Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate của loài địa y Roccella montagnei

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate của loài địa y Roccella montagnei

1. ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETHYL ACETATE CỦA LOÀI ĐỊA Y ROCCELLA MONTAGNEI GVHD: TS. DƢƠNG THÚC HUY SVTH: NGUYỄN THỊ QUỲNH NHƢ MSSV: K40.201.059 Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2018
2. Xác nhận của Hội đồng phản biện: KÍ TÊN VÀ DUYỆT (Kí và ghi rõ họ tên)
3. LỜI CẢM ƠN Trong thời gian được học tập và rèn luyện ở Khoa Hóa học, trường Đại Học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh, bản thân em đã tiếp nhận được rất nhiều kiến thức và các kĩ năng cần thiết để tự tìm tòi và phát triển bản thân. Em xin cảm ơn thầy Dương Thúc Huy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình thực hiện cho đến lúc hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô và các anh chị, các bạn sinh viên Khoa Hóa học đã hỗ trợ cho em trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp. Tuy nghiên, do kinh nghiệm chưa thật sự dày dặn cùng thời gian có hạn và hạn chế về mặt vật chất nên khóa luận này không thể tránh khỏi sai sót, em rất mong nhận được sự thông cảm và góp ý từ phía quý thầy cô và mọi người. Em xin chân thành cảm ơn! i
4. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC PHỤ LỤC v LỜI MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Định nghĩa và phân loại địa y 2 1.2. Vai trò sinh thái của các hợp chất tự nhiên trong địa y 3 1.3. Nghiên cứu hoá học về các hợp chất trong địa y 3 1.4. Nghiên cứu hóa học của một số loài địa y thuộc chi Roccella 4 1.5. Hoạt tính của địa y và các hợp chất của địa y 5 1.5.1. Hoạt tính đối với động vật 7 1.5.2. Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao 7 1.5.3. Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme virus của các hợp chất địa y 8 1.5.4. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y 9 1.5.5. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y 12 CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM 15 2.1. Máy móc, thiết bị, hóa chất 15 2.2. Thu hái và xử lý mẫu nguyên liệu, ly trích và cô lập các hợp chất 15 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất DS 18 ii
5. 3.2. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất R1 18 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 19 4.1. Kết luận 19 4.2. Đề xuất 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined. iii
6. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU Ac Acetone AcOH Acid acetic br Mũi dãn rộng (Broad) C Chloroform DMSO Dimethyl sulfoxide d Mũi đôi (Doublet) EA Ethyl acetate H n-hexane HMBC Tương quan 1H-13C qua 2, 3 nối (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) HSQC Tương quan 1H-13C qua 1 nối (Heteronuclear Single Quantum Correlation) IC50 Nồng độ ức chế sự phát triển của 50% số tế bào thử nghiệm (Half Maximal Inhibitory Concentration) J Coupling constant (Hằng số tương tác spin-spin) NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) s Mũi đơn (Singlet) SKC Sắc ký cột δ Chemical shift (Độ chuyển dịch hóa học) iv
7. DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1. Ba dạng chính của địa y Hình 1.2. Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y Hình 1.3. Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Rocella Hình 1.4. Một số hợp chất cô lập từ địa y Hình 2.1. Địa y Rocella montagnei Hình 3.1. Một số tương quan HMBC trong hợp chất DS Hình 3.2. Một số tương quan HMBC trong hợp chất R1 Hình 4.1. Cấu trúc hai hợp chất đã cô lập Sơ đồ 2.1. Sơ đồ sắc ký cột trên cao n-hexane Sơ đồ 2.2. Sơ đồ sắc kí cột trên cao ethyl acetate DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao Bảng 1.2. Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus của các hợp chất địa y Bảng 1.3. Hoạt tính ức chế enzyme của một số hợp chất cô lập từ địa y Bảng 1.4. Hoạt tính ức chế enzyme của một số hợp chất cô lập từ địa y Bảng 1.5. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y Bảng 3.1. So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất DS, acid lecanoric và acid diorcinolic. Bảng 3.2. So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất R1 và lecanorin DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất DS Phụ lục 2. Phổ HSQC và HMBC của hợp chất DS Phụ lục 3. Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất R1 Phụ lục 4. Phổ HSQC và HMBC của hợp chất R1 v
8. LỜI MỞ ĐẦU Trong khoảng 20 năm trở lại đây, những nghiên cứu hóa học và sinh học về địa y trên thế giới trở nên phổ biến. Địa y là thực vật bậc thấp, là kết quả của sự cộng sinh của tảo và nấm. Nhờ dạng sống này, địa y có thể sống được ở nhiều nơi như trên đất đá, thân cây, lá cây, trong những điều kiện môi trường từ vùng khô hạn đến khắc nghiệt. Ở Việt Nam, người ta dễ dàng tìm thấy sự có mặt của địa y ở những nơi quen thuộc với sự phân bố phong phú và đa dạng. Từ xưa, con người đã biết sử dụng địa y vào nhiều mục đích khác nhau như làm thực phẩm, men rượu, phẩm nhuộm. Địa y Evernia prunastri hiện vẫn được sử dụng trong ngành kỹ nghệ mỹ phẩm để làm chất định hương. Một vài loại hợp chất polyphenol có trong địa y có khả năng hấp thu tia UVB nên chúng được sử dụng làm kem chống nắng. Quan trọng hơn hết là địa y đã được sử dụng để chữa một số bệnh như bệnh lao, bệnh dại, cảm sốt, ho, vết thương ngoài da. Địa y Lobaria pulmonaria được sử dụng để chữa bệnh liên quan đến đường hô hấp, viêm khớp (Atalay 2011 [1], Suleyman 2003 [2]), địa y Parmelia sulcata chữa các bệnh về sọ não, loài Peltigera được sử dụng để chữa trị các bệnh dại (Barrington 1974 [3]). Địa y Cetraria islandica được sử dụng ở Thuỵ Điển làm thuốc chữa bệnh đái tháo đường, viêm phổi (Ahmadjian 1963 [4]). Các nghiên cứu cho biết địa y thường chứa các loại hợp chất thơm như depside, depsidone, depsone, dẫn xuất dibenzofuran và các hợp chất có màu như xanthone, antraquinone và dẫn xuất acid usnic (Devehat 2007 [5]). Nhiều loại depsidone có đa dạng hoạt tính sinh học đặc biệt trong ức chế enzyme liên quan đến các bệnh chuyển hóa ở người [6]. Nhằm phát triển các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài địa y sinh trưởng ở Việt Nam nói chung cũng như mở rộng các nghiên cứu trên loài địa y Roccella montagnei, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate của loài địa y Roccella montagnei”. 1
9. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Định nghĩa và phân loại địa y Địa y là một dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, là kết quả cộng sinh của nấm (mycobiont) và một thành phần quang hợp (photobiont) thường là tảo (green alga) hay vi khuẩn lam (cyanobacterium). Hiện nay có khoảng 17.000 loài địa y đã được tìm thấy. Thông thường địa y chia làm 3 dạng: dạng khảm, dạng phiến và dạng sợi (Choi và cộng sự, 2008)[7]: Xanthoria sp., Flavoparmelia caperata, Letharia vulpina, (Crustose lichen) (Foliose lichen) (Fructicose lichen) Hình 1.1. Ba dạng chính của địa y Thành phần tảo của địa y sản sinh các carbohydrate bằng quá trình quang hợp, còn thành phần nấm sản sinh các hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu bọ và các loài động vật ăn cỏ, ), cung cấp nước và khoáng chất. Kết quả từ sự cộng sinh này giúp địa y có thể sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu ở vùng vĩ độ cao, vùng nhiệt đới, và có thể hiện diện ở khắp mọi nơi như trên đá, đất, lá cây, thân cây, kim loại, thủy tinh (Choi và cộng sự, 2008)[7]. Ðể hiểu được bản chất của địa y và giải thích nguồn gốc của chúng, các nhà thực vật học đã thử tổng hợp địa y từ tế bào tảo và nấm. Mặc dù cả hai thành phần được nuôi cấy riêng rẽ nhưng việc tổ hợp lại thành địa y thật sự khó khăn. 2
