›

Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của cao ethyl acetate lá cây ô môi (Cassia grandis L.f) họ vang (caesalpiniaceae)

pdf 70 trang thiennha21 15/04/2022 5470
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của cao ethyl acetate lá cây ô môi (Cassia grandis L.f) họ vang (caesalpiniaceae)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_thanh_phan_hoa_hoc_cua_cao_ethyl_acetate.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của cao ethyl acetate lá cây ô môi (Cassia grandis L.f) họ vang (caesalpiniaceae)

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC CHUYÊN NGÀNH HÓA HỮU CƠ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAO ETHYL ACETATE LÁ CÂY Ô MÔI (Cassia grandis L.f) HỌ VANG (CAESALPINIACEAE) Giáo viên hướng Th.S PHÙNG VĂN TRUNG dẫn: Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KHÁNH CHI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH-2012
  2. NHẬN XÉT CỦA GV NHẬN XÉT CỦA CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
  3. LỜI CẢM ƠN Luận văn này được thực hiện tại phòng Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên – Viện Công Nghệ Hóa Học – Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam; số 1 Mạc Đĩnh Chi, phường Bến Nghé, quận 1, TP.Hồ Chí Minh; năm 2011 – 2012. Với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến: PGS.TS Nguyễn Ngọc Hạnh Cô đã truyền đạt cho em những kiến thức chuyên môn, luôn động viên và luôn tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận. ThS Phùng Văn Trung Thầy đã truyền đạt cho em kiến thức chuyên môn, tận tình hướng dẫn kỹ thuật cũng như những kinh nghiệm hết sức quý báu và đầy tâm huyết trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Quý thầy cô Ban Giám Hiệu trường Đại Học Sư Phạm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Khoa, Khoa Hóa-Tổ Hóa Hữu Cơ, cùng tất cả quý thầy cô giáo đã trang bị cho em những kiến thức nền tảng vững chắc trong suốt thời gian học tại trường, niên khóa 2008-2012. Các anh chị ThS Ngô Quốc Luân, ThS Phan Nhật Minh, CN Nguyễn Tấn Phát, CN Nguyễn Trung Kiên, CN Võ Thị Bé, các anh chị cao học viên của trường Đại học Cần Thơ và các bạn thực hiện đề tài luận văn tại phòng Hoá Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên, năm 2011 – 2012 đã giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng con rất cảm ơn gia đình đã giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện từ vật chất đến tinh thần cho con học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ CHCl3 Chloroform đđ Đậm đặc EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol MeOH Methanol COSY Correlation Spectroscopy NMR Nuclear Magnetic Resonance HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation J Coupling constant mp Melting point ppm Parts per million Rf Retention factor s Singlet d Doublet dd Doublet of doublet
  5. t Triplet m Multiplet TLC Thin Layer Chromatography UV Ultra Violet δ Chemical shift A Analysis T Technical STT Số thứ tự SKBM Sắc ký bản mỏng SKC Sắc ký cột
  6. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Các phân đoạn sau khi sắc ký cột cao EtOAc 35 Bảng 4.1: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC của Cg01 42 Bảng 4.2: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC của Cg01 43 Bảng 4.3: So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của Cg01 với tài liệu tham khảo 44 Bảng 4.4: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC của Cg02 50 Bảng 4.5: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, COSY của Cg02 51 Bảng 4.6: So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của Cg02 với tài liệu tham khảo 53
  7. DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1: Cây ô môi 13 Hình 1.2: Hoa ô môi 13 Hình 1.3: Quả và hạt ô môi 14 Hình 1. 4: Lá ô môi nhìn từ mặt trên và mặt dưới 14 Hình 3.1: Chất Cg01 36 Hình 3.2: Bản mỏng hiện vết Cg02 36 Hình 3.3: Chất Cg02 37 Hình 3.4: Bản mỏng hiện vết Cg02 37 Hình 4.1: Một số tương quan HMBC trong vòng A của Cg01 40 Hình 4.2: Một số tương quan HMBC trong vòng B của Cg01 41 Hình 4.3: Tương quan HMBC trong vòng A của Cg02 47 Hình 4.4: Một số tương quan HMBC trong vòng B của Cg02 48 Hình 4.5: Một vài tương quan HMBC trong gốc đường của Cg02 49 Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng quát chiết tách hợp chất hữu cơ 34 Sơ đồ 3.2: Quy trình cô lập và tinh chế các hợp chất 38
  8. DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của Cg01 60 Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR của Cg01 61 Phụ lục 3: Phổ HMBC của Cg01 62 Phụ lục 4: Phổ HSQC của Cg01 63 Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR của Cg02 64 Phụ lục 6a: Phổ 13C-NMR dãn rộng của Cg02 65 Phụ lục 6b: Phổ 13C-NMR dãn rộng của Cg02 66 Phụ lục 6c: Phổ 13C-NMR dãn rộng của Cg02 67 Phụ lục 7: Phổ HMBC của Cg02 68 Phụ lục 8: Phổ HSQC của Cg02 69 Phụ lục 9: Phổ COSY của Cg02 70
  9. LỜI MỞ ĐẦU Với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa thay đổi theo địa hình, điều đó đã làm cho nước ta có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Và thế giới cây cỏ thiên nhiên có muôn vàn bí ẩn với khả năng chữa bệnh diệu kỳ. Từ xa xưa, con người đã sử dụng nhiều loại cây cỏ hoặc các hợp chất trích ly từ cây cỏ để làm thuốc chữa bệnh trong y học cổ truyền. Nhiều bài thuốc có giá trị mà ngày nay chúng ta chỉ mới khám phá được một phần. Trong đó, đa số các hoạt chất đã và đang sử dụng làm thuốc trong y học hiện đại là các hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên. Với ưu điểm chứa nhiều loại biệt dược quý và hầu như không gây tác dụng phụ, nên xu thế quay trở về với các dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên đang ngày càng phát triển. Cây ô môi Cassia grandis L.f là một trong số các dược liệu được sử dụng từ lâu trong y học dân gian như ngâm rượu làm thuốc tiêu, bổ giúp ăn ngon cơm, đỡ đau lưng, đau người, có tác dụng nhuận tràng. Lá tươi giã nát và lấy nước xát vào nơi hắc lào, lở ngứa, hạt ô môi là nguyên liệu để chế gôm dùng trong công nghiệp dược phẩm [2], [3] Dựa vào những hiểu biết trên, chúng tôi chọn thực hiện đề tài “KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAO ETHYL ACETATE LÁ CÂY Ô MÔI (Cassia grandis L.f)”. Vì điều kiện có hạn nên chúng tôi chỉ mới tập trung quan tâm đến cao ethyl acetate với mong muốn chiết xuất ra được những chất có hoạt tính sinh học, góp phần nhỏ vào việc nâng cao sức khỏe của con người, đồng thời, cũng góp phần làm sáng tỏ hơn thành phần hóa học của lá cây ô môi Cassia grandis L.f, từ đó giúp cho việc khai thác và sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên thực vật.
