›

Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae

pdf 86 trang thiennha21 15/04/2022 7280
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_thanh_phan_hoa_hoc_cua_trai_chuoi_hot_mus.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HỒ CHÍ MINH  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TRÁI CHUỐI HỘT ( MUSA BALBISIANA COLLA ) HỌ MUSACEAE Người hướng dẫn khoa học ThS. PHÙNG VĂN TRUNG Người thực hiện LÊ THỊ THU HIỀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 2012
  2. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae LỜI CẢM ƠN Luận văn này được thực hiện tại phòng Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên – Viện Công Nghệ Hóa Học – Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam; số 1 Mạc Đĩnh Chi, phường Bến Nghé, quận 1, TP. Hồ Chí Minh; năm 2012. Với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến: PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hạnh Nguyên Phó Viện Trưởng Viện Công Nghệ Hóa Học – Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam. Cô đã truyền đạt cho em những kiến thức chuyên môn, luôn động viên và luôn tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận. ThS. Phùng Văn Trung Phó Trưởng phòng Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên Thầy đã truyền đạt cho em kiến thức chuyên môn, tận tình hướng dẫn kỹ thuật cũng như những kinh nghiệm hết sức quý báu và đầy tâm huyết trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Quý thầy cô Ban Giám Hiệu trường Đại Học Sư Phạm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa Hóa-Tổ Hóa Hữu Cơ, cùng tất cả quý thầy cô giáo đã trang bị cho em những kiến thức nền tảng vững chắc trong suốt thời gian học tại trường, niên khóa 2008-2012. Các anh chị và các bạn thực hiện đề tài luận văn tại phòng Hoá Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên, năm 2012 đã giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng con rất cảm ơn gia đình đã giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện từ vật chất đến tinh thần cho con học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. TP.Hồ Chí Minh, tháng 05, năm 2012. LÊ THỊ THU HIỀN NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 1
  3. MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn M c l c i Danhụ ụm c các ký hi u, ch vi t t t iv Danh mụcụ các bảng ệ ữ ế ắ vi Danh mục các hình vii Danh mục các sơ đồ viii Danh mục các biểu đồ viii Danh mục các đồ thị viii Danh mục các phụ lục ix Lời mở đầu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Đại cương về thực vật 1. 1. Đặc điểm thực vật 1 1. 1. 1. Giới thiệu 1 1. 1. 2. Mô tả thực vật 1 1. 1. 3. Phân bố và sinh thái 3 1. 2. Y học dân gian 3 1. 3. Y dược học và hóa sinh hiện đại 4 2. Một số công trình nghiên cứu về chuối hột 2. 1. Một số công trình nghiên cứu nước ngoài 5 2. 2. Một số công trình nghiên cứu trong nước 5 3. Các chất đã phân lập được từ chuối hột 7 CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học 1. 1. Phương pháp phân nhóm. 11 1. 2. Phương pháp tinh chế 12 1. 2. 1. Phương pháp kết tinh 12 1. 2. 2. Phương pháp sắc ký 12 1. 3. Phương pháp cấu trúc 13
  4. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 1. 3.1. Phương pháp khối phổ MS 13 1. 3.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 2. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học 14 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 1. HÓA CHẤT- DỤNG CU- THIẾT BỊ 1. 1. Hóa chất. 16 1. 2. Dụng cụ 16 1. 3. Thiết bị 16 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Nghiên cứu thành phần hóa học 19 2. 1. 1. Nguyên liệu 19 2. 1. 2. Trích ly cao thô 19 2. 1. 3. Phân lập các chất 22 2. 1. 3. 1. Chất Mb01 22 2. 1. 3. 2. Chất Mb02 23 2. 1. 3. 3. Chất Mb04 25 2. 1. 4. Tinh chế các chất 26 2. 1. 4. 1. Chất Mb01 26 2. 1. 4. 2. Chất Mb02 27 2. 1. 4. 3. Chất Mb04 28 2.2. Nghiên cứu hoạt tính sinh học 30 2. 2. 1. Mục tiêu 30 2. 2. 2. Tiến hành 30 2. 2.2. 1. Chuẩn bị hóa chất 30 2. 2.2. 2. Dựng đường chuẩn 30 2. 2.2. 3. Đo mẫu ức chế 30 2. 2. 3. Kết quả 31 2. 2. 3. 1. Khảo sát mật độ quang của các dung dịch PNP có nồng độ Ci 31 2. 2. 3. 2. Khảo sát hoạt ức chế men α- glucosidase của các mẫu ức chế 31 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 1
  5. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 1. NHẬN DANH CẤU TRÚC CÁC CHẤT TINH KHIẾT 1.1. Nhận danh Mb01 33 1.2. Nhận danh Mb02 37 1.3. Nhận danh Mb04 37 2. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 2.1. Kết quả khảo sát mật độ quang của đường chuẩn 37 2.2. Khảo sát hoạt ức chế men α- glucosidase của các mẫu ức chế 37 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận 45 2. Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC NHẬN XÉT NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 2
  6. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ A Absorbane (mật độ quang) (A) Analytic (phân tích) COSY Correlation Spectroscopy 13C–NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance d Doublet (mũi đôi) dd Doublet of doublet (mũi đôi- mũi đôi) dm Dung môi DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimethyl sulfoxide EtOH Ethanol 1H–NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation High Performance Liquid Chromatography HPLC (sắc ký lỏng cao áp) HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation J Coupling constant (hằng số ghép) m Multiplet (mũi đa) mp. Melting point (điểm nóng chảy) PA Preparative Analytic (điều chế) PĐ Phân đoạn Preparative High Performance Liquid Chromatography P-HPLC (sắc ký lỏng điều chế) PNP p-nitrophenol PNP-Glc p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside ppm Parts per million q Quartet (mũi bốn) R f Retardation factors (yếu tố làm chậm trễ) s Singlet (mũi đơn) NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 3
  7. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae t Triplet (mũi ba) T Technicality (kỹ thuật) TLC Thin Layer Chromatography (sắc ký lớp mỏng) δ Chemical shift (độ dịch chuyển hóa học) α – Glc α – glucosidase NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 4
  8. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1: Kết quả quá trình trích ly cao thô 20 Bảng 2: Kết quả chạy cột cao áp cao H 22 Bảng 3: Kết quả chạy cột cao áp phân đoạn HA 23 Bảng 4: Kết quả chạy cột P-HPLC phân đoạn HE 24 Bảng 5: Kết quả chạy cột P-HPLC phân đoạn HE1 25 Bảng 6: Kết quả chạy cột P-PHPLC phân đoạn HE3B 26 Bảng 7: Thành phần các dung dịch PNP nồng độ Ci 30 Bảng 8: Thành phần các dung dịch ức chế có nồng độ Ci 31 Bảng 9: Thành phần mẫu trắng có nồng độ Ci 31 Bảng 10: Mật độ quang của các dung dịch PNP ở các nổng độ Ci 31 Bảng 11: Kết quả thử hoạt tính ức chế α- glucosidase của cao tổng 31 Bảng 12: Kết quả thử hoạt tính ức chế α- glucosidase của cao H 32 Bảng 13: Kết quả thử hoạt tính ức chế α- glucosidase của Mb01 32 Bảng 14: Kết quả thử hoạt tính ức chế α- glucosidase của thuốc Acarbose 32 Bảng 15: Số liệu phổ 13C-NMR, 1H –NMR và DEPT của Mb01 38 Bảng 16: Số liệu phổ HMBC và 1H-1H COSY của Mb01 39 Bảng 17 : So sánh 13C (δ ppm) của Mb01 với tài liệu tham khảo 41 Bảng 18: Mật độ quang của các dung dịch PNP ở các nổng độ Ci 42 Bảng 19: Kết quả thử hoạt tính ức chế α- glucosidase của cao tổng 43 Bảng 20: Kết quả thử hoạt tính ức chế α- glucosidase của cao H 44 Bảng 21: K ết quả thử hoạt tính ức chế α- glucosidase của Mb01 44 Bảng 22: Kết quả thử hoạt tính ức chế α- glucosidase của thuốc Acarbose 45 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 5
  9. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1 : Cây chuối hột trưởng thành 2 Hình 2: Cây chuối hột con 2 Hình 3: Lá chuối hột 2 Hình 4: Nải chuối hột 2 Hình 5: Trái chuối hột 2 Hình 6: Mặt cắt trái chuối hột 2 Hình 7: Một số thực phẩm chức năng chiết xuất từ chuối hột 4 Hình 8: Cân điện tử hiệu TANITA KD–200 17 Hình 9: Máy siêu âm Elma S 100 H Elmasonic 17 Hình 10: Cân điện tử hiệu PRECISA XB 220ª 17 Hình 11: Máy thổi khí Nitogen N2LCMS hiệu Claind 17 Hình 12: Máy Máy đo nhiệt độ nóng chảy Electrothermal IA 9000 Series 18 Hình 13: Máy soi UV MINERALIGHT ® LAMP (U.S.A) 18 Hình 14: Máy sắc ký điều chế NovaPrep 200 18 Hình 15: Máy cô quay chân không hiệu BUCHI Rotavapor R–200 18 Hình 16: Máy đo pH 18 Hình 17: Máy đo mật độ quang EL x 800(Biotek, Mỹ) 18 Hình18: Mẫu chuối hột tươi 19 Hình19: Mẫu trái chuối hột đã được thái mỏng tưoi 19 Hình 20: Mẫu trái chuối hột đã được thái mỏng khô 19 Hình 21: Tinh thể Mb01 27 Hình 22: TLC của Mb01 hiện hình bằng H2SO4 10% trong ethanol 27 Hình 23: Dạng vô định hình của Mb02 28 Hình 24: TLC của Mb02 hiện hình bằng H2SO4 10% trong ethanol 28 Hình 25: Dạng vô định hình của Mb04 28 Hình 26: TLC của Mb04 hiện hình bằng H2SO4 10% trong ethanol 28 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 6
