›

Khóa luận Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn nước cây Tầm bóp Physalis angulata

pdf 61 trang thiennha21 15/04/2022 5170
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn nước cây Tầm bóp Physalis angulata", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_buoc_dau_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_phan_doan_n.pdf

Nội dung text: Khóa luận Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn nước cây Tầm bóp Physalis angulata

  1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC NGUYỄN THỊ MAI BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN NƯỚC CÂY TẦM BÓP PHYSALIS ANGULATA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ HÀ NỘI – 2017
  2. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC NGUYỄN THỊ MAI BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN NƯỚC CÂY TẦM BÓP PHYSALIS ANGULATA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN VĂN BẰNG HÀ NỘI – 2017
  3. LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn chân thành, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo PGS.TS NGUYỄN VĂN BẰNG đã định hướng và hướng dẫn em tận tình trong suốt thời gian em làm đề tài khóa luận tốt nghiệp. Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo và các anh, chị cán bộ Viện Hóa Sinh biển đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện cho em được sử dụng các thiết bị tiên tiến của viện để nghiên cứu và hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp của mình. Em xin chân thành cảm ơn TS. Hoàng Lê Tuấn Anh - Viện Hóa Sinh biển - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam người đã tận tình, hướng dẫn và giúp em hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa học - Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện và giúp đỡ, dạy dỗ em trong quá trình học tập tại trường. Xin cảm ơn gia đình và tất cả các bạn bè đã động viên, khích lệ giúp đỡ trong quá trình học tập và làm khóa luận. Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp này mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót. Vì vậy em kính mong nhận được ý kiến đóng góp chỉ bảo của các quý thầy, cô. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 03 năm 2017 Sinh viên NGUYỄN THỊ MAI
  4. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận: “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn nước cây Tầm bóp Physalis Angulata” Dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Văn Bằng là hoàn toàn trung thực và không trùng với kết quả của tác giả khác. Sinh viên Nguyễn Thị Mai
  5. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Chú giải 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13 Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two- Dimensional NMR CC Sắc ký cột Column Chromatography DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer EI-MS Phổ khối lượng va chạm electron Electron Impact Mass Spectroscopy HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy Me Nhóm metyl MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography
  6. DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ Trang Hình 1.1: Cây Tầm bóp 3 Hình 1.2: Hoa và quả cây Tầm bóp 3 Hình 1.3: Quả Tầm bóp xanh 3 Hình 1.4: Quả Tầm bóp khi chín 3 Sơ đồ 1: Sơ đồ phân lập cây Tầm bóp 30 Hình 4.1.1 Cấu trúc của hợp chất Icariside E5 (VPA1A) 32 Hình 4.1.2 Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 33 Hình 4.1.3 Phổ 13C-NMR của hợp chất 1 34 Hình 4.1.4 Phổ HMBC của hợp chất 1 35 Hình 4.1.5 Phổ HSQC của hợp chất 1 36 Hình 4.1.6: Một số tư ơng tác HMBC của hợp chất 1 36 Hình 4.2.1 Cấu trúc của hợp chất Methyl salicylate 2-0-triglycoside (VPA7) 38 Hình 4.2.2: Phổ 1H-NMR hợp chất 2 39 Hình 4.2.3: Phổ 13C-NMR hợp chất 2 40 Hình 4.2.4: Phổ HMBC hợp chất 2 41 Hình 4.2.6 Một số tương tác HMBC chính của hợp chất 2 43
  7. Bảng 4.1: Số liệu phổ NMR của chất 1 và chất tham khảo 37 Bảng 4.2: Số liệu phổ NMR của chất 2 và chất tham khảo 44
  8. MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về cây Tầm bóp 3 1.1.1. Giới thiệu về cây Tầm bóp 3 1.1.2. Phân bố, sinh thái 4 1.1.3. Công dụng 5 1.1.4 Thành phần hóa học 5 a) Các hợp chất steroid 5 b) Các hợp chất flavonoid 11 c) Các hợp chất khác 12 1.1.5. Hoạt tính sinh học 13 1.2. Các phương pháp chiết mẫu thực vật 15 1.2.1. Chọn dung môi chiết 15
  9. 1.2.2. Quá trình chiết 16 1.3. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ 17 1.3.1. Đặc điểm chung 17 1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký 18 1.3.3. Phân loại các phương pháp sắc ký 18 1.3.3.1. Sắc ký cột (C.C) 21 1.3.3.2. Sắc ký lớp mỏng 22 1.4. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ23 1.4.1. Phổ hồng ngoại (IR) 23 1.4.2. Phổ khối lượng (MS) 24 1.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR) 24 1.4.3.1. Phổ 1H-NMR 24 1.4.3.2. Phổ 13C-NMR 24 1.4.3.3. Phổ DEPT 25 1.4.3.4. Phổ 2D-NMR 25 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Đối tượng nghiên cứu 26 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất 26 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) 26
  10. 2.2.2. Sắc ký cột (CC) 26 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 26 2.4. Dụng cụ và thiết bị 26 2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết 27 2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất . 27 2.5. Hoá chất 27 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 28 3.1. Thu và xử lí mẫu 28 3.2. Tính chất vật lí của các hợp chất phân lập được 31 3.2.1. Hợp chất 1: Icariside E5 31 3.2.1. Hợp chất 2 :Methyl salicylate 2-0-triglycoside 31 CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 32 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 32 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 38 KẾT LUẬN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