  10. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ Ô MÔI 1.1 GIỚI THIỆU THỰC VẬT [2], [3] 12 1.1.1 PHÂN LOẠI KHOA HỌC: 12 1.1.2 MÔ TẢ CHUNG [2], [3] 12 1.1.3 PHÂN BỐ VÀ SINH THÁI [2], [3] 13 1.1.4 MỘT SỐ HÌNH ẢNH: 13 1.2 Y HỌC DÂN GIAN[2], [3] 14 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 15 1.3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 15 1.3.2 HOẠT TÍNH SINH HỌC 27 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP 2.1 PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT [4] 29 2.1.1 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 29 2.1.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG (TLC) 29 2.1.3 PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ 30
  11. 2.2 PHƯƠNG PHÁP PHỔ CỘNG HƯỞNG TỪ HẠT NHÂN [5] 30 2.2.1 PHỔ 1H-NMR 30 2.2.2 PHỔ 13C-NMR 31 2.2.3 PHỔ HSQC VÀ HMBC 31 2.2.4 PHỔ COSY 31 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 33 3.1.1 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ 33 3.1.2 HÓA CHẤT 33 3.2 THỰC NGHIỆM 34 3.2.1 NGUYÊN LIỆU 34 3.2.2 TIẾN HÀNH 34 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 KẾT QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ 39 4.2 KẾT QUẢ NHẬN DANH CẤU TRÚC CÁC CHẤT TINH KHIẾT 39 4.2.1 NHẬN DANH Cg01 39 4.2.2 NHẬN DANH Cg02 45 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 55
  12. 5.2 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56
  13. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU THỰC VẬT [2], [3] − Tên khoa học: Cassia grandis L.f 1781 (CCVN, 1064) − Tên tiếng Việt: Ô môi, Canhkina Việt Nam, cây cốt khí, mạy khuốm (Tày) − Tên nước ngoài: Cathartocarpus grandis (L.f) Pers. 1805. – Cassia brasiliana Lamk. 1785. – Cathartocarpus brasiliana (Lamk) Jacq. 1809. – Pink shower, pudding pipe tree, horse cassia (Anh) 1.1.1 PHÂN LOẠI KHOA HỌC: − Giới: Thực vật − Ngành: Magnoliophyta − Lớp: Magnoliopsida − Bộ: Fabales − Họ: Caesalpiniaceae (Họ Vang) − Chi: Cassia − Loài: Grandis 1.1.2 MÔ TẢ CHUNG [2], [3] Cây thân gỗ, cứng chắc, to cao 12 – 15m, vỏ thân nhẵn, cành mọc ngang, cành non có lông màu rỉ sắt, cành già màu nâu đen. Lá có kích thước lớn, kép lông chim gồm khoảng 12 đôi lá chét hình hơi quả trám, dài 7 – 12 cm, rộng 4 – 8 cm, có phủ lông mịn, màu xanh bóng, gân lộ rõ. Hoa màu hồng tươi mọc thành chùm ở những kẽ lá đã rụng. Chùm hoa thõng xuống, dài tới 20 – 40 cm. Quả hình trụ, cong như lưỡi liềm, đường kính 3 – 4 cm, dài 50 – 60 cm, có màu nâu đen, cứng, có 50 – 60 ô, ngăn cách nhau bởi một vách dày 0,5 cm, giòn. Mỗi ô chứa một hạt dẹt cứng màu vàng. Ở vách ngăn có lớp cơm mềm, đặc sền sệt, màu nâu đen, vị ngọt chát nhẹ, có mùi hắc.
  14. 1.1.3 PHÂN BỐ VÀ SINH THÁI [2], [3] Cây có nguồn gốc từ các nước Nam Mỹ, được nhập trồng khắp vùng nhiệt đới để làm cảnh, làm thuốc và lấy gỗ. Cây được trồng nhiều ở Campuchia, miền Nam Việt Nam, Malaysia, Indonesia (đảo Java) và Niu Guine. Ô môi thích nghi cao với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng và ẩm. Ở Việt Nam, cây được trồng nhiều nhất ở các tỉnh miền Đông và Tây Nam Bộ, ít hơn ở miền Trung và rất hiếm ở miền Bắc. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, thụ phấn nhờ gió và côn trùng. Do quả dài và nặng, nên dễ bị rụng khi có gió bão. Hạt nhiều, tỷ lệ nảy mầm cao (60 – 80%). Cây trồng từ hạt ở các tỉnh phía nam sau 3 – 4 năm đã bắt đầu có hoa quả. Cây chịu đất ẩm, thường rụng lá vào mùa khô. Cây ra hoa vào khoảng tháng 2, tháng 3 đến tháng 5, mùa quả từ tháng 6 đến tháng 10. 1.1.4 MỘT SỐ HÌNH ẢNH: Hình 1.1: Cây ô môi Hình 1.2: Hoa ô môi
  15. Hình 1.3: Quả và hạt ô môi Hình 1. 4: Lá ô môi nhìn từ mặt trên và mặt dưới 1.2 Y HỌC DÂN GIAN[2], [3] − Quả ô môi được dùng sống chữa táo bón, liều 4 – 6 g có tác dụng nhuận tràng và 10 – 20 g gây tẩy. Cơm quả ô môi được ngâm rượu làm thuốc bổ, kích thích tiêu hóa, chữa đau lưng nhức mỏi, hiệu quả rất tốt đối với người cao tuổi và phụ nữ mới đẻ. Lấy quả ô môi thật chín, vỏ ngoài đã khô cứng, đập vỡ vỏ quả lấy phần cơm ngâm với nửa lít rượu 25 – 300 càng lâu càng tốt. Ngày uống 2 lần, mỗi lần 1 chén nhỏ trước bữa ăn. − Cao cơm quả ô môi có tác dụng kích thích tiêu hóa, nhuận tràng, lấy 1000g cơm quả ngâm với 1 lít nước. Nghiền nát, lọc lấy nước. Bã còn lại ngâm tiếp với một ít nước nữa rồi lọc lại. Trộn 2 nước lại, cô nhẹ lửa đến khi được cao mềm. Ngày dùng 2 lần sau bữa ăn, mỗi lần 4 – 8 g. − Lá ô môi tươi rửa sạch, giã nát, xát vài lần trong ngày, chữa hắc lào, lở ngứa, tác dụng tốt hơn lá muồng trâu. Cũng có thể chế rượu lá ô môi với tỷ lệ 1:5 (dùng rượu 25 – 300) để bôi ngoài. − Ở Campuchia, vỏ thân ô môi được nhân dân giã đắp chữa rắn và bò cạp cắn. Ngoài ra hạt ô môi là nguyên liệu để chế gôm dùng trong công nghiệp dược phẩm.
  16. 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC Trong cơm quả có đường, chất nhầy, tannin, saponins, calcium oxalate, anthraglucoside, sáp, tinh dầu và chất nhựa, trong hạt có chứa chất béo. Trong lá có anthraglucoside và flavonoids. [3] • NƯỚC NGOÀI Năm 1998, Meenarani và cộng sự đã cô lập được 3 hợp chất từ thân của Cassia grandis:[16] (1) palmitic acid, (2) β-sitosterol và (3) emodin-9- anthrone O OH (1) Palmitic acid H H H HO (2) β-sitosterol
  17. OH O OH HO (3) Emodin-9-anthrone Năm 1996, A G González và cộng sự đã cô lập được (10) trans-3- methoxy-4,5-methylene-dioxycinnamaldehyde từ Cassia grandis cùng với những hợp chất đã biết:[6] (11) aloe emodin ( 1,8-dihydroxy-3- (hydroxymethyl)anthraquinone) , (4) centaureidin, (5) catechin, (6) myristicin, (7) 2,4-dihydroxybenzaldehyde, (8) 3,4,5- trimethoxybenzaldehyde, (9) 2,4,6-trimethoxybenzaldehyde OH O O O OH HO O O (4) Centaureidin
  18. OH HO O OH OH OH (5) Catechin O O O (6) Myristicin HO OH O (7) 2,4-dihydroxybenzaldehyde O O O O
  19. (8) 3,4,5-trimethoxybenzaldehyde O O O O (9) 2,4,6-trimethoxybenzaldehyde O O O O (10) trans-3-methoxy-4,5-methylene-dioxycinnamaldehyde OH O OH OH O (11) 1,8-dihydroxy-3-(hydroxymethyl)anthraquinone
  20. Năm 1995, Valencia và cộng sự đã cô lập được một furoquinoline alkaloid: [25] (13) kokusaginine và một piperidine alkaloid: (12) 1,1’- bipiperidine N N (12) 1,1’-bipiperidine O O O O N (13) Kokusaginine Năm 1994, Verma R. P. và cộng sự đã cô lập được một anthraquinone từ vỏ của Cassia grandis và xác định là [20] 14) 1,3,4-trihydroxy-6,7,8- trimethoxy-2-methyl anthraquinone O OH O OH O O O OH (14) 1,3,4-trihydroxy-6,7,8-trimethoxy-2-methyl anthraquinone
  21. Năm 1996, Verma R. P. và cộng sự đã cô lập được từ vỏ của Cassia grandis và xác định là [21] (15) 1,3,4-trihydroxy-6,7,8-trimethoxy-2-methyl anthraquinone-3-O-β-D-glucopyranoside O OH O O O O O OH HHO H O HO HO H OH H H (15) 1,3,4-trihydroxy-6,7,8-trimethoxy-2-methyl anthraquinone-3-O- ß-D-glucopyranoside Năm 1993, Ibadur Rahman Siddiqui và cộng sự đã cô lập từ hạt của Cassia grandis được 3 anthraquinone glucoside: [13] (16) 1,2,4,8 - tetrahydroxy-6-methoxy-3 methyl anthraquinone - 2 - O -β - D – glucopyranoside (17) 3 - hydroxy-6, 8-dimethoxy-2- methyl anthraquinone - 3 - O-β - D -glucopyranoside (18) 1, 3- dihydroxy-6, 7, 8-trimethoxy anthraquinone-3 - O - β - D – glucopyranoside
  22. O OH O O OH O OH HHO H O HO HO H OH H H (16) 1,2,4,8 - tetrahydroxy-6-methoxy-3 methyl anthraquinone - 2 - O -β - D – glucopyranoside O O O O O H H O H O HO HO H OH H H (17) 3 - hydroxy-6, 8-dimethoxy-2- methyl anthraquinone - 3 - O-β - D –glucopyranoside
  23. O O O O O O HO H OH H O HO HO H OH H H (18) 1, 3- dihydroxy-6, 7, 8-trimethoxy anthraquinone-3 - O - β - D – glucopyranoside Năm 1981, YS Srivastava và cộng sự đã cô lập từ hạt của Cassia grandis một flavonol glycoside: [28] (19) kaempferol-3-O-β-D- mannopyranosyl (1 4)-O-β-D-glucopyranoside OH HO O O HO O H OH HHO OHO H O HO HO O H H HO H OH H H H H (19) kaempferol-3-O-β-D-mannopyranosyl (1 4)-O-β-D- glucopyranoside Năm 2010, Pino J.A đã nghiên cứu các hợp chất dễ bay hơi được phân lập từ trái cây Cassia grandis L từ Cuba [18]. Tổng cộng có 108 hợp chất được xác định (30,47 mg/kg), từ đó Linalool (31,5% tổng số các chất bay hơi) là hợp chất chính.
