Đồ án Đánh giá khả năng kháng nấm của cao chiết từ phân đoạn phân cực rong mơ “Sargassum”

84 trang thiennha21 14/04/2022 3340

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Đánh giá khả năng kháng nấm của cao chiết từ phân đoạn phân cực rong mơ “Sargassum”", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_danh_gia_kha_nang_khang_nam_cua_cao_chiet_tu_phan_doan.pdf

Nội dung text: Đồ án Đánh giá khả năng kháng nấm của cao chiết từ phân đoạn phân cực rong mơ “Sargassum”

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA CAO CHIẾT TỪ PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC RONG MƠ “ SARGASSUM” Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: THỰC PHẨM Giảng viên hướng dẫn : ThS. Trần Thị Ngọc Mai Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Thuý MSSV: 1051110157 Lớp: 10DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan: - Những kết quả nghiên cứu trong đề tài này chưa được bất kì ai công bố trước đây. - Những nội dung thí nghiệm trong đề tài này là do em thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp của cô Trần Thị Ngọc Mai. - Mọi tham khảo dùng trong đề tài đều được trích dẫn rõ ràng, đầy đủ, chĩnh xác về tác giả, tên công trình, thời gian công bố. Nếu xảy ra bất kỳ trường hợp nào liên quan đến bản quyền, em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2014 Nguyễn Thị Thuý i
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Nhà Trường đã cho chúng em có một môi trường học tập thật tốt, sắp xếp những môn học hợp lý phù hợp với năng lực của mình. Cảm ơn cô Trần Thị Ngọc Mai đã rất tận tình hướng dẫn, giúp đỡ để em hoàn thành tốt đồ án này. Cô là người đã truyền thụ cho em nhiều kiến thức và kinh nghiệm bổ ích trong quá trình thực hiện đồ án, và đây cũng là hành trang để chúng em có thể vững vàng bước vào đời theo ngành mình đã chọn sau khi rời trường. Thứ hai, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quí thầy cô Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường Trường Đại Học Công Nghệ Tp. HCM đã giảng dạy, truyền đạt nguồn tri thức quí báu giúp em có thể hoàn thành tốt đồ án của mình. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên cùng khoá và các anh chị sinh viên khóa trước đã đóng góp ý kiến giúp em hoàn thành đồ án. Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn thầy cùng quí thầy cô và gửi lời chúc sức khỏe đến quí thầy cô! ii
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG viii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu đề tài 2 3. Giới hạn đề tài 2 CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 3 1.1 Tổng quan về rong Nâu 3 1.1.1 Phân loại khoa học [1,2,6] 3 1.1.2 Sự phân bố của rong nâu 3 1.1.2 Đặc điểm thực vật [1,2,7] 4 1.1.3 Thành phần hóa học của rong nâu 5 1.1.5 Nguồn lợi – tình hình khai thác và sử dụng rong nâu 9 1.2. Tổng quan về polyphenol trong rong nâu 11 1.2.1 Đặc điểm 11 1.2.2 Cơ chế kháng nấm của polyphenol 12 1.3 Tổng quan về quá trình trích ly 13 1.3.1 Định nghĩa 13 1.3.2 Cơ sở khoa học 13 1.3.3 Phương pháp trích ly 13 1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trích ly 14 1.3.5 Tìm hiểu dung môi trích ly trong đề tài 16 1.4 Tổng quan về phương pháp đánh giá khả năng kháng nấm 17 1.4.1 Giới thiệu về nấm Aspergillus niger 17 1.4.2 Phương pháp đánh giá khả năng kháng nấm 18 CHƯƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Hoá chất và dụng cụ - thiết bị 20 iii
Đồ án tốt nghiệp 2.1.2.1 Hoá chất 20 2.2. Các phương pháp nghiên cứu 20 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 23 2.3.1 Đối với dung môi trích ly là nước 23 2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian trích ly 24 2.3.2 Đối với dung môi trích ly là ethanol 25 2.4 Cách tính toán các chỉ tiêu xác định 28 2.4.1.1 Cách tính tỉ lệ thu hồi 28 2.4.1.2 Cách tính hàm lượng polyphenol 28 2.5 Thí nghiệm khảo sát tính kháng nấm 29 2.5.1 Khảo sát hoạt tính kháng nấm của dịch chiết bằng nước 29 2.5.2. Khảo sát hoạt tính kháng nấm của dịch chiết ethanol 29 2.5.3 Các chỉ tiêu theo dõi 30 2.6 Sơ đồ và thuyết minh quy trình trích ly thu nhận polyphenol 31 2.6.1 Sơ đồ quy trình 31 2.6.2 Thuyết minh quy trình 32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết quả 34 3.1.1 Đối với dung môi là nước 34 3.1.2 Đối với dung môi là EtOH 42 3.4 Kết quả kháng nấm của dịch chiết thu được 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 iv
Đồ án tốt nghiệp v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ❖ EtOH: Ethanol ❖ NL: nguyên liệu ❖ DM: dung môi ❖ P.p: polyphenol ❖ HQ % : hiệu quả kháng nấm vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 2. 1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng nguyên liệu: dung môi đến hiệu quả trích ly. 23 Hình 2. 2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả trích ly 24 Hình 2. 3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của dung nhiệt độ đến hiệu quả trích ly. 25 Hình 2. 4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng nguyên liệu: dung môi đến hiệu quả trích ly 26 Hình 2. 5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả trích ly 27 Hình 2. 6. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ EtOH đến hiệu quả trích ly 28 Hình 2. 7. Sơ đồ quy trình trích ly thu nhận polyphenol 31 vii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG viii
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Trong thảm thực vật đa dạng và vô tận của đại dương, rong nâu là một trong các loài thực vật biển có khả năng tự tái tạo đáng được lưu ý nhất. Rong nâu chứa nhiều các hợp chất thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao. Đó là các chất dinh dưỡng đường (galactose, manose, xylose, ); 17 acid amin; các acid béo không no; các chất khoáng; keo và các vitamin cần thiết cho cơ thể sống; các polyphenol có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ bảo vệ cơ thể loại trừ các gốc tự do nguy hiểm; iốt hữu cơ giúp tuyến giáp hoạt động tối ưu ; alginat là chất giải độc thiên nhiên; polyuronan có hoạt tính kháng u não; laminaran có tác dụng rất tích cực trong việc hỗ trợ điều trị bệnh có liên quan đến mạch máu tim, chất kháng ung thư,chất bảo vệ phóng xạ, kháng đông lạnh, chất kích thích hạt giống nảy mầm, tăng trưởng cây trồng và fucoidan có khả năng kích thích hệ miễn dịch, chống viên nhiễm, ngăn ngừa ung thư. Trong rong nâu, hàm lượng polysaccharide chiếm khoảng từ 40 - 80% khối lượng rong khô, là những chất có giá trị nhất và có ứng dụng hết sức rộng rãi nhờ các đặc điểm cấu trúc và tính chất đặc thù của chúng. Theo các nhà khoa học Nga, polysaccharide tồn tại trong rong nâu được chia làm 2 nhóm chính: nhóm tan trong kiềm là acid alginic, đã được nghiên cứu từ những năm 30 của thế kỷ trước và được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm; nhóm tan trong nước bao gồm fucoidan, laminaran và polyuronan là những chất có nhiều hoạt tính sinh học quí giá mới được nghiên cứu sử dụng trong khoảng vài thập kỷ trở lại đây. Đặc biệt fucoidan được tìm thấy trong vách tế bào rong nâu là chất có nhiều hoạt tính sinh học quí giá: hoạt tính chống đông máu và chống đông tụ (Anticoagulant và Antithrombotic), hoạt tính kháng u, tăng cường miễn dịch, hoạt tính kháng virus, trị bệnh dạ dày, bệnh về da. Ngoài ra fucoidan còn được sử dụng để điều trị các bệnh dị ứng, lão hóa, viêm khớp, suyễn, đái tháo đường, tăng nhãn áp, huyết áp cao, cholesterol cao, bệnh tim, viêm gan C, HIV, bệnh gan, loét dạ dày, đột quỵ, tuyến giáp, thiên đầu thống. Việt Nam có hệ động vật, thực vật vô cùng phong phú, có nhiều gen quý hiếm đặc trưng cho khí hậu nhiệt đới nóng ẩm. Một trong những điều kiện tạo nên sự phong phú và giàu có ấy chính là vùng biển nhiệt đới rộng với bờ dài hơn 3200 1
Đồ án tốt nghiệp km bao bọc hết phía đông và nam đất nước. Một trong những nguồn tài nguyên phong phú và có giá trị mà vùng biển ban tặng cho chúng ta là rong biển. Nhằm đáp ứng nhu cầu của xã hội hiện đại, đồng thời tận dụng được nguồn nguyên liệu dồi dào, các nhà khoa học của nước ta đã và đang tăng cường nghiên cứu, chuyển nguồn rong biển và phế thải từ rong biển thành các sản phẩm có giá trị, bằng cách sản xuất ra các loại thực phẩm khác nhau, tách chiết ra các thành phần khác nhau có hoạt tính sinh học hoặc hỗn hợp các thành phần có hoạt tính sinh học để gia tăng giá trị rong biển Việt Nam. Đi chung với xu hướng đó nhóm thực hiện đề tài tiến hành nghiên cứu : “Đánh giá khả năng kháng nấm của cao chiết từ phân đoạn phân cực rong mơ Sargassum”. 2. Mục tiêu đề tài Đánh giá khả năng kháng nấm của cao chiết từ phân đoạn phân cực rong mơ Sargassum ở các nồng độ khác nhau. 3. Giới hạn đề tài Bước đầu tiếp cận với nghiên cứu khoa học, trong điều kiện kiến thức còn hạn chế, điều kiện cơ sở vật chất, kinh phí nghiên cứu còn thiếu thốn, ngoài việc nỗ lực của bản thân, sự giúp đỡ của giảng viên hướng dẫn cùng với các Thầy phụ trách phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường, nhóm nghiên cứu đã hoàn thành đề tài được giao. Tuy nhiên, đề tài không tránh khỏi những thiếu sót, nhóm thực hiện đề tài rất mong được sự góp ý chân thành của các Thầy/Cô để đề tài được hoàn thiện hơn. 2
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về rong Nâu 1.1.1 Phân loại khoa học [1,2,6] Ngành: Ochrophyta Lớp: Phaeophyceae Bộ: Fucales Họ: Sargassaceae Chi: Sargassum Loài: Sargassum virgatum (rong mơ chổi), Sargassum feldmannii P.Hoang (rong mơ Việt Nam), Sargassum mcclurei setchell (rong mơ McClurei), Sargassum graminifolium (rong mơ cỏ), Sargassum carpophyllum (rong mơ chụm), Sargassum horneri (rong mơ Horner), v.v 1.1.2 Sự phân bố của rong nâu Rong nâu phân bố dọc theo bờ biển nước ta, ở miền Trung và miền Nam rong tập trung chủ yếu ở các tỉnh: Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hoà, Ninh Thuận, Bình Thuận, Vũng Tàu, Kiên Giang và các đảo: Lý Sơn, Phú Quý, Phú Quốc, quần đảo Trường Sa. Ở các tỉnh phía Bắc, rong nâu có ở các tỉnh: Quảng Ninh, Hải Phòng, và một số đảo như Cô Tô, Cát Bà 2 Diện tích rong nâu ở vùng biển Quảng Nam Đà Nẵng khoảng 190.000 m , trữ lượng khoảng 800 tấn rong tươi. Diện tích rong nâu ở tỉnh Bình Định 2 khoảng hơn 40.000 m , trữ lượng rong khoảng hơn 100 tấn/năm. Vùng biển 2 Khánh Hoà là vùng biển có diện tích rong nâu mọc cao nhất khoảng 2.000.000 m , trữ lượng có thể khai thác được hàng năm khoảng 11.000 tấn rong tươi. Sản lượng rong nâu trung bình của các tỉnh duyên hải miền trung là 18,00 tấn rong tươi/vụ . 3
Đồ án tốt nghiệp 1.1.2 Đặc điểm thực vật [1,2,7] Rong dài ngắn tùy loài và tùy thuộc vào điều kiện môi trường, thường gặp rong dài từ vài chục centimet đến vài ba mét hay hơn. Chúng bám vào vật bám nhờ đĩa bám hay hệ thống rễ bò phân nhánh. Đĩa bám thường chắc hơn rễ và sóng biển thường đánh đứt rong hơn là nhổ được đĩa bám. Thân rong gồm một trục chính rất ngắn, đa số thường dài trên dưới 1cm, Hình 1. 1. Hình thái rong nâu hình trụ, sần sùi. Đỉnh của trục chính sẽ phân ra làm 2 đến 5 nhánh chính, hai bên Hình 1. 2 nhánh chính sẽ mọc ra nhiều nhánh bên. Nhánh chính và nhánh bên sẽ tạo ra chiều dài của rong. Chiều dài này khác nhau tuỳ vào các chi, loài và trong cùng một loài kích thước này cũng thay đổi tuỳ vào điều kiện sống, nơi phân bố. Trên các nhánh có các cơ quan dinh dưỡng gần giống như lá và các túi chứa đầy không khí được gọi là phao. Khi rong trưởng thành trên các nhánh bên mọc ra các nhánh phụ, ngắn (thường từ tháng 3 đến tháng 6) có mang nhiều cơ quan sinh sản đực và cái gọi là đế. Nhờ có hệ thống phao rong luôn giữ vị trí thẳng đứng trong môi trường biển. Nếu nước cạn rong khá dài thì phần trên của rong nằm trên mặt nước. 4
