›

Khóa luận Góp phần nghiên cứu thành phần saponin trong sâm Việt Nam (Panax vietnamensis)

pdf 44 trang thiennha21 18/04/2022 6770
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Góp phần nghiên cứu thành phần saponin trong sâm Việt Nam (Panax vietnamensis)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_gop_phan_nghien_cuu_thanh_phan_saponin_trong_sam_v.pdf

Nội dung text: Khóa luận Góp phần nghiên cứu thành phần saponin trong sâm Việt Nam (Panax vietnamensis)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THỦY GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2016.Y Người hướng dẫn 1: PGS.TS. Nguyễn Hữu Tùng Người hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Thị Thanh Bình Hà Nội – 2021
  3. LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực nghiệm và hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ vô cùng quý báu của các thầy cô giáo của Trường Đại học Phenikaa và Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng với gia đình và bạn bè. Trước hết, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Nguyễn Hữu Tùng – Khoa Dược, Trường Đại học Phenikaa, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian, hết lòng chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện và đóng góp ý kiến cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Thị Thanh Bình – Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội vì đã dành thời gian hướng dẫn, động viên, góp ý cho em trong quá trình hoàn thiện khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể Ban giám hiệu, các thầy cô trong Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội và Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho em làm khóa luận tốt nghiệp và giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập. Em xin gửi lời cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2016.Y đã đồng hành cùng em trong suốt 5 năm học qua. Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến chị Đặng Thị Ngần, người đã nhiệt tình, giúp đỡ chỉ bảo, góp ý cho em trong suốt quá trình thực nghiệm và hoàn thiện đề tài. Cuối cùng, em vô cùng biết ơn gia đình đã luôn ở bên động viên, khích lệ và sát cánh, giúp em có thêm động lực cố gắng để có kết quả như ngày hôm nay. Hà Nội, ngày 16 tháng 5 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Thị Phương Thủy
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu, chữ Tên đầy đủ viết tắt 1 ACN Acetonitril 2 n-BuOH n-butanol 4 CH3COOH Acid acetic 3 CHCl3 Chloroform 5 DAD Detector mảng điốt (Diode array detector) 6 EtOAc Ethyl acetat 7 G-Rb1 Ginsenosid-Rb1 8 G-Re Ginsenosid-Re 9 G-Rg1 Ginsenosid-Rg1 10 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performace liquid chromatography) 11 MeOH Methanol 12 M-R2 Majonosid-R2 13 SKLM Sắc ký lớp mỏng 14 SVN Sâm Việt Nam
  5. DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1. Hình ảnh cây sâm Việt Nam (P. vietnamensis Ha & 1 3 Grushv) 2 Hình 1.2. Thân rễ của sâm Việt Nam 4 3 Hình 1.3. Lá của sâm Việt Nam 4 4 Hình 1.4. Hoa và quả khi chín của sâm Việt Nam 5 Hình 1.5. Bản vẽ cây sâm Việt Nam (A) và vùng phân bố tự 5 5 nhiên ở Việt Nam (B) 6 Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của ginsenosid-Rb1 8 Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của ginsenosid-Rg1 và ginsenosid- 7 10 Re 8 Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của majonosid-R2 11 Hình 2.1. Mẫu dược liệu Sâm Việt Nam sau sơ chế và sấy 9 19 khô được sử dụng trong nghiên cứu Hình 2.2. Mẫu dược liệu và chế phẩm chứa sâm Việt Nam 10 19 làm ví dụ minh họa cho phân tích (Mẫu số 1~ 5) 11 Hình 3.1. Sắc ký đồ của mẫu trắng 26 Hình 3.2. Sắc ký đồ phân tích mẫu cao sâm Việt Nam đã 12 28 giám định. 13 Hình 3.3. Sắc ký đồ phân tích mẫu số 1 28 14 Hình 3.4. Sắc ký đồ phân tích mẫu số 2 29 15 Hình 3.5. Sắc ký đồ phân tích mẫu số 3 29 16 Hình 3.6. Sắc ký đồ phân tích mẫu số 4 29
  6. DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1. Các saponin dẫn chất của 20(S)- 1 7 protopanaxadiol Bảng 1.2. Các saponin dẫn chất của 20(S)- 2 9 protopanaxatrol 3 Bảng 1.3: Các saponin có cấu trúc Ocotillol 10 4 Bảng 1.4: Các saponin dẫn chất của acid oleanolic 11 Bảng 1.5. Thành phần acid béo phần dưới mặt đất sâm 5 12 Việt Nam Bảng 1.6. Thành phần acid amin ở phần dưới mặt đất 6 12 sâm Việt Nam Bảng 1.7. Thành phần các nguyên tố đa và vi lượng ở 7 13 phần dưới mặt đất sâm Việt Nam Bảng 3.1. Kết quả phân tích thành phần saponin chính 8 23 trong sâm Việt Nam bằng sắc ký lớp mỏng 9 Bảng 3.2: Chương trình rửa giải pha động sắc ký lỏng 25 hiệu năng cao Bảng 3.3. Kết quả phân tích các mẫu chuẩn bằng sắc ký 10 26 lỏng hiệu năng cao
  7. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về sâm Việt Nam 3 1.1.1. Phân loại 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật 3 1.1.3. Phân bố, sinh thái 5 1.1.4. Thành phần hóa học 6 1.1.5. Tính vị, công năng 14 1.1.6. Công dụng 14 1.1.7. Tác dụng dược lý 14 1.2. Tổng quan về các phương pháp sắc ký 17 1.2.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng 17 1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 18 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.1. Mẫu dược liệu sâm Việt Nam 19 2.1.2. Chất chuẩn ginsenosid 20 2.1.3. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị 20 2.2. Nội dung nghiên cứu 20 2.3. Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1. Phương pháp phân tích các thành phần saponin chính trong sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng. 21 2.3.2. Phương pháp phân tích các thành phần saponin chính trong sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao. 21
