›

Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn nước của loài đơn châu chấu (Aralia armata)

pdf 52 trang thiennha21 15/04/2022 5250
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn nước của loài đơn châu chấu (Aralia armata)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_thanh_phan_hoa_hoc_phan_doan_nuoc_cua_loa.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn nước của loài đơn châu chấu (Aralia armata)

  1. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC  NGUYỄN THỊ THÚY KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN NƢỚC CỦA LOÀI ĐƠN CHÂU CHẤU (ARALIA ARMATA) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ HÀ NỘI-2018
  2. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC  NGUYỄN THỊ THÚY KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN NƢỚC CỦA LOÀI ĐƠN CHÂU CHẤU (ARALIA ARMATA) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. PHẠM HẢI YẾN HÀ NỘI-2018
  3. LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn tới TS. Phạm Hải Yến - phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng và giúp đỡ em trong suốt thời gian em làm đề tài khóa luận tốt nghiệp. Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đối với ThS Nguyễn Anh Hƣng người đã tận tình hướng dẫn, dạy bảo em trong suốt những năm học tại trường đại học và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin gửi lời cảm ơn tới các anh, chị Viện Hóa sinh biển đã chỉ bảo và tạo điều kiện cho em học tập, nghiên cứu đề hoàn thiện tốt khóa luận. Qua đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong khoa Hóa học -Trường đại học Sư Phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ, dạy dỗ em trong quá trình học tập ở trường. Xin cảm ơn tất cả bạn bè, người thân đã động viên, khích lệ giúp tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận. Khóa luận tốt nghiệp của em không tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được sự góp ý chỉ bảo của các thầy cô và các bạn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Thúy
  4. LỜI CAM ĐOAN Đề tài “Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn nƣớc của loài đơn châu chấu (Aralia armata)” là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Phạm Hải Yến. Các kết quả, số liệu nêu trong khóa luận này là trung thực, được làm từ thực nghiệm tại phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các kết quả không trùng với các kết quả đã được công bố trước đây. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Thúy
  5. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Nghiên cứu tổng quan về loài đơn châu chấu 3 1.1.1. Thực vật học 3 1.1.2. Mô tả cây 3 1.1.3. Phân bố và sinh thái 4 1.1.4. Bộ phận dùng 4 1.1.5. Tính vị và công dụng 4 1.1.6. Thành phần hóa học 6 1.2. Các phương pháp chiết mẫu thực vật 12 1.2.1. Chọn dung môi chiết 12 1.2.2. Quá trình chiết 14 1.3. Tổng quan về phương pháp sắc kí 15 1.4. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ . 19 1.4.1 phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy-IR) 19 1.4.2 Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy- MS) 19 1.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy- NMR) 20 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. Mẫu thực vật 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu 23 2.2.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất 23 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 24 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 25
  6. 3.1. Phân lập các hợp chất 25 3.2. Hằng số vật lí và dữ liệu phổ các chất 26 3.2.1. Hợp chất 1: Chikusetsusaponin IVa 26 3.2.2. Hợp chất 2: Chikusetsusaponin IV 26 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN 27 4.1. Xác định cấu trúc hợp chất 1 27 4.2. Xác định cấu trúc hợp chất 2 33 KẾT LUẬN 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41
  7. DANH PHÁP CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Carbon - 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 1H-1H-COSY 1H-1H Chemical Shif Correlation Spectroscopy 2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Tow-Dimensional NMR CC Sắc ký cột Column Chromatography DEPT Distortionless Ebhancement by Polarisation Transfer ESI-MS Phổ khối lượng phun điện tử Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy FI-MS Phổ khối lượng ion hóa thường Field Ionization HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Connectivity HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence HR-FAB-MS Phổ khối lượng phân giải cao bắn phá nguyên tử nhanh High Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography
  8. DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH BẢNG Bảng 4.1 : Số liệu phổ của hợp chất 1 (AA-W2B1) và chất tham khảo 31 Bảng 4.2 : Số liệu phổ của hợp chất 2 (AA-W2A1) và chất tham khảo 37 HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh cây và hoa của cây đơn châu chấu 4 Hình 3.1: Sơ đồ phân lập phân đoạn nước của cây đơn châu chấu 25 Hình 4.1.1 : Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 28 Hình 4.1.2 : Các tương tác HMBC chính của hợp chất 1 28 Hình 4.1.3 : Phổ proton 1H của hợp chất 1 29 Hình 4.1.4 : Phổ cacbon 13C của hợp chất 1 29 Hình 4.1.5 : Phổ DEPT của hợp chất 1 30 Hình 4.1.6 : Phổ HMBC của hợp chất 1 30 Hình 4.1.7 : Phổ HSQC của hợp chất 1 31 Hình 4.2.1 : Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 34 Hình 4.2.2 : Các tương tác HMBC chính của hợp chất 2 34 Hình 4.2.3 : Phổ proton 1H của hợp chất 2 35 Hình 4.2.4 : Phổ cacbon 13C của hợp chất 2 35 Hình 4.2.5 : Phổ DEPT của hợp chất 2 36 Hình 4.2.6 : Phổ HMBC của hợp chất 2 36 Hình 4.2.7 : Phổ HSQC của hợp chất 2 37