Đồ án tốt nghiệp 1.1.3 Thành phần hóa học của rong nâu Bảng 1. 1. Thành phần hoá học chính của rong nâu 1.1.3.1 Sắc tố Sắc tố trong rong nâu là diệp lục tố (Chlorophyl), diệp hoàng tố (Xantophyl), sắc tố màu nâu (Fucoxanthin), sắc tố đỏ (Caroten). Tùy theo tỷ lệ các loại sắc tố mà rong có màu từ nâu – vàng nâu – nâu đậm – vàng lục. Nhìn chung sắc tố của rong nâu khá bền [1]. 1.1.3.2 Gluxit ➢ Monosacaride [1]. Monosacaride quan trọng trong rong nâu là đường mannitol được Stenhouds phát hiện ra năm 1884 và được Kylin (1913) chứng minh thêm. Mannitol có công thức tổng quát: HOCH2 – (CHOH)4 – CH2OH. Mannitol tan được trong alcol, dễ tan trong nước, có vị ngọt. Hàm lượng từ 14% ÷ 25% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào hoàn cảnh địa lý nơi sinh sống. ➢ Polysaccharide • Alginic Công thức cấu tạo của acid alginic là (C6H6O6)n. Là một acid hữu cơ có trong tảo nâu, có trọng lượng phân tử từ 32.000 - 200.000, do D - Mannuroic acid và L - Guluronic acid liên kết với nhau bởi liên kết glucozit. Nó tồn tại dưới dạng sợi, hạt hay bột màu trắng đế vàng nâu, được dùng làm chất tạo đông, chất ổn định, chất tạo gel, chất nhủ hóa, không tan trong nước và dung môi hữu cơ, tan chậm trong dung dịch carbonate natri, hydroxide natri. 5
Đồ án tốt nghiệp Hình 1. 2. Cấu trúc của acid alginic • Axit Fucxinic: có tính chất gần giống với axit alginic. • Fuccoidin: Là loại muối giữa axit fuccoidinic với các kim loại hóa trị khác nhau như: Ca, Cu, Zn. Fuccoidin có tính chất gần giống với alginic, nhưng hàm lượng thấp hơn alginic. Fuccoidin hay fucoidan là một polysaccharide sulfate hóa dị hợp, trong đó fucose chiếm từ 18,6% ÷ 60% [18], sulfate chiếm từ 17,7% ÷ 39,2%, ngoài ra còn có mặt các thành phần đường khác như: galactose, glucose, mannose, xylose, rhamnose, và acid uronic. Hàm lượng fucoidan trong các loại rong nâu khoảng 2 ÷ 9% so với rong khô. Hàm lượng này phụ thuộc vào loài rong và vị trí địa lý môi trường mà rong sinh sống . Fucoidan là môt hợp chất chống oxy hóa được chiết xuất từ thành phần chất nhờn “sliminess” của tảo nâu Mozuku (Cladosiphon okamuranus) và Mekabu (phần cuốn nằm gần gốc của Wakame). Cấu trúc hóa học của fucoidan là một chuỗi dài polysaccharide giàu sulfate fucose. Giáo sư Kylin.H.Z của đại học Uppsala Thụy Điển, vào năm 1913 đã điều chế thành công fucoidan từ tinh chất nhờn của loài rong Konbu và đặt tên là fucoidin. Sau đó, hiệp hội thế giới đồng ý đổi tên fucoidin thành fucoidan. Fucoidan được chiết xuất từ tảo nâu Okinawa Mozuku và Mekabu. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh fucoidan tăng cường hoạt động của các Natual Killer Cell (tạm dịch là tế bào tiêu diệt tự nhiên) cũng như thúc đẩy sự hoạt động của Macrophage (đại thức bào), Helper T - cells và B - cells làm cho các tế bào có hại trong cơ thể giảm đi đáng kể và thậm chí tự tiêu biến đi. Đó là kết quả chứng tỏ 6
Đồ án tốt nghiệp fucoidan đã tăng cường miễn dịch cho cơ thể và để tấn công trực tiếp loại bỏ các tế bào có hại (hiện tượng này được gọi là Apoptosis). Fucoidan là thành phần chứa nhóm các phân tử đường (polysaccharide) chỉ có trong các loại tảo biển, có tác dụng đặc biệt khiến cho tế bào ung thư vốn liên tục tự tăng lên có thể tự tiêu diệt (apoptosis). Fucoidan chính là thành phần “nhớt” đặc biệt có trong các loại tảo biển màu nâu, một loại sợi thuộc nhóm hợp chất đa đường phân tử cao do đường fucoza kết hợp với axit sulfuric tạo thành đường fucoza chứa lưu huỳnh hóa trị cao, cùng với các loại đường như galactoze, mannoza liên kết với nhau. Có 3 loại Fucoidan là F - FUCOIDAN, U - FUCOIDAN, G - FUCOIDAN. Trong 3 loại này, U - FUCOIDAN là loại được quan tâm nhiều nhất. Đó là do các nghiên cứu đã chứng minh trong U - FUCOIDAN có chất làm cho tế bào ung thư trong cơ thể con người tự hủy diệt. U - FUCOIDAN có nhiều trong các loại tảo biển như Konbu, Mozuku, Hijiki, trong đó các phân tử đường đơn như glucuronic acid, mannoza, fucoza đứng cạnh nhau. CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA U - FUCOIDAN Tế bào con nguời sau khi hoàn thành nhiệm vụ của mình thì sẽ tự chết đi (hiện tượng apoptosis), đây là cơ chế mang tính di truyền. Tuy nhiên, riêng đối với tế bào ung thư, khác với tế bào thường, cơ chế này không xảy ra và tế bào ung thư cứ được nhân lên mãi. Tuy nhiên, một loại U - FUCOIDAN bao gồm các sợi đa đường vốn có nhiều trong các loại tảo biển Konbu, Wakame, Mozuku có tác dụng làm các tế bào ung thư tự tiêu biến. Khi U - FUCOIDAN kết hợp với cơ quan thụ cảm, sẽ xuất hiện dấu hiệu khởi động cơ chế tự tiêu biến của tế bào ung thư, khi đó tế bào ung thư sẽ tự cắt DNA đi và mất khả năng sinh tồn. Hiện tượng này đã được xác minh tại Nhật Bản. Phương pháp này là phương pháp tiêu diệt tế bào ung thư từ bên trong, khác với phương pháp dùng tế bào miễn dịch tấn công tế bào ung thư từ bên ngoài. • Laminarin: Laminarin là tinh bột của rong nâu. Laminarin thường ở dạng bột không màu, không mùi và có hai loại: loại hòa tan và loại không hòa tan 7
Đồ án tốt nghiệp trong nước. Laminarin có hàm lượng từ 10% ÷ 15% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào loại rong, vị trí địa lý và môi trường sinh sống của rong nâu. • Cellulose: là thành phần tạo nên vỏ cây rong. Hàm lượng cellulose trong rong nâu nhiều hơn rong đỏ. 1.1.3.3 Protein Protein của rong nâu thường ở dạng kết hợp với iod tạo iod hữu cơ như: monoiodinzodizin, diiodinzodizin. Hàm lượng protein rong nâu vùng biển Nha Trang dao động từ 8,05% ÷ 21,11% so với trọng lượng rong khô. 1.1.3.4 Hỗn hợp Phenolic Theo Ragan và Glombitza, hợp chất rất phổ biến trong rong nâu thuộc nhóm hợp chất polyphenolic là phlorotannin. Phlorotannin là chất chuyển hóa thứ cấp, xuất hiện chủ yếu ở các mô, tại đó nồng độ có thể tới 20% so với khối lượng tịnh của rong biển. Schoenwaelder (2002) chỉ ra một số chức năng của chúng như tăng tính liên kết và độ chắc cho thành tế bào. Phlorotannin hấp thụ bước sóng UV, chủ yếu là UVC và một phần UVB, với cực đại tại 195 nm và 265 nm [9]. Polyphenol là một nhóm các hợp chất mà trong công thức cấu tạo có chứa vòng benzen và ít nhất 2 nhóm - OH trở lên. Lượng polyphenol có trong hầu hết các loại rau, củ, quả , tùy theo loại nguyên liệu mà hàm lượng polyphenol sẽ khác nhau, cùng tồn tại trong nguyên liệu đó là enzym polyphenoloxidase. Khi tiếp xúc với oxi không khí sẽ kích hoạt enzym polyphenoloxidase hoạt động và xúc tác cho phản ứng oxi hóa các hợp chất polyphenol thành những hợp chất mới gây sẫm màu và tạo vị đắng cho rau quả.Ví dụ: Trong khoai tây là pirocatechol và dẫn xuất tạo từ tyrozyl bị oxi hóa thành dopaquinon gây sẫm màu khoai tây. Hợp chất phenol rất dễ bị oxy hóa trong các điều kiện khác nhau: chúng có thể bị oxi hóa bình thường trong môi trường không khí ẩm, phản ứng được tăng cường trong môi trường kiềm. 1.1.3.5 Chất khoáng Hàm lượng các nguyên tố khoáng trong rong nâu thường lớn hơn trong nước biển. Hàm lượng c h ấ t khoáng trong các loài rong nâu ở Nha Trang dao động từ 15,51 ÷ 46,30% phụ thuộc vào mùa vụ, thời kỳ sinh trưởng. 8
Đồ án tốt nghiệp 1.1.5 Nguồn lợi – tình hình khai thác và sử dụng rong nâu 1.1.5.1 Nguồn lợi. Nguồn lợi rong nâu chủ yếu tập trung ở các nước Châu Âu và Bắc Mỹ. Canada tập trung hơn 75% khối lượng rong nguyên liệu sản xuất alginate , trong khi đó khối lượng rong nâu Châu Á chỉ khoảng 5% [1]. Trên thế giới alginate được sản xuất từ rong nâu có sản lượng lớn hơn agar, carrageenan, furcellanan được sản xuất từ rong đỏ. Về sản lượng rong nâu thì khu vực Bắc Mỹ có sản lượng lớn nhất, tiếp đến là Châu Âu, Mỹ La Tinh và Châu Á. Đối với rong đỏ thì sản lượng chủ yếu tập trung lớn tại Châu Á, đến Châu Mỹ La Tinh, rồi đến Châu Âu. Việt Nam có nguồn lợi rong biển rất đa dạng và phong phú. Theo các kết quả nghiên cứu gần đây, ở nước ta có khoảng 794 loài rong biển, phân bố ở vùng biển miền Bắc 310 loài (các nghiên cứu từ Quảng Bình trở ra), miền Nam có 484 loài (các nghiên cứu từ Đà Nẵng trở vào), 156 loài được tìm thấy ở cả 2 miền (Nguyễn Hữu Dinh, 1998). Trong đó có các đối tượng quan trọng là: rong câu (Gracilaria), rong nâu (Sargassum) Sản lượng và nguồn lợi rong biển trên thế giới được thể hiện trên bảng sau: Bang 1.2. Nguồn lợi, sản lượng thu hoạch và tiềm năng sản xuất rong biển [1]. (Đơn vị: 1.000 tấn) Rong đỏ Rong nâu Khu vực Sản lượng Nguồn lợi Sản lượng Nguồn lợi Bắc cực - - - - Tây bắc Đại Tây dương thu35 100 thu6 500 Đông bắc Đại Tây dương hoạc72h 150 hoạc223h 2,00 Trung tâm tây Đại Tây dương - 10 1 01 ,00 Trung tâm đông Đại Tây 10 50 1 0 150 Địa Trungdươ Hảing và biển đen 50 1,000 1 50 Tây nam Đại Tây dương 23 100 75 2,00 Đông nam Đại Tây dương 7 100 13 0 100 9
Đồ án tốt nghiệp Tây Ấn Độ dương 4 120 5 150 Đông Ấn Độ dương 3 100 10 500 Tây bắc Thái Bình dương 545 650 822 1,50 Đông bắc Thái Bình dương - 10 - 01 ,50 Trung tâm tây Thái Bình 20 100 1 0 50 Trung tâdmươ đôngn g Thái Bình 7 50 153 3,50 Tây namdư Tháiơng Bình dương 1 20 1 0 100 Đông nam Thái Bình dương 30 100 1 1,50 Nam cực - - - 0 - Tổng cộng 807 2,660 1,315 14,6 1.1.5.2 Tình hình khai thác và sử dụng rong nâu 00 Tại Nhật Bản, rong nâu đã được sử dụng làm thức ăn từ thế kỷ thứ V, cuối năm 2001 cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm đã xem xét và cấp phép cho các sản phẩm thực phẩm chức năng của Nhật được bổ sung thêm thành phần fucoidan để tăng cường hệ miễn dịch, giảm cholesterol, giảm mỡ máu và trở thành thực phẩm hỗ trợ điều trị bệnh nan y ngay cả ung thư. Các polysaccharide từ rong nâu được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, công nghệ sinh học và y học. Ngoài ra trong công nghiệp chế biến phức hợp rong biển ta cũng có thể thu nhận các thành phần có các giá trị khác nhau như: fucoidan, laminaran và những chất chuyển hoá phân tử thấp như mannitol, các acid amin tự do, polyphenol, các hợp chất chứa iod, các vitamin và acid béo. 10
Đồ án tốt nghiệp Hình 1. 3. Biểu đồ biểu diễn sản lượng khai thác rong nâu toàn cầu (thống kê của FAO) Hình 1. 4. Biểu đồ biểu diễn sản lượng nuôi trồng rong nâu trên toàn cầu (thống kê của FAO) 1.2. Tổng quan về polyphenol trong rong nâu 1.2.1 Đặc điểm Polyphenol là các hợp chất mà phân tử của chúng chứa nhiều vòng benzene, trong đó có một, hai hoặc nhiều hơn hai nhóm hydroxyl. Dựa vào đặc trưng của cấu tạo hoá học người ta chia các hợp chất polyphenol thành ba nhóm: 11
Đồ án tốt nghiệp Nhóm hợp chất phenol C6 – C1: Acid Gallic Nhóm hợp chất phenol C6 – C3: Acid Cafeic Nhóm hợp chất phenol C6 – C3 – C6: Catechin, Flavonoid Hình 1. 5. Hợp chất polyphenol Tính chất: Các polyphenol có chứa gốc pyrocatechic hoặc pyrogalic nên chúng có thể tham gia phản ứng oxy hoá – khử, phản ứng cộng và ngưng tụ. Phản ứng oxy hoá – khử: Dưới tác dụng của enzyme polyphenol oxydase, các polyphenol bị oxy hoá tạo thành các quinon. Phản ứng cộng: Khi có mặt các acid amin thì các quinon này sẽ tiến hành phản ứng cộng với acid amin để tạo thành các octoquinon tương ứng. Phản ứng ngưng tụ: Các octoquinon này dễ dàng ngưng tụ với nhau để tạo thành các sản phẩm có màu gọi chung là flobafen. 1.2.2 Cơ chế kháng nấm của polyphenol Các hợp chất polyphenol phát huy tác dụng bằng cách thay đổi màng tế bào nấm. Tương tác với 14 - alpha demethylase, một enzym cytochrom P - 450 cần để chuyển lanosterol thành ergosterol, ức chế tổng hợp ergosterol. Kết quả là làm tǎng tính thấm tế bào, gây rò rỉ chất chứa trong tế bào. Những tác dụng chống nấm khác của các hợp chất polyphenol đã được đề xuất bao gồm: ức chế hô hấp nội sinh, tương tác với các phospholipid màng, và ức chế sự chuyển dạng nấm men thành dạng sợi. 12
Đồ án tốt nghiệp 1.3 Tổng quan về quá trình trích ly 1.3.1 Định nghĩa Bản chất của quá trình trích ly (quá trình chiết) là sự rút chất hòa tan trong chất lỏng hay chất rắn bằng một chất hòa tan khác (gọi là dung môi) nhờ quá trình khuếch tán giữa các chất có nồng độ khác nhau. Trích ly chất hòa tan trong chất lỏng được gọi là trích ly lỏng, còn trích ly chất hòa tan trong chất rắn là trích ly chất rắn. 1.3.2 Cơ sở khoa học Độ hoà tan vào nhau của hai chất lỏng phụ thuộc vào hằng số điện môi. Hai chất lỏng có hằng số điện môi càng gần nhau thì khả năng tan lẫn vào nhau càng lớn. 1.3.3 Phương pháp trích ly Trích ly (chiết xuất) là một quá trình tách chiết hoàn toàn các chất có trong hỗn hợp. Các chất này có độ hoà tan khác nhau trong một dung môi hoặc trong những hệ dung môi khác nhau. Quá trình trích ly là quá trình phức tạp, có thể xảy ra được là nhờ hiện tượng khuếch tán, hoà tan, thẩm thấu, thẩm tích, của chất tan vào dung môi. Phương pháp trích ly là bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ trích ly và cách trích ly. Một phương pháp trích ly thích hợp chỉ có thể được hoạch định khi biết rõ thành phần của các chất cần trích ly trong nguyên liệu ra. Mỗi loại hợp chất có độ hoà tan khác nhau trong từng loại dung môi. Vì vậy không thể có phương pháp trích ly chung áp dụng cho tất cả nguyên liệu. Phương pháp thực hiện quá trình trích ly: Các công đoạn chủ yếu của quá trình trích ly là: Cho hỗn hợp cần trích ly tiếp xúc với dung môi rồi tách các pha, sau đó tách và thu hồi dung môi và tiến hành phân tách riêng. ➢ Phương pháp ngâm: Nguyên liệu được ngâm với dung môi trong bồn trích ly ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng đảo trộn. Thời gian ngâm tuỳ thuộc vào loại nguyên liệu. ➢ Có thể thực hiện quá trình trích ly gián đoạn hoặc liên tục; trích ly một hoặc nhiều bậc, dung môi có thể chuyển động cùng chiều hoặc ngược chiều. 13