  8. CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1. Phân tích các thành phần saponin chính trong sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng 23 3.2. Phân tích các thành phần saponin chính trong sâm Việt Nam bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 25 3.3. Bàn luận 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay nhu cầu sử dụng thuốc có nguồn gốc dược liệu ngày càng tăng do đó việc đi sâu vào nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao đang rất được quan tâm. Đặc biệt là Việt Nam, một quốc gia có hệ sinh thái vô cùng phong phú, đa dạng cùng với nguồn tài nguyên cây thuốc dồi dào và truyền thống sử dụng dược liệu có nguồn gốc từ lâu đời đã thúc đẩy sự phát triển, đổi mới các sản phẩm từ tự nhiên. Sâm Việt Nam là loại nhân sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới, đây là loài đặc hữu của hệ thực vật Việt Nam, được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973 tại vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum [2, 5]. Sâm Việt Nam là một loài thảo dược quý hiếm, có nhiều tác dụng như kích thích thần kinh, giúp tăng hoạt động vận động và trí nhớ ở liều thấp nhưng với liều cao lại gây ức chế thần kinh, ngoài ra còn có tác dụng tăng sinh lực, chống mệt mỏi, kích thích hệ miễn dịch, chống oxy hoá Phần thân rễ/củ của sâm là bộ phận chính được sử dụng làm thuốc còn phần thân lá thường dùng làm trà thảo mộc [1, 5]. Saponin là thành phần chính có hoạt tính sinh học trong sâm Việt Nam cũng như các cây thuộc chi Panax [1]. Trong các nghiên cứu so sánh thành phần hóa học của sâm Việt Nam thì thấy hàm lượng saponin có trong phần thân rễ/củ vượt trội hơn so với các loài sâm khác, đặc biệt trong loại sâm này có chứa một lượng lớn các saponin dammaran dạng ocotillol, đây chính là yếu tố quyết định sự khác biệt giữa sâm Việt Nam so với sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc trong trị liệu [1, 5, 9]. Các nghiên cứu hiện nay hầu như đều tập trung vào thành phần hóa học của phần dưới mặt đất trong sâm Việt Nam và đã phân lập được 52 saponin triterpen dạng dammaran trong đó có 26 hợp chất mới được phân lập từ thân rễ của sâm. Các saponin chính phải kể đến như majonosid-R2, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rg1 và ginsenosid-Re [1, 4, 5]. Việc nghiên cứu thành phần hóa học của sâm Việt Nam đem lại ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn cao. Hiện nay các kỹ thuật sắc ký được sử dụng rộng rãi, phổ biến dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp và được ứng dụng trong các lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm, môi 1
  10. trường, vì nhiều lý do như có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt [10]. Trên cơ sở kế thừa và phát triển tiếp các nghiên cứu về sâm Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài “Góp phần nghiên cứu thành phần saponin trong sâm Việt Nam (Panax vietnamensis)” với hai mục tiêu: 1. Phân tích các thành phần saponin chính của sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng. 2. Phân tích các thành phần saponin chính của sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao. 2
  11. CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về sâm Việt Nam 1.1.1. Phân loại Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Mộc lan (Magnoliophyta) Lớp: Mộc lan (Magnoliopsida) Bộ: Hoa tán (Apiales) Họ: Ngũ gia bì (Araliaceae) Chi: Sâm (Panax) Loài: Panax vietnamensis Ha et Grushv Hình 1.1. Hình ảnh cây sâm Việt Nam (P. vietnamensis Ha & Grushv) [32] SVN còn có những tên gọi khác như sâm Ngọc Linh, sâm Khu Năm (sâm K5), sâm trúc (sâm đốt trúc, trúc tiết nhân sâm) củ ngải rọm con hay cây thuốc giấu [1, 4, 9] 1.1.2. Đặc điểm thực vật SVN là cây thân thảo, sống nhiều năm, cao từ 40-80 cm, có khi đến 1m. Thân rễ mập có đường kính 1 - 3,5 cm, mọc bò ngang như củ gừng, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30 - 40 cm, có thể hơn, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh lụi hàng năm để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, đôi khi ở một số cây phần cuối thân rễ có củ gần hình cầu, đường kính đến 5 cm [1,9,11]. 3
  12. Đốt trên cùng của thân rễ tồn tại 1 - 4 thân. Thân khí sinh mảnh, mọc thẳng, nhẵn, cao 40 - 80 cm, rỗng, có 3 mặt hơi tròn có những rãnh nhỏ theo chiều dọc [1, 9, 11]. Hình 1.2. Thân rễ của sâm Việt Nam [33] Lá kép hình chân vịt, mọc vòng, ở ngọn, mỗi lá kép gồm 3 - 5 lá chét [10, 11]; lá chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 - 14 cm, rộng 3 - 5 cm, đầu lá thường nhọn đột ngột, mũi nhọn kéo 1,5 - 2 cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng cưa nhỏ đều, gân bên ở mặt trên của lá chét có nhiều lông cứng dạng gai dài đến 3 mm, mặt dưới ít hơn [6, 9, 11]. Hình 1.3. Lá của sâm Việt Nam [34] Cụm hoa dài 25 cm, gấp 1,5 - 2 lần chiều dài của cuống lá, mọc thành tán đơn ở ngọn thân, đôi khi có thêm 1 - 4 tán phụ hay một hoa đơn độc [1, 9]. Tán hoa chính đường kính 2,5 - 4 cm, có 50 - 120 hoa, hoa màu vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3 - 4 mm; 5 đài nhỏ; 5 cánh hoa; 5 nhị [4, 6, 9]. Bầu 2 ô (nếu thấy 1 ô là do ô còn lại bị chèn ép khó phân biệt), vòi nhụy chẻ 2 ở đầu [4]. Quả mọng, hình trứng, khi chín màu đỏ và thường có 1 chấm đen ở trên 4
  13. đỉnh quả. Quả 1 hạt hình thận, quả 2 hạt có hình cầu hơi dẹt dài 7 - 10 mm. Hạt lớn dài 8 mm, vỏ hạt cấu tạo bởi nhiều vết xốp lồi lõm [1, 2, 4, 9, 11]. Hình 1.4. Hoa và quả khi chín của sâm Việt Nam [34] 1.1.3. Phân bố, sinh thái 1.1.3.1. Phân bố A B Hình 1.5. Bản vẽ cây sâm Việt Nam (A) và vùng phân bố tự nhiên ở Việt Nam (B) [35] SVN được phát hiện sau cùng trong số hơn mười loài và dưới loài đã biết của chi Nhân Sâm vào năm 1973, cho đến năm 1985 nó mới được công bố là loài hoàn toàn mới đối với khoa học [1]. Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam, đỉnh cao nhất là đỉnh Ngọc Linh cao 2598m. Sâm mọc tập trung ở dưới chân núi Ngọc Linh trên lớp đất đá granit vàng đỏ có độ mùn cao, tơi xốp [1]. Những điểm vốn trước đây có SVN mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1500 – 2200 m, chủ yếu tập trung ở 1800 – 2000 m, thuộc địa bàn hai huyện Đăk Tô (Tỉnh Kon Tum) và Trà Vinh 5
  14. (tỉnh Quảng Nam) [9]. Tuy nhiên giới hạn phân bố của SVN ở núi Ngọc Linh hiện nay đã có nhiều thay đổi, trong những nghiên cứu thực địa mới nhất cho thấy SVN còn mọc cả ở núi Ngọc Lum Heo thuộc xã Phước Lộc, huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam, đỉnh núi Ngọc Am thuộc Quảng Nam, Đắc Glei thuộc Kontum, núi Langbian ở Lạc Dương tỉnh Lâm Đồng [4, 9]. 1.1.3.2. Đặc điểm sinh thái SVN sinh trưởng ở độ cao từ 1200 – 2100 m so với mặt nước biển, là loại cây thân thảo ưa ẩm và ưa bóng, mọc dày thành đám dưới tán rừng hỗn giao có độ che phủ cao, ít dốc, dọc theo các suối ẩm, trên đất nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20⁰C - 25⁰C ban đêm 15⁰C - 18⁰C. Môi trường rừng có sâm luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây mù, nhiệt độ khoảng 15 - 18 ⁰C, lượng mưa khoảng 3000 mm/năm. Đất rừng tại đây được tạo thành do lá cây mục lâu ngày, có màu nâu rêu, tơi xốp, hàm lượng mùn cao và chứa nhiều nước [4, 6]. SVN sinh trưởng mạnh trong mùa xuân hè. Cây ra hoa quả tương đối đều vào tháng 5 đến tháng 10 hàng năm. Sau khi quả chín rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông khoảng 4 tháng và sẽ nảy mầm vào mùa xuân năm sau [1, 4, 9]. Có thể nhân giống bằng hạt hay bằng thân rễ. Chọn hạt mới thu hoạch, gieo vào bầu hay gieo trực tiếp trên luống. Khi không có hạt, có thể dùng những đoạn thân rễ ngắn dưới đầu mầm có một vết sẹo đem giâm trong bầu hoặc trên luống [4]. Cây có phần thân trên mặt đất lụi hàng năm, để lại vết sẹo rõ. Mỗi năm từ đầu mầm thân rễ (kể cả phần thân rễ phân nhánh) chỉ mọc lên một thân mang lá. Có thể tính tuổi của sâm dựa vào viết sẹo trên thân rễ để lại, mỗi vết sẹo có thể tượng trưng cho một năm tuổi [1, 20]. 