  9. MỞ ĐẦU Khoa học ngày càng phát triển để phục vụ nhu cầu nâng cao đời sống vật chất và tinh thần của con người. Nhưng bên cạnh mặt tích cực đó thì con người cũng đang phải đối đầu với nguy cơ mắc nhiều bệnh hiểm nghèo. Nguyên nhân đó là do môi trường sống của con người đang bị ô nhiễm nặng nề: ô nhiễm không khí, ô nhiễm nước, ô nhiễm đất, Từ đó đòi hỏi con người phải nghiên cứu, tìm tòi ra các loại thuốc có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên cho hiệu quả cao, ít tác dụng phụ, ít độc tính lại dễ tìm kiếm trong tự nhiên làm nguồn nguyên liệu để ứng dụng trong y học, nông nghiệp và phục vụ các mục đích khác cho con người. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa có khí hậu nóng ẩm, lượng mưa hàng năm lớn, có nhiều đồi núi chia cắt nên điều kiện khí hậu rất đa dạng, khí hậu đặc trưng cho từng vùng.Những yếu tố trên đã tạo nên nguồn tài nguyên sinh vật vô cùng dồi dào, đặc biệt là hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Theo ước tính Việt Nam có khoảng 12000 loài thực vật, trong đó có khoảng 4000 loài cây thuốc quý mọc tự nhiên. Đây là nguồn nguyên liệu có giá trị về mặt kinh tế phục vụ cho việc chữa nhiều loại bệnh khác nhau. Trong vài thập kỷ gần đây, xu hướng sử dụng các sản phẩm thuốc và thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thực vật tự nhiên để phòng và trị bệnh đã và đang trở lên thịnh hành trên thế giới. Ngoài sự phát triển của y học hiện đại thì trong dân gian vẫn lưu truyền các bài thuốc quý về các loại thảo dược để chữa bệnh. Những bài thuốc này đóng một vai trò quan trọng là tiền đề cho sự phát triển của ngành y học ngày nay. Như vậy, việc hòa hợp hai nền y học cổ truyền và y học hiện đại là xu thế tất yếu của thời đại nhằm giải quyết những khó khăn trong y học. Trong những bài thuốc cổ truyền hay được nhân dân sử dụng thì cây Đơn châu chấu (Aralia armata) được biết đến với nhiều tác dụng khác nhau: 1
  10. làm thuốc trị các bệnh phong thấp tê bại, phù thũng,lá và rễ dùng để trị rắn cắn. Rễ sắc uống và ngâm chữa bệnh ở cổ họng, viêm amidal, thấp khớp. Ngoài ra, rễ còn được dùng để trị các chứng viêm gan cấp, viêm bạch hầu, viêm sưng vú và vết thương do bị dao chém. Lá giã ra để đắp chữa mụn nhọt, phần lá non có thể luộc ăn thay rau [2], [31]. Do vậy, nó là một loài cây thuốc quý, cần được nghiên cứu để giải thích các tác dụng chữa bệnh của cây cũng như tạo điều kiện để các nhà khoa học tìm ra các phương thuốc chữa bệnh khác cho con người. Xuất phát từ mục đích muốn góp phần hiểu biết và bổ sung thêm vào giá trị sử dụng của loài cây này mà tôi quyết định chọn đề tài khóa luận là: “Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn nƣớc của loài đơn châu chấu (Aralia armata)” Nhiệm vụ chính của đề tài là: 1. Thu mẫu cây đơn châu chấu (Aralia armata), xử lý mẫu và tạo dịch chiết. 2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được 3. Phân lập các hợp chất trong phân đoạn nước từ cây đơn châu chấu. 2
  11. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Nghiên cứu tổng quan về loài đơn châu chấu 1.1.1. Thực vật học Cây đơn châu chấu được phân loại thực vật học theo cách xác định như sau [32]: Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Cornales Họ : Araliaceae Chi : Aralia Loài: Aralia armata 1.1.2. Mô tả cây - Đặc điểm thực vật học: Cây đơn châu chấu hay còn được gọi với các tên khác như: cây cuồng, rau gai (Thái Nguyên), độc lực, cẩm giàng (Lạng Sơn), đinh lăng gai, cây đuống, cây răng, lổ cổ, rau gai, Nó có tên khoa học là Aralia armata (wall) Seem, thuộc họ Ngũ gia bì -Araliaceae. - Đặc điểm sinh thái: + Dạng cây: cây nhỏ, cao 1-2m, có thân mảnh, mang nhiều gai cong quắp, mọc lòa xòa. + Lá lớn, kép 2-3 lần lông chim, có 9-11 lá chét có phiến lá chét hình trứng dài 4-8 cm, rộng 2-3 cm, nhọn ở đầu, phía cuống hơi tròn, mép có răng cưa, nhẵn cả hai mặt, nhưng trên gân có những gai nhỏ, cuống lá có bẹ. + Hoa chùm gồm nhiều tán dài, cuống hoa có gai. Hoa nhỏ, màu lục, vàng nhạt. + Quả hạch hình tròn, màu đen. 3
  12. - Mùa hoa quả tháng 7-9 [1], [31], [32]. Hình 1.1: Hình ảnh cây và hoa của cây Đơn châu chấu 1.1.3. Phân bố và sinh thái Loài của vùng Himalaia, lan tràn sang Ấn Độ, Mianma, Nam Trung Quốc, Lào, Việt Nam và Malaixia. Ở Việt Nam: cây đơn châu chấu mọc hoang tại nhiều nơi trong nước ta chủ yếu tại các tỉnh miền núi như Lào Cai, Hà Giang, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Hòa Bình, Ninh Bình, Nghệ An, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Lâm Đồng. Cây mọc nơi có ánh sáng, ẩm, dọc theo các đường mòn ven rừng, các bờ suối, các nơi hoang vắng, các nương rẫy cũ [2], [30]. 1.1.4. Bộ phận dùng Rễ, vỏ rễ và lá- Radix, Cortex Radicis et Folium Araliae armata. Rễ thu hái quanh năm, rửa sạch, phơi khô. Lá non thường dùng tươi. 1.1.5. Tính vị và công dụng - Tính vị: Vị cay, hơi đắng, tính ấm - Công dụng: Vỏ rễ, rễ thường dùng chữa các chứng viêm như viêm gan cấp, viêm họng, viêm amygdal, viêm bạch cầu, viêm khớp, viêm thận phù thũng, viêm 4
  13. sưng vú. Cũng được dùng chữa phong thấp tê bại, dao chém thương tích, sốt rét cơn và rắn cắn. Lõi thân dùng làm thuốc bổ. Lá non dùng làm rau ăn (do có nhiều gai nên gọi là lá rau gai). Lá dùng đắp mụn nhọn. Nhựa của nõn non dùng chấm làm tan chắp lẹo ở mắt. Quả sao khô, tán bột thổi vào mũi chống ngạt mũi [2], [31] Ngoài ra, vỏ rễ đơn châu chấu có nhiều tác dụng: chống viêm, đặc biệt tác dụng ức chế khá mạnh giai đoạn mạn tính của phản ứng viêm; gây thu teo tuyến ức rõ rệt, kích thích sự chuyển dạng lympho bào trong thí nghiệm nuôi cấy trong ống nghiệm; có tác dụng nội tiết kiểu oestrogen trên động vật thí nghiệm; kháng khuẩn đối với phế bào khuẩn và liên cầu khuẩn tan máu; các saponin triterpen và genin acid oleanolic từ rễ đơn châu chấu là thành phần có hoạt tính chống viêm cấp, viêm mạn và gây thu teo tuyến ức chuột cống trắng đực non. Đồng bào vùng núi thường lấy lá non, chồi non về luộc hay xào ăn như các loại rau khác. Có thể tước bỏ gai trước khi xào, nhưng ở những nõn non thì sau khi xào gai cũng trở nên mềm. Để làm thuốc, thường dùng 10-30g rễ khô sắc nước uống, dùng riêng hoặc phối hợp với các vị thuốc khác. Đơn thuốc: 1. Viêm khớp: Rễ đơn châu chấu 10-30g sắc uống, thường phối hợp với xà cừ và mặt quỷ. 2. Bạch hầu, bí đái: Dùng 8-12g rễ cây sắc nước uống 3. Rắn cắn: Vỏ rễ giã lấy nước uống, bã đắp. 4. Chữa sưng vú, áp xe vú: lấy 20-30g vỏ rễ cẩm ràng, để tươi, rửa sạch, giã nhỏ với muối, trộn với ít nước vo gạo đặc, bọc trong một miếng vải sạch, hơ nóng, đắp và băng lại. Có thể phối hợp với rễ cây trôm (hay cây sảng), lá mua non, lá bồ công anh, lá kim ngân với liều lượng bằng nhau. Dùng 3-4 ngày [32]. 5