  11. MỞ ĐẦU Việt Nam là một nước nhiệt đới với địa hình là ba phần tư là đồi núi, lại giáp biển đông nên có nguồn sinh thái đa dạng và phong phú. Thế giới sinh vật phát triển đa dạng về thành phần loài, phong phú về số lượng loài. Số loài thực vật bậc cao ở nước ta có khoảng 12000 loài, trong đó đã biết gần 4000 loài là cây thuốc mọc tự nhiên được nhân dân dùng làm thảo dược. Các loại thảo dược dùng làm thuốc đều có sẵn trong tự nhiên, nhất là khi Việt Nam lại là quốc gia nhiệt đới nên các loại thảo dược này rất phong phú.Hiện nay có nhiều phương pháp thử hoạt tính sinh học hiện đại ,đạt kết quả cao,con người đã nghiên cức các mẫu dịch chiết thực vật, nghiên cứu các chất tách ra từ các dịch chiết.Do vậy mà đã tìm ra nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học có hiệu quả trong việc chữa trị các căn bệnh nan y. Vì vậy, việc nghiên cứu các thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao . Cây Tầm bóp (Physalis angulata) hiện đang thu hút các nhà nghiên cứu vì trong cây chứa hàm lượng lớn các chất hóa học có hoạt tính ngăn ngừa ức chế mầm tế bào ung thư [18]. Cây thường phân bố ở những vùng nhiệt đới, liên nhiệt đới như vùng Nam Mỹ, Ấn Độ , Trung quốc .Ở Việt Nam, cây Tầm bóp mọc hoang dại trên khắp mọi vùng miền đất nước tại những cánh đồng, bờ ruộng và ven đường. Theo dân gian, lá cây Tầm bóp dùng để trị cảm sốt, ho nhiều đờm, yết hầu sưng đau. Lá cây Tầm bóp tốt cho dạ dày, do đó ngoài việc dùng lá cây làm thuốc chữa bệnh người ta còn dùng thứ cây này như một vị rau ăn hàng ngày. 1
  12. Một số hợp chất trong cây Tầm bóp có hoạt tính chống sốt rét [16] ,điều hòa hệ miễn dịch [13], hoạt tính kháng khuẩn [23] ,hoạt tính ‘in vitro” chống lại các siêu vi khuẩn bại liệt sởi [19] ,ban hồng được nghiên cứu trong những năm 2000- 2004 và hoạt tính chống ung thư [18] Vì vậy, tôi chọn cây Tầm bóp làm đối tượng nghiên cứu, với mục đích nhằm góp phần tìm hiểu thêm về những thành phần hóa học của cây trong phân đoạn nước. Từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển ngành y dược trong công cuộc chữa bệnh cứu người và làm tăng thêm kho tàng tri thức về cây thuốc cổ truyền Việt Nam với đề tài khóa luận là: “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn nước cây Tầm bóp Physalis angulata” Nhiệm vụ của đề tài: 1. Thu mẫu lá cây Tầm bóp, xử lí mẫu và tạo dịch chiết. 2. Nghiên cứu phân lập các hợp chất hóa học trong phân đoạn nước từ cây Tầm bóp. 3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được. 2
  13. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây Tầm bóp 1.1.1. Giới thiệu về cây Tầm bóp Tên khoa học: Physalis angulata Tên tiếng việt: Cây Tầm bóp (Cây thù lù, cây đèn lồng, ) Chi: Thù lù (Physalis) Họ : Cà (Salanaceae) Bộ: Cà (Solanales) Lớp (Nhóm): Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida) Hình 1.1: Cây Tầm bóp Hình 1.2: Hoa và quả cây Tầm bóp Hình 1.3: Quả Tầm bóp xanh Hình 1.4: Quả Tầm bóp khi chín 3
  14. 1.1.2. Phân bố, sinh thái - Chi Thù Lù (Physalis) bao gồm nhiều loài thực vật có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới với khoảng 75- 90 loài. Hầu hết các loài trong chi này có nguồn gốc từ Mexico ở Nam Mỹ. Kể từ khi, người Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha chiếm Nam Mỹ làm thuộc địa, các loài cây thù Lù được phát tán khắp châu lục chúng thích nghi trở thành cây mọc hoang trên khắp thế giới. - Cây Tầm bóp (Physalis angulata) có nguồn gốc từ vùng đất nhiệt đới châu Mỹ sau này trở thành cây liên vùng nhiệt đới.Tầm bóp mọc hoang trên các bờ ruộng, bãi cỏ, đất hoang hay ven đường làng quê, ở khắp phía Nam châu Âu, Ấn Độ, Baluchistan, Afghanistan, nhiệt đới châu Phi, Singapore và các đảo ở Thái Bình Dương. Ngoài ra còn thấy ở ven rừng từ vùng thấp đến vùng có độ cao 1500m so với mặt nước biển. - Tầm bóp là cây thân thảo. + Thân: thân cao 50- 100cm, phân nhiều cành. Đường kính thân tròn từ 1- 2cm. + Lá: lá mọc so le, hình bầu dục, dài 30- 35mm, rộng 20- 40mm, cuống lá dài từ 15- 30mm. + Hoa: hoa mọc đơn độc ở nách lá, có cuống mảnh dài khoảng 1cm. Đài hình chuông, chia ra từ phía giữa thành 5 thùy, tràng hoa màu vàng tươi hay màu trắng nhạt. Quả mọng, tròn, nhẵn, lúc non màu xanh, khi chín màu đỏ hoặc vàng, có đài lớn cùng với quả dài 3- 4cm, rộng 2cm bao trùm lên ở ngoài như cái túi. Ruột quả có nhiều không gian rỗng, khi bóp vỡ phát ra tiếng “bộp” . + Hạt: quả chứa nhiều hạt nhỏ hình thận. 4
  15. 1.1.3. Công dụng - Toàn cây có vị đắng, tính mát, không độc, thường dùng trị cảm sốt, ho nhiều đờm, yết hầu sưng đau. Dùng ngoài da trị nhọt vú, đau bìu đái, đinh độc.Quả Tầm bóp chữa đờm nhiệt sinh ho, chữa chứng đái đường.Ở Ấn Độ, dịch lá được dùng trị bệnh táo bón và đau dạ dày, cây dùng làm thuốc lợi tiểu.Rễ được dùng như loại thuốc giun giải nhiệt và điều trị bệnh tiểu đường. 1.1.4 Thành phần hóa học - Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Tầm bóp. Nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy cây Tầm bóp này chứa các chất thuộc nhóm alkaloid, steroid thực vật, Flavonoid và một số đó chưa được tìm thấy trong khoa học. a) Các hợp chất steroid - Năm 1970, Matsuura T và cộng sự đã xác định được cấu trúc hóa học của physalin A và physalin B [17] H O HO O O H O O HO H O O 9 OH O H OH O O O O O O OH O OH H physalin A physalin B 5
