Đề tài Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải photphat khó tan trên đất bazan nâu đỏ ở ĐakLak

Nội dung text: Đề tài Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải photphat khó tan trên đất bazan nâu đỏ ở ĐakLak

1. 1 M ĐU 1. Đt vn đ Tây Nguyên vùng cĩ tim năng di dào đ phát trin nơng lâm nghip, vi trên 2 triu ha đt bazan màu m, chim 60% din tích đt bazan ca c nưc. Tây Nguyên là khu vc thích hp cho phát trin cây cơng nghip hàng hố như cà phê, cao su, h tiêu và cây lương thc là ngơ. Theo s liu thng kê năm 2008, Tây Nguyên cĩ khong 470.000 ha cà phê, 144.000 ha cao su, 30.000 ha h tiêu và hàng trăm nghìn ha lúa, ngơ và các cây cơng nghip ngn ngày khác. Theo cơ cu kinh t năm 2009, nơng nghip vn là ngành ch đo trong phát trin kinh t Tây Nguyên, trong đĩ trng trt chim xp x 86% tng sn phm và gn 35% tng kinh t tồn vùng. Cĩ đưc nhng thành cơng trên là do cĩ s thay đi cơ cu cây trng, áp dng nhng thành tu khoa hc k thut vào quá trình sn xut, tăng cưng đu tư thâm canh Mt trong nhng bin pháp thâm canh đem li hiu qu cao là tăng cưng s dng các loi phân hố hc, vic đĩ đã làm tăng đáng k năng sut và cht lưng nơng sn. Nhưng mt trái ca vic s dng phân bĩn hố hc là làm cho đt ngày càng b thối hố, chua hố, chai cng, đng thi làm cho h vi sinh vt cĩ ích trong đt ngày càng gim đi mt cách nhanh chĩng. Photphat là mt trong nguyên t dinh dưng đa lưng quan trng, cn thit cho s sinh trưng và phát trin ca cây trng như tng hp ATP ngun năng lưng cho mi hot đng sng ca cơ th và cu to acid nucleic. [2] Trong t nhiên s chuyn hố photphat xy ra ch yu dưi tác dng ca quá trình hố hc và sinh hc [1]. Quá trình chuyn hố hp cht photphat khĩ tan trong đt cĩ phn đĩng gĩp quan trng ca các loi vi sinh vt.
2. 2 Nhĩm vi sinh vt phân gii photphat khĩ tan tn ti nhiu trong đt và cùng các loi vi sinh vt khác luơn gi cho h vi sinh vt trong đt đưc cân bng sinh thái và dch bnh xy ra nu s cân bng b phá v. Các vi sinh vt phân gii photphat khĩ tan trong đt hot đng như các nhà máy phân lân chuyn qung khĩ tan thành d tan đ cây trng hp th đưc, khơng cn axit mnh và nhit đ cao. Do vy bĩn vi sinh vt phân gii photphat khĩ tan vào đt s cung cp mt lưng photphat d tan cho cây trng, khơng làm chua đt và giúp cây hp th các cht dinh dưng trong đt tt hơn [14]. Mt s nghiên cu trên th gii đã ch ra mt s vi sinh vt cĩ kh năng th hin đưc nhiu các hot tính sinh hc khác nhau, trong đĩ cĩ nhng vi sinh vt va chuyn hố hp cht photphat va cĩ kh năng to các cht dinh dưng cho cây, sinh tng hp cht kích thích sinh trưng thc vt đng thi cũng cĩ kh năng c ch mt s vi sinh vt gây bnh vùng r cây trng [3,6]. Đk Lk vi hơn 310.000 ha là đt bazan nâu đ là loi đt cĩ hàm lưng lân tng s cao nhưng hàm lưng lân d tiêu thp do s di đng ca Fe, Al, hay hàm lưng Ca 2+ cao dn đn lân d b c đnh thành lân khĩ tiêu ( Ca 3(PO 4)2, AlPO 4, FePO 4 ) nên lưng lân d tiêu luơn mc nghèo[25]. Đt bazan nâu đ rt thích hp cho vic phát trin các cây cơng nghip dài ngày, nhưng trong nhiu năm qua nơng dân thưng ch dùng phân hố hc đ bĩn cho cây trng thiu bĩn phân hu cơ cũng như phân vi sinh vt làm cho đt trng b thối hố, chai cng, vi sinh vt đt b suy thối, gây ơ nhim mơi trưng. Xut phát t nhng lý do trên chúng tơi tin hành nghiên cu đ tài Nghiên cu phân lp và tuyn chn vi khun phân gii photphat khĩ tan trên đt bazan nâu đ ĐakLak .