  10. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 1: Quy trình trích ly các cao từ trái chuối hột 21 Sơ đồ 2: Tổng kết quá trình cô lập và tinh chế các chất 29 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 1: Chương trình chạy cột cao áp cao H 22 Biểu đồ 2: Chương trình chạy cột P-HPLC phân đoạn HE 24 Biểu đồ 3: Chương trình chạy cột P-HPLC phân đoạn HE1 24 Biểu đồ 4: Chương trình chạy cột P-HPLC phân đoạn HE3 25 Biểu đồ 5: Chương trình chạy cột P-HPLC phân đoạn HE3B 26 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Trang Đồ thị 1: Mật độ quang của các dung dịch PNP ở các nổng độ Ci 37 Đồ thị 2: Hoạt tính ức chế ức chế α- glucosidase của cao tổng 38 Đồ thị 3: Hoạt tính ức chế ức chế α- glucosidase của cao H 38 Đồ thị 4: Hoạt tính ức chế ức chế α- glucosidase của Mb01 39 Đồ thị 5: Hoạt tính ức chế ức chế α- glucosidase của thuốc Acarbose 39 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 7
  11. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: PHỔ Mb01 Phụ lục 1.1: Phổ 13C-NMR của Mb01 Phụ lục 1.1a: Phổ 13C-NMR của Mb01 Phụ lục 1.2: Phổ DEPT của Mb01 Phụ lục 1.2a: Phổ DEPT của Mb01 Phụ lục 1.3: Phổ 1H-NMR của Mb01 Phụ lục 1.3a: Phổ 1H-NMR của Mb01 Phụ lục 1.3b: Phổ 1H-NMR của Mb01 Phụ lục 1.4: Phổ COSY của Mb01 Phụ lục 1.4a: Phổ COSY của Mb01 Phụ lục 1.4b: Phổ 1H-NMR của Mb01 Phụ lục 1.5: Phổ HSQC của Mb01 Phụ lục 1.5a: Phổ HSQC của Mb01 Phụ lục 1.6: Phổ HMBC của Mb01 Phụ lục 1.6a: Phổ HMBC của Mb01 Phụ lục 1.6b: Phổ HMBC của Mb01 Phụ lục 1.6c: Phổ HMBC của Mb01 Phụ lục 1.6d: Phổ HMBC của Mb01 PHỤ LỤC 2: PHỔ Mb02 Phụ lục 2.1: Phổ 1H-NMR của Mb02 Phụ lục 2.1a: Phổ 1H-NMR của Mb02 PHỤ LỤC 3: PHỔ Mb04 Phụ lục 3.1: Phổ 1H-NMR của Mb04 Phụ lục 3.1a: Phổ 1H-NMR của Mb04 Phụ lục 3.1b: Phổ 1H-NMR của Mb04 Phụ lục 3.1c: Phổ 1H-NMR của Mb04 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 8
  12. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae LỜI MỞ ĐẦU Trên thế giới, những loại cây thuốc thường được dùng để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau trong các phương thuốc dân gian (Palombo, 2005). Những kiến thức dân gian này, được truyền tử đời này qua đời khác, đã đóng góp quan trọng đến sự phát triển của hệ thống các loại thuốc dân gian (Jackak va Saklani, 2007) từ đó tìm ra được những kiến thức khoa học căn bản trong việc sử dụng chúng trong dân gian [15]. Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới, gió mùa, độ cao khôngđều, diện tích vùng núi và vùng trung du chiếm đến 70% với điều kiện môi trường tự nhiên thuận lợi tạo nên một hệ thực vật rất phong phú và đa dạng. Theo các số liệu thống kê mới nhất, thảm thực vật Việt Nam nguồn tài nguyên sinh học quý giá có trên 12000 loài, trong số đó có tới hơn 3200 loài được sử dụng làm thuốc hay thực phẩm chức năng trong Y học dân gian. Dân số Việt Nam gồm nhiều dân tộc anh em sinh sống, từ xa xưa đã có truyền thống chữa bệnh bằng cây cỏ mà Hải Thượng Lãn Ông gọi chung là thảo dược. Từ nhiều thế hệ, người dân đã sử dụng tri thức bản địa để phòng và chữa bệnh cho bản thân và cộng đồng. Ở Việt Nam, chuối hột đã được trồng từ lâu để lấy lá gói bánh; quả chín ăn được; còn hạt được coi là một vị thuốc quý. Theo kinh nghiệm dân gian, trái chuối hột có công dụng chữa bệnh đường ruột, sỏi đường tiết và đặc biệt là bệnh đái tháo đường. Đái tháo đường là một trong những bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa có mức tăng nhanh chóng trong thời gian gần đây cả về số lượng cũng như chi phí điều trị trở thành gánh nặng về kinh tế và xã hội đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Việt Nam nằm trong số các quốc gia có số người mắc bệnh đái tháo đường tăng nhanh chóng. Số liệu điều tra quốc gia năm 2002- 2003 thông báo tỷ lệ mắc bệnh trong cả nước là 2.7 %.[11] Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla) họ Musaceae ”. Những kết quả của đề tài sẽ góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa của trái chuối hột và tạo cơ sở để tiến hành khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng đái tháo đường của trái chuối hột bằng phương pháp nghiên cứu khả năng ức chế men α- glucosidase của trái chuối hột. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 9
  13. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ THỰC VẬT. 1. 1. Đặc điểm thực vật. 1. 1. 1. Giới thiệu: Cây chuối thuộc lớp Đơn tử diệp, bộ Scitaminales, họ Musaceae, giống Musa L., giống phụ Enmusa (Simmonds 1962, Champion 1963). Chuối hột thuộc giống Musa L., loài balbisiana [6]. Tên khoa học: Musa balbisiana Colla[6]. Tên Việt Nam: chuối hột, chuối chát[6]. Tên nước ngoài: balbisiana, balbis banana, starchy banana, mealy banana, seedy banana, wild (starchy) banana, devil banana và seeded “apple” banana (Maui, Hawai’i), Pisang Klutuk Wulung, Botohan, và Pacol (Philippines)[20]. 1. 1. 2. Mô tả thực vật[6]: Cây thảo lớn có thân rễ to (củ chuối). Thân trên do các bẹ lá to mọng nước mọc ôm lấy nhau (thân giả). Thân giả cao 2-4 m. Lá dài 1-1,5 m, có cuống mập hình máng, gân giữa to, lồi lên ở mặt dưới, gân phụ song song. Cụm hoa mọc tử thân rễ trên một thân thật xuyên qua thân giả thành bông dài gồm nhiều lá bắc màu đỏ tía, mỗi lá bắc mang nhiều hoa xếp đều đặn thành nải chuối khi quả chính và lá bắc rụng đi; bao hoa có 3 lá dài, 3 cánh hoa và 5 nhị; bầu hạ. Trái mọng, to và thẳng, có 5 cạnh, có hột. Hột: màu nâu đen, có dạng trứng, kích thước khoảng 4-5 mm, nội nhũ dạng bột, trắng. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 1
  14. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae Hình 1: Cây chuối hột trưởng thành Hình 2: Cây chuối hột con Hình 3: Lá chuối hột Hình 4: Nải chuối hột Hình 5: Trái chuối hột Hình 6: Mặt cắt trái chuối hột NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 2
  15. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 1. 1. 3. Phân bố và sinh thái Chuối là một loại cây quen thuộc của vùng nhiệt đới. Bắt nguồn từ Tây Nam Thái Bình Dương, chuối đã được trồng ở Ấn Độ vào khoảng 600 năm trước công nguyên và sau đó được trồng lan rộng ra khắp vùng nhiệt đới. Chuối có thể là loài cây trồng được biết đến sớm nhất thế giới. Nó thậm chí đã được trồng lan rộng ở các đảo của Thái Bình Dương và bờ tây châu Phi vào khoảng 200- 300 năm trước công nguyên[18]. Đa số các giống chuối trồng hiện nay là do sự kết hợp hợp giữa hai loài hoang dại là Musa acuminata Colla và Musa balbisiana Colla (Stover and Simmonds 1987). Simonds (1962) gọi kiểu gen của M. acuminata Colla là AA và kiểu gen của M. balbisiana Colla là BB. Hiện nay, chưa thống kê được số loài thuộc chi Musa L. trên toàn thế giới. Ở vùng nhiệt đới châu Á, cụ thể là khu vực Ấn Độ- Malaysia và Đông Dương- Thái Lan có thể là những trung tâm có sự đa dạng cao của chi này, đặc biệt là các quần thể chuối mọc hoang dại. Ấn Độ có 14 loài; Việt Nam 10 loài và Malaysia có số loài nhiều hơn.[18] Ở Việt Nam, chuối hột đã được trồng từ lâu để lấy lá gói bánh; quả chin ăn được; còn hột được coi là một vị thuốc quý[6]. Chuối hột là loại cây ưa ẩm, có sức sống khỏe hơn các loại chuối trồng khác. Cây có khả năng chịu bóng và có thể cạnh tranh được với một vài loài cây trồng khác. Do đó, để tận dụng đất đai, người ta thường trồng chuối hột ở góc vườn, dưới bóng các cây ăn quả khác, thậm chí cây được trồng sát bụi tre mà vẫn sinh trưởng phát triển tốt. Hàng năm, từ gốc cây mẹ thường mọc lên 1-3 cây chồi. Ngoài ra hạt chuối hột có khả năng nảy mầm tốt để tạo thành cây con[6]. 1. 2. Y học dân gian [6] Quả chuối hột lúc còn xanh được ăn thay rau, quả chin ăn được nhưng không ngon, lại có tác dụng tẩy giun. Ở một số địa phương, người ta dùng quả chuối hột xanh chữa sỏi đường tiết niệu theo cách làm sau: lấy 7-8 trái thái mỏng, sao vàng, rồi lấy 30-50g hạ thổ rồi sắc uống 3-4 bát mỗi ngày vào lúc no. Có thể cho vào ấm hãm với nước sôi như pha trà, ngày uống 3–4 lần. Cũng có nơi người ta dùng hạt chuối hột để tống sỏi, như trường hợp anh Nguyễn Thành T., đau quặn thận, chụp phim thấy một NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 3
  16. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae viên sỏi 8mm ở đoạn giữa của niệu quản trái và 2 viên 4mm ở bàng quang. Dùng hột trái chuối hột, rang giòn giã nát, rây bột. Mỗi ngày dùng 2 thìa canh bột cho vào ấm tích chế nước sôi như pha trà uống. Trong thời gian uống thuốc thấy có chất lắng đục ở đáy dụng cụ đựng nước tiểu qua đêm. Uống liên tục trong 30 ngày, sỏi ra hết thành những viên nhỏ hơn trong phim chụp. Vỏ chuối hột (40g) phơi khô sao hơi vàng, tán bột; quế chi (4g), cam thảo (2g) tán bột. Trộn đều 2 bột luyện với mật làm viên uống 2–3 lần trong ngày với nước ấm chữa đau bụng kinh nhiên. Hoặc vỏ chuối hột 20g, rễ gai tầm xooang 20g, vỏ quả lựu 20g, rễ tầm xuân 20g, búp ổi 10g phơi khô, thái nhỏ. Sắc uống chữa kiết lỵ. Củ chuối hột giã nát vắt lấy nước uống chữa sốt cao, mê sảng. Củ chuối hột phối hợp với củ xả, tẩm gửi cây táo hay vỏ cây táo (mỗi thứ 4g) thái nhỏ sao vàng, sắc với 200ml nước còn 50ml uống làm một lần trong ngày chữa kiết lỵ ra máu. Củ chuối hột phối hợp với tầm gửi cây dâu, rễ cỏ tranh, thài lài tía, mỗi thứ 15g. Sắc nước uống, chữa ho ra máu. Củ chuối hột, củ chuối rừng, rễ cây móc, mỗi thứ 10-20g sao vàng sắc uống là thuốc an thai của đồng bào Thái ở Tây Bắc. Thân cây chuối hột còn non, cắt một đoạn nướng chín ép lấy nước ngậm chữa răng đau. Nước tiết ra từ thân cây chuối hột chữa đái đường. Theo tài liệu nước ngoài, nước sắc thân và lá chuối hột có tác dụng lợi tiểu, chữa phù thủng. Quả chuối hột có tác dụng chữa bệnh đái đường, viêm thận, cao huyết áp; nước hãm củ chuối hột uống mát, giải độc, kích thích tiêu hóa. 1. 3. Y dược học và hoá sinh học hiện đại Hiện nay trên thị trường đã có một số sản phẩm chiết xuất từ chuối hột nhưng chỉ ở dạng thực phẩm chức năng. Hình 7: Một số thực phẩm chức năng chiết xuất từ chuối hột NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 4