1.1.4. Thành phần hóa học SVN đã được phát hiện và tập trung nghiên cứu ở nước ta ngay từ những năm cuối của thế kỷ XX. Từ 1974 đến 1990, Nguyễn Thời Nhâm và cộng sự đã nghiên cứu về thành phần hợp chất saponin trong SVN hoang dại, khởi đầu cho những nghiên cứu toàn diện và sâu hơn các thành phần hóa học có trong SVN [5,9]. Tính đến nay đã có 52 hợp chất saponin đã được phân lập và xác định cấu trúc [5]. Các hợp chất này chủ yếu được phân lập từ rễ và thân rễ của SVN. Ngoài saponin, trong SVN các tác giả cũng xác định được các 6
  15. polyacetylen, acid béo, acid amin, glucid, tinh dầu và một số yếu tố vi lượng [9, 11]. Thành phần nhóm chất saponin triterpen có hàm lượng cao nhất (12- 15%) và có số lượng saponin nhiều hơn so với các loài Panax khác đã được nghiên cứu trên thế giới như nhân sâm Triều Tiên, sâm Nhật Bản, sâm Mỹ và tam thất [16, 21]. Trong đó saponin kiểu ocotillo với hàm lượng khá cao là một điểm khác biệt khá lý thú so với các loài sâm khác [11]. 1.1.4.1. Các hợp chất saponin trong sâm Việt Nam Saponin là thành phần hoạt chất chủ yếu của SVN cũng như của các loài sâm khác trên thế giới. Phần dưới mặt đất của SVN đã phân lập và xác định được cấu trúc protopanaxadiol oxid II và 52 hợp chất saponin bao gồm 26 saponin đã biết và 26 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina - ginsenosid- R1-R25 và 20-O-Me-G.Rh1 [1, 5, 8, 9, 16]. Các saponin dammaran là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học, chiếm tỉ lệ rất cao về hàm lượng và số lượng trong thành phần saponin của SVN [9, 16]. Trong đó, các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol gồm 22 hợp chất với đại diện chính là G-Rb1 chiếm 2,0% về hàm lượng [5]. Bảng 1.1 Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol [1, 5] Hàm lượng STT Tên Kiểu R1 R2 (%) 1 G-Rb1* (A) -Glc2- Glc -Glc6- Glc 2,0 -Glc6- 2 G-Rb2 (A) -Glc2- Glc 0,012 Ara(p) 3 G-Rb3* (A) -Glc2- Glc -Glc6-Xyl 0,11 -Glc6- 4 G-Rc (A) -Glc2- Glc 0,013 Ara(f) 5 G-Rd* (A) -Glc2- Glc -Glc 0,87 PG- -Glc2- Glc6- 6 (A) -Glc 0,001 RC1 Ac 7 GY-IX (A) -Glc -Glc6-Xyl 0,002 GY- 8 (A) -Glc -Glc6- Glc 0,036 XVII -Glc2- Glc6- 9 Q-R1 (A) -Glc6- Glc 0,012 Ac 7
  16. -Glc2- Glc2- 10 Q-R1 (A) -Glc6- Glc 0,072 Xyl 11 M-F1 (B) -Glc2- Glc -Glc 0,001 12 VG-R3 (H) -Glc2- Glc -Glc 0,009 -Glc2- Glc2- 13 VG-R7 (A) -Glc 0,01 Xyl 14 VG-R8 (C) -Glc2- Glc -Glc 0,004 15 VG-R9 (B) -Glc2- Glc -Glc 0,004 VG- 16 (E) -Glc2- Glc -Glc 0,002 R13 17 VG-R24 (A) -Glc2-Xyl -Glc 0,001 18 VG-R23 (A) -Glc2- Glc -Ara 0,001 19 VG-R22 (A) -Glc2- Glc -Xyl 0,001 20 VG-R16 (D) -Glc2- Glc -Glc 0,003 21 VG-R21 (G) -Glc2- Glc -Glc 0,001 22 VG-R20 (F) -Glc2- Glc -Glc 0,003 Ghi chú: G = ginsenoside; PG = pseudo-ginsenoside; GY=gypenoside; Q = quinquenoside; N = notoginsenoside; M = majonoside; VG = vina-ginsenoside. *: các saponin chính R1 R2 Ginsenoside Rb1 (G-Rb1) -Glc2-Glc -Glc6-Glc Glc=glucose Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của ginsenosid-Rb1 Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol gồm 17 hợp chất với các đại diện là: Ge-Re, -Rg1. Trong đó G-Rg1 chiếm tỷ lệ cao nhất 1,37% và G-Re chiếm 0,17% [5]. 8
  17. Bảng 1.2. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatrol [1, 5] Hàm lượng STT Tên Kiểu R1 R2 R3 (%) 23 G-Re* (I) -H -Glc2-Rha -Glc 0,17 20-glc- 24 (I) -H -Glc2-Glc -Glc 0,01 G-Rf 25 G-Rg1* (I) -H -Glc -Glc 1,37 26 G-Rh1 (I)20(R),20(S) -H -Glc -H 0,008 27 G-Rh1 (I) -H -Glc -H 0,021 -Glc2- 28 PG-RS1 (I) -H -Glc 0,013 Rha-6Ac 29 N-R1* (I) -H -Glc2-Xyl -Glc 0,36 -Glc6- 30 N-R6 (I) -H -Glc 0,01 aGlc -Glc2- 31 VG-R4 (I) -H -Glc 0,004 Glc 32 VG-R12 (K) -H -Glc -H 0,005 33 VG-R15 (J) -H -Glc -Glc 0,003 34 VG-R17 (K) -H -Glc -Glc 0,002 35 VG-R18 (K) -H -Glc -Glc 0,002 -Glc2- 36 VG-R19 (L) -H -Glc 0,006 Glc OMe- 37 (I) -H -Glc -CH3 0,015 GRh1 38 VG-R25 (G) -H -Glc -Glc 0,003 39 G-Rh4 (M) -H -Glc -H 0,014 Ghi chú: *: các saponin chính trong thành phần saponin dẫn chất protppanaxatriol. Glc: β-D-glucopyranosyl; α-Glc: α-glucopyranosyl; GlcA: β- D-glucoronopyranosyl; Rha: α-L-rhamnopyranosyl; Xyl: β-D-xylopyranosyl; Ara: α-arabinopyranosyl; Ara(f): α-L-arabinofuranosyl; Ara(p): α-L- arabinopyranosyl; Ac: acetyl. 9
  18. R1 R2 Ginsenoside Rg1 (G-Rg1) -Glc -Glc Ginsenoside Re (G-Re) -Glc2-Rha Glc=glucose; Rha=rhamnose Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của ginsenosid-Rg1 và ginsenosid-Re Các saponin có cấu trúc Ocotillol bao gồm 11 hợp chất với các đại diện là: majonosid-R1 và -R2. Đặc biệt M-R2 chiếm 5,29% hàm lượng saponin và là hợp chất chủ yếu của SVN so với thành phần saponin trong các loài sâm khác trên thế giới và gấp 48 lần hiệu suất chiết được từ Panax japonicum C.A. Mey. var. major (Burk.) C.Y.Wu et K.M.Feng [5]. Bảng 1.3: Các saponin có cấu trúc Ocotillol [1, 5] Hàm STT Tên Kiểu R1 R2 lượng (%) 40 PG-RT4 (N) -Glc -CH3 0,065 2 41 24(S)-PG-F11 (N) -Glc -Rha -CH3 0,005 2 42 M-R1* (N) -Glc -Glc -CH3 0,14 2 43 M-R2 * (N) -Glc -Xyl -CH3 5,29 2 44 VG-R1 (N) -Glc -Rha-6Ac -CH3 0,033 2 45 VG-R2 (N) -Glc -Xyl-6Ac -CH3 0,014 2 46 VG-R5 (N) -Glc -Xyl4-aGlc -CH3 0,008 2 47 VG-R6 (N) -Glc -Xyl-6Ac -CH3 0,006 2 48 VG-R14 (N) -Glc -Xyl -CH2OH 0,02 49 VG-R10 (O) -Glc -CH3 0,007 2 50 VG-R1 (O) -Glc -Xyl -CH3 0,03 Ghi chú: *: các saponin chính trong thành phần có cấu trúc ocotillol H= hemsloside 10
  19. Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của majonosid-R2 Hai saponin dẫn chất của acid oleanolic chiếm tỉ lệ rất thấp với Hemsloside –Ma3 được phát hiện đầu tiên trong một loài Panax thuộc họ Nhân sâm [7]. Bảng 1.4: Các saponin dẫn chất của acid oleanolic [1, 5] STT Tên Kiểu R1 R2 Hàm lượng (%) 51 G-R0 (P) -Glc2-Glc -Glc 0,038 52 H-Ma3 (P) -Glc2-Glc-3Ara(p) -Glc 0,05 Từ phần trên mặt đất của SVN đã phân lập được 19 saponin damaran bao gồm 11 saponin đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới, được đặt tên là vinaginsenosid-L1-L8 [1, 5, 16, 18]. Khác với thành phần saponin từ phần dưới mặt đất của SVN , các saponin dẫn chất của 20S - protopanaxadiol chiếm tỷ lệ rất cao trong thành phần saponin phần trên mặt đất với đại diện chính là notoginsenosid-Fc, G-Rb3, N-Fe và VG-L2. Các saponin có cấu trúc cotillol chiếm tỷ lệ thấp với đại diện chính là VG-R1 [1,5]. 1.1.4.2. Hợp chất polyacetylen Từ phần dưới mặt đất của SVN đã phân lập được 7 hợp chất ở phân đoạn ít phân cực. 5 hợp chất đã được xác định cấu trúc với panaxynol và heptadeca- 1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là 2 polyacetylen và hai hợp chất mới là 10- acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và heptadeca-1,8(E), 10(E)-trien- 4,6-diyn-3,10-diol [5]. 11