  24. HO (20) Linalool Năm 1984, V. K Mahesh và cộng sự đã cô lập được từ lá cây ô môi Cassia grandis L được 4 hợp chất và xác định được là: [24] (21) Chrysophanol( 1,8-dihydroxy-3-methylanthraquinone) (22) Rhein( 4,5-dihydroxyanthraquinone-2-carboxylic acid) (23) Kaempferol( 3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H- chromen-4-one) (24) Physcion( 1,8-dihydroxy-3-methoxy-6-methylanthraquinone) OH O OH O (21) Chrysophanol ( 1,8-dihydroxy-3-methylanthraquinone) O O OH OH O OH (22) Rhein ( 4,5-dihydroxyanthraquinone-2-carboxylic acid)
  25. OH HO O OH OH O (23) Kaempferol ( 3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one) O O OH O OH (24) Physcion ( 1,8-dihydroxy-3-methoxy-6-methylanthraquinone) • TRONG NƯỚC Năm 2011, Đào Huy Phong trong đề tài luận văn thạc sĩ hóa học đã cô lập được 5 hợp chất flavonoids: [1] (25) (-)-epicatechin ( 3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavan), (26) (-)-epiafzelechin ( 4’,5,7-trihydroxy flavanol), (27) 2,3,6’-trihydroxy-2’-methoxy-4’-hydroxymethylbenzophenone, (28)Quercitrin(3’,4’,5,7-tetrahydroxy-3-O-α-L- rhamnopyranosylflavonol), (29)Isoquercitrin(3’,4’,5,7-tetrahydroxy-3-O-β-D- glucopyranosylflavonol)
  26. OH OH HO O OH H H OH (25) (-)-epicatechin ( 3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavan) OH HO O OH H H (26) (-)-epiafzelechin (4’,5,7-trihydroxy flavanol) CH3 O OH HO OH O OH (27) 2,3,6’-trihydroxy-2’-methoxy-4’-hydroxymethylbenzophenone
  27. OH OH HO O O OH O H3C O HO H HO OH (28) Quercitrin ( 3’,4’,5,7-tetrahydroxy-3-O-α-L-rhamnopyranosylflavonol) OH HO O OH O H OH OH O H O HO HO H OH H H (29) Isoquercitrin ( 3’,4’,5,7-tetrahydroxy-3-O-β-D-glucopyranosylflavonol) 1.3.2 HOẠT TÍNH SINH HỌC Năm 2010, Sandesh R Lodha [22]và cộng sự nghiên cứu đánh giá hiệu quả của Cassia grandis làm giảm carbon tetrachloride đã gây ra nhiễm độc gan cấp tính cho chuột bạch. Có thể kết luận rằng ethanolic trích xuất từ Cassia grandis sở hữu đặc tính bảo vệ gan đáng kể.
  28. Năm 2003, Harsha Joshi và Virendra P Kapoor [12] nghiên cứu galactomannan hạt Cassia grandis, có chứa khoảng 50% nội nhũ gum và có những đặc điểm để trở thành nguồn tiềm năng của hạt giống gum. Polysaccharide tinh khiết có đặc điểm như là một galactomannan tinh khiết có một tỉ lệ mannose- galactose là 3,15. Năm 2009, MA Awal [15] và cộng sự đã nghiên cứu hoạt động kháng khuẩn và độc tính của ethanol chiết xuất từ lá cassia grandis đối với Brine Shrimp. Cassia grandis có thể hữu ích chống lại các loại bệnh vi sinh vật. Năm 1987, Hosamani [8]và cộng sự đã nghiên cứu dầu hạt giống Cassia grandis chứa một lượng nhỏ sterculic acid và malvalic acid được xác định bởi chuyển đổi ester với AgNO3/MeOH, NMR và IR. Năm 2004, Tillan Capo, Juana [14] và cộng sự nghiên cứu hoạt động của Cassia grandis trong một mô hình thử nghiệm thiếu máu thiếu sắt ở chuột, sử dụng bột khô thu được từ trái như là một bổ sung dinh dưỡng. Năm 2005, Montejo Cuenca Emilio [11]và cộng sự đã nghiên cứu Cassia grandis như một loại thuốc bổ trong suy dinh dưỡng của bê. Mục đích chính của điều tra này là chứng minh hiệu quả của thuốc. Năm 2008, Joscineia Kelli Clippel [9] và cộng sự nghiên cứu thành phần của của một số cây thân thảo và thân gỗ ở Brazil, phân tích mức độ polysaccharide lưu trữ thành tế bào và khoáng chất dinh dưỡng trong hạt giống. Năm 1993, Cáceres A [7]và cộng sự nghiên cứu thực vật được sử dụng ở Guatemala trong điều trị các bệnh nhiễm trùng dermatophytes. Các bộ phận hoạt động kháng nấm nhiều nhất là vỏ cây và lá cây. Các loài có hoạt động tích cực nhất là Byrsonima crassifolia, Cassia grandis, Gliricidia sepium và Malpighia glabra. Năm 2010, Sandesh R Lodha [23]và cộng sự đã đánh giá tiềm năng trị đái tháo đường của Cassia grandis bằng cách sử dụng một mô hình in vivo. Các chất chiết xuất từ dung dịch nước và ethanolic của Cassia grandis được đánh giá hoạt động trị đái tháo đường bằng một xét nghiệm dung nạp glucose ở
  29. chuột bình thường và chuột bị mắc bệnh tiểu đường gây ra bởi alloxan. Những kết quả cho thấy Cassia grandis sở hữu hoạt động trị đái tháo đường đáng kể. Năm 2007, Singh V [26]và cộng sự đã nghiên cứu loại bỏ chì từ dung dịch nước bằng cách sử dụng hạt gum Cassia grandis-ghép- poly(methylmethacrylate). Sử dụng hệ thống oxi hóa khử persulfate/ascorbic acid, một loạt hạt gum Cassia grandis-ghép-poly(methylmethacrylate) được tổng hợp. Các mẫu copolymer được đánh giá loại bỏ Pb(II) khỏi dung dịch nước mà khả năng hấp phụ được tìm thấy tỉ lệ với mức độ ghép.
