Khóa luận Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ cây thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.)

Nội dung text: Khóa luận Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ cây thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.)

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ THÙY ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN MƠ HÌNH GÂY SA SÚT TRÍ NHỚ BẰNG SCOPOLAMIN CỦA CAO CHIẾT GIÀU ALCALOID TỪ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS.) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khĩa: QH.2015.Y Hà Nội – 2020
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: NGUYỄN THỊ THÙY ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN MƠ HÌNH GÂY SA SÚT TRÍ NHỚ BẰNG SCOPOLAMIN CỦA CAO CHIẾT GIÀU ALCALOID TỪ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS.) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khĩa: QH.2015.Y Người hướng dẫn: 1. ThS. Đặng Kim Thu 2. ThS. Bùi Sơn Nhật Hà Nội – 2020
3. LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tơi xin được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới hai giảng viên hướng dẫn là ThS. Đặng Kim Thu và Th.S Bùi Sơn Nhật - giảng viên Bộ mơn Dược lý và Dược lâm sàng, Khoa Y – Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã đưa ra những lời khuyên hữu ích, luơn lắng nghe, động viên và dẫn dắt tơi từng bước chân trên con đường thực hiện đề tài. Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Bùi Thanh Tùng và các thầy cơ thuộc bộ mơn Dược lý – Dược lâm sàng, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã chia sẻ những bài học kinh nghiệm quý báu, nhiệt tình giúp đỡ và động viên tơi. Tơi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới DS. Nguyễn Thị Thu Hồi – Học viên cao học khĩa 22, đại học Dược Hà Nội đã cùng ở bên và nhiệt tình giúp đỡ tơi trong suốt thời gian làm đề tài. Tơi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới các thầy cơ của Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình chỉ bảo, quan tâm và truyền dạy cho tơi những kiến thức quí báu trong suốt 5 năm học tập tại khoa cũng như tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tơi được thực hiện trọn vẹn đề tài này. Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên và sát cánh bên tơi vượt qua những khĩ khăn trong quãng thời gian cịn ngồi trên ghế nhà trường. Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Thùy
4. DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT A Độ hấp thụ (Absorbance) A Amyloid beta ACh Acetylcholin AChE Enzym Acetylcholinesterase ACTI Acetylthiocholin iodid APP Protein tiền thân amyloid (Amyloid Precursor Protein) DL-30 Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg cân nặng DL-60 Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 60 mg/kg cân nặng FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) HFD Chế độ ăn giàu chất béo (High fat diet) Hup A Huperzin A IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) IU Đơn vị quốc tế (International Unit) MDA Malondialdehyd NMDA Thụ thể N-methyl-D-aspartat LD50 Liều dùng gây chết 50% số động vật thử nghiệm OBX Chuột mất vùng khứu giác (Olfactory bulbectomized) SAM Chuột tăng tốc lão hĩa SAMP Chuột tăng tốc lão hĩa nhạy cảm SE Sai số chuẩn (Standard errror) UV-Vis Quang phổ tử ngoại khả kiến
5. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.2.1. Các hợp chất alcaloid của Thạch tùng răng cưa 8 Bảng 2.4.1. Thành phần của hỗn hợp phản ứng 28 Bảng 3.1.1. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa và chất chuẩn donepezil. 29 Bảng 3.1.2. Giá trị IC50 của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa và chất chuẩn quercetin 30
6. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.2.1. Cấu trúc hĩa học của Hup A 8 Hình 2.1.1. Cây Thạch tùng răng cưa Huperzia serrata (Thunb.) Trevis 17 Hình 2.1.2. Phương pháp chiết alcaloid bằng dung mơi hữu cơ trong mơi trường kiềm 18 Hình 2.3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu 20 Hình 2.4.1. Phản ứng giữa các chất trong hỗn hợp phản ứng Ellman 21 Hình 2.4.2. Sơ đồ triển khai mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin in vivo 24 Hình 3.2.1. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến tỷ lệ chuyển tiếp giữa các cánh 31 Hình 3.2.2. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến thời gian tìm thấy bến đỗ ở bài tập cĩ bến đỗ 32 Hình 3.2.3. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa tới thời gian lưu tại gĩc phần tư cĩ bến đỗ ở bài tập khơng cĩ bến đỗ 34 Hình 3.2.4. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hoạt độ AChE trên thể đồng nhất não chuột 35 Hình 3.2.5. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hàm lượng malondialdehyd (MDA) trong mơ não 36
7. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1 - TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về bệnh 3 1.1.1. Khái niệm về bệnh sa sút trí nhớ 3 1.1.2. Các thể sa sút trí nhớ và cơ chế bệnh sinh 4 1.1.3. Các thuốc điều trị bệnh sa sút trí nhớ 6 1.2. Tổng quan về cây Thạch tùng răng cưa 7 1.2.1. Đặc điểm thực vật 7 1.2.2. Phân bố 7 1.2.3. Thành phần hĩa học 7 1.2.4. Tác dụng dược lý 9 1.2.5. Các nghiên cứu hiện nay về tác dụng cải thiện trí nhớ của Thạch tùng răng cưa 9 1.3. Một số mơ hình nghiên cứu tác dụng tăng cường trí nhớ 11 1.3.1. Các mơ hình động gây sa sút trí nhớ trên động vật thử nghiệm 11 1.3.2. Một số thử nghiệm hành vi đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ in vivo . 13 1.3.3. Một số phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE 14 1.3.4. Một số phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hĩa 15 Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.1. Dược liệu nghiên cứu 17 2.1.2. Mẫu nghiên cứu 17 2.2. Phương tiện nghiên cứu 18 2.2.1. Động vật thí nghiệm 18 1.2.2. Hĩa chất, dung mơi 18
8. 1.2.3. Thiết bị, dụng cụ 19 2.3. Nội dung nghiên cứu 19 2.4. Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE và chống oxy hĩa in vitro . 20 2.4.2. Phương pháp đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa trên mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin. 23 2.5. Phương pháp xử lý số liệu 28 Chương 3 – KẾT QUẢ 29 3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE và khả năng dọn gốc tự do in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa 29 3.1.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro 29 3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro 30 3.2. Kết quả đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa trên mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin 31 3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thơng qua thử nghiệm mê lộ Y 31 3.2.2. Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thơng qua thử nghiệm mê lộ nước Morris 32 3.2.3. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hoạt độ AChE trong não 34 3.2.4. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hàm lượng malondialdehyd (MDA) trong mơ não 36 Chương 4 – BÀN LUẬN 38 4.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AchE và chống oxy hĩa in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa 38 4.1.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro 38 4.1.2. Về kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do in vitro 39 4.2. Về kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa . 40 4.2.1. Về kết quả của thử nghiệm hành vi 40 4.2.2. Về kết quả định lượng các marker sinh học 42
9. Chương 5 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
10. MỞ ĐẦU Xã hội ngày càng phát triển, những áp lực của cuộc sống cũng ngày càng tăng cao. Con người bị ảnh hưởng bởi mơi trường và xuất hiện những vấn đề về sức khỏe. Ngồi những nhĩm bệnh phổ biến như bệnh tim mạch và ung thư, sa sút trí nhớ cũng là một bệnh lý mà nhiều người mắc phải. Sa sút trí nhớ là một nhĩm các rối loạn đặc trưng bởi sự suy giảm trí nhớ và nhận thức, cĩ ảnh hưởng đến các hoạt động sống hàng ngày và hoạt động xã hội của người bệnh. Trên thế giới, số lượng người mắc sa sút trí nhớ ngày càng tăng cao với khoảng 50 triệu người mắc và cĩ gần 10 triệu ca mắc mới mỗi năm [47]. Sa sút trí nhớ là căn bệnh cĩ tác động rất lớn đến nền kinh tế. Chi phí dành cho chăm sĩc và điều trị cho bệnh nhân sa sút trí nhớ hàng năm trên thế giới ước tính khoảng 800 tỷ USD (tương đương 1% GDP tồn cầu) và sẽ đạt tới 2000 tỷ USD vào năm 2030 [47]. Sa sút trí nhớ là bệnh lý phổ biến thường gặp ở người cao tuổi. Bệnh diễn biến từ từ tăng dần, suy giảm dần khả năng nhận thức, trí tuệ, dẫn đến mất dần khả năng sinh hoạt độc lập và thường tử vong do mắc phải các bệnh nhiễm trùng, tiết niệu. Mặc dù sa sút trí nhớ cĩ tác động rất lớn đến sức khỏe người cao tuổi và đang cĩ xu hướng ngày càng gia tăng nhưng việc điều trị lại gặp nhiều khĩ khăn do hiểu biết về bệnh cịn hạn chế và việc lựa chọn thuốc điều trị bị giới hạn. Những thuốc dùng điều trị sa sút trí nhớ gồm 2 nhĩm thuốc ức chế cholinesterase và thuốc đối kháng thụ thể N-methyl-D-aspartat (NMDA). Các thuốc kể trên cho thấy tác dụng kiểm sốt triệu chứng tốt nhưng khơng làm thay đổi diễn tiến bệnh. Ngồi ra, giá thành tương đối cao và các tác dụng phụ khơng mong muốn là nhược điểm của các thuốc này. Do đĩ, việc tiếp tục nghiên cứu tìm ra loại thuốc hiệu quả và an tồn hơn trong điều trị sa sút trí nhớ và Alzheimer là rất cần thiết. Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.) là một dược liệu đã được dùng để điều trị bệnh sa sút trí nhớ tại Trung Quốc. Trong dược liệu, Huperzin A (Hup A) là hợp chất alcaloid nổi bật cĩ tác dụng cải thiện trí nhớ [50,61]. Tuy nhiên, ở nước ta mới chỉ cĩ một số nghiên cứu dược lý về cao chiết cồn của Thạch tùng răng cưa trong khi chưa cĩ nghiên cứu nào thực hiện trên đối tượng nghiên cứu là cao chiết alcaloid. Vì vậy, nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa theo 2 mục tiêu sau: 1
11. 1. Đánh giá được tác dụng ức chế enzym AChE và khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa. 2. Đánh giá được tác dụng cải thiện trí nhớ trên mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa. 2
12. Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh 1.1.1. Khái niệm về bệnh sa sút trí nhớ Bệnh sa sút trí nhớ được định nghĩa bởi Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 1992 như sau: Sa sút trí nhớ là một hội chứng bệnh của não, cĩ tính chất mạn tính và tiến triển, cĩ sự xáo trộn nhiều chức năng của não liên quan đến trí nhớ, suy nghĩ, định hướng, học tập, ngơn ngữ và phán đốn. Song, ý thức khơng bị suy giảm. Sự suy giảm trong kiểm sốt cảm xúc, hành vi xã hội hoặc động lực thường đi kèm, đơi khi xuất hiện trước sự suy giảm chức năng nhận thức. Hội chứng xảy ra trong bệnh Alzheimer, bệnh mạch máu não và trong các điều kiện nguyên phát hoặc thứ phát khác ảnh hưởng đến não [66]. Sa sút trí nhớ là một hội chứng bệnh lý phổ biến ở người cao tuổi. Mặc dù bệnh chủ yếu ảnh hưởng đến người già nhưng khơng phải là một phần bình thường của quá trình lão hĩa. Đa số các bệnh nhân rối loạn chức năng nhận thức đều do tổn thương khơng hồi phục các neuron thần kinh hai bên bán cầu (đặc biệt ở vùng vỏ não phối hợp) và/hoặc các cấu trúc dưới vỏ. Bệnh diễn biến từ từ tăng dần, suy giảm dần khả năng nhận thức, trí tuệ, cuối cùng mất hết khả năng sinh hoạt độc lập, phải lệ thuộc hồn tồn vào người khác và thường tử vong do mắc phải các bệnh nhiễm trùng, tiết niệu [1]. Theo báo cáo của hiệp hội Alzhiemer năm 2018, trên thế giới cĩ khoảng 50 triệu người mắc sa sút trí nhớ (chiếm khoảng 5% tổng số người trên 60 tuổi của thế giới). Ước tính cứ mỗi 3 giây sẽ cĩ thêm 1 người mắc sa sút trí nhớ và số người mắc bệnh dự kiến tăng lên đến 152 triệu người vào năm 2050 [47]. Trong đĩ, số ca mắc mới ở châu Á chiếm gần 50% số ca trên thế giới và tập trung chủ yếu ở các nước thu thập thấp – trung bình. Nguy cơ mắc sa sút trí nhớ tăng theo tuổi. Tỷ lệ mắc sa sút trí nhớ của một người tăng gấp đơi sau mỗi 6,3 năm [49]. Việt Nam cĩ xu hướng già hĩa dân số nhanh. Số người cao tuổi (trên 65 tuổi) chiếm hơn 10% tổng dân số [10]. Tuy nhiên, số người mắc sa sút trí nhớ trong nước chưa được đánh giá trên nghiên cứu quy mơ lớn. Một số nghiên cứu được thực hiện với quy mơ nhỏ tại địa phương từ năm 2009 – 2015 ước tính tỷ lệ mắc sa sút trí nhớ chiếm khoảng 4,5 – 5% tổng số người cao tuổi (trên 60 tuổi) [4,9,12]. 3