  20. 1.1.4.3. Thành phần acid béo Trong SVN đã xác định được 17 acid béo từ 8 - 20 cacbon, trong đó chiếm tỷ lệ lớn nhất là acid linoleic (40,04%); acid palmitic (29,62%); acid oleic (13,26%); acid stearic (4,48%) và acid linolenic (2,61%) [5] Bảng 1.5. Thành phần acid béo phần dưới mặt đất sâm Việt Nam [1,5,7] STT Số cacbon của hợp chất (%) Tên của acid béo 1 8C vết Acid caprylic 2 10C vết Acid capric 3 11C vết 4 12C 0,22 Acid lauric 5 13C 0,31 6 14C 1,33 Acid myristic 7 15C 0,40 Acid pentadecausic 8 15C-1 0,31 9 16C 29,62 Acid palmitic 10 16C-1 vết Acid palmitoleic 11 17C 1,13 Acid heptadecausic 12 17C-1 vết 13 18C 4,48 Acid stearic 14 18C-1 13,26 Acid oleic 15 18C-2 40,04 Acid linoleic 16 18C-3 2,61 Acid linolenic 17 20C 1,51 Acid arachidic 1.1.4.4. Thành phần acid amin Bằng phương pháp sắc ký lỏng trên máy Beckman multichrom đã xác định được 18 acid amin. Thành phần này bao gồm đủ 8 acid amin cần thiết cho cơ thể, một số acid amin có tỷ lệ rất cao như arginin 46,66%, lysin 17,90% và trytophan 10,20% đã được xác định có tính chống lão hoá tế bào [5]. Bảng 1.6. Thành phần acid amin ở phần dưới mặt đất sâm Việt Nam [1,5] STT Acid amin Acid amin (%) Acid amin thủy giải (%) 1 Tryptophan 10,20 - 2 Lysin 17,90 5,29 3 Histidin 1,02 2,59 12
  21. 4 Arginin 46,66 12,90 5 Acid Aspartic 7,60 10,38 6 Threonin 1,20 5,19 7 Serin 5,12 5,19 8 Acid Glutamic 2,05 6,49 9 Prolin 3,07 15,58 10 Glycin 4,10 5,19 11 Alanin - 5,19 12 Cystin 1,53 Vết 13 Valin 0,51 1,29 14 Methionin 0,51 Vết 15 Isoleucin 1,02 2,59 16 leucin 1,02 5,19 17 Tyrosin 0,51 6,49 18 Phenylanin 0,51 6,49 1.1.4.5. Thành phần các nguyên tố vi đa và vi lượng Bằng phương pháp kích hoạt neutron và huỳnh quang tia X đã xác định được 20 nguyên tố đa và vi lượng của phần dưới mặt đất SVN. Trong đó bao gồm một số nguyên tố có tác dụng sinh học như K, Na, Mg, Mn, Cu, Fe, Co, Zn, Se [5]. Bảng 1.7. Thành phần các nguyên tố đa và vi lượng ở phần dưới mặt đất sâm Việt Nam [1,5] Nguyên tố Hàm lượng Nguyên tố vi Hàm lượng STT STT vi lượng (ppm) lượng (ppm) 1 K 9349,19 11 Br 17,27 2 Ca 2844,74 12 Ni 10,61 3 Mg 1950,19 13 Cu 6,23 4 Fe 491,21 14 Cr 4,10 5 Sr 169,87 15 Y 1,51 6 Ti 120,65 16 I 0,24 7 B 140,00 17 Co 0,15 8 Rb 91,62 18 As 0,10 9 Mn 68,10 19 Se 0,05 10 Zn 26,11 20 Hg 0,04 13
  22. 1.1.4.6. Hợp chất sterol. β-sitosterol và daucosterin (β-sitosteryl-3-O-β-D-glucopyranosid[1]. 1.1.4.7. Hợp chất gluxit: (định lượng theo phương pháp Bertran). - Đường tự do: 6,19% - Đường toàn phần: 26,77% [1] 1.1.4.8. Các thành phần khác: - Tinh dầu: 0,05-0,10% - Vitamin C: 0,059%[1] 1.1.5. Tính vị, công năng SVN có vị đắng, hơi ngọt, mùi thơm nhẹ. Quy vào 2 kinh phế, tỳ [1,3,10]. Công năng: - Đại bổ nguyên khí, ích huyết, sinh tân dịch, làm khỏe tinh thần, trí não minh mẫn [2]. - Bổ phế bình suyễn: dùng đối với bệnh ho do phế hư như ho lao, viêm phế quản mạn tính [2]. - Kiện tỳ, sinh tân dịch, chỉ khát. Ngoài ra còn dùng trong các bệnh huyết áp thấp, cơ thể mệt mỏi [2]. 1.1.6. Công dụng SVN thường được sử dụng phối hợp với các vị thuốc bổ khí hoặc bổ huyết khác trong một thang thuốc hay một dạng bào chế. Thân rễ và rễ củ của SVN được dùng làm thuốc bổ toàn thân, tăng lực, chữa suy nhược, mệt mỏi, chống xơ vữa động mạch, giải độc và bảo vệ gan, lại có thể dùng làm thuốc trị viêm họng và hen phế quản mạn tính, điều hoà thần kinh trung ương, điều hoà tim mạch, giảm đường huyết [1,9,10]. 1.1.7. Tác dụng dược lý Rễ và thân rễ của SVN được coi là bộ phận chính được sử dụng cho mục đích y học trong khi các bộ phận thân lá chỉ được sử dụng làm trà thảo mộc [20]. - Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương: SVN liều thấp có tác dụng kích thích thần kinh, làm tăng hoạt động vận động và trí nhớ, nhưng liều cao lại ức chế thần kinh[1]. - Tác dụng chống trầm cảm: 14
  23. SVN có tác dụng chống trầm cảm ở liều uống một lần 200 mg/kg hoặc liều 50-100 mg/kg dùng luôn 7 ngày ở chuột nhắt trắng, M-R2 tiêm trong màng bụng có tác dụng chống trầm cảm ở cả 3 liều: 3,1; 6,2 và 12,5 mg/kg [1]. - Tác dụng tăng sinh lực: SVN có tác dụng tăng lực trong thí nghiệm chuột bơi, làm tăng sinh lực chống lại sực mệt mỏi, giúp phục hồi sức lực [1]. - Tác dụng sinh thích ứng. Trong stress vật lý, cho chuột nhắt trắng uống SVN liều 100 mg/kg có tác dụng làm tăng khả năng chịu đựng đối với nước nóng (37 - 42 ⁰C) và lạnh (- 5 ⁰C) làm kéo dài thời gian sống thêm của chuột thí nghiệm [1]. Trong stress cô lập, chuột nhắt trắng được nuôi riêng từng con trong 4 tuấn, thời gian ngủ khi tiêm natri barbital giảm đi 30%. SVN liều uống 50-100 mg/kg hoặc hoạt chất tiêm trong màng bụng liều 3,1 - 12,5 mg/kg làm thời gian ngủ trở lại gần bình thường [1]. Theo nghiên cứu của Yamasaki Kazuo, ở những con chuột bị căng thẳng về tâm lý, thành phần saponin M-R2 của SVN làm giảm đáng kể các rối loạn liên quan đến căng thẳng [19]. - Tác dụng chống oxy hóa: Trên thí nghiệm in vitro dùng dịch nổi của mô não, gan và phân đoạn vi thể gan của chuột nhắt trắng, saponin SVN ở nồng độ 0,05 - 0,5 mg/kg có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA (malonyl chaldehyd) là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng sinh học [1]. Trong một nghiên cứu, M- R2 chiết xuất từ SVN cho thấy tác dụng bảo vệ tế bào H9C2 chống lại tình trạng thiếu oxy/tổn thương tái oxy hóa thông qua điều chỉnh chức năng ty thể [30]. - Tác dụng kích thích miễn dịch Bột chiết SVN liều uống 500 mg/kg và M-R2 tiêm trong màng bụng có tác dụng làm tăng chỉ số thực bào trong thí nghiệm in vitro và in vivo ở chuột nhắt trắng[1]. Dùng liều Escherichia coli gây chết chuột nhắt trắng. Nếu kết hợp dùng sâm và M-R2 với liều trên sẽ làm tăng tỷ lệ số chuột sống sót. Có lẽ do thuốc làm tăng tác dụng thực bào với Escherichia Coli [1]. - Tác dụng phục hồi máu: 15
