắc kí cột trung áp đẳng dòng. Khối lượng mẫu: 25 mg Kích thước cột: 15 x 250 (mm) Tốc độ dòng: 2 ml/phút Hệ dung môi: CHCl3 – MeOH – H2O (70:30:5) Kết quả thu được 5 phân đoạn. Bảng 3: Kết quả cột trung áp phân đoạn VG4 Phân đoạn Hệ dung môi TLC VG4a CHCl3 – MeOH – H2O = 70:30:5 Vết dơ CHCl3 – MeOH – H2O = VG4b 1 vết vàng  AA01 70:30:5 CHCl3 – MeOH – H2O = VG4c 1 vết đen  AA02 70:30:5 VG4d CHCl3 – MeOH – H2O = 70:30:5 Xả cột 43
  46. AA03 Bước 1: Từ cao EtOAc (17g) tiến hành 2 lần sắc kí cột điều chế với hệ dung môi tăng dần. Khối lượng cao: 14g Kích thước cột: 40 x 300 (mm) Tốc độ dòng: 20 ml/phút Dung môi A: n-Hexan, B: EtOAc, C: MeOH Bảng 4: Điều kiện chạy P-HPLC cao EtOAc Bước Thời gian (phút) Tốc độ (ml/phút) %A %B %C 1 5 20 100 0 0 2 20 20 100 0 0 3 100 20 0 100 0 4 20 20 0 100 0 5 15 20 0 85 15 6 10 20 0 85 15 7 10 20 0 0 100 Bảng 5: Kết quả chạy P-HPLC cao EtOAc Phân đoạn Hệ dung môi TLC EA Hexan = 100% Nhiều vết EB Hexan – EtOAc =75:25 1 vết tím EC Hexan – EtOAc =75:25 Nhiều vết ED Hexan – EtOAc =50:50 Có vết cam EE EtOAc = 100% Nhiều vết EF EtOAc – MeOH = 85:15 Nhiều vết EG EtOAc – MeOH = 80:20 Nhiều vết EH EtOAc – MeOH – H2O = 70:30:5 Nhiều vết EI EtOAc – MeOH – H2O = 60:40:10 Nhiều vết 44
  47. Bước 2: Từ phân đoạn ED ta tiến hành 2 lần sắc kí cột điều chế pha đảo tách diệp lục với hệ dung môi tăng dần từ MeOH – H2O (70:30) đến MeOH – H2O (100:0). Khối lượng mẫu: 832,9mg Kích thước cột: 15 x 400 (mm) Tốc độ dòng: 5 ml/phút Dung môi: MeOH – H2O Bước 3: Sau khi tách diệp lục, phần còn lại có vết cam đem chạy sắc kí cột trung áp đẳng dòng. Khối lượng mẫu: 590,3mg Kích thước cột: 15 x 400 (mm) Tốc độ dòng: 5 ml/phút Dung môi: CHCl3 – MeOH (99:1) Bảng 6: Kết quả cột trung áp phân đoạn ED Phân đoạn Hệ dung môi TLC ED1 CHCl3 – MeOH = 99:1 Có vết cam ED2 CHCl3 – MeOH = 99:1 Nhiều vết ED3 CHCl3 – MeOH = 99:1 Nhiều vết ED4 CHCl3 – MeOH = 99:1 Nhiều vết ED5 CHCl3 – MeOH = 99:1 Nhiều vết ED6 CHCl3 – MeOH = 99:1 Nhiều vết ED7 CHCl3 – MeOH = 99:1 Nhiều vết Bước 4: Từ phân đoạn ED1 ta tiến hành sắc kí cột trung áp chạy đẳng dòng. Khối lượng mẫu: 355,5mg Kích thước cột: 15 x 250 (mm) Tốc độ dòng: 2 ml/phút Dung môi: Hexan – EtOAc (80:20) 45
  48. Bảng 7: Kết quả cột trung áp phân đoạn ED1 Phân đoạn Hệ dung môi TLC ED1a Hexan – EtOAc = 80:20 Vết dơ ED1b Hexan – EtOAc = 80:20 Nhiều vết ED1c Hexan – EtOAc = 80:20 1 vết cam  AA03 ED1d Hexan – EtOAc = 80:20 Nhiều vết ED1e Hexan – EtOAc = 80:20 Nhiều vết 46
  49. Sơ đồ 2: Tóm tắt các chất đã phân lập Cao EtOH (276g) Phân đoạn V Cao Hexan Cao EtOAc Cao MeOH (427,6mg) (54g) (14g) (3,5g) Chạy MPLC isocratic. Dung môi: CHCl3 – MeOH (70:30) VA VB VC VD VE VF VG (100mg) (70mg) (11,5mg) (20mg) (71,9mg) (34mg) (95mg) Chạy MPLC isocratic Dung môi: CHCl3 – MeOH – H2O (70:30:5) VG1 VG2 VG3 VG4 VG5 (8mg) (28mg) (10mg) (25mg) (7mg) Chạy MPLC isocratic Dung môi: CHCl3 – MeOH – H2O (60:40:10) AA01 AA02 (5mg) (1mg) Chạy P-HPLC gradient. Dung môi: Hexan – EtOAc EA EB EC ED EE EF EG EH EI Chạy MPLC isocratic. Dung môi: CHCl3 – MeOH (99:1) ED1 ED2 ED3 ED4 ED5 ED6 ED7 (355,5mg) (20,9mg) (11,3mg) (46mg) (17,5mg) (32,7mg) (95.2mg) Chạy MPLC isocratic. Dung môi: Hexan – EtOAc (80:20) AA03 (3mg) 47