3. 3 2. Mc tiêu ca đ tài Phân lp các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan trên đt bazan nâu đ Đăk Lăk. Tuyn chn các chng cĩ hot tính phân gii photphat khĩ tan cao ca các chng vi khun. 3.Ý nghĩa khoa hc Kt qu nghiên cu ca đ tài gĩp phn làm sáng t vai trị ca vi sinh vt phân gii photphat khĩ tan . Các nghiên cu ca th gii và Vit Nam v phân gii photphat khĩ tan dng photphat st, photphat nhơm cịn rt ít nghiên cu. Đáng chú ý đ tài nghiên cu, tuyn chn và phân lp các chng vi khun cĩ kh năng phân gii photphat khĩ tan hiu qu trên đt bazan nâu đ trong điu kin c th Đak Lak và gĩp phn bo tn ngun gen vi sinh vt bn đa hu ích. 4. Ý nghĩa thc tin Thành cơng ca đ tài s gĩp phn vào vic sn xut và ng dng ch phm vi sinh vt phân gii photphat khĩ tan trong sn xut nơng , lâm nghip nhm cung cp photphat d tan cho cây trng, gim chi phí đu tư, gim s thối hố đt, gĩp phn ci thin đi sng ca nơng dân và bo v mơi trưng nơng thơn Đak Lak. 5. Gii hn ca đ tài Trong quá trình thc hin, do thi gian, trang thit b, hố cht cĩ hn nên chúng tơi ch tin hành phân lp trên mt s mu đt ca tnh Đak Lak và ch theo dõi mt s ch tiêu cơ bn. Mt khác, đây là ln đu tham gia nghiên cu nên khơng th tránh khi thiu sĩt. Kính mong quý thy cơ và các bn đĩng gĩp ý kin.
4. 4 CHƯƠNG 1 TNG QUAN NGHIÊN CU 1.1. Các dng lân trong t nhiên Photphat là nguyên t đĩng vai trị đc bit trong quá trình trao đi cht ca cây, tham gia vào vic hình thành t bào, acid nucleic, làm nhanh quá trình chín cây, các quá trình phân gii protein và các sn phm trung gian trong lá đưc tăng cưng và chuyn đn các cơ quan vào ht, làm tăng s phát trin r. Nu trong đt ch cĩ nitơ mà khơng đ photphat thì cây khơng phát trin tt đưc [29]. Tuy nhiên hiu sut s dng photphat bi cây trng khơng quá 25% , trong khi đĩ mt lưng ln b c đnh trong đt và chuyn thành dng khĩ hp th. Lưng d tr ca photphat trong đt xp x 0,025 – 0,3% P 2O5 nhưng chúng tn ti trong đt dng khơng tan trong nưc nên cây khĩ hp th. Lưng lân trong đt nhiu hay ít là do tính cht đá m, thành phn cơ gii và hàm lưng cht hu cơ quyt đnh [22]. Theo SepfeSatsaben (1960) thì hàm lưng lân trung bình nhiu loi đt thưng t 0,02 0,08%. Do quá trình tích lu sinh hc, hàm lưng lân trong lp đt mt cao hơn lp dưi. Trong các loi đt khống, t l lân hu cơ thưng t 25 65%. Các c ht thuc thành phn sét thưng cha nhiu lân hơn các c thuc thành phn cát. Do đĩ: các chân đt nh, đt bc màu cĩ ít keo sét, thì t l lân thưng thp hơn các chân đt khác. Vit Nam, t l lân trong đt khác nhau tuỳ theo tính cht ca đá m và nhng đt phát sinh t đá m chua như: Nai, mica, quartzit, thưng t l lân thp hơn là đt phát sinh t mu thch khơng chua như: Bazan, đá vơi,
5. 5 Như vy, bĩn phân lân và tăng cưng đ hồ tan các dng lân khĩ tiêu là bin pháp rt quan trng trong sn xut nơng nghip. Bĩn phân hu cơ, vùi xác đng vt thc vt vào đt mc đ nht đnh cũng là bin pháp tăng cưng hàm lưng lân cho đt [27]. Trong t nhiên nĩi chung và trong đt nĩi riêng, lân thưng các dng ch yu như sau: 1.1.1. Lân hu cơ Hàm lưng lân hu cơ trong đt chim mt t l cao khong 20 80% lân tng s. lp đt mt, lân chim khong 50% [22]. Lân hu cơ trong đt ch yu trong thành phn mùn. Đt càng giàu mùn thì càng giàu lân hu cơ. Theo Kletcơpxki và Petecbuaxki (1964) thì: Trong lân hu cơ ca đt dng ph bin nht là dng fytat, cĩ th chim đn 50% tng s lân hu cơ. Tuỳ theo mơi trưng chua hay kim mà tn ti các dng fytat khác nhau. đt chua, lân hu cơ ch yu là fytat Fe, Al; đt trung tính, kim tn ti dng phytat Ca, Mg. Lân hu cơ trong cơ th đng vt, thc vt, vi sinh vt thưng gp các hp cht ch yu như phytin, photpholipit, axit nucleic. Điu đáng chú ý là lân t bào vi sinh vt thì khơng trc tip tham gia vào vic dinh dưng cây trng đưc và phi đi vi sinh vt cht đi, t bào b khống hố cây mi hút đưc [7]. Khi thc hin quá trình khống hố cĩ s tham gia ca vi sinh vt phân gii lân, nhng hp cht hu cơ (trong đĩ cĩ lân hu cơ) s đưc khống hố đ gii phĩng ra lân vơ cơ hay lân hu cơ, là ngun dinh dưng cung cp thc ăn cho cây trng. Cĩ 70 80 tp đồn vi sinh vt tham gia vào quá trình phân gii lân. Trong quá trình khống hố cht hu cơ ca đt, lân hu cơ đưc gii phĩng ra dưi dng photphoric và mui d tan ca nĩ. Nhưng các dng lân này li b đt hp ph và b vi sinh vt hút li, nên trong đt rt ít lân th hồ tan. Nhiu tác gi