13. 1.1.2. Các thể sa sút trí nhớ và cơ chế bệnh sinh Sa sút trí nhớ bao gồm nhiều thể bệnh khác nhau. Sa sút trí nhớ trong bệnh Alzheimer và trong bệnh mạch máu là hai thể bệnh thường gặp nhất: 1.1.2.1. Sa sút trí nhớ trong bệnh Alzheimer Bệnh Alzheimer là một bệnh thối hĩa não nguyên phát. Sự tích lũy của các mảng bám amyloid  (A) ở ngoại bào và một dạng bất thường của protein tau ở trong tế bào thần kinh là hai trong nhiều thay đổi ở não của bệnh nhân mắc Alzheimer. Nguyên nhân gây bệnh và cơ chế bệnh sinh chưa được làm sáng tỏ do sự phức tạp của các yếu tố gây bệnh. Nhiều giả thuyết được hình thành để giải thích về nguyên nhân gây bệnh cũng như cơ chế bệnh sinh, ví dụ như giả thuyết về amyloid  (A), protein Tau, cholinergic,  Giả thuyết về cholinergic Trong não, các tế bào thần kinh hệ cholinergic cĩ mặt nhiều ở vùng vỏ não và đồi hải mãi, chịu trách nghiệm về trí nhớ và học tập. Acetylcholin là chất dẫn truyền thần kinh quan trọng của hệ cholinergic, cĩ vai trị hoạt hĩa thụ thể nicotinic và muscarinic. Giả thuyết cholinergic là giả thuyết được đưa ra bởi hai nhà khoa học Davies và Maloney vào năm 1976 [22]. Giả thuyết cho rằng nguyên nhân gây bệnh Alzheimer cĩ thể do giảm số lượng acetylcholin và suy yếu thụ thể nicotinic và muscarinic dẫn đến suy giảm dẫn truyền thần kinh. Giả thuyết là cơ sở cho việc nghiên cứu phát triển thuốc hướng tăng cường hoạt động của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin.  Giả thuyết về amyloid  (A) và protein tau Hardy John và cộng sự đã đưa ra giả thuyết về A để giải thích cho cơ chế bệnh Alzheimer năm 1991 [31]. Những A là kết quả của quá trình biến đổi bất thường của APP – một protein xuyên màng chưa rõ chức năng cụ thể. APP là protein nằm trong màng, được phân cắt bởi 3 loại enzym -, - và -secretase. Một trong những sản phẩm của quá trình phân cắt APP là một loại protein khơng tan tự kết tụ (A40 và A42 ) từ đoạn cắt --. Dưới tác động của Apolipoprotein E (APOE) - protein vận chuyển giúp phân bố cholesterol trong mơ não, những peptid này kết tụ với nhau hình thành các mảng amyloid. Những mảng amyloid gây suy giảm trí nhớ và nhận thức nhờ can thiệp vào sự giao tiếp của các nơ-ron tại synap. Các A kích 4
14. thích quá trình phosphoryl hĩa protein tau và phát triển các đám rối tơ thần kinh NFT. Protein Tau là thành phần quan trọng của tế bào thần kinh cĩ vai trị cố định và ổn định cấu trúc của vi ống ở sợi trục. Trong Alzheimer, protein tau bị phosphoryl hĩa, tách ra và tích lũy thành các đám rối tơ thần kinh NFT, ngăn sự di chuyển của dưỡng chất và các phân tử thiết yếu bên trong tế bào, gây chết tế bào thần kinh. Sự tích lũy A gĩp phần khởi động quá trình phosphoryl hĩa protein tau. Ngược lại, một nghiên cứu khác cho thấy protein tau độc cĩ thể tăng cường sản xuất A [33]. Sự hiện diện của A và tau độc kích hoạt các tế bào miễn dịch ở não (tế bào thần kinh đệm). Các tế bào này cĩ nhiệm vụ loại bỏ các protein độc, song cũng làm chết tế bào thần kinh. Viêm mạn tính được cho là xảy ra khi các tế bào thần kinh đệm khơng cịn đảm nhận được nhiệm vụ của chúng. Khi viêm xảy ra, các yếu tố miễn dịch được kích hoạt kéo theo sự hình thành các gốc tự do phá hủy màng tế bào. Teo não là kết quả do chết các tế bào thần kinh. Ngồi ra, A và tau độc cũng làm giảm khả năng sử dụng glucose ở não gây suy yếu các chức năng bình thường [15].  Giả thuyết về Glutamat Glutamat là chất dẫn truyền thần kinh kích thích nhanh ở não đĩng vai trị quan trọng trong học tập, trí nhớ và vận động. Glutamat hoạt hĩa ba loại thụ thể chính là Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoazolepropionic acid (AMPA), N- methyl-D-aspartat (NMDA) và thụ thể hướng chuyển hĩa. Trong đĩ, thụ thể NMDA cho phép ion Na+ và Ca2+ đi vào tế bào. Quá trình exitotoxicity xảy ra khi kích thích quá mức các thụ thể NMDA bởi glutamat hoặc các acid amin cĩ cấu trúc tương tự, làm nồng độ các ion Ca2+ trong tế bào tăng cao, gây tổn thương và chết tế bào [24]. 1.1.2.2. Sa sút trí nhớ trong bệnh mạch máu Sa sút trí nhớ trong bệnh mạch máu là thể bệnh phổ biến đứng thứ hai sau bệnh Alzheimer, chiếm 10 – 20% các trường hợp mắc bệnh. Sa sút trí nhớ do nguyên nhân mạch máu làm giảm lượng máu tới não, gây tổn thương tế bào thần kinh và ít hồi phục. Biểu hiện của bệnh thường đột ngột, nhanh (nếu bị tai biến mạch máu mới) hoặc tiến triển theo từng nấc (trong trường hợp tái phát tai biến nhiều lần) [57]. 1.1.2.3. Các thể sa sút trí nhớ khác Sa sút trí nhớ cịn do các nguyên nhân hiếm gặp khác gây ra, cĩ thể kể đến như sa sút trí nhớ thể Lewy, sa sút trí nhớ thể thái dương, sa sút trí nhớ trong bệnh Parkinson, Huntington, Creutzfeldt-Jakob (CJD), sa sút trí nhớ trong bệnh suy giảm 5
15. miễn dịch ở người (ví dụ HIV), các bệnh chuyển hĩa và nội tiết (ví dụ suy giáp, lupus ban đỏ hệ thống, tăng calci huyết, thiếu vitamin B12) [66]. 1.1.3. Các thuốc điều trị bệnh sa sút trí nhớ Hiện nay chưa cĩ thuốc nào cĩ thể làm chậm hoặc dừng quá trình diễn tiến của bệnh sa sút trí nhớ. Tổ chức FDA đã chấp nhận 6 thuốc trong điều trị sa sút trí nhớ bao gồm: tacrin, rivastigmin, galantamin, donepezil, memantin và memantin phối hợp donepezil [15]. 1.1.3.1. Nhĩm thuốc ức chế enzym Acetylcholinesterase (AChE) Giả thuyết cholinergic được lấy làm trung tâm để phát triển các thuốc. Giả thuyết cho rằng nguyên nhân gây bệnh Alzheimer cĩ thể do giảm số lượng acetylcholin và suy yếu thụ thể nicotinic và muscarinic dẫn đến suy giảm dẫn truyền thần kinh [17]. Nhĩm thuốc cĩ tác dụng ức chế AChE cĩ phục hồi, tăng thời gian tồn tại các chất dẫn truyền thần kinh Acetylcholin từ đĩ cải thiện trí nhớ và nhận thức. Nhĩm ức chế AChE gồm 4 thuốc đã được tổ chức FDA cấp phép sử dụng (Tacrin, Donepezil, Rivastigmin và Galantamin). Tacrin ức chế khơng cạnh tranh với enzym acetylcholinesterase nhưng gây độc cho gan nên hiện nay hiếm khi được sử dụng [64]. Các thuốc thế hệ sau (Donepezil, Rivastigmin và Galantamin) được sử dụng để thay thế cho Tacrin. Ngồi khả năng ức chế AChE, Rivastigmin cĩ thể ức chế cả BuChE, trong khi galantamin cĩ tác dụng trong việc điều biến các thụ thể nicotinic. Cả hai được sử dụng để điều trị Alzheimer mức độ nhẹ - trung bình. Donepezil chỉ ức chế chọn lọc AChE nên ít cĩ độc tính ngoại biên hơn, được sử dụng để điều trị trong cả trường hợp nặng. Các tác dụng phụ thường gặp trên hệ tiêu hĩa (mệt mỏi, buồn nơn và tiêu chảy), hệ thần kinh (lo lắng, khĩ chịu) và hệ tim mạch (nhịp tim chậm) [41]. 1.1.3.2. Nhĩm thuốc ức chế thụ thể NMDA Thuốc duy nhất trong nhĩm này được tổ chức FDA phê duyệt là Memantin. Memantin là chất ức chế thụ thể NMDA khơng cạnh tranh, cĩ tác dụng bảo vệ thần kinh, ngăn cản việc mất tế bào thần kinh. Memantin dung nạp tốt hơn vào cơ thể [40]. Tác dụng phụ thường gặp trên hệ tiêu hĩa (buồn nơn, tiêu chảy hoặc táo bĩn) và hệ thần kinh (lú lẫn và hưng phấn) [41]. Memantin phối hợp donepezil cho thấy sự cải thiện lớn về chức năng nhận thức và ghi nhớ ở bệnh nhân sa sút trí nhớ [20]. 6
16. Ngồi ra, người ta cịn sử dụng các chất chống oxy hĩa như vitamin E, vitamin C, các dược liệu (bạch quả, đinh lăng, ), thuốc giảm đau khơng steroid để hỗ trợ điều trị sa sút trí nhớ. 1.2. Tổng quan về cây Thạch tùng răng cưa 1.2.1. Đặc điểm thực vật Thạch tùng răng cưa cĩ tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb.) Trevis. hay cịn được biết đến là Lycopodium serratum thuộc họ Thơng đất (Lycopodiaceae). Tên khác là Thạch tùng răng hoặc Chân sĩi. Mơ tả Cây thân thảo, thường mọc thành đám nhỏ trên đất hay trên gốc cây cĩ nhiều rêu trong rừng rậm thường xanh, trên đất ẩm cĩ tầng dày và nhiều mùn, ở độ cao 300 – 1800m. Thân đứng cao 15 – 40 cm, đơn hay lưỡng thân 1 – 2 lần, đường kính khoảng 2 mm, hình trụ. Lá hình bầu dục – mũi mác, dài 15mm, rộng 3mm, tương đối mỏng, gân giữa rõ, mép cĩ răng. Túi bao tử ở nách nhánh lá giống lá thường; túi bào tử hình thận, màu vàng tươi [5,8,11]. 1.2.2. Phân bố Cây thường tìm thấy ở những nước nhiệt đới châu Á, Trung Quốc, Úc và vùng Trung Mỹ. Ở nước ta, Thạch tùng răng cưa phân bố rải rác ở các tỉnh vùng trung du và vùng núi cao ở Tây Bắc, miền Trung và Tây Nguyên [5,8,11]. 1.2.3. Thành phần hĩa học Thạch tùng răng cưa cĩ thành phần chính là alcaloid thuộc Lycopodium alcaloid, được phân thành 4 nhĩm theo cấu trúc bao gồm Lycodin alcaloid, Lycopodin alcaloid, Fawcettimin alcaloid và dạng hỗn hợp [35]. Các hợp chất alcaloid của Thạch tùng răng cưa được liệt kê trong bảng 1.2.1. Trong đĩ, Huperzin A (Hup A) được coi là thành phẩn hĩa học nổi bật được phân lập và nghiên cứu nhiều nhất. Theo tác giả Vũ Thị Ngọc và cộng sự (2015), hàm lượng Hup A trong lá Thạch tùng răng cưa ở Đà Lạt vào mùa thu và mùa xuân lần lượt là 75,4 và 92,5 (g.g-1 mẫu khơ) [13]. Theo tác giả Takuya Ohba và cộng sự 7
17. (2015), Hup A là alcaloid chính trong cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa với hàm lượng đạt 0,5 0,003% [45]. Hình 1.2.1 Cấu trúc hĩa học của Hup A Ngồi ra, Thạch tùng răng cưa cịn chứa saponin, glycosid, flavonoid, tanin, đường khử, acid amin, polysaccharid, steroid và carotenoid [5]. Bảng 1.2.1 Các hợp chất alcaloid của Thạch tùng răng cưa Các alcaloid Phân nhĩm Tên hợp chất Clavolonin, serratidin, 4α-hydroxyserratidin, 4α,6α- dihydroxyserratidin, 6α-hydroxyserratidin, lycoposerramin K, Huperzin E,2-chlorohuperzin E, noxid huperzin E, Huperzin F, N-oxid huperzin F, Huperzin G, 12-hydroxyhuperzin, Huperzin Nhĩm O, 12-deoxyhuperzin O, Lycodolin, 12-epilycodolin N-oxid, lycopodin 4α,6α-dihydroxylycopodin, 6α-hydroxylycopodin, 7- hydroxylycopodin, lycoposseramin G, lycoposseramin L, lycoposseramin M, lycoposseramin N, Serratezomin C, Lucidiolin, lycoposerramin F lycoposerramin H lycoposerramin I, lycoposerramin J, lycoposerramin O. Huperzin A, NN-Dimethylhuperzin A, 6α-Hydroxyhuperzin A, 6β-Hydroxyhuperzin A, 6β-Hydeoxyhuperzin A, Phlegmariurin Nhĩm M, Huperzin U, Huperzin C, Huperzin D, Huperzinin, Isofordin, lycodin Huperzin B, N-Methylhuperzin B, De-N-methyl-βobscurin. Huperzin P, Huperzin Q, N‐oxyhuperzin Q, Lycoflexin, lycothunin, 11α-hydroxyfawcettidin, 2α,11α- Nhĩm dihydroxyfawcettidin, 8α,11α-dihydroxyfawcettidin, macleanin, fawcettimin 11α-hydroxyphlegmariurin B, 7-hyroperoxyphlegmariurin B, 8
18. Neohuperzinin, Serratanidin, Serratezomin B, Serratinin, Serratin, 8-deoxyserratinin, 8-deoxy-13-dehydroserratinin, Huperserratinin. Nhĩm các Huperzin J, Huperzin K, Huperzin L, Huperzin V, Huperzinin B, alcaloid Phlegmariurin N, Serratanin A, Serratanin B khác 1.2.4. Tác dụng dược lý Thạch tùng răng cưa được biết đến là một dược liệu quý để chữa bệnh sa sút trí nhớ. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, cao chiết của Thạch tùng răng cưa cĩ tác dụng ức chế chọn lọc enzym AChE và cải thiện trí nhớ trên động vật thử nghiệm [3,6,45]. Trong cây, Hup A là thành phần hĩa học cĩ tác dụng dược lý nổi trội, cĩ khả năng ức chế AChE, bảo vệ tế bào thần kinh và ty thể thơng qua thay đổi chuyển hĩa của APP và giảm stress oxy hĩa đồng thời ức chế biểu hiện của yếu tố gây viêm [26,62]. Cao chiết của Thạch tùng răng cưa cịn cho thấy cĩ tác dụng tiềm năng chống khối u trên các tế bào ung thư bạch cầu HL-60 [30] và ức chế sự di căn của tế bào u thần kinh đệm C6 (glicoma) [46]. Các tác dụng khác của lồi cây này như kháng khuẩn [39] và chữa lành vết thương [18] cũng đã được chứng minh. Bên cạnh đĩ, tác dụng chống nhược cơ, giải độc organophosphat cũng được ghi nhận ở Hup A [28,38]. 1.2.5. Các nghiên cứu hiện nay về tác dụng cải thiện trí nhớ của Thạch tùng răng cưa 1.2.5.1. Các nghiên cứu trên thế giới Ở Nhật Bản, tác giả Takuya Ohba và cộng sự đã xác định hàm lượng Hup A trong cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa là 0,5 0,003%. Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa cĩ tác dụng ức chế chọn lọc AChE với IC50 là 5,96 µg/ml và khơng ức chế BuChE ở cùng dải nồng độ ức chế AChE. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg cho thấy tác dụng cải thiện trí nhớ ở chuột nhắt trắng thơng qua các thử nghiệm hành vi (thử nghiệm mê lộ chữ Y và mê lộ nước Morris) [45]. Hup A là hợp chất được phân lập từ cao chiết của Thạch tùng răng cưa lần đầu tiên vào năm 1986 bởi tác giả Liu JS và cộng sự [37]. Năm 1996, Cheng Dong Hang và cộng sự cho thấy Hup A là một chất ức chế chọn lọc AChE theo cơ chế đảo 9