  50. 3.2.2.2. Tinh chế AA01 và AA02 Từ phân đoạn VG4b, đem cô quay đuổi dung môi, kết tinh nhiều lần trong MeOH, ta thu được AA01. - Tinh thể vô định hình, màu vàng - Hấp thụ UV - Ít tan trong MeOH - Hiện màu bằng H2SO4 10% trong EtOH có màu vàng khi hơ nóng. - Rf = 0,53 với hệ dung môi CHCl3 – MeOH – H2O = 60:40:10. Hình 15: Hình dạng AA01 Hình 16: TLC AA01 Từ phân đoạn VG4c, đem cô quay đuổi dung môi, kết tinh nhiều lẩn trong MeOH, ta thu được AA02. - Bột màu trắng - Không hấp thụ UV - Tan trong MeOH - Hiện màu bằng H2SO4 10% trong EtOH có màu đen khi hơ nóng. - Rf = 0,37 với hệ dung môi CHCl3 – MeOH – H2O = 60:40:10. 48
  51. Hình 17: Hình dạng AA02 Hình 18: TLC AA02 AA03 Từ phân đoạn ED1c, đem cô quay đuổi dung môi, ta thu được AA03. - Chất dính vô định hình không màu. - Hấp thụ UV - Tan trong MeOH - Hiện màu bằng H2SO4 10% trong EtOH có màu cam khi hơ nóng. - Rf = 0,38 với hệ dung môi CHCl3:MeOH = 96:4 - Rf = 0,73 với hệ dung môi CHCl3:MeOH = 90:10 Hình 19: Hình dạng AA03 Hình 20: TLC AA03 49
  52. Bảng 8: Tóm tắt các chất đã phân lập và tinh chế từ lá Xa kê Ký hiệu Khối Tính chất R Cao chất lượng f - Kết tinh vô định hình, màu vàng. - Tan trong MeOH. AA01 5 mg 0,53 - Kiểm tra bằng TLC cho một vết tròn Phân màu vàng. đoạn - Dạng bột, màu trắng. V - Tan trong MeOH AA02 1 mg 0,37 - Kiểm tra bằng TLC cho một vết tròn màu đen. - Chất dính trong suốt. Cao - Tan trong MeOH AA03 3 mg 0,38 EtOAc - Kiểm tra bằng TLC cho một vết tròn màu cam. 50
  53. 3.3. THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG ĐÁI THÁO ĐƯỜNG Điều kiện phản ứng: toC = 370C, pH = 6.8. PNP chuẩn nồng độ 100µg/ml: Cân 1.39mg PNP pha trong 100ml đệm pH = 6.8. Đệm phosphat pH = 6.8: 28,8g Na2HPO4 + 11,45g KH2PO4 + 1000ml H2O. Mẫu ức chế nồng độ 400µg/ml tương ứng với nồng độ 100μg/ml trong hỗn hợp phản ứng. Cân 0,4mg AA01, AA03 pha trong 1ml DMSO. Cân 4mg các cao EtOH, hexan, EtOAc, MeOH pha trong 10ml DMSO. α-glucosidase (100U/2.45 mg) nồng độ 0,12U tương ứng với nồng độ tối ưu 0,03U trong hỗn hợp phản ứng: Cân 1,47mg pha trong 100ml nước khử ion lạnh. Chất nền PNP – Glc (400µg/ml): Cân 21,64mg pha trong 25ml đệm pH = 6.8 Xây dựng đường chuẩn PNP Pha loãng PNP trong đệm pH = 6.8 để có các nồng độ 0, 20, 40, 60, 80µg/ml. Cho vào giếng và tiến hành đo độ hấp thu A ở bước sóng 405nm. Bảng 9: Dựng đường chuẩn PNP Tác chất µl 0 20 40 60 80 100 PNP (100µg/ml) 0 20 40 60 80 100 Đệm pH = 6.8 100 80 60 40 20 0 Chuẩn bị mẫu thử Pha loãng mẫu ức chế trong nước khử ion để có các nồng độ 20, 40, 60, 80 μg/ml. Tiến hành cho hoá chất vào giếng theo bảng. Mỗi nồng độ chuẩn bị 4 mẫu, một mẫu blank để đối chiếu và 3 mẫu đo mật độ quang lấy giá trị trung bình. Bảng 10: Pha mẫu ức chế thử hoạt tính Tác chất (µl) 0 20 40 60 80 100 Chất ức chế 25 25 25 25 25 25 Đệm pH 6.8 25 25 25 25 25 25 51
  54. Enzym 25 25 25 25 25 25 Lắc đều, ủ ở 37oC trong 30 phút PNP - Glc 25 25 25 25 25 25 Đo mật độ quang ở bước sóng 405nm, tính phần trăm ức chế, IC50 Xác định độ ẩm mẫu cao thử Dựa vào phụ lục 9.3 Dược điển Việt Nam 3, độ ẩm được xác định như sau: Dùng cân phân tích cân chính xác 0,5-2 g mẫu cao thử, đem sấy khoảng 105-110oC trong 2- 3 giờ. Lấy ra, đem cân và tiếp tục sấy trong 30 phút, lặp lại nhiều lần cho đến khi khối lượng không đổi (sai số khoảng 5%). Độ ẩm cao: mcuối – mđầu % độ ẩm = x 100% mcao 52
