Khóa luận Đánh giá mối liên quan giữa độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen CYP2C192, CYP2C193 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định tại Viện Tim mạch Việt Nam

82 trang thiennha21 18/04/2022 4430

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Đánh giá mối liên quan giữa độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định tại Viện Tim mạch Việt Nam", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_danh_gia_moi_lien_quan_giua_do_ngung_tap_tieu_cau.pdf

Nội dung text: Khóa luận Đánh giá mối liên quan giữa độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen CYP2C192, CYP2C193 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định tại Viện Tim mạch Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC VŨ PHƯƠNG THẢO ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐỘ NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI KIỂU GEN CYP2C19*2, CYP2C19*3 VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ KHÁC TRÊN BỆNH NHÂN ĐAU THẮT NGỰC KHÔNG ỔN ĐỊNH TẠI VIỆN TIM MẠCH VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2018
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: VŨ PHƯƠNG THẢO ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐỘ NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI KIỂU GEN CYP2C19*2, CYP2C19*3 VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ KHÁC TRÊN BỆNH NHÂN ĐAU THẮT NGỰC KHÔNG ỔN ĐỊNH TẠI VIỆN TIM MẠCH VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2013.Y Người hướng dẫn: 1. ThS.BS. Nguyễn Thị Thúy Mậu 2. ThS.BS. Vũ Ngọc Trung Hà Nội - 2018
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô, nhà trường, bệnh viện, gia đình và bạn bè. Lời đầu tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin trân trọng cảm ơn ThS.BS. Nguyễn Thị Thúy Mậu và ThS.BS. Vũ Ngọc Trung là người hướng dẫn khoa học, người thầy đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn đề tài khoa học công nghệ cấp ĐHQGHN, mã số QG.15.32 đã cung cấp kinh phí, tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Khoa Y Dược cùng các thầy cô bộ môn Y Dược học cơ sở đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các bác sỹ và nhân viên Viện Tim mạch Việt Nam đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện nghiên cứu. Xin bày tỏ lòng biết ơn và sự yêu thương đến gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn ở bên cổ vũ, khuyến khích, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận này. Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới những bệnh nhân đã tham gia vào nhóm nghiên cứu, sự đóng góp của các bệnh nhân đã giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. Hà Nội, ngày 28 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Vũ Phương Thảo @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ACC American college of Cardiology: Trường môn Tim mạch Hoa Kỳ AHA American Heart Association: Hiệp hội Tim mạch Hoa Kỳ ADP Adenosin diphosphate CK - MB Creatine Kinase Myocardial Band isoenzyme COX Cyclooxygenase CRP C-Reactive Protein: Protein phản ứng C DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyrinucleotidtriphosphate ĐMV Động mạch vành ĐTNKÔĐ Đau thắt ngực không ổn định ĐTĐ Đái tháo đường EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid GTT Giải trình tự GP Glycoprotein G-protein Group protein HCĐMVC Hội chứng động mạch vành cấp HDL High Density Lipoprotein: Lipoprotein có tỷ trọng phân tử cao LDL Low Density Lipoprotein: Lipoprotein có tỷ trọng phân tử thấp MCV Mean Corpuscular Volume: Thể tích trung bình hồng cầu MPV Mean Platelet Volume: Thể tích trung bình tiểu cầu NMCT Nhồi máu cơ tim NTTC Ngưng tập tiểu cầu PCR Polymerase chain reaction: Phản ứng chuỗi polymerase PGH2 Prostaglandin H2 PGI2 Prostaglandin I2 PLT Platelet Count: Số lượng tiểu cầu RBC Red Blood Cell: Số lượng hồng cầu RLCH lipid Rối loạn chuyển hóa lipid RFLP Restriction fragment length polymorphism: Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn SNP Single Nucleotide polymorphism: Đa hình đơn nucleotide THA Tăng huyết áp @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
TXA2 Thromboxan A2 vWF von Willebrand factor: yếu tố von Willebrand WBC White Blood Cell: Số lượng bạch cầu XVĐM Xơ vữa động mạch @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Trình tự mồi nhân dòng các alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 24 Bảng 2.2. Quy trình PCR cho alen *2 25 Bảng 2.3. Quy trình PCR cho alen *3 25 Bảng 2.4. Quy trình RFLP để phân tích kiểu gen của alen *2 26 Bảng 2.5. Quy trình RFLP để phân tích kiểu gen của alen *3 26 Bảng 2.6. Cách đọc kết quả kiểu gen CYP2C19 27 Bảng 3.1. Phân bố các yếu tố nguy cơ ở nhóm nghiên cứu 32 Bảng 3.2. Kết quả cận lâm sàng của nhóm nghiên cứu 33 Bảng 3.3. Kết quả đo độ NTTC của bệnh nhân ĐTNKÔĐ 34 Bảng 3.4. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của sản phẩm tách DNA 34 Bảng 3.5. Kết quả kiểu gen và tần số alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 39 Bảng 3.6. Tần số phân bố các kiểu gen CYP2C19 của nhóm nghiên cứu 39 Bảng 3.7. Tỉ lệ phân loại theo mức tác dụng dược lý do kiểu gen quy định 40 Bảng 3.8. Độ NTTC giữa các kiểu gen trong CYP2C19*3 40 Bảng 3.9. Độ NTTC giữa các kiểu gen trong CYP2C19*2 40 Bảng 3.10. Độ NTTC giữa các kiểu tác dụng dược lý do kiểu gen quy định 41 Bảng 3.11. Mối liên quan giữa độ NTTC với một số yếu tố nguy cơ: Hút thuốc lá, RLCH lipid, ĐTĐ, THA và béo phì 42 Bảng 3.12. Mối liên quan giữa độ NTTC với số lượng yếu tố nguy cơ 43 Bảng 3.13. Mối liên quan giữa độ NTTC với một số yếu tố cận lâm sàng 43 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Phân bố số lượng bệnh nhân ĐTNKÔĐ theo giới 31 Biểu đồ 3.2. Đặc điểm về tuổi của bệnh nhân ĐTNKÔĐ 31 Biểu đồ 3.3. Phân bố số lượng yếu tố nguy cơ của bệnh nhân ĐTNKÔĐ 32 Biểu đồ 3.4. Độ NTTC giữa các kiểu gen trong CYP2C19*2 41 Biểu đồ 3.5. Độ NTTC giữa tác dụng (giảm + kém) và tác dụng bình thường 41 Biểu đồ 3.6. Tần số alen của gen CYP2C19 51 Biểu đồ 3.7. So sánh tần số phân bố các alen CYP2C19 52 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ 4 Hình 1.2. Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng 5 Hình 1.3. Bám dính và ngưng tập tiểu cầu 7 Hình 1.4. Cơ chế tác dụng của aspirin lên quá trình NTTC 8 Hình 1.5. Quá trình chuyển hóa clopidogrel và công thức cấu tạo của các chất sau mỗi bước chuyển hóa 9 Hình 1.6. Cơ chế tác dụng clopidogrel lên quá trình NTTC 10 Hình 1.7. Mô tả single nucleotide polymorphism (SNP) 10 Hình 1.8. Vị trí gen CYP2C19 trên nhiễm sắc thể số 10 12 Hình 1.9. Vị trí của các exon (hộp đen) và một số alen trên gen CYP2C19 12 Hình 1.10. Vai trò của enzyme Cytochrome P450 trong chuyển hóa thuốc 15 Hình 1.11. Quy trình PCR 16 Hình 1.12. Các kiểu cắt RE 17 Hình 2.1. Nguyên lý của xét nghiệm độ NTTC 28 Hình 3.1. Điện di DNA tổng số trên gel Agarose 0,7% 35 Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR nhân vùng gen chứa alen CYP2C19*2 (719 bp) và CYP2C19*3 (898 bp) trên gel agarose 1% 35 Hình 3.3. Kết quả giải trình tự alen CYP2C19*2 36 Hình 3.4. Kết quả giải trình tự alen CYP2C19*3 37 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm cắt của alen CYP2C19*2 trên gel agarose 1,5% 38 Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt của alen CYP2C19*3 trên gel agarose 1,5% 38 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Đau thắt ngực không ổn định 3 1.1.1. Định nghĩa 3 1.1.2. Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ 3 1.1.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán đau thắt ngực không ổn định 5 1.2. Tổng quan về ngưng tập tiểu cầu 5 1.2.1. Sinh lý tiểu cầu 5 1.2.2. Quá trình ngưng tập tiểu cầu 6 1.2.3. Điều trị ức chế NTTC trong ĐTNKÔĐ 7 1.2.4. Thuốc chống NTTC aspirin và clopidogrel 8 1.3. Tổng quan về đa hình di truyền gen CYP2C19 10 1.3.1. Đa hình đơn nucleotide 10 1.3.2. Gen CYP2C19 và vai trò của chúng trong chuyển hóa thuốc 11 1.3.2.1. Gen CYP2C19 11 1.3.2.2. Vai trò của CYP2C19 trong chuyển hóa thuốc .13 1.3.3. Các phương pháp phát hiện kiểu gen CYP2C19 15 1.4. Tình hình nghiên cứu mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19 và các yếu tố khác trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ trên thế giới và trong nước 19 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 19 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 19 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn 21 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ 21 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21 2.3. Phương pháp nghiên cứu 21 2.4. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 21 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
2.4.1. Hóa chất 21 2.4.2. Thiết bị 22 2.5. Các bước nghiên cứu 22 2.5.1. Quy trình nghiên cứu 22 2.5.2. Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu 23 2.5.3. Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số 23 2.5.3.1. Tách chiết DNA tổng số 23 2.5.3.2. Kiểm tra chất lượng DNA tổng số 23 2.5.4. Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR và kiểm tra chất lượng sản phẩm 24 2.5.4.1. Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR 24 2.5.4.2. Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR 24 2.5.5. Tinh sạch sản phẩm PCR 25 2.5.6. Xác định kiểu gen của SNP CYP2C19*2, *3 sử dụng phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn (RFLP) có đối chiếu với phương pháp giải trình tự 26 2.5.7. Cách đọc kết quả kiểu gen CYP2C19 27 2.5.8. Xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu 27 2.6. Xử lý và phân tích số liệu 29 2.7. Các loại sai số và cách khắc phục 29 2.7.1. Sai số mắc phải 29 2.7.2. Cách khắc phục sai số 30 2.8. Đạo đức nghiên cứu 30 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31 3.1. Kết quả 31 3.1.1. Một số đặc điểm chung 31 3.1.2. Kết quả đo một số chỉ số cận lâm sàng 32 3.1.3. Kết quả đo độ NTTC 34 3.1.4. Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 34 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
3.1.5. Mối quan hệ giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 40 3.1.6. Mối liên quan giữa độ NTTC và các yếu tố khác 42 3.2. Bàn luận 44 3.2.1. Một số đặc điểm chung . 45 3.2.1.1. Đặc điểm về giới . 45 3.2.1.2. Đặc điểm về tuổi 45 3.2.1.3. Các yếu tố nguy cơ của ĐTNKÔĐ . 45 3.2.2. Một số đặc điểm cận lâm sàng 47 3.2.3. Kết quả đo độ NTTC 48 3.2.4. Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 49 3.2.5. Mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 54 3.2.6. Mối liên quan giữa độ NTTC với các yếu tố khác 54 3.2.6.1. Mối liên quan giữa độ NTTC và giới 54 3.2.6.2. Mối liên quan giữa độ NTTC và các yếu tố nguy cơ 54 KẾT LUẬN 57 KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
ĐẶT VẤN ĐỀ Đau thắt ngực không ổn định (ĐTNKÔĐ) là một dạng trong hội chứng động mạch vành cấp (HCMVC). Nguyên nhân dẫn đến ĐTNKÔĐ là do sự nứt vỡ của các mảng xơ vữa không ổn định, hình thành nên các cục máu đông nhưng chưa gây tắc hoàn toàn động mạch vành. Tuy nhiên, ĐTNKÔĐ có thể diễn biến nặng thành nhồi máu cơ tim thực sự và gây nên các biến cố tim mạch [26]. Tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh, tử vong ngày càng tăng và trở thành gánh nặng cho ngành y tế. Mỗi năm tại Hoa Kì có hơn 5 triệu bệnh nhân nhập viện cấp cứu với cơn đau ngực và các triệu chứng liên quan, trong đó 1,4 triệu bệnh nhân là ĐTNKÔĐ hoặc nhồi máu cơ tim không ST chênh [33]. Do đó, để giảm tỷ lệ tử vong cùng các biến cố tim mạch cho bệnh nhân ĐTNKÔĐ thì một trong những điều trị cốt lõi là chống hình thành huyết khối thông qua ức chế hoạt động của tiểu cầu [53]. Clopidolgrel là một thuốc chống ngưng tập tiểu cầu (NTTC) được chỉ định đối với bệnh nhân HCĐMVC và can thiệp mạch vành qua da. Kết hợp clopidogrel với aspirin được khuyến cáo là lựa chọn đầu tay trong điều trị ức chế ngưng tập tiểu cầu theo nhiều cơ chế khác nhau. Bản thân clopidogrel là một tiền chất thuộc nhóm thienopyridine không có hoạt tính. Để trở thành chất có hoạt tính ức chế không hồi phục thụ thể P2Y12 trên màng tiểu cầu gây giảm ngưng tập tiểu cầu, chúng cần được chuyển hóa qua hệ thống cytochrome P450 (chủ yếu là CYP2C19) ở gan [54], [68]. Nghiên cứu cho thấy, clopidogrel có tác dụng làm giảm tới 50% các biến chứng tim mạch chính (nhồi máu cơ tim, đột quỵ) ở những bệnh nhân HCĐMVC. Tuy nhiên, hiện tượng kháng clopidogrel chiếm tỉ lệ khá lớn, dao động từ 5- 44% trong các quần thể khác nhau, gây nên giảm khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu của clopidogrel [30]. Do đó, vẫn còn một tỉ lệ đáng kể bệnh nhân có nguy cơ tử vong, nhồi máu cơ tim (NMCT), đột quỵ, huyết khối trong stent lên quan đến giảm đáp ứng clopidogrel [66]. Một trong những nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau trong đáp ứng điều trị là do ảnh hưởng của enzyme CYP2C19 lên quá trình chuyển hóa của clopidogrel [66]. Enzyme CYP2C19 có tính đa hình cao với khoảng 25 alen đã được xác định, trong đó quan trọng nhất là alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3, chiếm tần số cao trong quần thể người châu Á [66]. Đa hình di truyền CYP2C19*2 và CYP2C19*3 có thể mã hóa tạo enzym giảm hoặc mất chức năng chuyển hóa thuốc, qua đó giảm khả năng chuyển clopidogrel thành dạng có hoạt tính kháng tiểu cầu dẫn đến tăng các biến cố tim mạch. Hơn nữa, ở những bệnh nhân mang alen CYP2C19*2, nguy cơ xảy ra các biến cố tim mạch tăng gấp 3 lần so với những người không mang alen này [71]. Tuy @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