6. 6 nghiên cu cho rng: Nu cht hu cơ vùi trong đt là cht hu cơ nghèo lân thì qua quá trình phân gii khơng nhng hàm lưng lân hu cơ trong đt khơng tăng lên mà cịn st xung (Ivanop 1955). Theo nhng cơng trình nghiên cu ca Kaila (1954) nu cht hu cơ vùi xung đt cha ít hơn 0,2 0,3% P 205 thì quá trình phân gii khơng cĩ tăng thêm v lân d tiêu cho cây vì vi sinh vt hút ht. Cưng đ hút lân hu cơ ca đt thơng qua s phân gii ca vi sinh vt ph thuc rt nhiu vào nhit đ. Theo SepfeSatsaben (1960) trong điu kin nhit đ bình thưng, các nưc ơn đi, s khống hố lân hu cơ tin hành rt chm và lưng lân cung cp cho cây t nhng hp cht hu cơ khơng đáng k. Trái li, nhit đ t 35 50 0C thì quá trình khống hố đĩ tăng lên rt mnh và cung cp cho cây đưc nhiu lân t nhng hp cht hu cơ. Vì th, nưc ta bĩn phân chung cũng cĩ kh năng gii quyt đưc phn nào nhng triu chng thiu lân ca cây. 1.1.2. Lân vơ cơ Lân vơ cơ tn ti dng mui ca nhng nguyên t Ca, Fe, Al. đt trung tính và đt kim thì photphat Ca là ch yu, cịn đt chua thì photphat Fe, Al là ch yu. Photphat Ca d đưc huy đng đ làm thc ăn cho cây hơn là photphat Fe, Al. S tn ti ca ion photphat trong mơi trưng đt b chi phi bi ion photphat b chuyn đi hố tr. Trong thc t, H2PO 4 là dng cây trng d hp thu nht. Các dng lân cịn li thưng là nhng loi khĩ hồ tan mà cây trng khơng th đng hố đưc, mun cây trng s dng đưc phi qua ch bin, bin chúng thành dng d tan. Cũng như các yu t khác, lân trong t nhiên luơn luơn tun hồn chuyn hố. Nh vi sinh vt, lân hu cơ đưc vơ cơ hố bin thành dng mui ca axit photphoric. Các dng lân này mt phn đưc cây trng s dng bin thành dng lân hu cơ, mt phn b c đnh dưi dng khĩ tan như Ca 3(PO 4)2, FePO 4, AlPO 4 . Nhng dng khĩ tan này trong các mơi trưng cĩ pH thích
7. 7 hp s chuyn hố và bin thành dng d tan. Trong quá trình này vi sinh vt gi vai trị quan trng [4]. 1.1.3. Vịng tun hồn lân trong t nhiên Vịng tun hồn ca lân khơng ging như vịng tun hồn ca nitơ. Trong khi nitơ luơn khan him trong đt thì lân tn ti nhiu trong đt dng khĩ phân gii [2,14]. Nitơ đưc đưa vào đt nh vi sinh vt c đnh đm t khơng khí, cịn đi vi lân, chúng đưc các vi sinh vt phân gii t các ngun lân vơ cơ và hu cơ khác nhau. Vịng tun hồn ca lân đưc biu din trong sơ đ sau: Cây xanh Đng vt 3 PO 4 trong dung dch đt 3 PO 4 b hp th Quá trình khống Hịa tan Quá trình c đnh Lân vơ cơ C đnh tm thi Cht hu cơ tươi và t bào sinh vt Ch t hu c ơ mùn hĩa 1.2. S chuyn hố lân trong đt 1.2.1. Đi vi lân hu cơ Tuỳ loi đt t l hu cơ thưng chim t 20 80% lân tng s trong đt. Trong tng đt mt, lân hu cơ thưng chim 50% tng s lân trong đt. Trong đt, nhiu loi vi khun và nm cĩ th phân hu các
8. 8 cht hu cơ phc tp đ gii phĩng lân dưi dng vơ cơ. Myskow cho rng 70 80 tp đồn vi sinh vt đt cĩ kh năng khống hố lân hu cơ. Các vi sinh vt đt tit ra các enzyme kh photphoryl đng thi gii phĩng ion photphat. Phn ng men nhanh khi nĩ tác đng đn các cht va mi bĩn vào đt, phn ng men chm li khi hp cht lân đã ci bin và phát trin trong đt bng cách to thành các phc liên kt vi Fe, Al, các cht hu cơ phân t lưng cao như: Các dn xut ca phytin, axit nucleic , và b gi cht trên các phn t sét trong đt. Tc đ gii phĩng lân ph thuc vào bn cht các hp cht hu cơ cĩ lân: Axit nucleic d khống hố hơn phytin. Nguyên nhân do hu ht các vi sinh vt khống hố lân hu cơ đu tit ra các enzyme tương ng đ phân gii axit nucleic [19]. Nu lưng C/P cao hơn 300 thì lân s b các vi sinh vt trong đt c đnh. Cịn mc C/P nh hơn 200, lân s tha nên đưc khống hố [19]. pH ti thích là 6 – 7. mơi trưng kim lân vơ cơ đưc phĩng thích nhanh hơn lân hu cơ [19]. Nhit đ cao cũng thun li cho vic khống hố lân hu cơ. Ti thích là 40 – 50 oC. Do đĩ trong mùa hè tc đ khống hố lân mnh hơn các mùa khác [19]. 1.2.2 .Đi vi lân vơ cơ S tn ti các loi ion photphat trong đt ph thuc vào pH đt. Do 2 vy, thc t trong đt, lân tn ti ch yu hai dng: H 2PO 4 và HPO 4 . 2 3 H2PO 4 HPO 4 PO 4 Dung dch acid Dung dch kim pH = 7 t l 2 loi ion này gn bng nhau. H 2PO 4 d đng hố hơn 2 HPO 4 , nên v mt lý thuyt pH = 5 – 6 dinh dưng lân ca cây thun li nht. Song trong đt do cĩ mt ca nhiu ion khác mà vn đ tr nên phc tp hơn.