  24. Trong thí nghiệm làm giảm hồng cầu và bạch cầu ở động vật thí nghiệm, SVN có tác dụng làm phục hồi số lượng hồng cầu và bạch cầu đã bị giảm [1]. - Các tác dụng dược lý khác: SVN còn có tác dụng tăng cường nội tiết tố sinh dục, điều hòa hoạt động của tim, tác dụng chống tăng cholesterol máu, tác dụng bảo vệ gan do các yếu tố gây độc với gan, có tác dụng chống viêm và ức chế sự phát triển vi khuẩn Streptococcus gây bệnh viêm họng ở người [1]. Từ một nghiên cứu về tác dụng bảo vệ gan của M-R2, phát hiện được rằng M-R2 có thể đã bảo vệ tế bào gan khỏi sự chết tế bào theo chương trình thông qua sự ức chế sản xuất TNF-α bởi các đại thực bào được hoạt hóa và ức chế trực tiếp sự chết tế bào do TNF-α gây ra [14, 27]. Tác dụng dược lý chống ung thư được nghiên cứu nhiều nhất của SVN là cả tác dụng phòng ngừa ung thư và hóa trị liệu ung thư tương quan với các ginsenosides ocotillol. Theo báo cáo của Yamasaki, chiết xuất của SVN thô và các thành phần saponin chính của nó (M-R2, G-Rb1, G-Re, G-Rg1 ) đã cho thấy tác dụng ức chế sự hoạt hóa kháng nguyên của virus Epstein-Barr (EBV- EA) gây ra bởi độc tố gây ung thư 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) và fumonisin B1 mà không có độc tính trên tế bào bình thường [17, 22]. Theo nghiên cứu của Takao Konoshima và các cộng sự thì saponin loại ocotillol là M-R2 thu được từ thân rễ và rễ của SVN thể hiện tác dụng ức chế mạnh nhất trên sự hoạt hóa EBV-EA và tương đối hoạt động hơn acid glycyrrhizic có nguồn gốc từ cây cam thảo được biết đến như một chất thúc đẩy kháng khối u mạnh [12,24]. Trong một nghiên cứu khác trên mô hình in vivo, M-R2 ức chế sự hình thành và phát triển khối u da chuột kích thích bởi 7,12- dimethylbenz[a]anthracene/TPA, nitric oxide (NO)/TPA và peroxynitrite /TPA và u gan chuột gây ra bởi N-nitrosodiethylamine/phenobarbital [13]. Ngoài ra, Panaxynol là thành phần chính của tinh dầu được phân lập từ SVN được cho là có lợi cho việc ngăn ngừa tổn thương thận do thuốc chống ung thư Cisplatin gây ra trên cả in vitro và in vivo [15]. Gần đây một số hợp chất được phân lập từ Panax vietnamensis còn được phát hiện là có hiệu quả trong việc chống lại các phản ứng viêm [26]. 16
  25. 1.2. Tổng quan về các phương pháp sắc ký 1.2.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng - Nguyên tắc Dựa vào hệ số phân tách khác nhau của chất cần phân tích giữa 2 pha: pha động và pha tĩnh. Chất cần phân tích được hấp phụ (hoặc phân bố hoặc trao dổi ion) trên pha tĩnh, pha động chạy qua pha tĩnh đồng thời kéo theo chất cần phân tích. Các thành phần sau khi được phân tách riêng biệt khỏi hỗn hợp được lưu giữ trên pha tĩnh. Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu các chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở các bước sóng 254 nm, 365nm hoặc phun thuốc thử hiện màu hoặc quét lên bề mặt bản mỏng thiết bị densitometer (một thiết bị đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến của chất cần phân tích). Tùy thuộc bản chất của chất phân tích ta có thể sử dụng một trong các phương pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích [10]. - Đại lượng đặc trưng [10] + Hệ số lưu giữ Rf : Đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữ khoảng cách dịch chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động: 푅 Rf = Trong đó: dR là khoảng các từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm) dM là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (cm) ( đo trên cùng đường đi của vết ) Rf có giá trị dao động giữa 0 và 1 + Hệ số lưu giữ tương đối Rr : 푅, Rf = 푅, Trong đó: dR,x là đường đi của chất phân tích (cm) dR,C là đường đi của chất chuẩn (cm) ( giá trị Rr càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất) 17
  26. 1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kỹ thuật để tách hỗn hợp các chất thành các thành phần riêng biệt dựa trên sự tương tác giữa chất phân tích với pha động (thường là chất lỏng) và pha tĩnh (thông thường là các chất rắn). Pha động mang theo chất phân phân tích di chuyển qua pha tĩnh đứng yên [10]. Sơ đồ của một thiết bị HPLC đặc thù gồm có cổng lấy mẫu, bơm và một đầu dò. Cổng lấy mẫu đưa hỗn hợp mẫu và dòng pha động để đi qua cột. Hệ thống bơm đảm bảo tốc độ dòng mong muốn và thành phần của pha động qua cột. Đầu dò tạo ra tín hiệu tỷ lệ với lượng mẫu thành phần đi ra từ cột do đó cho phép phân tích định lượng của những thành phần trong mẫu. Một bộ vi xử lý số và phần mềm điều khiển thiết bị HPLC và cung cấp dữ liệu phân tích. Một vài mẫu bơm cơ trong thiết bị HPLC có thể trộn nhiều dung môi với nhau trong những tỉ mà thay đổi theo thời gian, tạo ra thành phần gradient trong pha động. Các đầu dò như UV/Vis, PDA hay khối phổ được sử dụng phổ biến. Phần lớn các thiết bị HPLC có lò cột để điều chỉnh nhiệt độ phân tách [10]. 18
  27. CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Mẫu dược liệu sâm Việt Nam Mẫu nghiên cứu là SVN (6 năm tuổi) được lấy từ vườn sâm Ngọc Linh trên núi Ngọc Linh thuộc huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam của Viện Nghiên cứu Phát triển Y Dược học Cổ truyền Việt Nam vào tháng 6/2019. Mẫu nghiên cứu được xác định trên cơ sở đặc điểm nhận dạng bởi chuyên gia dược liệu và thực vật học của Trường Đại học Phenikaa. Mẫu nghiên cứu được tạo tiêu bản và được lưu giữ tại Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội và Khoa Dược, Trường Đại học Phenikaa. Hình 2.1. Mẫu dược liệu Sâm Việt Nam sau sơ chế và sấy khô được sử dụng trong nghiên cứu Mẫu dược liệu và chế phẩm chứa SVN làm ví dụ minh họa cho phân tích (Mẫu số 1~ 5): mẫu dược liệu SVN và chế phẩm chứa SVN được đánh số, ký hiệu từ mẫu số 1 đến mẫu số 5. Hình 2.2. Mẫu dược liệu và chế phẩm chứa sâm Việt Nam làm ví dụ minh họa cho phân tích (Mẫu số 1~ 5) 19
  28. 2.1.2. Chất chuẩn ginsenosid Các mẫu chất chuẩn Majonosid R2, Ginsenosid Rb1, Ginsenosid Rg1, Ginsenosid Re được cung cấp bởi Khoa Hóa Phân tích-Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu. Các mẫu chất chuẩn có độ tinh khiết không thấp hơn 95% theo HPLC. 2.1.3. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị 2.1.3.1. Hóa chất - Các dung môi dùng để chiết xuất cao sâm và chạy SKLM: ethanol (EtOH), ethyl acetat (EtOAc), chloroform (CHCl3), methanol (MeOH), acid acetic (CH3COOH), n-butanol (n-BuOH), nước cất hai lần đều đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA). - SKLM tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thường Kieselgel 60 F254 (Merck, Damstadt, Đức). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%/EtOH hơ nóng để phát hiện vết chất. - Dung môi chạy HPLC: acetonitril (Merck, Đức), nước cất hai lần dùng cho phân tích đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V. 2.1.3.2. Dụng cụ, trang thiết bị - Dụng cụ: bình nón, cốc có mỏ, phễu lọc, ống đong, ống nghiệm, pipet chính xác, bình định mức. - Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức), tủ hút. - Máy siêu âm Power Sonic 405 (Hàn Quốc) - Máy ly tâm Dlab DM0412S (Mỹ) - Cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001g, Precisa-Thụy Sĩ). - Màng lọc Cellulose Acetate 0,45 µm. - Đèn soi sắc ký bản mỏng WFH - 203B (Trung Quốc). - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1260 Infinity LC, Mỹ với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động. 2.2. Nội dung nghiên cứu 1. Phân tích định tính các thành phần saponin chính trong sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng. 2. Phân tích các thành phần saponin chính trong sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 20