  14. 5. Chữa ho lâu ngày, viêm họng, viêm amidan: vỏ rễ khô cẩm ràng 8- 12g, vỏ cây khế chua 20g thái nhỏ, sắc với 400ml nước còn 100ml, uống làm 2 lần trong ngày. 6. Chữa viêm nhiễm sưng tấy chưa thành mủ: lá non cẩm ràng rửa sạch 10-20g giã nhỏ với ít muối, sao nóng, đắp lên vết thương. Ngoài ra, vỏ rễ cẩm ràng 12g phối hợp với rễ cây ngấy tía 8g, rễ cây han tía 8g. Tất cả thái nhỏ, phơi khô, sắc uống chữa hen; với rễ cây thóc lép 10g, lá cối xay 8g, sao vàng, sắc uống chữa phù thũng [32]. 1.1.6. Thành phần hóa học Những nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chỉ ra thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Aralia L. chủ yếu thuộc nhóm chất saponin triterpen, đây là một nhóm chất có nhiều hoạt tính sinh học lý thú. Nghiên cứu về các loài thuộc chi Aralia L. được bắt đầu vào khoảng cuối những năm 80 của thế kỉ XX. Năm 1988, Hernandez và cộng sự đã phát hiện tác dụng kháng viêm dạ dày từ dịch chiết rễ của loài A. elata [13]. Năm 1994, từ vỏ rễ loài A. elata đã được Sakai và cộng sự phân lập và xác định cấu trúc của 3 hợp chất saponin mới dưới dạng methyl hóa và được đặt tên là tarasaponin I-III methyl ester (1-3), cùng 4 hợp chất đã biết [14]. Cũng trong năm 1994, Satoh và cộng sự đã thông báo xác định được cấu trúc của 5 hợp chất saponin mới, glycoside acid oleanolic, tarasaponin III-VII (4-8) từ vỏ rễ loài A. elata [15]. Từ loài này, Yoshikawa và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 6 saponin mới elatoside E, G, H, I, J và K (9-14). Các hợp chất này được phát hiện có khả năng hạ đường huyết mạnh [16]. 6
  15. Ngoài ra, bốn hợp chất mới: aralia-saponin I-IV (15-18) cũng được phân lập và xác định cấu trúc từ loài A. elata [17]. Zhang và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 4 saponin mới (19-22) từ loài A. elata. Các hợp chất này đã được phát hiện có khả năng 8
  16. kháng sự phát triển của các dòng tế bào ung thư: HL-60, A-549 và DU-145 [18]. Cũng liên quan đến hoạt tính diệt tế bào ung thư, Tomatsu và cộng sự đã phát hiện ra một protein, aralin từ loài A. elata có khả năng diệt tế bào ung thư mạnh [19]. Protein này có khả năng kháng sự phát triển các tế bào ung thư theo cơ chế tự chết [20]. Một hợp chất triterpenoid saponin, oleanolic acid 3- O-β-D-glucopyranosyl(1 3)-α-L-rhamnopyranosyl(1 2)-α-L-arabinopyranoside từ loài A. elata cũng được thông báo có tác dụng kháng viêm mạnh. Vào năm 1995, Fang và cộng sự đã phân lập được 1 hợp chất mới đặt tên là armatosid và 10 hợp chất đã biết từ loài A. armata [5]. Từ rễ loài A. decaisneana, Miyase và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 18 hợp chất mới, được đặt tên là araliasaponin I-XVIII (23-39) [21], [22]. 9
  17. Từ loài A. dasyphylla var. latifolia Miq., Xiao và cộng sự đã phân lập được 1 hợp chất mới (40) và hợp chất này thể hiện khả năng kháng sự phát triển của các dòng tế bào ung thư mạnh [24]. Zou và cộng sự đã phát hiện ra 2 hợp chất mới có mặt ở loài A. subcapitata: subcapitatoside B (41) và C (42) [25]. 10
  18. Từ rễ loài A. spinifolia, Yu và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 2 hợp chất mới được đặt tên là aralosid H-J (43-44) cùng 4 hợp chất đã biết [26]. Dịch chiết loài A. mandshurica được phát hiện có tác dụng chống béo phì. Kết quả này dựa trên nghiên cứu 32 bệnh nhân ngẫu nhiên [29]. Acid continentalic từ loài A. continentalis đã thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh [28]. Từ loài, A. elata, Nhiệm và cộng sự đã thông báo phân lập được 2 hợp chất mới thuộc khung saponin triterpen nhóm oleanan là tarasaponin IV (45) và elatosid L (46) cùng với 4 hợp chất đã biết. Các hợp chất đều được nghiên cứu tác dụng kháng viêm, kết quả cho thấy elatosid L và elatosid D thể hiện hoạt tính với giá trị IC50 lần lượt là 4,1 µM và 9,5 µM [27]. 11
  19. 1.2. Các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật 1.2.1. Chọn dung môi chiết Tùy thuộc vào đối tượng chất có trong mẫu mà người ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau. Các dung môi dùng trong quá trình chiết phải được lựa chọn một cách cẩn thận. Yêu cầu với dung môi dùng trong quá trình chiết: Nó phải hòa tan những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, khó bốc cháy. Trước khi được sử dụng làm dung môi chiết những dung môi này nên được chưng cất để loại bỏ tạp chất ta sẽ thu được dang sạch trước khi sử dụng nếu chúng có lẫn các chất có thể gây ảnh hưởng tới chất lượng của quá trình chiết. Có một số chất dẻo thường lẫn trong dung môi như điankyl phtalat, tri-n-butyl- axetycitrat và tributylphotphat (bị lẫn trong quá trình sản xuất dung môi hoặc khâu bảo quản dung môi do các dung môi thường được đựng trong các thùng chứa bằng nhựa hoặc các nút nhựa). Một số dung môi thường được sử dụng: Người ta hay sử dụng clorofom, metylen và metanol là những dung môi trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như lá, thân, rễ, củ, quả, hoa. Tuy nhiên, metanol và clorofom thường chứa diotylphtalat [đi-(2- etylhexyl)phatlat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat], nó sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật. Ngoài ra chất này còn thể hiện hoạt tính trong quá trình thực nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Những tạp chất thường lẫn trong clorofom như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với một số hợp chất như các ankanoit tạo muối bậc 4. Tương tự như vậy sự có mặt của HCl có thể gây ra sự phân hủy, sự khử nước hay sự đồng phân hóa các hợp chất khác. Do clorofom có thể gây tổn thương do gan và 12