Đồ án tốt nghiệp ➢ Có thể trích ly ở nhiệt độ thường hoặc trích ly nóng. Hai cách trích ly ở nhiệt độ thường là ngấm kiệt và ngâm phân đoạn. Phương pháp ngấm kiệt cho kết quả tốt hơn vì trích ly được nhiều hoạt chất và ít tốn dung môi, nhất là khi áp dụng cách trích ly ngấm kiệt ngược dòng. Khi trích ly nóng, nếu dung môi là các chất bay hơi thì áp dụng cách chiết liên tục hoặc chiết hồi lưu. Nếu dung môi là nước thì sắc hoặc hãm phân đoạn. ➢ Phương pháp ngấm kiệt và phương pháp ngược dòng: được thực hiện trong bồn chiết có van điều chỉnh để dịch chiết chảy xuống theo mong muốn sau khi ngâm nguyên liệu với dung môi trong một thời gian nhất định. Dịch rút ra từ bồn thứ nhất dùng để ngâm nguyên liệu ở bồn thứ hai, tiếp tục thực hiện cho đến bồn chiết sau cùng. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong sản xuất. 1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trích ly Thực chất quá trình trích ly là quá trình khuếch tán. Vì vậy sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha (gradient nồng độ) chính là động lực của quá trình. Khi chênh lệch nồng độ lớn, lượng chất trích ly tăng; thời gian trích ly giảm ta thực hiện bằng cách tăng tỷ lệ của dung môi so với nguyên liệu. Quá trình trích ly polyphenol (phlorotannin) hiện nay được thực hiện bằng nhiều loại dung môi. Nguyên tắc của trích ly bằng dung môi dựa trên sự thẩm thấu dung môi vào tế bào, chất cần trích ly hòa tan vào dung môi và khuếch tán ra ngoài tế bào. Quá trình trích ly bằng dung môi có ưu điểm là thiết bị đơn giản, có thể xử lý một lượng lớn nguyên liệu và có thể sử dụng ở quy trình liên tục. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly bằng dung môi: ➢ Lựa chọn dung môi trích ly: Dung môi trích ly là dung môi hòa tan được hợp chất cần trích ly. Các polyphenol (phlorotannin) là các hợp chất phân cực nên chủ yếu sử dụng các dung môi phân cực như: nước, ethanol, acetone, ethyl acetate ➢ Diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi. Cần tăng diện tích này để làm tăng hiệu quả của quá trình. Với các nguyên liệu rắn cần tăng diện tích tiếp xúc giữa chúng và dung môi. Điều này thực hiện bằng cách nghiền nhỏ, thái nhỏ, băm nhỏ vật liệu. Nó còn làm phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình tiếp xúc triệt để giữa dung môi và vật liệu. Tuy nhiên kích thước và hình dạng của vật 14
Đồ án tốt nghiệp liệu khi làm nhỏ cũng có giới hạn vì nếu chúng quá mịn sẽ bị lắng đọng lên lớp nguyên liệu, làm tắc các ống mao dẫn hoặc bị dòng dung môi cuốn vào mixen (hỗn hợp) làm cho dung dịch có nhiều cặn gây phức tạp cho quá trình xử lý tiếp theo. ➢ Khuấy trộn: Khuấy trộn giúp tăng cường hiệu quả trích ly, do tăng cường quá trình truyền khối. ➢ pH: Polyphenol (phlorotannin) rất bền ở pH acid và kém bền ở pH bazo. Khi thực hiện trích ly ở pH thấp sẽ tránh được hiện tượng oxy hóa polyphenol và tăng hiệu quả quá trình trích ly. Tuy nhiên, cũng có nghiên cứu cho rằng ảnh hưởng của pH không làm ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả trích ly, chỉ cần đảm bảo pH trung tính hoặc thấp hơn. ➢ Tính chất của vật liệu cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất trích ly. Vật liệu là hỗn hợp lỏng - lỏng hoặc hỗn hợp rắn – lỏng cộng với một dung môi hoặc tập hợp một số loại dung môi. Chúng có độ hòa tan khác nhau, nồng độ các chất khác nhau và có tác dụng tương hỗ, khuếch tán vào nhau. Như khi trích ly đầu nếu độ ẩm nguyên liệu giảm, tốc độ trích tăng lên, vì độ ẩm tác dụng với protein và các chất háo nước khác ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu, làm chậm quá trình khuếch tán. ➢ Nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán và giảm độ nhớt, phần tử chất hòa tan chuyển động dễ dàng khi khuếch tán giữa các phần tử dung môi. Tuy nhiên nhiệt độ là một yếu tố có giới hạn. Vì khi nhiệt độ quá cao có thể xảy ra các phản ứng khác không cần thiết (làm oxi hóa polyphenol cần trích ly), gây khó khăn cho quá trình công nghệ. Do đó trong toàn bộ quá trình nhiệt độ không nên vượt quá 800C. ➢ Sử dụng chất kháng oxy hóa hỗ trợ: Việc sử dụng các chất kháng oxy hóa bổ sung như acid ascorbic, acid citric, được xác nhận làm tăng hiệu quả trích ly cũng như làm giảm sự oxy hóa polyphenol. ➢ Yếu tố thời gian cũng ảnh hưởng đến quá trình trích ly. Khi thời gian tăng lên, lượng chất khuếch tán tăng, nhưng thời gian phải có giới hạn. Vì khi đã đạt được mức độ trích ly cao nhất, nếu kéo dài thời gian sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế. 15
Đồ án tốt nghiệp 1.3.5 Tìm hiểu dung môi trích ly trong đề tài 1.3.5.1 Nước Phân tử nước được cấu tạo từ một phân tử oxy và hai phân tử hydro, mà hai electron trong môi trường liên kết này bị kéo lệch về phía oxy nên phân tử nước có tính phân cực, do đó nước dễ liên kết với các nguyên tử, phân tử và các chất khác. Mặt khác, các phân tử nước liên kết với nhau bằng các liên kết hydro (liên kết kém bền) nên các phân tử, nguyên tử hoặc các chất khác dễ bẻ gãy liên kết đó để tạo nên chất mới. 1.3.5.2 Ethanol Ethanol là một ancol mạch thẳng, công thức hóa học của nó là C2H6O hay C2H5OH. Một công thức thay thế khác là CH3 - CH2 - OH thể hiện carbon ở nhóm metyl (CH3 – ) liên kết với carbon ở nhóm metylen ( – CH2 – ), nhóm này lại liên kết với oxy của nhóm hydroxyl ( – OH). Nó là đồng phân hoá học của dimetyl ete. Ethanol thường được viết tắt là EtOH, sử dụng cách ký hiệu hoá học thường dùng đại diện cho nhóm etyl (C2H5) là Et. Các tính chất của ethanol chủ yếu do sự hoạt động của nhóm hydroxyl (OH) và do mạch cacbon ngắn. Vì có nhóm OH nên có thể tham gia vào các liên kết với phân tử hydro, làm cho nó có độ nhớt và ít bay hơi so với các hợp chất hữu cơ cùng trọng lượng phân tử. Nhóm phân cực của hydroxyl làm ethanol có thể hòa tan các hợp chất ion đặc biệt như natri và kali hydroxit, magiesium chloride, clorua calci .Vì các phân tử ethanol có cấu trúc không phân cực nên sẽ hòa tan các chất không phân cực, bao gồm các loại tinh dầu, nhiều hương liệu, màu sắc. 16
Đồ án tốt nghiệp 1.4 Tổng quan về phương pháp đánh giá khả năng kháng nấm 1.4.1 Giới thiệu về nấm Aspergillus niger Hình 1. 6. Chủng nấm Aspergillus niger Nấm Aspergillus niger thuộc nhóm Aspergillus flavus, là nấm đa bào, có hình thức sinh sản vô tính. Sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu 6 - 80C, tối đa 45 - 470C, tối ưu 25 - 280C, độ ẩm tối thiểu 23%. Chúng sinh trưởng và phát triển khi có mặt O2, pH tối ưu 4 - 6,5. Tuy nhiên, theo Patt (1981) cũng có những chủng Aspergillus niger sinh trưởng được ở pH = 2. Aspergillus niger có khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử đính không nằm trong bọc bào tử, cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở 2 đầu tạo bọng hình cầu 5 - 6 x 20 – 30 mm, đôi khi 6 - 10 x 60 – 70 mm. Thể bình gồm 2 lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ 2 hình chai; bào tử đính xòe ra, hình cầu xù xì, có gai nhọn, màu nâu đen đến đen than, đường kính 4 - 5 mm. - Khả năng lên men đường: Aspergillus niger có khả năng đồng hóa tốt các loại đường đơn và đường đôi như: glucose, fructose, maltose, xylose, manose, saccharose. Aspergillus niger đồng hóa được galactose, sorbose và lactose ở mức độ kém hơn. - Khả năng tổng hợp enzyme: + a-amylase: Aspergillus niger có khả năng tổng hợp a-amylase ngoại bào để thủy phân nhanh tinh bột tạo dextrin và một ít maltose và glucose. 17
Đồ án tốt nghiệp + Protease: Aspergillus niger có khả năng tạo 2 loại protease. Protease thứ nhất phân giải protein thành polypeptid, pepton; protease thứ hai tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm trên thành acid amin. + Cellulase: Aspergillus niger có khả năng tạo cellulase, chủ yếu là cellulase Cl, cellulase Cx và b-glucosidase hay cellobiase. + Pectinase, Xylanase: Aspergillus niger có khả năng tạo pectinase, xylanase ở nhiệt độ tối thích 25 độ C, pH = 5,6. Ngoài ra, Aspergillus niger còn có khả năng tổng hợp hàng loạt enzym khác như: lipase, mananase. 1.4.2 Phương pháp đánh giá khả năng kháng nấm Sử dụng phương pháp đục lỗ thạch: 18
Đồ án tốt nghiệp 19
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là loài rong nâu khô (Sargassum), mọc tự nhiên ở vùng biển Ninh Thuận. 2.1.2 Hoá chất và dụng cụ - thiết bị 2.1.2.1 Hoá chất Các loại hoá chất sử dụng cho toàn bộ quá trình thực hiện các thí nghiệm đều là hoá chất tinh khiết đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích: ethanol 96%, folin, acid gallic, agar Môi trường PDA: MT Potato - Dextrose - Agar (nuôi nấm mốc) Khoai tây: 400 g Agar : 40 g D - Glucose: 40g Nước : 2000 ml (pH = 7) 2.1.2.2 Dụng cụ - thiết bị Sử dụng các dụng cụ có của phòng thí nghiệm phân tích: cốc thuỷ tinh, erlen, đũa thuỷ tinh, bình định mức, giấy lọc, phễu, nhiệt kế, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, que đục lỗ thạch đường kình 8 mm Các thiết bị sử dụng là: máy li tâm, máy cô quay, tủ sấy, máy so màu, bếp điện, bình hút ẩm, tủ lạnh, máy xay 2.2. Các phương pháp nghiên cứu ❖ Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy a) Nguyên lý: Dùng nhiệt độ cao để làm bay hơi hết nước trong mẫu thử, sau đó dựa vào hiệu số khối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy khô, từ đó tính được hàm lượng nước trong thực phẩm (%). b) Dụng cụ và hóa chất: Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ. Cân phân tích, độ chính xác 10-4 g. Cốc sấy bằng thủy tinh. Đũa thủy tinh. 20
Đồ án tốt nghiệp Bình hút ẩm. c) Tiến hành: Sấy cốc đến khối lượng không đổi: Cốc được rửa sạch, úp khô, sấy ở nhiệt độ 100 ÷ 105 0C trong khoảng 1 giờ, sau đó lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm rồi mang đi cân và sấy tiếp ở nhiệt độ trên, làm nguội trong bình hút ẩm và cân đến khi nào giữa hai lần liên tiếp sai khác khối lượng không quá 5.10-4 g là được (sấy đến khối lượng không đổi). Cân chính xác một lượng rong đã cắt nhỏ (khoảng 10 g) vào cốc đã sấy khô đến khối lượng không đổi. Dùng đũa thủy tinh đánh tơi mẫu rồi dàn đều mẫu trên đáy cốc. Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở 60 ÷ 800C trong 2 giờ. Sau đó nâng nhiệt độ lên 100 ÷ 1050C, sấy liên tục trong 3 giờ. Chú ý, trong quá trình sấy cứ sau một giờ đảo mẫu một lần. Lấy mẫu ra để nguội trong bình hút ẩm, sau đó mang cân trên cân phân tích rồi sấy tiếp ở nhiệt độ 100 ÷ 1050C đến khối lượng không đổi như trên d) Tính kết quả: Độ ẩm của rong được tính theo công thức: X = 푮 − 푮 ∗ (%) 푮 − 푮 Trong đó: X : Độ ẩm (hàm lượng nước) của rong (%). G1: Khối lượng cốc sấy và mẫu thử trước khi sấy (g). G2: Khối lượng cốc sấy và mẫu thử sau sấy (g). G : Khối lượng cốc sấy (g). ❖ Xác định hàm lượng P.p trong dịch chiết Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn acid gallic Ốn 1 2 3 4 5 6 Nồng gđộ 0 0,2 0, 0, 0, 0, (µg/ml) 3 4 5 6 V 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 acid gallic 0 (ml) 2 3 4 5 6 V 2,9 2,9 2,9 dung môi 3 2,98 2,97 (ml) 6 5 4 V natri citrate 2 (ml) Để yên trong 2 phút 21