9. 9 1.2.2.1. S chuyn hố lân đt chua Trong đt chua nghèo cht hu cơ: Fe, Al và Mn thưng nm dưi dng hồ tan phn ng vi H 2PO 4 to thành hp cht khơng tan cây khơng đng hố đưc 3+ + Al + H 2PO 4 + 2H 2O 2H + Al(OH) 3.H 2PO 4 Khơng tan 3+ 3+ các loi đt rt chua, Al và Fe vưt các ion H 2PO 4 nhiu làm cho phn ng trên càng nghiêng theo chiu thun, to thành lân khơng tan khin cho ch cịn mt lưng rt nh H 2PO 4 trong đt. 3+ 3+ đt chua, ion H 2PO 4 khơng nhng phn ng vi Fe , Al hồ tan mà cịn phn ng vi các oxit ngm nưc ca các nguyên t đĩ như gibbsit (Al 2O3.3H 2O) và goethit (Fe 2O3.3H 2O). đt chua s lưng lân b các oxit st, oxit nhơm ngm nưc c đnh cịn vưt quá c s lưng lân b kt ta vi Fe, Al và Mn hồ tan. Al(OH) 3 + H 2PO 4 Al(OH) 2.HPO 4 + H 2O Điu đáng lưu ý là hu ht các loi đt đu cha oxit st, nhơm ngm nưc nên đây cũng là kiu c đnh khá nhiu lân và din ra trên phm vi rng. Trong mơi trưng chua cịn cĩ hai quá trình c đnh lân liên quan ti sét. Đĩ là do s tn ti các ion OH l trên b mt khống sét. S c đnh này đi kèm vi vic gii phĩng kim theo phn ng sau: Sét – OH + Ca(H 2PO 4)2 sét – H2PO 4 +1/2Ca(OH) 2 Kh năng c đnh thay đi theo bn cht khống vt ca keo sét theo th t sau đây: Illit > Kaolinit > Montmorillonit. + [Al] + H 2PO 4 + 2H 2O 2H + Al(OH) 2.H 2PO 4
10. 10 Vai trị ca st và nhơm th hin qua thc t là vic c đnh các anion mnh lên khi t l SiO 2/seoquioxit gim, vi các loi đt đã mt vơi nu các seoquioxit cũng mt đi thì kh năng c đnh lân cũng gim. V vai trị ca can xi, ngưi ta thy khi đ cho sét hp th Ca 2+ , t l anion photphat đưc hp thu tăng lên, bt chp ngưng kt ta canxi photphat. Điu đĩ chng t rng đây là quá trình c đnh ion ch khơng phi bng con đưng hố hc. Tính n đnh ca quá trình gi cht này ph thuc vào điu kin mơi trưng và vic gii phĩng anion cĩ th xy ra khi điu kin mơi trưng thay đi và đc bit là nu sét b gii keo. đt chua, các hydroxit st, nhơm lưng tính cĩ th mt 1 nhĩm OH tr thành keo dương tính tham gia hp ph trao đi anion: + + Al(OH) 3 + H = Al(OH) 2 + H 2O 1.2.2.2. S chuyn hố lân đt kim Trong mơi trưng kim giàu Ca, ion H 2PO 4 phn ng mnh vi Ca to thành các hp cht ít tan hơn theo các phn ng ln lưt như sau [29]: Ca(H 2PO 4)2 + CaCO 3 + H 2O → 2CaHPO 4.2H 2O + CO 2 6CaHPO 4.2H 2O + 2CaCO 3 + H 2O → Ca 8H2(PO 4)6.5H 2O + 2CO 2 Ca 8H2(PO 4)6.5H 2O + CaCO 3 → Ca 3(PO 4)2 + CO 2 + 6H 2O Lân tr nên kém hồ tan hơn khi gp điu kin thun li và đ thi gian Ca 3(PO 4)2 cĩ th chuyn thành các hp cht khơng tan hơn na như hydroxy, cacbon và ngay c fluoro apatit. 1.3 Tng quan v vi sinh vt phân gii lân Vi sinh vt (microorganisms) là tên chung dùng đ ch tt c các loi sinh vt nh bé ch cĩ th quan sát bng kính hin vi. Theo Hồng Lương Vit (1978) trung bình mt gam đt khơ cĩ đn gn 200 triu t bào vi sinh vt. Vi sinh vt cĩ các nhĩm chính sau: vi khun, x khun, nm men, nm mc, vi
11. 11 to, virut [8]. Các nhĩm cĩ kh năng phân gii photphat là vi khun, x khun, nm men, nm mc. Nghiên cu ca Puneet và cng s cho thy: Vic nhim mt s chng nm si cĩ kh năng hồ tan photphat như Aspergillus flavus và Aspergillus niger vi vi khun c đnh nitơ Azotobacter sp đã tăng năng sut ht 17.7% [6], trong khi đĩ nhim Azotobacter sp ch làm tăng 9% . Kopoor và cng s cũng đt kt qu tương t khi nghiên cu s phi hp gia chng Azotobacter sp vi các vi khun phân gii photphat thuc các chi Agrobacterium sp , Bacillus sp và Pseudomonas sp [41]. Nhng vi sinh vt này cĩ vai trị vơ cùng quan trng đi vi sn xut nơng, lâm nghip và con ngưi.Vi sinh vt phân gii lân đưc chia thành 2 nhĩm: Vi sinh vt phân gii lân hu cơ và vi sinh vt phân gii lân vơ cơ. 1.3.1 Vi sinh vt phân gii lân hu cơ S chuyn hố các hp cht lân hu cơ thành mui ca H 3PO 4 (Stoklaza – 1991, Menkina – 1952) theo sơ đ sau [4]: Nucleoprotein protein Acid nucleic 4C 5H10 O C6H5O C5H5O5 C5H5O5O2 C4H5O5O 4H 3PO Acid amin O NH 3 CO 2 H2S H2O Cht khác
