›

Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của vỏ thân cây me rừng Phyllanthus emblica Linn

pdf 65 trang thiennha21 15/04/2022 5400
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của vỏ thân cây me rừng Phyllanthus emblica Linn", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_thanh_phan_hoa_hoc_cua_vo_than_cay_me_run.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của vỏ thân cây me rừng Phyllanthus emblica Linn

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC     KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA VỎ THÂN CÂY ME RỪNG Phyllanthus emblica Linn. PHẠM BẢO QUÝ Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2018.
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC     KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA VỎ THÂN CÂY ME RỪNG Phyllanthus emblica Linn. Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết Sinh viên thực hiện : Phạm Bảo Quý Mã số sinh viên : K40.106.088 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2018.
  3. NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018. Chủ tịch hội đồng
  4. LỜI CẢM ƠN Quá trình thực nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên, khoa Hóa học, trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh. Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết – người giảng viên luôn nhiệt tình trong việc truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm, luôn theo sát quá trình làm việc của em để kịp thời hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em được hoàn thành tốt đề tài này. Bên cạnh những bài học thực nghiệm quý báu mà em được học tập từ cô, em còn được cô truyền cho tinh thần nghiên cứu khoa học giúp em có được động lực trong việc nghiên cứu và học tập. Cảm ơn thầy Phạm Đức Dũng đã giúp đỡ và cho em những ý kiến bổ ích để em hoàn thành đề tài của mình. Em cũng xin dành một lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình đã là điểm tựa vững chắc cho em trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện khóa luận của mình. Thành công của em trong ngày hôm nay không thể có được nếu không có sự yêu thương và chăm sóc của ba mẹ. Em xin hết lòng cảm ơn quý thầy cô khoa Hóa học – trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, thầy cô đã tận tâm trong công tác giảng dạy, truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học hữu ích trong suốt thời gian em học tập tại trường. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Huỳnh Thị Thùy Linh – học viên cao học, cùng các bạn Nguyễn Thị Thanh Trúc, Nguyễn Hữu Toàn, Trần Thị Tú Quyên, Dư Vỉnh An đã luôn giúp đỡ, động viên em trong quá trình thực hiện đề tài này. Xin gửi những lời chúc tốt đẹp nhất đến các bạn và mong các bạn mãi thành công trên con đường tương lai sau này. Mong rằng sẽ có thật nhiều cơ hội hợp tác với các bạn sau này. Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người! Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 04 năm 2018
  5. MỤC LỤC Lời cảm ơn Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các sơ đồ Danh mục các hình Danh mục các phụ lục LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1 1.1. Đặc điểm thực vật cây Me rừng 1 1.2. Các nghiên cứu về dược tính của cây Me rừng 2 1.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học 4 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 13 2.1. Hóa chất, thiết bị, phương pháp 13 2.2. Nguyên liệu 14 2.3. Điều chế các loại cao 14 2.4. Cô lập các hợp chất hữu cơ có trong cao ethyl acetate 15 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1. Khảo sát cấu trúc hợp chất PEE04 20 3.2. Khảo sát cấu trúc hợp chất PA1 23 3.3. Khảo sát cấu trúc hợp chất PA2 26 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30 4.1. Kết luận 30 4.2. Đề xuất 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
  6. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 1H-NMR Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của proton (1)) 13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của carbon (13)) HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation (Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence (Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết) brs Broad singlet (mũi đơn rộng) s Singlet (Mũi đơn) d Doublet (Mũi đôi) dd Double of doublet (Mũi đôi - đôi) m Multiplet (Mũi đa) 훿 Chemical shift (Độ chuyển dịch hoá học) J Coupling constant (Hằng số ghép spin) ppm Part per million (Một phần một triệu) RP-18 Reversed Phase-18 (Pha đảo C-18) Rf Retention factor (Hệ số lưu giữ) EA Ethyl Acetate C Chloroform Me Methanol H n-Hexane SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng G Gam Mg Miligam Hz Hertz
  7. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số hợp chất đã được cô lập từ cây Phyllanthus emblica Linn. 4 Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate 15 Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 16 Bảng 2.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.6 17 Bảng 2.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.3 18 Bảng 2.5. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.7 19 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PEE04 và periplogenin 22 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PA1và 16-dehydropregenolone 25 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PA2 và phyllanthol 28
  8. DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế các loại cao từ vỏ thân cây Me rừng 15 Sơ đồ 2.2. Quy trình cô lập một số hợp chất từ cao ethyl acetate 19
  9. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây Me rừng 1 Hình 1.2. Vỏ thân cây Me rừng 1 Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất đã được cô lập từ cây Phyllanthus emblica Linn. 12 Hình 3.1. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất PEE04 23 Hình 3.2. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất PA1 25 Hình 3.3. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất PA2 29
  10. DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất PEE04 Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất PEE04 Phụ lục 2a. Phổ 13C-NMR dãn rộng của hợp chất PEE04 Phụ lục 3. Phổ DEPT của hợp chất PEE04 Phụ lục 4. Phổ HSQC của hợp chất PEE04 Phụ lục 5. Phổ HMBC của hợp chất PEE04 Phụ lục 6. Phổ 1H-NMR của hợp chất PA1 Phụ lục 7. Phổ 13C-NMR của hợp chất PA1 Phụ lục 8. Phổ DEPT (CDCl3) của hợp chất PA1 Phụ lục 9. Phổ COSY (CDCl3) của hợp chất PA1 Phụ lục 10. Phổ HSQC (CDCl3) dãn rộng của hợp chất PA1 Phụ lục 11. Phổ HMBC (CDCl3) dãn rộng của hợp chất PA1 1 Phụ lục 12. Phổ H-NMR (CDCl3) của hợp chất PA2 1 Phụ lục 12a. Phổ H-NMR dãn rộng (CDCl3) của hợp chất PA2 13 Phụ lục 13. Phổ C-NMR (CDCl3) của hợp chất PA2 Phụ lục 14. Phổ HMBC (CDCl3) của hợp chất PA2 Phụ lục 15. Phổ HMBC (CDCl3) dãn rộng của hợp chất PA2
  11. LỜI MỞ ĐẦU Chi Phyllanthus là một chi lớn, bao gồm khoảng 500 đến 700 loài, được chia thành 10 đến 11 chi nhỏ, bao gồm các chi Isocladus, Kirganelia, Cicca, Emblica, Conani, Gomphidium, Phyllanthodendron, Xylophylla, Botryanthus, Ericocus và Phyllanthus [6]. Bên cạnh các loài như Phyllanthus amarus Schum et Thonn. (cây Diệp hạ châu đắng), Phyllanthus urinaria L. (cây Diệp hạ châu ngọt), Phyllanthus reticulatus Poir. (cây Phèn đen) được dùng nhiều trong các bài thuốc chữa bệnh gan, sỏi thận, [2], thì trong những năm gần đây, cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) cũng đang rất được quan tâm bởi vì những ứng dụng của nó trong y học cổ truyền và y học hiện đại. Cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) là cây thuộc chi Phyllanthus. Cây này được dùng phổ biến trong y học cổ truyền của Việt Nam và nhiều nước trên thế giới. Ở nước ta, cây mọc phổ biến trên các đồi trọc, trong các rừng thưa. Quả có thể dùng chữa cảm mạo, phát sốt, ho, đau cổ họng, miệng khô khát, rễ được dùng để trị viêm ruột, đau bụng đi ngoài, cao huyết áp, lá nấu nước rửa bên ngoài có thể trị lở loét, mẫn ngứa, còn thân vỏ có tác dụng hạ huyết áp [2]. Bên cạnh việc được sử dụng trong các bài thuốc y học cổ truyền, các hợp chất cô lập được từ cây Me rừng đã được chứng minh có tác dụng hạ men gan, chống oxi hóa, kháng khuẩn [1]. Mặc dù trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học về cây Me rừng, nhưng ở Việt Nam, các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây này còn hạn chế, đặc biệt là chưa có nghiên cứu về thành phần hóa học trên vỏ thân. Chính vì vậy mà chúng tôi chọn vỏ thân cây Me rừng để nghiên cứu với mong muốn làm rõ thêm thành phần hóa học, từ đó hiểu thêm về tác dụng chữa bệnh của cây và đóng góp những chứng cứ khoa học có giá trị vào kho dược liệu của Y học Việt Nam.