  20. thận nên khi sử dụng nó các thao tác phải cẩn thận khéo léo làm ở những nơi khô thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofom. Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn clorofom. Do khả năng phân cực của clorofom thấp hơn nên nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Trái lại các dung môi thuộc nhóm rượu phân cực hơn nên sẽ thấm tốt hơn qua màng tế bào. Phần lớn các ancol là các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp do vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hòa tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có thể được xem là dung môi có những đặc tính tốt nhất trong quá trình chiết sơ bộ. Tuy nhiên khi dùng metanol trong quá trình chiết cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành. Ví dụ như techlonolide A thu được từ Technonaetes laciniata được chuyển hóa thành trechonolode B bằng quá trình metyl hóa khi đun nóng với metanol chứa một ít axit và quá trình phân hủy 1- hydroxyltropacocain cũng xảy ra khi Erythroxylum novogranatense được chiết trong metanol nóng. Người ta thường ít sử dụng nước để thu dung dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của metanol. Đietyl ete là chất rất dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc đồng thời nó có xu hướng tạo ra peroxit dễ nổ, peroxit của đietyl ete dễ gây ra phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Do vậy mà hiếm khi đietyl ete được sử dụng trong quá trình chiết thực vật. Ngoài ra axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit. Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazo thường được sử dụng đối với các quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit-bazo có thể tạo ra các sản phẩm mong muốn. 13
  21. Trong cây thường các chất chuyển hóa thứ cấp sẽ có độ phân cực khác nhau. Khi biết và hiểu được những đặc tính hoặc những chuyển hóa thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó có thể lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết tránh được sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn. Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 300C-400C, với một vài hóa chất có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. 1.2.2. Quá trình chiết Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau: - Chiết ngâm - Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet - Chiết sắc với dung môi nước - Chiết lôi cuốn theo hơi nước Một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vất là chiết ngâm bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh có khóa ở dưới đáy để tạo tốc độ chảy cho quá trình tách rửa dung môi, dung môi nóng hoặc lạnh. Trước kia, máy chiết ngâm thường được làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thủy tinh. Mẫu thực vật được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ và sau đó chất chiết được lấy ra. Lưu ý rằng sau một quá trình chiết 3 lần dung môi, cặn thu được không còn chứa những chất giá trị nữa. Có thể xác định sự kết thúc quá trình chiết bằng một số cách như: khi chiết các ankaloit ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của nhiều hợp chất này ra khỏi bình chiết bằng sự tạo thành kết tủa với các tác nhân đặc trưng như Dragendorff và Mayer. Hay các flavoloid thường là những chất màu bởi vậy khi dịch chảy mà không có màu sẽ đánh dấu là đã rửa hết những chất này trong quá trình chiết. Hoặc 14
  22. khi chiết các chất béo, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết. Trong trường hợp các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde có thể được sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với anilin axetat sẽ cho sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc. Như vậy tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi chiết thích hợp và lựa chọn phương pháp chiết hợp lý để đạt được kết quả cao trong quá trình nghiên cứu. Ngoài ra có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các hợp chất mà ta có thể thu được một số hợp chất ngay trong quá trình chiết [9] [10] [11]. 1.3. Tổng quan về phƣơng pháp sắc kí Phương pháp sắc kí (chromatography) là một trong những phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiên nay, được sử dụng trong việc phân lập các chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự khác nhau về ái lực giữa các chất cần tách với chất hấp thụ. Độ phân cực của dung môi tăng dần từ ete dầu hỏa đến nước. Sắc kí bao gồm pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với các tính chất của chúng (tính bị hấp thụ, tính tan, ). Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, quá trình hấp thụ và phản hấp thụ sẽ lặp đi lặp lại. Kết quả là chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ sắc kí so với chất tương tác yếu hơn ở pha này. Dựa vào đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí. Trên thế giới hiện nay chủ yếu sử dụng pha tĩnh là chất rắn (bao gồm các loại chất hấp thụ như silicagel, YMC, ODS, Al2O3 ) còn pha động được 15
  23. sử dụng là các chất lỏng (sắc kí lỏng), hay chất khí (sắc kí khí). Pha động được dùng trong sắc ký lỏng là các dung môi hữu cơ, trên nguyên tắc là chất phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi phân cực hơn và ngược lại chất ít phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi kém phân cực hơn. Phân loại các phương pháp sắc kí Tùy thuộc vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành 2 loại chính: - Sắc kí khí - Sắc kí lỏng Còn dựa vào cách tiến hành sắc kí người ta chia thành các phương pháp sắc kí chủ yếu sau: - Sắc kí cột (CC) Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, chất hấp thụ là pha tĩnh bao gồm các loại silicagel (có độ hạt khác nhau) pha thường cũng như pha đảo YMC, ODS, Dianion Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy tinh hay kim loại nhưng phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn do đó khả năng tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có độ hạt càng nhỏ thì tốc độ dòng chảy càng giảm. Trog một số trường hợp lực trọng trường không đủ lớn sẽ gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được) khi đó người ta phải sử dụng áp suất với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC). Trong sắc kí cột, tỉ lệ chiều cao cột (L) so với đường kính cột (D) rất quan trọng, tỉ lệ này còn thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách nghĩa là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc kí tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi 16