12. 12 Sơ đ ca quá trình phân gii nucleoprotein [7] c th như sau: 1. Nucleoprotein Nuclein axit nucleic Nucleotic H3PO 4 2. Lơxitin Glixerphosphat H3PO 4 Vi sinh vt phân gii lân hu cơ ch yu gm các chng Bacillus và Pseudomonas. Bacillus mycoides: Vi khun hình que, dài khong 1,6 – 3,6 , rng khong 0,5 1, phân b rng rãi trong t nhiên và là vi khun ym khí, cĩ tiêm mao đu và quanh cơ th. Trên mơi trưng thch, khun lc gn ging khun lc ca nm. Nĩ cĩ th phân gii lân hu cơ, amơn hố protit nhưng khơng sinh H 2S [7] . Bacillus megaterium var phosphaticum : Vi khun hình que, cĩ nha bào, ym khí tuỳ tin, cĩ kh năng phân gii lân hu cơ rt mnh [7]. Bacillus là trc khun gram dương, sinh bào t, chiu ngang ca bào t khơng vưt quá chiu ngang ca t bào vi khun, do đĩ khi cĩ bào t vi khun khơng thay đi hình dng, bào t ca vi khun này cĩ sc sng rt lâu. Ngồi ra, cịn cĩ các vi khun như: Bacillus cereus, Bacillus asterosporus, Pseudomonas sp cũng cĩ kh năng phân gii lân hu cơ. Ngày nay, ngồi vi khun, ngưi ta cịn thy x khun, nm cũng cĩ kh năng phân gii lân hu cơ [7]. 1.3.2. Vi sinh vt phân gii lân vơ cơ T năm 1900 đã cĩ nhiu nhà khoa hc nghiên cu vn đ này. J.Stoklasa dùng đt đã tit trùng cĩ bĩn bt apatit và cy vi khun. Ơng dùng Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus bytyricus . Sau khi cy vi khun và bĩn cho yn mch cĩ tác dng tăng năng sut. Nhiu vi
13. 13 khun như Pseudomonas fluorescens , vi khun nitrat hố, mt s vi khun h r, nm, x khun cũng cĩ kh năng phân gii Ca 3(PO 4)2 và bt apatit. Ngồi ra, trong quá trình lên men butiric, lên men lactic, quá trình lên men dm trong phân chung cũng cĩ th xúc tin quá trình hồ tan Ca 3(PO 4)2. Vi khun vùng r phân gii Ca 3(PO 4)2 mnh. h r lúa mì, thưng cĩ 30% vi khun cĩ kh năng phân gii Ca 3(PO 4)2 và lưng phân gii so vi đi chng tăng 618 ln [7]. Trong s nm đã thí nghim thì Aspergillus niger cĩ kh năng phân gii lân mnh nht. Nhưng v cơ ch quá trình phân gii thì đi đa s các nhà nghiên cu đu cho rng s phân gii Ca 3(PO 4)2 cĩ liên quan mt thit vi s sn sinh axit trong quá trình sng ca vi sinh vt, trong đĩ axit cacbonic rt quan trng. Chính H 2CO 3 đã làm cho Ca 3(PO 4)2 phân gii. Quá trình cĩ th phân gii theo phương trình sau [7]: Ca 3(PO 4)2 + 2 H 2CO 3 + H 2O → Ca(H 2PO 4)2. H 2O + 2 Ca(HCO 3)2 Trong đt, vi khun nitrat hố và vi khun chuyn hố lưu huỳnh cũng cĩ tác dng quan trng trong vic phân gii Ca3(PO 4)2. Vì trong quá trình sng, các vi khun này tích lu trong đt HNO 3 và H 2SO 4. Quá trình hồ tan cĩ th biu th theo các phương trình sau: 1. Ca 3(PO 4)2 + 4 HNO 3 = Ca(H 2PO 4)2 + 2 Ca(NO 3)2 2. Ca 3(PO 4)2 + 2 H 2SO 4 = Ca(H 2PO 4)2 + 2 CaSO 4 Ngồi ra, theo mt s tài liu thì vi sinh vt đt cịn tham gia vào quá trình kh mui ca axit photphoric đ hình thành hidrophosfua [7]. 1.3.3. Các điu kin nh hưng ti kh năng phân gii lân ca vi sinh vt Đ pH: nhìn chung pH ít nh hưng đn kh năng phân gii lân. Tuy nhiên pH trong khong 7,8 – 7,9 nh hưng tt ti s phát trin ca h vi sinh vt phân gii lân [27].