  12. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm thực vật cây Me rừng Tên thông thường tại Việt Nam là cây Me rừng. Ngoài ra, cây Me rừng có tên gọi khác tùy thuộc từng vùng miền là mận rừng, me quả tròn, chùm ruột núi, chùm ruột rừng, mác kham (Tày), diều cam (Dao), xì xà Liên (K’Ho) [2]. Tên khoa học: Phyllanthus emblica Linn. Thuộc họ: Thầu dầu (Euphorbiaceae). Hình 1.1. Cây Me rừng Hình 1.2. Vỏ thân cây Me rừng Cây Me rừng phân bố rộng khắp vùng nhiệt đới châu Á, có thể tìm thấy loài thực vật này ở Việt Nam, Ấn Độ, Thái Lan, Riêng tại Việt Nam, cây Me rừng phân bố nhiều ở các tỉnh trung du và miền núi phía Bắc như Cao Bằng, Lạng Sơn, Vĩnh Phúc, [1]. Cây Me rừng thường là loại cây gỗ nhỏ, ưa sáng, ưa nóng, chịu khô hạn rất tốt, thân cây cao 2 – 7 mét, phân nhiều cành, cành nhỏ mềm, có lông, dài 20cm. Lá xếp thành hai dãy trên các cành nhỏ trông giống như một lá kép lông chim, cuống lá rất ngắn. Lá kèm rất nhỏ hình ba cạnh. Hoa nhỏ, đơn tính cùng gốc. Cụm hoa thành xim co mọc ở nách lá phía dưới của cành, với rất nhiều hoa đực và vài hoa cái. Quả hình cầu trước mọng, sau khô thành quả nang. Hạt hình ba cạnh, màu hồng nhạt. Cây ra hoa từ tháng 3 đến tháng 11 hàng năm. 1
  13. 1.2. Các nghiên cứu về dược tính của cây Me rừng 1.2.1. Dược tính theo y học cổ truyền Dựa vào những nghiên cứu trước đây về dược tính theo y học cổ truyền, hầu hết tất cả các bộ phận của loài thực vật này đều có những công dụng chữa bệnh. Ở Ấn Độ, quả Me rừng là một thành phần trong nhiều bài thuốc cổ truyền dùng để chữa sỏi niệu, các bệnh về gan, có tác dụng bảo vệ chống độc hại gan. Còn ở Việt Nam, quả Me rừng khô thường được dùng để trị tiêu chảy đau bụng. Hơn hết, quả Me rừng còn được dùng như một nguồn vitamin C dồi dào với tên “Myrobalan emblic”, chữa bệnh cảm mạo, phát sốt, ho, đau cổ họng, miệng khô khát (dùng 10 – 30 quả sắc uống mỗi ngày), còn trị được bệnh đái tháo đường, trị ho, lợi tiểu, nhuận tràng. Còn rễ có vị đắng, chát, tính mát được dùng để trị viêm ruột, đau bụng đi ngoài, cao huyết áp (dùng 15 – 20g sắc uống mỗi ngày). Bên cạnh đó, lá nấu nước rửa bên ngoài để trị lở loét, mẩn ngứa. Vỏ thân cây và rễ có vị đắng, chát, tính mát, sắc lấy nước uống làm lợi tiểu, chữa phù thũng và tăng huyết áp [1–2]. 1.2.2. Dược tính theo y học hiện đại Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về dược tính theo y học hiện đại về cây Me rừng, trong đó phải kể đến một số nghiên cứu tác dụng dược lý của các hợp chất quan trọng trong cây Me rừng như acid gallic, acid ellagic, phyllaemblicin B, phyllaemblicin C, putranjivain A, emblicamin A và B  Tác dụng kháng khuẩn và chống oxi hóa Năm 2007, từ dịch chiết của quả Me rừng, Xiaoli Liu cùng các cộng sự của mình đã nghiên cứu thành công được về khả năng kháng khuẩn và chống oxi hóa từ dịch chiết đó. Dịch chiết này thu được bằng phương pháp chiết với chất lỏng siêu tới hạn và cao chiết với methanol [22]. Kết quả của cuộc nghiên cứu cho thấy cao chiết bằng phương pháp chiết với chất lỏng siêu tới hạn có khả năng kháng khuẩn ở các loại vi khuẩn gram âm (E. coli, P. aeruginosa, S. typhi), gram dương (S. aureus, B. cereus và B. subtilis) và kể cả nấm (C. abican, C. tropicalis và A. niger) gây hại trên thực 2
  14. phẩm. Điều này được xem như góp phần vào việc sử dụng một sản phẩm thay thế để kiểm soát vi khuẩn và bảo quản thực phẩm từ tự nhiên. Ngoài ra, vào năm 2016, cũng từ dịch chiết ethanol của quả Me rừng, Sirinya Pientaweeratch và các cộng sự đã cho thấy nó khả năng chống oxi hóa với nồng độ ức chế 50% (IC50) được xác định bằng phương pháp khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DDPH) là 1.70 0.07 mg/mL và phương pháp khử gốc tự do 3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) là 4.45 0.10 mg/mL [13].  Tác dụng bảo vệ gan Năm 2008, từ dịch chiết trong vỏ thân cây Me rừng, S.K. El-Desouky và các cộng sự đã công bố trong dịch này có chứa các phenolic, flavonoid và tanin. Với một số thử nghiệm trên chuột, kết quả thu được cho thấy dịch chiết này có tác dụng chống rối loạn chức năng gan dưới tác dụng của ethanol [15]. Sau đó, năm 2010, một loạt các nghiên cứu của Sharma Bhawna và cộng sự đã công bố dịch chiết ethanol của cây Me rừng có tác dụng hạ men gan, phục hồi chức năng gan với liều lượng 75 mg/kg/ngày khi thử nghiệm trên chuột [12].  Tác dụng kháng virus Vào năm 2011, Yang Fei Xiang và các cộng sự đã cô lập được hợp chất 1,2,4,6‐tetra‐O‐galloyl‐β‐D‐glucose (75), sau đó họ tiến hành một loạt các thử nghiệm với tác dụng chống virus HSV (Herpes Simplex virus) loại 1 và 2 (HSV- 1 và HSV-2). Kết quả cho thấy rằng hoạt chất này ngăn chặn được sự lây nhiễm virus trong tế bào ở giai đoạn đầu [26]. Năm 2017, He Yan và các cộng sự từ dịch chiết rễ Me rừng đã tìm ra được hai hợp chất chalconoid là emblirol A (21) và emblirol B (22) có tác dụng kháng virus khảm thuốc lá (TMV) gây bệnh khảm thuốc lá, với khả năng ức chế lần lượt ở 79,6% và 82,1% (nồng độ thử nghiệm 1mg/mL) [5].  Tác dụng gây độc tế bào ung thư Năm 2012, Xiaoli Liu cùng các cộng sự đã cô lập từ cao etyl acetat của quả Me rừng và thử nghiệm hoạt tính sinh học một số hợp chất một số hợp chất 3