  16. - Năm 1978, L.Ramachandra Row thông báo đã tách được năm hợp chất 3 physalin E , F , G, H , I. Và cấu trúc hóa học của physalin F và physalin J được xác định. [12] H O O O O HO O O O OH O CH3 OH O O O O O H3C H3C O O O OH O physalin E physalin F H O O O H O H O O O O OH O O O O O O H OH H O O R1 R2 R1= -Cl R2= -OH OH physalin G physalin H 6
  17. H H O O O O O O O H O H O HO H O O O OH H HO O O O H R H O R=-MeO physalin I physalin J - Năm 1990 , Jin- kai Juang và cộng sự của ông đã tìm ra một withanolide mới là withangulin A , được phân lập từ cây Tầm bóp [11] - Đến năm 1991, Kazushi Singu và cộng sự cũng tìm thấy physagulin C, được phân lập từ thân và lá cây Tầm bóp [25] O O H O H O OH O HO O O H O O O H H OH H O H O O H OH withangulatin A physagulin C - Năm 1991, Shingu và cộng sự của ông thông báo đã tìm được hợp chất mới là physagulin C. Năm 1992 ông và cộng sự tìm được thêm physagulin A ,B , D từ lá tươi và thân cây Tầm bóp [20] 7
  18. O O O O O O OAc OH OH Cl OH O physagulin A physagulin B OH O O O O O O O OAc OH OH OO OH OH O OH OH physagulin C physagulin D - Ngoài ra trong cây còn chứa :withphysalin A,B,C; Withangulatin A,B; 8
  19. H O O H O O O O HO O H H O O H H OH O Withphysalin A Withaphysalin B OH H O O O O OH O HO O O O O H O OAc OH H O OH OH H OH O O OH OH Withaphysalin C Withangulatin A Withangulatin B - Người ta còn tìm thấy các hợp chất Withaphysalis P,Q,R,S có trong cây Tầm bóp nhỏ. O O O O O O O OMe H O HO O H H H O H H Withaphysalin Q Withaphysalin P O 9
  20. O O O OMe H O H Withaphysalin R: R1=R2=H Withaphysalin S: R1=H, R2=OH R2 H H R1O OH - Từ lá, rễ, thân cây được báo cáo là có chứa stigmasterol, sitosteol, physangulidine. OH HO O O O O O OH Physangulidine A H H H H H H H H HO HO Β-sitosterol Stimasterol 10
  21. - Trong khi đó ở hoa và quả thì chứa withanone, withanolide A O O O O O OH O OH O OH O WithnolideA Withanone - Vào năm 2014, tại Viện Hóa học, Đại học Tự trị Quốc gia Mexico,Emma Maldonado và cộng sự đã phát hiện được một withanolide mới – physangulide B , được phân lập từ đài hoa Tầm bóp. Cấu trúc của hợp chất này phân tích trên dữ liệu quang phổ, chỉ ra sự hiện diện của nhóm 20,24-epoxy [12] OH O O O H H O H H H O OH Physangulide B b) Các hợp chất flavonoid - Năm 1976, Lopez và cộng sự thông báo đã phân lập được ayanin một o- 11
  22. methylated flavonol từ cây Tầm bóp [25] OCH3 O OH H3CO ayanin OCH3 OH O - Năm 2001, Ismail N và cộng sự đã tìm ra hợp chất myricetin 3-O- neohesperidoside, được phân lập từ dịch chiết MeOH, cho thấy hoạt tính gây độc tế bào sắc in vitro chống lại chuột dòng tế bào bệnh bạch cầu P- 388 [10] HO HO OH HO O O O HO O O O HO OH HO OH HO myricetin 3-O-neohesperidoside OH c) Các hợp chất khác - Năm 1992, Basey K cùng cộng sự thông báo tìm được một alkaloid mới là phygrine [7] O O N N CH3 CH3 Phygrine Ngoài ra có nhiều chất hóa học đã được tìm thấy trong cây như axit chlorogenic, cholin, ixocarpanolit, myriceti ,vamonolit 12
  23. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về hóa học cũng như hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Thù Lù (Physalis), cũng như loài Physalis angulata còn khá ít. Nghiên cứu vẫn còn nhiều hạn chế, mới chỉ mang tính chất thăm dò, chưa đưa ra phương hướng ứng dụng thực tế. 1.1.5. Hoạt tính sinh học - Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất hóa học được phân lập từ cây Tầm bóp đặc biệt nghiên cứu hoạt tính của các dòng physalis, withanolide. - Cây Tầm bóp đã được nghiên cứu lâm sàng gần đây (vẫn đang được tiến hành), dựa trên những nghiên cứu ban đầu cho thấy nó là một chất kích thích miễn dịch hiệu quả, rất độc đối với nhiều loại ung thư và tế bào ung thư bạch cầu và nó có tính chất chống vi trùng. Các steroid mới tìm thấy trong cây Tầm bóp đã nhận được nhiều sự chú ý, và nhiều tác động chống ung thư và chống lại bạch cầu được cho là do các steroid. - Các chất chiết xuất khác nhau của cây Tầm bóp, cũng như các steroid thực vật chiết xuất được gọi là physalin , đã cho thấy hoạt tính in-vitro và in - vivo mạnh mẽ với nhiều loại tế bào ung thư người và động vật, bao gồm phổi, ruột kết, mũi họng, gan, cổ tử cung, u ác tính và glioma (Não) tế bào ung thư. Nghiên cứu về ung thư này bắt đầu vào đầu những năm 1980 với các nhà nghiên cứu ở Thái Lan và Hoa Kỳ và đã được kiểm chứng bằng các nghiên cứu được thực hiện tại Đại học Đài Loan năm 1992 - Physalin F và Physalin D( trích từ nguyên cây Tầm bóp bằng etanol) có hoạt tính diệt tế bào trên 8 dòng tế bào ung thư trong đó có 5 dòng loại ung thư ở người và 3 dòng ung thư ở động vật. (Nguồn: Anticancer Research Số 12_1992). 13