  17. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 2. MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CHUỐI HỘT 2. 1. Một số công trình nghiên cứu nước ngoài Trên thế giới, năm 1992, tác giả M. Ali của trường Đại học Hamdard tại Ấn Độ đã cô lập thành công 3 hợp chất thuộc họ neo- clerodance diterpenoid được đặt tên là musabalbisianes A (1), B (2) và C (3) từ dịch dịch chiết chloroform của hột chuối hột[14]. Vào năm 2006, nhóm các tác giả María J. Pascual – Villalobos và Benjamín Rodríguez từ Tây Ban Nha đã phân lập được một ester béo của phytol (4), một ester béo của n-alkanol (5), và một hỗn hợp của β-sitosterol (6) và stigmasta- 5, 22 E- dien- 3β- ol (7) từ cao chloroform hột chuối hột. Từ dịch chiết acetone, các tác giả trên cũng phân lập được một hợp chất (+)–Epiafzelechin (8). Chất này cũng đã được thử nghiệm khả năng chống lại loài Cryptolestes pusillus Schocherr- một loài côn trùng gây hại cho các loại ngũ cốc[16]. 2. 2. Một số công trình nghiên cứu trong nước Tại Việt Nam, từ năm 1998 đến năm 2002, hàng loạt các thử nghiệm khảo sát các tác dụng dược lý của chuối hột như tác dụng trên sỏi niệu của một số chế phẩm từ chuối [1], tính lợi tiểu [2], tính kháng khuẩn của chuối hột [4] đã được tác giả Bùi Mỹ Linh cùng một số tác giả khác thực hiện. Năm 2002, các tác giả Huỳnh Tú Quyên, Bùi Mỹ Linh của trường đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh đã chiết xuất và phân lập một số hợp chất kém phân cực trong hột chuối hột. Tiến hành theo phương pháp phân tích hóa thực vật của trường Đại học Dược khoa Rumani kết hợp với giáo trình thực tập Dược liệu của Bộ môn Dược liệu trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh cho thấy trong hôt chuối hột có: Flavonoid (leuco), acid béo, Coumarin, Phytosterol, Tanin, acid hữu cơ, đường khử, hợp chất Urolic Đồng thời, các tác giả cũng đã thăm dò các phương pháp chiết xuất phân đoạn (phương pháp chiết nóng bằng Soxhlet với dung môi có độ phân cực tăng dần và phương pháp phân bố lỏng–lỏng với dung môi có độ phân cực tăng dần). Mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng. Các tác giả đề nghị rằng nên chọn phương pháp chiết nóng nhưng cải tiến bằng siêu âm và chỉ khảo sát phân đoạn kém phân cực [3]. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 5
  18. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae Năm 2003, các tác giả Trần Văn Sung, Trương Bích Ngân, Trịnh Thị Thủy của viện Hóa học, trung tâm KHTN & CNQG đã sơ bộ nghiên cứu thành phần hóa học của trái chuối hột của Việt Nam. Kết quả đã phân lập được hai hợp chất là cyclomusalenon [(24S)-24 methyl-29-norcycloart -25-en-3-on] (9) và stigmasterol (7). Stigmasterol là một sterol khá phổ biến trong tự nhiên. Cyclomusalenon là một triterpen năm vòng có chứa vòng cyclopropan có cấu trúc 3-oxo-29-norcycloartan tương đối ít gặp trong tự nhiên[12]. Năm 2004, nhóm tác giả Đỗ Quốc Việt, Trần Văn Sung, Nguyễn Thanh Thúy của viện Hóa học, Trung tâm KHTN & CNQG kết hợp với trường đại học Y Hà Nội đã sơ bộ nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của trái chuối hột trên chuột thực nghiệm. Bằng phương pháp tiêm trực tiếp thuốc thử lên màng bụng của chuột, các tác giả thấy rằng các mẫu thử từ quả chuối hột có phần vượt trội hơn dịch chiết toàn phần than rễ cây tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) và gần tương đương với dịch chiết toàn phần than rễ thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) – là hai vị thuốc thường được sử dụng trong điều trị bệnh đái tháo đường - ở cùng một nồng độ. Đáng lưu ý là hoạt chất cyclomusalenon chiếm khoảng 0.85% (so với cao toàn phần) nhưng lại có tác dụng hạ đường huyết gần bằng với lượng cao toàn phần tương đương (0.82%), cho thấy có thể hoạt tính hạ đường huyết của cao toàn phần chủ yếu là do cyclomusalenon[7]. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 6
  19. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 3. CÁC CHẤT ĐÃ ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CHUỐI HỘT Musabalbisianes A [14]: O H OHC O OH CH2OH HO HOOC CHO OH HOOC (1) Công thức phân tử: C23H28O12 Khối lượng phân tử: 496 Musabalbisianes B [14]: O H HO O OH CH2OH HO OHC COOH OH HOOC (2) Công thức phân tử: C23H30O12 Khối lượng phân tử: 498 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 7
  20. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae Musabalbisianes C[14]: O H O HOH2C OH CH O 3 CH2OH O OH HOH2C CH3 CH2OH HOOC (3) Công thức phân tử: C28H40O12 Khối lượng phân tử: 568 CH3 H3C O (CH2)n CH3 CH CH CH 3 3 3 CH2 (4) O 3C (CH2)n O (CH )n 2 CH3 (5) NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 8
  21. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae β- sitosterol[6]: H3C CH3 H3C CH3 H3C CH3 HO (6) Công thức phân tử: C29H45O Khối lượng phân tử: 414 Stigmasterol[7]: H3C CH3 H3C CH3 H3C H3C H H HO (7) Công thức phân tử: C29H48O Khối lượng phân tử: 412 Tinh thể hình kim không màu, mp. 1700C (ethanol) NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 9
  22. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae (+) – Epiafzelechin[8]: OH HO O OH OH (8) Công thức phân tử: C15H14O5 Khối lượng phân tử: 274 Tinh thể hình kim màu trắng. mp. 248-251 0C (ethyl acetate) [7] Cyclomusalenon : [ 9 ] Công thức phân tử: C30H48O Khối lượng phân tử: 424 0 Là tinh thể hình kim màu trắng, mp. 133- 135 C ( CHCl3 ) Rf = 0.75, dung môi n-hexane/ ethyl acetate ( 90: 10 ) NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 10
  23. Nghiên cứu thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 1. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1. 1. Phương pháp phân nhóm[10] Để chiết tách các hợp chất tự nhiên ra khỏi mẫu cây bằng dung môi có thể dùng lần lượt các dung môi có tính phân cực tăng dần để chiết hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất bằng dung môi là ancol ( ethanol hay methanol), vì loại dung môi này có khả năng thấm xuyên qua màng tế bào thực vật, cũng như có thể tạo nói hydrogen liên phân tử với các nhóm phân cực khác, nên được xem là dung môi vạn năng, có thể chiết lấy được cả các hợp chất có độ phân cực mạnh, vừa và yếu. Trong mẫu cây có nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại rất phân cực đến loại không phân cực, vì thế muốn cô lập hợp chất mà áp dụng sắc ký cột trực tiếp ngay lên trên cao thô ban đầu sẽ rất khó đạt được kết quả mong muốn. Vì thế cần chia ra từng đoạn với độ phân cực khác nhau để cho quá trình cô lập chất được dễ dàng hơn. Muốn có các loại cao có độ phân cực khác nhau chỉ cần sử dụng các loại dung môi chiết có độ phân cực khác nhau, dựa trên nguyên tắc “ các chất giống nhau sẽ hòa tan nhau” Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung môi phù hợp, sử dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm, bằng máy chiết Soxhlet Chiết siêu âm là phương pháp chiết ngâm dầm cổ điển (Maceration) kết hợp với siêu âm. Tức là, ngâm mẫu cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó có chứa trong cây. Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của mẫu cây. Đặt bình chứa vào máy siêu âm, giữ ở nhiệt độ 60o trong 30 phút, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc của tế bào thực vật và hòa tan các chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa mẫu cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Dung môi thu hồi có thể được tiếp tục sử dụng cho các lần chiết sau. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 11
  24. Nghiên cứu thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 1. 2. Phương pháp tinh chế 1.2. 1. Phương pháp kết tinh Trong hóa học các hợp chất tự nhiên, người ta mong muốn cô lập chất có độ tinh khiết cao. Do đó, sau khi thực hiện sắc ký nhiều lần cần tiến hành kết tinh lại hợp chất để đạt độ tinh khiết 90- 95%. Có thể thực hiện kết tinh phân đoạn nhờ vào độ hòa tan khác nhau của các chất trong một dung môi nào đó hoặc kết tinh nhờ vào nhiệt độ lạnh. 1.2. 2. Phương pháp sắc ký Phương pháp sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại chất đó với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh) Phương pháp sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography) dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp phụ. Pha tĩnh là một lớp mỏng silica gel khoảng 25mm phủ lên bề mặt một tấm nhôm phẳng. Pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi. Mẫu cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1μL dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình. Khi pha động di chuyển chầm chậm dọc theo tấm bản mỏng vào tính mao quản sẽ lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mức dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào hiện tượng hấp thu của pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi. Nhờ vào đó có thể nhận biệt được sự hiện diện của các hợp chất khác nhau trong mẫu chất. Phương pháp sắc ký cột Pha tĩnh là là các hạt silicagel như silica gel 60, silica gel C18 Pha động là dung môi hay hỗn hợp dung môi. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 12