10. 1.2. Vai trò sinh thái của các hợp chất tự nhiên trong địa y Bảo vệ đối với cây trồng bậc thấp và bậc cao. Các hợp chất thơm hấp thụ tia UV, bảo vệ địa y chống lại bức xạ có hại. Các acid carboxylic từ địa y là tác chất tạo phức mạnh và giúp cho địa y lấy được các khoáng chất từ vật chủ nơi địa y bám vào (substrate) (Choi và cộng sự, 2008)[7]. Giúp xua đuổi thú ăn thịt và côn trùng. 1.3. Nghiên cứu hoá học về các hợp chất trong địa y Có nhiều hệ thống phân loại các hợp chất hóa học từ địa y, trong đó được sử dụng nhiều nhất là hệ thống phân loại do Shibata và công sự đề nghị (Huneck 1997)[8]: Các hợp chất hóa học trong địa y được chia làm ba nhóm chính dựa theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (Hình 1.2). Nguồn gốc acid shikimic: terphenylquinone và dẫn xuất của acid tetronic. Nguồn gốc acid mevalonic: triterpenoid. Nguồn gốc acetate-malonate: các acid dây dài và các acid phenol. Tảo Nấm Hình 1.2. Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y 3
11. 1.4. Nghiên cứu hóa học của một số loài địa y thuộc chi Roccella Địa y Roccella đã được nghiên cứu hóa học trong hơn 50 năm. Nghiên cứu hóa thực vật trên chi Roccella được công bố trên một số loài Roccella fuciformis, R. phycopis Ach., R. capesis Follm., R. galapagoensis, R. hypomecha Bory., R. montagnei, R. portentosa và R. capesis Follm. D-Montagnetol và D-erythrin là các hợp chất chính, được tìm thấy trên tất cả các loài địa y Roccella [9]. ● Roccella capesis 9-Methyl pannarate (R10) được cô lập bởi Huneck S. và cộng sự (1991) [10]. ● Roccella fuciformis D-Tagatose (R3) từ R. fuciformis được cô lập bởi Culberson C. F. (1969) [11]. Ethyl orsellinate (R4) được ly trích từ R. fuciformis (Huneck S., 1997) [8]. Acid lepraric (R7) được cô lập từ R. fuciformis bởi Aberhart D. J. (1969) [12]. 2-Methyl-5-hydroxy-6- hydroxymethyl-7-methoxychromone (R8) được cô lập từ R. fuciformis bởi Huneck S. và Follmann G. (1972) [9]. Picroroccellin (R14) được cô lập bởi Marcuccio S. M. và Elix J. A. từ R. fuciformis (1983) [13]. ● Roccella galapagoensis Galapagin (R9) được cô lập bởi Huneck S. (1992) [14]. ● Roccella hypomecha Acid 3-O-Demethylschizopeltic (R11) được cô lập bởi Huneck và cộng sự (1993) [15]. ● Roccella montagnei Năm 1969, D-(+)-montagnetol (R5) được cô lập từ R. montagnei bởi Culberson C. F. và cộng sự [11]. Năm 2017, Duong T. H. và cộng sự đã cô lập được 5 hợp chất mới 4
12. orsellinylmontagnetol A–D và hydrofurylmontagnetol (R15-R19) cùng với (+)-D- montagnetol (R5), (+)-D-erythrin (R6), 1-acetylerythritol (R20), acid lecanoric (R21), lecanorin (R22), acid orsellinic (R23), methyl orsellinate (R24). ● Roccella phycopis Acid roccellic (R1) được cô lập từ R. phycopis Ach. Bởi Huneck S. và cộng sự (1994) [12]. Meso-erythritol (R2) và erythrin (R6) được cô lập từ R. phycopis bởi Culberson C. F. (1969) [11]. ● Roccella portentosa Acetylportentol (R12) và portentol (R13) được cô lập từ R. portentosa bởi Aberhart D. J. và cộng sự (1970) [12]. 1.5. Hoạt tính của địa y và các hợp chất của địa y Địa y sản sinh ra một lượng lớn các hợp chất hữu cơ, đa số có hoạt tính sinh học và nhiều loại trong chúng là đặc hiệu của địa y trong hoá học các hợp chất tự nhiên. Tuy vậy, các khảo sát hoá học trên địa y bị hạn chế do nguồn cung có hạn, vì các địa y phát triển rất chậm. Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc nuôi cấy địa y trong phòng thí nghiệm cũng không dễ dàng, chỉ khoảng 10% địa y được nuôi cấy thành công, tuy nhiên chúng lại chứa các hợp chất hữu cơ khác hẳn với các hợp chất có trong cùng loại địa y tự nhiên. Lê Hoàng Duy (2012)[16] đã nghiên cứu nuôi cấy thành công 10% trên khoảng 50 loài địa y lấy từ Việt Nam. Tuy đạt thành công về mặt cô lập hợp chất mới nhưng hầu như các hợp chất cô lập từ địa y nuôi cấy đều khác so với các hợp chất địa y tự nhiên. Khoảng gần 1.000 hợp chất địa y đã được cô lập cho đến nay. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học và khả năng dược học của các hợp chất tự nhiên từ địa y được thống kê đầy đủ của Boustie (2010)[6], Huneck (1999)[17], Muller (2001)[18] về kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm, kháng enzyme 5