nhiên, cơ chế đáp ứng điều trị kém clopidogrel chưa được làm sáng tỏ đầy đủ, không chỉ do yếu tố di truyền như đa hình gen CYP2C19 mà còn do ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác như sự tương tác thuốc, không tuân thủ điều trị, giới tính, tuổi hay các yếu tố lâm sàng kèm theo như tăng huyết áp (THA), đái tháo đường (ĐTĐ), hút thuốc lá, rối loạn chuyển hóa lipid (RLCH lipid), béo phì [30]. Hiện nay, năm 2015, tại Việt Nam đã có một nghiên cứu của Trần Hòa tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh về mối tương quan giữa kiểu gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 và tiên lượng ở bệnh nhân được can thiệp đặt stent động mạch vành (ĐMV) có điều trị clopidogrel. Tuy nhiên, nghiên cứu này chỉ tiến hành trên những đối tượng bệnh nhân đã được can thiệp ĐMV tại khu vực phía Nam - Việt Nam. Do vậy, tính đến thời điểm này, vẫn chưa có nghiên cứu nào về đa hình di truyền gen CYP2C19 ở bệnh nhân ĐTNKÔĐ tiến hành tại khu vực phía Bắc - Việt Nam nhằm đưa ra câu trả lời cho các vấn đề nêu ở trên. Vì vậy, xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá mối liên quan giữa độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định tại Viện Tim mạch Việt Nam”. Đề tài được tiến hành với 2 mục tiêu: 1. Xác định tần số phân bố kiểu gen CY2C19*2 và CYP2C19*3 trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định. 2. Đánh giá mối liên quan giữa độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Đau thắt ngực không ổn định 1.1.1. Định nghĩa ĐTNKÔĐ là một dạng trong HCĐMVC, được định nghĩa bởi sự xuất hiện các triệu chứng lâm sàng của thiếu máu cơ tim (cơn đau thắt ngực mới xuất hiện hoặc biến đổi các dạng đau ngực, hoặc sự gia tăng cơn đau thắt ngực lúc nghỉ ngơi, hoặc những biến đổi đau thắt ngực tương đương), không có sự xuất hiện các dấu ấn sinh học do tổn thương cơ tim (troponin), điện tâm đồ có thể thay đổi [29]. 1.1.2. Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ Xơ vữa động mạch (XVĐM) là quá trình tiến triển bởi sự hình thành các mảng xơ vữa ở lớp nội mô của động mạch vừa và lớn, diễn ra liên tục và dẫn đến thiếu máu cấp tính. Các yếu tố nguy cơ như: cholesterol máu cao, THA, ĐTĐ, hút thuốc lá, đóng vai trò thiết yếu trong khởi phát XVĐM [43]. Chúng làm tổn thương đến tế bào nội mô của mạch máu và gây rối loạn chức năng nội mô bằng cách làm giảm hoạt tính sinh học của nitric oxyde, tăng sản xuất endothelin, làm tổn thương mạch máu, tăng biểu lộ phân tử kết dính (selectin, phân tử kết dính tế bào mạch, phân tử kết dính giữa các tế bào) và tăng cường quá trình đông máu [39]. Viêm đóng vai trò quan trọng trong sự tiến triển của mảng xơ vữa. Khi các tế bào nội mô bị tổn thương, các tế bào viêm đặc biệt là monocyte sẽ gắn với các phân tử dính nội mô, đi vào lớp dưới nội mô và biệt hóa thành đại thực bào. Các đại thực bào ăn các phân tử LDL, chuyển thành tế bào bọt và hình thành lên dải chất béo. Để duy trì quá trình viêm, đại thực bào được hoạt hóa sẽ thu hút thêm các đại thực bào khác bằng cách tiết ra các chất trung gian. Thêm vào đó, đại thực bào cũng kích thích sự tăng sinh và hình thành tế bào cơ trơn ở lưới ngoại bào thông qua việc tiết ra các cytokin, góp phần hình thành các mô xơ bởi lưới ngoại bào [43]. Nguy cơ vỡ mảng xơ vữa phụ thuộc vào kiểu mảng xơ vữa hơn là kích thước. Lõi vữa của mảng xơ vữa giàu lipid và không có collagen nâng đỡ. Nghiên cứu cho thấy kích thước của lõi vữa tỉ lệ thuận với khả năng vỡ mảng xơ vữa [40]. Thêm vào đó, viêm là một nhân tố quan trọng làm mảng xơ vữa dễ bị tổn thương, liên quan đến tăng hoạt động của đại thực bào và lympho T tại vị trí mảng. Sự tăng hoạt động này làm kích thước của lõi xơ vữa lớn lên và làm mỏng vỏ bao xơ của mảng do đại thực bào tạo ra metalloproteinase – enzym tiêu khung ngoại bào và tế bào lympho T cũng tiết ra các enzyme tiêu khung ngoại bào mạnh như tryptase, chymase [56]. Bên cạnh @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
đó, các phân tích bệnh học còn cho thấy, có sự thiếu các tế bào cơ trơn tại các mảng xơ vữa dễ tổn thương. Các chất trung gian trong quá trình viêm có thể làm cho các tế bào cơ trơn chết theo chương trình hoặc ức chế sự tổng hợp các chất collagen từ tế bào cơ trơn [56]. Tóm lại, các mảng xơ vữa có nguy cơ cao hay dễ bị tổn thương nếu chúng có các đặc điểm sau: lõi xơ vữa lớn, vỏ bao xơ mỏng, tập trung dày đặc đại thực bào và lympho T, lượng nhỏ tế bào cơ trơn, tăng biểu hiện tại chỗ của metalloproteinase sẽ làm thoái hóa collagen, tăng sinh mạch và xuất huyết tại mảng xơ vữa [40]. Hình 1.1. Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ (Nguồn: Khi mảng xơ vữa vỡ ra, lớp dưới nội mô lộ ra (giàu các yếu tố mô và tiền yếu tố đông máu) tiếp xúc với tiểu cầu, dẫn đến hoạt hóa các thụ thể trên bề mặt tiểu cầu, hoạt hóa quá trình ngưng kết tiểu cầu và kết quả là hình thành huyết khối. Nếu mảng vỡ nhỏ và cục huyết khối không làm tắc hoàn toàn động mạch vành, chỉ làm giảm dòng máu tới vùng cơ tim do động mạch đó nuôi dưỡng, thì biểu hiện lâm sàng là cơn đau @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
thắt ngực không ổn định. Nội soi động mạch vành cho thấy 73,7% bệnh nhân ĐTNKÔĐ có huyết khối trong lòng động mạch vành [27,56]. 1.1.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán đau thắt ngực không ổn định Chẩn đoán ĐTNKÔĐ theo tiêu chuẩn của ACCF/AHA (2012) (American college of Cardiology Foundation/ American Heart Association) [53]: - Lâm sàng: cơn ĐTNKÔĐ có thể hiện diện dưới các dạng thức khác nhau: + Cơn đau thắt ngực xuất hiện dưới đây (4-8) tuần. + Cơn đau thắt ngực trầm trọng dần thêm (tần số hoặc cường độ hoặc thời gian các cơn đau, giảm đáp ứng với các dẫn xuất nitrat). + Cơn đau thắt ngực kéo dài lúc nghỉ ngơi (>15-20 phút) nhưng đáp ứng với các dẫn xuất nitrat (nếu không có thể đó là nhồi máu cơ tim không có sóng Q). - Điện tâm đồ lúc nghỉ có thể thay đổi. - Men CK-MB, troponin T, Ic không tăng. 1.2. Tổng quan về ngưng tập tiểu cầu 1.2.1. Sinh lý tiểu cầu Tiểu cầu là thành phần hữu hình nhỏ nhất của máu, hình đĩa, đường kính 3-4µm, không nhân, được sản xuất từ nguyên mẫu tiểu cầu ở tủy xương. Quan sát dưới kính hiển vi, tiểu cầu có cấu trúc siêu phức tạp, gồm hệ thống màng, hệ thống vi quản, hệ thống ống đặc, nhiều hạt và hệ thống các kênh mở. Màng tiểu cầu gồm 2 lớp lipid kép bao quanh tiểu cầu, có các glycoprotein (GP) tác dụng như các thụ thể (receptor) bề mặt và là nơi diễn ra các hoạt động đông máu của tiểu cầu [10]. Ngoài ra, màng tiểu cầu cũng có thể nhận và chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệu hóa học bên trong [63]. Hình 1.2. Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng [10] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5
1.2.2. Quá trình ngưng tập tiểu cầu Ở trạng thái sinh lý bình thường, khi mạch máu nguyên vẹn, tiểu cầu bị bất hoạt, không bám dính được do hoạt động của nitric oxide, prostacyclin và do khả năng kìm hãm kích hoạt ADP của ADPase (adenosin diphotphatase) từ các tế bào nội mô. Tuy nhiên, khi mạch máu bị tổn thương, tiểu cầu sẽ nhanh chóng bám dính vào thành mạch, thay đổi hình dạng, bài tiết và ngưng tập thông qua một loạt phản ứng dẫn đến hình thành nút tiểu cầu tại mô tổn thương. Quá trình tạo tiểu cầu hoạt hóa có thể được chia thành các bước: bám dính, ngưng tập và phóng thích các chất [50]. ➢ Giai đoạn bám dính Khi mạch máu bị tổn thương, các yếu tố kháng tiểu cầu nội sinh bị suy yếu, để lộ lớp dưới nội mô có bản chất là các protein dính như: collagen, yếu tố von Willebrand (vWF), fibronectin, lamilin [50,63]. Khi tốc độ dòng máu cao, vWF đóng vai trò quan trọng trong bám dính tiểu cầu ban đầu thông qua liên kết với phức hợp GP Ib/IX/V. Tuy nhiên, khi tốc độ dòng máu thấp hoặc tĩnh thì bám dính tiểu cầu ban đầu chủ yếu thông qua liên kết của collagen với phức hợp GP Ia//IIa. Những tương tác này giúp tiểu cầu lưu thông chậm lại, từ đó giúp các cặp thụ thể - phối tử tương tác, ràng buộc hơn nữa dẫn đến sự bám dính tĩnh [50,52]. Đặc biệt, sự tương tác ban đầu giữa collagen và GP VI làm hoạt hóa các thụ thể GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa. vWF và collagen hình thành liên kết mạnh với GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa [50]. ➢ Giai đoạn ngưng tập Trong giai đoạn NTTC, tiểu cầu dính với nhau tạo thành từng đám (nút tiểu cầu). GP IIb/IIIa là một thụ thể có vai trò quan trọng trong giai đoạn này, có khoảng 4000 - 5000 phức hợp GP IIb/IIIa trên bề mặt của màng tiểu cầu bất hoạt. Khi tiểu cầu hoạt hóa, các GP IIb/IIIa mới được hoạt hóa, chúng hoạt động như thụ thể gắn với fibrinogen, vWF, fibronectin, vitronectin. Tuy nhiên chúng gắn với fibrinogen là chủ yếu vì fibrinogen có nồng độ cao trong huyết tương và GP IIb/IIIa có ái lực với fibrinogen là mạnh nhất. Khi liên kết này xảy ra trên các tiểu cầu sẽ tạo nên một cầu nối làm cho các tiểu cầu ngưng tập lại với nhau và tiếp tục hoạt hóa. Hai giai đoạn ngưng tập và hoạt hóa tác động qua lại, tương hỗ lẫn nhau, diễn ra liên tục cho đến khi tạo thành nút tiểu cầu [10,50]. Một số chất có khả năng gây NTTC như: ADP, adrenalin, thromboxan A2, collagen, ristocetin , trong đó ADP là chất gây NTTC quan trọng nhất vì chúng không phụ thuộc vào tác nhân khác và còn giúp cho phản ứng ngưng tập của các tác nhân khác diễn ra đầy đủ hơn. Hơn nữa, ADP còn có nguồn @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
gốc từ hồng cầu. Do đó, ở những thành mạch bị tổn thương, hồng cầu sẽ bài tiết ADP, làm tăng nhanh nồng độ ADP, giúp tăng NTTC, nhanh chóng tạo nút cầm máu ban đầu, làm ngừng chảy máu. ADP phát huy hiệu quả tối đa khi gắn kết với cả 3 thụ thể trên tiểu cầu: P2Y1, P2Y12, P2X1, trong đó P2Y1, P2Y12 là 2 thụ thể cần thiết cho hiện tượng NTTC xảy ra tối đa. Chúng là một trong những trọng tâm của nghiên cứu về thuốc ức chế NTTC trong dự phòng và điều trị huyết khối [10]. ➢ Giai đoạn phóng thích các chất của tiểu cầu Sau khi bị ngưng tập bởi các chất gây ngưng tập, các tiểu cầu sẽ xảy ra một loạt các biến đổi như quá trình thay đổi hình dạng và phóng thích các yếu tố của tiểu cầu. Quá trình này rất phức tạp, tiểu cầu biến đổi cả về hình thái và sinh hóa [69]. Hình 1.3. Bám dính và ngưng tập tiểu cầu (Nguồn: 14_24_Fig1_HTML&req=4 ) 1.2.3. Điều trị ức chế NTTC trong ĐTNKÔĐ Chống hình thành huyết khối thông qua ức chế hoạt hóa tiểu cầu là điều trị cốt lõi trong ĐTNKÔĐ, giúp làm giảm các biến cố tim mạch và giảm tỉ lệ tử vong cho người bệnh [53]. Theo cơ chế tác dụng, các thuốc chống NTTC được phân loại như sau [63]: - Thuốc ức chế Cyclooxygenase (aspirin). - Thuốc ức chế thụ thể ADP (clopidogrel [Plavix], prasugrel [Effient], ticlopidine [Ticlid]). - Thuốc ức chế phosphodiesterase (cilostazol [Pletal]). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
- Thuốc ức chế thụ thể GPIIb/IIIa (abciximab [ReoPro], eptifibatide [Integrilin], tirofiban [Aggrastat]). - Thuốc ức chế tái hấp thu Adenosin (dipyridamole [Persantine]). - CPTPs (cyclo-pentyl-triazolo-pyrimidines [Ticagrelor]). 1.2.4. Thuốc chống NTTC aspirin và clopidogrel 1.2.4.1. Aspirin Hình 1.4. Cơ chế tác dụng của aspirin lên quá trình NTTC (Nguồn: Aspirin là thuốc chống tiểu cầu được nghiên cứu rộng rãi nhất và được sử dụng phổ biến trên lâm sàng. Hơn 100 thử nghiệm ngẫu nhiên ở những bệnh nhân có nguy cơ cao đều cho thấy aspirin làm giảm tử vong do mạch máu xuống khoảng 15% và các biến cố tim mạch không gây tử vong xuống khoảng 30%. Aspirin ức chế chọn lọc exzyme cyclooxygenase (COX) do gắn vào gốc Ser ở vị trí 529 của COX-1 và gắn vào gốc Ser ở vị trí 516 của COX-2, làm bất hoạt enzyme này, dẫn đến ngăn chặn quá trình biến đổi acid arachidonic thành prostaglandin H2 (PGH2). PGH2 là cơ chất của nhiều isomerase tạo ra các prostanoid có hoạt tính sinh học khác nhau, chủ yếu là thromboxan A2 (TXA2) và PGI2. TXA2 khi gặp các tác nhân kích thích (collagen, thrombin, ADP) sẽ được tổng hợp và phóng thích bởi tiểu cầu, chúng có tác dụng gây co mạch mạnh và gây NTTC không hồi phục thông qua thụ thể TXA2. Aspirin ức chế COX-1 gây ức chế tạo TXA2, dẫn đến ức chế NTTC. Vì tiểu cầu không có nhân, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