  25. Nghiên cứu thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae Ở phương pháp sắc ký này, các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu lên bề mặt của pha tĩnh. Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh và chúng cũng phụ thuộc vào tính chất của pha động. Kết quả là trong quá trình pha động di chuyển các hợp chất sẽ tách nhau ra. 1. 3. Phương pháp xác định cấu trúc 1.3.1. Phương pháp khối phổ MS [8] (Mass spectroscopy) Khối phổ là một kỹ thuật để để đo khối lượng phân tử của một phân tử. Bên trong máy đo khối phổ, ở áp suất thấp, phân tử cần phân tích đang ở trạng thái khí, bị bắn phá bởi những chùm tia điện tử có năng lượng cao. Sự bắn phá này sẽ tách một điện tử ra khỏi phân tử khảo sát làm cho phân tử biến thành một ion mang điện tích dương hoặc gốc tự do. Có nhiều cách tạo ra ion như bằng cách bắn phá điện tử (EI- MS), bằng hóa học (IC-MS) hoặc bằng cách phun ion (ESI-MS) .Chùm tia điện tử không chỉ làm tách một điện tử ra khỏi phân tử để tạo ra một ion phân tử mà còn làm đứt gẫy những nối hóa trị phân những ion phân tử thành những mảnh nhỏ hơn mang điện tích dương hay trung hòa. Những ion này sẽ đi qua một vùng tử trường mạnh và sẽ được phân loại dựa trên khối lượng/điện tích (m/z) của ion. Giá trị m/z của mỗi ion sẽ là khối lượng của nó. Do đó, dựa trên phổ MS có thể biết thông tin vể khối lượng, công thức nguyên của phân tử. 1.3.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [9] NMR là phương pháp phổ phân tích hiện đại, quan trọng trong hóa học, đặc biệt là hóa học hữu cơ. Cùng với phương pháp phân tích sắc ký, NMR là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong việc nghiên cứu cấu trúc. Có nhiều loại hạt nhân hoạt động bằng cách tự xoay quanh trục của nó. Do các hạt nhân mang điện nên khi chúng tự xoay quanh trục của mình sẽ làm nảy sinh ra từ trường có thể tương tác với một từ trường bên ngoài nếu có. Chỉ một số hạt nhân có số proton lẻ hoặc notron lẻ mới có đặc trưng này (1H, 13C ). Khi đó, các spin hạt nhân này sẽ định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường bên ngoài. Hai định hướng này không có cùng mức năng lượng (song song cùng chiều có mức năng lượng thấp hơn định hướng song song ngược chiều). Khi các hạt nhân này hấp thụ năng lượng được cung cấp từ một bức xạ điện từ có tần số thích hợp thì spin trạng thái năng NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 13
  26. Nghiên cứu thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae lượng thấp sẽ nhảy lện spin trạng thái có mức năng lượng cao hơn. Một máy rất nhạy ghi nhận sự hấp thụ năng lượng này và cho tín hiệu trên phồ đồ. Trên nguyên tắc chung này nhưng dựa vào nguyên tử khảo sát mà có nhiều loại phổ NMR một chiều (1H-NMR, 13C-NMR). Bên cạnh đó còn có các loại phổ NMR hai chiều là sự kết hợp của các loại phổ NMR một chiều (HMBC, HSQC, COSY ) 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC[19] Phương pháp ức chế men α-glucosidase trong điều trị đái tháo đường loại 2 là phương pháp ưu tiên sử dụng vì cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyền hóa đường hay cải thiện chức năng insulin hoặc kích thích sự sản sinh insulin của tế bào beta tuyến tụy như các phương pháp khác. Những hoạt chất có khả năng ức chế hoạt động men α-glucosidase như là Acarbose, Miglitol là những chất làm giảm nhanh lượng đường huyết sau bữa ăn [17]. Phương pháp in vitro để khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase dựa trên nguyên tắc: − Men α-glucosidase khi gặp nối α-D-glucose sẽ cắt đứt nối này để giải phóng đường D-glucose − Sử dụng chất nền có liên kết α với đường D-glucose như p-nitrophenyl-α-D- glucoryranoside, dưới tác dụng của men α- glucosidase sẽ bị thủy phân cho ra đường α-D- glucose và p-nitrophenol α-glucosidase PNP- Glc α-D- glucopyranoside + p-nitrophenol − Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với p- nitrophenol. p- nitrophenol hấp thu trong ánh sáng nhìn thấy được, nên tiến hành đo hấp thu ở bước sóng λ=405nm. Từ đó xác định được đường D- glucose sinh ra. − So sánh hàm lượng đường D- glucose sinh ra giữa mẫu có ức chế và mẫu không ức chế để xác định % ức chế. Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định nồng độ chất ức chế tại đó có thể ức chế 50% khả năng hoạt động của men α-glucosidase (IC50) NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 14
  27. Nghiên cứu thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae % ức chế được tính theo công thức [PNP] [PNP] % ứ ế = × 100 [PNP] 0 − i ℎ 0 Vỉ [PNP] tuyến tính bậc 1 với mật độ quang nên [A] [A] % ứ ế = × 100 [A] 0 − i Trong đó: ℎ 0 [PNP]0: nồng độ PNP sinh ra khi không sử dụng chất ức chế (mM) [PNP]i: nồng độ PNP sinh ra khi sử dụng chất ức chế có nồng độ Ci (mM) [A]0: độ hấp thu trung bình khi không sử dụng chất ức chế [A]i: độ hấp thu trung bình khi sử dụng chất ức chế có nồng độ Ci NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 15
  28. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 1. HÓA CHẤT- DỤNG CỤ- THIẾT BỊ 1. 1. Hóa chất  Acarbose 50mg (Standard chem & pharm. Co.)  Chloroform (PA) Trung Quốc  DMSO (A) Merck  Ethanol 96o (T) Việt Nam  Ether petrol (A)Trung Quốc  Ethyl acetate (PA) Trung Quốc  H2SO4 10%/EtOH ( Pha 50ml H2SO4 đậm đặc trong 500 ml EtOH 95 %)  KH2PO4 (A) Prolabo  Methanol (PA) Trung Quốc  NaHPO4 (A) Prolabo  n-hexan (T) Trung Quốc  Nước khử ion  Nước tinh khiết HPLC  p-nitrophenol (PNP) (PA) Merck  p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNP-Glc) (PA) Merck  Tween 80 Sigma  α – glucosidase (α – Glc) Sigma 1. 2. Dụng cụ  Bảng mỏng sắc ký (TLC) là bản nhôm tráng sẵn silica gel Merck–GF60F254, kích thước 20 × 20 cm, độ dày lớp hấp phụ 0,2 mm (Merck, Germany)  Bếp điện dùng nướng bản mỏng Blacker®  Bình định mức 100 ml  Bình giải ly TLC  Bình phun xịt thuốc thử.  Cột cao áp.  Micropipette 20 – 200μl và micropipette 100 – 1000μl  Pipette 10ml  Silica gel 60, MERCK, đường kính hạt 0,06–0,2 mm NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 16
  29. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 1. 3. Thiết bị  Cân điện tử (TANITA KD–200, Nhật và PRECISA XB 220ª, Đức).  Máy cô quay chân không (BUCHI Rotavapor R–200, Đức)  Máy đo mật độ quang EL x 800 (Biotek, Mỹ)  Máy đo nhiệt độ nóng chảy (Electrothermal IA 9000 Series)  Máy đo pH (inolab, Đức)  Máy đo phổ NMR, 500 MHz (Brucker Advant, Đức)  Máy sấy (UE 400)  Máy sắc ký điều chế NovaPrep 200 (Merde Hitadu,Mỹ)  Máy siêu âm (Elma S 100 H Elmasonic)  Máy soi UV , λ=254 nm (MINERALIGHT ® LAMP, Mỹ) Hình 8: Cân điện tử hiệu TANITA KD–200 Hình 9: Máy siêu âm Elma S 100 H Elmasonic Hình 10: Cân điện tử PRECISA XB 220ª Hình 11: Máy thổi khí Nitogen N2LCMS Claind NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 17
  30. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae Hình 12: Máy đo nhiệt độ nóng chảy Hình 13: Máy soi UV MINERALIGHT ® Electrothermal IA 9000 Series LAMP(U.S.A) Hình 14: Máy sắc ký điều chế Hình 15: Máy cô quay chân không hiệu BUCHI Rotavapor R–200 NovaPrep 200 Hình 16: Máy đo pH Hình 17: Máy đo mật độ quang EL x 800(Biotek, Mỹ) NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 18
  31. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 2. THỰC NGHIỆM 2. 1. Nghiên cứu thành phần hóa học 2. 1. 1. Nguyên liệu 10,6 kg mẫu trái chuối hột tươi (trái chuối còn xanh gồm vỏ, thịt và hột) thu hái tại huyện Thuận An, tỉnh Bình Dương vào tháng 8 năm 2011 được thái mỏng rồi sấy ở nhiệt độ 45oC thu được 3,4 kg mẫu trái chuối hột khô. 2. 1. 2. 2. 1. 3. Hình18: Mẫu nải chuối hột tươi Hình19: Mẫu trái chuối hột đã được 2. 1. 4. thái mỏng tươi i Hình 20: Mẫu trái chuối hột đã được thái mỏng khô 2. 1. 2. Trích ly cao thô Mục tiêu: Phân chia các hợp chất tự nhiên trong mẫu ra từng nhóm với độ phân cực khác nhau. Tiến hành: Chiết kiệt 3,4 kg mẫu chuối khô với ethanol 96o bằng phương pháp chiết siêu âm. Toàn bộ dịch chiết được đem cô quay áp suất thấp, thu hồi dung môi nhận được cao ethanol ở dạng sệt (m=135g). Trong cao ethanol xuất hiện nhiều chất rắn màu NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 19
  32. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae trắng dạng hạt, tan tốt trong nước nhưng tan rất ít trong methanol. Khi đem đốt, chất rắn trở thành dạng bột màu xám. Điều này chứng tỏ chất rắn không phải là một hợp chất hữu cơ. Phần bã còn lại đem chiết kiệt với nước cất bằng phương pháp siêu âm, rồi cô quay áp suất thấp thu hồi dung môi được cao nước ở dạng sệt (m=12g). Hòa tan hoàn toàn cao ethanol trong methanol rồi lọc qua giấy lọc để loại bỏ chất rắn trên. Phần dịch methanol được đem cô quay áp suất thấp thu hồi dung môi, nhận được cao tổng (m=105g). Lần lượt chiết kiệt cao tổng bằng n-hexane, ethyl acetate theo phương pháp chiết siêu âm. Phần cắn còn lại là cao methanol (m=80g ) chiếm 76,2 % khối lượng cao tổng . Cô quay áp suất thấp, thu hồi dung môi lần lượt các dịch chiết, thu được 13 g cao n-hexane ở dạng sệt (chiếm 12,4 % khối lượng cao tổng), 4g cao ethyl acetate ở dạng sệt (3,8 % khối lượng cao tổng) theo thứ tự. Bảng 1 : Kết quả quá trình trích ly cao thô Cao n-hexane Cao ethyl Cao methanol Cao nước (cao H) acetate (cao E) (cao M) (cao W) Khối lượng 13 g 4 g 80 g 12 g C:M 9:1 C:M 9:1 TLC Cao n- Cao n- NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 20