13. Hình 1.3. Các hợp chất được cô lập từ loài địa y thuộc chi Roccella 6
14. 1.5.1. Hoạt tính đối với động vật Acid caperatic và các cao chiết xuất từ địa y Flavoparmelia baltimorensis và Xanthoparmelia cumberlvàia kìm hãm sự tăng trưởng của loài ốc Pallifera varia. Các hợp chất phenol đơn vòng gây độc ấu trùng của loài giun Toxocara canis. Atranorin, pulvinic acid dilactone, calycin, parietin, acid evernic, acid psoromic, acid physodic, acid 3-hydroxyphysodic, acid fumarprotocetraric, acid stictic, acid norstictic, acid salazinic, acid vulpinic, acid rhizocarpic và acid usnic làm giảm sự tăng trưởng của ấu trùng ăn tạp Spodoptera littoralis nhưng không ảnh hưởng đến sự sống còn của chúng. 1.5.2. Hoạt tính điều tiết tăng trƣởng đối với thực vật bậc cao Một số hợp chất từ địa y thể hiện hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao như Bảng 1.1. Bảng 1.1. Hoạt tính điều tiết tăng trƣởng đối với thực vật bậc cao Địa y hoặc các hợp chất của địa y Hoạt tính Acid barbatic, acid 4-O-demethylbarbatic, acid Ức chế sự tăng trưởng của cây rau diffractaic, acid evernic, acid lecanoric, acid β- diếp orcinolcarboxylic, acid orsellinic Ergochrome AA (acid secalonic A) Gây độc cho thực vật Acid evernic Giảm các nồng độ chất diệp lục trong lá rau bina Acid lecanoric Nguyên nhân gây bất thường cho gốc của cây Allium cepa Các hợp chất phenol đơn vòng Hoạt tính ức chế của độc chất thực vật Các quinone từ Pyxine spp Ức chế sự nguyên phân của rễ cây Allium cepa Acid usnic Ức chế sự nảy mầm và phát triển của Lepidium sativum 7
15. 1.5.3. Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme virus của các hợp chất địa y Anthraquinone như emodin và các chất tương tự có hoạt tính kháng virus. Hypericin có hoạt tính đáng kể chống lại sự sao chép ngược của virus HIV (antiretroviral). Các hợp chất 7,7’-dichlorohypericin cũng như 5,7-dichloroemodin có hoạt tính mạnh đối với virus HSV-1 (virus bệnh sinh dục herpes đơn dạng loại 1) trong khi các anthraquinone thế monochloro có hoạt tính giảm hơn. Hoạt tính dường như tăng theo số lượng nguyên tử Cl trong cấu trúc (Muller 2001)[18]. Các hợp chất thơm cô lập từ các loài địa y như depsidone, depside và diphenyl ether thể hiện hoạt tính ức chế mạnh nhiều loại enzyme. Bảng 1.2. Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus của các hợp chất địa y Hợp chất Virus và enzyme của virus Depsidone: acid virensic và dẫn xuất Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực tương tự khuẩn vào nhiễm sắc thể virus HIV. Acid butyrolactone: acid Nhân bản của HIV protolichesterinic (+)-Acid usnic và 4 depside khác Virus Epstein-Barr (EBV) Emodin, 7-cloroemodin, 7-chloro-1-O- methylemodin, 5,7-dichloroemodin, HIV, cytomegalovirus và các virus khác hypericin Từ địa y Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm, thu hái trên núi Zelengora (Bosnia), hai hợp chất depsidone đã được cô lập, đó là: diacid 4-formyl-8-hydroxy-1,9-dimethyl-3- methoxy-11-oxo-11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-6,7-carboxylic và 7,8-diacetoxy-4- formyl-1,9-dimethyl-3-methoxy-11-oxo-11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin [6]. Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng cho thấy hợp chất diacid không có hoạt tính nhưng hợp chất mang hai nhóm acetate lại có hoạt tính khá ở nồng độ 1 g/ mL, so với chất đối chứng dương galanthamine hoạt tính ở nồng độ 0,01 g/ mL [6]. 8