không thể tổng hợp thêm COX-1 mới nên sự ức chế này rất mạnh, diễn ra trong suốt đời sống của tiểu cầu. Tuy nhiên, aspirin còn ức chế men prostacyclin synthetase dẫn đến ức chế sự tổng hợp chất prostaglandin kháng đông là PGI2 (có tác dụng ức chế NTTC và giãn mạch) của tế bào nội mạc, kết quả là kích thích NTTC. Nhưng do các tế bào nội mạc có nhân có thể tổng hợp ra men mới nên tác dụng này không mạnh bằng tác dụng ức chế men COX và không kéo dài [54,68]. 1.2.4.2. Clopidogrel Clopidogrel không có hoạt tính chống NTTC. Sau khi được hấp thu tại ruột, có tới 85% lượng clopidogrel được chuyển hóa bởi các enzyme esterase: carboxylesterase (CES), butyrylcholinesterase (BchE) thành chất không có hoạt tính. Chỉ có 15% lượng thuốc được chuyển hóa qua hai bước ở gan bởi hệ thống enzyme P-450 (chủ yếu là CYP2C19) tạo thành chất có hoạt tính. Chất này có tác dụng ức chế chọn lọc và không hồi phục quá trình gắn phân tử ADP (adenosin diphosphate) vào các thụ thể (P2Y12) của nó lên bề mặt tiểu cầu, dẫn đến các cảm thụ GPIIb/IIIa không được hoạt hóa và dẫn đến các tiểu cầu không kết dính được với nhau [54,68]. Hình 1.5. Quá trình chuyển hóa clopidogrel và công thức cấu tạo của các chất sau mỗi bước chuyển hóa (Nguồn: conversion-to-an-active-metabolite-Clopidogrel-AM-via_fig1_313838290) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
Hình 1.6. Cơ chế tác dụng clopidogrel lên quá trình NTTC (Nguồn: ) 1.3. Tổng quan về đa hình di truyền gen CYP2C19 1.3.1. Đa hình đơn nucleotide Đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism – SNP – đọc là “snip”) là biến thể di truyền phổ biến nhất trong DNA ở người. Gen là một đoạn phân tử DNA mang thông tin mã hóa cho một sản phẩm nhất định. Một gen chứa rất nhiều nucleotide (gồm 4 loại A, T, G và C). Mỗi SNP đại diện cho sự khác biệt một nucleotide trong gen đó, tạo nên sự khác biệt về một gen giữa các cá thể. Ví dụ, một SNP có thể thay thế nucleotide cytosine (C) bằng nucleotide thymine (T). Các SNP là sự khác biệt duy nhất, là cơ sở tồn tại giữa các cá nhân [44]. Hình 1.7. Mô tả single nucleotide polymorphism (SNP) (Nguồn: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
SNP được xác định khi tần số xuất hiện của một alen phải lớn hơn hoặc bằng 1%. Mặc dù, theo lý thuyết, có thể xuất hiện 1 trong 4 loại nucleotide, nhưng thông thường SNP chỉ xuất hiện 2 loại alen. Có thể giải thích điều này là do SNP bắt nguồn từ một đột biến điểm xảy ra trong hệ gen, chuyển một nucleotide này sang một nucleotide khác. Nếu đột biến xảy ra trong tế bào sinh sản của cơ thể, thì các thế hệ sau sẽ mang đột biến này, và qua nhiều thế hệ sẽ hình thành SNP trong quần thể. Tuy nhiên, chỉ có 2 alen – một alen gốc và một alen đột biến. Để có alen thứ 3, cần phải có một đột biến mới xảy ra ở đúng vị trí trước đó trong hệ gen, và cá thể mang đột biến phải di truyền lại được cho các thế hệ sau. Khả năng xảy ra là rất hiếm, do đó phần lớn SNP chỉ có 2 alen [78]. SNP có thể xảy ra trong vùng mã hóa nhưng không gây ra sự thay đổi trong trình tự axit amin, có thể xảy ra ở một vùng mã hóa với sự thay đổi trình tự axit amin, có thể xảy ra trong vùng điều khiển gây ra sự thay đổi biểu hiện gen, hoặc có thể xảy ra trong một vùng giữa các gen [75]. SNP xuất hiện một lần trong mỗi 300 nucleotide, nghĩa là có khoảng 10 triệu SNP trong hệ gen của con người. Chúng có thể hoạt động như các marker sinh học, giúp các nhà khoa học xác định vị trí các gen có liên quan đến bệnh tật. Khi SNP xảy ra trong một gen hoặc ở vùng điều khiển gần gen, chúng có thể liên quan trực tiếp đến bệnh tật bằng cách ảnh hưởng đến chức năng gen. Hầu hết các SNPs không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. Tuy nhiên, một số SNP đã chứng tỏ được vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu sức khoẻ con người. Các SNP có thể giúp dự đoán phản ứng của một cá nhân đối với một số loại thuốc nhất định, sự nhạy cảm với các yếu tố môi trường như chất độc và nguy cơ phát triển thành bệnh lý cụ thể. SNP cũng có thể được sử dụng để theo dõi sự di truyền của gen bệnh trong gia đình. Các nghiên cứu tiếp theo trong tương lai sẽ được tiến hành để xác định các SNP liên quan đến các bệnh phức tạp như bệnh tim, tiểu đường và ung thư [44]. 1.3.2. Gen CYP2C19 và vai trò của chúng trong chuyển hóa thuốc 1.3.2.1. Gen CYP2C19 Enzym cytochrome P450 là các protein màng có chứa hem (hem protein) nằm ở lưới nội chất của tế bào gan. Enzyme CYP bao gồm CYP3A4, CYP2D6, CYP2C19, CYP1A2 và CYP2E1, trong đó CYP2C19 là một enzyme quan trọng trong siêu họ cytochrome P450 [80]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
Gen mã hóa cho CYP2C19 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 10 ở người (10q23.33), có kích thước 90,637bp, từ cặp nucleotide 94,762,624 đến cặp nucleotide 94,853,260. Hình 1.8. Vị trí gen CYP2C19 trên nhiễm sắc thể số 10 (Nguồn: ) Gen CYP2C19 gồm 9 exon, mã hóa cho protein CYP2C19 dài 490 axit amin. Gen CYP2C19 có tính đa hình cao với 25 alen đã được xác định. Bên cạnh alen CYP2C19*1 quy định enzym CYP2C19 có hoạt tính chuyển hóa thuốc bình thường thì các alen như alen *2, *3, *4, *5, *6, *7, *8, *17 quy định enzyme CYP2C19 giảm, mất hoặc tăng hoạt tính [73]. Trong đó alen *2, *3 là 2 đa hình alen quan trọng nhất, chiếm tần số cao trong quần thể người châu Á [68]. (Nguồn: of-the-CYP2C19-gene-highlighting-the-location-of) Hình 1.9. Vị trí của các exon (hộp đen) và một số alen trên gen CYP2C19 ➢ Alen mã hóa cho enzym CYP2C19 có chức năng bình thường Alen CYP2C19*1: quy định biểu hiện enzym CYP2C19 có chức năng hoạt động bình thường. ➢ Alen mã hóa cho enzym CYP2C19 giảm hoặc mất hoạt tính - Alen đa hình CYP2C19*2 Alen có kí hiệu rs4244285 ở vị trí (c.681G>A) là đa hình xác định của alen CYP2C19*2, đây là dạng đột biến đồng hoán thay G bằng A ở exon 5 làm xuất hiện một vị trí cắt nối intron - exon bất thường. Đa hình này tạo ra 3 kiểu gen gồm @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG, kiểu gen dị hợp tử đột biến GA và kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA. Đột biến này làm khung đọc mRNA bị cắt ngắn hơn bình thường và tạo ra dạng enzym không có hoạt tính. CYP2C19 *2 là dạng alen mã cho enzyme CYP2C19 mất hoạt tính phổ biến nhất với tần số xuất hiện khoảng 12% ở người da trắng, 15% ở người Mỹ gốc Phi và 29-35% ở người châu Á [68]. - Alen đa hình CYP2C19*3 CYP2C19*3 cũng là dạng alen mã hóa cho enzym CYP2C19 mất hoạt tính có kí hiệu rs4986893 ở vị trí (c.636G>A), đây là dạng đột biến thay G bằng A ở exon 4 làm xuất hiện mã kết thúc sớm ở axit amin 212. Đa hình này tạo ra 3 kiểu gen, trong đó, kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG, kiểu gen dị hợp tử đột biến GA và kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA. Tần số của alen CYP2C19*3 trong phần lớn các quần thể là dưới 1%, tuy nhiên tỷ lệ này cao hơn ở người châu Á với 2-9% [68]. Ngoài ra, các alen khác mã hóa cho enzym giảm hoặc mất hoạt tính là CYP2C19*4 (rs28399504), *5 (rs56337013), *6 (rs72552267), *7 (rs72558186) và *8 (rs41291556). Các alen này có tần số dưới 1% trong các quần thể người [68]. Một số alen khác cũng được xác định trong các quần thể khác nhau với rất ít dữ liệu được mô tả hoặc được dùng các thuật toán phân tích để dự đoán ảnh hưởng của chúng lên chức năng protein [68]. 1.3.2.2. Vai trò của CYP2C19 trong chuyển hóa thuốc Siêu họ enzyme Cytochrome 450 (Cyt-P450) tham gia vào quá trình chuyển hóa phần lớn các thuốc khác nhau như thuốc chống ngưng tập tiểu cầu clopidogrel (Plavix), thuốc chống động kinh mephenytoin, thuốc ức chế bơm proton omeprazole, thuốc an thần diazepam , trong đó enzyme CYP2C19 là enzyme chính tham gia vào quá trình chuyển hóa thuốc clopidogrel [80]. Một thuốc A khi đưa vào trong cơ thể sẽ đi theo một hoặc các con đường sau [6]: - Được hấp thu và thải trừ không biến đổi: bromid, lithi, saccharin. - Chuyển hóa thành chất B (pha I), sau đó thành chất C (pha II) và thải trừ. - Chuyển hóa thành chất D ( pha II) rồi thải trừ. Chất A có thể có hoặc không có hoạt tính sinh học, sinh ra chất B có thể có hoặc không có hoạt tính. Chất C, D luôn là chất không có hoạt tính. Chất A có thể sinh ra nhiều loại chất B hoặc C [6]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
Pha I. Qua pha này thuốc ở dạng tan trong lipid sẽ phân cực hơn, dễ tan trong nước hơn. Thuốc có thể mất, giảm, tăng hoặc trở nên có hoạt tính sinh học. Pha I xảy ra các phản ứng như phản ứng khử, phản ứng thủy phân, nhưng thường gặp nhất là phản ứng oxy hóa với sự tham gia của Cyt-P450 [80]. Pha II. Các thuốc đi qua pha này chủ yếu trở thành phức hợp không có hoạt tính, dễ tan trong nước và bị thải trừ. Các phản ứng ở pha II đều là các phản ứng liên hợp: một phân tử nội sinh (acid glucuronic, glutathion, sulfat, glycin, acetyl) sẽ ghép với một nhóm hóa học của thuốc để tạo thành các phức hợp tan mạnh trong nước. Thông thường, các phản ứng ở pha I sẽ tạo ra các nhóm chức cần thiết cho các phản ứng ở pha II như nhóm -OH, -COOH, -NH2, -SH [80]. Như đã nói ở trên, ở pha I, phản ứng chính là phản ứng oxy hóa và là phản ứng phổ biến nhất có xúc tác của các enzym oxy hóa, đặc biệt là cyptochrome P450. Chu trình phản ứng được thực hiện theo các bước chính sau [6]: Bước 1. Thuốc (Drug) phản ứng với Cyt-P450 dạng oxy hóa (Fe3+) tạo phức hợp Drug - P450 (Fe3+). Cyt-P450 lúc này biến đổi đương lượng từ trạng thái spin thấp thành trạng thái spin cao. Sự biến đổi thế năng oxy hóa gây ra bằng cách này giúp vận chuyển điện tử thứ nhất thuận lợi. Bước 2. Nhận điện tử thứ nhất từ NADPH, dưới tác dụng xúc tác của enzym Cyt-P450-reductase tạo phức hợp Drug-P450 dạng khử (Fe2+). Bước 3. Phức hợp dạng khử này phản ứng với một phân tử oxy để tạo thành phức hợp oxy hoạt hóa. Bước 4. Phức hợp vừa tạo thành nhận tiếp điện tử thứ 2 từ phân tử NADPH thứ 2 hoặc từ NADH. Hai điện tử nhận được khử phân tử oxy trong phức hợp thuốc - enzym tạo thành hợp chất trung gian. Bước 5. Oxy được hoạt hóa sẽ phản ứng với 2H+ (từ 2 phân tử NADPH+) tạo thành phân tử nước, tách ra khỏi hợp chất trung gian trên. Bước 6. Hợp chất mới thu được, được oxy hóa bằng nguyên tử oxy còn lại và được giải phóng (drug-OH); enzym Cyt-P450 trở về trạng thái oxy hóa ban đầu (Fe3+), hoàn thành một chu kì phản ứng. Kết quả của quá trình chuyển hóa làm thuốc từ không có hoạt tính thành dạng có hoạt tính. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
Hình 1.10. Vai trò của enzyme Cytochrome P450 trong chuyển hóa thuốc (Nguồn: 1.3.2.3. Mối liên quan giữa kiểu gen và hoạt tính enzym chuyển hóa thuốc Hoạt tính enzyme chuyển hóa thuốc dựa vào kiểu gen theo các alen được phân loại trong bảng như sau [67]: Hoạt tính enzym Kiểu gen Tần suất Bình thường *1/*1 35 - 50% bệnh nhân Trung bình *1/*2, *1/*3 18 - 45% bệnh nhân Kém *2/*2, *2/*3, *3/*3 2 - 15% bệnh nhân 1.3.3. Các phương pháp phát hiện kiểu gen CYP2C19 1.3.3.1. PCR - RFLP ➢ PCR PCR (polymerase chain reaction) được dùng để khuếch đại một chuỗi DNA. Nguyên tắc của PCR là dùng DNA polymerase để tổng hợp phân tử DNA mới từ trình tự của DNA làm khuôn với tiền chất là các dNTP. Chuỗi phản ứng gồm các bước: khởi đầu, biến tính, gắn mồi, kéo dài chuỗi và kết thúc. Cụ thể, người ta tổng hợp và sử dụng hai đoạn oligonucleotide có vị trí liên kết chặn ở 2 đầu của đoạn DNA cần nhân dòng. Đoạn thứ nhất có trình tự bổ sung với đầu 5’ của mạch mã hóa là mồi xuôi, đoạn thứ hai có trình tự bổ sung với đầu 5’ của mạch đối mã là mồi ngược. DNA khuôn được biến tính bởi nhiệt, tạo điều kiện cho mồi xuôi, mồi ngược đính vào các vị trí ở 2 đầu đoạn DNA cần nhân dòng. Với sự có mặt của các tiền chất là dNTP, DNA polymerase sẽ nhân dòng đoạn trình tự DNA được giới hạn bởi 2 đoạn mồi. Trong PCR, DNA được gây biến tính và sự tổng hợp DNA diễn ra lặp lại qua @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
nhiều chu kì nhờ khả năng điều nhiệt của máy. Kết quả là, sau mỗi chu kì, số phân tử DNA lại tăng gấp đôi. Đây là phản ứng có độ nhạy cao. Vậy nên, chỉ một vài bản sao DNA, ta có thể thu được hàng tỉ bản sao sau khoảng 30 chu kì (số bản sao DNA= 2n với n là số chu kì phản ứng) [11]. Hình 1.11. Quy trình PCR (Nguồn: ➢ RFLP Kĩ thuật RFLP (Restriction fragment length polymorphism) là kĩ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt của các enzym giới hạn (Restriction Enzyme, RE). DNA khi ủ với enzym giới hạn trong dung dịch đệm thích hợp với nhiệt độ và pH thích hợp sẽ tạo ra các phân đoạn DNA có kích thước khác nhau. Nguyên tắc của kĩ thuật này là dựa trên độ đặc hiệu của các RE đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA. Sự khác biệt về vị trí cắt giữa 2 cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau [51]. Mỗi enzym giới hạn nhận biết một đoạn nucleotide khác nhau rất đặc hiệu với nó và được gọi là trình tự nhận biết. Các trình tự này có cấu tạo từ 4 đến 6 bp và phải có cấu trúc đối xứng nghịch đảo (palindromic), tức là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi được đọc theo chiều 5’ đến 3’ ở mỗi sợi đơn. Ví dụ như đoạn DNA được đóng khung dưới đây [51]: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