  29. 2.3.1. Phương pháp phân tích các thành phần saponin chính trong sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng. - Phương pháp: SKLM được thực hiện trên bản mỏng Silicagel 60 F254 (Merk). Qua tra cứu các tài liệu tham khảo cùng với việc khảo sát điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi đã chọn được các hệ dung môi khai triển là CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10), EtOAc-C2H5OH-H2O (8:2:1), n-BuOH-EtOH- CH3COOH (7:1:2). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%/EtOH phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ đến khi xuất hiện màu. Quan sát vết xuất hiện ở ánh sáng thường. 2.3.2. Phương pháp phân tích các thành phần saponin chính trong sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao. 2.3.2.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn Dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 1,0 mg chất chuẩn G -Rb1 rồi pha thành dung dịch gốc tương ứng với nồng độ 1000 μg/mL trong methanol, sau đó siêu âm 10 phút, ly tâm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc Cellulose Acetate 0,45 µm. Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với MeOH để thu được các dung dịch có nồng độ thích hợp để xây dựng dãy dung dịch chuẩn. Tiến hành pha các dung dịch đối chiếu G-Re, G-Rg1 và M-R2 tương tự như G- Rb1 2.3.2.2. Chuẩn bị mẫu thử SVN chứa thành phần chính là saponin, tham khảo các tài liệu về chiết xuất saponin trong dược liệu để tìm ra phương pháp chiết xuất phù hợp nhất với mẫu nghiên cứu là thân rễ và rễ SVN [3] . Quy trình chiết mẫu: Cân 10g thân rễ SVN, sau khi rửa sạch phơi khô, xay – nghiền nhỏ được ngâm chiết kỹ bằng dung môi ethanol 80% 5 lần, với tỷ lệ DL/DM = 1/10, sử dụng thiết bị siêu âm ở 40 oC trong 5 giờ. Thu lấy dịch chiết, tiếp tục thêm dung môi đến ngập dược liệu và chiết đến khi dịch chiết trong suốt (5 lần). Gộp các dịch chiết ethanol lọc qua giấy lọc, gom lại và cất dung môi dưới áp suất giảm thu được 3,3 g cao chiết tổng ethanol. Pha dung dịch mẫu thử: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 100 mg cao ethanol thân rễ SVN cho vào bình định mức 10 ml, thêm 7 ml methanol, 21
  30. lắc siêu âm 10 phút để hòa tan, thêm methanol vừa đủ tới vạch. Lắc đều, ly tâm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc Cellulose Acetate 0,45 µm. 2.3.2.3. Phương pháp phân tích sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao Trong nghiên cứu này, phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng hệ thống Agilent 1260 Infinity LC, Mỹ với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động. - Lựa chọn điều kiện sắc ký: Tham khảo một số tài liệu [3, 23] và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, lựa chọn điều kiện sắc ký để đảm bảo điều kiện phân tích định tính các chất chuẩn và thành phần saponin trong mẫu thử là SVN. - Nhận dạng các pic trên sắc ký đồ Tiến hành sắc ký HPLC các saponin chính theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Nhận dạng pic trên sắc ký đồ dựa vào thời gian lưu tương ứng trên sắc ký đồ của mẫu thử. 22
  31. CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Phân tích các thành phần saponin chính trong sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng Các hệ dung môi khai triển SKLM là CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10), EtOAc-C2H5OH-H2O (8:2:1), n-BuOH-EtOH-C2H5OH (7:1:2). Hình ảnh sắc ký đồ của các mẫu sau khi hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 10%/EtOH, hơ nóng trên bếp điện từ được thể hiện trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả phân tích thành phần saponin chính trong SVN bằng sắc ký lớp mỏng STT Hệ dung môi Hình ảnh Hệ số Rf 1 CHCl3- Rf (Rb1)=0,2125 MeOH-H2O Rf (Rg1)=0,5 (65:35:10) Rf (Re)=0,3375 Rf (MR2)=0,4875 23
  32. 2 EtOAc- Rf (Rb1)=0,0375 C2H5OH-H2O Rf (Rg1)=0,4 (8:2:1) Rf (Re)=0,225 Rf (MR2)=0,35 3 n-BuOH- Rf (Rb1)=0,225 EtOH- Rf (Rg1)=0,6875 CH3COOH Rf (Re)=0,525 (7:1:2) Rf (MR2)=0,475  Nhận xét: - Dựa vào hình ảnh sắc ký đồ và giá trị Rf của các vết, với các hệ dung môi khác nhau, sau khi hiện màu bằng thuốc thử thấy trên sắc ký đồ của mẫu cao SVN đều xuất hiện các vết chất tương ứng với vết của các chất chuẩn G-Rb1, G-Rg1, G-Re và M-R2. Như vậy, kết luận sơ bộ trong mẫu cao SVN có các saponin chính như G-Rb1, G-Rg1, G-Re, M-R2. 24
  33. - Trong ba hệ dung môi khai triển, hệ CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10) cho hình ảnh sắc ký đồ với các vết xuất hiện rõ nét, có màu đặc trưng cho thành phần saponin. Có thể lựa chọn hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10) để phân tích định tính các thành phần saponin chính trong SVN sử dụng phương pháp SKLM. 3.2. Phân tích các thành phần saponin chính trong sâm Việt Nam bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 3.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích các thành phần saponin chính trong sâm Việt Nam bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Qua phân tích tài liệu tham khảo và điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã xây dựng chương trình sắc ký như sau: - Hệ thống máy: Agilent 1260 Infinity LC, Mỹ - Detector: UV-DAD (G7115A) - Cột sắc ký: ZORBAX Eclipse XDB- C18 (Φ4,6 x 250 mm; cỡ hạt 5 μm) - UV detection: 196 nm - Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút - Nhiệt độ cột: 30 oC - Thể tích tiêm mẫu: 20 μL - Pha động: ACN - nước Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình rửa giải như bảng 3.2 Bảng 3.2. Chương trình rửa giải pha động sắc ký lỏng hiệu năng cao Thời gian 0 - 20 20 - 60 60 - 70 70 - 75 75 - 80 80 - 81 81 - 85 (phút) % ACN 20 20 - 45 45 - 85 85 - 100 100 100 - 20 20 3.2.2. Kết quả phân tích các mẫu chuẩn Tiến hành phân tích mẫu trắng theo phương pháp đã xây dựng. Kết quả được thể hiện trong hình 3.1 25