  33. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae Sơ đồ 1: Quy trình trích ly các cao từ trái chuối Mẫu khô 3,4 kg − o Chiết với ethanol 96 − Thu hồi dung môi Cao ethanol ( m=135g) Phần còn lại Hòa tan bằng methanol − Chiết với nước cất Lọc bằng giấy lọc − Thu hồi dung môi Phần bã Cao nước (cao W) Chất rắn màu trắng Cao tổng ( m=12g ) (m= 26,6g) ( m =105g ) − Chiết với n-hexane − Thu hồi dung môi Cao n-hexane (cao H) Phần cắn ( m=13g) − Chiết với ethyl acetate − Thu hồi dung môi Cao ethyl acetate (cao E) Cao methanol (cao M) ( m = 4g) ( m=80g ) 2. 1. 3. Phân lập các chất 2. 1. 3. 1. Chất Mb01 Thí nghiệm 1: Mục tiêu: Tiến hành sắc ký cột cao áp cao H nhằm phân chia cao H thành những phân đoạn gồm những chất có độ phân cực khác nhau. Tiến hành: Thông số khi chạy cột cao áp: o Khối lượng mẫu: 13gam. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 21
  34. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae o Kích thước cột: 40x300mm o Pha tĩnh: silica gel 60, 0,06- 0,2mm o Tốc độ dòng : 30 ml/ phút o Hệ dung môi: n-hexane/ethyl acetate Biểu đồ 1: chương trình chạy cột cao áp cao H % ethyl acetate 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 t (phút) 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Kết quả : Bảng 2: Kết quả chạy cột cao áp cao H Thí nghiệm 2: Mục tiêu: Tiến hành sắc ký cột cao áp phân đoạn HA nhằm phân lập chất Mb01. Tiến hành: Các thông số khi chạy cột cao áp: o Khối lượng mẫu: 413mg o Kích thước cột: 15x 400mm o Pha tĩnh: silica gel 60, 0,06- 0,2 mm o Tốc độ dòng: 5 ml/ phút Phân đoạn Thời gian chạy (phút) TLC HA 10-30 Có 1 vết đậm → Mb01 HB 31-55 Có 4 vết đậm HC 56-120 Nhiều vết HD 121-210 Nhiều vết HE 211-235 Có 3 vết đậm→ Mb02, Mb04 HF 236-280 Nhiều vết HG 281-315 Có 3 vết đậm HH 316-390 Có 3 vết đậm NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 22
  35. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae o Hệ dung môi: n-hexane/ethyl acetate 98: 2 o Thời gian chạy: 180 phút Kết quả: Bảng 3: Kết quả chạy cột trung áp phân đoạn HA 2. 1. 3. 2. Chất Mb02 Thí nghiệm 1: Mục tiêu: tiến hành sắc ký cột P-HPLC phân đoạn HE nhằm phân lập chất Mb02. Tiến hành: Các thông số khi chạy cột P-HPLC: o Khối lượng mẫu: 93 mg o Kích thước cột: 15x 400 mm o Loại silica gel: silica gel C18, 15 µm Phân đoạn Thời gian chạy ( phút) TLC HA1 0-38 Nhiều vết HA2 39 - 83 2 vết HA3 84 - 127 1 vết→Mb01 HA4 127- 152 2 vết HA5 153- 180 2 vết o Tốc độ dòng: 5 ml/ phút o Dung môi: methanol/ nước Biểu đồ 2: Chương trình chạy cột P-HPLC phân đoạn HE % methanol 100 90 80 70 t ( phút) 60 0 20 40 60 80 100 120 140 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 23
  36. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae Bảng 4: Kết quả chạy cột P-HPLC phân đoạn HE Kết quả: Phân đoạn Thời gian chạy ( phút) TLC HE1 46- 52 1 vết đậm→ Mb02 HE2 53- 78 Nhiều vết HE3 80- 87 1 vết đậm HE4 88- 123 Nhiều vết Thí nghiệm 2: Mục tiêu : chạy cột P-HPLC phân đoạn HE1 nhằm phân lập chất Mb02. Tiến hành: Các thông số khi chạy cột P-HPLC o Khối lượng mẫu: 10mg o Kích thước cột: 10x 250 mm o Loại silica gel: silica gel C18, 15 µM o Tốc độ dòng: 2 ml/ phút o Dung môi: methanol/ nước Biểu đồ 3: Chương trình chạy cột P-HPLC phân đoạn HE1 100 % methanol 90 80 t ( phút) Kết quả: 70 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 24
  37. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae Bảng 5: Kết quả chạy cột HPLC phân đoạn HE1 Phân đoạn Thời gian chạy ( phút) TLC HE1A 17,6 – 22,5 1 vết→Mb02 HE1B 22,6 - 29 Nhiều vết 2. 1. 3. 3. Chất Mb04 Thí nghiệm 1: Mục tiêu: chạy cột P-HPLC phân đoạn HE3 nhằm phân lập chất Mb04. Tiến hành: Các thông số khi chạy cột P-HPLC o Khối lượng mẫu: 40 mg o Kích thước cột: 10x 250 mm o Pha tĩnh: silica gel C18, 15 µm o Tốc độ dòng: 3 ml/ phút o Dung môi: methanol/ nước Biểu đồ 4: Chương trình chạy cột P-HPLC phân đoạn HE3 % methanol 100 95 t ( phút) Kết quả : Bảng 9: Kết90 quả chạy cột P-HPLC phân đoạn HE3 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Phân đoạn Thời gian chạy ( phút) TLC HE3A 6- 18 Nhiều vết HE3B 18.1 - 26 1 vết đậm→Mb04 HE3C 26.1 - 42 Nhiều vết Thí nghiệm 2: NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 25
  38. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae Mục tiêu: chạy cột P-HPLC phân đoạn HE3B nhằm phân lập chất Mb04. Tiến hành: Các thông số khi chạy cột P-HPLC: o Khối lượng mẫu: 10 mg o Kích thước cột: 10x 250 mm o Pha tĩnh: silica gel C18, 15 µm o Tốc độ dòng: 3 ml/ phút o Dung môi: methanol/ nước Biểu đồ 5: Chương trình chạy cột P-HPLC phân đoạn HE3B 100 % methanol 90 80 t ( phút) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 Kết quả : Bảng 6: Kết quả chạy cột P-PHPLC phân đoạn HE3B Phân đoạn Thời gian chạy ( phút) TLC HE3B1 46.1-56 Nhiều vết HE3B2 56.1 - 60 1 vết→Mb04 2 Tinh chế các chất tinh khiết 2. 1. 4. 1. Chất Mb01 Chất Mb01 thu được từ phân đoạn HA3 được rửa nhiều lẩn bẳng methanol lạnh rồi kết tinh lại nhiểu lần trong hỗn hợp chloroform/ methanol. Sau đó, hòa tan trong chlorofrom, kiểm tra bẳng TLC giải ly nhiều lần với dung môi triển khai là n-hexane/ ethyl acetate (98: 2) thu được 117 mg chất Mb01 tinh khiết. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 26
  39. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae Đặc tính Mb01  Tinh thể hình kim, màu trắng.  Hấp thu bước sóng 254 nm.  Tan trong chloroform.  Sắc ký lớp mỏng (TLC) triển khai bằng hỗn hợp dung môi n-hexane/ ethyl acetate (96: 4) hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong ethanol cho vết tròn màu vàng nhạt có Rf = 0,34 khi hơ nóng.  Mp.: 133oC-135oC Hình 22: TLC của Mb01 hiện hình Hình 21: Tinh thể Mb01 bằng H2SO4 10% trong ethanol 2. 1. 4. 2. Chất Mb02 Chất Mb02 được hòa tan trong methanol, kiểm tra bằng TLC giải ly nhiều lần với dung môi triển khai là chloroform/ methanol (96: 4) hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong EtOH, thu được 2mg chất Mb02 tinh khiết. Đặc tính Mb02  Dạng vô định hình màu cam.  Tan trong methanol.  Sắc ký lớp mỏng (TLC) triển khai bằng hỗn hợp dung môi chloroform/ methanol (9: 1) hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong EtOH, cho vết tròn màu hồng có Rf = 0,57 khi hơ nóng. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 27
  40. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae Hình 23: dạng vô Hình 24 : TLC của Mb02 hiện hình định hình của Mb02 bằng H2SO4 10% trong ethanol 2. 1. 4. 3. Chất Mb04 Chất Mb04 thu được từ phân đoạn HE3B được kết tinh nhiều lần trong hỗn hợp chloroform/ methanol rồi hòa tan trong methanol, kiểm tra bằng TLC giải ly nhiều lần với dung môi triển khai là chloroform/ methanol (98:2) thu được 3,4 mg chất Mb04 tinh khiết. Đặc tính Mb04  Dạng vô định hình màu trắng.  Tan trong methanol.  Sắc ký lớp mỏng (TLC) triển khai bằng hỗn hợp dung môi chloroform:methanol (96: 4) hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong ethanol, cho vết tròn màu xanh dương có Rf = 0,32 khi hơ nóng. Hình 25: Dạng vô Hình 26: TLC của Mb04 hiện hình định hình của Mb04 bằng H2SO4 10% NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 28
  41. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae Sơ đồ 2: Tổng kết quá trình cô lập và tinh chế các chất Cao tổng Chiết lần lược với n-hexan; ethyl acetate Cô quay thu hồi dung môi Cao H Cao E Cao M Chạy sắc ký cột HPLC Dung môi: gradient từ n-hexane/ethyl acetate 100:0 đến n-hexane/ethylacetate 0: 100 PĐ PĐ PĐ PĐ PĐ PĐ PĐ PĐ HA HB HC HD HE HF HG HH Chạy sắc ký cột P-HPLC, pha thuận Chạy sắc ký cột P-HPLC, pha đảo Dung môi: n-hexane/ethyl acetate 98: 2 Dung môi: gradient methanol/nước 75:25 đến methanol/ nước100: 0 Mb01 PĐ PĐ PĐ PĐ HE1 HE2 HE3 HE4 Chạy sắc ký cột P-HPLC, pha đảo Chạy sắc ký cột P- HPLC, pha đảo Dung môi: gradient M/W 95: 5 đến Dung môi:gradient methanol/ nước M/W 100: 0 85: 15 đến methanol/ nước 100: 0 Mb02 PĐ PĐ HE3A HE3B Chạy sắc ký cột P- HPLC Dung môi: gradient methanol/ nước 90:10 đến methanol/ nước 100: 0 Mb04 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 29