Có 2 loại kiểu cắt RE: cắt đầu bằng và cắt đầu dính. Hình 1.12. Các kiểu cắt RE (Nguồn: Cắt đầu bằng: Phân tử DNA được cắt ngay chính giữa palindromic, tạo ra hai DNA đầu bằng. Sau khi cắt, hai đầu không có khả năng tự kết hợp trở lại. Cắt đầu dính: Cắt bên này và bên kia của tâm đối xứng để tạo hai đầu lệch nhau một vài bazơ. Hai đầu phân tử DNA sau khi cắt có trình tự bổ sung với nhau, do đó chúng có thể bắt cặp trở lại, hoặc có thể bắt cặp với các phân tử DNA khác được cắt bởi cùng enzym giới hạn tạo ra những phân tử lai. Tính chất này được ứng dụng trong nhân dòng phân tử và tạo DNA tái tổ hợp, góp phần thúc đẩy sự phát triển của công nghệ di truyền [11,51]. Phân tích PCR - RFLP dựa trên nguyên tắc đa hình vị trí giới hạn trong các phân đoạn DNA đã được nhân bản bởi PCR. Tức là đoạn DNA đích sẽ được khuếch đại bằng kĩ thuật PCR, sau đó chúng được cắt bằng các RE. Các phân đoạn tạo thành có thể được phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhờ nhuộm màu gel, tính đặc thù của các đoạn này có thể được quan sát trực tiếp hoặc chụp ảnh qua máy soi DNA. Sự phân bố của những vị trí cắt trong phân tử DNA sẽ được phản ánh thông qua số lượng và kích thước của các phân đoạn. Sự hiện diện của các đoạn cắt này đặc trưng cho từng tổ hợp DNA/ enzym giới hạn. Do đó, người ta có thể sử dụng PCR – RFLP để đánh giá trực tiếp tính biến dị di truyền của sinh vật. Ưu điểm của phương pháp là kỹ thuật đơn giản, nhanh, tiết kiệm chi phí và độ tin cậy cao [51]. 1.3.3.2. PCR - Giải trình tự Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định trật tự chính xác của các nucleotide trong phân tử DNA. Hầu hết các phương pháp giải trình tự (GTT) DNA hiện nay đều dựa trên phương pháp Sanger. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào việc bổ sung các dẫn xuất tương ứng của các dNTP là 2’, 3’dideoxynucleotide @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
(ddNTP - mất cả 2 nhóm OH ở vị trí C2 và C3 trên phân tử đường pentose) vào thành phần phản ứng tổng hợp DNA. Khi ddNTP được gắn vào mạch, do thiếu nhóm C3’- OH nên sự tổng hợp sẽ dừng lại, tạo ra các đoạn DNA chênh lệch nhau [11]. Phản ứng GTT được chia làm 4 ống nghiệm tách biệt, mỗi ống bổ sung một hỗn hợp 4 loại dNTP thông thường, một trong những loại dNTP này được đánh dấu phóng xạ để phát hiện mạch mới đang tổng hợp. Ngoài ra, từng loại trong 4 loại ddNTP sẽ được thêm lần lượt vào mỗi ống với nồng độ bằng 1/10 loại dNTP tương ứng. Phần lớn trường hợp, dNTP sẽ liên kết vào mạch DNA đang tổng hợp, nhưng ddNTP cũng sẽ liên kết vào một số mạch DNA đang tổng hợp và làm kết thúc quá trình sao chép. Kết quả là hình thành hỗn hợp nhiều phân tử DNA được sao chép không hoàn chỉnh, đầu 5’ giống nhau nhưng khác nhau ở đầu 3’ về chiều dài và loại nucleotide kết thúc chuỗi. Sản phẩm được phân tách trên gel polyacrylamide và đọc trình tự theo thứ tự băng xuất hiện với chiều từ cực dương sang âm [11]. Kỹ thuật Sanger cần nhiều thao tác kỹ thuật, đồng thời việc đọc kết quả điện di bằng mắt có thể xảy ra sai sót. Vậy nên hiện nay, để GTT DNA các hệ gen lớn đều dựa vào phương pháp GTT tự động. Phương pháp này sử dụng bộ các ddNTP được gắn chất phát quang khác nhau cho mỗi loại. Các ddNTP khi được kích thích bởi nguồn sáng của máy giải trình tự sẽ phát ra tín hiệu khác nhau. Thông tin này được một cảm biến tín hiệu kết hợp với máy tính sẽ xử lý và tự động chuyển thành trình tự DNA. Ưu điểm của phương pháp là khả năng tự động hóa phần lớn các bước của quá trình phân tích và có độ nhạy, tốc độ đọc, mức độ chính xác cao (đặc biệt là đoạn DNA dài từ 30 đến 1000 bp) [11]. 1.3.3.3. RT - PCR (Real-time PCR) Real-time PCR (hay còn gọi là PCR định lượng – qPCR) là kỹ thuật mới dựa trên phản ứng PCR. Ở phương pháp này, sự khuếch đại của một phân tử DNA đích sẽ được theo dõi sau từng chu kì nhiệt của phản ứng, nghĩa là trong thời gian thực (real- time) chứ không phải ở cuối phản ứng như trong PCR thông thường. Nguyên lý: RT- PCR cũng là một phản ứng tái bản các trình tự đặc hiệu nhưng có sử dụng thêm chất phát huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang được phát hiện ngay trong bước bắt cặp mồi và kéo dài chuỗi DNA. Do đó Real-time PCR còn có thể sử dụng để định lượng hoặc bán định lượng DNA như định lượng số bản copy của virus viêm gan B,C. Bên cạnh đó, phương pháp cũng có thể giúp xác định tỷ lệ biến đổi gen có trong mẫu, phát hiện các khác biệt SNP và xác định kiểu di truyền [77]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
1.4. Tình hình nghiên cứu mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19 và các yếu tố khác trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ trên thế giới và trong nước 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về mối tương quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19 trên bệnh nhân bệnh mạch vành. Nghiên cứu của Sibbing và các cộng sự (2009) trên 2485 bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua da cho thấy: tỉ lệ các biến cố huyết khối đặt stent ở những bệnh nhân mang alen đột biến CYP2C19*2 tăng gấp 3 lần so với những bệnh nhân mang đồng hợp tử kiểu dại với p=0,007 [71]. Nghiên cứu đa trung tâm, ngẫu nhiên, mù đôi ELEVATE-TIMI (2011) tiến hành trên 333 bệnh nhân bị bệnh tim tại 32 điểm từ tháng 10/2010 đến tháng 9/2011. Các bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử CYP2C19*2 liều clopidogrel 225 mg có tác dụng dược lý tương đương với liều chuẩn 75 mg, còn với bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử CYP2C19*2 thì liều 300mg cũng không có tác dụng chống NTTC [49]. Yang J và cộng sự (2013) cho thấy rằng ở những người mang 1 alen đột biến (*1/*2, *1/*3) và 2 alen đột biến (*2/*3, 2 /*2, *3/*3) có độ NTTC tối đa với ADP cao hơn so với những người mang kiểu dại (*1/*1) với p lần lượt là 0,002 và 0,0039 [81]. Yu Chen và các cộng sự (2015) đã tiến hành nghiên cứu trên 336 bệnh nhân HCĐMVC có can thiệp mạch vành qua da, theo dõi sau 1 tháng và 6 tháng. Với nhóm bệnh nhân mang alen CYP2C19*2, có độ NTTC cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm mang kiểu gen dại ở cả thời điểm nhập viện và sau 1 tháng (p lần lượt là 0,005 và 0,003). Đồng thời, nguy cơ các biến cố tim mạch chính ở bệnh nhân mang alen CYP2C19*2 cũng cao hơn so với nhóm bệnh nhân mang alen kiểu dại CYP2C19*1 với p=0,003 [37]. Các nghiên cứu trên đều cho thấy, alen CYP2C19*2 chiếm tỉ lệ khá cao trong quần thể nghiên cứu. Những bệnh nhân mang alen này cũng cho thấy có biến cố tim mạch nặng hơn so với những người không mang gen. Điều này phần nào khẳng định vai trò của CYP2C19*2 trong kháng thuốc clopidogrel. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Tính tới thời điểm này, chưa có nghiên cứu nào về mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19 trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ ở Việt Nam, mới chỉ có các nghiên cứu về mối liên quan độ NTTC với một số yếu tố trên bệnh lý khác nhau. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
Nguyễn Thị Nữ, Cung Thị Tý và Đỗ Trung Phấn (1997) nghiên cứu “Chỉ số NTTC ở người trưởng thành Việt Nam bình thường” với chất kích tập tiểu cầu collagen nồng độ 1mg/ml là 65,5±6,7%; với chất kích tập ADP nồng độ 10µM là 67±6,5%. Không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về độ NTTC giữa nam và nữ [17]. Trương Thị Minh Nguyệt (2003) nghiên cứu độ NTTC trên bệnh nhân thiếu máu cục bộ cơ tim với chất kích tập ADP nồng độ 5µM là 71,6±8,83%, trong đó độ NTTC ở nhóm NMCT cấp là 74,46±9,95%, tăng có ý nghĩa so với nhóm chứng ở tất cả các bệnh nhân thiếu máu cục bộ cơ tim có các yếu tố nguy cơ như THA, ĐTĐ, béo phì, hút thuốc lá, tiền sử gia đình bị tim mạch. Mức tăng độ NTTC có mối liên quan đồng biến mức độ vừa với hàm lượng fibrinogen huyết tương và có xu hướng tăng theo số lượng nhóm nguy cơ [15]. Nghiêm Hoàng Lan Phương (2007) cũng nghiên cứu về độ NTTC ở bệnh nhân NMCT cấp trước và ĐMV cho thấy: độ NTTC ở người bị NMCT cấp là 74,3±10,2%, cao hơn so với người bình thường là 67±6,5%. Bệnh nhân NMCT cấp có nhiều yếu tố nguy cơ thì độ NTTC sẽ cao hơn người có ít yếu tố nguy cơ. Độ NTTC giảm rõ rệt sau liều điều trị tấn công của thuốc chống NTTC (Plavix+ Aspirin+ Lovenox) so với trước can thiệp [18]. Trần Hòa và Trương Quang Bình (2015) nghiên cứu mối tương quan giữa kiểu gen giảm chức năng CYP2C19*2, CYP2C19*3 và tiên lượng ở bệnh nhân được can thiệp đặt stent động mạch vành có điều trị clopidogrel. Hiện tại nghiên cứu vẫn đang thực hiện và chưa công bố kết quả cuối cùng. Như vậy, cho tới nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về mối liên quan giữa độ NTTC với đa hình di truyền gen CYP2C19 trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ. Do đó, việc tiếp tục nghiên cứu theo hướng này điều rất cần thiết, giúp công tác điều trị và phòng bệnh ĐTNKÔĐ được tốt hơn. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn Tất cả các bệnh nhân được chẩn đoán ĐTNKÔĐ theo tiêu chuẩn ACCF/AHA (American College of Cardiology Foundation/ American Heart Association) (2012). Bệnh nhân sau khi nhập viện, điều trị với liệu pháp kháng tiểu cầu kép vào ngày thứ 3 với liều duy trì aspirin (100mg/ngày) kết hợp clopidogrel (75mg/ngày). 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ - Bệnh nhân phải dùng thêm bất cứ một loại thuốc chống ngưng tập tiểu cầu nào khác ngoài aspirin và clopidogrel. - Đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng. - Tai biến mạch não dưới 3 tháng. - Mới phẫu thuật dưới 1 tuần. - Nguy cơ cao chảy máu. - Suy thận, suy gan giai đoạn cuối. 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ➢ Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2017 đến tháng 1/2018 ➢ Địa điểm thu mẫu: Viện Tim mạch Việt Nam ➢ Địa điểm nghiên cứu: - Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - Viện Tim mạch Việt Nam - Viện nghiên cứu hệ gen 2.3. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang Cỡ mẫu nghiên cứu: Chúng tôi sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện. Đối tượng nghiên cứu thỏa mãn các tiêu chuẩn, đồng ý tham gia nghiên cứu, được lựa chọn liên tục cho đến khi đủ cỡ mẫu (54 bệnh nhân) tại Viện Tim mạch Việt Nam. 2.4. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 2.4.1. Hóa chất - Cặp mồi tự thiết kế, được đặt tổng hợp từ hãng IDT- Mỹ. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
- Lambda DNA/HindIII Marker, code SM0103, hãng Fermentas. - GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder, code SM0321, hãng Thermo Scientific. - Q5 High – Fidelity DNA polymerase, hãng Neb (New England Biolabs). - E.Z.N.A blood DNA Mini kit, code D3392, hãng Omega-Biotek. - GeneJET PCR Kit, hãng Thermo Fisher Scientific. - Chất kích tập là ADP 5 µM của hãng Nippon Corporation (Nhật Bản). 2.4.2. Thiết bị - Máy PCR Prime Thermal Cycler (Code: 5PRIME/02, Anh). - Máy đo nồng độ DNA Eppendorf Bio Photometer Plus (Eppendorf, Đức). - Máy giải trình tự 3500 Genetic Analyzer applied Biosystems, Mỹ. - Máy đo độ ngưng tập tiểu cầu Chrono – LOG của Mỹ. 2.5. Các bước nghiên cứu 2.5.1. Quy trình nghiên cứu Quy trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ như sau: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
2.5.2. Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu ➢ Cách lấy mẫu: 4ml máu lấy từ tĩnh mạch người bệnh, được chuyển vào ống chuyên dụng có sẵn chất chống đông EDTA, đảm bảo không bị nhiễm bẩn. Ghi đầy đủ thông tin của bệnh nhân và mã code để tránh nhầm các mẫu với nhau. Lượng máu ở mỗi ống đủ cho hơn một lần tách DNA tổng số, luôn đảm bảo còn mẫu lưu để có thể lặp lại việc tách DNA tổng số cho đến khi kiểu gen của bệnh nhân được xác định. ➢ Bảo quản mẫu: Mẫu được bảo quản trong điều kiện ngăn đá tủ lạnh dân dụng không quá 1 ngày, sau đó được vận chuyển đảm bảo nguyên tắc an toàn sinh học đến phòng thí nghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Mẫu tiếp tục được bảo quản trong điều kiện lạnh -30˚C đến khi sử dụng. ➢ Kí hiệu mẫu: Ống mẫu phải có đầy đủ các thông tin bao gồm: mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu. Thông tin của mỗi mẫu phải được lưu lại trong sổ gồm: mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu sau khi bàn giao và khi sử dụng. 2.5.3. Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số 2.5.3.1. Tách chiết DNA tổng số Chúng tôi sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số. Nguyên lý kit: Dưạ trên sự hấp thụ chọn lọc của các axit nucleic vào màng silica-gel trong điều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính bao gồm: - Phá vỡ tế bào để giải phóng DNA. - DNA liên kết với màng silica-gel. - Loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel với Wash Buffer. - Thu nhận DNA tổng số. 2.5.3.2. Kiểm tra chất lượng DNA tổng số Sau khi tách chiết, DNA tổng số được kiểm tra theo hai phương pháp sau: ➢ Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang Thực nghiệm được tiến hành tại bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Chúng tôi sử dụng máy Eppendorf Bio Photometer Plus. Các bước của quy trình thao tác chung: - Đo Blank: Đo với môi trường được sử dụng để bảo quản/ pha loãng mẫu DNA. - Đo mẫu DNA. Các mẫu được đo ở 2 bước sóng: 260nm và 280nm, mỗi mẫu đo ít nhất 2 lần và lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA của mẫu. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