16. Depsidone acid lobaric [9] ức chế mạnh được nhiều loại enzyme như 12(S)- lipoxygenase platelet-type (IC50 28,5 µM), 5-lipoxygenase (IC50 7,3 µM), protein tyrosine phosphate 1B (PTP1B, IC50 0,87 µM), cyclogenase (IC50 29,2 µM). Các hợp chất diphenyl ether pseudodepsidone (H1) và (H2) [7] có khả năng ức chế mạnh dòng enzyme PTP1B với giá trị lần lượt IC50 6,86 và 2,48 µM và depside acid baeomyceric ức chế enzyme 5-lipoxygenase với giá trị IC50 8,3 µM. Một số hợp chất địa y khác ức chế vài loại enzyme được thống kê bởi Boustie (2010) [6] và Muller (2001) [15], lần lượt minh họa trong Bảng 1.1 và 1.2. 1.5.4. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y Các hợp chất từ địa y cũng là những hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả. Acid protolichesterinic được thử nghiệm in vitro kháng khuẩn Helicobacter pylori (acid này là thành phần trong thuốc cổ truyền giảm đau dạ dày với tên Iceland moss) (Muller 2001)[18]. Một số lượng lớn các hợp chất địa y kiềm hãm sự phát triển của vi khuẩn hay nấm như alectosarmentin, pannarin và chloropannarin, emodin và physcion, acid evernic, acid leprapinic và dẫn xuất, các hợp chất phenol đơn vòng, acid puvinic và dẫn xuất, acid usnic và dẫn xuất (Bảng 1.3) (Muller 2001)[18]. Khả năng kháng nấm của các hợp chất địa y cũng được đánh giá dựa trên giá trị MIC, thí dụ như các hợp chất parietin, fallacinal, emodin (Boustie 2010) [6]. Trong các hợp chất địa y, acid usnic và dẫn xuất của nó cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cực kì mạnh trên khá nhiều dòng vi khuẩn. 9
17. Hình 1.4. Một số hợp chất cô lập từ địa y 10
18. Bảng 1.3. Hoạt tính ức chế enzyme của một số hợp chất cô lập từ địa y [6] Tên hợp chất Loại enzyme Depside atranorin Ức chế mức độ trung bình enzyme protein tyrosine (H8) phosphatase 1B (PTP1B) (IC50= 63,5 µM). Ức chế yếu enzyme 12(S)-lipoxygenase platelet- Depside acid baeomycesic type (100 µg/mL: 15%) (H4) Ức chế enzyme 5-lipoxygenase từ porcine leukocyte (IC50= 8,3 µM) Tridepside tenuiorin (H7) Ức chế enzyme 5-lipoxygenase (IC50= 59,6 µM). Kháng viêm: ức chế enzyme phospholipase synovial Orcinol (H10) fluid A2 (IC50= 0,22 mM). Kháng viêm: ức chế enzyme phospholipase synovial Methyl β-orsellinate (H11) fluid A2 (IC50= 0,26 mM). Ức chế mức độ trung bình enzyme protein tyrosine Acid usnic (H14) phosphatase 1B (PTP1B) (IC50= 16,4 µM). Ức chế mức độ trung bình enzyme protein tyrosine Usimines A C (H15, H16) phosphatase 1B (PTP1B) (IC50= 16,4 23,0 µM). Acid protolichesterinic Ức chế enzyme 12(S)-lipoxygenase platelet-type (H13) (IC50= 77,0 µM) Ức chế enzyme 5-lipoxygenase (IC50= 20,0 µM) Ức chế enzyme 12(S)-lipoxygenase platelet-type Acid lichesterinic (H9) (IC50= 77,0 µM) Ức chế mức độ yếu đối với enzyme protein tyrosine Stereocalpin A (H17) phosphatase 1B (PTP1B) (IC50= 40,0 µM). cis-9-Octadecenamide Ức chế enzyme cyclogenase (IC = 64,3 µM). (H12) 50 11
19. Bảng 1.4. Hoạt tính ức chế enzyme của một số hợp chất cô lập từ địa y [18] Hợp chất Enzyme Atranorin (H8) Trypsin, Pankreaselastase, Phosphorylase Bis-(2,4-dihydroxy-6-n- Tyrosinase propylphenyl)methane, divarinol, cao chiết thô của địa y Cetraria juniperina, Hypogymnia physodes and Letharia vulpina Chrysophanol Glutathione reductase Acid confluentic, acid 2β-O- Monoaminoxidase B methylperlatolic Acid 4-O-methylcryptochlorophaeic Prostataglandinsynthetase Acid (+)-protolichesterinic 5-Lipoxygenase (ngăn cản sự sao chép ngược virus HIV) Acid vulpinic Phosphorylase Acid norsolorinic Monoamino oxidase Acid physodic Arginine decarboxylase Acid usnic (H14) Ornithine decarboxylase 1.5.5. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y Hợp chất từ địa y có khả năng gây độc tế bào mạnh là acid usnic. Thử nghiệm kháng u (antitumour) của acid usnic được khám phá cách đây 3 thập niên, được thử nghiệm lần đầu đối với hệ thống thử nghiệm ung thư phổi Lewis bởi Kupchan và Kopperman (1975)[20]. Những nghiên cứu về mối liên hệ hoạt tính cấu trúc cũng được 12