  42. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 2. 2. Nghiên cứu hoạt tính sinh học 2. 2. 1. Mục tiêu: Khảo sát hoạt tính ức chế men α- glucosidase của cao tổng, cao n-hexan và chất Mb01 và thuốc Acarbose 2. 2. 2. Tiến hành: 2. 2. 2. 1. Chuẩn bị hóa chất Pha dung dịch đệm pH= 6,8: cân 122 mg Na2HPO4 và 57,3mg KH2PO4 pha trong 5 ml nước khử ion. Pha hỗn hợp A gồm DMSO-tween 80- dd đệm pH= 6,8-nước khử ion (4: 1: 5: 10) Pha dung dịch p-nitrophenol (PNP) chuẩn 0.1 mM: cân 1.4 mg PNP pha trong 10 ml hỗn hợp DMSO: tween 80: đệm (4:1) rồi pha loãng 10 lần. Pha dung dịch p- nitrophenyl- α- D glucopyranoside (PNP-Glc) 0,865 mg/ml: cân 4,3mg PNP-Glc pha trong 5ml nước khử ion Pha enzyme 1,2 U/ ml: cân 0,3mg enzym (100U/2,45 mg) pha trong 10 ml nước khử ion lạnh. Pha chất ức chế nồng độ 0,4 mg/ ml: cân 2mg chất ức chế pha trong 5ml hỗn hợp DMSO: tween 80 (4: 1). Pha loãng thành các dung dịch có nồng độ Ci= 0, 0,08, 0,16, 0,24, 0,32, 0,4 mg/ml. 2. 2. 2. 2. Dựng đường chuẩn Pha loãng dung dịch PNP chuẩn thành các dung dịch có nồng độ 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/ml. Bảng 7: Thành phần các dung dịch PNP nồng độ Ci Nồng độ (μg/ml) 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 VPNP 0,1 mM (μl) 100 80 60 40 20 0 Vdd A (μl) Đo mật độ quang của các mẫu có nồng độ PNP khác nhau. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 30
  43. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 2. 2. 2. 3. Đo mẫu ức chế Pha các dung dịch có nồng độ Ci= 0, 0,08, 0,16, 0,24, 0,32, 0,4 μg/ml lần lượt thành các dung dịch có nồng độ C= 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/ml theo bảng sau: Bảng 8: Thành phần các dung dịch ức chế có nồng độ Ci Nồng độ (μg/ml) 0 20 40 60 80 100 V chất ức chế Ci (μl) 25 25 25 25 25 25 V dd đệm pH= 6,8 (μl) 25 25 25 25 25 25 V enzym (μl) 25 25 25 25 25 25 Ủ các dung dịch trên ở nhiệt độ 37oC trong 20 phút. Thêm vào mỗi dung dịch 25 μl dung dịch PNP- Glc. Ủ tiếp các dung dịch ở nhiệt độ 37oC trong 30 phút. Tiến hành đo mật độ quang của các dung dịch trên. 2. 2. 3. Kết quả 2. 2. 3. 1. Khảo sát mật độ quang của các dung dịch PNP có nồng độ Ci Bảng 10: Mật độ quang của các dung dịch PNP ở các nổng độ Ci Nồng độ (µg/ml) 0 20 40 60 80 100 A 0,083 0,231 0,348 0,495 0,618 0,689 A 0,088 0,230 0,255 0,519 0,645 0,672 A 0,095 0,225 0,238 0,516 0,663 0,650 2. 2. 3. 2. Khảo sát hoạt ức chế men α- glucosidase của các mẫu ức chế. Khảo sát hoạt tính ức chế men α- glucosidase của cao tổng Bảng 11: Kết quả thử hoạt tính ức chế α- glucosidase của cao tổng K Nồng độ (µg/ml) 0 20 40 60 80 100 A 0,047 0,048 0,034 0,027 0,015 0,012 A 0,049 0,050 0,037 0,031 0,013 0,014 A 0,052 0, 046 0,038 0,029 0,016 0,012 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 31
  44. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae Khảo sát hoạt tính ức chế men α- glucosidase của cao H Bảng 12: Kết quả thử hoạt tính ức chế α- glucosidase của cao H Nồng độ( µg/ml) 0 20 40 60 80 100 A 0,11 0,084 0,047 0,034 0,023 0,009 A 0,12 0,086 0,048 0,033 0,023 0,004 A 0,11 0,088 0,052 0,034 0,024 0,008 Khảo sát hoạt tính ức chế men α- glucosidase của chất Mb01 Bảng 13: Kết quả thử hoạt tính ức chế α- glucosidase của Mb01 Nồng độ (µg/ml) 0 20 40 60 80 100 A 0,031 0,044 0,037 0,023 0,039 0,017 A 0,022 0,057 0,067 0,03 0,014 0,015 A 0,108 0,024 0,018 0,032 0,015 0,014 Khảo sát hoạt tính ức chế men α- glucosidase của thuốc Acarbose Bảng 14: Kết quả thử hoạt tính ức chế α- glucosidase của thuốc Acarbose nồng độ (µg/ml) 0 20 40 60 80 100 A 0.151 0.176 0.125 0.108 0.115 0.096 A 0.137 0.13 0.133 0.125 0.114 0.099 A 0.148 0.115 0.134 0.138 0.119 0.093 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 32
  45. Khào sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla) họ Musaceae 1. NHẬN DANH CẤU TRÚC CÁC CHẤT TINH KHIẾT 1. 1. Nhận danh Mb01 Phổ ESI-MS (phụ lục 1.7) có các peak ion giả phân tử [M+H]+ có m/z= + + + 425,4; [M+Na] có m/z=447,4; [M+Na+H2O] có m/z=465,4 ;[M+Na+2H2O] có m/z= 480,4 tương ứng với công thức phân tử C30H48O. 13 Phổ C-NMR (125 MHz, CDCl3, δ ppm, TMS) (phụ lục 1.1, 1.1a ) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 1.2, 1.2a) (bảng 18) cho biết chất Mb01 có 30 nguyên tử carbon. Trong đó, có 6 carbon của nhóm methyl (-CH3); 12 carbon của nhóm methylene (trong đó có 1 carbon olefin (=CH2 ) cho tín hiệu ở δC-27= 109,36 ppm); 6 carbon của nhóm methine (>CH-) và 5 carbon tứ cấp (trong đó có 1 carbon carbonyl >C=O cho tín hiệu ở δC-3= 213,27 ppm; 1 carbon olefin cho tín hiệu ở δC-25= 150,21 ppm). 1 Phổ H (500 MHz, CDCl3, δ ppm, J= Hz, TMS) (phụ lục 1.3, 1.3a, 1.3b) kết hợp với phổ HSQC (phụ lục 1.5, 1.5a) (bảng 19) cho biết chất Mb01 có 48 proton liên kết với 30 nguyên tử carbon. Trong đó, cặp proton ở δH–19b= 0,39 ppm (1H, d, J= 4) và δH-19a= 0,62 (1H, d, J= 4) tương tác với cùng một carbon của nhóm methylen ở δC–19= 26,94 ppm, là hai proton không tương đương của vòng cyclopropan; proton ở δH-27= 4,67 ppm (2H, s) là proton liên kết với carbon olefin ở δ=109,36 ppm; proton ở δH-2= 2,41ppm (2H, m) và proton ở δH-4= 2,23 ppm (1H, q, J=6,5) là những proton liên kết với những carbon kề nhóm carbonyl. Phổ HMBC (phụ lục 1.6, 1.6a, 1.6b, 1.6c, 1.6d) kết hợp với phổ 1H-1H COSY (phụ lục 1.4, 1.4a) (bảng 20) xác định vị trí tương đối giữa các carbon trong cấu trúc chất như sau: Trên HMBC, carbon carbonyl C-3 (δ= 213,27 ppm) tương tác với proton H-2 (δ= 2,41 ppm, 2H, m); H-4 (δ= 2,23 ppm, 1H, q, J=6.5); H-28 (δ= 1,00 ppm, 3H, m) chứng tỏ C-2 và C-4 cùng liên kết với C-3. Trên phổ COSY, proton H-4 (δ= 2,23 ppm, 1H, q, J=6,5) tương tác với proton H-28 (δ= 1,00 ppm, 3H, m ) và H-5 (δ= 1,58 ppm, 1H, m). Chứng tỏ C- 28, C-5 cùng liên kết với C-4. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 33
  46. Khào sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla) họ Musaceae Phổ HMBC cho biết, carbon C-4 (δ= 50,03 ppm) tương tác với proton H-6a (δ= 1,58 ppm, 1H, m) chứng tỏ C-6 liên kết với C-5. Trên phổ COSY, proton H-2 (δ= 2,41 ppm, 2H, m) tương tác với proton H-1a (δ= 1,90 ppm, 1H, m) chứng tỏ C-1 liên kết với C-2. Trên phổ HMBC, proton H-2 (δ= 2,41 ppm, 2H, m) và H-1a (δ= 1,90 ppm, m) cùng tương tác với carbon C-10 (δ= 29,33 ppm) chứng tỏ C-10 liên kết với C-1. Carbon C-1 (δ= 32,87ppm) và C-10 (δ= 29,33 ppm) cùng tương tác với proton H-19b (δ=0,39 ppm, 1H, d, J= 4) và H-5 (δ= 1,58 ppm, 1H, m). Ngoài ra, proton H-5 (δ= 1,58 ppm, 1H, m) cũng tương tác với carbon C-1 (δ= 32,87 ppm) và C-19 (δ= 26,94 ppm) chứng tỏ C-5, C-19 cùng liên kết với C-10 Proton H-19a (δ= 0,62 ppm, 1H, d, J= 4) tương tác với carbon C-8 (δ= 47,08 ppm). Bên cạnh đó, carbon C-19 (δ= 26,94 ppm) tương tác với proton H- 11 (δ= 2,03 ppm, 2H, m); Carbon C-11 (δ= 27,25 ppm) tương tác với proton H- 8 (δ= 1,64 ppm, 1H, m) chứng tỏ C-11 và C-8 cùng liên kết với C-9 và vòng cyclopropan gắn trên hai carbon C-9 và C-10. Proton H-8 (δ= 1,64 ppm, 1H, m) tương tác với proton H-7a (δ= 1,35 ppm, 1H, m) chứng tỏ C-7 liên kết với C-8. Carbon C-8 (δ= 47,08 ppm) tương tác với proton H-6b (δ= 0,73 ppm, 1H, m) chứng tỏ C-6 liên kết với C-7. Trên phổ COSY, proton H-11 (δ= 2,03 ppm, 2H, m) tương tác với proton H-12 (δ= 1,65 ppm, 2H, m) chứng tỏ C-12 liên kết với C-11. Trên phổ HMBC, proton H-1 (δ= 2,03 ppm, 2H, m) và H-12 (δ= 1,65 ppm, 2H, m) cùng tương tác với carbon C-13 (δ= 45,38 ppm) chứng tỏ C-13 liên kết với C-12. Carbon C-12 (δ= 32,82 ppm) và C-13 (δ= 45,38 ppm) cùng tương tác với proton H-17 (δ=1,57 ppm, 1H, m), H-18 (δ= 0,98 ppm, 3H, s). Ngoài ra, proton H-12 (δ= 1,65 ppm, 2H, m) và H-18 (δ= 0,98 ppm, 3H, s) cùng tương tác với carbon C-14 (δ= 48,82 ppm) chứng tỏ C-14, C-17 và C-18 cùng liên kết với C-13. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 34
  47. Khào sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla) họ Musaceae Trên phổ 1H-1H COSY, proton H-16b (δ= 1,31 ppm, m) tương tác với proton H-17 (δ= 1,57 ppm, 1H, m) chứng tỏ C-16 liên kết với C-17 Trên phổ HMBC, proton H-16a (δ= 1,89 ppm, m) và H-17 (δ=1,57 ppm, 1H, m) cùng tương tác với carbon C-15 (δ= 35,45 ppm) chứng tỏ C-15 liên kết với C-16. Carbon C-8 (δ= 47,08 ppm), C-13 (δ= 45,38 ppm), C-14 (δ= 48.82 ppm), C-15 (δ=35,45 ppm) cùng tương tác với proton H-29 (δ= 0.90 ppm, 3H, s) chứng tỏ C-8, C-15 và C-29 cùng liên kết với C-14. Proton H-16b (δ= 1,89 ppm, 1H, m) và H-17 (δ= 1,57 ppm, 1H, m) cùng tương tác với carbon C-20 (δ= 36,04 ppm) chứng tỏ C-20 liên kết với C-17. Carbon C-17 (δ= 52,26 ppm) và C-20(δ= 36,04 ppm) cùng tương tác với proton H-21 (δ= 0,87 ppm, 3H, d, J= 6,5) chứng tỏ chứng tỏ C-21 liên kết với C-20. H3C CH2 R R= H2C CH3 H3C 21 HSQC HMBC CH3 20 18 R 12 17 11 13 19 16 1 9 14 2 10 8 15 3 5 7 CH3 O 4 6 29 (1) CH3 28 Mặt khác, carbon tứ cấp olefin C-25 (δ= 150,21 ppm) tương tác với H- 24 (δ= 2,08 ppm, 1H, m), H-26 (δ= 1,66 ppm, 3H, s) và một proton olefin H-27 (δ= 4,67 ppm, 2H, s). Thêm vào đó, C-27 (δ= 109,36 ppm) tương tác với H-24 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 35
  48. Khào sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla) họ Musaceae (δ= 2,08 ppm, 1H, m) và H-26 (δ= 1,66 ppm, 3H, s) chứng tỏ C-24, C-26, C-27 cùng liên kết với C-25 . C-24 (δ= 41,64 ppm) và C-25 (δ= 150,21 ppm) cùng tương tác với H-30 (δ= 0,99 ppm, 3H, m) chứng tỏ C-30 liên kết với C-24. H-30 (δ= 0,99 ppm, 3H, m) tương tác với C-23 (δ= 31,56 ppm ) chứng tỏ C-23 liên kết với C-24. H-23b (δ= 1,19 ppm, 1H, m) tương tác với C-20 (δ= 36,04 ppm) chứng tỏ C-23 liên kết với C-22. C-22 (δ= 33.96 ppm ) tương tác với H-21 (δ= 0,87 ppm, 3H, d, J= 6,5) chứng tỏ C-22 liên kết với C-20. 1 13 HH-SQCC H3C 21 1HHMBC-1H CH 22 3 H C 20 30 3 24 18 23 12 17 25 CH3 11 13 26 19 16 1 9 14 H2C 27 2 10 8 15 CH3 3 5 7 29 O 4 6 (1) CH3 28 Dựa vào những dữ liệu trên và các tài liệu tham khảo [8], [13] (bảng 21) chúng tôi xác nhận chất Mb01 là Cyclomusalenon (24- methyl-29-nor-cycloart- 25-en-3-on). NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 36