➢ Kiểm tra DNA bằng phương pháp điện di - Điều kiện điện di: Điện di trên gel agarose 0,7% pha trong đệm TAE 1X, hiệu điện thế 90V, thời gian chạy 60 phút. - Thể tích mẫu điện di: 5 µl mẫu + 1µl DNA 6X loading dye, 5µl Ruler 100. 2.5.4. Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR và kiểm tra chất lượng sản phẩm 2.5.4.1. Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR Nguyên lý: Nguyên lý của kĩ thuật PCR để khuếch đại đoạn trình tự DNA mong muốn là: DNA mới được tổng hợp từ 1 DNA khuôn ban đầu bằng enzym polymerase. Thành phần chính của phản ứng bao gồm: DNA khuôn, mồi, dung dịch đệm, 4 loại deoxyrinucleotide triphosphate (dNTP) và DNA polymerase. Quy trình gồm 3 giai đoạn chính: - Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (95˚C) để tách hai mạch của chuỗi DNA xoắn kép. - Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ được hạ xuống thích hợp để mồi tự bắt cặp vào sợi DNA khuôn. Nhiệt độ này phụ thuộc vào mồi sử dụng như trình tự và số lượng nucleotide của mồi. - Giai đoạn kéo dài: Enzyme DNA polymerase sẽ tổng hợp mạch polynucleotide mới dựa vào mạch khuôn và 4 loại dNTP tại nhiệt độ 72˚C [24]. Trình tự mồi nhân dòng các alen *2 và *3 được trình bày dưới đây: Bảng 2.1. Trình tự mồi nhân dòng các alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 Alen Mồi Trình tự Độ dài sản phẩm *2 CYP2C19*2-F TGGAATTTGAAGTATCTTTGAGCCC 719 bp CYP2C19*2-R CAATGAATCACAAATACGCAAGCAG *3 CYP2C19*3-F GCAACCATTATTTAACCAGCTAGG 898 bp CYP2C19*3-R CTGTCTCATCAGCTAGAATCCCA Chúng tôi tiến hành tối ưu hóa các thành phần và điều kiện phản ứng PCR cho từng alen *2, *3. Quy trình PCR của 2 alen này được thể hiện trong bảng 2.2 và bảng 2.3 như sau: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
Bảng 2.2. Quy trình PCR cho alen *2 Thành phần Nồng độ hoạt động Điều kiện phản ứng DNA template 5-100 ng - Biến tính: 98˚C trong 3 phút dNTP mix, 2 mM 0,2 mM - 35 chu kì: Q5® Reaction Buffer 5X 1X + 98˚C trong 10 giây Mồi *2F 10 mM 0,25 µM + 59˚C trong 30 giây Mồi *2R 10mM 0,25 µM + 72˚C trong 30 giây Q5 pol 2 u/µl 0,02 u/µl - Kết thúc: 72˚C trong 5 phút Bảng 2.3. Quy trình PCR cho alen *3 Thành phần Nồng độ hoạt động Điều kiện phản ứng DNA template 40-170 ng - Biến tính: 98˚C trong 3 phút dNTP mix, 2 mM 0,2 mM - 35 chu kì: Q5® Reaction Buffer 5X 1X + 98˚C trong 10 giây Mồi *3F 10 mM 0,25 µM + 68˚C trong 30 giây Mồi *3R 10mM 0,25 µM + 72˚C trong 30 giây Q5 pol 2 u/µl 0,02 u/µl - Kết thúc: 72˚C trong 5 phút 2.5.4.2. Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR Phương pháp điện di được sử dụng để kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR. Quy trình được tiến hành tương tự như điện di kiểm tra chất lượng tách chiết DNA. 2.5.5. Tinh sạch sản phẩm PCR Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng kit GeneJET PCR theo các bước sau: 1. Thêm thể tích Binding Buffer vào sản phẩm PCR theo tỉ lệ 1:1. Mix đều. 2. Nếu DNA <500 bp, thêm isopropanol 100% với tỉ lệ 1:2. Mix đều. 3. Chuyển 800µl hỗn hợp từ bước 1 (hoặc bước 2) vào cột tách GeneJET, sau đó ly tâm trong 30 - 60 giây, loại bỏ phần dịch lọc. 4. Thêm 700µl Wash Bufer vào cột, ly tâm trong 30 - 60 giây, bỏ phần dịch lọc. 5. Ly tâm cột lọc trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn Wash Bufer. 6. Chuyển cột lọc sang ống ly tâm vô trùng 1,5ml. Thêm 50µl Elution Buffer. Ủ trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm, thu dịch lọc. 7. Bảo quản sản phẩm tinh sạch ở -20˚C. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
2.5.6. Xác định kiểu gen của SNP CYP2C19*2, *3 sử dụng phương pháp cắt bằng enzym giới hạn (RFLP) có đối chiếu với phương pháp giải trình tự Sau khi tinh sạch, sản phẩm PCR sẽ được pha loãng hoặc cô đặc đến nồng độ 40 - 50ng/µl và tiến hành cắt bằng enzym giới hạn (RFLP). Mỗi mẫu sẽ được cắt (quá trình ủ) ở 2 thời gian trong vùng thời gian cắt hoàn toàn tối ưu để đảm bảo phản ứng cắt xảy ra hoàn toàn, cũng như để kiểm tra tính lặp lại của phản ứng. Quy trình RFLP phân tích kiểu gen của alen *2, *3 được thể hiện dưới đây: Bảng 2.4. Quy trình RFLP để phân tích kiểu gen của alen *2 Thành phần Thể tích Điều kiện phản ứng Sản phẩm PCR alen *2 đã tinh sạch 5 µl - Ủ: 300C trong 2 điều kiện: 10X Buffer Tango 1 µl 1 giờ và 3 giờ SmaI 1U/µl 1 µl - Bất hoạt: 650C trong 20 Nước khử ion 8 µl phút Kết quả được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,5%, ở 100V trong 60 phút (so sánh với marker 100bp). Alen *2: điểm đa hình thay thế G bằng A: Kiểu gen AA điện di cho 1 băng duy nhất có kích thước: 719 bp. Kiểu gen GG (kiểu gen dại) điện di cho 2 băng có kích thước: 526 bp và 193 bp. Kiểu gen GA điện di cho 3 băng có kích thước: 719bp, 526bp và 193 bp. Bảng 2.5. Quy trình RFLP để phân tích kiểu gen của alen *3 Thành phần Thể tích Điều kiện phản ứng Sản phẩm PCR alen *3 đã tinh sạch 5 µl - Ủ: 370C trong 2 điều kiện: 10X FastDigest Buffer 1 µl 15 phút và 30 phút FastDigest BamHI 1 µl - Bất hoạt: 800C trong 5 phút Nước khử ion 8 µl Kết quả được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,5%, ở 100V trong 60 phút (so sánh với marker 100bp). Alen *3: điểm đa hình thay thế G bằng A: Kiểu gen AA điện di cho 1 băng duy nhất kích thước: 898 bp. Kiểu gen GG (kiểu gen dại) điện di cho 2 băng có kích thước: 523 bp và 375 bp. Kiểu gen GA điện di cho 3 băng có kích thước: 898 bp, 523 bp và 375 bp. Sau khi có kết quả kiểu gen của SNP CYP2C19*2 và CYP2C19*3 sử dụng phương pháp RFLP, chúng tôi cũng tiến hành GTT ở 15 mẫu bệnh nhân đầu để kiểm tra độ chính xác của phương pháp RFLP. Quy trình RFLP được coi là tối ưu tốt và @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
cho kết quả chính xác khi cả hai phương pháp có kết quả như nhau. Do đó, với các mẫu bệnh nhân tiếp theo chúng tôi sẽ tiến hành phương pháp RFLP để xác định kiểu gen của SNP CYP2C19*2 và CYP2C19*3, vì phương pháp cho kết quả nhanh và tiết kiệm chi phí cho bệnh nhân. Chúng tôi lấy 20µl sản phẩm PCR lên băng đặc hiệu và sáng nét gửi đi tinh sạch và giải trình tự 2 chiều tại hãng First Base (Malaysia). Kết quả GTT được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9, dựa trên các pic thu được. Với mỗi SNP, kết quả cũng cho ra các loại kiểu gen như ở phương pháp RFLP. 2.5.7. Cách đọc kết quả kiểu gen CYP2C19 Để tìm được kiểu gen của từng bệnh nhân trong nghiên cứu, chúng tôi cần tìm được kiểu gen của từng alen tức là phải xác định được từng SNP. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn 2 SNP: CYP2C19*2 và CYP2C19*3 để phân tích. Mặc dù gen CYP2C19 còn một số SNP khác nhưng tần số xuất hiện của các SNP thấp qua các nghiên cứu ở quần thể người Châu Á và mức độ ảnh hưởng của chúng không nhiều đến đáp ứng của clopigogrel cũng như hạn chế về mặt kinh phí, nên với nghiên cứu này, chúng tôi đã coi các SNP trên là alen kiểu dại (CYP2C19*1). Sau khi đã có kết quả của 2 SNP CYP2C19*2 và CYP2C19*3, tổ hợp kết quả kiểu gen của 2 SNP này sẽ ra kết quả kiểu gen CYP2C19 của từng bệnh nhân như trong bảng dưới đây: Bảng 2.6. Cách đọc kết quả kiểu gen CYP2C19 Kiểu gen của từng alen Kiểu gen CYP2C19 Tác dụng dược lý CYP2C19*2: GG *1/*1 Chuyển hóa thuốc bình thường CYP2C19*3: GG CYP2C19*2: GA *1/*2 CYP2C19*3: GG Chuyển hóa thuốc trung bình CYP2C19*2: GG *1/*3 CYP2C19*3: GA CYP2C19*2: AA *2/*2 CYP2C19*3: GG CYP2C19*2: GA *2/*3 Chuyển hóa thuốc kém CYP2C19*3: GA CYP2C19*2: GG *3/*3 CYP2C19*3: AA 2.5.8. Xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu ➢ Nguyên lý chung: Khi thêm chất kích tập như ADP, collagen thì tiểu cầu có khả năng ngưng tập, qua đó phản ánh một trong những chức năng quan trọng của tiểu cầu. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
Kỹ thuật đo độ NTTC được sử dụng phổ biến là thông qua sự thay đổi mật độ quang (phương pháp đo quang) hoặc độ trở kháng để đánh giá chức năng tiểu cầu [4]. ➢ Nguyên lý của phương pháp đo quang: Trong phương pháp quang học, một quang phổ kế có bước sóng thích hợp cố định được dùng làm thiết bị đo độ NTTC. Một chùm tia ánh sáng đỏ chiếu qua một ống chứa huyết tương giàu tiểu cầu và một chùm tia khác chiếu qua một ống chứa huyết tương nghèo tiểu cầu. Khi đo, người ta sử dụng một mẫu huyết tương giàu tiểu cầu của mẫu máu cần đo để thiết lập điểm chuẩn mà ở đó ánh sáng bị cản hoàn toàn và có độ dẫn truyền ánh sáng là 0%. Bên cạnh đó, người ta sử dụng huyết tương nghèo tiểu cầu của mẫu máu cần đo như trên để thiết lập điểm chuẩn mà ở đó ánh sáng đi qua hoàn toàn và độ dẫn truyền ánh sáng là 100%. Khi cho các chất kích tập như ADP, collagen, thrombin, epinephrine, arachidonic acid, ristocetin vào huyết tương giàu tiểu cầu thì các tiểu cầu sẽ ngưng tập với nhau tạo thành đám vì vậy độ dẫn truyền ánh sáng sẽ tăng lên. Do đó, độ NTTC sẽ được phản ánh bằng độ dẫn truyền ánh sáng. Kết quả thể hiện bằng % độ dẫn truyền ánh sáng của huyết tương giàu tiểu cầu mà khi đó tiểu cầu đã ngưng tập tối đa [22]. Hình 2.1. Nguyên lý của xét nghiệm độ NTTC (Nguồn: Principles of platelet aggregation in clinical trials, JAVA clinical Research) Trị số bình thường [1]: - Chất kích tập ADP: 59- 88%. - Chất kích tập Collagen: 58- 78%. NTTC bị thay đổi trong nhiều bệnh rối loạn chức năng tiểu cầu. Ví dụ như NTTC bị giảm với chất kích tập là ristocetin ở những bệnh nhân có hội chứng Bernard @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
Soulier (thiếu GP Ib) hoặc vWF, giảm với chất kích tập là ADP ở những bệnh nhân dùng aspirin [2]. ➢ Cách tiến hành: Đo độ NTTC được tiến hành trên máy Chrono – LOG của Mỹ. Chất kích tập được sử dụng là ADP 5µM của hãng Nippon Corporation (Nhật Bản). Các bước tiến hành được trình bày dưới đây: - 4ml máu tĩnh mạch của bệnh nhân được lấy theo cách thức không garo tĩnh mạch, để máu tự chảy qua kim lấy máu vào ống xét nghiệm có chứa sẵn chất chống đông natri citrat 3,8%, theo tỉ lệ 9 thể tích máu/1 tỉ lệ chống đông. - Trộn đều nhẹ nhàng chất chống đông với máu. - Làm xét nghiệm không quá 30 phút kể từ khi lấy máu. Đảm bảo máu được vận chuyển nhẹ nhàng, không bị vỡ hồng cầu. - Các mẫu máu đo độ NTTC trước tiên cần thu huyết tương giàu tiểu cầu bằng cách ly tâm nhẹ trong 10 phút với tốc độ 500 vòng/phút (số lượng tiểu cầu từ 200- 400 G/L), sau đó ly tâm mạnh trong 10 phút với tốc độ 3000 vòng/phút để thu được huyết tương nghèo tiểu cầu. Sử dụng máy ly tâm KUBOTA 5910 (Nhật Bản). - Độ NTTC được đánh giá dựa vào độ ngưng tập tối đa MA% (Maximum aggregation): chỉ số NTTC ở người bình thường với chất kích tập ADP 10µM là 67±5%. 2.6. Xử lý và phân tích số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20.0 Sử dụng các test thống kê: Tính trị số trung bình, trung vị, T-test, chi-square, ANOVA test, ở những chỗ phù hợp. Kết quả trình bày dưới dạng tần số, tỉ lệ %, trung bình ± độ lệch chuẩn (có phân phối chuẩn). Giá trị p<0,05 trong các kiểm định thống kê được coi là có sự sai khác mang ý nghĩa thống kê. 2.7. Các loại sai số và cách khắc phục 2.7.1. Sai số mắc phải - Sai số trong quá trình lựa chọn bệnh nhân. - Sai số trong quá trình làm thí nghiệm và xét nghiệm: sai số hệ thống do máy móc, do các loại test, kit. Sai số ngẫu nhiên do người làm thí nghiệm hoặc xét nghiệm, do ảnh hưởng của môi trường lên kết quả xét nghiệm. - Sai số trong quá trình thu thập số liệu + Trong quá trình thăm khám bệnh nhân. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