  24. được gọi là Rf , các chất khác nhau sẽ có Rf khác nhau. Dựa vào sự khác nhau về Rf mà người ta có thể tách được từng chất ra khỏi hỗn hợp chất. Ngoài ra tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp thụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách. Chẳng hạn nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (từ 1/5-1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tùy vào hệ số tách (tức là phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất) hệ số này dao động trong khoảng 1/20-1/30. Việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng trong sắc kí cột tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì người ta phải tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn sau đó mới đưa lên cột. Nếu tách tinh thì người ta thường đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với một lượng tối thiểu. Việc nhồi cột (bằng chất hấp phụ) cũng hết sức quan trọng. Có hai phương pháp đưa chất hấp phụ lên cột: 1. Phương pháp nhồi cột khô: Chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột (cột đã được rửa sạch bằng hỗn hợp sunfocromic, sấy khô và lót bông thủy tinh ở dưới) sau đó dùng đũa thủy tinh có bọc cao su gõ nhẹ lên thành cột đến khi chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột không nén xuống được nữa. Tiếp đên dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt. 2. Phương pháp nhồi cột ướt Cho chất hấp phụ vào dung môi (thường dùng là dung môi rửa cột sau này) trộn thành bột nhão sau đó đổ vào vào cột đến khi đủ lượng cần thiết. Phương pháp này có ưu điểm là dễ đồng đều trên cột, không hay bị nứt cột khi chạy. Lưu ý khi chuẩn bị cột phải không có bọt khí trong cột (nếu có bọt khí sẽ gây nên hiện tượng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và dung môi phải khô, cột không được nứt, gãy, dò, thời gian để cột ổn định phải mất 10- 12 giờ mới dùng được. 17
  25. Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến kết quả tách. Nếu tốc độ chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ chảy quá nhỏ sẽ kéo dài thời gian tách ảnh hưởng đến tiến độ công việc. Ngày nay để chạy nhanh, tách nhanh các chất người ta dùng phương pháp sắc kí cột nhanh có hệ thống bơm đẩy trộn dung môi tự động, lấy mẫu tự động dựa vào phổ tử ngoại. Thời gian để tách rất nhanh, chính xác. Sắc kí bản mỏng (TLC) Phương pháp dùng chất hấp phụ tráng thành lớp trên kính để phân tích hay tinh chế các chất gọi là sắc ký bản mỏng. Sắc kí bản mỏng được dùng để phân tích định tính, định lượng và tinh chế các chất hay cũng có thể dùng để theo dõi quá trình chạy cột sắc kí. Chất hấp phụ thường là silicagel. Việc sử dụng sắc kí bản mỏng điều chế (bản được tráng sẵn silicagel dày hơn) có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc kí có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiên màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%. Đối với sắc kí bản mỏng việc lựa chọn nội dung môi hay hệ dung môi chạy sắc kí cho Rf tốt rất quan trọng. Nếu kiểm tra độ tinh khiết và định tính phải có Rf 0,7, vệt tròn và sắc nét. Còn để khảo sát hỗn hợp hay theo dõi tiến trình phản ứng thì chọn dung môi sao cho các vệt tròn, sắc nét, rải đều trên toàn bản và có Rf càng xa nhau càng tốt. Kết quả chạy sắc kí bản mỏng phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện chạy sắc kí. Lượng dung môi cho vào bình sao cho không ngập vết chấm trên bản. cho bản vào bình một cách dứt khoát và không nhắc đi nhắc lại làm lở chân bản mỏng gây ảnh hưởng đến kết quả. Trong suốt quá trình chạy không nên xê dịch bình từ chỗ này sang chỗ khác. Theo dõi quá trình chạy sắc kí, không để dung môi chạy hết bản [3] [9]. 18
  26. 1.4. Một số phƣơng pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ Để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ người ta thường dùng các phương pháp phổ kết hợp. Các chất khác nhau nên người ta sẽ sử dụng phương pháp phổ cụ thể cho từng chất. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất một số trường hợp người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa hóa học, các phương pháp sắc kí so sánh [4] 1.4.1 Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy-IR) Phổ hồng ngoại được xây dựng nhờ vào sự khác nhau vê dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ hồng ngoại mà người ta có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khoảng 1700-1750 cm-1. 1.4.2 Phổ khối lƣợng (Mass Spectroscopy- MS) Nguyên tắc của phương pháp phổ này dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hóa học của hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng nhưng có những phương pháp chủ yếu sau: 1. Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV. 2. Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy) được gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá 19
  27. thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là các pic ion phân tử và các pic đặc trung cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp dễ bị phá vỡ. 3. Phổ FAB ( Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở mức năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử. 4. Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao. Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc kí với khối phổ khác như: GC-MS (sắc kí khí-khối phổ), LC-MS (sắc kí lỏng- khối phổ). Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược). 1.4.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân ( Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy-NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được xem như là một trong những phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lí chung của các phương pháp phổ (phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân tử (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling). Phổ 1H-NMR Trong phổ 1H-NMR độ dịch chuyển hóa học () của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của 20