  30. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP 2.1 PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT [4] 2.1.1 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT Kỹ thuật này không đòi hỏi thiết bị phức tạp, có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây. Ngâm nguyên liệu trong một bình chứa thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy. Rót dung môi sử dụng để chiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của nguyên liệu. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc qua một tờ giấy lọc thu được dịch chiết. Cô quay loại dung môi thu được cao chiết. Rót tiếp dung môi mới vào bình chứa nguyên liệu và tiếp tục chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. 2.1.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG (TLC) Sắc ký bản mỏng hay sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu. Bình sắc ký là chậu, hũ, lọ, bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy. Pha tĩnh là một lớp mỏng silica gel khoảng 25mm phủ lên bề mặt một tấm nhôm phẳng. Mẫu cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1μL dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình. Pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển chầm chậm dọc theo tấm bản mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển lên cao nhờ vào tính mao quản. mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mức dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào
  31. hiện tượng hấp thu của pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi. 2.1.3 PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ • Kết tinh Đối với những chất dễ kết tinh, dựa vào tính tan của các chất. Kết tinh nhiều lần để thu được chất tinh khiết • Sắc ký lỏng Đối với những hỗn hợp chất khó tách hay những chất khó làm sạch, sử dụng phương pháp sắc ký cột hấp phụ. Pha động là chất lỏng, pha tĩnh là chất rắn. Ở phương pháp sắc ký này các chất của hỗn hợp sẽ hấp phụ lên bề mặt của pha tĩnh. Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp phụ khác nhau lên pha tĩnh và chúng cũng phụ thuộc vào tính chất của pha động. Kết quả là trong quá trình pha động di chuyển chúng sẽ tách xa nhau ra. Sự hấp phụ xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực, do sự tương tác giữa những phân tử có mang các nhóm phân cực đối với pha tĩnh rắn là chất rất phân cực. Trong sắc ký hấp phụ, pha tĩnh thường là những hạt silicagel. Trên bề mặt của những hạt này có mang nhiều nhóm –OH nên đây là những pha tĩnh có tính rất phân cực. 2.2 PHƯƠNG PHÁP PHỔ CỘNG HƯỞNG TỪ HẠT NHÂN [5] 2.2.1 PHỔ 1H-NMR Cho thông tin về các proton 1H có trong phân tử. Các thông số của phổ 1H-NMR cho biết độ dịch chuyển hóa học, hình dạng tín hiệu và hằng số tương tác (J) spin – spin giữa các proton không tương đương kế cận nhau sẽ cho các kiểu ghép vân phổ (tín hiệu bội), cường độ tích phân của tín hiệu thể hiện số lượng proton tương ứng với tín hiệu đó. 2.2.2 PHỔ 13C-NMR
  32. Cho thông tin về khung carbon của phân tử. Các tín hiệu phổ 13C-NMR xuất hiện trong khoảng thang chia độ rộng (0 – 250 ppm) (có thể đến 600ppm cho trường hợp đặc biệt) nên các tín hiệu tách rõ ràng, mũi đơn dễ quan sát. Mỗi loại cacbon trong hợp chất hữu cơ có độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học của cacbon trong phổ 13C-NMR, có thể dự đoán được loại cacbon và liên kết của cacbon đó. 2.2.3 PHỔ HSQC VÀ HMBC Khảo sát hạt nhân 1H ghép cặp với 13C. Phổ HSQC cho tín hiệu của cacbon gắn trực tiếp vào proton, nghĩa là cacbon và proton chỉ cách nhau qua 1 nối hóa trị. Từ những tín hiệu của cacbon ghi trên trục hoành, kẻ những đường chấm thẳng đứng, từ trên xuống, hết bề dọc của phổ đồ; từ những tín hiệu của proton ghi trên trục tung, kẻ những đường chấm nằm ngang,từ bên trái qua bên phải, hết bề ngang của phổ đồ. Nếu tại những vị trí các đường chấm đó giao nhau, có xuất hiện tín hiệu giao, có nghĩa là proton này đã gắn trực tiếp vào cacbon kia. Phổ HMBC tương tự phổ HSQC, nhưng phổ HMBC cho biết tương tác cacbon và proton ngang qua 2 và 3 nối hóa trị và không xuất hiện tín hiệu tương tác ngang qua 1 nối hóa trị. Tuy nhiên, quá trình giải phổ khá vất vả do khi nhìn vào phổ, với một tín hiệu giao bất kỳ nào đó thì không thể nào biết được rằng đó là của tương tác qua 2 nối hay ngang qua 3 nối. Do vậy phải kết hợp giải phổ HMBC với các phổ khác để xác định cấu trúc phân tử. 2.2.4 PHỔ COSY Phổ cho biết trong một phân tử các proton nào đã ghép cặp với nhau. Trong biểu đồ phổ COSY, độ dịch chuyển hóa học của các proton, giống như trong phổ 1H-NMR một chiều, được trình bày trên cả 2 trục hoành và trục tung. Hệ quả là về mặt lý thuyết sẽ có một biểu đồ hình vuông, có tính đối xứng, đối xứng qua đường chéo, bởi vì cả hai chiều tần số đều biểu diễn cùng một thông tin về độ chuyển dịch hóa học của proton. Nhưng trên thực tế, ít khi được sự đối xứng bởi vì khả năng phân giải số (digital resolution) hoàn toàn khác nhau cho 2 chiều. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã áp dụng phương pháp
  33. toán học gọi là sự đối xứng hóa, nhờ thế các số liệu của phổ trên hai trục biểu đồ đã trở nên đối xứng, giúp việc giải đoán phổ dễ dàng hơn.
  34. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 3.1.1 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ − Máy cô quay chân không BUCHI Ratavapor R-200 (Đức) − Máy soi UV: MINERALIGHT ® LAMP, bước sóng 254 nm (Mỹ) − Máy đo phổ NMR Brucker Advant 500 MHz (Đức) − Cân điện tử TANITA KD – 200 và PRECISA XB 2200 ( Nhật, Đức) − Bản mỏng sắc ký (TLC) được thực hiện trên bản silicagel 60 F254, MERCK tráng sẵn − Cột sắc ký dùng silicagel 60, MERCK, cỡ hạt: 0,04 – 0,06 mm − Bình phun xịt thuốc thử − Bình giải ly TLC − Bếp điện dùng nướng bản mỏng Blacker® − Ống nghiệm 10 ml − Bình tam giác 250 ml − Bình cầu 3.1.2 HÓA CHẤT − Cloroform ( A, Trung Quốc) − Ethyl acetate ( A, Trung Quốc) − Metanol ( A, Trung Quốc) − n-Hexan ( A, Trung Quốc) − Etanol 96o ( T, Việt Nam) − Silicagel 60, MERCK, cỡ hạt: 0,04 – 0,06 mm − H2SO4 đđ 10%/ EtOH