20. khảo sát và kết quả đã chỉ ra rằng tính thân dầu (lipophilicity) có ảnh hưởng quan trọng đối với khả năng gây độc tế bào. Hai liên kết hydrogen nội phân tử trong cấu trúc của acid usnic đã làm tăng tính thân dầu tự nhiên của nó. Depside và depsidone cũng thể hiện độc tính tế bào tương đối. Acid depsidone lobaric và acid depside baeomyceic cùng có khả năng ức chế sự phát triển của 14 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 trong khoảng 12-65 µg/mL (Boustie 2010) [6]. Depsidone pannarin và depside sphaerophin cũng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tiền liệt DU-145 và tế bào ung thư da M14 với IC50 trong khoảng 25-30 µg/mL (Bảng 1.4) (Boustie 2010) [6]. Ngoài ra, một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme trình bày trong bảng 1.5. Bảng 1.5. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y Hợp chất Vi khuẩn Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp., Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Staphylococcus Acid usnic và các dẫn xuất aureus, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Mycobacterium aurum Acid protolichesterinic Helicobacter pylori Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, M. Methyl orsellinate, gypseum, Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, ethyl orsellinate, Verticillium achliae, Bacillus subtilis, methyl β-orsellinate, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, methyl haematommate Escherichia coli, Cvàida albicans Alectosarmentin Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatitis 1´-Chloropannarin, pannarin Leishmania spp Emodin, physcion Bacillus brevis Drechslera rostrata, Alternaria alternata Acid pulvinic và dẫn xuất Vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí Acid leprapinic và dẫn xuất Vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) 13
21. Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y Hợp chất Hoạt tính trên loại tế bào (-)-Acid usnic Kháng ung thư phổi Lewis, ung thư bạch cầu P388, ức chế phân bào, có hoạt tính chống lại tế bào sừng hóa HaCat Acid protolichesterinic Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu K-562 và khối u rắn Ehrlich Pannarin, 1-chloropannarin, Gây độc cho quá trình tái tạo các lympho bào sphaerophorin Naphthazarin Có hoạt tính chống lại dòng tế bào sừng hóa Scabrosin ester và dẫn xuất, Gây độc chống lại tế bào murine P815 euplectin mastocytoma và các dòng tế bào khác Hydrocarpone, acid salazinic, acid Có hoạt tính với sự nhân bản của tế bào gan stitic chuột Acid psoromic, chrysophanol, Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu emodin và dẫn xuất 14
22. CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Máy móc, thiết bị, hóa chất Phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC được ghi bằng máy Bruker Avance 500 tại Phòng Phân tích trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM (phổ 1H-NMR được đo ở tần số 500MHz và phổ 13C-NMR được đo ở tần số 125 MHz). Dung môi sử dụng gồm có: ethyl acetate, acid acetic, acetone, chloroform, methanol, n-hexane được cung cấp bởi hãng Chemsol (Việt Nam). Sắc kí cột pha thường sử dụng silica gel kích thước hạt (0.040–0.063 mm, Merck). Sắc kí gel Sephadex sử dụng hạt gel LH-20. 2.2. Thu hái và xử lý mẫu nguyên liệu, ly trích và cô lập các hợp chất Địa y Roccella montagnei, họ Rocellaceae được thu hái ở chùa Cổ Thạch, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận, Việt Nam từ tháng 8-2012. Tên khoa học được xác định bởi tiến sĩ Holger Thüs, Bảo tàng lịch sử tự nhiên, London, Anh. Mẫu ký hiệu số US-B024 và được lưu trong quyển tiêu bản thực vật tại bộ môn Hoá hữu cơ, Khoa Hoá học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. Hình 2.1. Địa y Roccella montagnei Bột khô địa y nghiền nhỏ (2,600.0 g) được ngâm dầm trong acetone và dịch chiết cô quay dưới áp suất thấp. Trong quá trình acetone bay hơi, kết tủa trắng erythrin (204.7 g) xuất hiện dần và được lọc riêng. Phần dung dịch lọc còn lại được tiếp tục cô quay thu được cao acetone thô (395.3 g). Tiến hành chiết lỏng lỏng với dung môi có độ phân cực tăng dần và cô quay dịch chiết thu được cao n-hexane (53.6 g), cao ethyl acetate (200.0 g) và phần còn lại (15.9 g). 15