19. ngược với IC50 là 82 nM và tỷ lệ ức chế BuChE/AChE là 884,57. Đồng thời, dùng Hup A liều 0,1 – 0,4 mg/kg giúp cải thiện trí nhớ của chuột gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin [21]. Năm 2011, trong thử nghiệm lâm sàng pha 2, Hup A liều 400 g thấy tác dụng cải thiện trí nhớ ở bệnh nhân mắc sa sút trí nhớ mức độ nhẹ đến trung bình [50]. 1.2.5.2. Các tác dụng lý được báo cáo tại Việt Nam Năm 2013, tác giả Nguyễn Ngọc Chương và cộng sự báo cáo kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết cồn từ Thạch tùng răng cưa trên mơ hình gây sa sút trí nhớ ở chuột nhắt trắng bằng scopolamin. Kết quả cho thấy cao chiết cồn từ Thạch tùng răng cưa liều 0,533 g/kg cĩ tác dụng tăng cường trí nhớ trên chuột gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin và LD50 của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa là 5,33g/kg [3]. Năm 2016, tác giả Nguyễn Thị Kim Thu và cộng sự đã chứng minh cao chiết cồn và các phân đoạn của cao chiết cồn từ lá và thân của Thạch tùng răng cưa thu hái tại Sapa, Lào Cai cĩ tác dụng ức chế AChE in vitro. Phân đoạn dịch chiết EtOAc cho thấy hoạt tính ức chế AChE mạnh nhất với IC50 = 89,96 ± 3,42 µg/ml [6]. Cũng năm 2016, tác giả Vũ Thị Ngọc và cộng sự đã đánh giá sự cĩ mặt của Hup A trong mẫu cây Thạch tùng răng cưa thu hái tại Đà Lạt, Lâm Đồng vào mùa Xuân và mùa Thu bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Kết quả cho thấy, hàm lượng Hup A trong 2 mẫu lần lượt là 0,0925 mg/g mẫu khơ (mẫu mùa Thu) và 0,0171 mg/g mẫu khơ (mẫu mùa Xuân). Hàm lượng Hup A được nhận định cĩ sự thay đổi giữa các thời điểm trong năm, với hàm lượng cao nhất vào giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu mùa xuân [13]. Tại Việt Nam cĩ rất ít tài liệu nghiên cứu về Thạch tùng răng cưa và chưa cĩ nghiên cứu trên đối tượng cao chiết giàu alcaloid từ lồi cây này. Vì vậy, trong nghiên cứu này, nhĩm nghiên cứu sử dụng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa của Việt Nam để đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mơ hình gây sa sút trí nhớ ở chuột nhắt trắng bằng scopolamin. 10
20. 1.3. Một số mơ hình nghiên cứu tác dụng tăng cường trí nhớ 1.3.1. Các mơ hình động gây sa sút trí nhớ trên động vật thử nghiệm 1.3.1.1. Mơ hình gây sa sút trí nhớ tự phát  Mơ hình lão hĩa tự nhiên Suy giảm trí nhớ là đặc trưng đầu tiên và phổ biến của tuổi già. Vì vậy, những động vật già cĩ tiềm năng được dùng như những mơ hình tự phát gây suy giảm trí nhớ. Chuột là động vật thường được sử dụng trong các nghiên cứu do chi phí thấp, sẵn cĩ, dễ thao tác và hành vi đặc trưng. Do khơng gây xâm lấn và khơng chịu tác động của chất hĩa học thần kinh nên những mơ hình này được coi là cơng cụ hữu ích để phản ánh sinh lý bệnh tự nhiên của bệnh Alzheimer.  Mơ hình tăng tốc độ lão hĩa Chuột tăng tốc độ lão hĩa (SAM) là một mơ hình lão hĩa cấp tốc được hình thành thơng qua việc lựa chọn kiểu hình từ chủng chuột AKP/J, bao gồm 9 chủng tăng tốc độ lão hĩa nhạy cảm (SAMP) và 3 chủng tăng tốc độ lão hĩa đề kháng (SAMR). Trong đĩ, chủng SAMP8 là mơ hình gây sa sút trí nhớ đáng tin cậy cho thấy sự suy giảm khả năng học tập và trí nhớ liên quan đến lão hĩa [59]. 1.3.1.2. Mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng tác nhân hĩa học  Mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin Mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin là một trong những mơ hình động vật được sử dụng nhiều nhất do quy trình đơn giản và khả năng sống sĩt cao. Scopolamin là một chất đối vận muscarinic cĩ cấu trúc tương tự chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin. Do cĩ ái lực cao, scopolamin gắn với các thụ thể muscarinic và ngăn khơng cho acetylcholin gắn vào. Kết quả, nồng độ những chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin tự do tăng quá mức gây tổn thương các dây thần kinh dẫn đến suy giảm khả năng học tập và trí nhớ [65].  Mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng streptozotocin Streptozotocin gây tổn hại tế bào thần kinh thơng qua stress oxy hĩa, tăng tích lũy các A trong não, kích thích sự phosphoryl hĩa protein tau. Chuột tiêm streptozotocin liều 3 mg/kg, 2 lần trong 48 giờ được báo cáo gây ra suy giảm trí nhớ giống bệnh Alzheimer [52]. Hạn chế của mơ hình này là tỷ lệ tử vong cao, yêu cầu số lượng động vật thử nghiệm lớn. 11
21.  Mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng Trimethyltin (TMT) clorid TMT là một chất độc thần kinh mạnh, gây chết các tế bào thần kinh ở vùng đồi thị của động vật. TMT gây mất tế bào thần kinh, suy giảm trí nhớ, co giật ở chuột nhờ gây được stress oxy hĩa, kích thích các yếu tố tiền viêm [16]. Tuy nhiên, hiệu quả của TMT cĩ khác biệt giữa các lồi và tùy từng nhĩm sản xuất [43]. Ngồi ra, các tác nhân như L-methiomin, Colchicin, acid Okadaic, Benzodiazepin, các kim loại nặng (Fe, Cu, Cr, Co, ) cũng được sử dụng để gây sa sút trí nhớ trên động vật thí nghiệm [43]. 1.3.1.3. Mơ hình gây tổn thương não Mơ hình gây sa sút trí nhớ trên chuột mất vùng khứu giác cũng là một trong những mơ hình được sử dụng nhiều để gây sa sút trí nhớ ở động vật thí nghiệm. Chuột được tiến hành phá hủy vùng khứu giác và cầm máu bằng miếng bọt cầm máu gelatin. Các nghiên cứu chỉ ra rằng chức năng học tập và ghi nhớ đã suy giảm đáng kể sau khi cắt bỏ vùng khứu giác của chuột, làm giảm sự tăng sinh tế bào trong đồi hải mã và cholin acetyltransferase (ChAT) ở võ não và đồi hải mã [32,42]. 1.3.1.4. Mơ hình sử dụng động vật chuyển gen Động vật được biến đổi gen để biểu hiện các protein tiền chất amyloid (APP) tạo thành các đám rối A và gây sa sút trí nhớ. Các mơ hình thường sử dụng như chuột Tg2576, chuột APP23, JNLP3, ApoE Ngồi ra cịn cĩ các mơ hình chuyển gen khác bằng cách gây đột biến trong presenilin, đột biến -symelein, mơ hình chuột biểu hiện quá mức eyelooxygenase-2, đột biến yếu tố chống tăng trưởng thần kinh (NGF) [55] 1.3.1.5. Mơ hình gây sa sút trí nhớ do não thiếu oxy Tình trạng thiếu oxy (hypoxia), tăng natri máu và thiếu máu cục bộ được báo cáo làm giảm lượng máu cung cấp cho não và gây giảm trí nhớ ở lồi gặm nhấm. Cĩ thể gây thiếu oxy bằng cách cho chuột phơi nhiễm với khí CO2 tinh khiết, CO. NaNO2 cũng được dùng để gây suy giảm khả năng học tâp và ghi nhớ nhờ làm giảm khả năng mang oxy. Ngồi ra, người ta sử dụng mơ hình gây sa sút trí nhớ do thiếu máu não cục bộ bằng cách thắt động mạch cảnh đồng thời chích máu đuơi chuột gây hạ huyết áp [55]. 12
22. 1.3.1.6. Mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng chế ăn giàu chất béo (HFD) Trong mơ hình này, chuột được cho ăn chế độ ăn giàu chất béo (30-60% chất béo) trong 2-4 tháng. HFD làm tăng nồng độ cholesterol trong não. Vì cholesterol ảnh hưởng đến việc thanh thải và lắng đọng A nên việc tăng nồng độ cholesterol trong não thúc đẩy sự lắng đọng của peptit này và hình thành mảng bám A ở ngồi tế bào thần kinh. HFD gây ra sự lắng đọng của peptid A, tăng các phản ứng viêm, giảm tế bào thần kinh và tăng tốc độ suy giảm nhận thức thơng qua căng thẳng oxy hĩa và đẩy nhanh quá trình apoptosis thần kinh [51]. Mơ hình cĩ một hạn chế là quá trình xây dựng mơ hình tốn nhiều thời gian. 1.3.2. Một số thử nghiệm hành vi đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ in vivo  Thử nghiệm nhận diện đồ vật (ORT) Test nhận diện đồ vật ORT được thực hiện theo phương pháp của Yamada và cộng sự (2011) để đánh giá khả năng cải thiện trí nhớ ngắn hạn khơng liên quan đến vị trí khơng gian của chuột [67]. Chuột cĩ xu hướng khám phá vật thể lạ lâu hơn để thu thập thơng tin mới của mơi trường, qua đĩ đảm bảo sự an tồn cho bản thân động vật. Đánh giá thời gian chuột khám phá vật thể lạ so với thời gian khám phá vật thể cũ cho biết khả năng nhớ của chuột. Chuột được coi là cải thiện trí nhớ nếu thời gian khám phá vật thể mới của chuột lâu hơn so với thời gian khảm phá vật thể cũ.  Thử nghiệm mê lộ chữ Y Thử nghiệm mê lộ chữ Y được thực hiện nhằm đánh giá trí nhớ khơng gian ngắn hạn của chuột. Thử nghiệm này được tiến hành dựa vào hành vi thích khám phá của động vật gặm nhấm. Hành vi này giúp chúng thu thập thơng tin về mơi trường mới, từ đĩ đảm bảo an tồn cho bản thân. Trong thử nghiệm mê lộ chữ Y, chuột cĩ xu hướng tìm đến cánh mà chúng chưa khám phá (hay cĩ xu hướng khám phá lần lượng ba cánh tay liên tiếp). Chuột cĩ trí nhớ tốt sẽ di chuyển thay đổi luân phiên giữa các cánh và ngược lại [36].  Thử nghiệm mê lộ nước Morris (Morris Water Maze – MWM) Test mê lộ nước Morris để đánh giá khả năng học tập và trí nhớ khơng gian của chuột, dựa vào bản năng sinh tồn và khả năng nhớ vị trí khơng gian của chuột, khi cho vào nước chuột sẽ bơi để tìm bến đỗ và nhớ vị trí của bến đỗ ở các lần tiếp theo. Thử nghiệm dựa vào bản năng sinh tồn của động vật sống trên cạn: khi chuột 13
23. bị đưa vào mơi trường nước, chúng sẽ cố gắng bơi để tìm cách trốn thốt nhằm đảm bảo an tồn cho bản thân. Đánh giá kết quả dựa trên các thơng số: thời gian tìm thấy bến đỗ, quãng đường tìm thấy bến đỗ, vận tốc bơi trung bình, thời gian lưu lại gĩc cĩ bến đỗ [60].  Thử nghiệm né tránh thụ động Test né tránh thụ động được sử dụng để đánh giá trí nhớ dài hạn của động vật thử nghiệm, dựa trên sự mâu thuẫn giữa bản năng sợ hãi vùng khơng gian mở, cĩ ánh sáng của các lồi gặm nhấm với phản xạ trốn tránh cĩ điều kiện vùng khơng gian nguy hiểm đã được nhận diện trước đĩ. Dựa trên đặc điểm sinh học này, người ta thiết kế buồng tối (khu vực ưa thích của chuột) trở thành vị trí nguy hiểm (bị điện giật), trong khi buồng sáng lại là vị trí an tồn (khơng bị điện giật) [34]. Trong thử nghiệm, chuột được đưa vào buồng sáng, nếu chuột đi vào buồng tối sẽ bị điện giật. Sau một số lần tập luyện, chuột sẽ hạn chế vào buồng tối. Đánh giá kết quả dựa trên thơng số thời gian từ khi cho chuột vào buồng sáng đến khi chuột sang buồng tối. Ngồi ra, cịn cĩ một số thử nghiệm hành vi khác như thử nghiệm sợ hãi cĩ điều kiện, thử nghiệm vận động tự nhiên, bài tập tìm thức ăn trong mê lộ, mê lộ hình chữ thập, vận động trong rotarod 1.3.3. Một số phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE Acetylcholin là một chất dẫn truyền thần kinh thuộc hệ cholinergic, được tổng hợp từ Ac-coenzym A và cholin dưới tác dụng của acetyltransferase. Sau khi được giải phĩng, acetylcholin tồn tại ở mơ trong vài giây, sau đĩ bị AChE ở mơ liên kết tại chỗ phân giải thành ion acetat và cholin. AChE giữ vai trị quan trọng trong kiểm sốt biểu hiện của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin.  Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman Phương pháp đánh giá hoạt tính của AChE dựa trên nguyên tắc: cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ sự xúc tác của cholinesterase tạo thiocholin. Thiocholin phản ứng với thuốc thử DTNB giải phĩng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic màu vàng. Hợp chất này cĩ độ hấp thụ quang cực đại tại bước sĩng 412 nm. Lượng hợp chất này được tạo thành tỷ lệ thuận với hoạt độ của AChE. Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được áp dụng phổ biến trong đánh giá hoạt độ của enzym do cĩ ưu điểm là hợp chất được tạo thành cĩ độ bền cao, độ nhạy và đơn giản của phương pháp [25]. 14