  15. tannin (41–52), flavonoid (70–73). Kết quả cho thấy các hoạt chất này có tác dụng gây độc tế bào ung thư vú. Đặc biệt, hợp chất isocorilagin (41) có tác dụng gây độc HELF (Human embryonic lung fibroblast cell) với nồng độ ức chế 50% (IC50) là 51,4 μg/mL [23]. Vào năm 2013, Xinxian Zhu cùng cộng sự đã công bố nghiên cứu cho thấy trên cao chiết xuất giàu polyphenol từ cây Me rừng có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) ở nồng độ tối ưu là 150 mg/mL [24]. 1.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học Theo một số nghiên cứu đã được công bố, phần lớn trên các bộ phận như lá, quả, cành và rễ của cây Me rừng chứa các nhóm hợp chất alkaloid, benzenoid, coumarin, phenolic, tanin, terpenoid, steroid, flavonoid, [4], [6], [16–21], [25–28]. Bảng 1.1. Một số hợp chất đã được cô lập từ cây Phyllanthus emblica Linn. Tài liệu Nhóm Bộ phận Hợp chất tham hợp chất cây khảo Zeatin (1) [6] Alkaloid Zeatin nucleotide (2) Quả [6] Zeatin riboside (3) [6] Chebulic acid (4) [6] 3,6-Di-O-galloyl-β-O-D-glucopyranose [6] (5) Gluco-gallin (6) [6] Gallic acid (7) [4], [6] Ethyl gallate (8) [4], [6] Benzenoid Cinnamic acid (9) Quả [4] 2-O-Galloyl L-malic acid (10) [26] 2-O-Galloyl mucic acid (11) [26] 2-O-Galloyl 1,4-lactone mucic acid [26] (12) 5-O-Galloyl 1,4-lactone mucic acid [26] (13) 4
  16. 3-O-Galloyl 1,4-lactone mucic acid [26] (14) 3,5-Di-O-galloyl1,4-lactone mucic acid [26] (15) 2-O-Galloylmethyl ester mucic acid [26] (16) 2-O-Galloyl-1,4-lactone mucic acid [26] methyl ester (17) 5-O-Galloyl-1,4-lactone mucic acid [26] methyl ester (18) 3-O-Galloyl-1,4-lactone mucic acid [26] methyl ester (19) 3,5-Di-O-galloyl-1,4-lactone mucic [26] acid methyl ester (20) Emblirol A (21) [5] Rễ Emblirol B (22) [5] Coumarin Ellagic acid (23) Quả [4], [6] Giberellin A-1 (24) [6] Giberellin A-3 (25) [6] Diterpenoid Giberellin A-4 (26) Quả [6] Giberellin A-7 (27) [6] Giberellin A-9 (28) [6] Phyllaemblic acid (29) [27] Phyllaemblic acid methyl ester (30) [28] Sesqui- Phyllaemblic acid B (31) Rễ [28] terpenoid Phyllaemblic acid C (32) [28] Phyllaemblicin D (33) [28] Phyllaemblicin A (34) [29] Norsesqui- Phyllaemblicin B (35) Rễ [29] terpenoid Phyllaemblicin C (36) [29] 2-Carboxylmethylphenol-1-O-β-D- [28] glucopyranoside (37) Phenolic 2,6-Dimethoxy-4-(2- Rễ Glycoside hydroxyethyl)phenol1-O-β-D- [28] glucopyranoside (38) Tannin Chebulanic acid (39) Quả [19] 5
  17. Corilagin (40) [6] Isocorilagin (41) [21], [22] Chebulanin (42) [19] Chebulagic acid (43) [19] Mallotusinin (44) [20] Phyllaembinin A (45) [29] Phyllaembinin B (46) [29] Phyllaembinin C (47) [22] Phyllaembinin D (48) Lá, cành [29] Phyllaembinin E (49) [29] Phyllaembinin F (50) [29] Phyllanthunin (51) [4] Quả Geraniin (52) [22] Lipid và Stearic acid (53) Quả [4] acid Lauric acid (54) β-Sitosterol 3-O-β-D-glucoside (55) [8] Stigmasta-5,22-diene-3-O-β-D- Lá, quả [8] glucopyranoside (56) 5α,6β-Dihydroxysitosterol (57) [18] 5α,6β,7α-Trihydroxysitosterol (58) [18] 7α-Acetoxysitosterol (59) [18] β-Sitosterol (60) [18] 7α-Hydroxy-β-sitosterol (61) [18] 7β-Ethoxy-β-sitosterol (62) [18] 7-Ketositosterol (63) [18] Steroid Stigmast-4-ene-3-one (64) [18] Stigmast-4-ene-3,6-dione (65) Lá, cành [18] Stigmast-4-ene-6β-ol-3-one (66) [18] Stigmast-4-ene-3β,6α-diol (67) [18] 3-O-β-D-(6'-O- Hexanedecanoylglucopyranosyl)stigma [18] st-5-ene-3β-ol (68) 3-O-β-D-(6'-O- Hexanedecanoylglucopyranosyl)stigma [18] st-5-ene-3β,7β-diol (69) Kaempferol (70) [21], [22] Flavonoid Quả Quercetin (71) [6], [22] 6
  18. Quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside [21] (72) Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside [21], [22] (73) Leucodelphinidin (74) [6] Rutin (75) [6] (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) R = H, (8) R = C2H5 (9) (10) (16) R1=R2=CH3, (18) R1=CH3, R2=H (12) R1=Galloyl, R2=R3=R4=H (17) R1=H, R2=CH3, (11) R1=R2=H (19) R1=Galloyl, R2=R3=H, R4=CH3 (14) R1=R3=R4=H, R2=Galloyl (15) R1=R4=H, R2=R3=Gallo 7
  19. (13) R1=H, (20) R1=Me (21) R=Me, (22) R=H (23) (24) R1=R2=OH (25) R=OH (29) R=H (26) R1=H, R2=OH (27) R=H (30) R=Me (28) R1=R2=H (31) R1=OH, R2=H (34) (32) R1=R2=H (33) R1=H, R2=Glu (35) (36) 8
  20. (37) (38) (39 (40) (41) (42) (43) (44) (45) (46) 9
  21. (48) R1=Galloyl, R2=neoche, R3=R4=H (49) R1=Galloyl, R3=neoche, R2=R4=H (50) R1=Galloyl, R4=neoche, R2=R3=H (47) (53) R=n-C17H35 (54) R=n-C11H23 (51) 10
  22. (55) (56) (57) R=H (59) R1=H, R2=OCOCH3, (60) R1=H, R2=H (58) R=OH (61) R1=H, R2=OH, (62) R1=OC2H5, R2=H (63) (64) R1=R2=H (66) R1=H, R2=OH (65) (67) 11
  23. (68) R1=H, R2=OOC(CH2)14CH3 (70) R=H (69) R1=OH, R2=OOC(CH2)14CH3 (71) R=OH (72) (73) (74) (75) Chú thích: Galloyl Neoche Glu =Glucopyranosyl Hình 1.3. Cấu trúc của một số hợp chất trong cây Phyllanthus emblica Linn. 12
  24. CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất, thiết bị, phương pháp 2.1.1. Hoá chất - Silica gel: silica gel 40–63μm, Merck và silica gel 230–400μm, Himedia dùng cho sắc kí cột. - Silica gel pha đảo, RP–18, Merck dùng cho sắc kí cột. - Sắc kí lớp mỏng loại DC – Alufolein 20×20, Kiesel gel 60 F254, Merck. - Sắc kí lớp mỏng loại 25DC, RP–18, Merck. - Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: n–hexane, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol, acetic acid và nước cất. - Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên lớp mỏng dung dịch H2SO4 20%, nung nóng bảng. 2.1.2. Thiết bị - Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu. - Các cột sắc kí. - Máy cô quay chân không. - Bếp cách thuỷ. - Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm. - Cân điện tử. 2.1.3. Phương pháp tiến hành Phương pháp phân lập các hợp chất Cô lập các hợp chất hữu cơ bằng phương pháp sắc kí, bao gồm kỹ thuật sắc kí cột silica gel pha thường, pha đảo RP–18 và sắc kí lớp mỏng. Phát hiện vết chất hữu cơ có trên sắc kí lớp mỏng bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 20%, nung nóng bảng mỏng. 13