  28. nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. từ những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất. Phổ 13C-NMR Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, dải thang đo rộng 0-23ppm. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc 4 biến mất. với phổ DEPT 1350 thì tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 nằm về một phía. Còn đối với phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH. Phổ 2D-NMR Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định tương tác của các hạt nhân từ của phân tử không gian hai chiều. Thường sử dụng một số kỹ thuật chủ yếu như sau: + Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trực tiếp trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác HMQC năm trên đỉnh các ô vuông trên phổ. + Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shif Correlation Spectroscopy): phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau. + Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong không gian phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc. 21
  29. + Phổ NOESy (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): phổ biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử. Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kĩ thuật phổ NOE differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cùng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu phổ có cường độ mạnh hơn. Ngoài ra, người ta còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơnghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể. Nhưng phổ này có phạm vi sử dụng hạn chế vì yêu cầu tiên quyết là cần phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ. Như đã đề cập ở trên, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp chuyển hóa hóa học cũng như các phương pháp phân tích, so sánh, kết hợp khác. Đặc biệt đối với phân tử có nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định chính xác được chiều dài các mạch. Hay đối với các phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thủy phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến [3] [12]. 22
  30. CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật Mẫu Đơn châu chấu Aralia armata (Wall) Seem được thu hái ở Cao Bằng tháng 7/2017. Mẫu được giám định bởi TS. Bùi Văn Thanh, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật. Tiêu bản được lưu trữ tại phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp xử lý và chiết mẫu Lá loài A. armata được thái nhỏ, phơi khô, nghiền mịn thu được 2,4 kg bột khô. Bột này được ngâm chiết với metanol (3 lần x 5,0 lít) bằng thiết bị chiết siêu âm (ở 50oC, mỗi lần 30 phút). Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 130 g cặn chiết metanol. Cặn chiết này được phân bố vào 2 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với CH2Cl2 và etyl axetat, loại bỏ dung môi bằng máy cô quay dưới áp suất thấp thu được các phân đoạn CH2Cl2 (AA-C: 22,0 g), etyl axetat (AA-E: 9,8 g) và nước (AA-W: 85,0 g). 2.2.2. Phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất Để phân tích và phân tách các phần chiết của cây cũng như phân lập các hợp chất, các phương pháp sắc ký đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát), sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột pha đảo. - Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 và RP18 F254 (Merck-Đức). Các vết chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao cho đến khi hiện màu. 23
  31. - Sắc ký cột (CC) được tiến hành với chất hấp phụ pha thường (Silica gel 240-430 mesh, Merck) hoặc pha đảo (ODS-60-14/63, Fujisilisa-Nhật Bản). 2.2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất Cấu trúc hóa học của các hoạt chất được xác định bằng các phương pháp phổ kết hợp như : phổ khối lượng (ESI-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR). - Phổ khối lượng (ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1200 LC- MSD Trap, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AM500 FT- NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 24
  32. CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1. Phân lập các hợp chất Dịch nước, sau khi cất quay loại bỏ dung môi etyl axetat lẫn trong dịch nước, được đưa lên cột Diaion HP-20, loại bỏ đường bằng nước sau đó tăng dần nồng độ methanol trong nước (25, 50, 75 và 100% MeOH) thu được 4 phân đoạn, AA-W1− AA-W4. Phân đoạn nước Sắc kí cột Diaion HP-20 Metanol/nước (25, 50, 75 và 100% MeOH) AA-W1 AA-W2 AA-W3 AA-W4 Sắc kí cột silicagel CH2Cl2/ axeton/nước (1/4/0,2; v/v) AA-W2A AA-W2B Sắc kí cột silicagel pha thường Sắc kí cột silicagel pha đảo CH2Cl2/MeOH/nước (4/1/0,1; v/v) RP-18 MeOH/H2O (2/5; v/v) Hợp chất 2 Hợp chất 1 (18,0 mg) (15,0 mg) Hình 3.1 : Sơ đồ phân lập phân đoạn nƣớc cây Đơn châu chấu Phân đoạn AA-W2 được phân tách bằng cột sắc kí silicagel với hệ dung môi CH2Cl2/axeton/nước (1/4/0,2; v/v) thu được 2 phân đoạn nhỏ hơn là AA- W2A và AA-W2B. Phân đoạn AA-W2B tiếp tục được phân tách trên cột 25
  33. silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH/H2O (2/5; v/v) thu được hợp chất 1 (15,0 mg). Phân đoạn AA-W2A được phân tách bằng cột sắc kí silica gel pha thường với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/nước (4/1/0,1; v/v) thu được hợp chất 2 (18,0 mg). 3.2. Hằng số vật lí và dữ liệu phổ các chất 3.2.1. Hợp chất 1: Chikusetsusaponin IVa - Công thức phân tử: C42H66O14 - Khối lượng phân tử: M = 794 1 13 - H-NMR (500 MHz, CD3OD) và C-NMR (125 MHz, CD3OD) xem bảng 4.1. 3.2.2. Hợp chất 2 (AA-W2A1) : Chikusetsusaponin IV - Công thức phân tử: C47H74O18 - Khối lượng phân tử : M = 927 1 13 - H-NMR (500 MHz, CD3OD) và C-NMR (125 MHz, CD3OD) xem bảng 4.2. 26