  49. Khào sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla) họ Musaceae H C 3 CH3 CH3 CH3 H2C CH3 O CH (1) 3 Cyclomusalenon 1. 2. Nhận danh cấu trúc Mb02 Do lượng chất Mb02 tinh khiết thu được từ quá trình cô lập và tinh chế quá ít (m= 2mg) nên không thể tiến hành xác định cấu trúc Mb02 bằng các phương pháp phổ hiện đại. Tuy nhiên, chúng tôi cũng đã tiến hành đo phổ 1H- NMR để có được một số nhận định ban đầu về Mb02. Trong cấu trúc của chất Mb02 có sự hiện diện của proton nhóm aldehyde ở δH= 9,78ppm, 1H, s) và 10 proton vòng thơm ở vùng δH= 7- 8,5 ppm. So sánh với các tài liệu mà chúng tôi tham khảo, Mb02 đầy tiềm năng là một hợp chất mới trong cây. 1. 3. Nhận danh cấu trúc Mb04 Do lượng chất Mb04 tinh khiết thu được từ quá trình cô lập và tinh chế quá ít ( m= 3,4 mg) nên không thể tiến hành xác định cấu trúc Mb04 bằng các phương pháp phổ hiện đại. Tuy nhiên, chúng tôi cũng đã tiến hành đo phổ 1H- NMR để có được một số nhận định ban đầu về Mb04. Do cường độ tín hiệu quá thấp nên chúng tôi không có kết luận gì thêm về cấu trúc của chất Mb04. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 37
  50. Khào sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla) họ Musaceae Bảng 15: Số liệu phổ 13C-NMR, 1H –NMR và DEPT của Mb01 13 1 Vị C NMR Nhóm H-NMR DEPT 90 DEPT 135 trí C (ppm) C (δ ppm, J Hz) H-1a =1,90 (1H,m) 1 32,87 Biến mất Tín hiệu âm –CH2– H-1b= 1,59 (1H,m) 2 40,97 Biến mất Tín hiệu âm –CH2– 2,41 (2H, m) 3 213,27 Biến mất Biến mất >C=O 4 50,03 Tín hiệu dương Tín hiệu dương –CH C C C C< 15 35,45 Biến mất Tín hiệu âm –CH2– 1,30 (2H, m) 16 28,07 Biến mất Tín hiệu âm –CH2– H-16a= 1,89 (m) H-16b= 1,31 (m) 17 52,26 Tín hiệu dương Tín hiệu dương –CH< 1,57 (1H, m) 18 17,89 Biến mất Tín hiệu dương –CH3 0,98 (3H, s) 19 26,94 Biến mất Tín hiệu âm –CH2– H-19a= 0,62 (1H, d, J= 4) H=19b= 0,39 (1H, d, J= 4) 20 36,04 Tín hiệu dương Tín hiệu dương –CH< 1,3 (1H, m) NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 38
  51. Khào sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla) họ Musaceae 21 18,37 Biến mất Tín hiệu dương –CH3 0,87 (3H, d, J= 6,5) 22 33,96 Biến mất Tín hiệu âm –CH2– H22a= 1,34 (1H, m) H22b= 0,94 (1H, m) 23 31,56 Biến mất Tín hiệu âm –CH2– H 23a= 1,44 (1H, m) H23b= 1,19 (1H, m) 24 41,64 Tín hiệu dương Tín hiệu dương –CH C= 26 18,70 Biến mất Tín hiệu dương –CH3 1,66 (3H, m) 27 109,36 Biến mất Tín hiệu âm =CH2 4,67 (2H, s) 28 10,75 Biến mất Tín hiệu dương –CH3 1,00 (3H, m) 29 19,18 Biến mất Tín hiệu dương –CH3 0,90 (3H, s) 30 20,16 Biến mất Tín hiệu dương –CH3 0,99 (3H, m) Bảng 16: Số liệu phổ HMBC và 1H-1H COSY của Mb01 Vị trí 13C-NMR 1H-NMR COSY HMBC (H → C) C/H (δ ppm ) (δ ppm, J Hz) H-1a =1,90 (m) 1 32,87 H-1a / H-1b H-1a→ C-10, 19 H-1b= 1,59 (m) H-2/ H-1b 2 40,97 2,41 (2H, m) H-2→ C-1, 3, 10 H-2/ H-1a 3 213,27 H-4/ H-28 4 50,03 2,23(1H, q, J=6,5) H-4→ C-6a, 28 H-4/ H-5 5 46,09 1,58 (1H, m) H-5→ C-10 H-6a= 1,68 (m) 6 25,92 H-6a/ H-6b H-6b→ C-4, 8 H-6b= 0,73 (m) 25,21 H-7a= 1,35 (m) 7 H-7b→ C-8 H-7b= 1,10 (m) 8 47,08 1,64 (1H, m) H-8/ H-7b H-8→ C-11 9 25,00 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 39
  52. Khào sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla) họ Musaceae 10 29,33 11 27,25 2,03 (2H, m) H-11/ H-12 H-11→ C-9,10, 12,13, 19 12 32,82 1,65 (2H, m) H-12→ C- 9,13,14, 18 13 45,38 14 48,82 15 35,45 1,30 (2H, m) H-15→ C-16, 29 H-16a= 1,89 (m) H-16a→ C-15 16 28,07 H-16a/ H-16b H-16b= 1,31 (m) H-16b → C-13 H-17→ C-12, 13, 15, 16, 17 52,26 1,57 (1H, m) H-17/ H-16b 20 18 17,89 0,98 (3H, m) H-18→ C-12, 13, 14, 17 H-19a= 0,62 (1H, d, J= 4) H-19a→ C-8 19 26,94 H-19a/ H-19b H-19b= 0,39 (1H, d, J= 4) H-19b → C-1, 10, 11 20 36,04 H-20= 1,3 (1H, m) H-20/ H-21 21 18,37 0.87 (3H, d, J= 6,5) H-21→ C17, 20, 22 H-22a= 1,34 (1H, m) 22 33,96 H-22b= 0,94 (1H, m) H-23a= 1,44 (1H, m) 23 31,56 H-23a/ H-23b H-23→ C-20 H-23b= 1,19 (1H, m) H-24/ H-23a H-24→C-23, 25, 26, 27, 24 41,64 2,08 (1H, m) H-24/ H-23b 30 H-24/ H-30 25 150,21 26 18,70 1,66 (3H, m) H-26→ C-24, 25, 27 27 109,36 4,67 (2H, s) H-27→ C-24, 25, 26 28 10,754 1,00 (3H, m) H-28→ C-3, 4, 10 29 19,179 0,90 (3H, s) H-29→ C-8, 13, 14, 15 30 20,16 0,99 (3H, m) H-30→ C-23, 24, 25 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 40
  53. Khào sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla) họ Musaceae Bảng 17: So sánh 13C (δ ppm) của Mb01 với tài liệu tham khảo 13 C (δ ppm) Vị trí C/H Mb01 Tài liệu tham khảo [8] Tài liệu tham khảo [13] 3 213,27 213,28 213,33 18 17,89 17,90 17,88 19 26,94 26,95 26,94 21 18,37 18,35 18,33 25 150,21 150,16 150,18 26 18,70 18,66 18,64 27 109,36 109,39 109,36 28 10,754 20,17 10,73 29 19,179 10,76 19,15 30 20,16 19,17 20,16 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 41
  54. Khào sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla) họ Musaceae 2. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 2. 2. 3. 1. Kết quả khảo sát mật độ quang của đường chuẩn Bảng 18 : Mật độ quang của các dung dịch PNP ở các nổng độ Ci Nồng độ (µg/ml) 0 20 40 60 80 100 A 0,089 0,229 0,280 0,510 0,642 0,670 Đồ thị 6: Mật độ quang của các dung dịch PNP ở các nổng độ Ci A 0.800 0.700 y = 0.006x + 0.090 0.600 R² = 0.963 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 nồng độ (µg/ml) 0 20 40 60 80 100 2. 2. 3. 2. Khảo sát hoạt ức chế men α- glucosidase của các mẫu ức chế Khảo sát hoạt tính ức chế men α- glucosidase của cao tổng Bảng 20: Kết quả thử hoạt tính ức chế α- glucosidase của cao tổng Nồng độ (µg/ml) 0 20 40 60 80 100 A 0,049 0,048 0,036 0,029 0,015 0,013 % Ức chế 0 2,703 26,351 41,216 70,270 74,324 Đồ thị 7: Hoạt tính ức chế ức chế α- glucosidase của cao tổng % ức chế 80 70 60 50 40 30 20 10 Nồng độ (µg/ml) 0 0 20 40 60 80 100 120 Dựa vào đồ thị thu được kết quả: IC50= 66 (µg/ml) NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 42
  55. Khào sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla) họ Musaceae Khảo sát hoạt tính ức chế men α- glucosidase của cao H Bảng 21: Kết quả thử hoạt tính ức chế α- glucosidase của cao H Nồng độ( µg/ml) 0 20 40 60 80 100 A 0,113 0,086 0,049 0,034 0,023 0,007 % Ức chế 0 24.118 56.765 70.294 79.412 93.824 Đồ thị 8: Hoạt tính ức chế ức chế α- glucosidase của cao H % ức chế 100 80 60 40 20 nồng độ (µg/ml) 0 0 20 40 60 80 100 120 Dựa vào đồ thị thu được kết quả: IC50 = 36(µg/ml) Khảo sát hoạt tính ức chế men α- glucosidase của chất Mb01 Bảng 22: Kết quả thử hoạt tính ức chế α- glucosidase của Mb01 nồng độ (µg/ml) 0 20 40 60 80 100 A 0,054 0,042 0,041 0,028 0,023 0,015 % ức chế 0 22,360 24,224 47,205 57,764 71,429 Đồ thị 9: hoạt tính ức chế ức chế α- glucosidase của Mb01 80 % ức chế 70 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 12 nồng độ (µg/ml) Dựa vào đồ thị thu được kết quả: IC50 = 67 (µg/ml) NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 43
  56. Khào sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla) họ Musaceae Khảo sát hoạt tính ức chế men α- glucosidase của thuốcAcarbose Bảng 23: Kết quả thử hoạt tính ức chế α- glucosidase của thuốc Acarbose nồng độ (µg/ml) 0 20 40 60 80 100 A 0,145 0,140 0,131 0,124 0,116 0,096 % ức chế 0 3,440 10,092 14,908 20,183 33,945 Đồ thị 10: Hoạt tính ức chế ức chế α- glucosidase của thuốc Acarbose % ức chế 40 35 30 25 20 15 10 5 nồng độ (µg/ml) 0 0 20 40 60 80 100 120 Dựa vào đồ thị thu được kết quả: IC50 = 415 (µg/ml). Chất Mb01có khả năng ức chế enzym α-glucosidase tương đương với cao tổng. Cao n-hexane có khả năng ức chế enzym α-glucosidase cao hơn hẳn khả năng ức chế của cao tổng và chất Mb01. Vậy, khẳng định rằng trong cao n-hexan còn nhiều hợp chất khác có hoạt tính kháng đái tháo đường cao bên canh chất Mb01. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 44
  57. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
  58. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae KẾT LUẬN 1. Chúng tôi đã tiến hành tách riêng 4 loại cao dựa trên độ phân cực của các hợp chất có trong trái chuối hột:  Cao n- hexane (chiếm 3,8 ‰ về khối lượng so với lượng mẫu khô).  Cao ethyl acetate(chiếm 1,2 ‰ về khối lượng so với lượng mẫu khô).  Cao methanol (chiếm 23,5 ‰ về khối lượng so với lượng mẫu khô).  Cao nước chiếm (3,5 ‰ về khối lượng so với lượng mẫu khô). 2. Từ cao n-hexane, chúng tôi đã cô lập được 3 chất. Trong đó, định danh được 1 chất là cyclomusalenon (chiếm 0.9 % về khối lượng so với cao n-hexan). Đây là một hợp chất ít khi gặp trong tự nhiên và từng được phân lập trong chuối hột cũng như một số loài chuối khác [12], có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase cao. Tuy nhiên, trong cao n-hexan vẫn còn một số các chất khác có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase cần khảo sát. Mb02 và Mb04 do lương cô lập được quá ít nên không thể xác định cấu trúc hóa học. Tuy nhiên, Mb02 và Mb04 đầy tiềm năng là 2 chất mới trong cây nên tiếp tục nghiên cứu. KIẾN NGHỊ  Tiếp tục khảo sát các hoạt tính sinh học khác của Mb01.  Tiếp tục phân lập thêm chất Mb02, Mb04 để có thể xác định cấu trúc chất Mb02 và Mb04.  Tiếp tục phân lập và tinh chế các chất còn lại trong các cao n-hexane, cao ethyl acetate, cao methanol và cao nước. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 45