Đồ án tốt nghiệp V Folin 1 (ml) Ủ trong bóng tối trong 15 phút ở 500C, đo λ=750nm. Đường chuẩn acid gallic (Phương pháp Foiln-Ciocalteu) 0.7 0.6 y = 0.9256x + 0.0386 R² = 0.9976 0.5 0.4 OD 0.3 0.2 0.1 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Nồng độ acid gallic (µg/ml) Hàm lượng polyphenol trong dịch trích ly được xác định bằng phương pháp so màu, dùng phép thử Folin-Ciocalteu ở bước sóng 750 nm. a.) Nguyên lý: Oxy hoá toàn bộ lượng polyphenol trong dịch trích ly bằng dung dịch Folin - Ciocalteu (hỗn hợp acid phosphotungstic và acid phosphomolyblic). Các acid này sẽ bị khử thành Vonfram (W8O23) và oxit molipden (Mo8O23) có màu xanh. Màu xanh được hấp thụ nhiều nhất ở bước sóng 750 nm. b.) Dụng cụ, hoá chất: - Máy quang phổ UV - Vis - Pipet - Các ống thí nghiệm - Na2CO3 10% - Thuốc thử Folin - Ciocalteu 10% c.) Tiến hành: - Cho 1 ml mẫu vào 2ml Na2CO3 10%, để yên 2 phút. - Thêm 1 ml thuốc thử Folin - Ciocalteu 10%, ủ khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. - Sau khoảng thời gian trên quan sát thấy có màu xanh đen xuất hiện và tiến hành so màu bằng máy quang phổ UV - Vis ở bước sóng λ = 750 nm. - Ghi độ hấp phụ và tính toán xác định hàm lượng polyphenol. 22
Đồ án tốt nghiệp - Chú ý: Trước khi tiến hành thí nghiệm phải pha loãng mẫu nếu cần thiết ❖ Xác định màu bằng máy đo quang phổ hấp thu ❖ Phương pháp kháng nấm trực tiếp ❖ Phương pháp trích ly ❖ Phương pháp xử lý số liệu: sử dụng phần mềm Statgraphics 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.3.1 Đối với dung môi trích ly là nước 2.3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu: dung môi Việc lựa chọn tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (rong khô : nước cất) có ảnh hưởng lớn đến quá trình trích ly. Nếu lựa chọn dung môi quá ít, quá trình trích ly sẽ không triệt để, lượng chất hòa tan bên trong nguyên liệu còn nhiều (do chênh lệch nồng độ chất tan nhỏ). • Chuẩn bị 4 mẫu theo tỷ lệ khối lượng nguyên liệu: dung môi như sau: 1:20;1:30; 1:40; 1:50 trong các bình tam giác có đựng sẵn 120 ml dung môi. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. • Sơ đồ thí nghiệm: Hình 2. 1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng nguyên liệu: dung môi đến hiệu quả trích ly. • Cố định các thông số sau: - Dung môi: nước - Thời gian trích ly: 24 h 23
Đồ án tốt nghiệp - Nhiệt độ trích ly: 350C • Chỉ tiêu xác định: - Tỉ lệ thu hồi - Hàm lượng polyphenol. 2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian trích ly Thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định thời gian chiết tối ưu để thu được hàm lượng polyphenol cao nhất. Thời gian chiết phải hợp lý, nếu kéo dài thời gian chiết lượng chất hòa tan dung môi đã hết, đồng thời sẽ ảnh hưởng đến thời gian thực hiện và chi phí cho toàn bộ quá trình. • Chuẩn bị 3 mẫu thí nghiệm trong các bình tam giác dung tích 120 ml theo các thời gian như sau: 24 h; 48 h; 72 h, sau đó tiến hành lặp lại thí nghiệm 3 lần. • Cố định các thông số: - Dung môi: nước - Tỷ lệ NL: DM là: 1:20 - Nhiệt độ trích ly: 350C • Sơ đồ thí nghiệm Hình 2. 2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả trích ly • Chỉ tiêu xác định: - Tỉ lệ thu hồi - Hàm lượng polyphenol 24
Đồ án tốt nghiệp 2.3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát nhiệt độ trích ly Nhiệt độ có ảnh hưởng đến khả năng hoà tan các chất có trong rong nguyên liệu vào môi trường trích ly. Khi nhiệt độ tăng, các phân tử khuếch tán càng mạnh, độ nhớt giảm, lượng chất tan vào môi trường trích ly càng nhiều. Tuy nhiên, nếu nhiệt độ quá cao có thể làm biến tính một số hợp chất có hoạt tính sinh học hoặc hao hụt một lượng chất tan dễ bay hơi khác. • Chuẩn bị 4 mẫu thí nghiệm trong các bình tam giác dung tích 120 ml theo các thí nghiệm có các nhiệt độ như sau: 300C; 400C; 500C; 600C. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. • Cố định các thông số sau: - Dung môi: nước - Thời gian trích ly: 24 h - Tỷ lệ NL: DM là: 1:20 • Sơ đồ thí nghiệm: Hình 2. 3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của dung nhiệt độ đến hiệu quả trích ly. • Chỉ tiêu xác định: - Tỉ lệ thu hồi - Hàm lượng polyphenol 2.3.2 Đối với dung môi trích ly là ethanol 2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu: dung môi 25
Đồ án tốt nghiệp Sau khi chiết trong dung môi nước, ta thu lại bã rong, sấy khô đến khối lượng không đổi để tính hiệu suất thu hồi. Sau đó lấy rong đã sấy khô đó mang đi chiết lại bằng ethanol • Chuẩn bị 4 mẫu theo tỷ lệ khối lượng nguyên liệu: dung môi (rong khô: ethanol) như sau: 1:20;1:30; 1:40; 1:50 ( là các mẫu đã chiết bằng nước ở thí nghiệm 1 được thu lại bã sau đó mang đi sấy khô đến khối lượng không đổi ) trong các bình tam giác có đựng sẵn 120 ml dung môi. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. • Sơ đồ thí nghiệm: Hình 2. 4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng nguyên liệu: dung môi đến hiệu quả trích ly • Cố định các thông số sau: - Dung môi: ethanol 600 - Thời gian trích ly: 24 h - Nhiệt độ trích ly: 350C • Chỉ tiêu xác định: - Tỉ lệ thu hồi - Hàm lượng polyphenol. 26
Đồ án tốt nghiệp 2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian tới hiệu quả trích ly • Chuẩn bị 3 mẫu thí nghiệm ( là các mẫu đã chiết bằng nước ở thí nghiệm 2 được thu lại bã sau đó mang đi sấy khô đến khối lượng không đổi ) trong các bình tam giác dung tích 120 ml theo các thời gian như sau: 24h; 48h; 72h, sau đó tiến hành lặp lại thí nghiệm 3 lần. • Cố định các thông số: - Dung môi: ethanol 600 - Tỷ lệ NL: DM là: 1:20 - Nhiệt độ trích ly: 350C • Sơ đồ thí nghiệm: Hình 2. 5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả trích ly • Chỉ tiêu xác định: - Tỉ lệ thu hồi - Hàm lượng polyphenol 2.3.2.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ tới hiệu quả trích ly • Chuẩn bị 4 mẫu ( là các mẫu đã chiết bằng nước ở thí nghiệm 3 được thu lại bã sau đó mang đi sấy khô đến khối lượng không đổi ) có nồng độ EtOH lần lượt là: 60%; 70%; 80%; 90% trong các bình tam giác có dung tích 120 ml. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. • Cố định các thông số sau: - Tỷ lệ NL: DM là: 1:20 27
Đồ án tốt nghiệp - Thời gian trích ly: 24 h - Nhiệt độ trích ly: 350C • Sơ đồ thí nghiệm: Hình 2. 6. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ EtOH đến hiệu quả trích ly • Chỉ tiêu xác định: - Tỉ lệ thu hồi - Hàm lượng polyphenol 2.4 Cách tính toán các chỉ tiêu xác định. 2.4.1.1 Cách tính tỉ lệ thu hồi Tỉ lệ thu hồi =[ (mban đầu – msau trích ly) : mban đầu]* 100% mban đầu: khối lượng rong khô ban đầu, g msau trích ly: khối lượng rong khô còn lại sau khi trích ly, g Khối lượng rong khô trước và sau trích ly đều được đưa về cùng một độ ẩm (sấy đến khối lượng không đổi). 2.4.1.2 Cách tính hàm lượng polyphenol Xây dựng đường chuẩn acid gallic, xác định phương trình đường chuẩn bằng phần mềm exel (phương trình dạng y = ax + b) sau đó tiến hành đo mật độ quang (OD) của dịch chiết ở bước sóng 750 nm. OD đo được chính là y, thay y vào phương trình đường chuẩn để tìm x (x là hàm lượng polyphenol) rồi lấy x nhân với hệ số pha loãng để xác định hàm lượng polyphenol trong một đơn vị thể tích của mẫu. 28
Đồ án tốt nghiệp 2.5 Thí nghiệm khảo sát tính kháng nấm. 2.5.1 Khảo sát hoạt tính kháng nấm của dịch chiết bằng nước Thí nghiệm được bố trí gồm 5 nghiệm thức: - Nghiệm thức 1 (đối chứng): dung dịch nước - Nghiệm thức 2: dịch chiết bằng nước ở tỉ lệ 1/20 (3,505µg/ml) - Nghiệm thức 3: dịch chiết bằng nước ở tỉ lệ 1/30 (4,693 µg/ml) - Nghiệm thức 4: dịch chiết bằng nước ở tỉ lệ 1/40 (5,125 µg/ml) - Nghiệm thức 5: dịch chiết bằng nước ở tỉ lệ 1/50 (6,551 µg/ml) Dịch chiết được lấy ở tỉ lệ 1/20 (3,505µg/ml); 1/30 (4,693 µg/ml); 1/40 (5,125 µg/ml); 1/50 (6,551 µg/ml), chiết trong 24h, nhiệt độ chiết 350C. Thí nghiệm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình của 3 lần. Nấm được nuôi trên các đĩa petri chứa môi trửờng PDA (đĩa giống). Cấy tơ nấm ở giữa đĩa thạch, để ở nhiệt độ phòng (370C) cho tơ nấm lan tỏa trên bề mặt thạch. Dịch chiết bằng nước vô trùng bằng cách lọc qua phin lọc với đường kính lỗ lọc 0,45 µm. Dung dịch nước dùng làm nghiệm thức đối chứng cũng được lọc qua phin lọc để vô trùng. Môi trường PDA sau khi hấp khử trùng ở 121oC, 1atm trong 15 phút được rót vào đĩa petri với thể tích khoảng 15 - 20 ml/đĩa. Khi nhiệt độ môi trường trong đĩa petri hạ xuống khoảng hơn 40oC (lưu ý không để môi trường đặc lại) thì bổ sung vào mỗi đĩa 0,2 ml dịch đã được lọc vô trùng. Đối với nghiệm thức đối chứng thì thay thế dịch chiết bằng 0,2 ml dung dịch nước. Đục lỗ giữa các tơ nấm trên môi trường PDA đĩa giống gốc với đường kính lỗ đục 8 mm, đặt miếng thạch có tơ nấm giống trên vào đĩa thạch PDA được bổ sung dịch chiết nước đã được đục lỗ có đường kính 8 mm. Các đĩa thạch được ủ ở nhiệt độ phòng (370C) trong 3 ngày. 2.5.2. Khảo sát hoạt tính kháng nấm của dịch chiết ethanol Thí nghiệm được bố trí gồm 8 nghiệm thức: - Nghiệm thức 1 (đối chứng): dung dịch ethanol 60% - Nghiệm thức 2: dịch chiết bằng ethanol 60 % (0,393 µg/ml) - Nghiệm thức 3 (đối chứng): dung dịch ethanol 70% 29
Đồ án tốt nghiệp - Nghiệm thức 4: dịch chiết bằng ethanol 70 % (0,297 µg/ml) - Nghiệm thức 5 (đối chứng): dung dịch ethanol 80% - Nghiệm thức 6: dịch chiết bằng ethanol 80 % (0,231 µg/ml) - Nghiệm thức 7 (đối chứng): dung dịch ethanol 90% - Nghiệm thức 8: dịch chiết bằng ethanol 90 % (0,188 µg/ml) Thí nghiệm lặp lại 3 lần với từng nghiệm thức và lấy kết quả trung bình của 3 lần lặp lại. Nấm được nuôi trên các đĩa petri chứa môi trửờng PDA (đĩa giống). Cấy tơ nấm ở giữa đĩa thạch, để ở nhiệt độ phòng (370C) cho tơ nấm lan tỏa trên bề mặt thạch. Dịch chiết bằng nước vô trùng bằng cách lọc qua phin lọc với đường kính lỗ lọc 0,45 µm. Dung dịch ethnol dùng làm nghiệm thức đối chứng cũng được lọc qua phin lọc để vô trùng. Môi trường PDA sau khi hấp khử trùng ở 121oC, 1atm trong 15 phút được rót vào đĩa petri với thể tích khoảng 15 - 20 ml/đĩa. Khi nhiệt độ môi trường trong đĩa petri hạ xuống khoảng hơn 40oC (lưu ý không để môi trường đặc lại) thì bổ sung vào mỗi đĩa 0,2 ml dịch đã được lọc vô trùng. Đối với nghiệm thức đối chứng thì thay thế dịch chiết bằng 0,2 ml dung dịch ethanol. Đục lỗ giữa các tơ nấm trên môi trường PDA đĩa giống gốc với đường kính lỗ đục 8 mm, đặt miếng thạch có tơ nấm giống trên vào đĩa thạch PDA được bổ sung dịch chiết nước đã được đục lỗ có đường kính 8 mm. Các đĩa thạch được ủ ở nhiệt độ phòng (370C) trong 3 ngày. 2.5.3 Các chỉ tiêu theo dõi Đo đường kính tản nấm dạng tỏa tròn (mm) sau 3 ngày cấy. Đường kính tản nấm trên đĩa môi trường có bổ sung dịch chiết càng nhỏ so với trên đĩa đối chứng cho biết dịch chiết có tính kháng nấm càng cao. Công thức tính đường kính trung bình của tản nấm: Dtb =(d1+d2)/2 Trong đó: Dtb: đường kính trung bình của tản nấm, mm d1 : đường chéo thứ nhất của tản nấm, mm d2 : đường chéo thứ hai của tản nấm, mm Hiệu quả kháng nấm của dịch chiết: 30
Đồ án tốt nghiệp Công thức tính hiệu quả kháng nấm: HQ % = (D1 – D2)/ D1*100 Trong đó: D1: đường kính tản nấm trên môi trường không chứa dịch chiết, mm D2: đường kính tản nấm trên môi trường chứa dịch chiết, mm Thang đánh giá hiệu quả kháng nấm: - HQ ≤10%, dịch chiết không hạn chế được nấm (ký hiệu [-]). - 10% < HQ < 60%, dịch chiết hạn chế nấm ở mức trung bình (ký hiệu [+]). - HQ ≥ 60% , dịch chiết hạn chế nấm tốt (ký hiệu [++]). 2.6 Sơ đồ và thuyết minh quy trình trích ly thu nhận polyphenol 2.6.1 Sơ đồ quy trình Rong Rửa sạch Xay nhỏ Trích ly Lọc Bã Cô quay Dịch chiết Hình 2. 7. Sơ đồ quy trình trích ly thu nhận polyphenol 31
Đồ án tốt nghiệp 2.6.2 Thuyết minh quy trình ➢ Nguyên liệu: Thu mua rong khô đã được xử lý và có nguồn gốc rõ ràng. Mục đích của việc lựa chọn rong khô: hàm lượng ẩm trong rong nhỏ, góp phần quan trọng trong việc ức chế sự phát triển của vi sinh vật sống trên rong, ức chế quá trình sinh tổng hợp và chuyển hóa trong rong. ➢ Rửa sạch. Rong sẽ được rửa sạch nhằm loại bỏ tạp chất và muối bám dính trên rong, tạo điều kiện cho quá trình chiết và lọc được thực hiện dễ dàng. ➢ Xay nhỏ. Sau khi phơi khô rong ta đi xay nhỏ chúng nhằm mục đích tăng diện tích tiếp xúc của rong nguyên liệu và dung môi, đồng thời làm phá vỡ cấu trúc tế bào rong, tạo điều kiện thuận lợi cho các chất hòa tan trong dung môi. Tuy nhiên, ta không nên xay hoặc nghiền rong quá nhỏ, bởi kích thước bột rong quá nhỏ, bịt kín lỗ của giấy lọc làm cản trở quá trình lọc. ➢ Trích ly Phlorotannin: Phlorotannin là hợp chất hữu cơ có khả năng tan trong một số loại dung môi phân cực. Nước là dung môi phân cực nên được sử dụng để trích ly các chất phân cực có trong rong, cụ thể là phlorotannin. Các yếu tố như nhiệt độ, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi, thời gian chiết đều có ảnh hưởng đến khả năng hòa tan ủc a phlorotannin trong quá trình chiết. Vì vậy tại công đoạn chiết này ta sẽ tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng chiết phlorotannin. ➢ Ly tâm: Sau quá trình trích ly tiến hành ly tâm dịch rong nhằm loại bỏ các tạp chất hoặc bã rong. Bản chất của quá trình ly tâm là tách dễ dàng các phần tử khác nhau về kích thước và trọng lượng (khối lượng riêng) trong dịch chiết, dưới tác dụng của lực ly tâm và trọng lực của Trái đất (lực ly tâm lớn hơn trọng lực rất nhiều). ➢ Lọc: Sau khi ly tâm, tiến hành lọc nhằm thu hồi những chất hòa tan được trong dung môi. Đồng thời loại bỏ được những tạp chất không tan khác (cặn, bã rong). ➢ Cô quay: Sau khi lọc, dịch rong được đem đi cô quay chân không nhằm mục đích loại bỏ bớt dung môi trong dịch lọc nhờ quá trình bay hơi dung môi bởi nhiệt và áp suất, tạo điều kiện thuận lợi cho công đoạn sau. Quá trình cô quay phụ 32