  34. CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Xác định cấu trúc hợp chất 1 Hợp chất 1 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H-NMR của 1 cho biết sự xuất hiện tín hiệu của 1 proton olefin tại δH 5,27 (br s), 7 nhóm methyl bậc 3 tại δH 0,82 (3H, s), 0,87 (3H, s), 0,93 (3H, s), 0,96 (6H, s), 1,07 (3H, s) và 1,18 (3H, s) gợi ý sự có mặt của một aglycon thuộc khung oleanan, 2 proton anome tại δH 4,35 (1H, d, J = 7,5 Hz) và 5,40 (1H, d, J = 7,5 Hz) gợi ý sự có mặt của hai phân tử đường. Phổ 13C-NMR và DEPT cho biết sự có mặt 42 carbon, bao gồm 2 carbon carboxyl tại δC 177,0 và 178,1; 7 carbon bậc 4 tại δC 40,7, 40,2, 42,9 và 144,8; 15 methin tại δC 42,6, 49,6, 57,0, 71,2, 73,8, 73,9, 75,5, 76,5, 78,0, 78,3, 78,7, 90,7, 95,9, 106,7, 123,9; 11 methylen tại δC 19,3, 23,9, 24,0, 26,9, 28,9, 33,2, 34,0, 34,91, 39,9, 47,291, 62,495; 7 carbon methyl tại δC 16,0, 17,0, 17,7, 23,9, 26,3, 28,5 và 33,5. Phân tích số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 1 cho biết cấu trúc của hợp chất này giống với cấu trúc của hợp chất chikusetsusaponin IVa. Vị trí của liên kết đôi tại C-11/C-12 được xác định đựa trên tương tác HMBC giữa H-27 (δH 1,18) với C-13 (δC 144,8) và H-12 (δH 5,27) với C-14 (δC 42,9)/C-18 (δC 42,6). Độ 13 chuyển dịch hóa học C-NMR của 2 phân tử đường (δC 106,7, 75,5, 78,0, 73,8, 76,5, 177,0; 95,9, 73,9, 78,3, 71,2, 78,7, và 62,4) đã gợi ý đây là đường glucuronopyranosyl và glucopyranosyl. Cấu hình của nhóm hydroxyl tại C-1 được xác định là β dựa trên hằng số tương tác giữa H-1′ và H-2′; H-1″ và H- 2″, J = 7,5 Hz). Vị trí của β-D-glucuronopyranosyl và β-D-glucopyranosyl được xác định lần lượt tại C-3 và C-28 được dựa trên tương tác HMBC giữa H-1″ (δH 5,40) và C-28 (δC 178,1); giữa H-1′ (δH 4,35) và C-3 (δC 90,7). Dựa vào các bằng chứng phổ trên và kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất 1 được xác định là chikusetsusaponin IVa. Hợp chất này đã được thông báo có mặt ở loài A. armata 27
  35. 30 29 20 12 22 18 25 26 28 O C 1 15 6' 10 8 HOOC 27 O 5' 3 5 O O O RO 1'' HO 5'' 1' 24 23 OH 3' OH HO HOHO 3'' Hình 4.1.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 Hình 4.1.2 : Các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất 1 28
  36. Hình 4.1.3 : Phổ proton 1H của hợp chất 1 Hình 4.1.4 : Phổ cacbon 13C của hợp chất 1 29
  37. Hình 4.1.5 : Phổ DEPT của hợp chất 1 Hình 4.1.6 : Phổ HMBC của hợp chất 1 30
  38. Hình 4.1.7 : Phổ HSQC của hợp chất 1 Bảng 4.1 : Số liệu phổ của hợp chất 1 (và chất tham khảo) a,c [1] a,b DEPT δH HMBC Pos. δC δC (mult., J in Hz) (H→C) 1 39.8 39,9 CH2 1.02, 1.62 2 26.8 26,9 CH2 1.71, 2.01 3 90.8 90,7 CH 3.22 (dd, 4.0, 11.5) 23, 24, 1ʹ 4 40.1 40,2 C - 5 57.0 57,0 CH 0.82 6 19.3 19,3 CH2 1.42, 1.56 7 33.9 34,0 CH2 1.34, 1.51 8 40.7 40,7 C - 9 49.1 49,6 CH 1.60 10 37.8 37,9 C - 11 24.5 24,0 CH2 1.91 12 123.8 123,9 CH 5.27 (br s) 14, 18 13 144.8 144,8 C - 14 42.9 42,9 C - 31
  39. 15 28.9 28,9 CH2 1.11, 1.82 16 23.8 23,9 CH2 1.74, 2.07 17 48.0 48,0 C - 18 42.8 42,6 CH 2.87 (br d, 10.5) 19 47.2 47,2 CH2 1.17, 1.73 20 31.5 31,5 C - 21 34.9 34,9 CH2 1.23, 1.42 22 33.1 33,2 CH2 1.63, 1.76 23 28.5 28,5 CH3 1.07 (s) 3, 4, 5, 24 24 17.0 17,0 CH3 0.87 (s) 3, 4, 5, 23 25 16.0 16,0 CH3 0.96 (s) 1, 5, 9, 10 26 17.7 17,7 CH3 0.82 (s) 7, 8, 9, 14 27 26.2 26,3 CH3 1.18 (s) 8, 13, 14, 15 28 178.1 178,1 COOGlc 29 33.4 33,5 CH3 0.93 (s) 19, 20, 21, 30 30 23.9 23,9 CH3 0.96 (s) 19, 20, 21, 29 3-O-ß-D-Glucuronopyranosyl 1ʹ 106.6 106,7 CH 4.35 (d, 7.5) 3 2ʹ 75.5 75,5 CH 3.27 3ʹ 78.0 78,0 CH 3.43 4ʹ 73.7 73,8 CH 3.45 5ʹ 76.5 76,5 CH 3.57 6ʹ 176.9 177,0 COOH 28-O-ß-D-Glucopyranosyl 1ʺ 95.7 95,9 CH 5.40 (d, 7.5) 28 2ʺ 73.9 73,9 CH 3.35 1ʺ 3ʺ 78.3 78,3 CH 3.43 4ʺ 71.2 71,2 CH 3.38 5ʺ 78.7 78,7 CH 3.43 6ʺ 62.5 62,4 CH2 3.70, 3.83 a b c Đo trong CD3OD, 125 MHz, 500 MHz, 32
  40. 4.2. Xác định cấu trúc hợp chất 2 Phân tích chi tiết số liệu phổ của hợp chất 2 cho biết cấu trúc của hợp chất này giống với hợp chất 1 ngoại trừ sự xuất hiện thêm 1 phân tử đường tại C-4′ glu. Aglycon được xác định là 3β-hydroxyolean-12-en-28-oic acid dựa 13 trên tín hiệu đặc trưng C-NMR của aglycon: Liên kết đôi tại δC 123,8 (C-12) và 144,8 (C-13); một oxymethin tại C-3 (δC 90,7); 7 nhóm methyl tại δC 28,5 (C-23), 17,0 (C-24), 15,9 (C-25), 17,8 (C-26), 26,4 (C-27), 33,6 (C-29) và 24,0 (C-30). Số liệu phổ tại các vị trí của aglycon oleanan được xác định dựa vào kết hợp phân tích phổ HSQC và HMBC. Số liệu 13C-NMR của phần đường: δC 106,8 (C-1′), 75,4 (C-2′), 78,3 (C-3′), 79,6 (C-4′), 76,5 (C-5′) và 175,0 (C-6′); 109,5 (C-1″), 82,9 (C-2″), 78,6 (C-3″), 86,3 (C-4″) và 63,2 (C- 5″); 95,7 (C-1′′′), 73,9 (C-2′′′), 78,7 (C-3′′′), 71,1 (C-4′′′), 78,7 (C-5′′′) và 62,4 (C-6′′′) đã gợi ý sự có mặt của glucopyranosyl, arabinofuranosyl và glucuronopyranosyl. Thứ tự và cách liên kết giữa các phân tử đường được xác định dựa trên các tương tác HMBC cũng như kết hợp tra cứu tài liệu tham khảo. Cụ thể, các tương tác HMBC giữa ara H-1″ (δH 5,09) và glu C-4′ (δC 79,6); đã gợi ý trật tự liên kết của đường là -L-arabinofuranosyl (1→4)-β-D- glucuronopyranosid; phần đường này liên kết với aglycon tại C-3 được xác định bởi tương tác HMBC giữa glu H-1′ (δH 4,35) và C-3 (δC 90,7). Ngoài ra, vị trí của một phân tử đường còn lại glucopyranosyl tại C-28 của aglycon được xác định dựa trên tương tác HMBC giữa glc H-1′′′ (δH 5,40) và C-28 (δC 178,0) của aglycon. Số liệu phổ của hợp chất này hoàn toàn trùng khớp với số liệu phổ của hợp chất chikusetsusaponin IV, đã được từ loài A. Armata. Vì vậy cấu trúc của hợp chất 2 được xác định là chikusetsusaponin IV. 33
  41. Hình 4.2.1 : Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 Hình 4.2.2 : Các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất 2 34
  42. Hình 4.2.3 : Phổ proton 1H của hợp chất 2 Hình 4.2.4 : Phổ cacbon 13C của hợp chất 2 35
  43. Hình 4.2.5 : Phổ cacbon DEPT của hợp chất 2 Hình 4.2.6 : Phổ HMBC của hợp chất 2 36
  44. Hình 4.2.7 : Phổ HSQC của hợp chất 2 Bảng 4.2 : Số liệu phổ của hợp chất 2 và chất tham khảo a,c [1] a,b DEPT δH HMBC Pos. δC δC (mult., J in Hz) (H→C) 1 38.8 39,8 CH2 0.97, 1.61 2 26.2 26,9 CH2 1.69, 1.92 3 89.7 90,7 CH 3.16 (dd, 4.0, 11.5) 23, 24, 1' 4 39.7 40,2 C - 5 55.7 57,0 CH 0.80 4, 7, 9 6 18.4 19,3 CH2 1.42, 1.56 7 33.1 34,0 CH2 1.33, 1.51 8 39.9 40,6 C - 9 48.0 49,8 CH 1.60 10 36.9 37,9 C - 11 23.7 24,5 CH2 1.90 37