24.  Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B Phương pháp đánh giá hoạt tính của AChE sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được cơng bố sau phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman nhưng ít được sử dụng hơn. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất -naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym esterase giải phĩng chất -naphthol. Chất này phản ứng với thuốc thử muối Fast Blue B tạo thành sản phẩm mà diazo. Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sĩng 600 nm [29]. 1.3.4. Một số phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hĩa 1.3.4.1. Một số phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hĩa in vitro  Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH là phương pháp được sử dụng nhiều nhất để đánh giá tác dụng chống oxy hĩa của một hợp chất hoặc hồn hợp các chất. Nguyên tắc của phản ứng là dựa vào phản ứng giữ các gốc tự do DPPH với chất chống oxy hĩa tạo thành sản phẩm cĩ màu vàng khơng hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại bước sĩng 517 nm. Phương pháp cĩ nhiều ưu điểm như đơn giản, ít tốn kém, độ nhạy cao và phạm vi ứng dụng lớn [14].  Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do ABTS+ Khả năng dọn gốc tự do được xác định bằng phương pháp khử màu ABTS+ (2,2-azino-bis(2-ethylbenz-thiazolin-6-sulfonic acid)). ABTS+ phản ứng với chất chống oxy hĩa tạo thành sản phẩm khơng màu, làm dung dịch mất màu xanh. Độ hấp thụ quang được đo ở bước sĩng 750 nm và được tính tốn dựa vào đường chuẩn của chất chuẩn Trolox [48]. Ngồi ra, cịn nhiều phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hĩa in vitro khác được áp dụng trên thế giới như phương pháp dọn gốc tự do HO, nitric oxid, peroxynitrit, superoxid, 1.3.4.2. Phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hĩa in vivo Hiện nay trên thế giới cĩ rất nhiều phương pháp được đưa ra để đánh giá khả năng chống oxy hĩa trong mơ hình thực nghiệm như phương pháp đánh giá khả năng làm giảm sắt trong huyết tương, phương pháp đánh giá khả năng làm giảm glutathion, Trong đĩ, phương pháp định lượng hàm lượng peroxid hĩa lipid màng tế bào được sử dụng nhiều nhất do đơn giản và tiết kiệm chi phí. Khả năng ức chế quá trình peroxy hĩa lipid của các chất được đánh giá thơng qua việc xác định hàm 15
25. lượng malonyldialdehyde (MDA) - sản phẩm của quá trình oxy hĩa lipid màng tế bào.  Định lượng MDA theo phương pháp của Wojciech Wasowicz Phương pháp định lượng MDA theo Wojciech Wasowicz dựa trên phản ứng của malondialdehyd (MDA) với acid thiobarbituric (TBA) trong mơi trường acid, tạo ra hợp chất trimethin màu hồng cĩ cực đại hấp thụ tại 532nm. Do đĩ, cĩ thể định lượng MDA thơng qua mật độ quang của phức hợp tạo thành .Sử dụng 1,1,3,3- tetramethoxypropan (TMP) để xây dựng đường chuẩn [63].  Định lượng MDA theo phương pháp của Gérard-Monnier Phương pháp định lượng MDA theo Gérard-Monnier dựa trên phản ứng của malonaldehyd (MDA) với 2 phân tử 1-methyl-2-phenylindol ở 450C. Sản phẩm tạo thành cĩ cực đại hấp thụ ở bước sĩng 586 nm [27]. Do đĩ, cĩ thể định lượng MDA thơng qua đo độ hấp thụ quang của phức hợp tạo thành. Sử dụng 1,1,3,3- tetramethoxypropan (TMP) để xây dựng đường chuẩn. 16
26. Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Dược liệu nghiên cứu Thạch tùng răng cưa được thu hái vào tháng 9 năm 2019 tại Đà Lạt, Lâm Đồng. Mẫu cây được giám định thực vật học bởi Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Theo kết quả giám định, mẫu Thạch tùng răng cưa thu hái tại Đà Lạt, Lâm Đồng cĩ tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb.) Trevis. (Phụ lục 01). Mẫu tiêu bản số TB-7104, TB-8575, TB- 8919 được lưu trữ tại Phịng tiêu bản của Khoa tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Mẫu nghiên cứu sau đĩ được chiết theo phương Hình 2.1.1 Cây Thạch tùng pháp chiết alcaloid bằng dung mơi hữu cơ răng cưa Huperzia serrata trong mơi trường kiềm để thu cao chiết giàu (Thunb.) Trevis alcaloid từ Thạch tùng răng cưa. 2.1.2. Mẫu nghiên cứu  Chuẩn bị mẫu nghiên cứu Dược liệu sau khi thu mua được làm sạch, sấy khơ và tán thành bột thơ. Cân bột dược liệu vào cốc, làm ẩm bằng amoniac đậm đặc. Thêm dung mơi Cloroform, siêu âm, lọc, thu được dịch chiết cloroform. Dịch chiết sau đĩ được làm bay hơi một phần để thu hồi dung mơi dùng cho lần chiết tiếp theo. Tinh sạch chất bằng cách chiết với dung dịch axit sulfuric 2% và dung dịch cloroform. Cơ quay thu hồi dung mơi đến khi thu được cắn. Quy trình chiết được trình bày ở Hình 2.1.2. Cao khơ định chuẩn đạt độ ẩm 3,96% và tỷ lệ cao chiết: dược liệu là 0,23%. Hàm lượng Hup A trong cao khơ được định lượng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPLC cho kết quả 9,7% [7]. 17
27. Hình 2.1.2 Phương pháp chiết alcaloid bằng dung mơi hữu cơ trong mơi trường kiềm 2.2. Phương tiện nghiên cứu 2.2.1. Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng, giống đực, chủng Swiss, trọng lượng 18-22g được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương. Trước khi tiến hành thử nghiệm, chuột nuơi ổn định trong phịng thí nghiệm ít nhất 7 ngày. Điều kiện nuơi ở 22 - 26 độ C, đảo ngược sáng tối (7 giờ: tối, 19 giờ: sáng). Chuột được nuơi bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp, nước sạch được cho uống tự do. 1.2.2. Hĩa chất, dung mơi - Enzym acetylcholinesterase loại EC 3.1.1.7 (Sigma, Singapore) - Acetylthiocholine iodide (ATCI) (Sigma, Singapore) - 5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) (Sigma, Singapore) - Acid ascorbic 99% (Sigma, Singapore) 18
28. - Donepezil 5 mg biệt dược Alzepil (Egis Pharma, Hungary). - Scopolamin (Sigma, Singapore) - Một số hĩa chất phịng thí nghiệm: HCl, NaCl, NH3, NaCMC, H2SO4, - Dung mơi: Cloroform (CHCl3), MeOH, nước cất . 1.2.3. Thiết bị, dụng cụ - Cân phân tích AY 129 (Shimadzu, Nhật Bản) - Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal - Máy đo quan UV Aligenttechnologies Cary 60 UV-Vis, Mỹ - Máy cơ quay chân khơng Rovapor R-210 (Buchi-Đức) - Máy đo pH Mettler Toledo (Thụy Sỹ) - Giấy lọc (đường kính 11 cm), phễu lọc - Cuvet (1ml), ống Eppendorf 1,5ml - Các dụng cụ thủy tinh: Pipet, đầu cơn các loại, bình định mức, bình chiết, các loại cốc cĩ mỏ dung tích 25-500ml, bình cầu và các dụng cụ cần thiết khác. - Máy nghiền đồng thể (Wisetir HS-30E, Mỹ) - Mê lộ chữ Y - Mê lộ nước Morris 2.3. Nội dung nghiên cứu Để thực hiện các mục tiêu đề ra, đề tài được thiết kế với các nội dung sau:  Nội dung 1: Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE và dọn gốc tự do in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.).  Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa.  Đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa.  Nội dung 2: Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin in vivo của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa thơng qua các thử nghiệm:  Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin in vivo thơng qua các thử nghiệm: - Thử nghiệm hành vi: thử nghiệm mê lộ chữ Y và thử nghiệm mê lộ nước Morris 19
29. - Đánh giá các marker sinh học: định lượng hoạt độ AChE và hàm lượng MDA trong mơ não của chuột nhắt trắng. Nội dung nghiên cứu được sơ đồ hĩa ở Hình 2.3.1 dưới đây: Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alkaloid từ Thạch tùng răng cưa Đánh giá tác dụng ức chế AChE Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mơ hình gây sa sút trí và chống oxy hĩa in vitro nhớ bằng scopolamin Đánh giá tác Đánh giá dọn Các test Marker dụng ức chế gốc tự do hành vi sinh học AChE • - Test mê lộ • - Định lượng chữ Y AChE trong • - Test mê lộ mơ não nước Morris • - Định lượng MDA trong mơ não Hình 2.3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE và chống oxy hĩa in vitro 2.4.1.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro Tác dụng ức chế enzym AChE của cao chiết giàu alcaloid từ cây Thạch tùng răng cưa được đánh giá theo phương pháp của Ellman và cộng sự (1961) [25]. Nguyên tắc Cơ chất acetylcholin iodid (ACTI) bị thủy phân nhờ xúc tác của enzym acetylcholinesterase tạo ra thiocholin. Sản phẩm thiocholin phản ứng với thuốc thử acid 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) để tạo thành hợp chất acid 5-thio-2- nitrobenzoic cĩ màu vàng. Lượng hợp chất màu được tạo thành trong một đơn vị 20
30. thời gian tỷ lệ thuận với hoạt tính AChE. Phản ứng xảy ra được thể hiện ở Hình 2.4.1. Dựa vào xác định độ hấp thụ quang của mẫu thử ở bước sĩng 412 nm để đánh giá hoạt tính của AChE. Cơ chất ATCI Thiocholin Thuốc thử DTNB Màu vàng Hình 2.4.1 Phản ứng giữa các chất trong hỗn hợp phản ứng Ellman Cách tiến hành Cao chiết Thạch tùng răng cưa và chứng dương được hồ tan trong dung dịch đệm phosphat pH = 7,5 cĩ chứa 1% DMSO thành dung dịch gốc nồng độ 10.000 µg/ml. Từ các dung dịch gốc nồng độ 10.000 µg/ml pha lỗng ra thành các nồng độ thấp hơn bằng dung dịch đệm phosphat pH = 7,5. Phản ứng định lượng được thực hiện trên đĩa 96 giếng ở nhiệt độ phịng (25oC). Hỗn hợp phản ứng bao gồm 120 µl dung dịch đệm natri phosphat (pH 7,5), 20 µl dung dịch thử ở các nồng độ khác nhau và 20 µl dung dịch AChE 0,25 IU/ml. Trộn đều và đem ủ trong bĩng tối 15 phút tại 25oC. Sau đĩ, thêm 20 µl DTNB 1,25 mM và 20 µl ACTI 1,25 mM, trộn đều. Động học của phản ứng được theo dõi bằng cách đo mật độ quang của các giếng tại bước sĩng 412 nm với tần suất 1 phút/lần trong thời gian 10 phút. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Donepezil được sử dụng làm chứng dương. Đánh giá kết quả Đánh giá tác dụng ức chế AChE qua giá trị I% được tính theo cơng thức: ∆ODo/phút -∆ODt/phút I% = × 100% ∆ODo/phút 21
31. Trong đĩ: ΔODo/phút: thay đổi mật độ quang mỗi phút của giếng trắng. ΔODt/phút: thay đổi mật độ quang mỗi phút của giếng cĩ mẫu thử/chứng dương. IC50: Nồng độ ức chế 50% hoạt độ của enzym cholinesterase. 2.4.1.2. Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do in vitro Nguyên tắc Thử nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Kumar [54]. Hợp chất 2,2- diphenyl-2-picryhydrazin (DPPH) cĩ khả năng tạo ra gốc tự do, bền trong dung dịch MeOH bão hịa. Dung dịch cĩ màu tím đỏ, khi phản ứng với chất chống oxy hĩa sẽ tạo thành phức hợp màu vàng. Phức hợp này khơng hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại bước sĩng 517 nm. Cách tiến hành Dung dịch DPPH 0,1 mM: hịa tan 2,19 mg DPPH trong 50ml methanol. Mẫu thử là cao chiết alcaloid của Thạch tùng răng cưa được pha trong dung mơi MeOH thành các nồng độ khác nhau. Chất đối chứng là quercetin pha lỗng tương tự. Cho vào giếng hỗn hợp gồm: 20 µl dung dịch mẫu thử hoặc chất đối chứng hoặc MeOH và 180 µl dung dịch DPPH (0,1 mM). Trộn đều hỗn hợp trong vịng 1 phút rồi tiếp tục ủ 30 phút trong bĩng tối ở nhiệt độ phịng. Dung dịch sau khi phản ứng được đem đo độ hấp thụ quang ở bước sĩng 517 nm. Đánh giá kết quả Hoạt tính quét gốc tự do DPPH được đánh giá thơng qua giá trị phần trăm ức chế I%, được tính theo cơng thức: ODtr -ODth I% = × 100% ODtr Trong đĩ: + I (%): phần trăm dọn gốc tự do DPPH. + ODtr: Độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch mẫu trắng. + ODth: Độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch mẫu thử/mẫu đối chứng. 22
32. Khả năng dọn gốc tự do của dịch chiết được so sánh với chất chứng dương là quercetin. 2.4.2. Phương pháp đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa trên mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin.  Triển khai mơ hình đánh giá tác dụng của cao chiết Nguyên tắc Scopolamin là một chất đối kháng cạnh tranh với chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin tại thụ thể M1 muscarinic hậu synap. Scopolamin thay thế các Ach gắn vào thụ thể muscarinic, làm gián đoạn quá trình dẫn truyền tín hiệu thần kinh; đồng thời lượng ACh giải phĩng quá mức dẫn đến phá hủy các tế bào thần kinh vùng đồi hải mã và gây ra suy giảm khả năng học tập và trí nhớ [19,65]. Chuẩn bị chế phẩm Cao chiết (30 mg/kg và 60 mg/kg) và donepezil (5 mg/kg) được pha trong dung dịch natri carboxymethyl cellulose (NaCMC) 0,5%. Thiết kế thử nghiệm Chuột nhắt trắng, giống đực, chủng Swiss được nuơi ổn định 7 ngày trước khi thí nghiệm. Chuột được chia ngẫu nhiên thành 5 nhĩm khác nhau, mỗi nhĩm 10 con. - Nhĩm chứng sinh lý: uống dung dịch NaCMC 0,5%. - Nhĩm chứng bệnh: uống dung dịch NaCMC 0.5%. - Nhĩm cao chiết liều 30 mg/kg: uống dung dịch cao chiết giàu alcaloid liều 30 mg/kg. - Nhĩm cao chiết liều 60 mg/kg: uống dung dịch cao chiết giàu alcaloid liều 60 mg/kg. - Nhĩm donepezil: uống donepezil với liều 5 mg/kg. Dựa trên kết quả của thử nghiệm đánh giá độc tính cấp trước đĩ đã xác định giá trị LD50 của cao chiết là 707 (526 – 1043) mg/kg cân nặng và các nghiên cứu trước đây, liều dùng trong thử nghiệm được lựa chọn là 30 mg/kg (nhỏ hơn 1/20 LD50) và 60 mg/kg (nhỏ hơn 1/10 LD50) [3,7,45]. Các nhĩm chuột được cho uống cao chiết/donepezil/NaCMC 0,5% liên tục trong suốt quá trình nghiên cứu (23 ngày) và 1 giờ trước khi thực hiện các thử nghiệm. Chuột được gây suy giảm trí nhớ bằng cách tiêm màng bụng scopolamin: với liều 3 23