Đồ án tốt nghiệp thuộc vào loại dung môi, nhiệt độ, thời gian, áp suất của thiết bị, Trong quá trình cô quay, dung môi trong dịch rong bay hơi nên màu sẫm lại, thể tích dịch giảm dần. Nếu cô quay ở nhiệt độ và thời gian không thích hợp sẽ gây hao hụt hoặc làm biến tính chất tan cần chiết. Vì vậy không nên cô đặc ở nhiệt độ quá cao và thời gian dài. Sau khi cô đặc, dịch chiết được đem đi khảo sát tính kháng nấm. 33
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả 3.1.1 Đối với dung môi là nước 3.1.1.1 Kết quả xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (khối lượng: thể tích) đến khả năng trích ly. Hiệu suất m m m m Hiệu suất Tỉ lệ ban đầu bã ở giấy lọc bã ở cốc còn lại trung bình (g) (g) (g) (g) (%) (%) 1:20 0,42 5,281 5,701 4,983333 1:20 6 0,202 5,491 5,693 5,116667 5,105556 1:20 0,5 5,187 5,687 5,216667 1:30 0,079 3,682 3,761 5,975 1:30 4 0,488 3,263 3,751 6,225 6,15 1:30 0,2 3,55 3,75 6,25 1:40 0,022 2,76 2,782 7,266667 1:40 3 0,085 2,7 2,785 7,166667 7,277778 1:40 0,038 2,74 2,778 7,4 1:50 0,055 2,14 2,195 8,541667 1:50 2,4 0,145 2,046 2,191 8,708333 8,527778 1:50 0,17 2,03 2,2 8,333333 Độ pha Hàm lượng Thời Hàm lượng loãng OD C (µg/ml) trung bình gian (h) polyphenol (µg/ml) ( lần) (µg/ml) 24 0,375 0,36344 3,634399309 24 10 0,372 0,360199 3,6019879 3,6019879 24 0,369 0,356958 3,569576491 48 0,392 0,381806 3,818063959 48 10 0,398 0,388289 3,882886776 3,850475367 48 0,395 0,385048 3,850475367 72 0,408 0,399092 3,990924806 72 10 0,415 0,406655 4,066551426 4,001728608 72 0,404 0,394771 3,947709594 Sau khi tiến hành thí nghiệm như đã mô tả ở mục 2.3.1.1 ta được kết quả như sau: 34
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3. 1. Kết quả xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (khối lượng: thể tích) đến khả năng trích ly Tỉ lệ 1:20 1:30 1:40 1:50 5,105556 7,277778 8,527778 Tỉ lệ thu hồi (%) 6,15 ± 0,152 ± 0,017 ± 0,117 ± 0,188 Hàm lượng polyphenol 3,505± 0,02 4,693 ± 0,05 5,125 ± 0,02 6,551 ± 0,039 (µg/ml) Dịch chiết thu được ở các tỉ lệ có sự sai khác có ý nghĩa với độ chính xác 95%, LSD = +/- 0,005 9 8 7 6 5 4 Tỉ hồiTỉ thu lệ 3 2 1 0 1:20 1:30 1:40 1:50 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ NL: DM đến tỉ lệ thu hồi polyphenol trong mẫu 7 6 5 4 3 2 àm lượng polyphenollượng àm H 1 0 1:20 1:30 1:40 1:50 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ NL: DM đến hàm lượng polyphenol trong mẫu 35
Đồ án tốt nghiệp Nhận xét: Từ kết quả nghiên cứu bảng 3.1 và đồ thị (hình 3.1, 3.2) cho thấy: Khi tăng lượng dung môi sử dụng thì tỉ lệ thu hồi polyphenol và hàm lượng polyphenol tăng khi tăng tỷ lệ từ 1:20 lên 1:30; 1:30 lên 1:40; 1:40 lên 1:50. Có thể giải thích điều này như sau: • Trong quá trình trích ly bằng dung môi thì nhận thấy rằng lượng dung môi càng lớn thì hiệu quả trích ly càng tăng do chúng luôn tạo ra được một sự chênh lệch nồng độ cần thiết bên trong và bên ngoài mọi trường tức là luôn có động lực cho quá trình. • Khi tỷ lệ nguyên liệu: dung môi giảm tức lượng dung môi sử dụng tăng, polyphenol có trong rong Sargassum sẽ có điều kiện hoà tan tốt vào dung môi bởi lượng dung môi lớn sẽ làm tăng khả năng tiếp xúc của dung môi và chất tan, tạo ra được một sự chênh lệch nồng độ cần thiết bên trong và bên ngoài môi trường tức là luôn có động lực cho quá trình, từ đó làm chênh lệch áp suất thẩm thấu và sự khuếch tán của các chất tan có trong tế bào rong ra dung môi trích ly, làm cho hàm lượng chất tan, polyphenol có trong dịch trích ly tăng lên. • Lúc đầu nồng độ chất tan, polyphenol có trong rong nhiều, sự khuếch tán chúng ra khỏi tế bào cũng nhanh và mạnh. Nhưng dần dần khi lượng dung môi đã ngấm kiệt vào trong các thành phần của rong (sự thẩm thấu gần đạt trạng thái bão hoà) và nồng độ chất tan cũng như polyphenol đã giảm so với ban đầu, thì sự khuếch tán các chất này ra khỏi tế bào cây rong cũng giảm và chậm hơn. Do đó khả năng hoà tan của chúng vào môi trường trích ly sẽ giảm và dần đến ổn định (lúc này chênh lệch nồng độ chất tan trong tế bào rong và trong dịch trích ly là rất nhỏ). Kết luận xử lý số liệu ta thu được giá trị P = 0,0000 < (0,05) cho thấy tỷ lệ nguyên liệu: dung môi khác nhau thì sẽ thu được các lượng polyphenol khác nhau có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%. Kết quả xử lý LSD cho thấy sự khác biệt giữa tỷ lệ nguyên liệu: dung môi 1:50 và 1:60 so với các mẫu 1:20, 1:30, 1:40 là có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 36
Đồ án tốt nghiệp 95%. Do vậy, nhóm nghiên cứu đề tài chọn tỷ lệ nguyên liệu: dung môi là 1:50 làm tỷ lệ trích ly thích hợp cho quá trình trích ly. 3.3.1.2 Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly m bã ở giấy Thời m ban đầu m bã ở cốc m còn lại Hiệu suất Hiệu suất trung gian (h) (g) lọc (g) (g) (%) bình (%) (g) 24 0,04 5,665 5,705 4,916667 24 6 0,03 5,677 5,707 4,883333 4,861111 24 0,09 5,623 5,713 4,783333 48 0,09 5,468 5,558 7,366667 48 6 0,04 5,525 5,565 7,25 7,333333 48 0,09 5,467 5,557 7,383333 72 0,02 5,467 5,487 8,55 72 6 0,13 5,362 5,492 8,466667 8,533333 72 0,19 5,295 5,485 8,583333 Hàm lượng Độ pha Hàm lượng Thời gian polyphenol loãng OD C (µg/ml) polyphenol (h) trung bình ( lần) (µg/ml) (µg/ml) 24 0,375 0,36344 3,634399309 24 10 0,372 0,360199 3,6019879 3,6019879 24 0,369 0,356958 3,569576491 48 0,392 0,381806 3,818063959 48 10 0,398 0,388289 3,882886776 3,850475367 48 0,395 0,385048 3,850475367 72 0,408 0,399092 3,990924806 72 10 0,415 0,406655 4,066551426 4,001728608 72 0,404 0,394771 3,947709594 Sau khi tiến hành thí nghiệm như đã mô tả ở mục 2.3.1.2 ta được kết quả như sau: Bảng 3. 2. Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly Thời gian (h) 24 48 72 Tỉ lệ thu hồi (%) 4,861 ± 0,06 7,33 ± 0,07 8,53 ± 0,06 Hàm lượng polyphenol (µg/ml) 3,6 ± 0,032 3,85 ± 0,032 4,0 ± 0,06 Dịch chiết thu được trong các khoảng thời gian có sai khác có ý nghĩa với độ chính xác 95%, LSD = +/- 0,01 37
Đồ án tốt nghiệp 9 8 7 6 5 4 3 Tỉ (%)hồiTỉ thu lệ 2 1 0 24h 48h 72h Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian trích ly đến tỉ lệ thu hồi polyphenol trong mẫu. 4.1 ) 4 3.9 3.8 3.7 3.6 Hàm lượng p.p( p.p( lượng µg/ml Hàm 3.5 3.4 24h 48h 72h Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng polyphenol trong mẫu. Nhận xét: Từ kết quả nghiên cứu bảng 3.2 và đồ thị (hình 3.3, hình 3.4) ta thấy được rằng khi thay đổi thời gian từ 24 giờ đến 72 giờ thì có thể thấy tỉ lệ thu hồi sản phẩm và tổng hàm lượng polyphenol trong dịch trích ly tăng dần. Có thể giải thích điều này như sau: • Khi thời gian trích ly kéo dài, giúp dung môi thẩm thấu vào trong từng tế bào rong qua các mao quản, tạo điều kiện thuận lợi cho sự khuếch tán chất tan, polyphenol ra khỏi rong vào môi trường trích ly. 38
Đồ án tốt nghiệp • Lúc đầu, lượng chất tan, polyphenol có trong rong nhiều nên khả năng hoà tan của nó trong môi trường trích ly sẽ lớn. Nhưng lượng polyphenol trong rong nâu chỉ có ở mức độ giới hạn nhất định. Vì vậy, hàm lượng của chúng chỉ tăng mạnh ở thời gian đầu và giảm dần về sau, đến một thời điểm nào đó khi sự khuếch tán của chất này xảy ra hạn chế thì hàm lượng polyphenol sẽ không thay đổi. • Ta thấy thời gian trích ly dài thì hàm lượng polyphenol trong dịch trích ly tăng, nhưng việc kéo dài thời gian lại bất lợi về mặt năng lượng và ảnh hưởng tới thời gian thực hiện quy trình. Kết quả xử lý số liệu ta thu được giá trị P = 0,0002 < (0,05) cho thấy thời gian trích ly khác nhau thì sẽ có tỉ lệ thu hồi và hàm lượng polyphenol khác nhau có ý thống kê ở độ tin cậy 95%. Kết quả xử lý LSD cho thấy sự khác biệt ở thời gian trích ly 24 giờ so với các mẫu trích ly ở 48 giờ và 72 giờ là có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%. Điều này có ý nghĩa là ở mẫu có thời gian trích ly 72 giờ thu được lượng polyphenol là nhiều nhất. Tuy nhiên sự chênh lệch về tỉ lệ thu hồi và hàm lượng polyphenol của các mẫu trích ly ở 24 giờ và 72 giờ là không nhiều. Mặt khác ta thấy nếu trích ly ở 72 giờ thì sẽ bất lợi nhiều về mặt chi phí và rắc rối trong quy trình thực hiện nên nhóm thực hiện đề tài chọn thời gian trích ly thích hợp nhất là 24 giờ. 3.1.1.3. Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly Tiến hành thí nghiệm như ở mục 2.1.1.3 ta được kết quả sau: Nhiệt độ m ban đầu m bã ở giấy lọc m bã ở cốc m còn lại Hiệu suất Hiệu suất trung (0C) (g) (g) (g) (g) (%) bình (%) 30 0,09 5,616 5,706 4,9 30 6 0,12 5,585 5,705 4,916667 14,73333 30 0,18 5,525 5,705 4,916667 40 0,11 5,594 5,704 4,933333 40 6 0,21 5,492 5,702 4,966667 14,83333 40 0,09 5,614 5,704 4,933333 50 0,18 5,521 5,701 4,983333 50 6 0,24 5,461 5,701 4,983333 50 0,12 5,582 5,702 4,966667 14,93333 60 0,17 5,519 5,689 5,183333 60 6 0,28 5,406 5,686 5,233333 39
Đồ án tốt nghiệp 60 0,21 5,475 5,685 5,25 15,66667 Hàm lượng Hàm lượng Nhiệt độ Độ pha loãng OD C (µg/ml) polyphenol trung bình (0C) ( lần) (µg/ml) (µg/ml) 30 0,365 0,35263613 3,526361279 30 10 0,362 0,34939499 3,49394987 3,52636128 30 0,368 0,35587727 3,558772688 40 0,418 0,40989628 4,098962835 40 10 0,415 0,40665514 4,066551426 4,08815903 40 0,418 0,40989628 4,098962835 50 0,483 0,480121 4,801210026 50 10 0,487 0,48444252 4,844425238 4,82281763 50 0,485 0,48228176 4,822817632 60 0,521 0,52117545 5,211754538 60 10 0,525 0,52549697 5,254969749 5,24416595 60 0,526 0,52657736 5,265773552 Bảng 3.3. Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly Nhiệt độ (0C) 30 40 50 60 Tỉ lệ thu hồi 4,911± 0,096 4,922 ± 0,0192 4,938 ± 0096 4,944 ± 0,0347 (%) Hàm lượng polyphenol 3,53 ± 0,032 4,088 ± 0,019 4,823 ± 0,022 5,2444 ± 0,028 (µg/ml) Dịch chiết thu được ở các nhiệt độ khác nhau có sai khác có ý nghĩa với độ chính xác 95%, LSD = +/- 0,01 4.95 4.94 4.93 4.92 4.91 Tỉ % hồiTỉ thu lệ 4.9 4.89 30 40 50 60 40
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5. Biểu đồ khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ thu hồi polyphenol. 6 ) 5 4 3 2 1 Hàm lượng p.p p.p lượng(µg/ml Hàm 0 30 40 50 60 Hình 3.6. Biểu đồ khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol. Nhận xét: Từ kết quả nghiên cứu và đồ thị (hình 3.5, hình 3.6), ta thấy hàm lượng phlorotannin và tỉ lệ thu hồi phlorotanni trong dịch chiết tăng lên khi ta tăng nhiệt độ từ 300C đến 600C. Có thể giải thích điều này như sau: • Khi tăng nhiệt độ chiết sẽ làm giảm độ nhớt của dịch, làm tăng tốc độ phản ứng giữa các thành phần hóa học [4] trong rong với nhau cũng như các thành phần đó với hỗn hợp dung môi chiết. Và tăng hiệu quả của quá trình trích ly. Tuy nhiên nhiệt độ quá cao làm cho hiện tượng chuyển pha của dung môi diễn ra mãnh liệt đồng thời quá trình oxy hóa phlorotannin tăng cao nên làm giảm hiệu quả trích ly. • Khi tăng nhiệt độ chiết làm cho chuyển động nhiệt tăng, tốc độ khuếch tán của các chất tan cũng như phlorotannin và carbohydrate từ bên trong tế bào rong ra môi trường chiết sẽ tăng, làm tăng sự thẩm thấu giữa dung môi và tế bào nguyên liệu [4]. Vì thế, hàm lượng phlorotannin và carbohydrate trong dịch chiết tăng lên. Tuy nhiên, nhiệt độ là một yếu tố có giới hạn. Vì nhiệt độ quá cao, chúng ta phải cung cấp thêm năng lượng, ảnh hưởng đến giá thành sản phẩm và có thể xảy ra các phản ứng không mong muốn, làm biến tính hay thay đổi một số thành phần chất tan cần chiết. Nhiệt độ quá cao làm cho hiện tượng chuyển pha của dung môi diễn ra mãnh liệt, đồng thời quá trình oxy hóa phlorotannin tăng cao nên làm giảm hiệu quả trích ly. Còn 41