  55. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1. THÀNH PHẦN HOÁ HỌC Nhận danh AA01 Phổ 1H NMR (MeOD, δ ppm) (phụ lục 1.3-1.5) cho biết AA01 có 20H, trong đó có 5 mũi cộng hưởng của proton vòng thơm: - H6′ ở δ = 7,65 (1H, dd, J = 2,5 và J = 8,5) lần lượt ghép cặp ortho và meta với H5′ ở δ = 6,88 (1H, d, J = 8,5) và H2′ ở δ = 7,68 (1H, d, J = 2,5). - Hai proton H6 ở δ = 6,22 (1H, d, J = 2) và H8 ở δ = 6,41(1H, d, J = 2) ghép cặp meta với nhau. Từ phổ 1H NMR cho thấy phân tử AA01 có hai vòng thơm, một vòng mang ba nhóm thế và một vòng mang bốn nhóm thế. Ngoài ra, còn có các mũi cộng hưởng của: - Proton anomer H1″′ ở δ = 4,54 (1H, d) và H1″ ở δ = 5,12 (1H, d, J = 7,5) - Proton nhóm methyl H6″′ ở δ = 1,1 (3H, d) - Proton nhóm metilen H6″ ở δ = 3,45 (2H, m) và δ = 3,81(1H, d, J = 10) Phổ 13C NMR (MeOD, δ ppm) (Phụ lục 1.1) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 1.2) cho biết trong phân tử AA01 có 27C trong đó: - 1 nhóm –CH3 tương ứng với C6″′ (δ = 17,9 ppm). - 1 nhóm –CH2– tương ứng với C6″ (δ = 68,6 ppm). - 8 nhóm >CH–O–tương ứng với δ từ 69,7 ppm đến 78,2 ppm. - 5 nhóm –CH= tương ứng với C8 (δ = 94,9 ppm), C6 (δ = 99,9 ppm), C5′ (δ = 116,1 ppm), C2′ (δ = 117,7 ppm), C6′ (δ = 123,6 ppm). - 6 nhóm –O–C= tương ứng với δ từ 145,9 ppm đến 166 ppm - 2 nhóm –O–CH–O– tương ứng với C1″′ (δ = 102,4 ppm), C1″ (δ = 104,7 ppm). 53
  56. - 3 nhóm >C= tương ứng với C10 (δ = 105,7 ppm), C1′ (δ = 123,2 ppm), C3 (δ = 135,7 ppm). - 1 nhóm >C=O đặc trưng tương ứng với C4 (δ = 179,5 ppm). Từ 2 nhóm –O–CH–O– tương ứng với C1″′ (δ = 102,4 ppm), C1″ (δ = 104,7 ppm) và 8 nhóm >CH–O–tương ứng với δ từ 69,7 ppm đến 78,2 ppm chứng tỏ phân tử AA01 có 2 phân tử đường. Từ các proton trên, dựa vào HSQC ta xác định vị trí của C vòng thơm - H6′  C6′ ở δ =123,6 H6 C6 ở δ =99,9 - H5′  C5′ ở δ = 116,1 H8  C8 ở δ = 94,9 - H2′  C2′ ở δ = 117,7 H H 5' H 8 6' 2' H 6 H Phổ HMBC ( phụ lục 1.7) cho thấy: - Hai proton H6 và H8 đều cho tương quan với C10 (δ = 105,7 ppm) ở trường cao và C7 (δ = 166 ppm) ở trường thấp. - Proton H6 tương quan với cacbon C5 (δ = 163 ppm) - Proton H8 tương quan với cacbon C9 (δ = 166 ppm). 54
  57. H 8 7 9 10 H 6 5 - Proton H6′ tương quan với C2 (δ = 159,4 ppm). - Hai proton H2′ và H6′ cùng tương tác với C1′, C2, C4′. - Proton H2′ tương quan với C3′ (δ = 145,9 ppm). H H 5' 4' 6' C 2 2' H - Proton H6″ δ = 3,81(1H, d, J = 10) tương quan với C1″′ (δ=102,4 ppm). - Proton H1″ cho tương quan với C3 (δ = 135, 7 ppm). Như vậy, đơn vị đường gluocose gắn tại vị trí C3 của aglycon, proton H1″ ở δ = 5,12 (1H, d, J = 7,5) chứng tỏ đây là đường β–glucose. Phổ 13C NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy trong phân tử của AA01 có phần aglycon là flavonoid và hai đơn vị đường. Phổ COSY (phụ lục 1.6) và HSQC (phụ lục 1.8) xác nhận: - Một đơn vị đường là rhamnose với proton nhóm methyl H6″′ ở δ = 1,1 (3H, d) tương ứng với C6″′ (δ = 17,9 ppm) - Một đơn vị đường là glucose với proton nhóm metilen H6″ ở δ = 3,45 (2H, m), δ = 3,81(1H, d, J = 10) tương ứng với C6″ (δ = 68,6 ppm) 55