  24. - Sau đó, vào năm 2001, các nhà nghiên cứu tại Đại học Houston đã phân lập được một hóa chất mới - myricetin 3-o-neohesperidosid trong Tầm bóp [10], cho thấy độc tính đáng kể đối với tế bào ung thư vòm họng, ung thư phổi (ung thư biểu mô tuyến) cũng như bệnh bạch cầu ở chuột. Các nhà nghiên cứu ở Nga và Trung quốc đã chứng minh một cách độc lập các hiệu quả điều hòa hệ miễn dịch chống lại sự phát sinh của bệnh ung thu, đồng thời tăng cường khả năng miễn dịch khác , nó có thể gây ra các phản ứng chống lại bệnh bạch cầu ở những con chuột. - Meira và cộng sự cũng báo cáo rằng physalis B và F được phân lập từ cây Tầm bóp gây ức chế mạnh sự tăng sinh của cấu trúc nhỏ và khả năng lây nhiễm của Trypanosoma cruzi [19]. Silva và cộng sự báo cáo các chất chiết xuất nước của Physalis angulata có thể thúc đẩy sự khác biệt của các tế bào tủy xương, đặc biệt là Macrophages [22]. - Nghiên cứu tại Viện khảo cứu các hợp chất thiên nhiên thuộc ĐH Y Khoa Kaohsing (Taiwan) về hoạt tính chống ung thư gan của cây Tầm bóp ghi nhận: Các dịch chiết toàn cây bằng nước và bằng etanol được đánh giá về hoạt tính chống ung thư gan trên các dòng tế bào Hep G2, Hep 3B, PLC/PRF/5 ghi nhận hoạt tính chống ung thư do hiện tượng tế bào tự hủy phối hợp với những rối loạn chức năng của các mitochondria nơi màng tế bào bị ung thư.(Nguồn Life Sciences số 74,2-2004). - Physangulidine được cô lập từ Physalis angulate có thể làm xáo trộn chu kì tế bào và gây chết tế bào trong DU145 do apoptosis, ung thư tuyến tiền liệt ở người [24] 14
  25. - Matheus S.v à cộng sự của ông đã nghiên cứu về hoạt tính chống sốt rét của physalin B, D, F, G được tách từ cây Tầm bóp cho thấy sự ức chế sự sinh trưởng của kí sinh trùng [16] Một số nghiên cứu khác chứng minh được hoạt tính invitro của dịch chiết cây Tầm bóp trên 1 số vi khuẩn chống lại các siêu vi khuẩn bại liệt, sởi, bạch cầu. 1.2. Các phương pháp chiết mẫu thực vật Tuỳ thuộc vào chất có trong mẫu thực vật khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình ) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau. 1.2.1. Chọn dung môi chiết Các chất chuyển hóa thứ cấp liên tục, trong quá trình chiết nên mỗi phân đoạn sẽ có độ phân cực khác nhau. Do đó dung môi dùng trong mỗi phân đoạn chiết phải được lựa chọn cẩn thận. Điều kiện của dung môi: Phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc. Các tạp chất ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả trong quá trình chiết, do đó các dung môi được sử dụng phải sạch. Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của 15
  26. chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ. Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol. 1.2.2. Quá trình chiết Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau: - Chiết ngâm. - Chiết sắc với dung môi nước. - Chiết lôi cuốn theo hơi nước. - Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet. Trong đó, chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau. Ví dụ: 16
  27. - Các flavonoid thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết. - Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết. Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao. Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết. 1.3. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ Sắc ký là một trong những phương pháp quan trọng,phổ biến hữu hiêu nhất hiện nay. Sắc ký được áp dụng rất rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau như định tính, định lượng, điều chế các chất tinh khiết, xác định các hằng số hóa lí, nghiên cứu các quá trình động học và xúc tác. Phương pháp sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng trong việc phân lập các hợp chất hữu nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng. 1.3.1. Đặc điểm chung Sắc ký là phương pháp tách liên tục các chất từ hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng, giữa pha cố định và pha di động khi cho pha di động di chuyển qua pha cố định. Khi tiếp xúc với pha cố định, các phần tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan ) tương ứng với pha động và pha tĩnh. 17
  28. 1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký Định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần), xét trong điều kiện nhiệt độ không đổi. n b C n 1. bC Trong đó b: Hằng số. C: Nồng độ của chất bị hấp phụ. n: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đại cân bằng n∞: Lượng chất cực đại có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó 1.3.3. Phân loại các phương pháp sắc ký Trong các phương pháp sắc ký: pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. • Theo bản chất của hai pha sử dụng: - Pha tĩnh: Có thể là chất rắn hoặc chất lỏng. + Pha tĩnh là chất rắn: Thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý, nó có thể nạp vào trong một cột. + Pha tĩnh là chất lỏng: Có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất mang. - Pha động: Có thể là chất lỏng hoặc chất khí. 18
  29. + Pha động là chất lỏng: Ví dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột. + Pha động là chất khí: Ví dụ trong kĩ thuật sắc ký khí. Trong trường hợp này chất khí được gọi là khi mang hay khí vectơ. • Theo bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá trình phân tách chất. - Sắc ký phân chia (partition chromatography). + Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí). + Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lỏng này được nổi hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn. - Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography). + Pha động là chất lỏng hoặc chất khí, + Pha tĩnh là chất rắn: Đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ,được nối trong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử dụng là những hạt silica gel hoặc alumin. - Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography) + Pha động chỉ có thể là chất lỏng. + Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học là polymer nên gọi là hạt nhựa. Bề mặt của các hạt mang các nhóm chức hóa học ở dạng ion. Có hai loại nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation. - Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography), gel filtration chromatography + Pha động chỉ có thể là chất lỏng. + Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên bề mặt có nhiều lỗ rỗng. 19