23. Tiến hành sắc kí cột silica gel pha thường với cao n-hexane, giải ly với hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate: acetone (5:1:0.2) để thu được 9 phân đoạn H1 (10.8 g), H2 (8.0 g), H3 (5.7 g), H4 (4.5 g), H5 (2.4 g), H6 (1.3 g), H7 (0.7 g), H8 (1.5 g), H9 (4.0 g). Sắc kí gel Sephadex với dung môi methanol phân đoạn H5 thu được 7 phân đoạn H5.1 (516.0 mg), H5.2 (503.0 mg), H5.3 (784.0 mg), H5.4 (316.0 mg), H5.5 (178.0 mg), H5.6 (123.0 mg), H5.7 (1012.0 mg). Tiến hành sắc kí cột silica gel pha thường với phân đoạn H5.3, giải ly với hệ dung môi chloroform: ethyl acetate: acetone: nước (1:2:2:0.01) thu được DS (4.2 mg). Bột địa y Roccella montagnei (2,600.0 g) - Ngâm dầm với dung môi actone (10x3.5 L) - Cô quay dịch chiết Cao acetone (396.0 g) Kết tủa T (204.7 g) -Chiết lỏng-lỏng với dung môi có độ phân cực tăng dần - Cô quay dịch chiết Cao n-hexane Cao ethyl acetate Phần còn lại (53.6 g) (200.0 g) (15.91 g) SKC H:EA:Ac (5:1:0.2) H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 (10.8 g) (8.0 g) (5.7 g) (4.5 g) (2.4 g) (1.3 g) (0.7 g) (1.5 g) (4.0 g) Sephadex LH-20 H5.1 H5.2 H5.3 H5.4 H5.5 H5.6 H5.7 (516.0 mg) (503.0 mg) (748.0 mg) (316.0 mg) (178.0 mg) (123.0 mg) (1012.0 mg) SKC C:EA:Ac:H2O (1:2:2:0.01) DS (4.2 mg) Sơ đồ 2.1. Sắc kí cột trên cao n-hexane 16
24. Rửa nhiều lần cao ethyl acetate với dung môi acetone thu được phần dịch hữu cơ và phần tủa (80.0 g). Tiến hành sắc kí cột silica gel pha thường với phần dịch, giải ly với hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate: acetone: acid acetic (5:1:2:0.2) để thu được 13 phân đoạn EA1 (1.7 g), EA2 (4.1 g), EA3 (1.4 g), EA4 (6.6 g), EA5 (9.0 g), EA6 (9.5 g), EA7 (15.3 g), EA8 (9.4 g), EA9 (5.2 g), EA10 (4.2 g), EA11 (3.9 g), EA12 (10.5 g), EA13 (9.0 g). Từ phân đoạn EA1 (1.7 g) thực hiện sắc kí cột silica gel pha thường, giải ly nhiều lần với hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate: acetone (5:1:0.2) thu được hợp chất R1 (5.0 mg). Cao ethyl acetate (200 g) Lọc nhiều lần với dung môi acetone Phần dịch Phần tủa (80.0 g) SKC Hex:EA:Ac:AcOH (5:1:2:0.2) EA1 EA2 EA3 EA4 EA5 EA6 EA7 EA8 EA9 EA10 EA11 EA12 EA13 (1.7 g) (4.1 g) (1.4 g) (6.6 g) (9.0 g) (9.5 g) (15.3 g) (9.4 g) (5.2 g) (4.2 g) (3.9 g) (10.5 g) (9.0 g) SKC Hex:EA:Ac (5:1:0.2) R1 (5.0 mg) Sơ đồ 2.2. Sắc kí cột trên cao ethyl acetate 17
25. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất DS Hợp chất DS thu được từ phân đoạn cao n-hexane của loài địa y Roccella montagnei là chất dầu, màu vàng. Phổ 1H và 13C-NMR (phụ lục 1). Phổ HSQC và HMBC (phụ lục 2). 3.2. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất R1 Hợp chất R1 thu được từ phân đoạn cao ethyl acetate của loài địa y Roccella montagnei. Phổ 1H và 13C-NMR (phụ lục 3). Phổ HSQC và HMBC (phụ lục 4). 18
26. CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. Kết luận Từ mẫu địa y Roccella montagnei thu hái ở chùa Cổ Thạch, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận đã cô lập được hai hợp chất DS và R1. Bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo xác định được cấu trúc của hai hợp chất hữu cơ gồm Acid diorcinolic 4-carboxydiorcinal Hình 4.1. Cấu trúc hai hợp chất đã cô lập 4.2. Đề xuất Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên phân đoạn cao ethyl acetate. Trong thời gian sắp tới, nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát trên các phân đoạn cao còn lại. Đồng thời chúng tôi sẽ tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học ở các loại cao và hợp chất đã cô lập được. 19
27. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Atalay F., Halici M. B., Mavi A., Cakir A., Odabasoglu F., Kazaz C., Aslan A., Kufrevioglu O. I. Antioxidant phenolics from Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm and Usnea longissima Ach. lichen species, Turk J. Chem., 35, 647–661, 2011. 2. Süleyman H., Odabasoglu F., Aslan A., Cakir A., Karagoz Y., Gocer F., Halici M., Bayir Y., Anti-inflammatory and antiulcerogenic effects of the aqueous extract of Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm., Phytomedicine, 10, 552–557, 2003. 3. Barrington E. J. W., Willis A. J., The biology of lichens: Contemporary biology, 2nd edition, Edward Arnold, London, 10, 159–163, 1974. 4. Ahmadjian V., Nilsson S. Swedish Lichens. Yb. Am. Swed. Hist. Fdn., 1963. 5. Devehat F. L.-L., Tomasi S., Elix J. A., Bernard A., Rouaud I., Uriac P., Boustie J. Stictic acid derivatives from the lichen Usnea articulate and their antioxidant activities, J. Nat. Prod., 70, 1218–1220, 2007. 6. Boustie J., Tomashi S., Grube M., Bioactive lichen metabolites: alpine habitats as an untapped source, Phytochemistry Review, 10(3), 287–307, 2011. 7. Yit Heng Choi, Generic potential of lichen-forming fungi in polyketide biosynthesis, A thesis for Doctor of Philosophy, RMIT University, 10-15, 2008. 8. Huneck S., Yoshimura I., Identification of lichen substances, Springer, Berlin, 155−311, 1997. 9. Duong T. H., Huynh B. L. C., Chavasiri W., Chollet-Krugler M., Nguyen V. K., Nguyen T. H. T., Hansen P. E., Pogam P. L., Thüs H., Boustie J., Nguyen K. P. P., New erythritol derivatives from the fertile form of Roccella montagnei, Phytochemistry, 137, 156-164, 2017. 10. Huneck S., Jakupovic J., Follmann G., 9-Methylpannarate from the lichen Roccella capesis. Z Naturforsch, 969-970, 1991b. 11. Culberson C. F., Chemical and botanical guide to lichen products. Univ North Carolina Press, Chapel Hill, 1969. 12. Alberhart D. J., Overton K. H., Huneck S., Studies on lichen sunstance. Part LXII. Aromatic constituents of the lichen Roccella fuciformis DC. A recised structure for lepraric acid. J Chem Soc, 704-707, 1969. 20
28. 13. Marcuccio S. M., Elix J. A., A structual revision of picroroccellin , Tetrahedron Lett., 1445-1448, 1983. 14. O’Donovan D. G., Robert G., Keogh M. F., Structure of the β-orcinol depsidones, connorstictic acid and consalazinic acid, Phytochemistry, 19, 2497−2499, 1980. 15. Sakurai A., Goto Y., Chemical studies on the lichen. I. The structure of isolecanoric acid, a new ortho-depside isolated from Parmelia tinctorum Despr., Bulletin of the Chemical Society of Japan, 60, 1917−1918, 1987. 16. Le Hoang Duy, Chemical study of common lichens in the south of Vienam, A thesis for Doctor of Philosophy, Kobe Pharmaceutical University, 2-8, 2012. 17. Huneck S., “The significance of lichens and their metabolites”, Naturwissenschaften, 86, 559–570, 1999. 18. Muller K., Pharmaceutically relevant metabolites from lichens, Applied Microbiology and Biotechnology, 56, 9−16, 2001. 19. S. Morris Kupchan, Herbert L. Kopperman, “l-Usnic acid: Tumor inhibitor isolated from lichens”, Experientia, 31, 625-625, 1975. 20. Liu S., Wang H., Su M., Hwang GJ., Hong J., Jung JH., New metabolites from the sponge-derived fungus Aspergillus sydowii J05B-7F-4, Natural product research, 2-5, 2017. 21. Choudhary M. I., Meher A., Wahab A., Khan A.; Rasheed S., New antiglycation and enzyme inhibitors from Parmotrema cooperi, Science China Chemistry, 54, 1926- 1931, 2011. 21