  25. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), 2D-NMR trên máy Bruker Avance được ghi tại phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh và tại Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng, Phòng 133, nhà A18, Viện Hóa học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. 2.2. Nguyên liệu 2.2.1. Thu hái nguyên liệu Mẫu cây dùng trong nghiên cứu khoá luận là vỏ thân cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) được thu hái tại xã Tân Tiến, thị xã La Gi, tỉnh Bình Thuận vào tháng 5 năm 2014. Mẫu cây đã được TS. Phạm Văn Ngọt (khoa Sinh học – trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh) nhận danh tên khoa học là “Phyllanthus emblica Linn.”, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). 2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn. Sau đó tiến hành ngâm chiết và phân lập các hợp chất. 2.3. Điều chế các loại cao Vỏ thân cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) được phơi khô và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng không đổi (16.2kg). Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâm dầm, lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô (350.5g). Cao ethanol thô được chiết lỏng–lỏng lần lượt với n–hexane, ethyl acetate thu được cao hexane (11.5g), cao ethyl acetate (85.4g) và cao còn lại (224.8g). Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1. 14
  26. Bột vỏ thân cây khô (16.2kg) - Ngâm dầm với ethanol - Lọc, cô quay, thu hồi dung môi Cao ethanol thô (350.5g) - Chiết lỏng – lỏng với dung môi n–hexane - Lọc, cô quay, thu hồi dung môi Cao n-hexane (11.5g) Dịch chiết còn lại - Chiết lỏng – lỏng với dung môi ethyl acetate - Lọc, cô quay, thu hồi dung môi Cao ethyl acetate (85.4g) Dịch chiết còn lại Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế các loại cao từ vỏ thân cây Me rừng 2.4. Cô lập các hợp chất hữu cơ có trong cao ethyl acetate 2.4.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate Cao ethyl acetate (85.4g) được SKC silica gel, giải ly với hệ dung môi H:EA có độ phân cực tăng dần từ 70% đến 100% EA, sau đó tiếp tục giải ly với hệ dung môi EA:Me có độ phân cực tăng dần từ 5% đến 100% Me. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ, theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM. Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gom chung thành một phân đoạn. Kết quả thu được 9 phân đoạn (EA1 – 9) được trình bày ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate Phân Dung môi Khối Sắc kí STT Ghi chú đoạn giải ly lượng (g) lớp mỏng 1 EA1 H:EA (95:5) 4.1 Nhiều vết tách xa Đã khảo sát Nhiều vết, 2 EA2 H:EA (9:1) 5.4 Đã khảo sát kéo dài Nhiều vết, 3 EA3 H:EA (85:15) 12.6 Chưa khảo sát kéo vệt 4 EA4 EA:Me (99:1) 4.6 Nhiều vết Đã Khảo sát 15
  27. 5 EA5 EA:Me (95:5) 6.2 Nhiều vết tách xa Đã khảo sát Nhiều vết, 6 EA6 EA:Me (9:1) 11.2 Chưa khảo sát kéo dài Nhiều vết, 7 EA7 EA:Me (8:2) 6.7 Chưa khảo sát kéo dài Nhiều vết, 8 EA8 EA:Me (7:3) 10.5 Chưa khảo sát kéo dài Nhiều vết, 9 EA9 Me (100%) 9.8 Chưa khảo sát kéo dài 2.4.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 của bảng 2.1 Phân đoạn EA4 (4.6g) SKLM cho nhiều vết, hiện hình màu tím dưới đèn tử ngoại nên được chọn SKC silica gel, giải ly với hệ dung môi H:Ac có độ phân cực tăng dần từ 75% đến 100% EA, sau đó tiếp tục giải ly với hệ dung môi EA:Me có độ phân cực tăng dần từ 5% đến 100% Me. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 8 phân đoạn (EA4.1 – EA4.8) được ghi lại ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 Khối lượng Sắc kí lớp STT Phân đoạn Dung môi giải ly Ghi chú (mg) mỏng Có vết trùng với vết 1 EA4.1 H:Ac (95:5) 437.8 Chưa khảo sát glycoside của stigmasterol Có vết trùng 2 EA4.2 H:Ac (9:1) 323.9 với vết của Chưa khảo sát lupeol Khảo sát 3 EA4.3 H:Ac (85:15) 554.7 Nhiều vết thu được hợp chất PA1 4 EA4.4 H:Ac (8:2) 449.9 Nhiều vết Chưa khảo sát Nhiều vết, 5 EA4.5 H:Ac (7:3) 375.9 Chưa khảo sát kéo vệt Khảo sát 6 EA4.6 H:Ac (6:4) 536.6 3 vết thu được hợp 16
  28. chất PEE04 Khảo sát 7 EA4.7 EA:Me (95:5) 421.3 Nhiều vết thu được hợp chất PA2 Nhiều vết, 8 EA4.8 EA:Me (9:1) 312.9 Chưa khảo sát kéo vệt 2.4.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.6 của bảng 2.2 Phân đoạn EA4.6 (536.6mg) bằng hệ dung môi C:Me có độ phân cực tăng dần từ 5% đến 100% Me. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 6 phân đoạn (EA4.6.1 – EA4.6.6). Kết quả được trình bày ở bảng 2.3. Bảng 2.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.6 Dung môi Khối lượng STT Phân đoạn Sắc kí lớp mỏng Ghi chú giải ly (mg) Nhiều vết, kéo 1 EA4.6.1 C:Me (95:5) 68.6 Đã khảo sát vệt Nhiều vết, kéo 2 EA4.6.2 C:Me (95:5) 81.9 Đã khảo sát vệt Tinh chế thu Nhiều vết, 3 EA4.6.3 C:Me (9:1) 161.7 được hợp tách rõ chất PEE04 Nhiều vết, kéo 4 EA4.6.4 C:Me (9:1) 121.3 Đã khảo sát vệt Nhiều vết, kéo 5 EA4.6.5 C:Me (9:1) 52.0 Đã khảo sát vệt Nhiều vết, kéo 6 EA4.6.6 C:Me (8:2) 49.6 Đã khảo sát vệt Phân đoạn EA4.6.3 (161.7mg) của bảng 2.3 khi SKLM cho vết màu xanh và hai vết dơ kéo dài, nên tiếp tục SKC nhiều lần với hệ dung môi C:Ac thu được hợp chất có dạng bột màu trắng, được kí hiệu là PEE04 (5.8mg). 2.4.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.3 của bảng 2.2 Phân đoạn EA4.3 (554.7mg) bằng hệ dung môi H:Ac có độ phân cực tăng dần từ 20% đến 100% Ac. Tiến hành các bước tương tự như khi SKC phân đoạn 17