  30. - Sắc ký ái lực (arrinicy chromatography) + Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein. + Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị. Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở. - Sắc ký lỏng cao áp: Kĩ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên để có được một tốc độ chảy thích hợp, phải có một áp lực tác động lên cột. Phân loại sắc ký theo cấu hình (chromatography configuration). - Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng. Trong sắc ký giấy: + Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos. + Pha động: chất lỏng. Trong sắc ký lớp mỏng: + Chất hấp phụ thông dụng trong sắc ký lớp mỏng là silica gel, là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực. + Pha động: Luôn luôn là chất lỏng. - Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography) + Là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa. 20
  31. + Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ. Mẫu cần tách được đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh. • Theo trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn: Sắc ký lỏng và sắc ký khí. • Theo cách tiến hành sắc ký, người ta chia sắc ký thành các nhóm nhỏ: Sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng. 1.3.3.1. Sắc ký cột (C.C) Sắc ký cột là phương pháp sắc ký phổ biến, đơn giản nhất. Chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chúng được nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Kích thước của chất càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên, hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được) có thể xảy ra nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ, tốc độ chảy càng giảm. Khi đó, người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC). Trong sắc ký cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều dài cột (L) thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, Rf được gọi là tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. 21
  32. Tùy theo yêu cầu tách mà ta có tỉ lệ chất so với chất hấp phụ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 - 1/10), tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tùy vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 - 1/30. Trong sắc ký cột tùy vào lượng chất và dạng chất sẽ có các phương pháp khác nhau để có thể đưa chất lên cột. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu. Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột: + Cách 1: Nhồi cột khô. Chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phi sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt. + Cách 2: Nhồi cột ướt. Chất hấp phụ được hòa tan vào trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết. 1.3.3.2. Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng (SKLM) được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thủy tinh, thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử sụng SKLM điều chế (bản được tráng sẵn silica gel dày hơn) ,có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký người ta có thể cạo 22
  33. riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4. 1.4. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ Cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa hóa học, các phương pháp sắc ký so sánh, . 1.4.1. Phổ hồng ngoại (IR) Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại hoặc tia khuyếch tán Raman. Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Vì vậy có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất dựa vào phổ hồng ngoại, ví dụ như dao động hóa trị của nhóm -OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300 - 3450 cm-1, của nhóm C=C trong vùng 1630 – 1650 cm-1, của nhóm ete C-O-C trong vùng 1020 - 1100 cm-1, Đặc biệt vùng dưới 700 cm-1 được gọi là vùng vân tay, được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp. Hiện nay, đối với các hợp chất thiên nhiên (lượng chất thu được ít) thì phổ hồng ngoại được đo sau khi hoàn chỉnh các phép đo khác bởi vì thông tin chung 23
  34. thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều mà lượng chất cần để thực hiện phép đo này lại cần đến 2 - 3 mg chất và khó thu hồi lại. 1.4.2. Phổ khối lượng (MS) Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hóa học của các hợp chất vì phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau: 1.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều. 1.4.3.1. Phổ 1H-NMR Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Người ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học và tương tác spin- spin. 1.4.3.2. Phổ 13C-NMR Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230ppm. 24
  35. 1.4.3.3. Phổ DEPT Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3 nằm 0 0 về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135 . Trên phổ DEPT 90 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH. 1.4.3.4. Phổ 2D-NMR Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau: Phổ HSQC: Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ. Phổ HMBC: Đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc. 25