  58. 13 Bảng 11: Dữ liệu phổ C NMR, DEPT 90 và DEPT 135 của AA01 Vị trí C 13 C NMR (δ ppm) DEPT 90 DEPT 135 Nhóm C 6′′′ 17,9 Biến mất Peak dương CH3– 6′′ 68,6 Biến mất Peak âm –CH2– 5′′′ 69,7 Peak dương Peak dương >CH–O– 4′′ 71,4 Peak dương Peak dương >CH–O– 2′′′ 72,1 Peak dương Peak dương >CH–O– 3′′′ 72,3 Peak dương Peak dương >CH–O– 4′′′ 73,9 Peak dương Peak dương >CH–O– 2′′ 75,8 Peak dương Peak dương >CH–O– 3′′ 77,3 Peak dương Peak dương >CH–O– 5′′ 78,2 Peak dương Peak dương >CH–O– 8 94,9 Peak dương Peak dương –CH= 6 99,9 Peak dương Peak dương –CH= 1′′′ 102,4 Peak dương Peak dương –O–CH–O– 1′′ 104,7 Peak dương Peak dương –O–CH–O– 10 105,7 Biến mất Biến mất >C= 5′ 116,1 Peak dương Peak dương –CH= 2′ 117,7 Peak dương Peak dương –CH= 1′ 123,2 Biến mất Biến mất >C= 6′ 123,6 Peak dương Peak dương –CH= 3 135,7 Biến mất Biến mất >C= 3′ 145,9 Biến mất Biến mất –O–C= 4′ 149,8 Biến mất Biến mất –O–C= 9 158,5 Biến mất Biến mất –O–C= 2 159,4 Biến mất Biến mất –O–C= 5 163 Biến mất Biến mất –O–C= 7 166 Biến mất Biến mất –O–C= 4 179,5 Biến mất Biến mất >C=O 56
  59. 13 1 Bảng 12: Dữ liệu phổ C NMR, H NMR, COSY và HMBC của AA01 Vị 13C 1H NMR δ ppm COSY HMBC trí NMR (số H, J = Hz) 1H → 1H 1H → 13C C/H (δ ppm) 2 159,4 3 135,7 4 179,5 5 163 6 6,22–6,23 (1H, d, J = 2) 99,9 H6 → C5, C8, C10 7 158,5 8 6,41–6,42 (1H, d, J = 2) 94,9 H8 → C6, C7, C9, C10 9 166 10 105,7 1′ 123,2 2′ 7,68–7,69 (1H, d, J = 2,5) 117,7 H2′ → H6′ H2′→ C3′,C6′ 3′ 145,9 4′ 149,8 5′ 6,88–6,9 (1H, d, J = 8,5) 116,1 H5′ → H2′ H5′→ C1′,C4′, C3′ 6′ 7,64 (1H, dd, J = 2,5 và 8,5) 123,6 H6′→ C2,C4′ 1″ 5,12–5,13 (1H, d, J = 7,5) 104,7 H1″→ C3 2″ 3,51 (1H, m) 75,8 H2″→ C1″ 3″ 3,36 (1H, d, J = 1) 77,3 H3″→ C4″ 4″ 3,27–3,31 (2H, m) 71,4 H4″ →C3″ 5″ 3,39–3,43 (1H, m) 78,2 H5″ → C2″ H6″a 3,45–3,49 (2H, m) H6″b → H6″a → C5″ 6″ 68,6 H6″b 3,81–3,83 (1H, d, J= 10) H6″a H6″b → C1″′ 1″′ 4,54 (1H, d) 102,4 H1″′ → C2″′, C3″′, C5″′ 2″′ 3,64–3,65 (1H, t) 72,1 H2″′ → H3″′ 3″′ 3,54 (1H, dd, J = 3,5 và 9,5) 72,3 H3″′ → C4″′ 4″′ 3,27–3,31 (2H, m) 73,9 H4″′ → H3″′ H4″′ → C3″′, C5″′ 5″′ 3,45–3,49(2H, m) 69,7 6″′ 1,1–1,2 (3H, d) 17,9 H6″′ → H5″′ H6″′ → C4″′, C5″′ 57
  60. Tóm lại từ phổ 1H NMR, phổ 13C NMR, kết hợp với phổ DEPT, HSQC, HMBC, COSY và so sánh với tài liệu tham khảo [9,18] chúng tôi nhận danh AA01 là: rutin. Tên gọi khác: 2–(3,4–dihydroxyphenyl)–5,7–dihydroxy–3–(((2S,3R,4S,5S,6S)–3,4,5–trihydroxy– 6–(2–(((2S,3R,4R,5R,6S)–3,4,5–trihydroxy–6–methyltetrahydro–2H–pyran–2–yl)oxy) propan–2–yl) tetrahydro–2H–pyran–2–yl)oxy)–4H–chromen–4–one 5' ' OH 6' 4 HO 8 1' 3' 9 O 2 OH 7 2' 3 6 4 10 5 O '' 6b 6a'' OH O O ''' 6 ''' ''' '' 5 1 4 '' H3C 5 O O HO HO '' HO '' 1 3''' 2''' '' 2 4''' 3 HO OH OH Cấu trúc rutin Quercetin 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-O-α-L-rhamnopyranoside 58
  61. 4.2. HOẠT TÍNH SINH HỌC 4.2.1. Xác định độ ẩm cao Bảng 13: Kết quả xác định độ ẩm cao Cao (g) EtOH Hexan EtOAc MeOH % độ ẩm 15,44 4,34 4,43 29,84 4.2.2. Dựng đường chuẩn: Bảng 14: Dựng đường chuẩn PNP 0 20 40 60 80 100 A 0,0400 0,0823 0,1277 0,1703 0,2153 Đồ thị 1: Đường chuẩn PNP 4.2.3. Hoạt tính sinh học Chất AA01 Không có khả năng ức chế men α-glucosidase. Mẫu sau khi thêm enzym, đem ủ, thêm chất nền thì thấy có màu vàng do PNP sinh ra, tiếp tục đem ủ 30 phút, lặp lại 5 lần vẫn thấy có màu vàng, chứng tỏ chất AA01 không có hoạt tính ức chế men α-glucosidase. 59