33. mg/kg trong thử nghiệm mê lộ chữ Y và 1 mg/kg trong thử nghiệm mê lộ nước Morris. Ở ngày thứ 14, tiến hành thử nghiệm mê lộ chữ Y. Ngày thứ 18 – 22, tiến hành thử nghiệm mê lộ nước Morris. Ngày thứ 23, sau 24 giờ từ khi kết thúc thử nghiệm mê lộ nước Morris, tiến hành gây mê chuột ở tất cả các nhĩm và lấy não để đánh giá hoạt độ của enzym AChE và hàm lượng MDA. Hình 2.4.2 Sơ đồ triển khai mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin in vivo 2.4.2.1. Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thơng qua thử nghiệm mê lộ chữ Y Nguyên tắc Thử nghiệm mê lộ chữ Y là thử nghiệm hành vi dùng để đánh giá trí nhớ khơng gian ngắn hạn của động vật thử nghiệm được mơ tả lần đầu vào năm 1992 bởi nhà khoa học Dellu [23]. Thử nghiệm này được tiến hành dựa vào hành vi khám phá của động vật gặm nhấm giúp chúng thu thập thơng tin về mơi trường mới. Trong thử nghiệm mê lộ chữ Y, chuột cĩ xu hướng tìm đến cánh mà chúng chưa khám phá (hay cĩ xu hướng khám phá lần lượt ba cánh tay liên tiếp). Bố trí thí nghiệm Mê lộ chữ Y được sử dụng rộng rãi để đánh giá trí nhớ khơng gian của động vật. Mê lộ này cĩ 3 cánh tay ( được ký hiệu là A, B và C), kích thước mỗi cánh tay giống hệt nhau (kích thước 30 x 6 x 15 cm) được bố trí theo hình chữ Y, cách nhau 120o. Một bĩng đèn 10W chiếu sáng nhẹ, được bố trí để cường độ sáng ở ba cánh 24
34. tay là như nhau. Tồn bộ hoạt động của chuột trong mê lộ được theo dõi và ghi lại bằng camera đặt phía trên, chính giữa mê lộ. Tiến hành Vào ngày thử nghiệm, sau khi được cho uống chế phẩm/donepezil/nước cất 1 giờ và sau 30 phút được tiêm scopolamin vào màng bụng. Tiến hành thử nghiệm: chuột được đặt nhẹ nhàng vào một cánh tay bất kỳ và tự do khám phá các cánh tay trong 8 phút. Ghi nhận số lần chuột di chuyển vào 3 cánh tay khác nhau liên tiếp và trình tự chuột di chuyển vào các cánh tay. Chuột được xem là di chuyển vào một cánh tay khi cả bốn chân đều nằm trong cánh tay đĩ. Kết thúc mỗi thử nghiệm, mê lộ được vệ sinh bằng khăn sạch tẩm cồn và làm khơ tự nhiên để tránh lưu mùi. Đánh giá Tỷ lệ chuyển tiếp là tỷ lệ % số lần chuột khám phá 3 cánh tay khác nhau liên tiếp, được tính theo cơng thức sau: Số lần chuột di chuyển vào ba cánh liên tiếp Tỷ lệ chuyển tiếp = 100% Tổng số lần thay đổi cánh − 2 Trong đĩ, một lần chuột di chuyển vào ba cánh liên tiếp được tính nếu chuột đi vào ba cánh tay khác nhau liên tiếp (ABC, ACB, BAC, BCA, CAB hoặc CBA). 2.4.2.2. Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thơng qua thử nghiệm mê lộ nước Morris Nguyên tắc Thử nghiệm mê lộ nước Morris được mơ tả lần đầu tiên năm 1981 [44]. Đây là một thử nghiệm đánh giá khả năng học tập và trí nhớ khơng gian dài hạn của lồi gặm nhấm thơng qua bài tập tìm bến đỗ. Thử nghiệm dựa vào bản năng sinh tồn và khả năng ghi nhớ vị trí khơng gian của chuột, khi cho vào nước, chuột sẽ bơi để tìm bến đỗ và nhớ vị trí bến đỗ ở các lần tiếp theo. Tiến hành Mệ lộ là một bể nước hình trịn đường kính 1,1m, cao 30cm, mực nước trong bể duy trì ở mức 15cm, nhiệt độ nước khoảng 25oC trong suốt quá trình thí nghiệm. Nước được làm đục bằng sữa. Bến đỗ cĩ đường kính 7,5cm, làm bằng thủy tinh trong suốt, đặt cố định tại một gĩc phần tư của mê lộ. Thử nghiệm mê lộ nước Morris kéo dài 5 ngày, bao gồm 2 giai đoạn: 25
35. Giai đoạn luyện tập – bài tập cĩ bến đỗ: Bài tập diễn ra trong 4 ngày. Trong bài tập này, bến đỗ được đặt thấp hơn mặt nước 1cm. Chuột bắt đầu bơi lần lượt tại một trong 3 gĩc phần tư cịn lại của mê lộ. Mỗi lần chuột tập trong 1 phút, tập 3 lần/ngày, mỗi lần cách nhau 1 phút. Trong thời gian đĩ, chuột nhanh chĩng được lau khơ và sưởi ấm. Nếu khơng tìm được bến đỗ trong 90 phút thì chuột sẽ được hướng dẫn cách tìm thấy bến đỗ và ở đĩ 10 giây. Thử nghiệm được ghi lại bằng camera. Chỉ tiêu đánh giá là thời gian trung bình tìm thấy bến đỗ của 3 lần luyện tập trong ngày. Giai đoạn thử nghiệm – bài tập khơng cĩ bến đỗ: Trong ngày thứ 5, bến đỗ được bỏ ra ngồi và chuột bơi trong mê lộ 1 lần duy nhất trong 1 phút. Chuột phải tìm bến đỗ dựa vào trí nhớ đã hình thành những ngày trước đĩ và cĩ xu hướng bơi lâu hơn tại gĩc phần tư cĩ bến đỗ trước đĩ. Chỉ tiêu đánh giá là thời gian chuột bơi ở gĩc phần tư này. 2.4.2.3. Định lượng hoạt độ AChE in vivo trong mơ não Nguyên tắc Hoạt độ AChE được định lượng theo phương pháp của Ellman (1961), dựa vào phản ứng tạo màu giữa DTNB và thiocholin, một sản phẩm tạo thành từ phản ứng thủy phân cơ chất ACTI dưới xúc tác của AChE. Cách tiến hành Sau thử nghiệm mê lộ nước Morris 24 giờ, chuột bị giết và lấy não. Ngay sau đĩ não được rửa nhanh với nước muối sinh lý, cân và nghiền đồng thể với dung dịch đệm phosphat pH = 7,5 chứa 2% trion X-100 (tỷ lệ 2:100) trong điều kiện nhiệt độ từ 0 – 4oC. Ly tâm lạnh (0oC) với tốc độ 10.000 vịng/phút trong 30 phút. Lấy phần dịch nổi để định lượng hoạt độ AChE. Phần dịch này đĩng vai trị nguồn enzym.Phản ứng thực hiện trên đĩa 96 giếng ở nhiệt độ phịng (25oC). Hỗn hợp phản ứng được thêm lần lượt theo thứ tự gồm: Đệm phosphat pH=7,5, 100 mM: 100 µl Nguồn enzym: 30 µl DTNB 4 mM: 40 µl ATCI 6 mM: 30 µl Động học của phản ứng được theo dõi bằng cách đo mật độ quang của các giếng tại bước sĩng 412 nm, tần suất 2 phút/lần trong 10 phút. 26
36. Hoạt độ AChE trong não tồn phần được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hoạt độ (UI/g não). Trong đĩ, một đơn vị hoạt độ AChE là lượng enzym xúc tác cho sự hình thành 1 mol thiocholin/phút tại pH = 7,5 ở nhiệt độ phịng. OD⁄phút 200 k Hoạt độ enzym (UI) = V 0,0136 0,6 30 m Trong đĩ: ΔOD/phút là thay đổi mật độ quang/phút của giếng chứa hỗn hợp phản ứng 200 là thể tích hỗn hợp phản ứng trong mỗi giếng (µl) 0,0136 là hệ số hấp thụ micromol phân tử của phức tạo thành sau phản ứng tại bước sĩng 412 nm (µM-1.cm-1) 0,6 là độ cao của dung dịch trong mỗi giếng (cm) k là hệ số pha lỗng (lít) 30 là thể tích nguồn enzym trong hỗn hợp phản ứng (µl) m là khối lượng não tồn phần (g) V là thể tích dịch nghiền đồng thể não (ml) 2.4.2.4. Định lượng hàm lượng malondialdehyd (MDA) trong mơ não Nguyên tắc Hàm lượng malondialdehyd (MDA) được định lượng theo phương pháp của Wojciech Wasowicz và cộng sự, dựa trên phản ứng của malondialdehyd (MDA) với acid thiobarbituric (TBA) trong mơi trường acid, tạo ra hợp chất trimethin màu hồng cĩ cực đại hấp thụ ở bước sĩng 532 nm [48]. Cách tiến hành Thêm chất chống oxy hĩa pha dầu hydroxytoluen butylat hĩa (BHT) trong điều kiện lạnh (nhiệt độ 0 – 4oC) vào phần dịch nghiền đồng thể mơ não. Ly tâm lạnh (0oC) với tốc độ 10.000 vịng/phút trong 15 phút. Hỗn hợp phản ứng được đựng trong ống nghiệm thủy tinh cĩ nắp, trộn, hấp cách thủy ở nhiệt độ trên 95oC trong 60 phút và để nguội. Mẫu trắng và mẫu chuẩn được thực hiện tương tự. Thành phần các chất cĩ trong phản ứng được trình bày ở bảng 2.4.1. Lấy chính xác 500 µl dung dịch sau phản ứng từ các ống nghiệm vào ống eppendorf đã chứa 750 µl n-butanol, đem ly tâm trong 5 phút. Sau đĩ, lấy 750 µl lớp n-butanol sau ly tâm vào ống eppendorf cĩ chứa Na2SO4 khan, đem ly tâm trong 5 phút rồi lấy 200 µl mẫu đem đo quang ở bước sĩng 532 nm. Mỗi thử nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần được làm trên 3 giếng. 27
37. Bảng 2.4.1. Thành phần của hỗn hợp phản ứng Mẫu trắng Mẫu chuẩn Mẫu thử 150 µl nước cất 150 µl TMP 150 µl phần dịch nổi sau ly tâm 1 ml TBA 1 ml TBA 1ml TBA 1ml nước cất 1 ml nước cất 1ml nước cất Tiến hành đo độ hấp thụ của các mẫu ở bước sĩng 532 nm. Xây dựng đường chuẩn để xác định hàm lượng MDA trong mơ não theo cơng thức: a V b Hàm lượng MDA (mol⁄g) = m Trong đĩ: a (mmol⁄l) là nồng độ MDA tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn TMP. V (ml) là thể tích dịch nghiền đồng thể não với giá trị V = 2ml. b = 707/30 là hệ số pha lỗng m (g) là khối lượng não 2.5. Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm thống kê Microsoft excel 2013, SPSS 22, Graphpad Prism 8 để xử lý số liệu. Với các mẫu liên tục, phân bố chuẩn, dữ liệu được biểu diễn dưới dạng X ± SE. So sánh giá trị trung bình giữa các nhĩm bằng one-way ANOVA, kèm hậu kiểm LSD và Dunett’s T3. Với các mẫu rời rạc hoặc khơng tuân theo phân bố chuẩn, dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung vị (khoảng tứ phân vị) và sử dụng kiểm định Kruskal Wallis, sau đĩ là kiểm định Mann-Whitney U để so sánh khác biệt giữa các nhĩm . Sự khác biệt giữa các nhĩm được coi là cĩ ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. Giá trị IC50 và khoảng tin cậy 95% của IC50 được xác định dựa trên tỷ lệ phần trăm ức chế tại các nồng độ khác nhau, sử dụng phương pháp hồi quy phi tuyến tính bằng mơ hình sigmoid trên phần mềm Graphpad Prism 8. 28
38. Chương 3 – KẾT QUẢ 3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE và khả năng dọn gốc tự do in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa 3.1.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro Cao chiết alcaloid của Thạch tùng răng cưa được đánh giá tác dụng ức chế AChE bằng phương pháp của Ellman và cộng sự. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa được trình bày trong bảng 3.1.1. Bảng 3.1.1. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa và chất chuẩn donepezil. Mẫu Nồng độ % Ức chế IC50 (µg/ml) (µg/ml) AChE (Khoảng tin cậy 95% của IC50) 2 23,32 Cao 5 33,96 7,93 Thạch tùng 10 52,23 (5,43-10,98) răng cưa 15 67,15 20 78,81 0,05 12,42 0,1 23,43 0,28 Donepezil 0,2 39,42 (0,26-0,31) 0,4 61,81 0,8 75,23 Nhận xét - Chất chuẩn donepezil thể hiện tác dụng ức chế AChE in vitro với giá trị IC50 là 0,28 µg/ml và khoảng tin cậy 95% của IC50 là 0,26 – 0,31 µg/ml. - Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa thể hiện tác dụng ức chế AChE in vitro với IC50 = 7,928 g/ml (khoảng tin cậy 95% của IC50 là 5,429-10,98 g/ml) gấp 36 lần giá trị IC50 của chất chuẩn donepezil. Như vậy, cao chiết giàu 29
39. alcaloid từ Thạch tùng răng cưa cĩ khả năng ức chế AChE tốt trên mơ hình thử nghiệm in vitro. 3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa Đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa in vitro theo phương pháp của Kumar [54]. Kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa và quercetin được trình bày ở bảng 3.1.2 sau đây: Bảng 3.1.2 Giá trị IC50 của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa và chất chuẩn quercetin Nồng độ % Ức chế IC50 (µg/ml) Mẫu (µg/ml) DPPH (Khoảng tin cậy 95% của IC50) 10 3,00 Cao 30 24,96 56,06 Thạch 50 44,15 (37,56-90,55) tùng răng 100 78,59 cưa 300 82,46 0,5 3,32 Quercetin 1 9,24 2,65 3 56,24 (1,89-3,03) 5 83,57 10 93,05 Nhận xét - Chất chuẩn quercetin thể hiện khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro với giá trị IC50 là 2,65 µg/ml và khoảng tin cậy 95% của IC50 là 1,89 – 3,03 µg/ml. - Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa thể hiện khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro với IC50 = 56,06 g/ml (khoảng tin cậy 95% của IC50 là 37,56 – 90,55 g/ml) gấp 21 lần giá trị IC50 của chất chuẩn quercetin. 30
40. 3.2. Kết quả đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa trên mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin 3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thơng qua thử nghiệm mê lộ Y Thử nghiệm mê lộ chữ Y được thực hiện vào ngày thứ 14 để đánh giá trí nhớ khơng gian ngắn hạn của động vật thử nghiệm. Mẫu thử được coi là cĩ tác dụng cải thiện trí nhớ của động vật thí nghiệm khi tỷ lệ chuyển tiếp giữa các cánh của động vật thử nghiệm ở nhĩm đĩ cao hơn nhĩm bệnh chứng (p 0,05) (kiểm định ANOVA). Nhận xét Kết quả cho thấy, chuột thuộc nhĩm chứng bệnh cĩ tỷ lệ chuyển tiếp giảm 21,78% (p<0,001) so với nhĩm chứng sinh lý. Nhĩm chuột dùng donepezil liều 5 mg/kg làm tăng tỷ lệ chuyển tiếp so với nhĩm chứng bệnh với tỷ lệ tăng là 15,01% (p<0,05). Hai nhĩm chuột uống cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg đều cĩ tỷ lệ chuyển tiếp giữa các cánh tăng 11,62% (p<0,01) và 19,82% (p<0,05) tương ứng so với nhĩm chứng bệnh. 31