  36. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Toàn bộ mẫu cây Tầm bóp (Physalis angulata) được thu tại tỉnh Thái Bình vào tháng 8 năm 2015 và được giám định bởi TS. Trần Thị Phương Anh, Bảo Tàng Thiên Nhiên Việt Nam. Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại viện Hóa Sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 và RP18 F254 (Merck-Đức). Các vết chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao cho đến khi hiện màu. 2.2.2. Sắc ký cột (CC) Được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo OSD hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd). 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.4. Dụng cụ và thiết bị 26
  37. 2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm: bình chiết 30 lít, phễu chiết 2 lít, máy cô quay chân không, đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 368 nm, tủ sấy chân không, máy sấy, micropipet, bình sắc ký loại phân tích và điều chế, cột sắc ký pha thường và pha ngược. 2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectrometer. 2.5. Hoá chất + Silica gel pha thường 60 (0,04 - 0,063 mm) Merck. + Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC RP18 (150 m, FuJisilisa Chemical Ltd). + Bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715). + Bản mỏng tráng sẵn silica gel pha đảo RP18 F254s (Merck). + Bản mỏng điều chế silica gel pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck). + Các loại dung môi hữu cơ như metanol, etanol, etyl axetate, clorofom,n- hexan, axetone. 27
  38. CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Thu và xử lí mẫu 4,5 kg mẫu khô cây Tầm bóp, được cắt nhỏ, phơi khô, xay thành bột mịn rồi được ngâm chiết với metanol vớ sự hỗ trợ của thiết bị chiết siêu âm (mỗi lần 60 phút ở 40-50 oC, 3-5 lần). Lớp dung môi metanol được lọc qua giấy lọc rồi tiến hành cất loại dung môi metanol bằng thiết bị cất quay chân không áp suất giảm thu được 200 g cặn chiết metanol. 200 g cặn chiết metanol mẫu Tầm bóp thu được ở trên được phân bố đều vào 2 phễu chiết có chứa 1L nước cất. Sau đó, bổ sung vào mỗi phễu chiết 1L diclometan, lắc đều rồi để phân lớp qua đêm (3 lần). Lớp diclometan (dưới) được lọc qua giấy lọc rồi cất loại diclometan bằng thiết bị cất quay chân không áp suất giảm thu được 80,0 g cặn diclometan. Lớp nước (trên) được loại bỏ dung môi còn sót lại và nước thu được 30,0 g cặn nước. Cặn nước được đưa qua cột Diaion HP-20, rửa bằng nước cất để loại muối vô cơ rồi tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi có độ phân cực giảm dần MeOH/H2O (tăng dần nồng độ metanol trong nước, 25% - 50% - 75% -100% metanol) thu được 4 phân đoạn W1 – W4. Phân đoạn W2 (3,8g) tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký sử dụng silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2/MeOH/H2O (3/1/0,1,v/v/v thể tích 4,0lit) thu được 2 phân đoạn là W2A và W2B. Phân đoạn W2A được tinh chế trên cột sắc ký pha đảo C-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH/H2O(2/1,v/v thể tích 1,5lit), rồi tiếp tục đưa qua cột 28
  39. Shephadex LH20 với hệ dung môi rửa giải MeOH/H2O (3/1,v/v thể tích 1,2lit) thu được hợp chất WPA1A (12mg) – Hợp chất 1 Phân đoạn W2B được tinh chế trên cột sắc ký pha đảo C-18 với hệ dung môi rửa giải axeton/nước (1/1, v/v thể tích 2,3lit) thu được 2 phân đoạn W2B1 và W2B2. Tiếp tục tinh chế phân đoạn W2B2 trên cột sắc ký sử dụng silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải ethyl axetat/metanol/nước (15/1/0,05 về thể tích 1,5lit) thu được hợp chất VPA7 (9mg) – Hợp chất 2 29
  40. Physalin angulata (4,5 kg) M: Methanol D: Điclometan Chiết với methanol EtOAc: Ethylaxetat W: Nư ớ c ( 3 lần x 3l) Cặn Methanol (200g) A: Axeton Bổ sung nước và chiết phân lớp với CH2Cl2 (3 lần) Điclometan (80g) Cặn nước (30g) Diaion HP20 M:W (25,50,75,100% M) W1 W2 (3,8g) W3 W4 Silicagel pha thường D:M:W (3/1/0,1) W2A W2B Silica gel pha đảo C-18 Silica gel pha đảo C-18 M:W (2/1) và A:W (1/1) Cột Shephadex LH20 M:W (3/1) W2B1 W2B2 VPA1A (12mg) Silica gel pha thường (Hợp chất 1) EtOAc/M/W (15/1/0,05) WPA7 (9mg) (Hợp chất 2) Sơ đồ 1: Sơ đồ phân lập cây Tầm bóp 30
  41. Như vậy, có 2 hợp chất được phân lập từ phần cặn chiết nước của cây Tầm bóp. 3.2. Tính chất vật lí của các hợp chất phân lập được 3.2.1. Hợp chất 1: Icariside E5 Chất bột trắng vô định hình, có công thức phân tử là C26H34O11 ( M = 522,21). 1 13 H-NMR (500MHz, CD3OD); C-NMR (125Hz, CD3OD) (Bảng 4.1) 3.2.1. Hợp chất 2 :Methyl salicylate 2-0-triglycoside Chất bột vô định hình,có công thức phân tử là C25H36O17 ( M=608,55). 1 13 H-NMR (500MHz, CD3OD); C-NMR (125Hz, CD3OD) (Bảng 4.2) 31
  42. CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 Hình 4.1.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất Icariside E5 (VPA1A) Hợp chất 1 nhận được là chất bột vô định hình,trên phổ 1H-NMR của hợp chất này cho thấy hai proton nối đôi (cấu hình trans) tại δH 6,58 (1H, d, J = 16,0 Hz) và 6,33 (1H, dt, J = 5,5.16Hz); ba proton ở vòng thơm thế 3 vị trí 1,3,4 tại δH 6,6 (1H,d , J= 1,5Hz).6,57 (1H, br s) và 6,50 (1H, dd, J = 1,5 và 8,0 Hz); hai proton singlet tại δH 6,95 (1H, br s) và 6,94 (1H, br s); hai proton methoxy tại δH 3,85 (3H, s) và 3,71 (3H, s). Bên cạnh đó còn quan sát thấy tín hiệu của một proton anomeric tại δH 4,7 (1H, d, J = 7,0 Hz) gợi ý sự có mặt của 1 đơn vị đường . 32
  43. Hình 4.1.2 Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 Trên phổ 13C-NMR và quang phổ 2D- HSQC cho thấy tín hiệu 26 cacbon, bao gồm hai cacbon olefin có liên kết đôi δC 131,5 và 129,7; 6 cacbon của đường β- D-glucose tại δC 105,4. 76,0. 77,9. 71,3. 78,1, and 62,5; hai cacbon methoxy tại δC 56,4 và 56,3; và 12 cacbon của 2 vòng thơm trong đó 7 cacbon không liên kết với hydro và 5 cacbon metin (CH). 33