  29. trước. Kết quả thu được 5 phân đoạn (EA4.3.1 – EA4.3.5). Kết quả được trình bày ở bảng 2.4. Bảng 2.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.3 Dung môi Khối lượng STT Phân đoạn Sắc kí lớp mỏng Ghi chú giải ly (mg) Nhiều vết, kéo 1 EA4.3.1 H:Ac (9:1) 143.7 Đã khảo sát vệt Tinh chế thu Nhiều vết, 2 EA4.3.2 H:Ac (9:1) 121.3 được hợp tách rõ chất PA1 Nhiều vết, kéo 3 EA4.3.3 H:Ac (8:2) 85.8 Đã khảo sát vệt Nhiều vết, kéo 4 EA4.3.4 H:Ac (8:2) 97.4 Đã khảo sát vệt Nhiều vết, kéo 5 EA4.3.5 H:Ac (7:3) 105.9 Đã khảo sát vệt Phân đoạn EA4.3.2 (121.3mg) của bảng 2.4 khi SKLM cho vết màu cam và nhiều vết dơ nhưng các vết tách rõ ràng nên tiếp tục SKC nhiều lần với hệ dung môi H:Ac:AcOH thu được hợp chất có dạng hình kim màu trắng, được kí hiệu là PA1 (5.9mg). 2.4.5. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.7 của bảng 2.2 Phân đoạn EA4.7 (421.3mg) bằng hệ dung môi C:Me có độ phân cực tăng dần từ 10% đến 100% Me. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 6 phân đoạn (EA4.7.1 – EA4.7.6). Kết quả được trình bày ở bảng 2.5. Bảng 2.5. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.7 Dung môi Khối lượng STT Phân đoạn Sắc kí lớp mỏng Ghi chú giải ly (mg) Nhiều vết, kéo 1 EA4.7.1 C:Me (95:5) 68.1 Đã khảo sát vệt Nhiều vết, kéo 2 EA4.7.2 C:Me (95:5) 71.2 Đã khảo sát vệt 18
  30. Tinh chế thu Nhiều vết, 3 EA4.7.3 C:Me (9:1) 100.7 được hợp tách rõ chất PA2 Nhiều vết, kéo 4 EA4.7.4 C:Me (9:1) 69.8 Đã khảo sát vệt Nhiều vết, kéo 5 EA4.7.5 C:Me (9:1) 59.9 Đã khảo sát vệt Nhiều vết, kéo 6 EA4.7.6 C:Me (8:2) 51.1 Đã khảo sát vệt Phân đoạn EA4.7.3 (100.7mg) của bảng 2.5 khi SKLM cho vết màu nâu, hiện hình UV và có bốn vết dơ không hiện hình dưới đèn tử ngoại nhưng tách rõ, nên tiếp tục SKC nhiều lần với hệ dung môi C:Ac:AcOH thu được hợp chất có dạng bột màu trắng, được kí hiệu là PA2 (10.9mg). Dưới đây là sơ đồ trình bày quy trình cô lập một số hợp chất từ cao ethyl acetate. Sơ đồ 2.2. Quy trình cô lập một số hợp chất từ cao ethyl acetate 19
  31. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát cấu trúc hợp chất PEE04 Hợp chất PEE04 (5.8mg) thu được từ phân đoạn EA4.6.3 có những đặc điểm như sau: - Dạng hình kim, màu trắng. - Sắc kí lớp mỏng cho một vết duy nhất khi hiện hình dưới đèn tử ngoại và khi phun bằng H2SO4 20%, hơ nóng, bảng mỏng xuất hiện vết có màu xanh. (dung môi giải ly chloroform : acetone (9:1), Rf = 0.4) 1 - Phổ H–NMR (CDCl3, phụ lục 1, bảng 3.1) δH (ppm): 5.88 (1H, s, H–22), 4.98 (1H, dd, J = 1.0, 8.0 Hz, H–21a) , 4.81 (1H, dd, J = 1.5, 8.5 Hz, H–21b), 4.18 (1H, brs, H–3), 2.78 (1H, m, H–17), 0.95 (3H, s, H–19), 0.88 (3H, s, H– 18). 13 - Phổ C kết hợp với DEPT–NMR (CDCl3, phụ lục 2, 2a và 3, bảng 3.1) δC (ppm): 174.5, 174.4 (>C=O, >C=C, C–20/23), 117.8 (=CH–, C–22), 16.7 (– CH3, C–19), 15.7 (–CH3, C–18) và độ chuyển dịch của các carbon khác được trình bày trong bảng 3.1. - Phổ HSQC, HMBC (CDCl3, phụ lục 4, 5).  BIỆN LUẬN CẤU TRÚC Phổ 1H-NMR của hợp chất PEE04 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của một proton olefin tại δH 5.88 (1H, s, H–22). Phổ đồ còn thể hiện hai tín hiệu cộng hưởng của proton nhóm methylene gắn với oxygen tại δH 4.98 (1H, dd, J = 1.5, 8.5 Hz, H–21a) và 4.81 (1H, dd, J = 1.0, 8.0 Hz, H–21b), tín hiệu cộng hưởng của hai nhóm methyl –CH3 tại δH 0.95 (3H, s, H–19), 0.88 (3H, s, H–18). Ngoài ra, một số tín hiệu cộng hưởng của các proton methylene –CH2– và methine >CH– cũng xuất hiện trên phổ ở vùng từ trường cao. Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT và HSQC của hợp chất PEE04 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 23 carbon, gồm hai carbon methyl, mười carbon 20
  32. methylene, năm carbon methine và sáu carbon bậc bốn. Trong đó, tín hiệu cộng hưởng của vòng lactone không no 훼, 훽 ở δC 174.5 (>C=O, C–23), 174.4 (>C=C, C–20), 117.8 (=CH–, C–22), 73.5 (–CH2–O, C–21). Ngoài ra, phổ đồ còn có tín hiệu cộng hưởng của hai carbon tứ cấp mang oxygen tại δC 85.5 (C–14), 74.6 (C–5) và carbon oxymethine tại δC 68.1 (>CH–O–, C–3). Tín hiệu cộng hưởng của hai nhóm methyl bậc 4 tại δC 16.7 (–CH3, C–19) và 15.7 (–CH3, C–18). Từ các dữ kiện của phổ NMR trên và tài liệu tham khảo, hợp chất PEE04 được dự đoán là steroid có khung sườn pregnane với một nhóm C=O được gắn trong vòng lactone không no và ba nhóm hydroxyl. Tương quan HMBC của proton tại δH 2.78 (1H, m, H–17) với các carbon ở δC 174.4 (>C=, C–20), 117.8 (>C=CH–, C–22), 85.5 (>C C<, C–13), 40.1 (–CH2–, C–12) và 26.8 (–CH2–, C– 16) giúp dự đoán vòng lactone không no gắn ở vị trí carbon C–17. Ngoài ra, tương quan HMBC từ proton methyl tại δH 0.88 (3H, s, H–18), proton tại δH 2.78 (1H, m, H–17) đến carbon mang oxygen tại δC 85.5 (C–14) xác định nhóm hydroxyl gắn tại C–14. Tương tự, tương quan HMBC từ proton H–3 (δH 4.18) và proton methyl H–19 (δH 0.95) đến C–5 (δC 74.6) giúp xác định nhóm hydroxyl gắn vào vị trí C–5. Một số tương quan HMBC khác được trình bày trong hình 3.1. Qua các dữ kiện phổ NMR ở trên và kết hợp dữ liệu phổ của hợp chất periplogenin [9] cho thấy có sự tương đồng nên cấu trúc của hợp chất PEE04 được đề nghị là periplogenin. 21
  33. Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PEE04 và periplogenin PEE04 (CDCl3) Periplogenin (CDCl3) [9] Vị trí carbon δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δC (ppm) 1 24.8 24.9 2 28.0 27.9 3 4.18 (brs) 68.1 68.0 4 36.9 36.9 5 74.6 74.6 6 35.3 35.2 7 23.8 23.7 8 40.9 40.8 9 39.0 39.0 10 40.9 40.7 11 21.5 21.5 12 40.1 40.0 13 49.5 49.5 14 85.5 85.4 15 33.1 33.0 16 26.8 26.8 17 2.78 (m) 50.7 50.7 18 0.88 (s) 15.7 15.7 19 0.95 (s) 16.7 16.7 20 174.4* 174.5 4.98 (dd, 1.5, 8.5) 21 73.5 73.5 4.81 (dd, 1.0, 8.0) 22 5.88 (s) 117.8 117.7 23 174.5* 174.5 Ghi chú: (*): tín hiệu có thể trao đổi lẫn nhau. 22