  59. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước 1. Bùi Mỹ Linh, Trần Thị An Tường, Đào Thị Phải (1997), “Khảo sát tác dụng trên sỏi niệu của một số chế phẩm từ Chuối hột”. Hội nghị khoa học kỹ thuật Khoa Dược 1997-1998. 2. Bùi Mỹ Linh (2002), “Thử nghiệm tính lợi tiểu của Chuối hột, Kim tiền thảo và Rau om”. Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh, chuyên san 2001. 3. Bùi Mỹ Linh, Huỳnh Tú Quyên (2001), “Chiết xuất và phân lập một số hợp chất kém phân cực trong chuối hột”. Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, phụ bản số 6- Tập 4. Bùi Mỹ Linh, Trần Hùng, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ (2002), “Khảo sát tính kháng khuẩn và độc tính của Chuối hột, Kim tiền thảo và Rau om”. Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh. Chuyên đề Nghiên cứu khoa học Dược. Tập 6, phụ bản của số 4. 5. Bùi Mỹ Linh, Đặng thị Thu Hà (2004), “Xây dựng qui trình định lượng sitosterol trong Chuối hột bằng phương pháp sắc ký khí”. Luận văn tốt nghiệp dược sĩ Đại học 2004. 6. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I, nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, trang 463-466. 7. Đỗ Quốc Việt, Trần Văn Sung, Nguyễn Thanh Thúy, Sơ bộ nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của quả chuối hột (Musa balbisiana) trên chuột thực nghiệm, tạp chí dược học,số 5/2006, trang 8-10 8. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2004, Khối phổ, nhà xuất bản đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh 9. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2005, Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữ cơ, nhà xuất bản đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh. 10. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, nhà xuất bản đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 46
  60. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 11. Tạ Văn Bình, 2007, Những nguyên lý nền tảng bệnh đái tháo đường, tăng glucose máu , nhà xuất bản Y học , Hà Nội. 12. Trần Văn Sung,Trương Bích Ngân,Trịnh Thị Thủy, Kết quả ban đầu về nghiên cứu thành phần hóa học quả chuối hột của Việt Nam, tạp chí dược liệu, tập 9, số 2/2004,trang 43-46. 13. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, quyển III, NXB trẻ,trang 429. Tài liệu nước ngoài 14. Ali, A-1992, Neo- Clerodane diterpennoids from Musa balbisiana seeds, Phytochemistry, vol. 31, No. 6, pp. 2173-2175 15. Consolacion Y. Ragasa, Aillen T. Martinez,Jennifer Elizabeth Y. Chua, and John A. Rideout, a triterpene from Musa errans, 2007, Philippine Journal of Science,p.167-171. 16. María J. Pascual – Villalobos and Benjamín Rodríguez, 2007, Consituents of Musa balbisiana seeds and their activity against Cryptolestes pusillius, biochemical systematic and ecology, vol 35, pp. 11-16. 17. Min-Jung Kang, Ji-Hye Kim, Ha-Neul Choi, Myoung-Jin Kim, Jung-Hee Han, Jai-Heon Lee and Jung-In Kim, 2010, Hypoglycemic effects of welsh onion in an animal model of diabetes mellitus, Nutrion research and practice, Vol 4, No. 6, pp 486- 491. 18. Moohammad Zafar Imam and Saleha Akter, 2011, Musa paradisiaca L. and Musa sapientum L.: a phytochemical and pharmacological review, journal of applied pharmaceutical science, pp 14- 20. 19. Rammohan Subramanian, M. Zaini Asmawi and Amirin Sadikun, 2008, in vitro α- glucosidase and α- amilase enzyme inhibitory effects of Andrographis paniculata extract and andropholide, acta biochochimica polonica, vol. 55 No. 2/2008, pp 392- 398. 20. Randy C. Ploetz, Angela Key Kepler, Jeff Daniells, và Scot C. Nelson, 2007, Banana and plantain- an overview with emphasis on Pacific island cultivars, species profiles for pacific island agroforestry, ver. 1. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 47
  61. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 21. 22. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 48
  62. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 23. 24. Phụ lục 1.1: Phổ 13C-NMR của Mb01 25. 26. 27. 28. 29. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 49
  63. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. Phụ lục 1.1a: Phổ 13C-NMR của Mb01 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 50
  64. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 49. 50. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 51
  65. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 51. Phụ lục 1.2: Phổ DEPT của Mb01 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 52
  66. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 53. Phụ lục 1.2a: Phổ DEPT của Mb01 54. 55. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 53
  67. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 57. 58. P 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. Ph NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 54
  68. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 83. 84. 85. 86. 87. Phụ lục 1.3b: Phổ 1H-NMR của Mb01 88. 89. 90. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 55
  69. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98. 99. 100. 101. 102. 103. 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110. 111. 112. 113. Phụ lục 1.4: Phổ 1H-1H COSY của Mb01 114. 115. 116. 117. 118. 119. 120. 121. 122. 123. 124. 125. 126. 127. 128. 129. 130. 131. 132. 133. 134. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 56
  70. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 135. 136. 137. 138. 139. 140. 141. 142. 143. 144. 145. 146. 147. 148. 149. 150. 151. 152. 153. 154. 155. 156. 157. 158. 159. 160. 161. 162. 163. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 57
  71. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 164. 165. 166. 167. 168. 169. 170. 171. 172. 173. 174. 175. 176. 177. 178. 179. 180. 181. 182. 183. 184. 185. 186. 187. 188. 189. 190. 191. 192. 193. 194. 195. 196. 197. 198. 199. 200. 201. 202. 203. 204. 205. 206. 207. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 58
  72. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 208. 209. 210. 211. 212. Phụ lục 1.6: Phổ HMBC của Mb01 213. 214. 215. 216. 217. 218. 219. 220. 221. 222. 223. 224. 225. 226. 227. 228. 229. 230. 231. 232. 233. 234. 235. 236. 237. P NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 59
  73. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 238. 239. 240. 241. 242. 243. 244. 245. 246. 247. 248. 249. 250. 251. 252. 253. 254. 255. 256. 257. 258. 259. 260. 261. 262. 263. 264. 265. 266. 267. 268. 269. 270. 271. 272. 273. 274. 275. 276. 277. 278. 279. 280. 281. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 60
  74. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 282. 283. 284. 285. 286. 287. 288. Phụ lục 1.6c: Phổ HMBC của Mb01 289. 290. 291. 292. 293. 294. 295. 296. 297. 298. 299. 300. 301. 302. 303. 304. 305. 306. 307. 308. 309. 310. 311. 312. 313. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 61
  75. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 314. 315. 316. 317. 318. 319. 320. 321. 322. 323. 324. 325. 326. 327. 328. 329. 330. 331. 332. 333. 334. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 62
  76. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 335. Phụ lục 1.7: Phổ ESI-MS của Mb01 m/z 480.4 475 Max: 40944 465.4 449.4 448.4 447.4 450 426.4 425.4 425 400 375 350 325 300 *MSD2 SPC, time=0.275 of D:\LCMS\DEF_LC 2012-04-05 09-57-21\PURE0000006.D ES-API, Pos, Scan, Frag: 70 Frag: Scan, Pos, ES-API, 09-57-21\PURE0000006.D 2012-04-05 of D:\LCMS\DEF_LC time=0.275 SPC, *MSD2 0 80 60 40 20 100 336. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 63
  77. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 337. 338. 339. 340. 341. 342. 343. 344. 345. 346. 347. 348. 349. 350. 351. 352. 353. 354. 355. 356. 357. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 64
  78. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 359. 360. Phụ lục 2.1a: Phổ 1H-NMR của Mb02 361. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 65
  79. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 362. 363. Phụ lục 3.1: Phổ 1H-NMR của Mb04 NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 66
  80. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 365. 366. 367. Phụ lục 3.1a: Phổ 1H-NMR của Mb04 368. 369. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 67
  81. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 371. 372. Phụ lục 3.1b: Phổ 1H-NMR của Mb04 373. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 68
  82. Khảo sát thành phần hóa học của NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae 375. 376. Phụ lục 3.1c: Phổ 1H-NMR của Mb04 377. NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 69