14. 14 Nhit đ: các chng vi sinh vt cĩ nhit đ thích hp cho quá trình phân gii lân là khác nhau. Nhìn chung khong nhit đ thích hp nm trong khong 20 – 40 oC [27]. Hp cht hu cơ: cht hu cơ làm tăng quá trình sinh trưng ca vi sinh vt. Do đĩ kh năng phân gii lân ca chúng s tăng lên. Đ m: nhng nơi cĩ đ m cao, do hot đng ca vi sinh vt mnh nên to ra nhiu axit hu cơ làm tăng phân gii lân [27]. H r: h r cây trng khích thích s sinh trưng ca vi sinh vt. Do đĩ phân gii lân cũng đưc tăng cưng [27]. Tuy nhiên mt s lồi cây cĩ th tit ra các cht đc ngăn cn s sinh trưng, phát trin ca vi sinh vt. T l N và C trong mơi trưng: N, C là nhng thành phn cn thit cho s sinh trưng và phát trin ca vi sinh vt. T l N, C trong mơi trưng cao s thúc đy kh năng phân gii lân [27]. 1.4. Hàm lưng lân trong đt nâu đ trên đá bazan Đt bazan là mt loi đt rt giàu lân tng s,nhưng các quá trình c đnh lân t d tiêu thành dng khĩ tiêu thưng xuyên xy ra nên lưng lân d tiêu luơn mc nghèo. Theo Fridland (1973) đt bazan nâu đ là loi đt hình thành trên đá bazan, trong điu kin nhit đi m, các bazơ b ra trơi mnh , đt cĩ phn ng chua , st nhơm tích lu nhiu .Đây là nguyên nhân ch yu ca quá trình gi cht lân trên đt bazan. Nguyn T Siêm (1990) , Nguyn Vy (1993) lân là yu t hn ch hàng đu đi vi tt c các cây trng trên đt đi nĩi chung và đt bazan nâu đ nĩi riêng [23, 31]. Các tác gi Lê văn Căn (1978), Vũ Cao Thái (1989), Lê Đình Sơn, Đồn Triu Nhn (1990) khi nghiên cu tính cht hố hc đt đ bazan đu cĩ chung nhn xét đt giàu lân tng s nhưng nghèo lân d tiêu [1, 28,25].
15. 15 1.5. Tng quan v đt bazan nâu đ Đak Lak Theo h thng phân loi đt ca FAO – UNESCO (1995), Đak Lak cĩ 11 nhĩm và 84 đơn v đt đai. Trong đĩ, nhĩm đt xám chim din tích ln nht 44%. Nhưng nhĩm đt xám thưng phân b nhng vùng đt dc, v bn cht cĩ đ phì thp, chua, hàm lưng lân tng s và lân d tiêu thp. Như vy, nhĩm đt xám khơng thun li cho vic trng các loi cây trng. Nhĩm đt chim din tích nhiu th 2 Đak Lak là đt bazan đ (Ferrasols). Din tích đt bazan đ khong 311.340 ha, chim 23.7% din tích đt t nhiên. Phân b tp trung ti các khi bazan Buơn Ma Thut . Nhĩm đt này cĩ các đơn v phân loi: Nâu đ trên Bazan (Fk), nâu vàng trên bazan (Fu), là nhĩm đt cĩ tng B tích t nhơm rõ nht. Đt đưc phân b tp trung khi bazan Buơn Ma Thut chy t bc xung Nam, t Đơng sang Tây. Phía Bc cao nguyên (Ea H'Leo) cĩ đ cao 800m, phía Nam đ cao 400 m, phía Tây cao 300m (khu vc huyn Cư M'gar), b mt cao nguyên rt bng phng [32]. Đt bazan nâu đ hình thành và phát trin trên các cao nguyên Bazan phn ln cĩ đ dc thp, tng đt mn dày, cĩ thành phn cơ gii nng (t l sét >40%), tơi xp khi m, đ xp trung bình 6265%, kh năng gi nưc và hp thu nưc tt Rt thích hp vi các loi cây cơng nghip dài ngày cĩ giá tr hàng hố cao: cà phê, cao su, tiêu và nhng cây ăn qu khác [32]. Tuy nhiên, đim hn ch ca nhĩm đt này là hàm lưng lân d tiêu thp, lưng P2O5 d tan nh hơn 1,0 mg/100 g đt. Trong khi đĩ, lân tng s ca nhĩm đt này li cao, P 2O5 tng s trên 0.2% [32]. 1.6. Vai trị sinh lý ca nguyên t lân trong cây Lân là thành phn cu trúc bt buc ca các cht hu cơ trong cây, đĩng vai trị hot hố các đưng đơn, axit amin , các nhĩm hot đng (NAD, NADP, ), tham gia vào các quá trình trao đi cht, trao đi năng lưng (ATP), phân chia t bào , thúc đy ra hoa, hình thành qu, quyt đnh phm