+ Trong quá trình ghi chép bệnh án: không ghi chép được các đặc điểm lâm sàng quan trọng, ghi chép không đúng hoặc thiếu các thông tin quan trọng trong biểu mẫu. - Sai số trong quá trình nhập, xử lý và phân tích số liệu. 2.7.2. Cách khắc phục sai số - Sai số trong quá trình lựa chọn bệnh nhân: Khắc phục bằng cách cố gắng lựa chọn các bệnh nhân có đặc điểm tương đồng với nhau về tuổi và giới. - Sai số trong quá trình làm sạch và nhập số liệu: Khắc phục bằng cách đọc phiếu thu thập thông tin/bệnh án cẩn thận, làm sạch số liệu trước khi nhập liệu. - Sai số trong quá trình xét nghiệm: Khắc phục bằng cách chuẩn hóa các quy trình xét nghiệm, các bộ test, kit. Cán bộ phòng thí nghiệm được đào tạo, tập huấn, làm thành thạo các quy trình. Máy móc, thiết bị được chuẩn hóa. Ước tính sai số do máy móc thiết bị gây ra để điều chỉnh hợp lý. - Sai số trong quá trình thu thập số liệu: + Chuẩn hóa quy trình thăm hỏi bệnh nhân và ghi chép bệnh án. + Các biểu mẫu được xây dựng và được các bác sĩ, điều dưỡng, điều tra viên tham gia góp ý chỉnh sửa và tiến hành thu thập thử để hoàn thiện biểu mẫu. 2.8. Đạo đức nghiên cứu Đề tài nghiên cứu được thông qua tại hội đồng đạo đức Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, ngày 02/10/2015, theo mã số đề tài QG.15.32. Bệnh nhân trước khi tham gia nghiên cứu được thông báo đầy đủ về mục đích và mục tiêu nghiên cứu, các lợi ích cũng như những ảnh hưởng bất lợi của nghiên cứu tới bệnh nhân. Những bệnh nhân tham gia nghiên cứu sẽ được ký bản đồng thuận tham gia nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút khỏi nghiên cứu ở bất kỳ thời điểm nào. Các thông tin của bệnh nhân được đảm bảo bí mật tuyệt đối và chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả 3.1.1. Một số đặc điểm chung Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 54 bệnh nhân ĐTNKÔĐ, thu được một số kết quả lâm sàng về tỉ lệ giới tính, tuổi và các yếu tố nguy cơ được thể hiện trong các bảng biểu dưới đây. Biểu đồ 3.1. Phân bố số lượng bệnh nhân ĐTNKÔĐ theo giới Nhận xét: Trong nhóm nghiên cứu, số bệnh nhân nam là 45 (chiếm 83,3%) cao hơn so với số bệnh nhân nữ là 9 (chiếm 16,7%). Biểu đồ 3.2. Đặc điểm về tuổi của bệnh nhân ĐTNKÔĐ Nhận xét: Bệnh ĐTNKÔĐ có xu hướng tăng dần theo tuổi, phần lớn các bệnh nhân có độ tuổi trên 50 với tuổi trung bình là 63,57±10,28 trong đó, nhỏ nhất là 42 tuổi đến lớn nhất là 83 tuổi. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
Bảng 3.1. Phân bố các yếu tố nguy cơ ở nhóm nghiên cứu Yếu tố Tổng (N= 54) Nam (N= 45) Nữ (N= 9) P nguy cơ N % N % N % (2) Hút thuốc lá 37 68,5% 36 80% 1 11,1% 0,05). Biểu đồ 3.3. Phân bố số lượng yếu tố nguy cơ của bệnh nhân ĐTNKÔĐ Nhận xét: Các yếu tố nguy cơ chính của ĐTNKÔĐ có mặt ở hầu hết bệnh nhân. Chỉ có 1/54 bệnh nhân chưa tìm thấy yếu tố nguy cơ, còn phần lớn có từ 2 yếu tố nguy cơ trở lên (39/54 bệnh nhân) chiếm 72,2%. 3.1.2. Kết quả đo một số chỉ số cận lâm sàng Khi nhập viện, các bệnh nhân được làm một số xét nghiệm cận lâm sàng để theo dõi và đánh giá tình trạng bệnh. Kết quả đo được trình bày trong bảng 3.2 như sau: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
Bảng 3.2. Kết quả cận lâm sàng của nhóm nghiên cứu Tổng số Nam Nữ Chỉ số P N (푿̅ ±SD) N (푿̅ ±SD) N (푿̅ ±SD) RBC (T/L) 52 4,63±0,54 43 4,68±0,56 9 4,35±0,28 0,094 (4,5 - 5,9) WBC (G/L) 52 8,13±2,60 43 8,17±2,55 9 7,92±3,01 0,798 (4,0 - 10) PLT (G/L) 52 255,87±66,56 43 248,81±62,47 9 289,56±78,83 0,095 (150 - 450) MCV (fL) 52 87,86±7,27 43 88,14±7,89 9 86,51±2,88 0,543 (80 - 100) MPV (fL) 52 9,17±1,16 43 9,12±1,15 9 9,42±1,22 0,484 (5 - 20) Cholesterol (mmol/l) 42 4,20±1,01 36 4,08±0,95 6 4,90±1,12 0,065 ( =1,45) LDL (mmol/l) 43 2,32±0,71 37 2,30±0,66 6 2,45±1,05 0,646 (<=3,4) CRP (mg/dL) 50 0,81±1,81 41 0,92±1,98 9 0,29±0,31 0,350 (<0,5) Fibrinogen (g/l) 51 3,68±1,05 42 3,67±1,11 9 3,73±0,72 0,890 (2 - 4) PT(%) 51 91,75±14,17 42 90,55±14,45 9 97,38±11,88 0,192 (70 - 140) APTT bệnh/chứng 51 1,08±0,17 42 1,09±0,18 9 1,02±0,13 0,233 (0,85-1,2) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
Nhận xét: Sự khác biệt về một số kết quả cận lâm sàng ở hai giới của nhóm nghiên cứu đều không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). 3.1.3. Kết quả đo độ NTTC Ngoài các kết quả cận lâm sàng, chúng tôi cũng tiến hành đo độ NTTC của các bệnh nhân vào ngày thứ 3 sau khi dùng liệu pháp kháng tiểu cầu kép aspirin và clopidogrel để đánh giá hiệu quả điều trị. Kết quả đo độ NTTC như sau: Bảng 3.3. Kết quả đo độ NTTC của bệnh nhân ĐTNKÔĐ Tổng số Min Max Nam Nữ p 푿̅ ±SD % % 푿̅ ±SD 푿̅ ±SD Độ NTTC 31,3±11,66 10 61 30,93±11,98 33,11±10,30 0,614 Nhận xét: Kết quả cho thấy trung bình độ NTTC của các bệnh nhân là 31,3±11,66, dao động từ 10% đến 61%. Độ NTTC ở hai giới có độ tương đồng cao (p>0,05). 3.1.4. Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 3.1.4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số Khâu tách chiết DNA tổng số là bước quan trọng trong quá trình xác định kiểu gen nhằm đạt được mục tiêu đã đề ra. Tuy nhiên, để đánh giá chất lượng sản phẩm DNA tổng số tách được, chúng tôi đã sử dụng phương pháp điện di (đánh giá định tính) và đo OD (đánh giá định lượng) DNA tổng số. Kết quả đo OD và điện di được trình bày như sau: ➢ Kết quả đo OD Bảng 3.4. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của sản phẩm tách DNA Min Max Nồng độ (ng/µl) 13,10 170,05 OD260/OD280 1,806 2,146 Nhận xét: Nồng độ DNA được tách từ các mẫu máu toàn phần dao động từ 13,10 ng/µl đến 170,05 ng/µl và có độ tinh sạch cao (tỉ lệ OD260/OD280 trong khoảng từ 1,806 đến 2,146). ➢ Kết quả điện di DNA tổng số Sản phẩm tách DNA tổng số cũng được đánh giá bằng cách điện di trên gel agarose 0,7% với hiệu điện thế 90V, chạy trong một giờ. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
Hình 3.1. Điện di DNA tổng số trên gel Agarose 0,7% Làn M: Lambda DNA/HindIII Marker Làn 16-38 : DNA tổng số của bệnh nhân có mã tương ứng Nhận xét: Kết quả điện di cho thấy: chất lượng DNA tổng số cho kết quả tốt, tất cả mẫu đều có một băng điện di, ít bị đứt gãy, băng lên rõ. Sản phẩm DNA được tách đáp ứng đủ điều kiện cho thí nghiệm PCR nhân dòng các phân đoạn gen tiếp theo. 3.4.1.2. Kết quả khuếch đại vùng gen chứa alen CYP2C19*2, CYP2C19*3 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại các vùng gen chứa alen *2, *3 nhằm thu được vùng gen đặc hiệu đối với từng alen được thể hiện như sau: Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR nhân vùng gen chứa alen CYP2C19*2 (719 bp) và CYP2C19*3 (898 bp) trên gel agarose 1% Làn M: Ruler 100bp Plus DNA Ladder Lần 2(-), 3(-): Đối chứng âm Làn 2-41 đến 2-45, 2-49: sản phẩm PCR vùng chứa *2 của các bệnh nhân với mã tương ứng Làn 3-41 đến 3-45 : sản phẩm PCR vùng chứa *3 của các bệnh nhân với mã tương ứng Nhận xét: Kết quả điện di cho thấy, các cặp mồi được sử dụng là đặc hiệu, các thành phần khác và điều kiện phản ứng đã được tối ưu tốt. Với mỗi alen, các mẫu DNA đều tạo một băng duy nhất, rõ nét, không có băng phụ, không có smear. Kích thước băng điện di của sản phẩm PCR nhân vùng gen chứa CYP2C19*2 và *3 lần lượt là 719 bp và 898 bp. Các sản phẩm PCR có thể được sử dụng cho quy trình GTT và RFLP. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
3.1.4.3. Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 bằng phương pháp RFLP có đối chiếu với phương pháp giải trình tự Trước khi tiến hành RFLP và giải trình tự, sản phẩm PCR phải được tinh sạch và đo nồng độ DNA. Chúng tôi sử dụng kit E.Z.N.A.® Cycle-Pure Kit (Omega- biotek) để tinh sạch 25µl sản phẩm PCR theo quy trình khuyến cáo của hãng. 20µl sản phẩm PCR lên băng điện di đặc hiệu, được tinh sạch với nồng độ tối thiểu là 15 ng/µl sẽ mang đi GTT 2 chiều tại hãng First Base (Malaysia). Kết quả GTT được phân tích trên phần mềm BioEdit version 7.1.9, từ đó xác định được kiểu gen trên từng alen *2 và *3. Kết quả kiểu gen thể hiện trong hình 3.3 và 3.4 dưới đây: Hình 3.3. Kết quả giải trình tự alen CYP2C19*2. A. Kiểu dại GG, B. Dị hợp đa hình GA, C. Đồng hợp đa hình AA @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
Hình 3.4. Kết quả giải trình tự alen CYP2C19*3. A. Kiểu dại GG, B. Dị hợp đa hình GA Nhận xét: CYP2C19*2 có kiểu gen dại là GG, kiểu gen dị hợp và đồng hợp đa hình lần lượt là GA và AA. CYP2C19*3 có kiểu gen dại là GG, kiểu gen dị hợp đa hình là GA. Sản phẩm GTT cho hình ảnh rõ nét. Các đỉnh màu tương ứng với các nucleotide rõ ràng và không bị nhiễu. Tính đến thời điểm này, phương pháp GTT vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc phân tích kiểu gen nhằm phát hiện các SNP với độ chính xác cao. Tuy nhiên phương pháp này còn hạn chế do chi phí đắt và mất nhiều thời gian. Mặt khác, CYP2C19*2 và CYP2C19*3 có vị trí cắt đặc hiệu với enzym giới hạn. Vì vậy, chúng tôi tiến hành phân tích kiểu gen bằng phương pháp RFLP với hai alen này. Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, mẫu sẽ được xử lý để đạt nồng độ 40- 50 ng/µl và được cắt theo quy trình đã tối ưu. Chúng tôi tiến hành ủ trong thời gian tối ưu nhất và lặp lại 2 lần với mỗi alen để kiểm tra độ tương đồng và kết quả. Phương pháp điện di được sử dụng để thể hiện kết quả sản phẩm cắt 2 alen và được trình bày trong hình 3.5, 3.6 dưới đây: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 37
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm cắt của alen CYP2C19*2 trên gel agarose 1.5% Làn M: 100 bp DNA ladder Làn 2-52, 2-57, 2-66: Kiểu gen của bệnh nhân với mã tương ứng, mỗi mẫu được làm 2 lần Nhận xét: Hình ảnh điện di rõ nét cho thấy enzym cắt sử dụng cho alen *2 là đặc hiệu, các yếu tố của phản ứng cắt được tối ưu. Kiểu gen đồng hợp đa hình AA điện di cho 1 băng kích thước 719 bp, kiểu gen dại GG điện di cho 2 băng kích thước 526 và 193 bp, kiểu gen dị hợp GA điện di cho 3 băng kích thước 719, 526 và 193 bp. Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt của alen CYP2C19*3 trên gel agarose 1.5% Làn M: 100 bp DNA ladder. Làn 3-156, 3-157: Kiểu gen của bệnh nhân với mã tương ứng, mỗi mẫu được làm 2 lần Nhận xét: Hình ảnh điện di rõ nét cho thấy enzym cắt sử dụng cho alen *3 là đặc hiệu, các yếu tố của phản ứng cắt được tối ưu. Kiểu gen dại GG điện di cho 2 băng kích thước 523 và 375 bp, kiểu gen dị hợp GA điện di cho 3 băng kích thước 898, 523 và 375 bp. Khi so sánh kết quả phân tích kiểu gen của 2 alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 ở 15 mẫu bệnh nhân đầu giữa phương pháp GTT và phương pháp RFLP, chúng tôi @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 38
thấy có độ tương đồng cao. Vì vậy, chúng tôi sử dụng phương pháp RFLP với các mẫu bệnh nhân tiếp theo để giảm chi phí và tiết kiệm thời gian. Kết quả kiểu gen và tần số alen của CYP2C19*2 và CYP2C19*3 được trình bày trong bảng dưới đây: Bảng 3.5. Kết quả kiểu gen và tần số alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 Alen Số lượng kiểu gen trên từng alen (%) Tần số alen p-value (KĐ GG GA AA G A chi-square) CYP2C19*2 28 (51,9%) 20 (37%) 6 (11,1%) 0,70 0,30 0,41 CYP2C19*3 48 (88,9%) 6 (11,1%) - 0,94 0,06 0,67 Nhận xét: Alen *2: Kiểu gen GG chiếm tỉ lệ cao nhất với 51,9%, kiểu gen GA chiếm 37%, trong khi kiểu gen AA chỉ chiếm 11,1%. Với alen *3, phần lớn bệnh nhân có kiểu gen GG (chiếm 88,9%), còn lại là 11,1% kiểu gen GA và không thấy sự xuất hiện của kiểu gen AA. Kiểm định chi-square cho thấy các alen *2, *3 tuân theo định luật Hardy- Weinberg, mẫu nghiên cứu có tính đại diện cho quần thể bệnh nhân ĐTNKÔĐ ở người Việt Nam, trong đó, tần số alen đa hình của *2 chiếm tỉ lệ cao hơn tần số alen đa hình *3. Ngoài ra, trong tần số alen đa hình *3: alen A chiếm tỉ lệ khá thấp (0,06) so với alen G (0,94). Từ kết quả kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 kết hợp với bảng cách đọc kết quả kiểu gen (bảng 2.6), chúng tôi đưa ra bảng kết quả tần số phân bố kiểu gen CYP2C19 và tỉ lệ phân loại theo mức tác dụng dược lý do kiểu gen quy định như sau: Bảng 3.6. Tần số phân bố các kiểu gen CYP2C19 của nhóm nghiên cứu Kiểu gen Tổng (N= 54) Nam (N= 45) Nữ (N= 9) CYP2C19 N % N1 % N2 % *1*1 24 44,4% 19 42,2% 5 55,6% *1*2 18 33,3% 16 35,6% 2 22,2% *1*3 4 7,4% 4 8,9% 0 0,0% *2*2 6 11,1% 4 8,9% 2 22,2% *2*3 2 3,8% 2 4,4% 0 0,0% p 0,541 Nhận xét: Bảng kết quả tần số phân bố kiểu gen CYP2C19 cho thấy: kiểu gen *1*1 (kiểu dại) chiếm tỉ lệ cao nhất (44,4%). Các kiểu gen *1*2, *2*2 và *1*3 chiểm tỉ lệ giảm @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 39
dần với 33,3%; 11,1% và 7,4%. Kiểu gen *2*3 chiếm tỉ lệ rất nhỏ với 3,8%. Ngoài ra, không có sự khác biệt về tỉ lệ kiểu gen ở hai giới (p>0,05). Bảng 3.7. Tỉ lệ phân loại theo mức tác dụng dược lý do kiểu gen quy định Tác dụng dược lý Tổng (N= 54) Nam (N= 45) Nữ (N= 9) theo kiểu gen N % N % N % Tác dụng bình thường 24 44,4% 19 42,2% 5 55,6% Tác dụng giảm 22 40,7% 20 44,4% 2 22,2% Tác dụng kém 8 14,9% 6 13,4% 2 22,2% p 0,447 Nhận xét: Bảng 3.7 cho thấy sự phân bố của các nhóm gen theo tác dụng dược lý với tác dụng bình thường (*1*1), tác dụng giảm (*1*2, *1*3) và tác dụng kém (*2*2, *2*3). Chiếm tỉ lệ cao nhất là nhóm tác dụng bình thường với 44,4%, theo sau là nhóm tác dụng giảm với 40,7%. Chiếm tỉ lệ thấp nhất trong tổng số bệnh nhân nghiên cứu là nhóm tác dụng kém với 14,9%. Ngoài ra, không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê giữa tác dụng gen do kiểu gen quy định trong hai giới (p>0,05). 3.1.5. Mối quan hệ giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 Bảng 3.8. Độ NTTC giữa các kiểu gen trong CYP2C19*3 CYP2C19*3 GG GA AA p 636G>A N= 48 N= 6 N= 0 Độ NTTC (%) 30,73±11,06 35,83±16,21 - 0,317 (퐗̅ ± SD) Nhận xét: Bảng kết quả cho thấy ở alen CYP2C19*3, không có sự khác biệt về độ NTTC giữa các kiểu gen GG và GA (p>0,05). Bảng 3.9. Độ NTTC giữa các kiểu gen trong CYP2C19*2 CYP2C19*2 GG GA AA p 681G>A N= 28 N= 20 N= 6 Độ NTTC (%) 27,29±10,59 35,55±12,16 35,83±9.30 0,029 (퐗̅ ± SD) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 40