  35. 3.2 THỰC NGHIỆM 3.2.1 NGUYÊN LIỆU Lá cây ô môi Cassia grandis tươi được thu hái tại thành phố Cần Thơ. Sau khi thu hái, lá cây được loại bỏ phần chết, già, rửa sạch, cắt ngắn, để ráo, phơi khô, ngâm dầm với ethanol để chiết xuất cao tổng. Các cao phân đoạn được điều chế bằng phương pháp trích pha rắn cao ethanol ban đầu với các dung môi có độ phân cực tăng dần như: n-hexan, ethyl acetate và methanol. Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng quát chiết tách hợp chất hữu cơ Lá ô môi khô 3.4 kg Ngâm dầm với ethanol Cao tổng ♦ Chiết xuất lần lượt với các dung môi 497g EtOH, n-Hexan, EtOAc ♦ Cô quay loại dung môi Cao n-Hexan Cao EtOAc Cao MeOH 161g 43g 278g 3.2.2 TIẾN HÀNH Từ cao EtOAc, tiến hành sắc ký cột cao áp như sau: − Nhồi cột với khối lượng cao: 4 g − Tiến hành ổn định cột với dung môi là n-Hexan trong 30 phút − Sau khi ổn định, nạp mẫu cao ethyl acetate của lá cây ô môi (4 g) dạng khô vào cột. − Sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau để rửa giải các hợp chất: n-Hexan 100 %; n-Hexan - EtOAc (75:25); n-Hexan - EtOAc (50:50);
  36. n-Hexan - EtOAc (25:75); EtOAc 100 %; EtOAc - MeOH (85:15); EtOAc - MeOH (70:30) − Dùng bình tam giác 250 ml để hứng dịch chảy ra − Tiến hành cô quay loại dung môi thu được các hợp chất − Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng, hiện vết với thuốc thử H2SO4 đđ 10%/ EtOH và gom các phân đoạn có Rf giống nhau vào cùng một lọ chứa Bảng 3.1: Các phân đoạn sau khi sắc ký cột cao EtOAc Phân Kết quả Hệ dung môi Ghi chú đoạn thử TLC 2 vết EA CHCl3 – CH3OH (95:5) Khảo sát chính EB CHCl3 – CH3OH (90:10) Nhiều vết EC CHCl3 – CH3OH (90:10) Nhiều vết ED CHCl3 – CH3OH (90:10) Nhiều vết EF CHCl3 – CH3OH (85:15) Nhiều vết 3 vết EG CHCl3 – CH3OH (80:20) Khảo sát chính EH CHCl3 – CH3OH(80:20) Nhiều vết • PHÂN ĐOẠN EA Tại phân đoạn EA, chúng tôi thấy xuất hiện dạng bột vô định hình. Sau đó, phân đoạn EA được rửa nhiều lần với ethyl acetate thu được dạng bột vô định hình màu vàng cam. Tiếp theo, dạng bột màu vàng cam được hòa tan trong hỗn hợp dung môi cloroform, methanol và chờ kết tinh, thu được tinh thể
  37. hình kim màu vàng cam, khối lượng 90mg. Ký hiệu là Cg01. Kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng, hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10 % trong EtOH cho vết tròn rõ màu vàng có Rf = 0,43 hệ giải ly CHCl3 – CH3OH (96:4). Hình 3.1: Chất Cg01 Hình 3.2: Bản mỏng hiện vết Cg01 • PHÂN ĐOẠN EG Tại phân đoạn EG, chúng tôi thấy xuất hiện dạng bột vô định hình màu vàng. Sau đó, phân đoạn EG được rửa nhiều lần với ethyl acetate thu được dạng bột vô định hình màu vàng. Kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng, hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10 % trong EtOH cho 3 vết tròn rõ. Tiếp theo, chúng tôi tiến hành sắc ký cột trung áp đối với dạng bột vừa nêu trên. − Nhồi cột với khối lượng mẫu: 157 mg − Tiến hành ổn định cột với dung môi là CHCl3 – CH3OH (85:15) trong 30 phút − Sau khi ổn định, nạp mẫu EG dạng khô vào cột. − Sử dụng hệ dung môi CHCl3 – CH3OH (85:15), rửa giải đẳng dòng − Sau khi sắc ký cột, chúng tôi thu được dạng bột màu vàng, khối lượng 16 mg. Kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng, hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10 % trong EtOH cho vết tròn rõ màu vàng có Rf = 0,34 hệ giải ly CHCl3 – CH3OH (80:20). Ký hiệu là Cg02. Hình 3.3: Chất Cg02 Hình 3.4: Bản mỏng hiện vết Cg02
  38. Cao EtOAc (E) 4g • Thêm khoảng 5g Silica Gel vào bình cầu có chứa cao, trộn đều rồi cô quay đến khô, sau đó nạp vào cartridge 10g. Hệ dung môi • Chuẩn bị cột. Nén đầy Silica gel vào cột 40x300cm. • HE: n-Hexane_EtOAc • Ổn định cột bằng n-Hexan trong 30 phút • Gắn cartridge chứa mẫu vào đầu cột và tiến hành • CM: CHCl3_MeOH • EM: EtOAc_MeOH Hexane HE HE HE EtOAc EM EM 75:25 50:50 25:75 100% 85:15 70:30 EA EB EC ED EE EF EG EH Kết tinh Sắc ký cột trung áp Cg01 Cg02 90 mg 16mg Sơ đồ 3.2: Quy trình cô lập và tinh chế các hợp chất
  39. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 KẾT QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ Trong quá trình phân lập và tinh chế các hợp chất, chúng tôi đã phân lập và tinh chế được 2 hợp chất: Cg01 từ phân đoạn EA và Cg02 từ phân đoạn EG đã được xác định cấu trúc. 4.2 KẾT QUẢ NHẬN DANH CẤU TRÚC CÁC CHẤT TINH KHIẾT 4.2.1 NHẬN DANH Cg01 − Phổ 1H-NMR (DMSO, δ ppm, 500 MHz) ( phụ lục 1) cho thấy sự hiện diện của 5 proton vòng thơm δH [ 7.68 (1H, d, J = 1.5 Hz), 7.28 (1H, d, J = 1.5 Hz), 7.37 (1H, dd, J = 8.3, 1.3 Hz), 7.79 (1H, dd, J = 8.5, 7.5 Hz), 7.70 (1H,dd, J = 7.5, 1.0 Hz)], 2 proton của (-CH2-) có δH 4.62 (2H, d, J = 5.0 Hz), 1 proton –OH δOH 5.58 (1H, t, J = 5.8 Hz), 1 mũi đơn của 2 proton – OH có δOH 11.92 cho thấy phân tử Cg01 có 2 nhóm –OH kiềm nối − Phổ 13C-NMR (DMSO, δ ppm, 125 MHz) (phụ lục 2) cho các tín hiệu ứng với 15 cacbon, gồm 2 cacbon tứ cấp của vòng thơm mang oxigen (−O−C=) có δC [ 161.57, 161.28], 5 cacbon tứ cấp mang nối đôi (>C=) có δC [ 114.37, 133.04, 133.27, 115.82, 153.64], 5 cacbon metin mang nối đôi (– CH=) có δC [ 124.29, 137.23, 119.25, 120.62, 117.05], 2 cacbon cacbonyl (>C=O) có δC [ 191.55, 181.35], 1 cacbon hydroxymetylen (−CH2−O−) có δC 62.03. − Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho phép dự đoán hợp chất Cg01 là một anthraquinone − Vòng A có phổ 1H-NMR cho tín hiệu của 3 proton nhân thơm trong đó có 2 proton với δH [ 7.37 (1H, dd, J = 8.3, 1.3 Hz), 7.70 (1H,dd, J = 7.5, 1.0 Hz)] chứng tỏ 2 proton vừa ghép cặp ortho vừa ghép cặp meta; 1 proton với δH [
  40. 7.79 (1H, dd, J = 8.5, 7.5 Hz)] chứng tỏ proton này ghép cặp ortho với 2 proton khác; một trong 2 proton −OH kiềm nối có δOH 11.92. Theo khung anthraquinone, −OH kiềm nối có δOH 11.92 gắn trên C-8. Vòng A có 3 vị trí mang nhóm thế và proton với δH 7.79 ở vị trí H-6. Từ phổ HSQC (phụ lục 4) xác định được C-6 có δC 137.23. Do chịu ảnh hưởng cho điện tử của nhóm –OH tại C-8 nên H-7 cộng hưởng ở vùng trường mạnh hơn so với H- 1 5. Vì thế, 2 tín hiệu trong phổ H-NMR δH [ 7.37, 7.70] lần lượt của H-7 và H-5. Từ phổ HSQC, xác định được C-7 có δC 124.29 và C-5 có δC 119.25. Phổ HMBC (phụ lục 3), cả 3 proton H-5, H-6, H-7 đều cho tương quan với 1 cacbon tứ cấp của vòng thơm mang oxigen (−O−C=) có δC 161.28. Như vậy cacbon tứ cấp của vòng thơm mang oxigen (−O−C=) có δC 161.28 là C- 8. Ngoài ra, proton H-6, H-7 còn cho tương quan với 2 cacbon tứ cấp mang nối đôi (>C=) có δC [ 133.27, 115.82]. Do chịu ảnh hưởng cho điện tử của nhóm –OH tại C-8 và cacbon cacbonyl nên C-8a cộng hưởng ở vùng trường cao hơn so với C-5a nên xác định được C-8a có δC 115.82 và C-5a có δC 133.27. 2 cacbon cacbonyl (>C=O) có δC [ 191.55, 181.35] lần lượt là C-9 và C-10. H O 5 H 10 6 5a 4a A 7 8a 1a H 8 9 OH O Hình 4.1: Một số tương quan HMBC trong vòng A của Cg01 1 − Vòng B phổ H-NMR có tín hiệu của 2 proton nhân thơm với δH [7.68 (1H, d, J = 1.5 Hz), 7.28 (1H, d, J = 1.5 Hz)] chứng tỏ 2 proton ghép cặp meta, một trong 2 proton −OH kiềm nối có δOH 11.92. Sự hiện diện của hai proton –OH kiềm nối, cùng với sự khác biệt về độ chuyển dịch hóa học của hai