16. 16 cht nơng sn, ht ging, kích thích r phát trin và hn ch tác hi ca vic bĩn tha đm Phm Đình Thái , Nguyn Duy Minh , Nguyn Lương Hùng , 1987 [29]. Theo Hồng Minh Tn, Nguyn Quang Thch, Vũ Quang Sáng 2006 [26] : lân tham gia vào thành phn ca axit nucleic (ADN và ARN) cĩ vai trị quan trng trong quá trình di truyn ca cây, quá trình phân chia t bào và sinh trưng ca cây. Do vy giai đon cịn non hoc giai đon hot đng sng mnh thì hàm lưng lân trong cây thưng cao hơn các giai đon khác. Lân tham gia vào thành phn ca photpholipit. Đây là hp cht rt quan trng cu to nên màng sinh hc trong t bào như màng sinh cht, màng khơng bào, màng quang hp. các màng này cĩ chc năng bao bc , quyt đnh tính thm, s trao đi cht và năng lưng. Lân cĩ mt trong h thng ADP, ATP là các cht d tr và trao đi năng lưng sinh hc trong cây. Chúng như nhng acqui tích lu năng lưng ca t bào. Liên kt cao năng phosphat ( ˜ P) cha 7 10 Kcal năng lưng và là phương thc tích lu năng lưng quan trng nht đưc s dng cho tt c các hot đng sng trong cây, tham gia vào nhĩm hot đng ca các coenzym oxy hố kh là NAD, NADP, FAD, FMN. Đây là các coenzym cc kì quan trng trong các phn ng oxy hố kh trong cây, đc bit là quá trình hơ hp, quá trình đng hố nitơ. Theo Trn Kim Đng, Nguyn Quang Ph và Lê Th Hoa (1991) trong các quá trình trao đi cht, phospho gi vai trị trung tâm vì nĩ tham gia trong vic cu to nên ADP, ATP là nhng hp cht giàu năng lưng sinh hc. ATP đưc hình thành trong quang hp, hơ hp, đưc s dng cho nhiu quá trình sinh lý quan trng như hút nưc và các cht khống, trao đi và vn chuyn các cht trong cây và đc bit là trong quá trình sinh tng hp nhng cht hu cơ quan trng như protein. Vì vy, khi thiu photphat thì cây phát trin chm, quá trình hơ hp trong r b cn tr, hơ hp b c ch dn đn thiu các sn phm trung gian tip nhn NH4 + t đt, nh hưng đn chu trình trao đi nitơ ca cây [10].
17. 17 Trong cây, lân ch yu nm dưi dng hu cơ và mt phn nh dưi dng vơ cơ. Lân vơ cơ đĩng vai trị quan trng trong vic hình thành h thng đm ca t bào và là ngun d tr cn thit cho s tng hp lân hu cơ. Đ lân, biu hin trưc ht là cây sinh trưng tt, h thng r phát trin, đ nhánh khe, xúc tin hình thành cơ quan sinh sn , tin hành trao đi cht và năng lưng mnh m, xúc tin các hot đng sinh lý đc bit là quang hp và hơ hp kt qu là tăng năng sut cây trng Hồng Minh Tn, Nguyn Quang Thch và Vũ Quang Sáng (2006) [26]. Thiu lân làm cho các quá trình sinh lý trong cây b ri lon, s tng hp dip lc b nh hưng, các quá trình photphoryl hố, hút dinh dưng, tng hp cht hu cơ và các cht thơm b gim sút, đng thi làm gim kh năng chng chu vi các điu kin ngoi cnh bt li, hn ch và kéo dài quá trình hình thành, phân hố mm hoa, cht lưng nơng sn gim Phm Đình Thái, Nguyn Duy Minh và Nguyn Lương Hùng (1987) [29]. Theo Nguyn T Siêm, Trn Khi (1996) khi nhit đ tăng, đt cĩ đ m cao thì lân đưc hp thu tt hơn. S phát trin ca b r cĩ ý nghĩa quyt đnh vi dinh dưng lân. Đ dài r và tc đ ra r t l thun vi t l lân hp th [24]. Lân làm tăng s phát trin ca h r làm cho cây hút đưc nhiu nưc , nhiu cht dinh dưng trong đt hơn (Võ Minh Kha, 1996) [15]. Như vy, lân đĩng vai trị rt quan trng trong vic kích thích s phát trin ca b r, tăng cưng kh năng hút nưc và các cht khống ca cây. Khi đ lân, b r phát trin mnh do đĩ năng lc hút nưc và tr nưc ca b r s cao hơn, nên kh năng huy đng nưc tng sâu lên và gi vùng r (thơng qua lc hút và dch r) tt hơn, nh vy m đ đt tng đt mt s đưc nâng cao và n đnh.