  62. Kết quả thử hoạt tính AA01 Hình 21.1: Trước khi thêm enzym Hình 21.2: Sau khi thêm enzym Chất AA03 Có khả năng ức chế men α-glucosidase. Kết quả thử hoạt tính AA03 Hình 22.1: Trước khi thêm enzym Hình 22.2: Sau khi thêm enzym Bảng 15: Kết quả đo mật độ quang AA03 Nồng độ 0 20 40 60 80 100 A 1,2377 0,8460 0,3457 0,0267 0,0167 0,0097 I % 31,6456 72,0711 97,8454 98,6534 99,2189 Đồ thị 2: Kết quả % ức chế của chất AA03 60
  63. Cao EtOH, Hexan, EtOAc, MeOH Kết quả thử hoạt tính trên các cao Hình 23.1: Trước khi thêm enzym Hình 23.2: Sau khi thêm enzym Bảng 16: Kết quả đo mật độ quang cao EtOH Nồng độ 0 20 40 60 80 100 A 0,8600 0,8430 0,8365 0,0365 0,0070 0,0030 I % 1,9767 2,7326 95,7558 99,1861 99,6512 Hình 23.2.1: Cao EtOH Đồ thị 3: Kết quả % ức chế cao EtOH Bảng 17: Kết quả đo mật độ quang cao Hexan Nồng độ 0 20 40 60 80 100 A 1,0995 0,5210 0,0200 0,0070 0,0030 0,0005 I % 52,6148 98,1810 99,3634 98,7272 99,9545 61
  64. Hình 23.2.2: Cao Hexan Đồ thị 4: Kết quả % ức chế cao Hexan Bảng 18: Kết quả đo mật độ quang cao EtOAc Nồng độ 0 20 40 60 80 100 A 0,9400 0,5125 0,3550 0,2120 0,0030 0,0005 I % 45,4787 62,2340 77,4468 99,6810 99,9470 Hình 23.2.3: Cao EtOAc Đồ thị 5: Kết quả % ức chế cao EtOAc Bảng 19: Kết quả đo mật độ quang cao MeOH Nồng độ 0 20 40 60 80 100 A 0,9295 0,7495 0,559 0,012 0,007 0,001 I % 19,3653 39,8601 98,7089 99,2469 99,8924 62
  65. Hình 23.2.4: Cao MeOH Đồ thị 6: Kết quả % ức chế cao MeOH Bảng 20: Kết quả so sánh IC50 Arcabose AA03 Cao EtOH Cao Hexan Cao EtOAc Cao MeOH (µg/ml) (1) (2) (3) (4) (5) (6) IC50 32,26 27,83 52,94 19,20 8,74 33,33 Đồ thị 7: Kết quả so sánh giữa các cao Vậy cao EtOAc có hoạt tính ức chế men α-glucosidase mạnh nhất, trong đó một phần là do hoạt tính ức chế men của chất AA03. 63
  66. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN Từ dịch chiết cồn 96o, chúng tôi tiến hành tách riêng 3 loại cao dựa trên độ phân cực của các hợp chất có trong lá Xa kê. - Cao Hexan chiếm 19,57% - Cao EtOAc chiếm 6,26% - Cao MeOH chiếm 1,27% Từ lớp huyền phù lấy ra, chúng tôi đã cô lập được AA01 và AA02. Định danh được AA01 là Rutin 2–(3,4–dihydroxyphenyl)–5,7–dihydroxy–3– (((2S,3R,4S,5S,6S)–3,4,5–trihydroxy–6–(2–(((2S,3R,4R,5R,6S)–3,4,5–trihydroxy–6– methyltetrahydro–2H–pyran–2–yl)oxy) propan–2–yl) tetrahydro–2H–pyran–2– yl)oxy)–4H–chromen–4–one. 5' ' OH 6' 4 HO 8 1' 3' 9 O 2 OH 7 2' 3 6 4 10 5 O '' 6b 6a'' OH O O ''' 6 ''' ''' '' 5 1 4 '' H3C 5 O O HO HO '' HO '' 1 3''' 2''' '' 2 4''' 3 HO OH OH Từ cao EtOAc, chúng tôi đã cô lập được AA03. Qua quá trình kháo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase các cao lá Xa kê và so sánh với hoạt tính ức chế của thuốc Arcabose thì cao EtOAc ức chế mạnh nhất. 64
  67. 5.2. KIẾN NGHỊ Do thời gian thực hiện đề tài và khả năng có hạn, chúng tôi chưa thực hiện một số mục tiêu khác, để phát triển đề tài theo hướng tiếp theo. Nếu có điều kiện chúng tôi đề nghị: - Nhận danh và xác định cấu trúc AA03. - Tiếp tục khảo sát các phân đoạn còn lại của cao EtOAc để phân lập các hợp chất có trong cao, làm giàu AA02. - Khảo sát thành phần hoá học cao n-Hexan, cao MeOH để phân lập và tinh chế các chất trong cao. - Thử hoạt tính các chất cô lập và tinh chế có hoạt tính để có thể ứng dụng vào sản xuất các thực phẩm chức năng, dược phẩm. 65