  41. cacbon cacbonyl có δC 191.55 (C-9), 181.35 (C-10), cho thấy hai nhóm OH phenol ở cùng phía để tạo liên kết hydrogen với chỉ một trong hai cacbon cacbonyl và như vậy, một trong 2 proton −OH kiềm nối còn lại có δOH 11.92 gắn trên C-1. Do chịu ảnh hưởng ảnh hưởng cho điện tử của nhóm – OH tại C-1 nên H-2 cộng hưởng ở vùng trường mạnh hơn so với H-4. Vì 1 thế, 2 tín hiệu trong phổ H-NMR δH [7.68 (1H, d, J = 1.5 Hz), 7.28 (1H, d, J = 1.5 Hz)] lần lượt của H-4 và H-2. Từ HSQC, xác định được C-4 có δC 117.05 và C-2 có δC 120.62. Phổ HMBC còn cho tín hiệu proton –OH δOH 5.58 (1H, t, J = 5.8 Hz) có tương quan với 1 cacbon tứ cấp mang nối đôi (>C=) có δC 153.64; 2 proton của (−CH2−) có δH 4.62 (2H, d, J = 5.0 Hz) có tương quan với: 2 cacbon tứ cấp mang nối đôi (>C=) có δC [ 133.04, 153.64], 2 cacbon metin mang nối đôi (–CH=) có δC [ 120.62, 117.05], 1 cacbon tứ cấp của vòng thơm mang oxigen (−O−C=) có δC 161.57. Điều này chứng tỏ, nhóm –OH δOH 5.58 gắn trên C-11 ( cacbon hydroxymetylen) và cacbon hydroxymetylen (−CH2−OH) này có δC 62.03 và gắn trên C-3 ( δC 153.64). Còn lại 2 cacbon tứ cấp mang nối đôi (>C=) có δC [ 114.37, 133.04]. Do chịu ảnh hưởng cho điện tử của nhóm –OH tại C-1 và cacbon cacbonyl nên C-1a cộng hưởng ở vùng trường cao hơn so với C-4a nên xác định được C-1a có δC 114.37 và C-4a có δC 133.04. O H 10 4 CH2 4a 11 B 3 OH 1a 2 H 9 1 O OH Hình 4.2: Một số tương quan HMBC trong vòng B của Cg01
  42. Từ các dữ liệu phổ phân tích trên, so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất Cg01 được xác định là 1,8-dihydroxy-3-(hydroxymethyl)anthraquinone (aloe-emodin) O 5 10 4 5a 4a CH2 6 11 3 OH 7 8a 1a 2 8 9 1 OH O OH Bảng 4.1: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC của Cg01 (phụ lục 1, 2, 3) Vị 13C-NMR 1H-NMR (DMSO) δppm Loại HMBC trí (DMSO) (số H, dạng mũi, J = Hz) carbon 1H → 13C C/H δppm 1 161.57 −O−C= H2 → C4, 2 7.28 (1H, d, J = 1.5) 120.62 −CH= C1a, C1, C3, C9 3 153.64 >C= H4 → C10, 4 7.68 (1H, d, J = 1.5) 117.05 −CH= C2, C1a, C11, C9 H5 → C10, 5 7.7 (1H, dd, J = 7.5, 1.0) 119.25 −CH= C8, C7, C8a, C6, C9 H6 → C10, 6 7.79 (1H, dd, J = 8.5,7.5) 137.23 −CH= C8, C5a, C7, C8a H7 → C5, 7 7.37 (1H, dd, J = 8.5,1.5) 124.29 −CH= C8a, C5a, C8, C9 8 161.28 −O−C=
  43. 9 191.55 >C=O 10 181.35 >C=O 1a 114.37 >C= 4a 133.04 >C= 5a 133.27 >C= 8a 115.82 >C= H11→ C3, 11 4,62 (2H, d,J = 5.0) 62.03 −CH2−O− C4, C2, C4a, C1 5.58 (1H, t, J = 5.8 , 11- OH11→ C3 OH) Bảng 4.2: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC của Cg01 (Phụ lục 1, 2, 4) Vị 1 H-NMR δppm 13C-NMR Loại trí HSQC (số H, dạng mũi, J = Hz) δppm carbon C/H 1 161.57 −O−C= 2 7.28 (1H, d, J = 1.5) 120.62 −CH= H2 → C2 3 153.64 >C= 4 7.68 (1H, d, J = 1.5) 117.05 −CH= H4 → C4 5 7.7 (1H, dd, J = 7.5, 1.0) 119.25 −CH= H5 → C5 6 7.79 (1H, dd, J = 8.5,7.5) 137.23 −CH= H6 → C6 7 7.37 (1H, dd, J = 8.5,1.5) 124.29 −CH= H7 → C7 8 161.28 −O−C=
  44. 9 191.55 >C=O 10 181.35 >C=O 1a 114.37 >C= 4a 133.04 >C= 5a 133.27 >C= 8a 115.82 >C= 11 4,62 (2H, d,J = 5.0) 62.03 −CH2−O− H11 → C11 5.58 (1H, t, J = 5.8, 11-OH) Bảng 4.3: So sánh dữ liệu phổ 1H_NMR và 13C_NMR của Cg01 với tài liệu tham khảo: [19] Cg01 Aloe-emodin Vị trí 1 13 1 13 H-NMR C-NMR H-NMR C-NMR C/H (DMSO) (DMSO) (CDCl3) (CDCl3) δ ppm δ ppm δ ppm δ ppm 1 161.57 162.5 2 7.28 120.62 7.26 121.2 3 153.64 152.5 4 7.68 117.05 7.69 119.9 5 7.7 119.25 7.74 117.7 6 7.79 137.23 7.60 136.9 7 7.37 124.29 7.22 124.5
  45. 8 161.28 162.0 9 191.55 192.4 10 181.35 182.0 1a 114.37 114.9 4a 133.04 133.3 5a 133.27 133.4 8a 115.82 115.7 11 4,62 62.03 4.65 63.1 4.2.2 NHẬN DANH Cg02 − Phổ 1H-NMR (DMSO, δ ppm, 500 MHz) ( phụ lục 5) cho thấy sự hiện diện của 6 proton vòng thơm δH [ 6.21 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.42 (1H, d, J = 2.5 Hz), 7.75 (2H, dd, J = 2.0, 7.0 Hz), 6.91 (2H, dd, J = 2.0, 7.0 Hz)], 1 proton anomer của đường δH [ 5.29 (1H, d, J = 1.5 Hz)], các proton còn lại của đường [ 3.97 (1H, dd, J = 2.0, 3,5 Hz), 3.47 (1H, dd, J = 3.0, 9.0 Hz), 3,09~3.16 (2H, m) và 0.79 (3H, d, J = 6 Hz)], 1 mũi đơn tại δOH 12.62 cho thấy phân tử Cg02 có 1 nhóm –OH kiềm nối, 2 mũi đơn của –OH có tín hiệu tại δOH 10.89 và δOH 10.21. − Phổ 13C-NMR (DMSO, δ ppm, 125 MHz) (phụ lục 6 a, 6 b, 6 c) cho các tín hiệu ứng với 21 cacbon, gồm 6 cacbon tứ cấp của vòng thơm mang oxigen (−O−C=) có δC [ 157.15, 134.19, 161.22, 164.14, 156.43, 159.93], 2 cacbon tứ cấp mang nối đôi (>C=) có δC [ 120.47, 104.08], 1 cacbon cacbonyl (>C=O) có δC [ 177.66], 6 cacbon metin mang nối đôi (–CH=) có δC [ 98.66, 93.67, 130.49, 115.33], 1 cacbon acetal (−O−CH−O−) của phần đường có δC 101.77, 1 cacbon metyl (–CH3) có δC 17.5, 4 cacbon metin kề oxigen của phần đường (>CH−O−) có δC [ 70.32, 70.53, 71.10, 70.02].
  46. − Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho phép dự đoán hợp chất Cg02 là 1 flavonoid glycoside. − Vòng A có tín hiệu của 2 proton nhân thơm với δH [ 6.21 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.42 (1H, d, J = 2.5 Hz)] chứng tỏ 2 proton ghép cặp meta. Như vậy vòng A có 4 vị trí mang nhóm thế. Mặt khác, phổ HMBC (phụ lục 7) cho thấy 2 proton trên đều cho tương quan với 1 cacbon tứ cấp của vòng thơm mang oxigen có δC 164.14 và 1 cacbon tứ cấp mang nối đôi có δC 104.08. Proton có δH 6.21 còn cho tín hiệu tương quan với 1 cacbon tứ cấp mang nối đôi có δC 161.22 và 1 cacbon metin mang nối đôi có δC 93.67. Proton có δH 6.42 còn cho tín hiệu tương quan với 1 cacbon tứ cấp mang oxigen có δC 156.43 và 1 cacbon metin mang nối đôi có δC 98.66. − Từ phổ HSQC ( phụ lục 8), xác định được proton δH 6.21 gắn trên cacbon tương ứng có δC 98.66 và proton δH 6.42 gắn trên cacbon tương ứng có δC 93.67. Như vậy proton δH 6.21 ở vị trí 6, proton δH 6.42 ở vị trí 8. Ngoài ra phổ HMBC còn cho tín hiệu của proton δOH 10.89 tương quan với các cacbon có δC 98.66, δC 93.67, δC 164.14 và tín hiệu của proton kiềm nối δOH 12.62 các cacbon có δC 98.66, δC 104.08, δC 161.22. Như vậy, cacbon có δC 164.14 ở vị trí 7, cacbon có δC 161.22 ở vị trí 5, −OH có δOH 12.62 gắn trên C-5, −OH có δOH 10.89 gắn trên C-7, cacbon có δC 156.43 ở vị trí 9 và cacbon có δC 104.08 ở vị trí 10. Vòng A có dạng như sau: H 1 HO 8 O 7 9 2 A 3 6 10 H 5 4 OH O Hình 4.3: Tương quan HMBC trong vòng A của Cg02