  44. Hình 4.1.3 Phổ 13C-NMR của hợp chất 1 Tương tác từ H-2 (δH 6,57) và H-5 (δH 6,60) đến C-1 (δC 133,2)/ C-3 (δC 148,4)/ C-4 (δC 145,4); từ H-6 (δH 5,50) đến C-4 (δC 145,4)/ C-7 (δC 39,2); và từ proton methoxy (δH 3,71) đến C-3 (δC 148,4) khẳng định vị trí của cacbon methoxy tại C-3. Các tương tác giữa H-9 (δH 4,25) đến C-7 (δC 131,5) / C-8 (δC 129,7); H-7 (δH 6,58) đến C-2 (δC 109,1) / C-6 (δC 119,2); H-2 (δH 6,95) / H-6 (δH 6,94) / H-1 (δH 4,70, Glc) đến C-4 (δC 145,0); và proton giữa methoxy (δH 3,85) đến 34
  45. C-3 (δC 153,5) khẳng định vị trí của liên kết đôi tại C-7 , vị trí đường glucose tại C-4 , và nhóm methoxy tại C-3 , tương ứng. Hình 4.1.4 Phổ HMBC của hợp chất 1 35
  46. Hình 4.1.5 Phổ HSQC của hợp chất 1 Kết quả so sánh dữ liệu phổ của hợp chất 1 thấy hoàn toàn phù hợp tại các vị trí tương ứng của chất Icariside E5 [15]. Từ đó chất này được xác định là Icariside E5 (VPA1A) có CTPT: C26H34O11 với số khối tương ứng M = 522,21. Hình 4.1.6: Một số tương tác HMBC của hợp chất 1 36
  47. Bảng 4.1: Số liệu phổ NMR của chất 1 và chất tham khảo a a,b a,c No. δC δC δH (mult., J in Hz) HMBC 1 133.2 133.2 - 2 116.0 115.7 6.57 (br s) 1, 3, 4 3 148.3 148.4 - 4 145.3 145.4 - 5 114.1 113.8 6.60 (d, 1.5) 1, 3, 4, 6 6 122.8 122.6 6.50 (dd, 1.5, 8.0) 5 7 39.1 2.74 (dd, 9.5, 14.0) 1, 6, 8, 9, 5' 39.2 2.99 (dd, 6.0, 14.0) 8 43.0 42.8 3.98 (m) 9 66.5 3.70 (m) 66.8 3.80 (d, 11.0) 1' 135.4 135.4 - 2' 108.7 109.1 6.95 (br s) 3', 4', 6', 7' 3' 153.4 153.5 - 4' 145.0 145.0 - 5' 139.0 139.0 - 6' 118.7 119.2 6.94 (br s) 2', 4', 7', 8 7' 131.5 131.5 6.58 (d, 13.5) 8' 129.6 129.7 6.33 (dt, 5.5, 16.0) 1' 9' 63.5 63.7 4.25 (dd, 1.0, 6.0) 7', 8' 3-OMe 56.0 56.3 3.71 (s) 3 3'-OMe 55.9 56.4 3.85 (s) 3' 4′-O-Glucosyl 1'' 106.0 105.4 4.70 (d, 7.0) 4' 2'' 75.7 76.0 3.48 (t, 9.0) 3'' 77.5 77.9 3.43 (t, 8.0) 4'' 71.0 71.3 3.39 (t, 8.5) 5'' 77.8 78.1 3.13 (m) 6'' 62.3 62.5 3.68 (m),3.79 (d, 12.0) a b c đo trong CD3OD; 125 MHz; 500 MHz; 37
  48. 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 5 4 6 3 1 2 O 7 Xyl O 6 O O 4 5 O Glc 1 4 5 O HO 2 HO 1 3 OH HO 3 HO 2 O O 1 6 5 2 OH HO 4 3 Glc HO HO Hình 4.2.1 Cấu trúc của hợp chất Methyl salicylate 2-0-triglycoside (VPA7) Hợp chất 2 nhận được là chất bột trắng vô định hình. Trên phổ 1H-NMR cho thấy sự hiện diện của bốn proton của một vòng benzen thế 1,2 tại δH 7,79 (1H,d, J = 7,5Hz); 7,46 (1H, t, J =7,5 Hz); 7,33 (1H, d, J = 8,5Hz); 7,09 (1H, t, J = 7,5); và một tín hiệu proton methoxy tại δH 3,89 (3H, s). Bên cạnh đó, ba proton anomeric được quan sát thấy ở δH 5,34 (1H, d, J=7,0 Hz); 4,86 (1H, chồng lấp) và 4,31 (1H, d, J = 7,0 Hz) cho thấy sự có mặt của trisaccharide. 38
  49. Hình 4.2.2: Phổ 1H-NMR hợp chất 2 Trên phổ 13C-NMR và HSQC cho tổng số 25 tín hiệu cacbon, trong đó có 1 cacbon cacbonyl tại δC 167,9; sáu cacbon thơm tại δC 157,6(C) ; 135,2 (CH); 132,4 (CH); 122,6 (CH); 121,2 (C); 116,5 (CH); một cacbon methoxy tại δC 52,6. Tín hiệu cacbon anomeric tại δC 105,3 và cacbon oxymethylene tại δC 66,8 cho biết sự hiện diện của một xylopyranose. Ngoài ra, hai tín hiệu cacbon anomeric đã được quan sát ở δC 99,6 và 104,3 cùng với 1 cacbon oximethine tại δC 82,9; và hai cacbon oxymethylene tại δC 69,9 và 61,4 cho biết sự hiện diện của 39
  50. 2-O-β- D- glucopyranosyl –(1→2) –[O- β-D-xylopyranosyl-(1→6)]-O- β-D- glucopyranoside. Hình 4.2.3: Phổ 13C-NMR hợp chất 2 Phân tích các tương tác đã nhận được trên phổ 2 chiều HSQC và HMBC cho phép gán chính xác các giá trị phổ NMR. Các tín hiệu proton được gán với các tín hiệu cacbon tương ứng dựa vào kết quả phân tích phổ HSQC (Bảng 4.2) .Trên phổ HMBC, tương tác giữa proton anomeric H-1′ (δH 5,34. Glc1) và C-1 (δC 157,5); H-1′′(δH 4,86 Glc2) và C-2′′ (δC 82,9); H-1ʹ (δH 4,31, Xyl) and C-6 (δC 69,6) đã chứng minh cho 2-O-β-D-glucopyranosyl-(1 2)-[O-β-D- 40
  51. xylopyranosyl-(1 6)]-O-β-D-glucopyrano-side và vị trí cacbon methoxy tại C-7 đã được xác nhận nhờ tương quan giữa proton methoxy (δH 3,89) và C-7 (δC 167,9). Hình 4.2.4: Phổ HMBC hợp chất 2 41
  52. Hình 4.2.5: Phổ HSQC hợp chất 2 Kết quả so sánh dữ liệu phổ của hợp chất 2 thấy hoàn toàn phù hợp tại các vị trí tương ứng của hợp chất Methyl salicylate 2-O-triglycoside [14]. Từ đó, hợp chất 2 được xác định là Methyl salicylate 2-O-triglycoside có CTPT: C25H36O17 (M =608,55) 42
  53. Hình 4.2.6 Một số tương tác HMBC chính của hợp chất 2 43
  54. Bảng 4.2: Số liệu phổ NMR của chất 2 và chất tham khảo d a,b a,c No. δC δC δH (mult., J in Hz) 1 121.0 121.2 - 2 157.4 157.5 - 3 116.4 116.5 7.33 (d, 8.5) 4 134.1 135.2 7.46 (t, 7.5) 5 121.5 122.6 7.09 (t, 7.5) 6 131.6 132.4 7.79 (d, 7.5) 7 166.3 167.9 - 7-OMe 52.0 52.6 3.89 (s) 3-O-Glucosyl 1' 100.0 99.6 5.34 (d, 7.0) 2' 82.7 82.9 3.85 (m) 3' 77.8 77.4 3.72 (t, 8.5) 4' 71.1 70.86 3.48 (m) 5' 77.5 77.6 3.99 (t, 8.5) 3.78 (dd, 1.5, 11.5) 6' 69.5 69.6 4.11 (d, 11.5) 2′′-O-Glucosyl 1'' 105.7 104.3 4.86 overlapped 2'' 76.8 76.0 3.23 (m) 3'' 78.1 77.1 3.16 (m) 4'' 71.2 70.6 3.40 (m) 5'' 78.3 77.3 3.14 (m) 3.17 (m) 6'' 62.3 61.4 3.50 (m) 6′′-O-Xylosyl 1''' 105.9 105.3 4.31 (d, 7.0) 2''' 75.0 75.0 3.20 (m) 3''' 78.1 77.4 3.39 (m) 4''' 70.8 71.1 3.51 (m) 3.10 (t, 11.5) 5''' 67.1 66.8 3.83 (dd, 5.0, 11.5) a đo trong MeOD; b125 MHz; c500 MHz; d) pyridine 44