  34. Periplogenin (PEE04) Hình 3.1. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất PEE04 3.2. Khảo sát cấu trúc hợp chất PA1 Hợp chất PA1 (5.9mg) thu được từ phân đoạn EA4.3.2 có những đặc điểm như sau: - Dạng bột, màu trắng. - Sắc kí lớp mỏng cho một vết duy nhất khi hiện hình dưới đèn tử ngoại và khi phun bằng H2SO4 20%, hơ nóng, bảng mỏng xuất hiện vết có màu vàng nâu. (dung môi giải ly n-hexane : chloroform (85:15), Rf = 0.45) 1 - Phổ H-NMR (CDCl3, phụ lục 6, bảng 3.2) δH (ppm): 6.70 (1H, dd, J = 2.0, 3.0 Hz, H–16), 5.36 (1H, dd, J = 2.5, 3.0 Hz, H–6), 3.52 (1H, m, H–3), 2.39 (3H, s, H–21), 1.04 (3H, s, H–19), 0.92 (3H, s, H–18). 13 - Phổ C kết hợp với DEPT–NMR (CDCl3, phụ lục 7 và 8, bảng 3.2) δC (ppm): 197.0 (>C=O, C–20), 155.6 (=C CH–O–, C–3), 19.5 (–CH3, C–19), 15.9 (–CH3, C–18) và độ chuyển dịch của các carbon khác được trình bày trong bảng 3.2. - Phổ COSY, HSQC, HMBC (CDCl3, phụ lục 9, 10 và 11).  BIỆN LUẬN CẤU TRÚC Phổ 1H-NMR của hợp chất PA1 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của hai proton olefin ở δH 6.70 (1H, dd, J = 2.0, 3.0 Hz, H–16), 5.36 (1H, dd, J = 2.5, 23
  35. 3.0 Hz, H–6), tín hiệu cộng hưởng của proton gắn trên carbon mang oxygen ở δH 3.52 (1H, m, H–3), tín hiệu cộng hưởng của một nhóm methyl ketone tại 2.39 (3H, s, H–21) và tín hiệu cộng hưởng của hai nhóm methyl –CH3 ở δH 1.04 (3H, s, H–19), 0.92 (3H, s, H–18). Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT–NMR của hợp chất PA1 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 21 carbon. Trong đó, tín hiệu cộng hưởng của carbon ketone không no tại δC 197.0 (>C=O, C–20), bốn carbon olefin tại δC 155.6 (>C=, C–17), 144.5(=CH–, C–16), 141.6 (>C=, C–5), 121.2 (=CH–, C–6), carbon gắn oxygen tại δC 71.9 (>CH–O–, C–3), một nhóm methyl ketone tại δC 27.3 (–CH3, C–21) và hai nhóm methyl –CH3 tại δC 19.5 (–CH3, C–19), 15.9 (– CH3, C–18). Từ các dữ kiện của phổ NMR trên và tài liệu tham khảo, hợp chất PA1 được dự đoán là steroid có khung sườn pregnane với hai liên kết đôi, một nhóm hydroxyl và một nhóm ketone. Về phổ HMBC, nhận thấy proton của nhóm methyl ketone tại δH 2.39 (3H, s, H–21) cho tương quan HMBC đến carbon carbonyl tại δC 197.0 (>C=O, C–20) và carbon olefin tại δC 155.6 (=C C=O, C–20) giúp xác định nối đôi nằm tại vị trí carbon C16–17. Tương tự, proton methyl ở δH 1.04 (3H, s, H–19) tương quan HMBC đến carbon olefin ở δC141.6 (=C CH–, C–8) giúp xác định nối đôi nằm tại vị trí carbon C5–6. Một số tương quan HMBC khác được trình bày trong hình 3.2. Qua các dữ kiện của phổ NMR ở trên và kết hợp dữ liệu phổ của hợp chất 16-dehydropregnenolone [30] cho thấy có sự tương đồng nên cấu trúc của hợp chất PA1 được đề nghị là 16-dehydropregnenolone. 24
  36. Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PA1 và 16-dehydropregnenolone 16-dehydropregnenolone PA1 (CDCl ) 3 (CDCl ) [30] Vị trí carbon 3 δ (ppm) δ (ppm) δ H δ (ppm) H C (J-Hz) C (J-Hz) (ppm) 1 37.3 37.2 2 31.8 31.7 3 3.52 (m) 71.9 3.58 71.8 4 42.5 42.4 5 141.6 141.5 6 5.36 (dd, 2.5, 3.0) 121.2 5.48 121.1 7 31.7 31.6 8 30.4 30.3 9 50.7 50.6 10 36.9 36.8 11 20.8 20.8 12 34.9 34.8 13 46.3 46.2 14 56.6 56.6 15 32.4 32.3 16 6.70 (dd, 2.0, 3.0) 144.5 6.70 144.4 17 155.6 155.6 18 0.92 (s) 15.9 0.92 15.8 19 1.04 (s) 19.5 1.05 19.4 20 197.0 196.7 21 2.39 (s) 27.3 2.26 27.2 16-Dehydropregnenolone (PA1) Hình 3.2. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất PA1 25
  37. 3.3. Khảo sát cấu trúc hợp chất PA2 Hợp chất PA2 (10.9mg) thu được từ phân đoạn EA4.7.3 có những đặc điểm như sau: - Dạng bột, màu trắng. - Sắc kí lớp mỏng không hiện hình dưới đèn tử ngoại và hiện một vết duy nhất khi phun bằng H2SO4 20%, hơ nóng, bảng mỏng xuất hiện vết có màu cam nhạt. (dung môi giải ly n-hexane : acetone (9:1), Rf = 0.3) 1 - Phổ H-NMR (CDCl3, phụ lục 12, 12a và bảng 3.3) δH (ppm): 3.19 (1H, dd, J = 5.5, 11.0 Hz, H–3), 1.14 (3H, s, H–26), 0.96 (3H, s, H–23), 0.93 (3H, d, J = 6.0 Hz, H–30), 0.89 (3H, s, H–28), 0.87 (3H, d, J =5.0 Hz, H–29), 0.86 (3H, s, H–25), 0.77 (3H, s, H–24), 0.66 (1H, d, J = 5.5 Hz, H–27a) và 0.00 (1H, d, J = 5.5 Hz, H–27b). 13 - Phổ C-NMR (CDCl3, phụ lục 13, bảng 3.3) δC (ppm): 79.2 (>CH–O–, C– 3) và độ chuyển dịch của các carbon khác được trình bày trong bảng 3.3. - Phổ HSQC, HMBC (CDCl3, phụ lục 14, 15).  BIỆN LUẬN CẤU TRÚC Phổ 1H-NMR của hợp chất PA2 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của proton gắn trên carbon mang oxygen ở δH 3.19 (1H, dd, J = 5.5, 11.0 Hz, H–3). Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn thể hiện tính hiệu cộng hưởng proton năm nhóm methyl tứ cấp ở δH 1.14 (3H, s, H–26), 0.96 (3H, s, H–23), 0.89 (3H, s, H–28), 0.86 (3H, s, H–25), 0.77 (3H, s, H–24) và hai nhóm methyl bậc ba ở δH 0.93 (3H, d, J = 6.0 Hz, H–30), 0.87 (3H, d, J =5.0 Hz, H–29). Trên phổ cũng xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của hai proton thuộc nhóm methylene –CH2– của vòng cyclopropane ở tại δH 0.66 (1H, d, J = 5.5 Hz, H–27a) và 0.00 (1H, d, J = 5.5 Hz, H–27b). Phổ 13C-NMR và HSQC của hợp chất PA2 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 30 carbon. Trong đó, có tín hiệu cộng hưởng của carbon gắn nhóm 26