  34. Hình 3.1. Sắc ký đồ của mẫu trắng Phân tích HPLC các mẫu chuẩn theo chương trình đã xây dựng ở trên, ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu, diện tích pic. Kết quả được tổng kết tại Bảng 3.3 . Bảng 3.3. Kết quả phân tích các mẫu chuẩn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Tên Thời Diện tích Nhận xét STT chất Sắc ký đồ gian pic chuẩn lưu tR (mAU*s) (phút) 1 G-Rg1 24,701 6405,16 Trên sắc ký đồ xuất hiện một pic cân đối, rõ nét, đẹp 2 G-Re 26,299 4872,55 Trên sắc ký đồ xuất hiện một pic cân đối, rõ nét, đẹp 26
  35. 3 M-R2 27,271 99,11022 Trên sắc ký đồ xuất hiện tín hiệu thấp 4 G-Rb1 44,993 3979,78 Trên sắc ký đồ xuất hiện một pic cân đối, rõ nét Nhận xét: Sau khi áp dụng chương trình HPLC đã xây dựng ở trên để chạy các mẫu chất chuẩn đã thu được các sắc ký đồ của các mẫu chuẩn G-Rg1, G-Re, G-Rb1 có độ cân đối, rõ nét, đẹp. Tuy nhiên tín hiệu trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn M-R2 lại thấp do trong cấu trúc của M-R2 không có nối đôi nên bắt tín hiệu UV kém. 3.2.3. Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích một số mẫu sâm trong phòng thí nghiệm Áp dụng chương trình phân tích HPLC xây dựng ở trên để bước đầu phân tích định tính sơ bộ hàm lượng các saponin chính trong một số mẫu SVN. Kết quả thu được, trên sắc ký đồ của mẫu cao SVN đã được giám định xuất hiện các pic có thông số thời gian lưu mẫu tương ứng với các pic của các mẫu chuẩn G-Rg1 với tR= 23,777 phút, G-Re với tR=25,275 phút, M-R2 với tR=28,765 phút và G-Rb1 với tR = 44,997 phút. Từ đó có thể kết luận sơ bộ trong mẫu cao SVN đã được giám định có chứa các chất G-Rg1, G-Re, M-R2 và G-Rb1. 27
  36. Rb1 Rg1 Re MR2 Hình 3.2. Sắc ký đồ phân tích mẫu cao sâm Việt Nam đã giám định. Trên sắc ký đồ của mẫu số 1 thấy xuất hiện các pic có thông số thời gian lưu mẫu tương ứng với thời gian lưu của các mẫu chuẩn G-Rg1, G-Re và G- Rb1 với tR lần lượt tương ứng là tR=23,777 phút, tR=25,275 phút và tR=45,331 phút. Do đó, kết luận sơ bộ trong mẫu số 1 có chứa các saponin G-Rg1, G-Re và G-Rb1. Rb1 Rg1 Re Hình 3.3. Sắc ký đồ phân tích mẫu số 1. Qua phân tích HPLC cho thấy trên sắc ký đồ của mẫu số 2 và mẫu số 3 đều xuất hiện các pic có thời gian lưu mẫu tương ứng với pic của các mẫu chuẩn G-Rg1, M-R2 và G-Rb1 chứng tỏ trong hai mẫu số 2 và mẫu số 3 đều có chứa các chất G-Rg1, M-R2 và G-Rb1. 28
  37. Rg1 Rb1 MR2 Hình 3.4. Sắc ký đồ phân tích mẫu số 2 Rg1 Rb1 MR2 Hình 3.5. Sắc ký đồ phân tích mẫu số 3 Sắc ký đồ của mẫu số 4 xuất hiện pic có thời gian lưu mẫu tương ứng với thời gian lưu mẫu của G-Rb1 với tR=44,850 phút chứng tỏ trong mẫu số 4 có chứa G-Rb1. Rb1 Hình 3.6. Sắc ký đồ phân tích mẫu số 4 29
  38. 3.3. Bàn luận 3.3.1. Về phân tích các thành phần saponin chính trong sâm Việt Nam bằng sắc ký lớp mỏng Chúng tôi sử dụng phương pháp SKLM để định tính các thành phần saponin chính trong SVN. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền, thích hợp để định tính các hợp chất. Khi phun thuốc thử H2SO4 10%/EtOH rồi hơ nóng bản mỏng thấy trên sắc ký đồ của mẫu cao SVN có xuất hiện các vết chất có cùng màu và thời gian lưu mẫu tương ứng với các mẫu chuẩn cho thấy sự có mặt của các saponin G- Rg1, G-Re, M-R2 và G-Rb1 ở mẫu cao SVN. Khi soi huỳnh quang ở các bước sóng 254 nm và 365nm không thấy hiện màu trên bản mỏng. Nghiên cứu đã đề xuất được dung môi phù hợp để định tính các thành phần sponin chính trong SVN bằng phương pháp SKLM. Trong một nghiên cứu xác định các thành phần saponin trong SVN bằng kỹ thuật SKLM thấy rằng G-Rg1 và M-R2 có trong sinh khối mô sẹo, chồi và rễ, trong khi G-Rb1 chỉ có trong sinh khối rễ [29]. Như vậy việc phân tích các thành phần saponin chính trong SVN bằng kỹ thuật SKLM là hoàn toàn phù hợp, góp phần ý nghĩa vào cơ sở dữ liệu về hóa thực vật cho loài sâm thuộc chi Panax này. 3.3.2. Về phân tích các thành phần saponin chính trong sâm Việt Nam bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao SVN là một loài thảo dược quý hiếm, có tiềm năng vô cùng to lớn trong y dược học hiện đại. Do đó việc nghiên cứu thành phần hóa học của SVN đem lại ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn cao. Sắc ký là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để tách, định tính, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp và được ứng dụng trong các lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm, môi trường Trong đó, HPLC được ứng dụng phổ biến nhất vì nhiều lý do như có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp để tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. Theo mô hình in vitro trong nghiên cứu của Dương Tân Nhựt và các công sự, saponin từ cây SVN được phân tích định lượng bằng HPLC với dectector khảo sát ở bước sóng 190 nm (đối với M-R2) và 203 nm (đối với G- 30
  39. Rb1 và G-Rg1) cho thấy cả ba saponin này đều có trong thân lá của SVN với hàm lượng cao [28]. Majonosid-R2 là một trong những saponin chính của SVN thuộc nhóm ocotillol, có hàm lượng khoảng 5 % tính theo khối lượng khô, mang lại tác dụng chính cho loài sâm này [5, 25] tuy nhiên hợp chất này không đáp ứng tốt khi phát hiện bằng đầu dò DAD do trong cấu trúc nhóm M-R2 có nối đôi và không có nhóm mang màu nên hấp thụ UV ở bước sóng rất thấp. Do đó chúng tôi đề xuất phân tích M-R2 bằng những phương pháp khác, ví dụ như LC-MS/MS. Đây là phương pháp phân tích hiện đại có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn, góp phần hoàn thiện cơ sở khoa học về thành phần hoạt chất cũng như tạo tiền đề cho việc phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ SVN. 31