  68. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Phạm Văn Hiểu, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Viện dược liệu, tập II trang 702, 2003. [2] GS.TS Đỗ Tất Lợi, Những Cây Thuốc và Vị Thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, trang 783–786, 2004. [3] Nguyễn Công Đức, Khoa Y học cổ truyền, ĐH Y Dược, TP.HCM, Cây sa kê, Sài Gòn giải phóng, số 14, trang 4, 2000. [4] Nguyễn Hữu Duy Khang, Trần Thụy Thanh Xuân, Nguyễn Trung Nhân, Nghiên cứu thành phần hoá học của lá cây Xa kê (Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg, họ dâu tằm Moraceae, Luận văn đại học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Tp. HCM, 2010. [5] Nguyễn Thanh Tùng, Dương Thị Kim Yến, Nguyễn Ngọc Mai Trâm, Hoàng Sa, Nguyễn Trung Nhân, Nghiên cứu thành phần hoá học cao n-hexan của trái cây Xa kê (Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg, họ dâu tằm Moraceae, Luận văn đại học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Tp. HCM, 2010. [6] PGS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng, Các phương pháp tách chiết hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, 2007. [7] PGS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng, Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, 2005. [8] PGS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng, Khối phổ sử dụng trong phân tích hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, 2005. [9] Phạm Ngọc Ẩn, Phạm Thị Nhật Trinh, Mai Đình Trị, Lê Tiến Dũng, Nghiên cứu thành phần hoá học lá cây sa kê Artocarpus altilis (Park) Fosberg, Tạp chí hoá học T49 (64), trang 87-91, 2011. Tài liệu tiếng Anh 66
  69. [10] Adewole, S.O., Ojewole, J.O., Hyperglycaemic effect of Artocarpus communis Forst (Moraceae) root bark aqueous extract in Wistar rats, Cardiovascular Journal of Africa 18, 221–227, 2007. [11] Ashok D. Patil, Alan J. Freyer, Lew Killmer, Priscilla Offen, Paul B. Taylor, Bartholomew J. Votta, Randall K. Johnson , A New Dimeric Dihydrochalcone and a New Prenylated Flavone from the Bud Covers of Artocarpus altilis: Potent Inhibitors of Cathepsin K, Journal of Natural Products 65, 624-627, 2002. [12] Boonphong S., Baramee, A., Kittakoop, P., Puangsombat, P. Antitubercular and antiplasmodial prenylated flavones from the roots of Artocarpus altilis, Chiang Mai J Sci 34, 339–344, 2007. [13] Carine Marie-Magdeleine, Maurice Mahieu, Marie-Laure Lastel, Harry Archimede, In vitro evaluation of the nematicidal value of Artocarpus altilis (Parkinson) var. seminifera and non seminifera and Terminalia cattapa L. against Haemonchus contortus, Advances in Animal Biosciences, Vol 1, Issue 2, 440-441, 2010. [14] Chien-Chih Chen, Yu-Lin Huang, Jun-Chih Ou, Chwan-Fwu Lin, Tzu-Ming Pan, Three New Prenylflavones From Artocarpus Altilis, Journal of Natural Products, Vol.56, No.9, 1594-1597, 1993. [15] Chun-Nan Lin và Wen-Liang Shieh, Pyranoflavonoids from Artocarpus Communis, Phytochemistry, Vol.31, No.8, 2922-2924, 1992. [16] Deivanai S. và Subhash J. Bhore, Breadfruit (Artocarpus altilis Fosb.