  38. hydroxyl tại δC 79.2 (>CH–O–, C–3), bảy tín hiệu carbon methyl tại δC 28.0 (– CH3, C–23), 15.4 (–CH3, C–24), 16.1 (–CH3, C–25), 18.0 (–CH3, C–26), 28.4 (– CH3, C–28), 18.1 (–CH3, C–29), 20.9 (–CH3, C–30), ba tín hiệu carbon cộng hưởng của nhóm methine tại δC 55.9 (>CH–, C-5), 50.1 (>CH–, C–9), 54.2 (>CH–, C–18). Ngoài ra trên phổ cũng xuất hiện tín hiệu cộng hưởng carbon methylene của vòng cyclopropane tại δC 13.5 (–CH2–, C–27). Từ các dữ kiện của phổ NMR trên và tài liệu tham khảo, hợp chất PA2 được dự đoán là triterpene với khung sườn ursane có một nhóm hydroxyl. Bên cạnh đó, tương quan HMBC của proton tại δH 3.19 (H–3) với carbon ở δC 55.9 (C–5), 38.6 (C–1), 28.0 (C–23) và 15.4 (C–24) xác định nhóm hydroxyl gắn trên carbon C–3. Ngoài ra phổ HMBC còn cho thấy sự tương quan từ proton ở δH 0.00 (H–27) với các carbon ở δC 54.2 (C–18), 35.3 (C–12), 26.7 (C–13), 21.4 (C–15) giúp xác định vòng cyclopropane gắn tại vị trí carbon C13– 14. Một số tương quan HMBC khác được trình bày trong hình 3.3. Qua các dữ kiện của phổ NMR ở trên và kết hợp dữ liệu phổ của hợp chất phyllanthol [17] cho thấy có sự tương đồng nên đề nghị cấu trúc của hợp chất PA2 là phyllanthol. 27
  39. Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PA2 và phyllanthol Vị trí PA2 (CDCl ) Phyllanthol (CDCl ) [17] 3 3 carbon δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δH (ppm) (J-Hz) δC(ppm) 1 38.6 38.7 2 27.4 27.5 3 3.19 (dd, 5.5, 11.0) 79.2 3.18 (dd, 5.8, 10.9) 79.3 4 39.0 39.1 5 55.9 55.9 6 18.3 18.3 7 38.6 38.7 8 37.1 37.2 9 50.1 54.2 10 37.5 37.5 11 17.8 17.8 12 35.3 35.4 13 26.7 26.6 14 32.4 32.4 15 21.4 21.5 16 27.4 27.5 17 32.1 32.1 18 54.2 50.3 19 40.9 41.0 20 38.6 38.7 21 31.2 31.3 22 42.2 42.3 23 0.96 (s) 28.0 0.96 (s) 28.1 24 0.77 (s) 15.4 0.77 (s) 15.5 25 0.86 (s) 16.1 0.86 (s) 16.2 26 1.14 (s) 18.0 1.11 (s) 18.2 27 0.00 (d, 5.5) 13.5 0.00 (d, 5.5) 13.5 0.66 (d, 5.5) 0.66 (d, 5.5) 28 0.89 (s) 28.4 0.89 (s) 28.4 29 0.87 (d, 5.0) 18.1 0.87 (d, 5.6) 18.3 30 0.93 (d, 6.0) 20.9 0.93 (d, 6.0) 20.9 28
  40. Phyllanthol (PA2) Hình 3.3. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất PA2 29
  41. CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. Kết luận Việc khảo sát thành phần hóa học từ vỏ thân của cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) được hái ở tỉnh Bình Thuận đã thu về những kết quả như sau: Từ phân đoạn EA4.3, EA4.6 và EA4.7 của phân đoạn EA4 cao ethyl acetate, thông qua các phương pháp chiết xuất và sắc ký đã cô lập được ba hợp chất, kí hiệu là PA1, PEE04 và PA2. Sử dụng các phương pháp phổ nghiệm và so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc của các hợp chất PA1, PEE04 và PA2 được đề nghị như sau: Periplogenin (PEE04) 16-Dehydropregnenolone (PA1) Phyllanthol (PA2) Periplogenin (PEE04) 16-Dehydropregnenolone Phyllanthol (PA2) (PA1) Ba hợp chất periplogenin (PEE04), 16-dehydropregenolone (PA1), phyllanthol (PA2) được cô lập từ cao ethyl acetate của vỏ thân cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) đều là những chất lần đầu tiên cô lập trong cây, trong đó hai hợp chất periplogenin (PEE04) và 16-dehydropregenolone (PA1) là những chất lần đầu tiên được phát hiện trong chi Phyllanthus. 30
  42. 4.2. Đề xuất Trong phạm vi của khóa luận, em chỉ mới nghiên cứu một số phân đoạn của cao ethyl acetate. Trong thời gian sắp tới, nếu có đủ điều kiện, em sẽ tiếp tục khảo sát các cao phân đoạn khác để có thể cô lập thêm những hợp chất khác. 31
  43. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt 1. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 695–696. 2. Đỗ Huy Bích (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ Thuật, 260-262. Tài liệu tham khảo Tiếng Anh 3. A.K. Jamal, W.A. Yaacob, Laily B. Din (2008), "A chemical study on Phyllanthus reticulatus", Journal of Physical Science, 19, 45–50. 4. Chun-Bin Yang, Fan Zang, Mei-Cai Deng, Guang-Yun He, Jian-Min Yue, Run-Hua Lu (2007), “A new ellagitannin from the fruit of Phyllanthus emblica L.”, Journal of the Chineses Chemical Society, 54, 1615–1618. 5. He Yana, Li Rong Han, Xing Zhang, Jun Tao Feng (2017), "Two new anti- TMV active chalconoid analogues from the root of Phyllanthus emblica", Natural Product Research, 31, 2143–2148. 6. João B. Calixto, Adair R. S. Santos, Valdir Cechinel Filho, Rosendo A. Yunes (1998), “A review of the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology, and therapeutic potential”, Medicinal Research Reviews, 18, 225–258. 7. M. Goretti V. Silva, Ícaro G. P. Vieira, Francisca N. P. Mendes, Irineu. L. Albuquerque, Rogério N. dos Santos, Fábio O. Silva, Selene M. Morais, M. Goretti V. Silva, Ícaro G. P. Vieira, Francisca N. P. Mendes, Irineu. L. Albuquerque, Rogério N. dos Santos, Fábio O. Silva, Selene M. Morais (2008), "Variation of ursolic acid content in eight Ocimum species from northeastern Brazil", Molecules, 13, 2482–2487. 8. Mahbuba Khatun, Mirajum Billah, Md. Abdul Quader (2012), “Sterols and sterol glucoside from Phyllanthus species”, Dhaka University Journal of Science, 60, 5–10. 32
  44. 9. Peter Junior, Max Wichtl (1979), "3-epi-periplogenin: ein neues cardenolid aus adonis verivaljs", Phytochemistry, 19, 2193–2197. 10. Prapawadee Puapairoj, Waree Naengchomnong, Anake Kijjoa, Madalena M. Pinto, Madalena Pedro, Maria São José Nascimento, Artur M. S. Silva, Werner Herz (2004), "Cytotoxic activity of lupane-type triterpenes from Glochidion sphaerogynum and Glochidion eriocarpum two of which induce apoptosis", Planta Medica, 71, 208–213. 11. Saem Han, Hye Min Kim, Jeong Min Lee, So-Youn Mok, Sanghuyn Lee (2010), "Isolation and identification of polymethoxyflavones from the hybrid Citrus, Hallabong", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 9488–9491. 12. Sharma Bhawna, Sharma Upendra Kumar (2010), “Hepatoprotective activity of some indigenous plants”, International Journal of PharmTech Research, 2, 568–572. 13. Sirinya Pientaweeratch, Vipaporn Panapisal, Anyarporn Tansirikongkol (2016), "Antioxidant, anti-collagenase and anti-elastase activities of Phyllanthus emblica, Manilkara zapota and silymarin: an in vitro comparative study for anti-aging applications", Pharmaceutical Biology, 54, 1865–1872. 14. Sitthichai Iamsaard, Supatcharee Arun, Jaturon Burawat, Wannisa Sukhorum, Porntip Boonruangsri, Malivalaya Namking, Nongnut Uanindut, Somsak Nualkaew và Bungorn Sripanidkulchai (2015), “Phyllanthus emblica L. branch extract ameliorates testicular damage in valproic acid – included rats”, International Journal of Morphology, 33, 1016–1022. 15. S.K. El-Desouky, Shi Young Ryu, Young-Kyoon Kim (2008), “A new cytotoxic acelated apigenin glucoside form Phyllanthus emblica L”, Natural Product Research, 22 (1), 91-95. 33