  55. KẾT LUẬN Trong quá trình hoàn thành khóa luận với đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn nước cây Tầm bóp ( Physalis angulata)” Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp, em đã phân lập được 2 hợp chất sau: 1. Hợp chất 1: Icariside E5 2. Hợp chất 2: Methyl salicylate 2-O-triglycoside Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 và 2 được xác định bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC) Hợp chất 1: Icariside E5, C26H34O11 , M= 522,21 45
  56. 5 4 6 3 1 2 O 7 Xyl O 6 O O 4 5 O Glc 1 4 5 O HO 2 HO 1 3 OH HO 3 HO 2 O O 1 6 5 2 OH HO 4 3 Glc HO HO Hợp chất 2: Methyl salicylate 2-0-triglycoside, C25H36O17 M= 608,55 46
  57. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Bộ môn Dược liệu, Bài giảng dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, 2004. [2].Nguyễn Tiến Bân, 2003. Danh mục các loài thực vật Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tập 2. [3]. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Toàn,Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tập I, trang 875-876 (2004). [4]. Võ Văn Chi, 1999. Từ điển cây thuốc Viêṭ Nam, NXB Y hoc̣ , Hà Nôị,471. [5]. Trần Văn Sung, Trịnh Thị Thủy, Nguyễn Hoàng Anh, Các hợp chất thiên nhiên từ một số cây cỏ Việt Nam, Bộ sách chuyên khảo tài nguyên thiên nhiên và Môi trường Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam, 2011. [6]. A. H. Janua ´rio, E. Rodrigues Filho, R. C. L. R. Pietro, S. Kashima, D. N. Sato and S. C. Franc (2002), “Antimycobacterial Physalins from Physalis angulata L. (Solanaceae)”, 16, 445-448 [7]. Basey K, B.A.Mc Gaw , J.G.Wooley , 1992 “Physalis alkekengi var. francheti and their Phygrine, an alkaloid from Physalis species. differentiation inducing activity”Phytochemistry, Phytochemistry, 31, 4173- 4176. 47
  58. [8]. Cheng-Peng Sun, Chong-Yue Qiu, Ting Yuan, Xiu-Fang Nie, Hong-Xin Sun, Qian Zhang, Hui-Xiang Li, Li-Qin Ding, Feng Zhao, Li-Xia Chen, and Feng Qiu (2016), “Antiproliferative and Anti-inflammatory Withanolides from Physalis angulate” , 79(6), 1586-1597 [9]. Emma Maldonado, Norma E. Hurtado , Ana L. Pérez-Castorena , Mahinda Martínez (2015), “Cytotoxic 20,24-epoxywithanolides from Physalis angulate" ,108, 72-74 [10]. Ismail N, Alam M (2001), “A novel cytotoxic flavonoid glycoside from Physalis angulate” at Fitoterapia, 72 (6), 676-679 [11]. Jin-Kai Juang et. Al, (1989) “ A new compound, withangulatin A promotestype II DNA topoisomera”, 159(3), 1128-1134 [12]. L.R. Row, N.S. Sarma, K.S. Reddy, T. Matsuura, R. Nakashima (1978), “The structure of Physalins F and J from Physalis angulata and P. lancifolia”Phytochemistry, 17, 1647-1650. [13]. Lorena A. Pinto, Cássio S. Meira, Cristiane F. Villarreal, Marcos A. Vannier-Santos, Claudia V.C. de Souza, Ivone M. Ribeiro, Therezinha C.B. Tomassini, Bernardo Galvao-Castro, Milena B.P. Soares, Maria F.R. Grassi (2016), “Physalin F, a seco-steroid from Physalis angulata. L, has immunosuppressive activity in peripheral blood mononuclear cells from patients with HTLV1-associated myelopathy” , 79, 129-134 [14]. Masateru Ono, Yuki Shiono, Takayuki Tanaka, Chikako Masuoka, Shin Yasuda, Tsuyoshi Ikeda, Masafumi Okawa, Junei Kinjo, Hitoshi Yoshimitsu, Toshihiro Nohara (2010), “Three new aromatic glycosides 48
  59. from the ripe fruit of cherry tomato”. J. Nat. Med, 64, 500–505 [15]. Maria Iorizzi, Virginia Lanzotti, Simona De Marino, Franco Zollo, Magdalena Blanco Molina, Antonio Macho and Eduardo Munoz (2001), “New Glycosides from Capsicum annuum L. Var.acuminatum. Isolation, Structure Determination, and Biological Activity” J. Agric. Food Chem, 49 , 2022−2029 [16] . Matheus S. Sa, Maria N. de Menezes, Antoniana U. Krettli, Ivone M. Ribeiro, Therezinha C. B. Tomassini, Ricardo Ribeiro dos Santos, Walter F de Azevedo and Milena B. P. Soares (2011), “Antimalarial Activity of Physalins B, D, F, and G”, 74, 2269-2272 [17]. Matsuura T, Kawai M, Nakashima R, Butsugan Y (1970), “Structures of physalin A and physalin B, 13,14-Seco-16,24-cyclo-steroids from Physalis alkekengi var. Francheti. J Chem Soc 1970, 5 , 664 – 70 [18]. Milena da Silva Lima, Afranio Ferreira Evangelista, Gisele Graca Leite dos Santos, ̧ Ivone Maria Ribeiro, Therezinha Coelho Barbosa Tomassini, Milena Botelho Pereira Soares, and Cristiane Flora Villarreal (2014), “Antinociceptive Properties of Physalins from Physalis angulate”, 77(11), 2397-2403 [19]. Meira. C.S, et al.(2015) “In vitro and in vivo antiparasitic activity of Physalis angulata L. concentrated ethanolic extract against Trypanosoma cruzi” 22(11) , 969-974 [20]. Kazushi Shingu, Shoji Yahara, Toshihiro Nohara, Hikaru okabe (1992), “Three New Withanolides, Physagulins A, B and D from Physalis angulata 49
  60. L”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 40 (8), 2088-2091 [21]. Soares M, Bellintani M, Ribeiro I, Tomassini T,Ribeiro R (2003) , “Inhibition of macrophage activation and lipopolysaccaride-induced death bye seco-steroids purified from Physalis angulata L” Eur J Pharmacol, 459,107 - 112 [24]. Ting Ma, Wen-Na Zhang, Lei Yang, Chao Zhang, Ru Lin, Si-Ming Shan, Meng-Di Zhu, Jian-Guang Luo and Ling-Yi Kong (2016) “Cytotoxic withanolides from Physalis angulata var.villosa and the apoptosis-inducing effect via ROS generation and the activation of MAPK in human osteosarcoma cells”, 6, 53089-53100 [25]. T.K.Lim (2013), Edible Medicinal and Non-Medicinal Plants,Springer Science and Business Media Dordrecht [26]. Zizhen Liu, Rui Jiang, Meng Xie, Guanling Xu, Weirui Liu, Xiaohong Wang, Hongying Lin, Jianqiu Lu, and Gaimei , She from Chem. Pharm. Bull. (2014) , 62(11), 1083–1091 50