41. Đối với nhĩm donepezil, tỷ lệ chuyển tiếp của nhĩm cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg giảm 2,94% (p>0,05) và liều 60 mg/kg tăng 4,18% (p>0,05). Sự khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê giữa hai nhĩm liều 30 mg/kg và 60 mg/kg (p>0,05). 3.2.2. Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thơng qua thử nghiệm mê lộ nước Morris Từ ngày 18 đến ngày 22, chuột thuộc các nhĩm được kiểm tra trí nhớ khơng gian dài hạn và khả năng học tập thơng qua thử nghiệm mê lộ nước Morris. Thử nghiệm gồm 2 bài tập (bài tập cĩ bến đỗ và bài tập khơng cĩ bến đỗ). Đánh giá hành vi thơng qua các thơng số: thời gian tìm thấy bến đỗ ở bài tập cĩ bến đỗ và thời gian lưu tại gĩc phần tư cĩ bến đỗ ở bài tập khơng cĩ bến đỗ.  Thời gian tìm thấy bến đỗ Kết quả của bài tập cĩ bến đỗ được trình bày ở hình 3.2.2. Hình 3.2.2 Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến thời gian tìm thấy bến đỗ ở bài tập cĩ bến đỗ Ghi chú: Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng M ± SE; #: khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm chứng sinh lý (p<0,001); *: khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm chứng bệnh (p<0,05); (kiểm định ANOVA) Nhận xét Từ kết quả nhận thấy, qua 4 ngày luyện tập, chuột thuộc tất cả các nhĩm đều cĩ xu hướng giảm dần thời gian tìm thấy bến đỗ. 32
42. So sánh thời gian tìm thấy bến đỗ giữa nhĩm chứng bệnh với nhĩm chứng sinh lý trong cùng một ngày: - Ngày 2: chuột thuộc nhĩm chứng bệnh cần 56,0 ± 5,1 giây để tìm thấy bến đỗ cịn chuột thuộc nhĩm chứng sinh lý cần 44,5 ± 3,9 giây để thực hiện hoạt động này, tỷ lệ chênh lệch là 20,53% (p <0,01). - Ngày 3: chuột thuộc nhĩm chứng bệnh lý và nhĩm chứng sinh lý cần thời gian tương ứng là 50,3 ± 5,0 và 35,5 ± 4,4 giây để tìm thấy bến đỗ, tỷ lệ chênh lệch là 29,42% (p<0,001). - Ngày 4: chuột thuộc nhĩm chứng sinh lý cĩ thời gian tìm thấy bến đỗ là 30,6 giây, giảm 50,0% so với ngày 1. Trong khi đĩ, thời gian tìm thấy bến đỗ của chuột thuộc nhĩm chứng bệnh là 45,3 giây, giảm 28,3% so với ngày đầu tiên. Như vậy, so với nhĩm chứng sinh lý, nhĩm chứng bệnh cĩ xu hướng ghi nhớ thơng tin kém hơn (sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê). Điều này cĩ nghĩa là scopolamin đã gây suy giảm trí nhớ và khả năng học tập của chuột [19]. So sánh với nhĩm chứng bệnh: nhĩm cao chiết cho thấy thời gian tìm thấy bến đỗ cĩ xu hướng giảm nhiều hơn (so sánh cùng ngày). Ở ngày 4, nhĩm cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và 60 mg/kg cĩ thời gian tìm thấy bến đỗ thấp hơn so với nhĩm chứng bệnh, tỷ lệ giảm lần lượt là 12,05% (p<0,05) và 17,57% (p<0,01).  Thời gian lưu tại gĩc phần tư cĩ bến đỗ Tại ngày thứ 5, bài tập khơng cĩ bến đỗ được tiến hành để đánh giá trí nhớ khơng gian dài hạn của động vật gặm nhấm. Mục tiêu của nhĩm nghiên cứu là đánh giá được khả năng củng cố trí nhớ đã được xây dựng trước đĩ. Chuột được coi là cĩ cải thiện trí nhớ khi thời gian lưu tại gĩc phần tư cĩ bến đỗ lâu hơn so với nhĩm bệnh chứng (p<0,05). Kết quả thời gian lưu tại gĩc phần tư cĩ bến đỗ của chuột ở ngày 5 được trình bày ở Hình 3.2.3: 33
43. Hình 3.2.3 Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa tới thời gian lưu tại gĩc phần tư cĩ bến đỗ ở bài tập khơng cĩ bến đỗ Ghi chú: Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng M ± SE; #: khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm chứng sinh lý (p 0,05) (kiểm định ANOVA). Nhận xét: Nhĩm chứng bệnh cĩ thời gian lưu tại gĩc phần tư cĩ bến đỗ ngắn hơn so với nhĩm chứng sinh lý với tỷ lệ giảm là 47,20% (p 0,05). Sự khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê giữa hai mức liều thử (p>0,05). 3.2.3. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hoạt độ AChE trong não Trong thử nghiệm trước đĩ, mẫu nghiên cứu đã thể hiện hoạt tính ức chế 34
44. enzym AChE tốt trên mơ hình in vitro. Để làm rõ hơn về cơ chế hoạt động của mẫu thử liên quan đến hoạt tính đề kháng hệ cholinergic, nhĩm nghiên cứu tiến hành định lượng hoạt độ enzym AChE trong thể đồng nhất mơ não chuột nhắt trắng sau khi kết thúc nghiên cứu. Mẫu nghiên cứu được coi là cĩ tác dụng ức chế enzym AChE khi hoạt độ AChE của nhĩm cao chiết thấp hơn nhĩm bệnh chứng (p 0,05) (kiểm định ANOVA). Nhận xét Kết quả của thử nghiệm định lượng AChE cho thấy nhĩm chứng bệnh cĩ hoạt độ enzym tăng đáng kể so với nhĩm chứng sinh lý với tỷ lệ tăng là 42,52% (p<0,01). Nhĩm chuột được cho uống donepezil liều 5 mg/kg cĩ biểu hiện giảm 17,91% (p<0,05) hoạt độ enzym AChE so với nhĩm chứng bệnh. Hai nhĩm uống cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg cĩ xu hướng làm giảm hoạt độ enzym AChE với tỷ lệ giảm 45,89% (p<0,001) và 52,57% (p<0,001) tương ứng so với nhĩm chứng bệnh. Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và 60 mg/kg làm giảm hoạt độ AChE so với nhĩm donepezil, 35
45. tỷ lệ giảm tương ứng là 34,77% (p 0,05) (kiểm định ANOVA). Nhận xét Kết quả của thử nghiệm cho thấy nhĩm chứng bệnh cĩ hàm lượng MDA trong mơ não cao hơn so với nhĩm chứng sinh lý với tỷ lệ tăng 27,59% (p<0,05). Nhĩm chuột dùng donepezil liều 5 mg/kg làm giảm đáng kể hàm lượng MDA với tỷ lệ giảm 36
46. 46,76% (p 0,05). Sự khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê giữa hai mức liều (p>0,05). 37
47. Chương 4 – BÀN LUẬN Sa sút trí nhớ và bệnh Alzheimer là căn bệnh phổ biến ở người cao tuổi nhưng cũng cĩ ghi nhận số ca mắc ở độ tuổi dưới 60. Bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống của cả người bệnh và gia đình, dẫn đến tử vong ở giai đoạn nặng. Tuy nhiên, các thuốc điều trị sa sút trí nhớ hiện nay cịn hạn chế về số lượng với 6 thuốc được chấp nhận trong điều trị sa sút trí nhớ thuộc hai nhĩm: nhĩm ức chế enzym acetylcholinesterase và nhĩm đối kháng thụ thể NMDA. Bản thân các thuốc này cịn cĩ nhiều nhược điểm như thời gian bán thải ngắn, tác dụng làm giảm triệu chứng nhưng khơng ngăn chặn hoặc làm chậm được diễn tiến bệnh, cùng các tác dụng phụ khơng mong muốn khi dùng thuốc. Trước những hạn chế trên, việc nghiên cứu phát triển thuốc mới là vơ cùng cần thiết. Trong đĩ, việc tìm kiếm thuốc mới từ các hợp chất tự nhiên là một hướng đi cĩ tính khả thi cao. Trên thế giới, cây Thạch tùng răng cưa đã được ghi nhận cĩ tác dụng tăng cường trí nhớ [45]. Hiện tại cĩ rất ít các nghiên cứu về lồi cây này ở Việt Nam. Hơn nữa mới chỉ cĩ nghiên cứu trên đối tượng cao chiết cồn. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa để đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mơ hình gây sa sút trí nhớ ở chuột nhắt trắng bằng scopolamin. 4.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE và chống oxy hĩa in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa 4.1.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro Enzym acetylcholinesterase (AChE) và giả thuyết cholinergic đĩng vai trị trung tâm trong nhiều nghiên cứu phát triển thuốc mới [17]. Trong đĩ, sự thiếu hụt acetylcholin và sự suy yếu của các thụ thể muscarinic và nicotin được cho là gây ra sa sút trí nhớ. AChE là enzym phân giải acetylcholin giúp kiểm sốt dẫn truyền tín hiệu thần kinh thơng qua hệ cholinergic. Sự hoạt động quá mức của AChE dẫn đến việc acetylcholin bị phân giải nhanh, gây thiếu hụt chất dẫn truyền thần kinh. Vì vậy, ức chế AChE được xem là mục tiêu để phát triển thuốc. Để đánh giá khả năng ức chế AChE, chúng tơi đã lựa chọn phương pháp đo độ hấp thụ quang của tác giả Ellman và cộng sự vì những ưu điểm như đơn giản, độ nhạy và tính lặp lại cao [25]. Donepezil là một trong số thuốc được FDA cấp phép sử dụng trong điều trị sa sút trí nhớ. Thuốc đã được cơng nhận cĩ tác dụng ức chế chọn lọc AChE và cải thiện trí nhớ đáng kể ở bệnh nhân mắc sa sút trí nhớ [56]. Trong nghiên cứu này, 38
48. donepezil được sử dụng làm mẫu chứng và cĩ giá trị IC50 với khoảng tin cậy 95% là 0,28 (0,26 – 0,31) g/ml. Kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu của tác giả Hachiro Sugimoto và cộng sự là 6,7 nM (khoảng 0,25 µg/ml) [56]. Điều này cho thấy phương pháp thử nghiệm của chúng tơi phù hợp và kết quả thu được cĩ ý nghĩa. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa cĩ tác dụng ức chế AChE với giá trị IC50 là 7,93 (5,43 – 10,98) g/ml; tương đồng với kết quả của tác giả Takuya Ohba và cộng sự đã cơng bố với giá trị IC50 = 5,96 µg/ml của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa tại Nhật Bản [45]. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thu và cộng sự đã đánh giá được tác dụng ức chế AChE in vitro của các phân đoạn dịch chiết từ lá và thân của Thạch tùng răng cưa thu hái tại Sapa, Lào Cai cho thấy phân đoạn dịch chiết EtOAc cĩ tác dụng ức chế AChE mạnh nhất với IC50 là 89,96 ± 3,42 µg/ml [6]. Kết quả trong nghiên cứu của chúng tơi cho thấy cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa cĩ tác dụng ức chế AChE in vitro tốt hơn phân đoạn dịch chiết cĩ tác dụng mạnh nhất của họ. Điều này chứng minh rằng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa cĩ tác dụng tốt hơn do alcaloid là thành phần chính cĩ trong cao chiết. 4.1.2. Về kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do in vitro Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH được sử dụng trong nhiều nghiên cứu do độ chính xác cao, đơn giản, nhanh và chi phí thấp. Trong cơ thể, quá trình sản sinh các gốc tự do và chống oxy hĩa luơn xảy ra đồng thời. Sự mất cân bằng giữa hai quá trình nĩi trên với sự gia tăng các gốc tự do được gọi là tình trạng stress oxy hĩa. Tổn thương các phân tử sinh học (protein, lipid, DNA, ) và tạo ra nhiều gốc tự do khác là hậu quả của tình trạng này. Stress oxy hĩa cĩ liên quan đến viêm và các bệnh thối hĩa thần kinh [34]. Trong đĩ, sa sút trí nhớ được tin tưởng là do các gốc tự do gĩp phần tạo thành. Các chất chống oxy hĩa cĩ vai trị quét sạch các gốc tự do và các ion kim loại, giúp ngăn chặn stress oxy hĩa và bảo vệ tế bào thần kinh khỏi các gốc tự do. Quercetin là một hợp chất thường được dùng làm mẫu chứng trong đánh giá khả năng dọn gốc tự do in vitro. Vì kết quả nghiên cứu của chúng tơi cho thấy quercetin cĩ tác dụng chống oxy với IC50 là 2,65 (1,89 – 3,03) g/ml, tương đồng với nghiên cứu trước đây [58]. Cho nên phương pháp thử nghiệm của chúng tơi là phù hợp. Kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro cho thấy cao chiết giàu alcaloid của Thạch tùng răng cưa cĩ IC50 = 56,06 (37,56 – 90,55) g/ml. Do 39
49. hiện nay chưa cĩ nghiên cứu đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro của cao chiết tồn phần, phân đoạn chiết hay cao chiết giàu alcaloid của Thạch tùng răng cưa nên chúng tơi khơng thể bàn luận thêm. Từ kết quả của 2 thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế AChE và khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro, chúng tơi đã đánh giá rằng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa cĩ tiềm năng cải thiện trí nhớ trên động vật thử nghiệm. 4.2. Về kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa Gỉa thuyết cholinergic cho rằng sự giảm sút chất dẫn truyền thần kinh hệ cholinergic và sự suy yếu các thụ thể nicotinic và muscarinic gây suy giảm khả năng nhớ và nhận thức [17]. Các mơ hình sa sút trí nhớ sử dụng các chất đối kháng hệ cholinergic để làm giảm lượng chất dẫn truyền thần kinh. Một trong số các chất này là scopolamin. Scopolamin là một chất đối kháng với chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin, gây giảm trí nhớ và nhận thức ở chuột [65]. Đề tài sử dụng mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin khơng địi hỏi khắt khe về điều kiện vật chất và kỹ thuật, đồng thời cĩ độ lặp lại và tỷ lệ sống sĩt cao nên được lựa chọn để thực hiện thử nghiệm. Chuột được tiêm scopolamin liều 3 mg/kg ở thử nghiệm mê lộ chữ Y và tiêm scopolamin liều 1 mg/kg ở thử nghiệm mê lộ nước Morris. Trong thời gian tiến hành thử nghiệm đánh giá trí nhớ và khả năng nhận thức của chuột, các yếu tố như ánh sáng, nhiệt độ, tiếng ồn, được kiểm sốt để đảm bảo khơng gây ảnh hưởng đến kết quả thực nghiệm. Tất cả các thử nghiệm đều được thực hiện trong pha tối của động vật thử nghiệm để phù hợp với đặc tính hoạt động vào ban đêm của lồi gặm nhấm. 4.2.1. Về kết quả của thử nghiệm hành vi 4.2.1.1. Về kết quả của thử nghiệm mê lộ chữ Y Thử nghiệm mê lộ chữ Y là một thử nghiệm đơn giản được ứng dụng để đánh giá trí nhớ khơng gian ngắn hạn dựa vào hành vi thích khám phá của chuột. Thử nghiệm cĩ ưu điểm nổi bật là thực hiện dễ dàng, yêu cầu ít trang thiết bị và tiết kiệm. Thơng số đánh giá là tỷ lệ chuyển tiếp. Chuột được coi là cĩ trí nhớ tốt khi tăng tỷ lệ chuyển tiếp và ngược lại. Kết quả của thử nghiệm cho thấy chuột thuộc nhĩm chứng bệnh cĩ tỷ lệ thay đổi chuyển tiếp giảm 21,78% so với nhĩm chứng sinh lý (p<0,001). Điều này cĩ nghĩa là scopolamin liều 3 mg/kg đã gây suy giảm trí nhớ ở chuột thuộc nhĩm chứng 40