-An Underutilized and Neglected Fruit Plant Species, Middle-East Journal of Scientific 6 (5), 418-428, 2010. [17] Donsing P., Limpeanchob N., Viyoch J., Evaluation of the effect of Thai breadfruit’s heartwood extract on melanogenesis-inhibitory and antioxidation activities, Journal of Cosmetic Science 59, 41–58, 2008. [18] Fatemeh Fathiazada, Abbas Delazar, Roya Amiri và Satyajit D. Sarker, Extraction of Flavonoids and Quantification of Rutin from waste Tobacco Leaves, Iranian Journal of Pharmaceutical Research, Vol 3, 222-227, 2006. 67
  70. [19] Gowsala Pavanasasivam và M.Uvais S.Sultanbawa, Cycloartenyl acetate, Cycloartenol and Cycloartenone in the bark of Artocarpus species, Phytochemistry, Vol.12, 2725-2726, 1973. [20] Jing-Ru Weng, Sheng-Ching Chan, Yi-Huang Lu, Hsien-Cheng Lin, Horng- Huey Ko, Chun-Nan Lin, Antiplatelet prenylflavonoids from Artocarpus communis, Phytochemistry 67, 824-829, 2006. [21] Kai-Wei Lin, Chiung-Hui Liu, Huang-Yao Tu, Horng-Huey Ko, Bai-Luh Wei, Antioxidant prenylflavonoids from Artocarpus communis and Artocarpus elasticus, Food Chemistry 115, 558–562, 2009. [22] Koshihara, Y. Fujimoto, Y. Inoue H., A New 5-lipoxygenase Selective Inhibitor Derived from Artocarpus communis Strongly Inhibits Arachidonic Acid-Induced Ear Edema, Biochem Pharmacol., 37 (11), 2161-2165, 1988. [23] Kuniyoshi Shimizu, Ryuichiro Kondo, Kokki Sakai, Supanida Buabarn, Uraiwan Dilokkunanant, A geranylated chalcone with 5a-reductase inhibitory properties from Artocarpus incises, Phytochemistry 54, 737–739, 2000. [24] Lin JA, Fang SC, Wu CH, Huang SM, Yen GC, Anti-inflammatory effect of the 5,7,4’-trihydroxy-6-geranylflavanone isolated from the fruit of Artocarpus communis in S100B-induced human monocytes, J Agric Food Chem; 59(1), 105-111, 2011. [25] Lotulung PD, Fajriah S, Hanafi M, Filaila E, Identification of cytotoxic compound from Artocarpus communis leaves against P-388 cells, Pak J Biol Sci;11(21), 2517-2520, 2008. [26] Morton, Miami, FL, Fruits of warm climates, Julia F, 50-58, 1987. [27] Neela Badrie, Sophia Balfour, Kizza Ottley, Ivan Chang-Yen, Nutrient Composition of a Commonly Consumed West Indian Meal of Breadfruit (Artocarpus altilis Fosberg) Oil Down , Journal of Nutrition in Recipe & Menu Development, Vol 3, Issue 3-4, 2005. [28] Nomura, T., Hano, S. and Aida, M., Isoprenoid-Substituted Flavonoid from Artocarpus Plants (Moraceae), Heterocycles, 47 (2), 1179-1205, 1998. 68
  71. [29] N.R. Amarasinghe; U.L.B. Jayasinghe, Chemotaxanomic Significance of the Fruit Constituents of Artocarpus altilis, Proceedings of the Peradeniya University Research Sessions, Sri Lanka, Vol.12, Part I, 2007. [30] Nyee JC Zerega, Diane Ragone, Timothy J.Motley, Complex origins of breadfruit: implications for human migrations in oceania, American Journal of Botany 91, 760-766, 2004. [31] PDN. Lotulung, S.Fajriah, M.Hanafi, E.Filaila, Benzopyran Derivative from Dichloromethane Extracts of Artocarpus communis Leaves, Proceedings of The Henk Timmerman International Seminar on Pharmacochemistry, No. 979 3688 82 3 , 50-58, 2007. [32] Sastre