  40. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Sau quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã hoàn thành các mục tiêu đề ra, kết quả thu được như sau: - Đề tài đã định tính sơ bộ được các thành phần saponin chính trong mẫu cao chiết tổng ethanol thân rễ SVN bằng kỹ thuật SKLM, kết quả cho thấy trong mẫu cao sâm phân tích có chứa các thành phần saponin trong SVN là M- R2, G-Rb1, G-Rg1 và G-Re. Lựa chọn hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10) là hệ dung môi phù hợp để phân tích định tính các thành phần saponin chính trong SVN. - Đề tài đã xây dựng được phương pháp phân tích đồng thời các saponin chính trong SVN bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao. Các điều kiện phân tích như sau: dung môi chiết là MeOH, phương pháp chiết siêu âm 3 lần mỗi lần 30 phút; điều kiện phân tích HPLC: Cột C18 (4,6x250 mm; 5 μm), Detector: UV-DAD (G7115A), tốc độ dòng: 1,2 mL/phút, nhiệt độ cột: 30 oC, thể tích tiêm mẫu: 20 μL, hệ gradient pha động gồm CH3CN-H2O. Áp dụng chương trình sắc ký đã xây dựng để phân tích định tính sơ bộ hàm lượng các saponin chính trong một số mẫu SVN trong phòng thí nghiệm. Những kết quả của đề tài đã góp phần nghiên cứu đầy đủ hơn về thành phần saponin của SVN. Về định hướng lâu dài, bên cạnh saponin, việc ứng dụng các kỹ thuật sắc ký sẽ cho phép định tính, định lượng đồng thời nhiều loại hợp chất khác trong SVN cũng như trong các loài khác thuộc chi Panax. Kiến nghị: Từ những kết quả thu được, nghiên cứu sẽ tiếp tục được phát triển theo hướng: - Khảo sát đầy đủ các yếu tố nhằm tối ưu hóa quy trình phân tích các saponin chính trong SVN bằng HPLC. - Tiến tới xây dựng quy trình định lượng các saponin chính trong SVN bằng HPLC. - Tiếp tục phân tích những hợp chất khác trong các bộ phận của SVN. 32
  41. - Đánh giá tác dụng sinh học của các saponin chính trong SVN nhằm tạo cơ sở khoa học vững chắc cho việc ứng dụng dược liệu này để điều trị bệnh và chăm sóc sức khỏe. 33
  42. TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tài liệu Tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 2, NXB Khoa học kỹ thuật, tr. 704-710. [2] Bộ Y tế (2006), Dược liệu học Tập 1, NXB Y Học, tr. 251-256 [3] Bộ Y tế (2018), Dược điển Việt Nam V Tập 2, NXB Y học, tr.1313-1314. [4] Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam (2007), Sách đỏ Việt Nam, Phần II. Thực vật, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, tr. 88-89. [5] Nguyễn Thượng Dong và cs. (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ nhân sâm, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr 141. [6] Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Tập. 2, NXB Trẻ, tr. 516. [7] Lương Thị Hồng (2017), Chiết xuất và đánh giá tác dụng của cao sâm Ngọc Linh trên mô hình gây suy nhược thần kinh ở động vật thực nghiệm, ĐH Y Dược - ĐH Quốc gia Hà Nội. [8] Phạm Duy Linh (2012), Phân lập các hợp chất saponin trong cao sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) đã bảo quản, Trường ĐH Nông lâm TPHCM. [9] Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 808-810. [10] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia TPHCM, tr. 213-246, 407-441. [11] Viện Dược Liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và Kĩ thuật, tr. 434-485, 472-484, 493-511, 581-601. B. Tài liệu Tiếng Anh [12] Takao Konoshima et al. (1999), "Cancer chemopreventive activity of majonoside-R2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis", Cancer Letters. Vol(1), tr. 11-16. [13] Takao Konoshima et al. (1998), "Anti-tumor-promoting Activity of Majonoside-R2 from Veitnamese Ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv.(I)". Vol(8), tr. 834-838. [14] Quan Le Tran et al. (2002), "Hepatoprotective effect of majonoside R2, the major saponin from Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis)". Vol(05), tr. 402-406.
  43. [15] Dahae Lee et al. (2019), "Protective Effect of Panaxynol Isolated from Panax vietnamensis against Cisplatin-Induced Renal Damage: In Vitro and In Vivo Studies". Vol(12), tr. 890. [16] MD Nguyen et al. (1993), "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv. Collected in central Vietnam. I". Vol(11), tr. 2010-2014. [17] Nguyen Minh Duc et al. (2014), "Processed Vietnamese ginseng: Preliminary results in chemistry and biological activity". Vol(2), tr. 154- 159. [18] Yamasaki et al. (1994), "Saponins from Vietnamese Ginseng, Panax vietnamensis HA et Grushv. Collected in central Vietnam. II". Vol(1), tr. 115-122. [19] Kazuo Yamasaki (2000), "Bioactive saponins in Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis". Vol(sup1), tr. 16-24. [20] Le THV, Lee GJ, Vu HKL, Kwon SW, Nguyen MK, Park JH, Nguyen MD (2015). Ginseng saponins in different parts of Panax vietnamensis. Chem. Pharm. Bull. 63, 950-954 [21] Nguyen, T. H., & Phuong, T. T. (2019). Vietnamese Ginseng (Panax vietnamensis Ha and Grushv.): Phylogenetic, Phytochemical, and Pharmacological Profiles. Pharmacognosy Reviews, 13(26). [22] Nguyen TT, Matsumoto K, Yamasaki K, Nguyen MD, Nguyen TN, Watanabe H. Crude saponin extracted from vietnamese ginseng and its major constituent majonoside R2 attenuate the psychological stress and foot shock stress induced antinociception in mice. Pharmacol Biochem Behav. 1995;52(2):427 32 [23] Tung NH, Quang TH, Ngan NTT, Minh CV, Anh BK, Long PQ, Cuong NM, Kim YH (2011). Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus. Chem. Pharm. Bull. 59, 1417-1420. [24] Mizutani K (1994). Biological activities, production, and use of chemical constituents of licorice in food phytochemicals for cancer prevention II. In: Ho CT, Osawa T, Huang MT, Rosen RT, editors. Teas, Spices and Herbs. Washington DC: American Chemical Society. 322-328.
  44. [25] Yang WZ, Hu Y, Wu WY, Ye M, Guo DA (2014). Saponins in the genus Panax L. (Araliaceae): A systematic review of their chemical diversity. Phytochemistry. 106, 7-14. [26] Le, Q. U., Lay, H. L., Wu, M. C., Nguyen, T. H. H., & Nguyen, D. L. (2018). Phytoconstituents and biological activities of Panax vietnamensis (Vietnamese Ginseng): A precious ginseng and call for further research-a systematic review. Natural Product Communications, 13(10), 1934578X1801301036. [27] Tran, Q. L., Adnyana, I. K., Tezuka, Y., Nagaoka, T., Tran, Q. K., & Kadota, S. (2001). Triterpene Saponins from Vietnamese Ginseng (Panax Vietnamensis) and Their Hepatocytoprotective Activity. Journal of Natural Products, 64(4), 456-461. [28] Nhut, D. T., Huy, N. P., Tai, N. T., Nam, N. B., Luan, V. Q., Hien, (2015). Light-emitting diodes and their potential in callus growth, plantlet development and saponin accumulation during somatic embryogenesis of Panax vietnamensis Ha et Grushv. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 29(2), 299-308. [29] Nhựt, D. T. (2009). The effects of some factors on in vitro biomass production of vietnamese ginseng (Panax Vietnamensis Ha et grushv.) And preliminary analysis of saponin content. Vietnam Journal of Biotechnology, 7(3), 357-370. [30] Thu, V. T., Yen, N. T. H., Tung, N. H., Bich, P. T., Han, J., & Kim, H. K. (2021). Majonoside-R2 extracted from Vietnamese ginseng protects H9C2 cells against hypoxia/reoxygenation injury via modulating mitochondrial function and biogenesis. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 36, 127814. Trang web: [31] [32] [33] [34] [35]