Biểu đồ 3.4. Độ NTTC giữa các kiểu gen trong CYP2C19*2 Nhận xét: Bảng 3.9 và biểu đồ 3.4 cho thấy: có mối liên quan giữa độ NTTC với các kiểu gen trong alen *2 (p=0,029). Hơn nữa, kiểu gen dị hợp đa hình GA có độ NTTC cao hơn so với kiểu dại GG (p=0,016). Tuy nhiên, chưa thấy có sự khác biệt về độ NTTC ở kiểu gen AA so với kiểu gen GG và kiểu gen GA với p lần lượt là 0,077 và 0,959. Bảng 3.10. Độ NTTC giữa các kiểu tác dụng dược lý do kiểu gen quy định Độ NTTC (%) Tác dụng dược lý N p (퐗̅ ± SD) Tác dụng bình thường 24 27,42±11,11 Tác dụng giảm 22 32,18±10,40 0,018 Tác dụng kém 8 40,5±12,19 Tổng số 54 31,30±11,66 Biểu đồ 3.5. Độ NTTC giữa tác dụng (giảm+kém) và tác dụng bình thường @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 41
Nhận xét: Bảng 3.10 và biểu đồ 3.5 cho thấy: độ NTTC giữa các tác dụng dược lý do kiểu gen quy định có mối liên quan với nhau (p=0,018).Với nhóm tác dụng dược lý (giảm và kém), độ NTTC cao hơn so với nhóm tác dụng dược lý bình thường (p= 0,027). Tuy nhiên, so sánh theo cặp, không có sự khác biệt giữa nhóm tác dụng giảm và kém (p=0,074). Vì vậy, chúng tôi gộp nhóm tác dụng dược lý giảm và kém thành 1 nhóm và nhóm tác dụng bình thường là 1 nhóm khi phân tích mối liên quan giữa độ NTTC và các yếu tố nguy cơ được trình bày dưới đây. 3.1.6. Mối liên quan giữa độ NTTC và các yếu tố khác Hút thuốc lá, RLCH lipid, ĐTĐ, THA và béo phì là những yếu tố nguy cơ thường gặp của ĐTNKÔĐ. Do đó chúng tôi tiến hành tìm hiểu mối liên quan giữa độ NTTC và các yếu tố nêu trên theo 2 nhóm tác dụng dược lý như sau: Bảng 3.11. Mối liên quan giữa độ NTTC với một số yếu tố nguy cơ: Hút thuốc lá, RLCH lipid, ĐTĐ, THA và béo phì Tác dụng bình thường Tác dụng (giảm+kém) (N= 24) (N= 30) Yếu tố Độ NTTC Độ NTTC N (%) p N (%) p (X̅ ± SD) (X̅ ± SD) Có hút thuốc 16 25,38±9,00 21 33,57±11,89 0,21 0,55 Không hút thuốc 8 31,50±14,25 9 36,33±10,24 Có RLCH lipid 9 27,89±11,01 6 41,83±15.77 Không RLCH 0,876 0,071 15 27,13±11,54 24 32,54±9,46 lipid Có ĐTĐ 5 31,00±6,75 7 33,29±6,90 0,43 0,772 Không ĐTĐ 19 26,47±11,96 23 34,74±12,47 Có THA 17 27,53±11,56 20 36,00±12,06 0,94 0,281 Không THA 7 27,14±10,81 10 31,20±9,41 Có béo phì 2 19,00±4,24 4 40,50±13,00 0,27 0,254 Không béo phì 22 28,18±11,27 26 33,46±11,02 Nhận xét: Theo kết quả bảng 3.10 và biểu đồ 3.5, có sự khác biệt về trung bình độ NTTC giữa nhóm tác dụng dược lý bình thường và nhóm tác dụng dược lý (giảm+kém) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 42
(p 0,05). Bảng 3.13. Mối liên quan giữa độ NTTC với một số yếu tố cận lâm sàng Tác dụng bình thường Tác dụng (giảm+kém) Yếu tố (N= 24) (N= 30) r p r p RBC (T/L) -0,206 0,334 -0,034 0,863 WBC (G/L) -0,089 0,678 -0,106 0,592 PLT (G/L) 0,098 0,649 -0,019 0,925 MCV (fL) -0,003 0,988 0,163 0,409 MPV (fL) 0,020 0,926 -0,090 0,649 CRP (mg/dL) 0,180 0,399 -0,161 0,432 Fibrinogen (g/l) 0,226 0,289 0,079 0,695 PT (%) 0,004 0,984 0,057 0,779 APTT -0,150 0,484 0,133 0,507 bệnh/chứng Nhận xét: Chúng tôi sử dụng phép phân tích hồi quy tuyến tính cho 2 biến định lượng để phân tích mối liên quan giữa độ NTTC với một số yếu tố cận lâm sàng. Trong đó r là hệ số tương quan, r >0,7 (tương quan rất chặt chẽ), r <0,3 (ít tương quan), tương quan @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 43
đồng biến khi r có giá trị dương, tương quan nghịch biến khi r có giá trị âm. Bảng kết quả trên cho thấy các chỉ số cận lâm sàng được chọn có mối tương quan tương đối yếu so với độ NTTC ở cả 2 nhóm tác dụng bình thường và tác dụng (giảm+kém). Do đó, với cỡ mẫu của nghiên cứu này, chúng tôi chưa kết luận được gì về mối tương quan giữa độ NTTC và một số yếu tố cận lâm sàng. 3.2. Bàn luận ĐTNKÔĐ là một dạng trong hội chứng động mạch vành cấp. Nguyên nhân chính dẫn đến ĐTNKÔĐ là do sự nứt, vỡ của các mảng xơ vữa không ổn định, hình thành nên các cục máu đông nhưng chưa gây tắc hoàn toàn động mạch vành. Tuy nhiên, ĐTNKÔĐ có thể diễn biến nặng thành nhồi máu cơ tim thực sự và gây nên các biến cố tim mạch [26]. Bệnh động mạch vành nói chung và ĐTNKÔĐ nói riêng là nguyên nhân hàng đầu đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe người bệnh, gây tử vong thương tật cao trên thế giới và ngày càng gia tăng ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam. Chống hình thành huyết khối thông qua ức chế hoat động tiểu cầu là điều trị cốt lõi trong ĐTNKÔĐ ở Việt Nam, được dựa trên các hướng dẫn quốc tế luôn cập nhật như hướng dẫn của Hội tim mạch Hoa Kì nhằm nâng cao sức khỏe và cải thiện tiên lượng sống cho người bệnh [29]. Hiện nay, liệu pháp kháng tiểu cầu kép gồm aspirin và clopidogrel vẫn là lựa chọn hàng đầu trong điều trị chống NTTC nhằm ngăn ngừa các biến cố tim mạch. Tuy nhiên một số lượng lớn bệnh nhân ĐTNKÔĐ vẫn xảy ra các biến cố thiếu máu cơ tim cục bộ mặc dù tuân thủ đúng phác đồ điều trị [16]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng có sự khác nhau giữa các bệnh nhân điều trị clopidogrel [30,79]. Clopidogrel là một tiền chất không có tác dụng sinh học, được chuyển hóa thành thuốc có hoạt tính nhờ cytochrome P450 ở gan (chủ yếu là CYP2C19) với tác dụng làm giảm độ NTTC thông qua ức chế không hồi phục thụ thể P2Y12 trên màng tiểu cầu, làm cho các tiểu cầu không kết dính lại với nhau [54,68]. Enzym CYP2C19 được biết đến là enzym có tính đa hình cao với 25 alen. Hoạt tính enzym khác nhau phụ thuộc vào sự xuất hiện của các alen trong kiểu gen. Cụ thể, *1 là alen kiểu dại, biểu hiện hoạt tính enzyme bình thường trong khi các alen *2 và *3 gây mất hoạt tính enzym [68]. Cơ chế đáp ứng kém với clopidogrel hiện vẫn chưa được làm sáng tỏ đầy đủ, không chỉ do yếu tố di truyền như đa hình gen CYP2C19 mà còn do các yếu tố phi di truyền như không tuân thủ điều trị, tương tác thuốc, béo phì, tuổi cao, RLCH lipid, hút thuốc, THA, tiểu đường, tiền sử NMCT, [30]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 44
Trong nghiên cứu này, bên cạnh việc xác định tần số phân bố kiểu gen CYP2C19, chúng tôi còn tiến hành đánh giá mối tương quan giữa độ NTTC với đa hình CYP2C19 và một số yếu tố ảnh hưởng khác trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ ở Việt Nam. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, có mối liên quan về độ NTTC giữa bệnh nhân mang alen quy định enzym hoạt động bình thường và bệnh nhân mang alen quy định enzym mất hoạt tính chuyển hóa (p<0,05). 3.2.1. Một số đặc điểm chung 3.2.1.1. Đặc điểm về giới ĐTNKÔĐ chiếm tỉ lệ cao ở nam giới. Theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi, có 45 bệnh nhân nam (chiếm 83,3%) và 9 bệnh nhân nữ (chiếm 16,7%). Kết quả này phù hợp với kết quả của các nghiên cứu khác như Đinh Hữu Nghị là 81,3% nam [13], Đỗ Thị Tuyến là 78,9% nam [23], Nghiêm Hoàng Lan Phương là 85,7% nam [18]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, nữ giới bị can thiệp động mạch vành thường muộn hơn so với nam giới khoảng 9 năm và sự can thiệp này có xu hướng lan tỏa hơn với tình trạng nhiều bệnh lý đi kèm khiến tiên lượng ở nữ giới nặng nề hơn [36,72]. 3.2.1.2. Đặc điểm về tuổi Kết quả nghiên cứu trên 54 bệnh nhân ĐTNKÔĐ cho thấy: ĐTNKÔĐ có xu hướng tăng dần theo tuổi với tuổi trung bình là 63,57±10,28 dao động từ 42 tuổi đến 83 tuổi. Kết quả của chúng tôi tương tự với các kết quả nghiên cứu khác như Đỗ Thị Tuyến là 64±12,2 [23], Sibbing và cộng sự là 66.5±10,2 [71]. Kết quả của chúng tôi là phù hợp vì tuổi cao là một trong những yếu tố nguy cơ ĐTNKÔĐ. Khi tuổi cao, mức độ dày nội mạc mạch máu và sự già hóa tổ chức động mạch tăng lên, làm giảm khả năng trao đổi chất, giảm tính thấm với các chất có phân tử lớn và trở thành bệnh lý [15]. XVĐM là nguyên nhân chính dẫn đến ĐTNKÔĐ, mức độ XVĐM cũng tăng dần theo tuổi [3]. Tuy nhiên, bệnh có thể gặp ở những người bệnh trẻ tuổi nhưng do nhiều yếu tố khác nhau làm xuất hiện tình trạng rối loạn chuyển hóa. 3.2.1.3. Các yếu tố nguy cơ của ĐTNKÔĐ Hút thuốc lá là một trong những yếu tố nguy cơ nguy hiểm nhất của ĐMV vì chúng làm giảm khuếch tán, vận chuyển oxy đến các tổ chức và tế bào cơ tim làm co thắt ĐMV. Nhiều nghiên cứu cho thấy những người hút thuốc lá nặng có tỷ lệ tử vong do bệnh tim mạch cao gấp 1,5 lần so với người không hút thuốc. Nicotin trong thuốc lá làm nhịp tim nhanh, huyết áp tăng, lưu lượng tim và công của tim cũng tăng. Nicotin còn làm giải phóng ra nhiều catecholamine, tăng huy động axit béo, giảm dự @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 45
trữ mỡ và tăng cholesterol máu, đẩy nhanh sự phát triển của XVĐM [7,15]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỉ lệ hút thuốc lá chiếm 68,5% cao hơn nhiều so với kết quả của Trần Thị Hải Hà khi nghiên cứu trên bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp 16,3% [9]. Ngoài ra, tỉ lệ bệnh nhân hút thuốc lá ở nam giới cao hơn đáng kể so với nữ giới (80% và 11,1%). Kết quả này phù hợp với số liệu của WHO và điều tra y tế quốc gia năm 2002 với tỉ lệ hút thuốc ở nam giới Việt Nam là 56%, nữ là 1,8% [4]. THA là bệnh phổ biến trên thế giới cũng như ở Việt Nam, thường đi kèm với các yếu tố nguy cơ khác tạo tác dụng hiệp đồng, đặc biệt là phối hợp với RLCH lipid. Trong các trường hợp mắc bệnh và tử vong do tim mạch hàng năm thì có tới 30-40% nguyên nhân do THA [25]. THA làm đẩy nhanh quá trình XVĐM, phì đại cơ tim và giảm khả năng cung cấp máu của ĐMV. Ngoài ra, THA động mạch còn đi kèm với nhiều biến chứng phức tạp về mạch máu kết hợp với tăng hoạt hóa tiểu cầu và tổn thương nội mạc. Các yếu tố này góp phần khởi phát, thúc đẩy những diễn biến phức tạp của quá trình XVĐM và tác động mạnh mẽ lên ĐMV [12]. Nghiên cứu của chúng tôi cho tỉ lệ THA khá cao là 68,5%, tương tự với nghiên cứu của Tomoyuki và cộng sự (2013) thực hiện trên bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua da tại Nhật Bản với 61,9% bệnh nhân THA [76]. Ngoài ra, trong nghiên cứu này, chúng tôi không thấy có sự khác biệt về tỉ lệ THA ở hai giới. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Đinh Hữu Nghị (2005) trên bệnh nhân NMCT cấp [13]. Một yếu tố quan trọng nữa của bệnh ĐMV là ĐTĐ. Bệnh nhân mắc ĐTĐ có các biến cố tim mạch như NMCT, đột quỵ, suy tim, tắc mạch Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, người bị ĐTĐ typ II có nguy cơ bị bệnh mạch vành cao gấp 2- 4 lần và tăng tỉ lệ tử vong sau đặt stent mạch vành so với người không bị ĐTĐ. Ngoài ra, ở nam, nguy cơ tử vong tăng gấp 2 lần khi mắc bệnh mạch vành kèm ĐTĐ trong khi ở nữ là 4 lần [15]. Các rối loạn chuyển hóa trong ĐTĐ thường phối hợp với các RLCH lipid máu và THA, gây ra XVĐM và tình trạng tiền huyết khối. Kiểm soát đường huyết chặt chẽ ở bệnh nhân ĐTĐ sẽ giúp giảm nguy cơ biến chứng mạch máu, đặc biệt là ở nữ giới [67]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, có 22,2% bệnh nhân ĐTĐ, thấp hơn so với nghiên cứu của Ewa Laskowska (2015) trên bệnh nhân NMCT là 34,4% [41]. Ngoài ra, tỉ lệ mắc ĐTĐ ở nữ giới cao hơn đáng kể so với nam giới (p= 0,008), kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Đinh Hữu Nghị với p<0,05 [13]. Béo phì là một trong những yếu tố nguy cơ của hội chứng chuyển hóa và bệnh tim mạch. Béo phì thường phối hợp với tình trạng đề kháng insulin và giảm HDL-C huyết tương. Bệnh nhân có trọng lượng cơ thể bằng 120% trọng lượng lý tưởng sẽ có @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 46