Đồ án tốt nghiệp nếu nhiệt độ quá thấp thì lại kéo dài thời gian trích ly ảnh hưởng đến cả quá trình. Nhìn chung có thể thấy là yếu tố nhiệt độ ít ảnh hưởng đến quá trình trích ly. Vì vậy, nhóm thực hiện đề tài chọn nhiệt độ chiết 600C là nhiệt độ chiết thích hợp cho quá trình chiết. 3.1.2 Đối với dung môi là EtOH 3.1.2.1 Kết quả xác định tỉ lệ NL: DM thích hợp cho quá trình trích ly m m bã ở giấy m m Hiệu suất Hiệu suất trung Tỉ lệ ban đầu bã ở cốc còn lại (g) lọc (g) (g) (%) bình (%) (g) 1:20 5,701 0,12 5,56 5,68 0,368356 1:20 5,693 0,15 5,52 5,67 0,404005 0,415709 1:20 5,687 0,18 5,48 5,66 0,474767 1:30 3,761 0,35 3,395 3,745 0,425419 1:30 3,751 0,34 3,39 3,73 0,559851 0,506201 1:30 3,75 0,15 3,58 3,73 0,533333 1:40 2,782 0,14 2,627 2,767 0,53918 1:40 2,785 0,23 2,536 2,766 0,682226 0,623118 1:40 2,778 0,13 2,63 2,76 0,647948 1:50 2,195 0,24 1,94 2,18 0,683371 1:50 2,191 0,25 1,922 2,172 0,867184 0,789579 1:50 2,2 0,172 2,01 2,182 0,818182 Độ pha Hàm lượng Hàm lượng Tỉ lệ loãng OD C (µg/ml) polyphenol trung bình ( lần) (µg/ml) (µg/ml) 1:20 0,218 0,193820225 0,387640449 1:20 2 0,223 0,199222126 0,398444252 0,394122731 1:20 0,222 0,198141746 0,396283492 1:30 0,25 0,228392394 0,456784788 1:30 2 0,238 0,215427831 0,430855661 0,445980985 1:30 0,247 0,225151253 0,450302506 1:40 0,27 0,25 0,5 1:40 2 0,262 0,241356958 0,482713915 0,495678479 1:40 0,272 0,252160761 0,504321521 1:50 0,271 0,25108038 0,502160761 1:50 2 0,28 0,260803803 0,521607606 0,510803803 1:50 0,274 0,254321521 0,508643042 42
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. Kết quả xác định tỉ lệ NL: DM thích hợp cho quá trình trích Tỉ lệ 1:20 1:30 1:40 1:50 Tỉ lệ thu hồi 0,039 ± 0,054 0,445 ±0,079 0,496 ± 0,074 0,511 ± 0,095 (%) Hàm lượng polyphenol 0,42 ± 0,57.10-2 0,506 ± 0,013 0,023 ± 0,011 0,789 ± 0,01 (µg/ml) Dịch chiết thu được ở các tỉ lệ khác nhau có sai khác có ý nghĩa với độ chính xác 95%, LSD = +/- 0,003 0.25 0.2 0.15 0.1 Tỉ % hồiTỉ thu lệ 0.05 0 24h 48h 72h Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ NL: DM tới tỉ lệ thu hồi polyphenol. 0.46 0.45 0.44 0.43 0.42 0.41 0.4 0.39 0.38 Hàm lượng p.p( p.p( lượng µg/ml Hàm 0.37 0.36 24h 48h 72h Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ NL: DM tới hàm lượng polyphenol 43
Đồ án tốt nghiệp Kết quả xử lý số liệu ta thu được giá trị P = 0,0000 < (0,05) cho thấy thời gian trích ly khác nhau thì sẽ có tỉ lệ thu hồi và hàm lượng polyphenol khác nhau có ý thống kê ở độ tin cậy 95% Kết quả xử lý LSD cho thấy sự tăng về tỉ lệ thu hồi và hàm lượng polyphenol ở các tỉ lệ từ 1: 20 đến 1: 50 nhưng sự chênh lệch này không nhiều. Bên cạnh đó giá thành của dung môi EtOH đắt hơn so với nước nên để tiết kiệm chi phí cho quá trình trích ly nhóm thực hiện đề tài chọn tỉ lệ NL: DM = 1:20 là thích hợp nhất. 3.1.2.2 Kết quả xác định sự ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả trích ly Hàm lượng Thời Độ pha Hàm lượng OD C (µg/ml) trung bình gian(h) loãng ( lần) polyphenol (µg/ml) (µg/ml) 24 0,212 0,187338 0,374675886 24 2 0,218 0,19382 0,387640449 0,394122731 24 0,233 0,210026 0,420051858 48 0,234 0,211106 0,422212619 48 2 0,238 0,215428 0,430855661 0,433016422 48 0,245 0,22299 0,445980985 72 0,247 0,225151 0,450302506 72 2 0,243 0,22083 0,441659464 0,448861999 72 0,249 0,227312 0,454624028 m bã ở giấy Thời m ban đầu m bã ở cốc m còn lại Hiệu suất Hiệu suất trung gian (h) (g) lọc (g) (g) (%) bình (%) (g) 24 5,705 0,04 5,656 5,696 0,157756 24 5,707 0,03 5,668 5,698 0,157701 0,157664 24 5,713 0,09 5,614 5,704 0,157535 48 5,558 0,09 5,458 5,548 0,179921 48 5,565 0,04 5,515 5,555 0,179695 0,179856 48 5,557 0,09 5,457 5,547 0,179953 72 5,487 0,02 5,456 5,476 0,200474 72 5,492 0,13 5,351 5,481 0,200291 0,200437 72 5,485 0,19 5,284 5,474 0,200547 Bảng 3.5. Kết quả xác định sự ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả trích ly Thời gian (h) 24 48 72 Tỉ lệ thu hồi (%) 0,158 ± 0,11.10-3 0,179 ± 0,14. 10-3 0,2 ± 0,13. 10-3 Hàm lượng 0,394 ± 0,023 0,433 ± 0,0120 0,449 ± 0,006 polyphenol (µg/ml) 44
Đồ án tốt nghiệp Dịch chiết thu được trong các khoảng thời gian khác nhau có sai khác có ý nghĩa với độ chính xác 95%, LSD = +/- 0,003 0.25 0.2 0.15 0.1 Tỉ % hồiTỉ thu lệ 0.05 0 24h 48h 72h Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian tới tỉ lệ thu hồi polyphenol 0.46 0.45 0.44 0.43 0.42 0.41 0.4 0.39 0.38 0.37 0.36 Hàm lượng p.p( p.p( lượng µg/ml Hàm 24h 48h 72h Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian tới hàm lượng polyphenol Kết quả xử lý số liệu ta thu được giá trị P = 0,0000 < (0,05) cho thấy thời gian trích ly khác nhau thì sẽ có tỉ lệ thu hồi và hàm lượng polyphenol khác nhau có ý thống kê ở độ tin cậy 95% Kết quả xử lý LSD cho thấy sự khác biệt ở thời gian trích ly 24 giờ so với các mẫu trích ly ở 48 giờ và 72 giờ là có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%. Điều này có ý nghĩa là ở mẫu có thời gian trích ly 72 giờ thu được lượng polyphenol là nhiều nhất. Tuy nhiên sự chênh lệch về tỉ lệ thu hồi và hàm lượng polyphenol của các mẫu trích ly ở 24 giờ và 72 giờ là không nhiều. Mặt khác ta thấy nếu trích ly ở 45
Đồ án tốt nghiệp 72 giờ thì sẽ bất lợi nhiều về mặt chi phí và rắc rối trong quy trình thực hiện nên nhóm thực hiện đề tài chọn thời gian trích ly thích hợp nhất là 24 giờ. 3.1.2.3 Kết quả xác định sự ảnh hưởng của nồng độ EtOH đến hiệu quả trích ly Độ pha Hàm lượng Hàm lượng Nồng độ loãng OD C (µg/ml) polyphenol trung bình (%) ( lần) (µg/ml) (µg/ml) 60 0,397 0,3872083 0,387208297 60 1 0,398 0,38828868 0,388288678 0,39333045 60 0,413 0,40449438 0,404494382 70 0,313 0,29645635 0,296456353 70 1 0,315 0,29861711 0,298617113 0,29681648 70 0,312 0,29537597 0,295375972 80 0,254 0,23271392 0,232713915 80 1 0,255 0,2337943 0,233794296 80 0,247 0,22515125 0,225151253 0,23055315 90 0,218 0,19382022 0,193820225 90 1 0,212 0,18733794 0,187337943 0,18841832 90 0,209 0,1840968 0,184096802 m bã ở giấy Nồng độ m ban đầu m bã ở cốc m còn lại Hiệu suất Hiệu suất trung (%) (g) lọc (g) (g) (%) bình (%) (g) 60 5,706 0,15 5,616 5,697 0,157729 60 5,705 0,21 5,585 5,697 0,140228 0,140219 60 5,705 0,27 5,525 5,698 0,122699 70 5,704 0,12 5,594 5,699 0,087658 70 5,702 0,21 5,492 5,698 0,070151 0,081822 70 5,704 0,25 5,614 5,699 0,087658 80 5,701 0,18 5,521 5,697 0,070163 80 5,701 0,19 5,461 5,698 0,052622 0,058466 80 5,702 0,26 5,582 5,699 0,052613 90 5,689 0,22 5,519 5,687 0,035156 90 5,686 0,17 5,406 5,684 0,035174 0,03517 90 5,685 0,13 5,475 5,683 0,03518 Bảng 3.6 Kết quả xác định sự ảnh hưởng của nồng độ EtOH đến hiệu quả trích ly Nồng độ (%) 60 70 80 90 Tỉ lệ thu 0,14 ± 0.0375 0,282 ± 0,01 0,058 ± 0,01 0,035 ± 0,1.10-4 hồi(%) Hàm lượng polyphenol 0,393 ± 0,01 0,297 ± 0,002 0,231 ±0,005 0,188 ±0,005 (µg/ml) 46
Đồ án tốt nghiệp 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 Tỉ % hồiTỉ thu lệ 0.04 0.02 0 60 70 80 90 Hình 3. 11. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ EtOH đến tỉ lệ thu hồi polyphenol. 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 Hàm lượng p.p Hàm (µg/ml) 0.05 0 60 70 80 90 Hình 3. 12. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ EtOH đến hàm lượng polyphenol. Ta thấy tỉ lệ thu hồi và hàm lượng polyphenol giảm dần khi tăng nồng độ EtOH từ 600 đến 900 . Nguyên nhân là do: - Dung môi càng có tính phân cực cao thì tỉ lệ thu hồi càng lớn do hoà tan được càng nhiều polyphenol. - Dung môi EtOH có nồng độ càng thấp thì có độ phân cực càng cao. 47
Đồ án tốt nghiệp Kết quả xử lý số liệu ta thu được giá trị P = 0,0000 < (0,05) cho thấy nồng độ EtOH khác nhau thì sẽ có tỉ lệ thu hồi và hàm lượng polyphenol khác nhau có ý thống kê ở độ tin cậy 95%. Kết quả xử lý LSD cho thấy sự khác biệt ở các nồng độ EtOH với nhau là có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%. Điều này có ý nghĩa là ở mẫu có nồng độ EtOH = 600 sẽ cho tỉ lệ thu hồi và hàm lượng polyphenol là cao nhất. Mặt khác ta thấy chọn EtOH có nồng độ = 600 sẽ tiết kiệm được chi phí cho quá trình trích ly nên nhóm nghiên cứu đề tài chọn dung môi EtOH có nồng độ = 600 là thích hợp nhất. 3.4 Kết quả kháng nấm của dịch chiết thu được Sau khi ủ ở 370C trong 3 ngày ta lấy mẫu khảo sát ra và tiến hành đo đường kính tản nấm để đánh giá khả năng kháng nấm của dịch chiết thu được ở các nồng độ khác nhau. Nồng độ Đường kính tản nấm (mm) Lần polyphenol HQ (%) (µg/ml) Đối chứng Thí nghiệm 1 21,2 20,1 5,189 2 3,505 21,1 19,9 5,687 3 21,2 19,8 6,604 1 21,3 19,8 7,52 2 4,693 21,1 19,7 6,635 3 21,2 19,6 7,547 1 21,2 19,2 9,434 2 5,125 21,3 19,3 9,390 3 21,2 19,3 8,902 1 21,3 19,1 10,329 2 6,551 21,1 19,0 9,953 3 21,3 19,3 9,859 Bảng 3.8 Hiệu quả kháng nấm Aspergillus niger cuả dịch chiết nước từ rong nâu (Sargassum) Nồng độ Đường kính tản nấm (mm) Khả năng polyphenol HQ (%) kháng nấm (µg/ml) Đối chứng Thí nghiệm 3,505 21,167 ± 0.06 19,933 ±0,153 5,827 ± 0,718 [ - ] 4,693 21,2 ± 0,1 19,667 ±0,058 7,231 ± 0,517 [ - ] 48
Đồ án tốt nghiệp 5,125 21,23 ± 0,06 19,267 ± 0,058 9,262 ± 0,260 [ - ] 6,551 21,233 ± 0,115 19,1 ± 0,1 10,047 ± 0,249 [ + ] [ - ]: không kháng nấm Qua xử lý số liệu bằng phần mềm Stargraphics ta thấy ở các nồng độ khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa với độ chính xác 95% Dựa vào kết quả trong bảng 3.8 cho thấy dịch chiết nước từ rong nâu (Sargassum) ở các nồng độ polyphenol: 3,505µg/ml; 4,693 µg/ml; 5,125 µg/ml không kháng được nấm Aspergillus niger, dịch chiết nước có nồng độ polyphenol 6,551 µg/ml kháng nấm ở mức rất thấp (HQ = 10,47 ± 0,249%) Bảng 3.9 Hiệu quả kháng nấm Aspergillus niger cuả dịch chiết ethanol ở các nồng độ khác nhau từ rong nâu (Sargassum) Nồng độ Đường kính tản nấm (mm) Lần polyphenol HQ (%) (µg/ml) Đối chứng Thí nghiệm 1 20,7 20,2 2,415 2 0,393 20,8 20,2 2,885 3 20,5 20,1 1,951 1 20,7 20,1 2,899 2 0,297 20,5 20,0 2,439 3 20,5 19,9 2,927 1 20,2 19,7 2,475 2 0,231 20,3 19,8 2,463 3 20,2 19,7 2,475 1 20,0 19,7 1,5 2 0,188 19,8 19,5 1,515 3 19,8 19,5 1,515 Nồng độ Đường kính tản nấm (mm) Khả năng polyphenol HQ (%) kháng nấm (µg/ml) Đối chứng Thí nghiệm 0,188 20,7 ± 0,1 20,167 ± 0,578 2,576 ± 0,009 [ - ] 0,231 20,567 ± 0,115 20 ± 0,1 2,755 ± 0,007 [ - ] 0,297 20,233 ± 0,058 19,733 ± 0,578 2,471 ± 0,274 [ - ] 0,393 19,867 ± 0,115 19,567 ± 0,115 1,51 ± 0,268 [ - ] 49
Đồ án tốt nghiệp Qua xử lý số liệu bằng phần mềm Stargraphics ta thấy ở các nồng độ khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa với độ chính xác 95% Dựa vào kết quả trong bảng 3.9 cho thấy dịch chiết EtOH từ rong nâu (Sargassum) ở các nồng độ polyphenol: 0,188 µg/ml; 0,231 µg/ml; 0,297 µg/ml; 0,393 µg/ml đều không kháng được nấm Aspergillus niger. 50
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Qua thời gian thực hiện đề tài, nhóm nghiên cứu đề tài đã rút ra một số kết luận như sau: ❖ Xây dựng được quy trình tối ưu hoá trích ly phlorotannin từ rong nâu Sargassum của bờ biển Ninh Thuận. ❖ Xác định được các thông số kỹ thuật cho quá trình trích ly, đó là: ✓ Dung môi sử dụng : nước ✓ Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi : 1:50 ✓ Nhiệt độ trích ly : 600C ✓ Thời gian trích ly : 24 giờ ❖ Kiểm tra khả năng kháng nấm Aspergillus niger của cao chiết từ rong nâu 4.2 Đề xuất Mặc dù đã cố gắng trong quá trình làm đề tài, song do thời gian và điều kiện nghiên cứu có hạn nên đề tài vẫn còn nhiều hạn chế và thiếu sót. Do vậy, nhóm nghiên cứu đề tài xin đề xuất một số ý kiến sau: ✓ Cần nghiên cứu thêm về khả năng kháng oxy hóa và những tác dụng khác của các chất có trong rong nâu. ✓ Tiếp tục nghiên cứu quy trình, đặc biệt là trong công đoạn chiết (như nghiên cứu chiết phlorotannin ở vùng biển có điều kiện sống của rong khác nhau, thực hiện chiết trong các môi trường pH khác nhau, dung môi khác nhau, ). Vì vấn đề này ít được nghiên cứu trong nước. ✓ Tiếp tục nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của cao chiết từ các loại rong mơ trên nhiều chủng nấm khác nhau. ✓ Cần nghiên cứu khả năng ứng dụng rộng rãi của chế phẩm từ rong nâu vào trong các lĩnh vực như: thực phẩm, dược phẩm, y học, mỹ phẩm, nông nghiệp 51