  47. − Vòng B với 2 cặp proton đối xứng δH [ 7.75 (2H, dd, J = 2.0, 7.0 Hz), 6.91 (2H, dd, J = 2.0, 7.0 Hz)] chứng tỏ 2 cặp proton vừa ghép cặp meta vừa ghép cặp ortho nên vòng B có vị trí 1′, 4′ - thế và vòng B mang 1 nhóm thế –OH tại C-4′. Proton có δH 7.75 có cho tương quan với 2 cacbon tứ cấp của vòng thơm mang oxigen (−O−C=) có δC [157.15, 159.93], còn proton có δH 6.91 cho tương với 1 cacbon tứ cấp của vòng thơm mang oxigen (−O−C=) 1 có δC 159.93. Vì thế, 2 tín hiệu trong phổ H-NMR δH 6.91, δH 7.75 lần lượt của H-3′, 5′ và H-2′, 6′. Từ phổ HSQC, xác định được độ chuyển dịch hóa học của C-2′, 6′ (δC 130.49), C-3′, 5′ (δC 115.33). − Phổ HMBC cho thấy cả 2 proton H-3′, 5′ và H-2′, 6′ cùng cho tương quan với 1 cacbon tứ cấp mang oxigen (−O−C=) có δC 159.93 nên cacbon này là C-4′. Proton H-3′, 5′ còn cho tín hiệu tương quan với 1 cacbon tứ cấp mang nối đôi (>C=) có δC 120.47 và 1 cacbon metin kề nối đôi (–CH=) có δC 115.33 nên cacbon có δC 120.47 là C-1′. Proton H-2′, 6′ còn cho tín hiệu tương quan với 1 cacbon tứ cấp của vòng thơm mang oxigen (−O−C=) có δC 157.15 và 1 cacbon metin mang nối đôi (–CH=) có δC 130.49 nên cacbon có δC 157.15 là C-2. Cacbon tứ cấp của vòng thơm mang oxigen (−O−C=) δC 134.19 còn lại là C-3. Ngoài ra phổ HMBC còn cho tín hiệu của proton −OH δOH 10.21 tương quan với các cacbon có δC 159.93, δC 115.33 nên −OH δOH 10.21 gắn trên C-4′. Vòng B có dạng như sau: 3' H 2' 4' OH B 1' 5' O 2 H 6' 3 O
  48. Hình 4.4: Một số tương quan HMBC trong vòng B của Cg02 13 − Dựa vào phổ C-NMR xác định C-6″ có δC 17.5. Phổ HSQC xác định được 3 proton gắn vào C-6″ có δH 0.79. Dựa vào các tín hiệu còn lại trong phổ HMBC, HSQC, suy ra độ chuyển dịch hóa học của các proton và cacbon còn lại của đường là 1 proton anomer của đường δH [ 5.29 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-1″)], các proton còn lại của đường [ 3.97 (1H, dd, J = 2.0, 3.5 Hz, H- 2″), 3.47 (1H, dd, J = 3.0, 9.0 Hz, H-3″), 3,09~3.16 (2H, m, H-4″và H-5″) và 0.79 (3H, d, J = 6 Hz, H-6″)], 1 cacbon acetal (−O−CH−O−) của phần đường có δC 101.77 ( C-1″), 1 cacbon metyl (–CH3) có δC 17.5 ( C-6″), 4 cacbon metin kề oxigen của phần đường (>CH−O−) có δC [ 70.32 (C-2″), 70.53 (C-3″), 71.10 (C-4″), 70.02 (C-5″)]. Các giá trị phổ nghiệm tương tự số liệu phổ của đường L-rhamnose. Proton H-1″ có độ chuyển dịch hóa học δH 5.29 và hằng số ghép J=1.5 Hz nên đây là đường α-L-rhamnose. Phổ HMBC cho thấy H-1″ ( H-anomer) δH 5.29 cho tín hiệu tương tác với cacbon δC 134.19 (C-3) trên khung flavonoid, điều này chứng tỏ phân tử đường rhamnose gắn tại C-3. 2 3 O 6'' 5" 1'' H3C 3" O H HO 4" HO 2" OH Hình 4.5: Một vài tương quan HMBC trong gốc đường của Cg02 Từ các dữ liệu phổ phân tích trên, so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất Cg02 được xác định là kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside ( afzelin)
  49. 3' OH 2' 4' 8 HO 9 O 2 ' 1' 5 7 6' 6 10 3 5 O OH O 6'' 5'' 1'' H3C O HO H 3'' 4'' HO 2'' OH Bảng 4.4: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC của Cg02 ( Phụ lục 5, 6 a, 6 b, 6 c, 7) 13C- Vị 1 H-NMR (DMSO) δppm NMR Loại HMBC trí (số H, dạng mũi, J = Hz) (DMSO) carbon 1H → 13C C/H δppm 2 157.15 −O−C= 3 134.19 −O−C= 4 177.66 >C=O OH5 → C6, C10, 5 12.62 (1H, s, 5-OH) 161.22 −O−C= C5 H6 → C8, C10, 6 6.21 (1H, d, J = 2.0) 98.66 −CH= C7, C5 OH7 → C6, C8, 7 10.89 (1H, s, 7-OH) 164.14 −O−C= C7
  50. H8 → C6, C9, 8 6.42 (1H, d, J = 2.5) 93.67 −CH= C7, C10 9 156.43 −O−C= 10 104.08 >C= 1′ 120.47 >C= H2′ → C2, C4′, 2′ 7.75 (1H, dd, J = 2.0, 7.0) 130.49 −CH= C6′ H3′ → C1′, C4′, 3′ 6.91 (1H, dd, J = 2.0, 7.0) 115.33 −CH= C5′ OH4′ → C3′, 4′ 10.21 (1H, s, 4′-OH) 159.93 −O−C= C4′, C5′ H5′ → C1′, C4′, 5′ 6.91 (1H, dd, J = 2.0, 7.0) 115.33 −CH= C3′ H6′ → C2, C4′, 6′ 7.75 (1H, dd, J = 2.0, 7.0) 130.49 −CH= C2′ −O−CH− H1″ → C2″, C3″, 1″ 5.29 (1H, d, J = 1.5) 101.77 O− C3 2″ 3.97 (1H, dd, J = 2.0, 3.5) 70.32 >CH−O− 3″ 3.47 (1H, dd, J = 3.0, 9.0) 70.53 >CH−O− H3″ → C2″, C4″ H4″ → C5″, C2″, 4″ 71.10 >CH−O− C3″, C6″ H5″ → C4″, C2″, 5″ 70.02 >CH−O− C3″, C6″ 6″ 0.79 (3H, d, J = 6) 17.5 −CH3 H6″ → C5″, C4″
  51. Bảng 4.5: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, COSY của Cg02 ( Phụ lục 5, 6 a, 6 b, 6 c, 8, 9) Vị 13C- 1H-NMR δppm HSQC COSY trí NMR (số H, dạng mũi, J = Hz) 1H → 13C 1H → 1H C/H δppm 2 157.15 3 134.19 4 177.66 5 12.62 (1H, s, 5-OH) 161.22 6 6.21 (1H, d, J = 2.0) 98.66 H6 → C6 7 10.89 (1H, s, 7-OH) 164.14 8 6.42 (1H, d, J = 2.5) 93.67 H8 → C8 9 156.43 10 104.08 1′ 120.47 H2′ → C2′, H2′ → H3′, 2′ 7.75 (1H, dd, J = 2.0, 7.0) 130.49 C6′ H5′ H3′ → C3′, H3′ → H2′, 3′ 6.91 (1H, dd, J = 2.0, 7.0) 115.33 C5′ H6′ 4′ 10.21 (1H, s, 4′-OH) 159.93 H5′ → C3′, H5′ → H2′, 5′ 6.91 (1H, dd, J = 2.0, 7.0) 115.33 C5′ H6′ H6′ → C6′, H6′ → H3′, 6′ 7.75 (1H, dd, J = 2.0, 7.0) 130.49 C2′ H5′ 1″ 5.29 (1H, d, J = 1.5) 101.77 H1″ → C1″ H1″ → H2″
  52. 2″ 3.97 (1H, dd, J = 2.0, 3.5) 70.32 H2″ → C2″ H2″ → H3″ 3″ 3.47 (1H, dd, J = 3.0, 9.0) 70.53 H3″ → C3″ H3″ → H2″ H4″ → H6″, 4″ 71.10 H4″ → C4″ H5″ H5″ → H4″, 5″ 70.02 H5″ → C5″ H6″ H6″ → H4″, 6″ 0.79 (3H, d, J = 6) 17.5 H6″ → C6″ H5″ Bảng 4.6: So sánh dữ liệu phổ 1H_NMR và 13C_NMR của Cg02 với tài liệu tham khảo: [18] Cg02 Afzelin Vị 1H-NMR 13 1H-NMR 13 trí C-NMR C-NMR C/H (DMSO) (DMSO) (DMSO) (DMSO) δ ppm δ ppm δ ppm δ ppm 2 157.15 157.24 3 134.19 134.15 4 177.66 177.70 5 161.22 161.28 6 6.21 98.66 6.21 98.92 7 164.14 164.80 8 6.42 93.67 6.42 93.88 9 156.43 156.56
  53. 10 104.08 103.98 1′ 120.47 120.49 2′ 7.75 130.49 7.74 130.64 3′ 6.91 115.33 6.91 115.48 4′ 159.93 160.14 5′ 6.91 115.33 6.91 115.48 6′ 7.75 130.49 7.74 130.64 1″ 5.29 101.77 5.29 101.77 2″ 70.32 70.35 3″ 70.53 70.69 4″ 71.10 71.13 5″ 70.02 70.11 6″ 0.79 17.5 0.9 17.53
  54. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Bước đầu khảo sát thành phần hóa học của cao ethyl acetate lá cây ô môi Cassia grandis L.f, chúng tôi đạt được kết quả như sau: Từ cao EtOAc của lá cây ô môi, chúng tôi đã phân lập được hai chất tinh khiết và đã nhận danh được cấu trúc của chúng bằng các phương pháp phổ như 1H- NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC, COSY. Gồm: • 1,8-dihydroxy-3-(hydroxymethyl)anthraquinone (aloe-emodin) • kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside (afzelin) 5.2 KIẾN NGHỊ Do thời gian thực hiện đề tài và khả năng có hạn, chúng tôi chưa thực hiện một số mục tiêu khác, để phát triển đề tài theo hướng tiếp theo. Nếu có điều kiện chứng tôi đề nghị: • Tiếp tục khảo sát các phân đoạn còn lại của cao EtOAc của lá cây ô môi để phân lập các hợp chất có trong cao. • Khảo sát thành phần hóa học các cao n-Hexan, MeOH của lá cây ô môi • Thử hoạt tính sinh học các chất sẽ được phân lập và tinh chế các chất có hoạt tính để khi cần có thể sản xuất trong thực phẩm chức năng hay dược phẩm.