C., Breuil A., Plantes, milieux et paysages des Antilles françaises. Ecologie, biologie, identification, protection et usages., Biotope, Mèze, 2007 [33] Shimizu, K. Fukuda, M. Kondo, R. Sakai, K., The 5α-reductase Inhibitory Components from Heartwood of Artocarpus incisus: Structure-activity Investigation, Planta Med., 66, 11-19, 2000. [34] Shimizu, K. Kondo, R. Sakai, K. Lee, SH. Sato, H., The Inhibitory Components from Artocarpus incisus on Melanin Biosynthesis, Planta Med., 64, 408- 412, 1998. [35] Siddesha J. M., D’Souza C. J. M., Viswanath B. S., Govil, J. N.,Singh, V. K, Inhibition of angiotensin converting enzyme (ACE) by medicinal plants exhibiting antihypertensive activity, Drug plants III, Recent Progress in Medicinal Plants, Vol 29, 269-308, ISBN 1-933699-19-1, 20103254396, 2010. [36] Singh PDA, Simon OR, Donaldson K., Investigation of the anti-inflammatory properties of leaves of Artocarpus altilis (breadfruit), West Indian Med J; Vol 50, 15, 2001. [37] Song-Chwan Fang, Chin-Lin Hsu, Yu-Shen Yu, Gow-Chin Yen, Cytotoxic Effects of New Geranyl Chalcone Derivatives Isolated from the Leaves of Artocarpus communis in SW 872 Human Liposarcoma Cells, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56, 8859–8868, 2008. 69
  72. [38] U.B. Jagtap, V.A. Bapat, Artocarpus: A review of its traditional uses, phytochemistry and pharmacology, Journal of Ethnopharmacology 129, 142-166, 2010. [39] Victor Kuete, Patrick Y Ango, Ghislain W Fotso, Gilbert DWF Kapche, Jean P Dzoyem, Arlette G Wouking, Bonaventure T Ngadjui, Berhanu M Abegaz, Antimicrobial activities of the methanol extract and compounds from Artocarpus communis (Moraceae), Kuete et al. BMC Complementary and Alternative Medicine, Vol 11, No.1, 6, 2011. [40] Wei, B.L., Weng, J.R., Chiu, P.H., Hung, C.F., Wang, J.P., Lin, C.N., Anti- inflammatory flavonoids from Artocarpus heterophyllus and Artocarpus communis, Journal of Agricultural and Food Chemistry 53, 3867–3871, 2005. [41] Wang Y., Deng, T., Lin, L., Pan, Y., Zheng, X., Bioassay guided isolation of antiatherosclerotic phytochemicals from Artocarpus altilis, Phytotherapy Research 20, 1052–1055, 2006. [42] Williams, L.A.D.; Mansingh, Ajai , Insecticidally active triterpene from Artocarpus altilis Park , Philippine Journal of Science, Vol 124, Issue 4, 345-357, 1995. [43] Yanbin Lu, Cuirong Sun, Yu Wang, Yuanjiang Pan, Two-dimensional counter- current chromatography for the preparative separation of prenylflavonoids from Artocarpus altilis, Journal of Chromatography A, 1151, 31–36, 2007. [44] Yu Wanga, Kedi Xua, Lin Lin, Yuanjiang Pan, Xiaoxiang Zheng, Geranyl flavonoids from the leaves of Artocarpus altilis, Phytochemistry, Vol 68, Issue 9, 1300–1306, 2007. 70
  73. PHỤ LỤC 1: Phổ AA01 Phụ lục 1.1: Phổ 13C NMR AA01 C13 CPD - MeOD - AA01
  74. Phụ lục 1.2: Phổ DEPT AA01 &DEPT C13 CPD - MeOD - AA01 ii
  75. Phụ lục 1.3: Phổ 1H NMR AA01 1H - MeOD - AA01 iii
  76. Phụ lục 1.4: Phổ 1H NMR AA01 1H - MeOD - AA01 iv
  77. Phụ lục 1.5: Phổ 1H NMR AA01 v
  78. 1H - MeOD - AA01 Phụ lục 1.6: Phổ COSY AA01 AA01-MeOD-COSYGP vi
  79. Phụ lục 1.7: Phổ HMBC AA01 AA01-MeOD-HMBC viii
  80. Phụ lục 1.8: Phổ HSQC AA01 AA01-MeOD-HSQC ix