50. bệnh. Các nhĩm cao chiết liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg cĩ cải thiện trí nhớ rõ rệt với tỷ lệ chuyển tiếp tăng cĩ ý nghĩa thống kê lần lượt là 11,62% (p 0,05). 4.2.1.2. Về kết quả thử nghiệm mê lộ nước Morris Thử nghiệm mê lộ nước Morris được áp dụng để đánh giá khả năng học tập và trí nhớ khơng gian dài hạn của lồi gặm nhấm. Thử nghiệm dựa vào bản năng sinh tồn của động vật sống trên cạn: khi đưa vào nước, chúng sẽ cố gắng bơi và tìm cách trốn thốt khỏi mơi trường xa lạ. Mơ hình thử nghiệm cho phép động vật thử nghiệm tự do lựa chọn hướng di chuyển. Do đĩ, thử nghiệm hạn chế được những sai số khơng cần thiết. Thử nghiệm kéo dài trong 5 ngày, bao gồm 4 ngày luyện tập bài tập cĩ bến đỗ và 1 ngày thực hiện bài tập khơng cĩ bến đỗ. Thơng số đánh giá thử nghiệm là thời gian tìm thấy bến đỗ (bài tập cĩ bến đỗ) và thời gian lưu tại gĩc phần tư cĩ bến đỗ (bài tập khơng cĩ bến đỗ). Trong thử nghiệm mê lộ nước Morris, ở ngày 4, thời gian tìm thấy bến đỗ của nhĩm cao chiết liều 30 mg/kg và 60 mg/kg đều giảm cĩ ý nghĩa thống kê với nhĩm chứng bệnh, tỷ lệ giảm lần lượt là 12,05% (p<0,05) và 17,57% (p<0,01). Cho thấy nhĩm cao chiết liều 30 mg/kg và 60 mg/kg được cải thiện trí nhớ và khả năng học tập tiến bộ hơn nhĩm chứng bệnh. Tại ngày thứ 5, kết quả cho thấy nhĩm cao chiết liều 30 mg/kg và 60 mg/kg đều tăng thời gian lưu tại gĩc phần tư cĩ bến đỗ cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm chứng bệnh với tỷ lệ tăng lần lượt là 36,39% (p<0,05) và 48,82% (p<0,01). Như vậy, cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa cĩ tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian dài hạn và khả năng học tập của chuột thơng qua thử nghiệm mê lộ nước Morris. Ở Việt Nam, tác giả Nguyễn Ngọc Chương và cộng sự đã chứng minh cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa liều 0,533 g/kg cĩ tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bị gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin dùng đường uống (1 mg/kg) (thơng qua thử nghiệm mê lộ nước Morris) [3]. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của tác giả 41
51. Nguyễn Thị Thu Hiền ghi nhận tác dụng cải thiện trí nhớ ở chuột dùng cao chiết tồn phần liều 600 mg/kg trong khi liều 300 mg/kg cĩ xu hướng tăng trí nhớ nhưng khơng cĩ ý nghĩa thống kê (thơng qua mê lộ chữ Y và mê lộ nước Morris) [2]. Từ những nghiên cứu vừa kể trên, chúng tơi nhận thấy liều cĩ tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết tồn phần là 533 – 600 mg/kg cao hơn hẳn so với liều cĩ tác dụng của cao chiết giàu alcaloid. Điều này cĩ thể giải thích do alcaloid là thành phần chính cĩ tác dụng chống sa sút trí nhớ trong dược liệu Thạch tùng răng cưa. 4.2.2. Về kết quả định lượng các marker sinh học 4.2.2.1. Về kết quả định lượng hoạt độ AChE trong thể đồng nhất não chuột Một ngày sau khi thử nghiệm trên chuột kết thúc, tiến hành định lượng hoạt độ AChE trong mơ não của chuột thuộc từng nhĩm. Mục đích thử nghiệm này nhắm tới là tìm hiểu cơ chế liên quan đến hoạt động ức chế AChE của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa. Kết quả cho thấy 2 mức liều cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đều cĩ tác dụng ức chế AChE trong mơ não của động vật thử nghiệm, tỷ lệ giảm cĩ ý nghĩa thống kê lần lượt là 45,89% (p<0,001), 52,57% (p<0,001) so với nhĩm chứng bệnh. Sự khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê giữa các nhĩm cao chiết. Điều này phù hợp với kết quả của 2 test hành vi là mê lộ chữ Y và test mê lộ nước Morris: chuột ở 2 nhĩm cao chiết đều cải thiện trí nhớ khơng gian. Từ đĩ cho thấy cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa cĩ tác dụng cải thiện trí nhớ theo cơ chế cĩ liên quan với sự điều tiết hệ thống cholinergic thơng qua ức chế AChE. Một nghiên cứu khác cũng chỉ ra cao chiết tồn phần liều 300 mg/kg và 600 mg/kg đều làm giảm hoạt độ AChE trong não chuột với tỷ lệ giảm lần lượt là 12,15% (p<0,05) và 24,77% (p<0,001) so với nhĩm chứng bệnh [2]. Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa cĩ tác dụng vượt trội hơn trong làm giảm hoạt độ AChE so với cao chiết tồn phần giải thích tương tự do sự khác biệt thành phần của 2 mẫu cao chiết. Ngồi ra khi so sánh với nhĩm chứng dương, cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và 60 mg/kg thể hiện tác dụng ức chế AChE trong thể đồng nhất não chuột tốt hơn so với nhĩm donepezil, tỷ lệ giảm tương ứng là 34,77% (p<0,05) và 43,45% (p<0,05). Trong khi đĩ, kết quả đánh giá in vitro cho thấy donepezil cĩ tác dụng ức chế AChE tốt hơn cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa. Điều này gợi ý cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa cĩ lẽ sở hữu đặc tính dược động học vượt trội hơn donepezil. Hiện nay ngồi một nghiên cứu 42
52. đánh giá tác dụng ức chế AChE in vivo của cao chiết tồn phần của Thạch tùng răng cưa thì chỉ cĩ nghiên cứu đánh giá tác dụng của Hup A. Theo nghiên cứu của Yan Qi Liang, Hup A cĩ tiềm năng vượt trội hơn donepezil và rivastigmin trong việc gia tăng hàm lượng acetylcholin và kéo dài thời gian tác dụng ức chế AChE trong vỏ não chuột [68]. 4.2.2.2. Về ảnh hưởng của cao chiết alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hàm lượng MDA trong mơ não Quá trình peroxy hĩa lipid là quá trình oxy hĩa các acid béo khơng bão hịa tạo thành các gốc tự do thơng qua khử H+. Các sản phẩm của quá trình peroxy hĩa lipid chủ yếu là lipid hydroperoxid (LOOH) và những sản phẩm phụ khác như malondialdehyd (MDA), propanal, hexanal, 4-hydroxynonenal (4-HNE), Ở não, các phân tử lipid tập trung với mật độ cao và mức tiêu thụ oxy của não lớn nên quá trình peroxid hĩa lipid diễn ra mạnh mẽ. Trong điều kiện bệnh lý, các gốc tự do được sản sinh quá mức cĩ thể gây tổn thương và gây chết tế bào thần kinh. Các nghiên cứu trước đây chủ yếu sử dụng malondialdehyd (MDA) như một marker sinh học hữu ích đế đánh giá quá trình peroxid hĩa lipid ở não của động vật thử nghiệm do sự đơn giản và chi phí thấp. Kết quả nghiên cứu cho thấy scopolamin làm tăng hàm lượng MDA trong não của động vật thí nghiệm 27,59% (p<0,05) so với nhĩm chứng sinh lý. Kết quả này phù hợp với cộng nhận scopolamin là tác nhân làm tăng biểu hiện stress oxy hĩa trong não thơng qua peroxy hĩa lipid và làm giảm khả năng chống oxy hĩa của não bộ [45]. Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và 60 mg/kg cĩ tác dụng ức chế quá trình peroxy hĩa lipid màng tế bào não chuột khi làm giảm hàm lượng MDA với tỷ lệ giảm lần lượt là 36,81% (p<0,01), 43,17% (p<0,01) so với nhĩm chứng bệnh. Kết quả này phù hợp với một nghiên cứu gần đây cho thấy cao chiết tồn phần liều 300 mg/kg và 600 mg/kg cân nặng đều cĩ tác dụng giảm nồng độ MDA trong não chuột với tỷ lệ giảm lần lượt là 23,44% (p<0,001) và 38,40% (p<0,001) so với nhĩm chứng bệnh [2]. Sự khác biệt về ảnh hưởng của mức liều đến hàm lượng MDA trong não chuột được giải thích là do khác biệt về thành phần của cao chiết. Ngồi ra, Hup A là một hợp chất alcaloid cĩ tác dụng nổi bật trong cây Thạch tùng răng cưa. Theo tác giả Liang YZ và cộng sự, sử dụng Hup A liều 0,05 mg/kg làm giảm rõ rệt nồng độ MDA và hoạt động của Mn-SOD ở chuột lão hĩa giống đực sau 7 -14 ngày điều trị liên tiếp. Trong khi ở chuột đực trường thành khơng 43
53. cĩ báo cáo về sự thay đổi của hai thơng số này sau 7 – 14 ngày liên tục sử dụng Hup A liều 0,05 mg/kg [53]. Những kết quả trên cho thấy cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa là đối tượng nghiên cứu cĩ tiềm năng để phát triển sản phẩm hỗ trợ cải thiện trí nhớ và điều trị bệnh sa sút trí nhớ. 44
54. Chương 5 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận 1. Đánh giá được tác dụng ức chế AChE và khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.): - Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa cĩ tác dụng ức chế AChE in vitro với IC50 = 7,928 (5,429-10,98) g/ml. - Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa cĩ khả năng dọn gốc tự do in vitro với IC50 = 56,06 (37,56 – 90,55) g/ml. 2. Triển khai mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin nhằm đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.) thơng qua các thử nghiệm:  Đánh giá thơng qua thử nghiệm hành vi: - Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg cĩ tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian ngắn hạn thơng qua thử nghiệm mê lộ chữ Y với tỷ lệ chuyển tiếp tăng cĩ ý nghĩa thống kê lần lượt là 11,62% (p<0,05) và 19,82% (p<0,01) so với nhĩm chứng bệnh - Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg cĩ tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian dài hạn và khả năng học tập thơng qua thử nghiệm mê lộ nước Morris: + Thời gian tìm thấy bến đỗ ở nhĩm sử dụng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg thấp hơn so với nhĩm chứng bệnh với tỷ lệ giảm lần lượt là 12,05% (p<0,05) và 17,57% (p<0,01). + Thời gian bơi tại gĩc phần tư cĩ bến đỗ ở nhĩm sử dụng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg lâu hơn so với nhĩm chứng bệnh với tỷ lệ tăng lần lượt là 36,39% (p<0,05) và 48,82% (p<0,01).  Đánh giá thơng qua marker sinh học: - Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg cĩ khả năng ức chế AChE trong thể đồng nhất mơ não chuột nhắt trắng với giá 45
55. trị hoạt độ AChE giảm tương ứng 45,89% (p<0,001) và 52,57% (p<0,001) so với nhĩm chứng bệnh. - Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg và liều 60 mg/kg cĩ khả năng ức chế quá trình peroxy hĩa lipid màng tế bào ở chuột nhắt trắng với tỷ lệ giảm tương ứng là 36,81% (p<0,01) và 43,17% (p<0,01). 46
56. Đề xuất  Tiếp tục các nghiên cứu đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa trên các mơ hình thực nghiệm khác.  Phân lập và xác định chất hoặc nhĩm chất cĩ tác dụng cải thiện trí nhớ trong cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa. 47
57. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Bộ Y tế (2010), Triệu chứng học thần kinh, tr. 157. [2] Nguyễn Thị Thu Hiền (2020), Triển khai mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin và áp dụng đánh giá tác dụng của cao chiết tồn phần từ cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.), Khĩa luận tốt nghiệp đại học ngành dược học, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội. [3] Nguyễn Ngọc Chương và cộng sự (2013), "Nghiên cứu tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ của các cao chiết cồn từ hai lồi thạch tùng thuộc họ Lycopodiaceae trên chuột nhắt trắng", Tạp chí y học TP.Hồ Chí Minh, Tập 17, tr. 243-248. [4] Nguyễn Ngọc Hịa và cộng sự (2009), "Nghiên cứu tỉ lệ mắc sa sút trí tuệ ở người cao tuổi tại huyện Ba Vì - Hà Tây cũ (2005 - 2006) ", Y học thực hành (662) - số 5/2009. [5] Nguyễn Quang Hiệu (2017), Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hĩa học của hai lồi Huperzia, họ Thạch tùng (lycopodiaceae) thu hái ở Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Luận văn thạc sĩ dược học, Đại học Dược Hà Nội. [6] Nguyễn Thị Kim Thu và cộng sự (2016), "Tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase của các phân đoạn dịch chiết Thạch tùng răng cưa (Huperza serrata)", Tạp chí Dược học, Số 11/2016, tr. 49-53. [7] Nguyễn Thị Thu Hồi (2020), Nghiên cứu tác dụng theo hướng chống sa sút trí nhớ của Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.) trên một số mơ hình thực nghiệm, Luận văn thạc sĩ dược học, Đại học Dược Hà Nội. [8] Phạm Hồng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Tập 1, NXB Trẻ, tr 22-26. [9] Phạm Thắng (2010), "Nghiên cứu dịch tễ về sa sút trí tuệ ở người cao tuổi tại cộng đồng", Y học thực hành. 5, tr. 715 [10] Uỷ ban Dân số và gia đình trẻ em (2006), Dự báo dân số, gia đình và trẻ em Việt Nam đến 2025, Hà Nội. [11] Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam (Bộ mới), Vol. II, Nhà xuất bản Y học, tr. 565. [12] Vũ Anh Nhị và cộng sự (2015), Nghiên cứu dịch tễ bệnh lý sa sút trí tuệ tại tp.hcm Hội nghị khoa học Y tế cơng cộng lần 2 của Hội Y tế cơng cộng TPHCM, tr. 8.