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Hữu Dinh et al (1993), Rong biển Việt Nam phần miền Bắc, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật. [2] Nguyễn Hữu Đại (1992), Góp phần nghiên cứu họ rong mơ (sargassaceae) ven biển miền trung Việt Nam, luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học, Trường Đại Học Tổng Hợp Hà Nội . [3] Nguyễn Hữu Đại (1997), Rong mơ Việt Nam nguồn lợi và sử dụng, Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp Tp.HCM . [4] Trần Thị Luyến – Đỗ Minh Phụng – Nguyễn Anh Tuấn – Ngô Đăng Nghĩa (2003), Chế biến rong biển, Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp . [5] Phạm Hoàng Hộ (1972) , Tảo học , Trung Tâm Học Liệu Bộ Giáo Dục. [6] Hoàng Thị Sản , Hoàng Thị Bé (1998), Phân Loại Học Thực Vật, NXB Giáo Dục. [7] Đặng Thị Sy (2005), Tảo Học, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội. [8] Phạm Đức Thịnh (2007), Tách chiết và phân tích thành phần các polysaccharide tan trong nước của một số loài rong nâu Việt Nam, luận văn thạc sỹ, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang , Khánh Hoà. [9] Investment Promotion Agency of Administrative Committee of Yantai Economic & Technologial Development Area , August 3 , 2007. [10] Public Healthy service Food and drug Administration Washington DC November 14 , 2000. 52
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục 1. Xử lý ANOVA và LSD đối với kết quả khảo sát thời gian ảnh hưởng tới quá trình trích ly polyphenol dựa vào hiệu suất thu hồi. Summary Statistics for I.hieu suat thu hoi % I.ti le Cou Average Standard Coeff. of Minimu Maximu Range Stnd. nt deviation variation m m skewness 1:20 3 5.10556 0.117063 2.29285% 4.98333 5.21667 0.233333 -0.299299 1:30 3 6.15 0.152069 2.47267% 5.975 6.25 0.275 -1.18761 1:40 3 7.27778 0.117063 1.6085% 7.16667 7.4 0.233333 0.299299 1:50 3 8.52778 0.187885 2.20322% 8.33333 8.70833 0.375 -0.233933 Total 12 6.76528 1.33752 19.7704% 4.98333 8.70833 3.725 0.167793 ANOVA Table for I.hieu suat thu hoi % by I.ti le Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 19.5069 3 6.50231 303.02 0.0000 groups Within 0.171667 8 0.0214583 groups Total (Corr.) 19.6786 11 Table of Means for I.hieu suat thu hoi % by I.ti le with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error I.ti le Count Mean (pooled s) Lower Upper limit limit 1:20 3 5.10556 0.0845741 4.96765 5.24346 1:30 3 6.15 0.0845741 6.01209 6.28791 1:40 3 7.27778 0.0845741 7.13987 7.41568 1:50 3 8.52778 0.0845741 8.38987 8.66568 Total 12 6.76528 Multiple Range Tests for I.hieu suat thu hoi % by I.ti le Method: 95.0 percent LSD I.ti le Count Mean Homogeneous Groups 1:20 3 5.10556 X 1:30 3 6.15 X 1:40 3 7.27778 X 1:50 3 8.52778 X Contrast Sig. Difference +/- Limits 1
Đồ án tốt nghiệp 1:20 - 1:30 * -1.04444 0.275812 1:20 - 1:40 * -2.17222 0.275812 1:20 - 1:50 * -3.42222 0.275812 1:30 - 1:40 * -1.12778 0.275812 1:30 - 1:50 * -2.37778 0.275812 1:40 - 1:50 * -1.25 0.275812 Xử lý ANOVA và LSD đối với kết quả khảo sát thời gian ảnh hưởng tới quá trình trích ly polyphenol dựa vào hàm lượng polyphenol trong dịch chiết thu được. Summary Statistics for A.ham luong polyphenol A.ti Co Aver Standard Coeff. Mini Maximu Range Stnd. le unt age deviation of mum m skewness variati on 1:20 3 3.50 0.0216076 0.6165 3.483 3.52636 0.043215 0.0 475 23% 15 2 1:30 3 4.69 0.0495092 1.0549 4.649 4.74719 0.097234 0.6613 317 2% 96 2 1:40 3 5.12 0.0216076 0.4215 5.103 5.14693 0.043215 0.0 532 85% 72 2 1:50 3 6.55 0.0389537 0.5945 6.519 6.59464 0.075626 0.814636 143 83% 01 6 Total 12 4.96 1.13841 22.911 3.483 6.59464 3.1115 0.255038 867 7% 15 ANOVA Table for A.ham luong polyphenol by A.ti le Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 14.2458 3 4.74861 3874.57 0.0000 groups Within 0.00980466 8 0.0012255 groups 8 Total (Corr.) 14.2556 11 Table of Means for A.ham luong polyphenol by A.ti le with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error A.ti le Count Mean (pooled Lower Upper limit s) limit 1:20 3 3.5047 0.02021 3.4718 3.53771 5 21 1:30 3 4.6931 0.02021 4.66021 4.72613 7 21 1:40 3 5.1253 0.02021 5.09237 5.15828 2
Đồ án tốt nghiệp 2 21 1:50 3 6.5514 0.02021 6.51847 6.58438 3 21 Total 12 4.9686 7 Table of Means for A.ham luong polyphenol by A.ti le with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error A.ti le Count Mean (pooled Lower Upper limit s) limit 1:20 3 3.5047 0.02021 3.4718 3.53771 5 21 1:30 3 4.6931 0.02021 4.66021 4.72613 7 21 1:40 3 5.1253 0.02021 5.09237 5.15828 2 21 1:50 3 6.5514 0.02021 6.51847 6.58438 3 21 Total 12 4.9686 7 Multiple Range Tests for A.ham luong polyphenol by A.ti le Method: 95.0 percent LSD A.ti le Count Mean Homogeneous Groups 1:20 3 3.5047 X 5 1:30 3 4.6931 X 7 1:40 3 5.1253 X 2 1:50 3 6.5514 X 3 Contrast Sig. Differenc +/- Limits e 1:20 - 1:30 * -1.18842 0.0659154 1:20 - 1:40 * -1.62057 0.0659154 1:20 - 1:50 * -3.04667 0.0659154 1:30 - 1:40 * -0.432152 0.0659154 1:30 - 1:50 * -1.85825 0.0659154 1:40 - 1:50 * -1.4261 0.0659154 3
Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 2: Xử lý ANOVA và LSD đối với kết quả khảo sát thời gian cho quá trình trích ly thông qua tỉ lệ thu hồi. Summary Statistics for hieu suat thu hoi % G.thoi Standard Coeff. of Stnd. Count Average Minimum Maximum Range gian deviation variation skewness 24h 3 4.86111 0.0693889 1.42743% 4.78333 4.91667 0.133333 -0.914531 48h 3 7.33333 0.0726483 0.990659% 7.25 7.38333 0.133333 -1.15263 72h 3 8.53333 0.0600925 0.704209% 8.46667 8.58333 0.116667 -0.814636 Total 9 6.90926 1.62267 23.4855% 4.78333 8.58333 3.8 -0.585397 ANOVA Table for hieu suat thu hoi % by G.thoi gian Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 21.0371 2 10.5185 2302.71 0.0000 groups Within groups 0.0274074 6 0.0045679 Total (Corr.) 21.0645 8 Table of Means for hieu suat thu hoi % by G.thoi gian with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error G.thoi gian Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 24h 3 4.86111 0.0390209 4.7936 4.92863 48h 3 7.33333 0.0390209 7.26582 7.40085 72h 3 8.53333 0.0390209 8.46582 8.60085 Total 9 6.90926 4
Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for hieu suat thu hoi % by G.thoi gian Method: 95.0 percent LSD G.thoi Count Mean Homogeneous gian Groups 24h 3 4.86111 X 48h 3 7.33333 X 72h 3 8.53333 X Contrast Sig. Difference +/- Limits 24h - * -2.47222 0.135031 48h 24h - * -3.67222 0.135031 72h 48h - * -1.2 0.135031 72h Phụ lục 3.Xử lý ANOVA và LSD đối với kết quả khảo sát thời gian cho quá trình trích ly thông qua hàm lượng polyphenol. Summary Statistics for C.ham luong polyphenol thoi Cou Average Standard Coeff. of Minimu Maximum Range Stnd. gian nt deviation variation m skewness 24h 3 3.60199 0.0324114 0.89982% 3.56958 3.6344 0.0648228 0.0 48h 3 3.85048 0.0324114 0.841751% 3.81806 3.88289 0.0648228 3.27249E-8 72h 3 4.00173 0.060153 1.50318% 3.94771 4.06655 0.118842 0.553065 Total 9 3.81806 0.178835 4.68391% 3.56958 4.06655 0.496975 -0.297106 ANOVA Table for C.ham luong polyphenol by thoi gian Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 0.244416 2 0.122208 64.10 0.0001 groups Within 0.0114388 6 0.0019064 groups 6 Total (Corr.) 0.255855 8 5
Đồ án tốt nghiệp Table of Means for C.ham luong polyphenol by thoi gian with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error thoi Count Mean (pooled Lower Upper gian s) limit limit 24h 3 3.6019 0.02520 3.55837 3.64561 9 89 48h 3 3.8504 0.02520 3.80686 3.89409 8 89 72h 3 4.0017 0.02520 3.95811 4.04535 3 89 Total 9 3.8180 6 Multiple Range Tests for C.ham luong polyphenol by thoi gian Method: 95.0 percent LSD thoi Count Mean Homogeneous gian Groups 24h 3 3.6019 X 9 48h 3 3.8504 X 8 72h 3 4.0017 X 3 Contras Sig. Differenc +/- t e Limits 24h - * -0.248487 0.08723 48h 44 24h - * -0.399741 0.08723 72h 44 48h - * -0.151253 0.08723 72h 44 Phục lục 4. Xử lý ANOVA và LSD đối với kết quả khảo sát nhiệt độ cho quá trình trích ly thông qua hiệu suất thu hồi. Summary Statistics for solieu.hieu suat thu hoi % solieu Cou Avera Stand Coeff. of Minimum Maximum Rang Stnd. skewness .nhiet nt ge ard variation e do devia tion 30 3 4.911 0.009 0.195933 4.9 4.91667 0.016 -1.22474 11 6225 % 6667 6
Đồ án tốt nghiệp 40 3 4.944 0.019 0.389225 4.93333 4.96667 0.033 1.22474 44 245 % 3333 50 3 4.977 0.009 0.193309 4.96667 4.98333 0.016 -1.22474 78 6225 % 6667 60 3 5.222 0.034 0.664361 5.18333 5.25 0.066 -0.914531 22 6944 % 6667 Total 12 5.013 0.129 2.57809 4.9 5.25 0.35 1.712 89 262 % ANOVA Table for solieu.hieu suat thu hoi % by solieu.nhiet do Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 0.180278 3 0.0600926 136.63 0.0000 groups Within 0.00351852 8 0.0004398 groups 15 Total (Corr.) 0.183796 11 Table of Means for solieu.hieu suat thu hoi % by solieu.nhiet do with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error solieu.nhiet Count Mean (pooled s) Lower Upper limit do limit 30 3 4.91111 0.0121081 4.89137 4.93085 40 3 4.94444 0.0121081 4.9247 4.96419 50 3 4.97778 0.0121081 4.95803 4.99752 60 3 5.22222 0.0121081 5.20248 5.24197 Total 12 5.01389 Multiple Range Tests for solieu.hieu suat thu hoi % by solieu.nhiet do Method: 95.0 percent LSD solieu.nhiet Count Mean Homogeneous do Groups 30 3 4.9111 X 1 40 3 4.9444 XX 4 50 3 4.9777 X 8 60 3 5.2222 X 2 7
Đồ án tốt nghiệp Contra Sig. Difference +/- st Limits 30 - 40 - 0.03948 0.0333333 67 30 - 50 * - 0.03948 0.0666667 67 30 - 60 * -0.311111 0.03948 67 40 - 50 - 0.03948 0.0333333 67 40 - 60 * -0.277778 0.03948 67 50 - 60 * -0.244444 0.03948 67 Phụ lục 5. Xử lý ANOVA và LSD đối với kết quả khảo sát nhiệt độ cho quá trình trích ly thông qua hàm lượng polyphenol. Summary Statistics for E.ham luong polyphenol nhi Coun Averag Standard Coeff. of Minim Maximu Range Stnd. et t e deviation variation um m skewness do 30 3 3.5263 0.032411 0.919118% 3.4939 3.55877 0.06482 0.0 6 4 5 28 40 3 4.0881 0.018712 0.45773% 4.0665 4.09896 0.03241 -1.22474 6 7 5 14 50 3 4.8228 0.021607 0.448029% 4.8012 4.84443 0.04321 0.0 2 6 1 52 60 3 5.2441 0.028584 0.545066% 5.2117 5.26577 0.05401 -1.03086 7 2 5 9 To 12 4.4203 0.691246 15.6377% 3.4939 5.26577 1.77182 -0.17851 tal 8 5 ANOVA Table for E.ham luong polyphenol by nhiet do Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 5.25066 3 1.75022 2607.78 0.0000 groups Within 0.00536922 8 0.0006711 groups 52 Total (Corr.) 5.25603 11 8
Đồ án tốt nghiệp Table of Means for E.ham luong polyphenol by nhiet do with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error nhiet Count Mean (pooled Lower Upper do s) limit limit 30 3 3.5263 0.01495 3.50197 3.55075 6 72 40 3 4.0881 0.01495 4.06377 4.11255 6 72 50 3 4.8228 0.01495 4.79843 4.84721 2 72 60 3 5.2441 0.01495 5.21978 5.26856 7 72 Total 12 4.4203 8 Multiple Range Tests for E.ham luong polyphenol by nhiet do Method: 95.0 percent LSD nhiet Count Mean Homogeneous do Groups 30 3 3.5263 X 6 40 3 4.0881 X 6 50 3 4.8228 X 2 60 3 5.2441 X 7 Contra Sig. Differenc +/- st e Limits 30 - 40 * -0.561798 0.04877 82 30 - 50 * -1.29646 0.04877 82 30 - 60 * -1.7178 0.04877 82 40 - 50 * -0.734659 0.04877 82 40 - 60 * -1.15601 0.04877 82 50 - 60 * -0.421348 0.04877 82 9
Đồ án tốt nghiệp Phục lục 6. Kết quả xác định ảnh hưởng của tỉ lệ NL: DM trong dung môi EtOH. Xử lý ANOVA và LSD đối với kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi cho quá trình trích ly thông qua tỉ lệ thu hồi. Summary Statistics for J. ti le thu hoi % J.ti Coun Average Standard Coeff. of Minim Maximum Range Stnd. le t deviation variation um skewness 1:20 3 0.41570 0.054162 13.0289 0.368 0.474767 0.10641 0.655518 9 3 % 356 1 1:30 3 0.50620 0.071204 14.0665 0.425 0.559851 0.13443 -1.03644 1 7 % 419 2 1:40 3 0.62311 0.074685 11.9858 0.539 0.682226 0.14304 -0.940953 8 4 % 18 6 1:50 3 0.78957 0.095185 12.0553 0.683 0.867184 0.18381 -0.869827 9 9 % 371 3 Tota 12 0.58365 0.159483 27.3251 0.368 0.867184 0.49882 0.633241 l 2 % 356 8 ANOVA Table for J. ti le thu hoi % by J.ti le Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 0.234501 3 0.0781669 13.81 0.0016 groups Within 0.0452839 8 0.00566048 groups Total (Corr.) 0.279785 11 Table of Means for J. ti le thu hoi % by J.ti le with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error J.ti Count Mean (pooled s) Lower Upper le limit limit 1:20 3 0.415709 0.0434376 0.34488 0.486539 1:30 3 0.506201 0.0434376 0.435372 0.57703 1:40 3 0.623118 0.0434376 0.552289 0.693947 1:50 3 0.789579 0.0434376 0.71875 0.860408 Total 12 0.583652 10
Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 7. Xử lý ANOVA và LSD đối với kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi cho quá trình trích ly thông qua hàm lượng polyphenol. Summary Statistics for B.ham luong polyphenol B.t Cou Avera Stand Coeff. of Minimum Maximu Range Stnd. skewness i le nt ge ard variation m devia tion 1:2 3 0.394 0.005 1.45052 0.38764 0.39844 0.0108038 -1.03086 0 123 7168 % 4 4 1:3 3 0.445 0.013 3.02568 0.430856 0.45678 0.0259291 -0.914531 0 981 4939 % 5 1:4 3 0.495 0.011 2.30667 0.482714 0.50432 0.0216076 -1.03086 0 678 4337 % 2 1:5 3 0.510 0.009 1.93848 0.502161 0.52160 0.0194468 0.6613 0 804 9018 % 8 5 To 12 0.461 0.048 10.5364 0.38764 0.52160 0.133967 -0.587762 tal 646 6411 % 8 ANOVA Table for B.ham luong polyphenol by B.ti le Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 0.0251385 3 0.0083794 75.57 0.0000 groups 8 Within 0.00088708 8 0.0001108 groups 8 86 Total (Corr.) 0.0260255 11 Table of Means for B.ham luong polyphenol by B.ti le with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error B.ti le Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 1:20 3 0.394123 0.00607964 0.384209 0.404036 1:30 3 0.445981 0.00607964 0.436068 0.455894 1:40 3 0.495678 0.00607964 0.485765 0.505592 1:50 3 0.510804 0.00607964 0.50089 0.520717 Total 12 0.461646 11
Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for B.ham luong polyphenol by B.ti le Method: 95.0 percent LSD B.ti le Count Mean Homogeneous Groups 1:20 3 0.394123 X 1:30 3 0.445981 X 1:40 3 0.495678 X 1:50 3 0.510804 X Contrast Sig. Difference +/- Limits 1:20 - * - 0.01982 1:30 0.0518583 69 1:20 - * -0.101556 0.01982 1:40 69 1:20 - * -0.116681 0.01982 1:50 69 1:30 - * - 0.01982 1:40 0.0496975 69 1:30 - * - 0.01982 1:50 0.0648228 69 1:40 - - 0.01982 1:50 0.0151253 69 12
Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 8: Xử lý ANOVA và LSD đối với kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi cho quá trình trích ly thông qua ti le thu hồi. Summary Statistics for H. ti le thu hoi % H.th Cou Averag Standard Coeff. of Minimu Maximu Range Stnd. oi nt e deviation variation m m skewnes gian s 24h 3 0.1576 0.0001149 0.0729115 0.15753 0.15775 0.0002209 -0.91385 64 55 % 5 6 09 48h 3 0.1798 0.0001409 0.0783642 0.17969 0.17995 0.0002586 -1.15244 56 43 % 5 3 93 72h 3 0.2004 0.0001316 0.0656822 0.20029 0.20054 0.0002556 - 37 52 % 1 7 13 0.81385 7 Total 9 0.1793 0.018526 10.3313% 0.15753 0.20054 0.0430115 - 19 5 7 0.06839 14 ANOVA Table for H. ti le thu hoi % by H.thoi gian Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0027456 2 0.0013728 81695.28 0.0000 Within groups 1.00824E-7 6 1.68039E-8 Total (Corr.) 0.0027457 8 Table of Means for H. ti le thu hoi % by H.thoi gian with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error H.thoi gian Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 24h 3 0.157664 0.0000748419 0.157535 0.157794 48h 3 0.179856 0.0000748419 0.179727 0.179986 72h 3 0.200437 0.0000748419 0.200308 0.200567 Total 9 0.179319 Multiple Range Tests for H. ti le thu hoi % by H.thoi gian Method: 95.0 percent LSD H.thoi gian Count Mean Homogeneous Groups 24h 3 0.157664 X 48h 3 0.179856 X 72h 3 0.200437 X Contrast Sig. Difference +/- Limits 24h - 48h * -0.0221919 0.000258988 24h - 72h * -0.0427731 0.000258988 48h - 72h * -0.0205812 0.000258988 13
Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 9: Xử lý ANOVA và LSD đối với kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi cho quá trình trích ly thông qua hàm lượng polyphenol. Summary Statistics for D.ham luong polyphenol thoi Coun Ave Standard Coeff. of Minimum Maximu Range Stnd. gian t rage deviation variation m skewne ss 24h 3 0.39 0.023372 5.93018% 0.374676 0.42005 0.045376 0.814636 412 2 2 3 48h 3 0.43 0.012030 2.77833% 0.422213 0.44598 0.023768 0.553065 301 6 1 4 6 72h 3 0.44 0.006601 1.47066% 0.441659 0.45462 0.012964 -0.6613 886 23 4 6 2 Tota 9 0.42 0.027904 6.56064% 0.374676 0.45462 0.079948 -1.17505 l 533 6 4 1 4 ANOVA Table for D.ham luong polyphenol by thoi gian Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 0.00476019 2 0.0023800 9.72 0.0131 groups 9 Within 0.00146914 6 0.0002448 groups 57 Total (Corr.) 0.00622933 8 Table of Means for D.ham luong polyphenol by thoi gian with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error thoi Count Mean (pooled s) Lower Upper gian limit limit 24h 3 0.39412 0.009034 0.378491 0.409754 3 33 48h 3 0.43301 0.009034 0.417385 0.448648 6 33 72h 3 0.44886 0.009034 0.433231 0.464493 2 33 Total 9 0.42533 4 Multiple Range Tests for D.ham luong polyphenol by thoi gian Method: 95.0 percent LSD 14
Đồ án tốt nghiệp thoi Count Mean Homogeneous gian Groups 24h 3 0.39412 X 3 48h 3 0.43301 X 6 72h 3 0.44886 X 2 Contras Sig. Difference +/- t Limits 24h - * - 0.03126 48h 0.0388937 3 24h - * - 0.03126 72h 0.0547393 3 48h - - 0.03126 72h 0.0158456 3 15
Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 10 :Xử lý ANOVA và LSD đối với kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi cho quá trình trích ly thông qua ti le thu hồi. Summary Statistics for C. ti le thu hoi % C.nong Count Average Standard Coeff. of Minimum Maxim Range do deviation variation um 60 3 0.14021 0.0175147 12.491% 0.122699 0.1577 0.0350293 9 29 70 3 0.08182 0.0101076 12.3532% 0.070150 0.0876 0.017507 21 8 578 80 3 0.05846 0.0101298 17.326% 0.052613 0.0701 0.01755 62 1 631 90 3 0.03517 0.00001287 0.0366009% 0.035155 0.0351 0.0000247 25 6 803 36 Total 12 0.07891 0.041907 53.1012% 0.035155 0.1577 0.122573 92 6 29 ANOVA Table for C. ti le thu hoi % by C.nong do Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 0.0182951 3 0.0060983 47.69 0.0000 groups 7 Within 0.00102308 8 0.0001278 groups 85 Total (Corr.) 0.0193182 11 Table of Means for C. ti le thu hoi % by C.nong do with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error C.nong Count Mean (pooled s) Lower Upper do limit limit 60 3 0.14021 0.006529 0.129572 0.150865 9 05 70 3 0.08182 0.006529 0.071175 0.092468 21 05 9 4 80 3 0.05846 0.006529 0.04782 0.069112 62 05 4 90 3 0.03517 0.006529 0.024523 0.045816 05 8 2 Total 12 0.07891 92 16
Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for C. ti le thu hoi % by C.nong do Method: 95.0 percent LSD C.nong Count Mean Homogeneous do Groups 90 3 0.03517 X 80 3 0.05846 X 62 70 3 0.08182 X 21 60 3 0.14021 X 9 Contra Sig. Difference +/- st Limits 60 - 70 * 0.0583965 0.02129 25 60 - 80 * 0.0817525 0.02129 25 60 - 90 * 0.105049 0.02129 25 70 - 80 * 0.0233559 0.02129 25 70 - 90 * 0.0466521 0.02129 25 80 - 90 * 0.0232962 0.02129 25 17
Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 11.Xử lý ANOVA và LSD đối với kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi cho quá trình trích ly thông qua hàm lượng polyphenol. Summary Statistics for F.ham luong polyphenol non Cou Averag Standard Coeff. of Minimu Maxim Range Stnd. g do nt e deviation variatio m um skewness n 60 3 0.3933 0.0096833 2.46188 0.38720 0.4044 0.017286 1.20762 3 3 % 8 94 1 70 3 0.2968 0.0016503 0.55600 0.29537 0.2986 0.003241 0.661299 16 1 3% 6 17 14 80 3 0.2305 0.0047092 2.0426 0.22515 0.2337 0.008643 -1.15263 53 7 % 1 94 04 90 3 0.1884 0.0049509 2.62762 0.18409 0.1938 0.009723 0.6613 18 2 % 7 2 42 Tota 12 0.2772 0.0809455 29.1927 0.18409 0.4044 0.220398 0.682844 l 8 % 7 94 ANOVA Table for F.ham luong polyphenol by nong do Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 0.0717875 3 0.0239292 668.51 0.0000 groups Within 0.00028635 8 0.00003579 groups 8 48 Total (Corr.) 0.0720739 11 Table of Means for F.ham luong polyphenol by nong do with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error nong Count Mean (pooled s) Lower Upper do limit limit 60 3 0.39333 0.003454 0.387698 0.398963 21 70 3 0.29681 0.003454 0.291184 0.302449 6 21 80 3 0.23055 0.003454 0.224921 0.236186 3 21 90 3 0.18841 0.003454 0.182786 0.194051 8 21 Total 12 0.27728 18
Đồ án tốt nghiệp Table of Means for F.ham luong polyphenol by nong do with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error nong Count Mean (pooled s) Lower Upper do limit limit 60 3 0.39333 0.003454 0.387698 0.398963 21 70 3 0.29681 0.003454 0.291184 0.302449 6 21 80 3 0.23055 0.003454 0.224921 0.236186 3 21 90 3 0.18841 0.003454 0.182786 0.194051 8 21 Total 12 0.27728 Multiple Range Tests for F.ham luong polyphenol by nong do Method: 95.0 percent LSD nong Count Mean Homogeneous do Groups 90 3 0.18841 X 8 80 3 0.23055 X 3 70 3 0.29681 X 6 60 3 0.39333 X Contra Sig. Difference +/- st Limits 60 - 70 * 0.096514 0.01126 49 60 - 80 * 0.162777 0.01126 49 60 - 90 * 0.204912 0.01126 49 70 - 80 * 0.0662633 0.01126 49 70 - 90 * 0.108398 0.01126 49 80 - 90 * 0.0421348 0.01126 49 19
Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 12. Xử lý ANOVA và LSD đối với kết quả khảo sát khả năng kháng nấm của dịch chiết trong dung môi nước. Summary Statistics for hieu qua khang nam % nong do Count Avera Standard Coeff. of Minim Maxim Range polyphenol ge deviation variation um um 3.505 3 5.826 0.717765 12.3189 5.1886 6.6037 1.41509 55 % 8 7 4.693 3 7.231 0.516676 7.14497 6.6350 7.5471 0.912099 33 % 7 7 5.125 3 9.261 0.260492 2.8125% 8.9622 9.4339 0.471698 97 6 6 6.551 3 10.04 0.248512 2.47354 9.8591 10.328 0.469484 68 % 5 6 Total 12 8.091 1.78409 22.0485 5.1886 10.328 5.13996 66 % 8 6 ANOVA Table for hieu qua khang nam % by nong do polyphenol Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 33.1892 3 11.0631 48.54 0.0000 groups Within 1.82351 8 0.227939 groups Total (Corr.) 35.0127 11 Table of Means for hieu qua khang nam % by nong do polyphenol with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error Level Count Mean (pooled Lower Upper s) limit limit 3.505 3 5.8265 0.27564 5.37709 6.27602 5 4 4.693 3 7.2313 0.27564 6.78186 7.68079 3 4 5.125 3 9.2619 0.27564 8.8125 9.71143 7 4 6.551 3 10.046 0.27564 9.59734 10.4963 8 4 Total 12 8.0916 6 20
Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for hieu qua khang nam % by nong do polyphenol Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups 3.505 3 5.8265 X 5 4.693 3 7.2313 X 3 5.125 3 9.2619 X 7 6.551 3 10.046 X 8 Contrast Sig. Differenc +/- e Limits 3.505 - * -1.40477 0.89892 4.693 7 3.505 - * -3.43541 0.89892 5.125 7 3.505 - * -4.22025 0.89892 6.551 7 4.693 - * -2.03064 0.89892 5.125 7 4.693 - * -2.81547 0.89892 6.551 7 5.125 - - 0.89892 6.551 0.784834 7 21
Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 13. Xử lý ANOVA và LSD đối với kết quả khảo sát khả năng kháng nấm của dịch chiết trong dung môi ethanol. Summary Statistics for hieu qua khang nam % nong do Count Averag Standard Coeff. of Minimu Maximu Range polyphenol e deviation variation m m 0.188 3 1.5101 0.00874773 0.579281% 1.5 1.51515 0.01515 15 0.231 3 2.4711 0.00703983 0.284877% 2.46305 2.47525 0.01219 8 33 0.297 3 2.7548 0.273836 9.94033% 2.43902 2.92683 0.48780 5 0.393 3 2.5757 0.267547 10.3871% 2.41546 2.88462 0.46915 5 6 Total 12 2.3279 0.530214 22.7759% 1.5 2.92683 1.42683 6 ANOVA Table for hieu qua khang nam % by nong do polyphenol Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 2.799 3 0.933001 25.44 0.0002 groups Within 0.293388 8 0.0366734 groups Total (Corr.) 3.09239 11 Table of Means for hieu qua khang nam % by nong do polyphenol with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error Level Count Mean (pooled Lower Upper s) limit limit 0.188 3 1.5101 0.11056 1.32982 1.69039 4 0.231 3 2.4711 0.11056 2.2909 2.65147 8 4 0.297 3 2.7548 0.11056 2.57452 2.93509 4 0.393 3 2.5757 0.11056 2.39547 2.75604 5 4 Total 12 2.3279 6 22
Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for hieu qua khang nam % by nong do polyphenol Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups 0.188 3 1.5101 X 0.231 3 2.4711 X 8 0.393 3 2.5757 X 5 0.297 3 2.7548 X 23