nguy cơ mắc bệnh tim mạch tăng gấp 2 lần và sẽ giảm 33-55% khi họ giảm cân [21]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, có 11,1% bệnh nhân béo phì, thấp hơn kết quả của Lê Phúc Nguyên 20% [14]. Tỉ lệ bệnh nhân nam mắc béo phì có xu hướng cao hơn so với nữ (13,3% và 0%), phù hợp với kết quả của Nghiêm Hoàng Lan Phương với tỉ lệ mắc béo phì ở nam là 23,3% và ở nữ là 0% [18]. RLCH lipid là yếu tố nguy cơ không thể thiếu của bệnh mạch vành, đặc biệt là tăng cholesterol toàn phần, tăng LDL-C và giảm HDL-C [8]. Cholesterol toàn phần đóng vai trò quan trọng trong hình thành các mảng xơ vữa. Nồng độ cholesterol càng cao thì tần suất mắc bệnh mạch vành càng cao. Nếu cholesterol toàn phần 2,6g/l [20]. RLCH lipid làm thúc đẩy mạnh mẽ hình thành mảng XVĐM, với sự tham gia của LDL-C. Bởi sau khi xâm nhập được vào thành mạch máu, lắng đọng ở bên trong lòng mạch, chúng gây tăng sinh tế bào bọt, làm thành mạch bị tổn thương, dẫn đến tăng sinh, thoái hóa tế bào cơ trơn, và kết quả là XVĐM [46]. Tỉ lệ bệnh nhân RLCH lipid trong nghiên cứu của chúng tôi là 27,8%, thấp hơn nhiều so với nghiên cứu của Ewa Laskowska là 62,4% [41], của Tomoyuki là 71% [76]. Ngoài ra, tỉ lệ bệnh nhân RLCH lipid ở hai giới có độ tương đồng cao (p>0,05). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nghiêm Hoàng Lan Phương [18] và Trịnh Xuân Thắng [19]. Các yếu tố nguy cơ tim mạch có khuynh hướng xuất hiện cùng nhau và có tác dụng cộng hưởng. Những người có nhiều yếu tố nguy cơ thì khả năng mắc bệnh tim mạch sẽ cao hơn những người có yếu tố nguy cơ ít hoặc không có yếu tố nguy cơ [19]. Theo nghiên cứu của chúng tôi, hầu hết các bệnh nhân đều mang yếu tố nguy cơ, trong đó có tới 72,2% số bệnh nhân có từ 2 yếu tố nguy cơ trở lên (biểu đồ 3.3), kết quả này cao hơn so với nghiên cứu của Nghiêm Hoàng Lan Phương là 48,6% [18] và Trần Thị Hải Hà là 65% [9]. Người có ≥ 2 yếu tố nguy cơ chính (bao gồm Cholesterol ≥ 5,2 mmol/l, huyết áp ≥ 140/90 mmHg, hút thuốc lá) thì nguy cơ mắc bệnh mạch vành tăng gấp 5,5 lần ở nam và 5,7 lần ở nữ còn nguy cơ tử vong chung cũng tăng gấp 3,2 và 2,3 lần tương ứng ở nam và nữ [19]. 3.2.2. Một số đặc điểm cận lâm sàng Trong nghiên cứu này, chúng tôi đo một số chỉ số cận lâm sàng để theo dõi và đánh giá tình trạng bệnh nhân, bao gồm một số chỉ số huyết học: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, thể tích hồng cầu trung bình, thể tích tiểu cầu trung bình và một số chỉ số hóa sinh, đông máu như: các chỉ số về mỡ máu, CRP, fibrinogen, PT, APTT. Hầu hết trung bình các chỉ số nằm trong giới hạn bình thường và có độ tương đồng cao giữa @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 47
hai giới (bảng 3.2). Kết quả này phần lớn tương tự với nghiên cứu của Đỗ Thị Tuyến, tuy nhiên trong nghiên cứu của Đỗ Thị Tuyến, các chỉ số Cholesterol toàn phần và LDL-C có sự khác biệt giữa hai giới (p<0,05) [23]. 3.2.3. Kết quả đo độ NTTC Hiện nay, đo độ NTTC là một trong những phương pháp được sử dụng nhiều nhất để nghiên cứu chức năng tiểu cầu, đặc biệt trong các trường hợp có tăng NTTC, góp phần quyết định việc điều trị thuốc ức chế NTTC [35]. Mặc dù có nhiều chất kết tập được sử dụng để đánh giá độ NTTC như: ADP (adenosin diphosphate), collagen, ristocetin, arachidonic [10] nhưng trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng ADP làm chất kích tập tiểu cầu bởi nhiều lý do. ADP gây kích tập tiểu cầu độc lập, không bị phụ thuộc vào các tác nhân khác và giúp phản ứng NTTC do các tác nhân này xảy ra đầy đủ hơn. Không chỉ thế, ADP cũng tham gia vào nhiều phản ứng khác ở tiểu cầu như làm thay đổi hình dạng, bài tiết, tạo thromboxane A2, hoạt hóa GP IIb/IIIa [28]. ADP còn là đích tác dụng của một số thuốc chống NTTC hiện nay như ticlopidin, clopidogrel Hiện nay, aspirin đã trở thành thuốc kháng tiểu cầu được sử dụng phổ biến trong phòng ngừa nguyên phát và thứ phát bệnh tim mạch [31]. Tác dụng của aspirin là ngăn cản quá trình chuyển acid arachidonic thành thromboxane A2 (TXA2- một chất co mạch mạnh và kích thích gây NTTC). Bên cạnh đó, aspirin cũng làm bất hoạt chức năng hoạt hóa tiểu cầu gây ảnh hưởng đến chức năng tiểu cầu. Aspirin tác động một phần đối với NTTC do tác động của collagen, thrombin và ADP [54,69]. Ở những bệnh nhân sử dụng aspirin, aspirin làm giảm ngưng tập tiểu cầu với ADP [2]. Clopidogrel là một tiền thuốc thuộc nhóm thienopyridine thế hệ thứ hai. Sau khi hấp thu tại ruột, chỉ có 15% lượng thuốc được chuyển hóa tại gan qua hai bước oxy hóa liên tiếp bởi các enzym cytochrome P-450 (chủ yếu là CYP2C19) trở thành chất có hoạt tính kháng tiểu cầu, 85% lượng thuốc còn lại được chuyển hóa bởi các enzym esterase trở thành chất không có hoạt tính. Clopidogrel ức chế chọn lọc và không hồi phục quá trình gắn phân tử ADP vào các thụ thể P2Y12 của nó lên bề mặt tiểu cầu, làm cho các cảm thụ GPIIb/IIIa không được hoạt hóa, từ đó ngăn cản tiểu cầu kết dính với nhau. Do vậy, clopidogrel được dùng để ức chế sự hình thành huyết khối trong động mạch vành, động mạch ngoại vi và động mạch não [68]. Hiện nay, clopidogrel kết hợp với aspirin là liệu pháp điều trị kháng tiểu cầu phổ biến nhất ở bệnh nhân HCĐMVC, đặc biệt là có can thiệp động mạch vành qua da [16]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá độ NTTC trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ sử dụng kháng tiểu cầu kép gồm aspirin (liều nạp 300mg, liều duy trì 100mg/ngày) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 48
kết hợp với clopidogrel (liều nạp 300mg, liều duy trì 75mg/ngày). Chúng tôi gây NTTC bằng chất kích tập ADP thu được kết quả trung bình độ NTTC là 31,3±11,66%. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nghiêm Hoàng Lan Phương trên bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp tại thời điểm dùng kháng tiểu cầu kép [18]. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn so với Nguyễn Thị Nữ, Cung Thị Lý và Đỗ Trung Phấn khi nghiên cứu chỉ số NTTC với chất kích tập ADP ở người trưởng thành Việt Nam bình thường là 67±6,5% [17]. Điều này có thể giải thích do chúng tôi đo độ NTTC vào ngày thứ 3 sau khi dùng aspirin và clopidogrel. 3.2.4. Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 Xã hội càng phát triển thì yêu cầu về chất lượng khám chữa bệnh càng được chú trọng hơn với mục tiêu giảm chi phí, xác định đúng căn nguyên của bệnh để có các phác đồ điều trị đích thích hợp. Từ yêu cầu thiết yếu đó, kĩ thuật y sinh học phân tử ra đời giúp đưa ra chẩn đoán sớm và liệu pháp điều trị phù hợp nhờ phát hiện bất thường, dấu hiệu, nguy cơ bệnh tật khi phân tích đoạn gen nào đó của người bệnh. Tuy nhiên, quá trình tiến hành thí nghiệm để xác định các đa hình đơn gen (SNP) của từng bệnh nhân phải trải qua nhiều khâu, trong đó tách DNA tổng số là khâu đầu tiên và rất quan trọng. DNA sau tách chiết phải đảm bảo yêu cầu về nồng độ, không bị đứt gãy, không tạp nhiễm và có độ tinh sạch cao vì chất lượng DNA ảnh hưởng rất lớn đến kết quả của các khâu tiếp theo. Do đó, để kiểm tra chất lượng, chúng tôi không chỉ sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ quang ở các bước sóng 260nm và 280nm nhằm đánh giá độ tinh sạch, định lượng DNA thu được, mà còn đánh giá độ nguyên vẹn chiều dài DNA thông qua phương pháp điện di trên gel agarose 0,7%. Kết quả thể hiện trong bảng 3.4 và hình 3.1 cho thấy sản phẩm DNA tổng số đáp ứng đủ điều kiện cho các thí nghiệm phân tích tiếp theo. Bước kế tiếp của đề tài là khuếch đại vùng gen chứa các alen CYP2C19*2 (c.681>A) thuộc exon 5 và alen CYP2C19*3 (c.636>A) thuộc exon 4 trước khi tiến hành GTT hay quy trình RFLP. Chúng tôi sử dụng phương pháp PCR đơn mồi dùng một cặp mồi đặc hiệu với đoạn gen cần khuếch đại. Kết quả điện di sản phẩm PCR được thể hiện trong hình 3.2 cho thấy các điều kiện phản ứng PCR đã tối ưu tốt, băng đạt yêu cầu với kích thước đoạn gen thu được là 719 bp chứa alen *2 và 898 bp chứa alen *3. Sản phẩm PCR được tinh sạch trước khi thực hiện GTT. Kết quả GTT các mẫu nghiên cứu thể hiện trong hình 3.3 và 3.4 cho thấy hình ảnh rõ nét, các đỉnh màu tương ứng với các nucleotide rõ ràng và không bị nhiễu. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 49
Trong các mẫu nghiên cứu, alen CYP2C19*2 cho 3 loại kiểu gen: đồng hợp tử kiểu dại GG, dị hợp tử đa hình GA và đồng hợp tử đa hình AA. Trong khi đó, alen CYP2C19*3 chỉ cho hai loại kiểu gen: đồng hợp tử kiểu dại GG, dị hợp tử đa hình GA và không có bệnh nhân nào mang kiểu gen đồng hợp tử đa hình AA. Hiện nay, phương pháp GTT vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc phân tích kiểu gen nhằm phát hiện các SNP với độ chính xác cao nhưng chi phí đắt và mất nhiều thời gian. Mặt khác, *2 và *3 có vị trí cắt đặc hiệu với enzym giới hạn tương ứng là SmaI và FastDigest BamHI. Vì vậy, ngoài GTT, chúng tôi tiến hành phân tích kiểu gen bằng phương pháp RFLP. Kết quả điện di được thể hiện trong hình 3.5 và 3.6. Với alen *2, kiểu gen đồng hợp đa hình AA điện di cho 1 băng duy nhất kích thước 719 bp, kiểu gen dại GG điện di cho 2 băng có kích thước 526 bp và 193 bp, kiểu gen dị hợp tử đa hình GA điện di cho 3 băng có kích thước 719, 526 và 193 bp. Điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR nhân dòng alen *2 đã được tối ưu hóa với 1µl enzym SmaI cắt 40-50ng/µl DNA ở 30˚C trong 1giờ và 3 giờ nhằm kiểm tra tính lặp lại của phản ứng. Với alen *3, kiểu gen đồng hợp đa hình AA điện di cho 1 băng duy nhất kích thước 898 bp, kiểu gen dại GG điện di cho 2 băng có kích thước 523 bp và 375 bp, kiểu gen dị hợp tử đa hình GA điện di cho 3 băng có kích thước 898, 523 và 375 bp. Điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR nhân dòng alen *3 đã được tối ưu hóa với 1µl enzym FastDigest BamHI cắt 40-50ng/µl DNA ở 37˚C trong 15 phút và 30 phút nhằm kiểm tra tính lặp lại của phản ứng. Chúng tôi nhận thấy xác định kiểu gen bằng phương pháp RFLP cho kết quả tương đương khi so sánh với phương pháp GTT. Hơn nữa, kỹ thuật RFLP thao tác đơn giản, tiết kiệm thời gian và chi phí. Vậy nên, với các mẫu bệnh nhân nghiên cứu còn lại, chúng tôi sử dụng phương pháp RFLP để phân tích alen *2 và *3. Mục tiêu đầu của chúng tôi là xác định tần số phân bố kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3. Chúng tôi tiến hành phân tích kiểu gen của từng alen trên 54 bệnh nhân ĐTNKÔĐ thu được kết quả như trong bảng 3.5. Kết quả phân tích cho thấy, các alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 tuân theo định luật Hardy-Weinberg, do đó mẫu nghiên cứu có tính đại diện cho quần thể bệnh nhân ĐTNKÔĐ người Việt Nam. Năm 2017, Marchini J.F. và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu trên 169 bệnh nhân có can thiệp động mạch vành qua da tại Brazil cho thấy sự khác biệt khá lớn về tần số kiểu gen ở alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3. Với alen CYP2C19*2 trong khi nghiên cứu của Marchini J.F. cho tỉ lệ GG (74,0%), GA (23,7%), AA (2,4%) thì nghiên cứu của chúng tôi là GG (51,9%), GA (37%), AA (11,1%). Với alen @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 50
CYP2C19*3, theo Marchini J.F., cho tỉ lệ GG (100%), không thấy sự có mặt của kiểu gen dị hợp tử GA và đồng hợp tử AA đa hình, trong khi nghiên cứu của chúng tôi cho tỉ lệ GG (88,9%), GA (11,1%). Từ đây ta có thể thấy được sự ảnh hưởng của chủng tộc lên sự phân bố alen trong từng kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 [59]. Tìm được kiểu gen của từng alen hay xác định từng SNP sẽ giúp chúng tôi xác định được kiểu gen của từng bệnh nhân. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn 2 SNP là CYP2C19*2 và CYP2C19*3 để phân tích. Tuy gen CYP2C19 còn các SNP khác như CYP2C19*4, *5, *6, *7, nhưng tần số xuất hiện thấp cũng như hạn chế kinh phí nên chúng tôi coi các SNP này là các alen kiểu dại (CYP2C19*1). Sau khi phân tích kiểu gen kết hợp với bảng cách đọc kết quả kiểu gen (bảng 2.6), chúng tôi đã tìm được kiểu gen của từng bệnh nhân. Bảng 3.6 cho thấy chiếm tỉ lệ cao nhất là kiểu gen *1*1 (kiểu dại) với 44,4%, các kiểu gen còn lại chiếm tỉ lệ thấp hơn là *1*2 (33,3%), *2*2 (11,1%), *1*3 (7,4%), *2*3 (3,8%) và *3*3 (0,0%). Wichittra Tassaneeyakul và cộng sự (2006) nghiên cứu trên 127 người Myanma cho thấy: *1*1 (44,1%), *1*2 (39,4%), *2*2 (9,4%), *1*3 (5,5%), *2*3 (1,6%) và *3*3 (0,0%). Kết quả cho thấy tần số phân bố kiểu gen trong quần thể người Myanma có sự tương đồng cao so với quần thể nghiên cứu của chúng tôi [74]. Nghiên cứu của Tomoyuki và cộng sự (2013) trên 155 bệnh nhân can thiệp động mạch vành ở Nhật Bản (khu vực Bắc Á) cho thấy tần số xuất hiện của các kiểu gen có sự khác biệt so với kết quả của chúng tôi: *1*1 (40,0%), *1*2 (27,7%), *2*2 (7,1%), *1*3 (17,4%), *2*3 (6,5%), *3*3 (1,3%) [76]. Cụ thể, ở nghiên cứu này, alen *2 chiếm tỉ lệ thấp hơn trong khi alen *3 chiếm tỉ lệ cao hơn so với nghiên của chúng tôi (khu vực Đông Nam Á). Để giúp so sánh thuận tiện hơn cũng như để có cái nhìn dễ dàng, tổng quan hơn, chúng tôi đã tính toán tần số phân bố của từng alen gen CYP2C19 (biểu đồ 3.6) dựa vào bảng tần số phân bố kiểu gen CYP2C19 (bảng 3.6) và tiến hành so sánh kết quả này với các khu vực trong và ngoài Đông Nam Á. Biểu đồ 3.6. Tần số alen của gen CYP2C19 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 51

Khóa luận Đánh giá mối liên quan giữa độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định tại Viện Tim mạch Việt Nam

Nội dung text: Khóa luận Đánh giá mối liên quan giữa độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định tại Viện Tim mạch Việt Nam

Khóa luận Đánh giá mối liên quan giữa độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen CYP2C192, CYP2C193 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định tại Viện Tim mạch Việt Nam

Nội dung text: Khóa luận Đánh giá mối liên quan giữa độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen CYP2C192, CYP2C193 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định tại Viện Tim mạch Việt Nam