58. [13] Vũ Thị Ngọc (2016), "Định tính và định lượng Huperzine A trong cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) ở Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng". Tài liệu tiếng Anh [14] Alam Md Nur et al. (2013), "Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity", Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), pp. 143-152. [15] Alzheimer's Association (2019), "2019 Alzheimer's disease facts and figures", Alzheimer's & Dementia. 15 (3), pp. 321-387. [16] Balaban CD et al. (1988), "Trimethyltin-induced neuronal damage in the rat brain: comparative studies using silver degeneration stains, immunocytochemistry and immunoassay for neuronotypic and gliotypic proteins", Neuroscience. 26 (1), pp. 337-361. [17] Bartus Raymond T et al. (1982), "The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction", Science. 217 (4558), pp. 408-414. [18] BK et al. (2007), "Wound healing activity of Lycopodium serratum", Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 69 (2), pp. 283. [19] Broks P et al. (1988), "Modelling dementia: effects of scopolamine on memory and attention", Neuropsychologia. 26 (5), pp. 685-700. [20] Chen Ruey et al. (2017), "Treatment effects between monotherapy of donepezil versus combination with memantine for Alzheimer disease: a meta-analysis", PLoS One. 12 (8). [21] Cheng Dong Hang et al. (1996), "Huperzine A, a novel promising acetylcholinesterase inhibitor", Neuroreport. 8 (1), pp. 97-101. [22] Davies Peter et al. (1976), "Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease", The Lancet. 308 (8000), pp. 1403. [23] Dellu F et al. (1992), "A two-trial memory task with automated recording: study in young and aged rats", Brain research. 588 (1), pp. 132-139. [24] Dong Xiao-xia et al. (2009), "Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases", Acta Pharmacologica Sinica. 30 (4), pp. 379-387. [25] Ellman George L et al. (1961), "A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity", Biochemical pharmacology. 7 (2), pp. 88-95. [26] Gao Xin et al. (2009), "Huperzine A protects isolated rat brain mitochondria against β-amyloid peptide", Free Radical Biology and Medicine. 46 (11), pp. 1454-1462.
59. [27] Gérard-Monnier Dominique et al. (1998), "Reactions of 1-methyl-2- phenylindole with malondialdehyde and 4-hydroxyalkenals. Analytical applications to a colorimetric assay of lipid peroxidation", Chemical research in toxicology. 11 (10), pp. 1176-1183. [28] Gersner R et al. (2015), "Huperzine A prophylaxis against pentylenetetrazole- induced seizures in rats is associated with increased cortical inhibition", Epilepsy research. 117, pp. 97-103. [29] HAGLER ALLEN N et al. (1981), "Rapid diazonium blue B test to detect basidiomycetous yeasts", International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 31 (2), pp. 204-208. [30] Ham Young-Min et al. (2012), "Investigation of the component of Lycopodium serratum extract that inhibits proliferation and mediates apoptosis of human HL-60 leukemia cells", Food and chemical toxicology. 50 (8), pp. 2629-2634. [31] Hardy John et al. (2002), "The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics", science. 297 (5580), pp. 353-356. [32] Hozumi Soichi et al. (2003), "Characteristics of changes in cholinergic function and impairment of learning and memory-related behavior induced by olfactory bulbectomy", Behavioural brain research. 138 (1), pp. 9-15. [33] Ittner Lars M et al. (2011), "Amyloid-β and tau—a toxic pas de deux in Alzheimer's disease", Nature Reviews Neuroscience. 12 (2), pp. 67-72. [34] Izquierdo Alicia et al. (2006), "Brief uncontrollable stress causes dendritic retraction in infralimbic cortex and resistance to fear extinction in mice", Journal of Neuroscience. 26 (21), pp. 5733-5738. [35] Jaswinder Kaur et al. (2016), "A systematic review on Huperzia serrata", International Journal of Pharmacognosy and Phytochemical Research. 8 (8), pp. 1250-1255. [36] Kraeuter Ann-Katrin et al. (2019), "The Y-maze for assessment of spatial working and reference memory in mice", Pre-Clinical Models, Springer, pp. 105-111. [37] Liu Jia-Sen et al. (1986), "The structures of huperzine A and B, two new alkaloids exhibiting marked anticholinesterase activity", Canadian Journal of Chemistry. 64 (4), pp. 837-839.
60. [38] Liu L et al. (2013), "Effect of huperzine A on neural lesion of acute organophosphate poisoning in mice", Wei sheng yan jiu= Journal of hygiene research. 42 (3), pp. 419-423. [39] Maridass M et al. (2009), "Investigation of phytochemical and antimicrobial activity of Huperzia Species", Pharmacologyonline. 3, pp. 688-692. [40] McShane Rupert et al. (2019), "Memantine for dementia", Cochrane database of systematic reviews(3). [41] Mimica Ninoslav et al. (2009), "Side effects of approved antidementives", Psychiatria Danubina. 21 (1), pp. 108-113. [42] Morales-Medina JC et al. (2013), "Impaired structural hippocampal plasticity is associated with emotional and memory deficits in the olfactory bulbectomized rat", Neuroscience. 236, pp. 233-243. [43] More Sandeep Vasant et al. (2016), "Toxin-induced experimental models of learning and memory impairment", International journal of molecular sciences. 17 (9), pp. 1447. [44] Morris Richard GM (1981), "Spatial localization does not require the presence of local cues", Learning and motivation. 12 (2), pp. 239-260. [45] Ohba Takuya et al. (2015), "Japanese Huperzia serrata extract and the constituent, huperzine A, ameliorate the scopolamine-induced cognitive impairment in mice", Bioscience, biotechnology, and biochemistry. 79 (11), pp. 1838-1844. [46] Park Ju-Yeon et al. (2018), "Ethanol Extract of Lycopodium serratum Thunb. Attenuates Lipopolysaccharide-Induced C6 Glioma Cells Migration via Matrix Metalloproteinase-9 Expression", Chinese journal of integrative medicine. 24 (11), pp. 860-866. [47] Patterson C (2018), World Alzheimer Report 2018: the state of the art of dementia research: new frontiers, Alzheimer’s Disease International (ADI): London, UK. [48] Peđa-Bautista Carmen et al. (2019), "Free radicals in Alzheimer's disease: Lipid peroxidation biomarkers", Clinica Chimica Acta. [49] Prince Martin James et al. (2015), "World Alzheimer Report 2015: The Global Impact of Dementia: an Analysis of Prevalence", Incidence, Cost and Trends. 2017. [50] Rafii MS et al. (2011), "A phase II trial of huperzine A in mild to moderate Alzheimer disease", Neurology. 76 (16), pp. 1389-1394.
61. [51] Sah Saroj Kumar et al. (2017), "Effect of high-fat diet on cognitive impairment in triple-transgenic mice model of Alzheimer's disease", Biochemical and biophysical research communications. 493 (1), pp. 731-736. [52] Salkovic-Petrisic Melita et al. (2014), "Long-term oral galactose treatment prevents cognitive deficits in male Wistar rats treated intracerebroventricularly with streptozotocin", Neuropharmacology. 77, pp. 68-80. [53] Shang Ya-Zhen et al. (1999), "Improving effects of huperzine A on abnormal lipid peroxidation and superoxide dismutase in aged rats", Zhongguo yao li xue bao= Acta pharmacologica Sinica. 20 (9), pp. 824-828. [54] Singh Sandeep Kumar et al. (2018), "Evaluation of phenolic composition, antioxidant, anti-inflammatory and anticancer activities of Polygonatum verticillatum (L.)", Journal of integrative medicine. 16 (4), pp. 273-282. [55] Sodhi Rupinder K et al. (2014), "Animal models of dementia and cognitive dysfunction", Life sciences. 109 (2), pp. 73-86. [56] Sugimoto Hachiro et al. (2002), "Research and development of donepezil hydrochloride, a new type of acetylcholinesterase inhibitor", The Japanese journal of pharmacology. 89 (1), pp. 7-20. [57] T O'Brien John et al. (2015), "Vascular dementia", The Lancet. 386 (10004), pp. 1698-1706. [58] Takao (2015), " Antioxidant activity and phenolic content of leaf infusions of Myrtaceae species from Cerrado (Brazilian Savanna).", Brazilian Journal of Biology, 75(4), 948-952. [59] Takeda Toshio (2009), "Senescence-accelerated mouse (SAM) with special references to neurodegeneration models, SAMP8 and SAMP10 mice", Neurochemical research. 34 (4), pp. 639-659. [60] Vorhees Charles V et al. (2006), "Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory", Nature protocols. 1 (2), pp. 848. [61] Wang Juan et al. (2010), "Huperzine a improves chronic inflammation and cognitive decline in rats with cerebral hypoperfusion", Journal of neuroscience research. 88 (4), pp. 807-815. [62] Wang Zhi‐Fei et al. (2008), "Huperzine A exhibits anti‐inflammatory and neuroprotective effects in a rat model of transient focal cerebral ischemia", Journal of neurochemistry. 106 (4), pp. 1594-1603.
62. [63] Wasowicz Wojciech et al. (1993), "Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid-reactive substances in serum: importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage", Clinical chemistry. 39 (12), pp. 2522-2526. [64] Watkins Paul B et al. (1994), "Hepatotoxic effects of tacrine administration in patients with Alzheimer's disease", Jama. 271 (13), pp. 992-998. [65] WM et al. (1986), "Patterns of memory failure after scopolamine treatment: implications for cholinergic hypotheses of dementia", Behavioral and Neural Biology. 45 (2), pp. 196-211. [66] World Health Organization (1992), "The ICD-10 classification of mental and behavioural disorders: clinical descriptions and diagnostic guidelines", Weekly Epidemiological Record= Relevé épidémiologique hebdomadaire. 67 (30), pp. 227-227. [67] Yamada Kaoru et al. (2011), "In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice", Journal of Neuroscience. 31 (37), pp. 13110-13117. [68] Liang et al. (2006), "Comparative studies of huperzine A, donepezil, and rivastigmine on brain acetylcholine, dopamine, norepinephrine, and 5- hydroxytryptamine levels in freely-moving rats", Acta Pharmacologica Sinica. 27 (9), pp. 1127-1136.
63. PHỤ LỤC