  45. 16. Tania Peshin, H. K. Kar (2017), "Isolation and characterization of β- sitosterol 3-O-β-D-glucoside from the extract of the flowers of Viola odorata", British Journal Pharmaceutical Research, 16,1–8. 17. Vuyelwa J. Ndlebe, Neil R. Crouch b,c, Dulcie A. Mulholland (2007), "Triterpenoids from the African tree Phyllanthus polyanthus", Phytochemistry Letters, 1, 11-17. 18. Wei-Yan Qi, Ya Li, Lei Hua, Ke Wang, Kun Gao (2013), “Cytotoxicity and structure activity relationships of phytosterol from Phyllanthus emblica”, Fitoterapia, 84, 252–256. 19. Wei Luo, Lingrong Wen, Mouming Zhao, Bao Yang, Jiaoyan Ren, Guanglin Shen, Gouhua Rao (2012), “Structural indentification of isomallotusisnin and other phenolics in Phyllanthus emblica L. fruit hull”, Food Chemistry, 132, 1527–1533. 20. Wei Luo, Mouming Zhao, Bao Yang, Jiaoyan Ren, Guanglin Shen, Guohua Rao (2011), “Antioxidant and antiproliferative capacities of phenolics purified from Phyllanthus emblica L. fruit”, Food Chemistry, 126, 277–282. 21. Xiaoli Liu, Chun Cui, Mouming Zhao, Jinshui Wang, Wei Luo, Bao Yang, Yueming Jiang (2008), “Identification of phenolics in the fruit of emblica (Phyllanthus emblica L.) and their antioxidant activities”, Food Chemistry, 109, 909-915. 22. Xiaoli Liu, Mouming Zhao, Jinshui Wang, Wei Luo (2007), “Antimicrobial and antioxidant activity of emblica extracts obtained by supercritical carbon dioxide extraction và methanol extraction”, Journal of Food Biochemistry, 33, 307–330. 23. Xiaoli Liu, Mouming Zhao, Kegang Wua, Xianghua Chai, Hongpeng Yu, Zhihua Tao, Jinshui Wang (2012), “Immunomodulatory and anticancer activities of phenolics from emblica fruit (Phyllanthus emblica L.)”, Food Chemistry, 131, 685–690. 34
  46. 24. Xinxian Zhu, Jianjun Wang, Yang Ou, Weiwei Han và Huaifang Li (2013), “Polyphenol extract of Phyllanthus emblica (PEEP) induces inhibition of cell proliferation and triggers apoptosis in cervical cancer cells”, European Journal of medical research, 18, 2–5. 25. Yang Fei Xiang, Ying Pei, Chang Qu, Zhicai Lai, Zhe Ren, Ke Yang, Sheng Xiong, Yingjun Zhang, Chongren Yang, Dong Wang, Qing Liu, Kaio Kitazato and Yifei Wang (2011), “In vitro anti-Herpes simplex virus activity of 1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose from Phyllanthus emblica L. (Euphorbiaceae)”, Phytotherapy Research, 25, 975-982. 26. Ying-Jun Zhang, Takashi Tanaka, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2001), “New phenolic constituents from the fruit juice of Phyllanthus emblica”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 49, 537–540. 27. Ying-Jung Zhang, Takashi Tanaka, Yoko Iwamoto, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2000), “Phyllaemblic acid, a novel highly oxygenated norbisabolane form the root of Phyllanthus emblica”, Tetrahedron Letters, 41, 1781–1784. 28. Ying-Jun Zhang, Takashi Tanaka, Yoko Iwamoto, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2001), “Novel norsesquiterpenoids from the root of Phyllanthus emblica”, American Chemical Society and American Society of Pharmacognosy, 63, 1507–1510. 29. Ying-Jung Zhang, Tomomi Abe, Takashi Tanaka, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2001), “Phyllanemblinins A-F, new ellagitannins from Phyllanthus emblica”, Journal of Natural Products, 64, 1527–1532. 30. Zsuzsa Szendi, Peter Forgó, Frederick Sweet (2000), "Complete 1H and 13C NMR spectra of pregnenolone", Steroids, 60, 442 - 446. 35
  47. PHỤ LỤC 36
  48. 19 18 22 21a 21b 3 17 Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất PEE04
  49. 22 3 14 20, 23 Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất PEE04
  50. 18 10 13 12 9 15 1 17 2 16 7 11 19 4 8 6 Phụ lục 2a. Phổ 13C-NMR dãn rộng của hợp chất PEE04
  51. 22 17 8 3 9 18 19 14 20, 23 5 Phụ lục 3. Phổ DEPT của hợp chất PEE04
  52. 19 18 22 21a 21b 3 17 18 19 17 3 21 22 Phụ lục 4. Phổ HSQC của hợp chất PEE04
  53. 19 18 22 21a 21b 3 17 17 3 21 22 20, 23 Phụ lục 5. Phổ HMBC của hợp chất PEE04
  54. 21 19 18 16 6 3 Phụ lục 6. Phổ 1H-NMR của hợp chất PA1
  55. 18 14 9 4 1 12 15 8 11 19 21 13 10 6 3 16 5 17 20 Phụ lục 7. Phổ 13C-NMR của hợp chất PA1
  56. 6 3 14 9 16 8 19 18 21 5 13 20 17 Phụ lục 8. Phổ DEPT (CDCl3) của hợp chất PA1
  57. 21 19 18 16 6 3 18 19 21 3 6 16 Phụ lục 9. Phổ COSY (CDCl3) của hợp chất PA1
  58. 21 19 18 16 6 3 21 3 6 16 Phụ lục 10. Phổ HSQC (CDCl3) của hợp chất PA1
  59. 21 19 18 16 6 3 18 19 21 13 14 17 20 Phụ lục 11. Phổ HMBC (CDCl3) của hợp chất PA1
  60. 27a 3 27b Phụ lục 12. Phổ 1H-NMR của hợp chất PA2
  61. 24 23 26 3 30 27a 27b 3 Phụ lục 12a. Phổ 1H-NMR dãn rộng của hợp chất PA2
  62. 2,16 1 25 24 22 19 21 28 15 30 6 11 12 27 8 17 4 10 13 14 3 5 9 18 Phụ lục 13. Phổ 13C-NMR của hợp chất PA2
  63. 26 23 24 27a 27b 3 27 9 18 5 3 Phụ lục 14. Phổ HSQC (CDCl3) của hợp chất PA2
  64. 26 23 24 3 27a 27b 27 24 15 13 12 9 18 5 3 Phụ lục 15. Phổ HMBC (CDCl3) của hợp chất PA2