  45. 12 122.5 123,8 CH 5.27 (br s) 18 13 144.2 144,8 C - 14 42.1 42,9 C - 15 28.2 28,9 CH2 1.16, 1.82 16 23.7 24,1 CH2 1.74, 2.08 17 47.0 47,7 C - 18 41.7 42,8 CH 2.87 (dd, 4.0, 14.0) 19 46.7 47,3 CH2 1.15, 1.73 20 30.8 31,6 C - 21 34.0 34,9 CH2 1.23, 1.41 22 32.6 33,9 CH2 1.63, 1.75 23 28.2 28,5 CH3 1.07 (s) 3, 4, 5, 24 24 17.0 17,0 CH3 0.86 (s) 3, 4, 5, 23 25 15.5 15,9 CH3 0.97 (s) 1, 5, 9, 10 26 17.4 17,8 CH3 0.82 (s) 7, 8, 9, 14 27 26.2 26,4 CH3 1.18 (s) 8, 13, 14, 15 28 176.5 178,0 COOH 29 33.1 33,6 CH3 0.93 (s) 19, 20, 21, 30 30 23.7 24,0 CH3 0.96 (s) 19, 20, 21, 29 3-O-ß-D-Glucuronopyranosyl 1ʹ 106.8 106,8 CH 4.35 (d, 7.5) 3 2ʹ 75.4 75,4 CH 3.33 3ʹ 76.3 78,3 CH 3.70 4ʹ 78.9 79,6 CH 3.72 5ʹ 76.3 76,5 CH 3.45 6ʹ 172.3 175,0 COOH 4'-O-α-D- Arabinofuranosyl 1ʺ 108.3 109,5 CH 5.09 (br s) 4ʹ 2ʺ 82.4 82,9 CH 4.02 (d, 1.5) 3ʺ 78.2 78,6 CH 3.85 4ʺ 87.4 86,3 CH 4.13 38
  46. 5ʺ 62.5 63,2 CH2 3.65, 3.71 28-O-ß-D-Glucopyranosyl 1‴ 95.8 95,7 CH 5.40 (d, 6.5) 28 2‴ 74.4 73,9 CH 3.34 3‴ 78.9 78,7 CH 3.43 4‴ 71.2 71,2 CH 3.38 5‴ 78.2 78,7 CH 3.43 6‴ 62.2 62,4 CH2 3.71, 3.83 a b c Đo trong CD3OD, 125 MHz, 500 MHz, 39
  47. KẾT LUẬN Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp đã phân lập được 2 hợp chất tritecpen saponin từ phân đoạn nước của loài Đơn châu chấu (Aralia armata (Wall) Seem). Cấu trúc của chúng được xác định là chikusetsusaponin IVa (1) và chikusetsusaponin IV (2). 30 29 20 12 22 18 25 26 28 O C 1 15 6' 10 8 HOOC 27 O 5' 3 5 O O O RO 1'' HO 5'' 1' 24 23 OH 3' OH HO HOHO 3'' Chikusetsusaponin IVa Chikusetsusaponin IV 40
  48. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Võ văn Chi (2012), “Từ điển cây thuốc Việt Nam”, NXB Y học, Hanoi, Vol. 1, tr. 956-957. 2. Ngô Thị Huyền Trang (2013) “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Đơn châu chấu ( Aralia armata (wall.)seem.)”, Luận văn Thạc sỹ Dược học, Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội. 3. PGS.TS Nguyễn Hữu Đình (2013), PGS.TS Đỗ Đình Rãng, “Hóa học hữu cơ”, Nhà xuất bản Giáo dục 4. Trần Đình Sơn, Vũ Thị Kim Ngọc, Nguyễn Thị Hồng Điệp, Phan Thanh Hải (2008), “Phổ cộng hưởng từ hạt nhân”, Quyển I, Nhà xuất bản Y học Hà Nội. Tiếng Anh 5. Fang Z., Lei J., et al. (1995) "Studies on the chemical constituents from root bark of Aralia armata (Wall.) Seem", Acta Botanica Sinica, 37, pp. 74-80 6. Hu M., Ogawa K., et al. (1995) "Triterpenoid glucuronide saponins from root bark of Aralia armata", Phytochemistry, 39, pp. 179-184 7. Liang C., Ding Y., et al. (2010) "Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 20, pp. 7110-7115. 8. Fang Z., Lei J., et al. (1995) "Chemical constituents from root bark of Aralia armata (Wall.) Seem", Zhiwu Xuebao, 37, pp. 74-80. 9. Cannell, R>J>P (1998), “Naturral Products Isolation”. 10. Duc Do Khac, Sung Tran Van, Angela Martha Campos, Duc Do Khac, Sung Tran Van, Angela Martha Campos, Yean- Yves Lallemand and 41
  49. Marcel Fetizon (1990), “Ellagic acid compounds from Diplopanax stahyanthus, Phytochrmistry”, Vol.29 , 251-256. 11. K. R. Markham, B. Ternai, R. Stanley, H. Geiger and T. J. Mabry (1978), “Tetrahedron” , 34, 1389-1392. 12. Lobe Songue, Kouam, Etienne Dông, Theophile Ngando Mpondo and Robert L. White (2012), “Article Chemical Constituents from Stem Bark and Roots of Clausean anisata Jules”. 13. Hernandez D. E., Hancke J. L., et al. (1988) "Evaluation of the anti- ulcer and antisecretory activity of extracts of coot and Schizandra chinensis fruit in the rat", Journal of Ethnopharmacology, 23, pp. 109-114. 14. Sakai S., Katsumata M., et al. (1994) "Oleanolic acid saponins from root bark of Aralia elata", Phytochemistry, 35, pp. 1319-1324. 15. Satoh Y., Sakai S., et al. (1994) "Oleanolic acid saponins from root- bark of Aralia elata", Phytochemistry, 36, pp. 147-152. 16. Yoshikawa M., Yoshizumi S., et al. (1995) "Medicinal foodstuffs. I. Hypoglycemic constituents from a garnish foodstuff "taranome," the young shoot of Aralia elata SEEM.: elatosides G, H, I, J, and K", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 43, pp. 1878-1882 17. Song S. J., Nakamura N., et al. (2000) "Four new saponins from the root bark of Aralia elata", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 48, pp. 838-842. 18. Zhang Y., Ma Z., et al. (2012) "Cytotoxic triterpene saponins from the leaves of Aralia elata", Fitoterapia, 83, pp. 806-811. 19. Tomatsu M., Kondo T., et al. (2004) "An apoptotic inducer, aralin, is a novel type II ribosome-inactivating protein from Aralia elata", Biological Chemistry, 385, pp. 819-827. 42
  50. 20. Tomatsu M., Ohnishi-Kameyama M., et al. (2003) "Aralin, a new cytotoxic protein from Aralia elata, inducing apoptosis in human cancer cells", Cancer Letters, 199, pp. 19-25. 21. Miyase T., Shiokawa K. I., et al. (1996) "Araliasaponins I-XI, triterpene saponins from the roots of Aralia decaisneana", Phytochemistry, 41, pp. 1411-1418. 22. Miyase T., Sutoh N., et al. (1996) "Araliasaponins XII-XVIII, triterpene saponins from the roots of Aralia chinensis", Phytochemistry, 42, pp. 1123-1130. 23. Fang Z., Lei J., et al. (1995) "Studies on the chemical constituents from root bark of Aralia armata (Wall.) Seem", Acta Botanica Sinica, 37, pp. 74-80. 24. Xiao K., Yi Y. H., et al. (1999) "A cytotoxic triterpene saponin from the root bark of Aralia dasyphylla", Journal of Natural Products, 62, pp. 1030- 1032. 25. Zou M. L., Mao S. L., et al. (2001) "Two new triterpenoid saponins from Aralia subcapitata", Natural Product Letters, 15, pp. 157-161. 26. Yu S. S., Yu D. Q., et al. (1994) "Triterpenoid saponins from the roots of Aralia”. 27. Nhiem N. X., Lim H. Y., et al. (2011) "Oleanane-type triterpene saponins from the bark of Aralia elata and their NF-kB inhibition and PPAR activation signal pathway", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 28. Jeong S. I., Han W. S., et al. (2006) "Continentalic acid from Aralia continentalis shows activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus", Phytotherapy Research, 20, pp. 511-514. 29. Abidov M. T., del Rio M. J., et al. (2006) "Effects of Aralia mandshurica and Engelhardtia chrysolepis extracts on some parameters of lipid metabolism in women with nondiabetic obesity", Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 141, pp. 343-346. 43
  51. Tài liệu web 30. ng 31. a&list=species 32. n39114.html 44