  55. TÀI LIỆU THAM KHẢO • TIẾNG VIỆT [1] Đào Huy Phong (2011), Luận văn thạc sĩ hóa học “Nghiên cứu thành phần hóa học lá Ô Môi Cassia grandis L.f Họ Vang (Caesalpiniaceae)” , Trường Đại học Cần Thơ, trang 36-50 [2] Đỗ Huy Ích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiền, Vũ ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2003), Viện Dược Liệu, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, trang 495-496. [3] Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, trang 909 [4] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, trang 151-280. [5] Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, trang 11-353. • TIẾNG NƯỚC NGOÀI [6] A G González, J Bermejo, E Valencia (1996), A new C6-C3 compound from Cassia grandis, Planta Medica, 62(2), pp. 176- 177 [7] Caceres A, Lopez BR, Giron MA, Logemann H (1993), Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections. 1. Screening for antimycotic activity of 44 plant extracts, Journal of Ethnopharmacol, 31(3), pp. 263-76
  56. [8] C. D. Daulatabad, K. M. Hosamani, V. A. Desai, K. R. Alagawadi (1987), Cyclopropennoid fatty acids in leguminosae oils, Journal of the American Oil Chemist’s Society, 64(10), pp. 1423 [9] Clippel, Joscineia Kelli, Carmo, Hallan Nunes Chamon do, Nascimento, Luis Cláudio Zanette, Cuzzuol, Geraldo Rogério Faustini (2008), Análise química em órgãos de reserva de algumas herbáceas e arbóreas ocorrentes na flora do Espírito Santo, Acta Botanica Brasilica, 22(4), pp. 1057-1067 [10] Danny E. García y Maria G. Medina (2006), Composición química, metabolitos secundarios, valor nutritivo y aceptabilidad relativa de diez a1rboles forrajeros, Zootecnia Trop, 24(3), pp. 233-250 [11] Dr. C. Emilio Montejo Cuenca, Dr. C. Melquiades Castanẽda Sánchez, Dr. C. Orlando Mastínez Yero, Dr. C. Felipe Pérez Freeman, MSc. Jorge Duvergel Rosseaux, MSc. Waldo Ramírez Sánchez y Dra. Yuniet Salgado Acosta (2005), Hemolizado y la canãndonga (Cassia grandis) como reconstituyente en la desnutrición de los terneros (The use of homolyzed and Canandonga (Cassia grandis) os reonstituent in calves’ malnutrition), Revista Electrónica de Veterinaria REDVET, 6(9), pp. 1-7 [12] Harsha Joshi, Viendra P Kapoor (2003), Cassia grandis Linn. F. seed galactomannan: structural and crystallographical studies, Carbohydrate Research, 338(18), pp. 1907-1912 [13] Ibadur Rahman Siddiqui, Mithiles Singh, Dipti Gupta, Jagdamba Singh (1993), Anthraquinone O-β-D-glucosides from Cassia grandis, Natural Product Letters, 2(2), pp. 83-90 [14] Juana Tillán Capó, Jorge Rodriguez Chanfrau, Juan Miguel Gómez Mirabal, Zenia Prado Ruíz y Sara Aguero Fernández, (2004),
  57. Actividad antianémica de la Cassia grandis L, Rev Cubana Farm, 38(3), pp. 1-1 [15] MA Awal, Syed Ashrafuzzaman, E Ekramul Haque (2009), Studies on antibacterial activity and Brine Shrimp toxicity of leaf extract of Cassia grandis, Bangladesh Journal of Medical Microbiology, 3(1), pp. 17-19 [16] Meennarani, S. B Khlidhar (1998), Chemical Examination Of The Stems Of Cassia grandis L, Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 60(1), pp. 59 [17] Pino J. A. (2010), Volatile compounds of Cassia grandis L. f. Fruit from Cuba, The Journal of essential oil research, 22(6), pp. 599-601 [18] O.A.Eldahshan (2011), Isolation and structure Elucidation of Phenolic compounds of carob leaves grown in Egypt, Journal of Biological Sciences, 3(1), pp. 52-55 [19] R.M.Coopoosamy, M.L.Magwa (2006), Antibacterial activity of aloe emodin and aloin A isolated from Aloe excelsa, African Journal of Biotechnology, Vol.5(11), pp. 1092-1094 [20] R. P. Verma, K. S. Sinha (1994), An anthraquinone from Cassia grandis Linn, Natural Product Research, 5(2), pp. 105-110 [21] R. P. Verma, K S Sinha (1996), Anthraquinone β-D-glucoside from Cassia grandis, Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 34(4), pp. 290-294 [22] Sandesh R Lodha, Shrikant V Joshi, Bhavin A Vyas, Dr. Shailesh A Shah, Megha S Kirve, Shweta S Salunke, Sheetal K Kadu, Manasi V Rogye (2010), Evaluation of the effectiveness of Cassia grandis (Leguminosae) in the alleviation of carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in the rat, International Journal of Drug Formulation and Research, 1(3), pp. 276-282
  58. [23] Sandesh R Lodha, Shrikant V Joshi, Bhavin A Vyas, Mohini C Upadhye, Megha S Kirve, Shweta S Salunke, Sheetal K Kadu, Manasi V Rogye (2010), Assessment of the antidiabetic potential of Cassia grandis using an in vivo model, Origimal article, 1(3), pp. 330-333 [24] V.K. Mahesh, Rashmi Sharma, R.S. Singh, S.K. Upadhya (1984), Anthraquinones and kaemferol from Cassia species section Fistula, Journal of Natural Products, 47(4), pp. 733 [25] Valencia, Emir Madinaveitia, A. Bermejo, Jaime González, Antonio G. Gupta, M. P. (1995), Alkaloids from Cassia grandis, Fitoterapia, 66(5), pp. 476-477 [26] Vandana Singh, Stuti Tiwari, Ajit Kumar Sharma, Rashmi Sanghi (2007), Removal of lead from aqueous solutions using Cassia grandis seed gum-graft-poly(methylmethacrylate), Journal of Colloid and Interface Science, 316(2),pp. 224-232 [27] Wandee Gritsanapan, Bamrung Tantisewie, Vichiara Jirawongse (1981), Chemical constituents of Cassia timorensis and Cassia grandis, ScienceAsia, 10, pp. 189-190 [28] Y S Srivastava, P C Gupta (1981), A new Flavonol Glycoside from Seeds of Cassia grandis, Planta Med, 41(4), pp. 400-2
  59. Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của Cg01
  60. Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR của Cg01
  61. Phụ lục 3: Phổ HMBC của Cg01
  62. Phụ lục 4: Phổ HSQC của Cg01
  63. Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR của Cg02
  64. Phụ lục 6a: Phổ 13C-NMR dãn rộng của Cg02
  65. Phụ lục 6b: Phổ 13C-NMR dãn rộng của Cg02
  66. Phụ lục 6c: Phổ 13C-NMR dãn rộng của Cg02
  67. Phụ lục 7: Phổ HMBC của Cg02
  68. Phụ lục 8: Phổ HSQC của Cg02
  69. Phụ lục 9: Phổ COSY của Cg02