18. 18 1.7. Cơng ngh lên men 1.7.1. Ging vi sinh vt Mun cĩ sn phm tt ngồi qui trình cơng ngh thì khâu ging là quan trng nht, nĩ quyt đnh cht lưng sn phm và giá tr kinh t ca qui trình sn xut. Trong cơng ngh lên men, ngưi ta s dng rng rãi nhiu loi vi sinh vt như vi khun, x khun, vi khun lam, nm men, nm mc, to. Tiêu chun ca ging: vi sinh vt tt; cĩ kh năng sinh tng hp to sinh khi vi hiu sut cao; cĩ kh năng s dng các nguyên liu r tin, d kim như các ph phm, các ph thi; trong quá trình lên men khơng to ra các phm ph khơng mong mun; ít mn cm đi vi s tp nhim do vi sinh vt khác; sn xut sinh khi cĩ th tách d dàng ra khi mơi trưng dinh dưng. Tuy nhiên trong quá trình sn xut, các tiêu chun trên khơng phi gn lin vi nhau. Các vi sinh vt thuc nhĩm Eukaryote cĩ kích thưc t bào ln th hình si, do đĩ d dàng tách chúng ra khi mơi trưng dinh dưng bng phương pháp lc ly tâm thơng thưng. Nhưng chúng thưng tn ti mt qui tc chung là kích thưc t bào t l nghch vi hot tính trao đi cht. Các cơng vic ch yu ca cơng tác ging trong sn xut: Kim tra đ thun khit ca ging trong lên men; Kim tra kh năng hi bin ca ging; Hot hố ging sau mt thi gian s dng, đ hot hố ging ngưi ta s dng mơi trưng nuơi cy giàu các cht kích thích sinh trưng; Gi ging bng phương pháp thích hp cĩ th duy trì nhng hot tính ưu vit ca chúng, chng thối hố, mt hot tính. Các phương pháp gi ging :
19. 19 Hin nay thưng s dng 4 phương pháp chính đ gi ging vi sinh vt đĩ là: + Bo qun trên mơi trưng thch, đnh kì kim tra cy truyn Ging vi sinh vt đưc gi trên mơi trưng thch nghiêng (đi vi các ging vi sinh vt hiu khí) hoc trích sâu vào mơi trưng thch (đi vi vi sinh vt k khí). Các ng ging đưc bo qun trong t lnh nhit đ 3 50C. Đnh kì kim tra đ cy truyn ging, tuỳ tng ging vi sinh vt khác nhau mà đnh kì cy truyn khác nhau, song gii hn ti đa là 3 tháng. + Gi ging trong cát hoc đt sét vơ trùng Do cu trúc hố lý cát và sét là nhng cơ cht tt mang các t bào vi sinh vt, ch yu là nhĩm vi sinh vt cĩ bào t. Cách làm như sau: Cát và đt đưc x lý sch, sàng lc qua rây, x lý pH đt trung tính, sy khơ và kh trùng. Sau đĩ bng thao tác vơ trùng trn bào t và cơ cht cát hoc đt trong các ng nghim. Dùng paraffin nĩng chy pht lên nút bơng ca ng nghim đ giúp cho ng ging khơng b m tr li. Ngồi cát và đt, ngưi ta cịn gi ging trong ht ngũ cc hay trên silicagen Phương pháp bo qun ging trên ch yu cho nm mc và x khun. + Gi ging bng phương pháp lnh đơng Bng phương pháp này da trên nguyên tc c ch s phát trin ca vi sinh vt, đưa chúng vào điu kin lnh sâu 25 0C đn 70 0C. Ngưi ta trn vi sinh vt vi dung dch bo v hay cịn gi là dung dch nhũ hố như glycerin 15%, huyt thanh nga (loi khơng cho cht bo qun), dung dch glycose hoc lactose 10% Vic làm lnh đưc tin hành mt cách t t. Khi đ lnh đt 20 0C, nu tip tc làm lnh thì tc đ làm lnh phi đt 1 – 2oC/phút. Phương pháp bo qun này cĩ ưu đim là bo qun đưc lâu.
20. 20 + Gi ging bng phương pháp đơng khơ V nguyên tc cũng ging như phương pháp đơng lnh nhưng khác ch là đưa cht bo v vào như glutamate 3% hay lactose 1,2% + pepton 1,2% hay saccharose 8% + sa 5% + gelatin 1,5%. Đây là phương pháp bo qun ti ưu nht hin nay, cĩ th ti vài chc năm mi phi làm li. 1.7.2. Nhân ging vi sinh vt Mc đích ca vic nhân ging là đ tăng s lưng t bào vi sinh vt. Trong quy trình lên men thì tuỳ chng ging vi sinh vt khác nhau mà nhân theo cơ cht và mơi trưng nhân khác nhau. Thưng cĩ hai dng ging: t bào sinh dưng và bào t. Trưng hp ging là t bào sinh dưng: Đ thu đưc lưng t bào sinh dưng, ngưi ta chn mơi trưng nhân sinh khi là mơi trưng đm bo cho vi sinh vt tn ti thích hp nht, đ vi thi gian ngn nht cho sinh khi vi sinh vt ln nht. Trong trưng hp này thưng dùng mơi trưng dch th (nuơi cy chìm). Trưng hp ging là bào t đính: Thơng thưng chn mơi trưng đc (nuơi cy bán rn: cám go, bt ngơ, thĩc ). Khi kt thúc mi khâu nhân ging cn kim tra ngay đ thun ca ging và mt đ t bào vi sinh vt cn nhân. 1.7.3. Lên men Là giai đon nuơi cy vi sinh vt đ chúng to sn phm hoc sinh khi vi sinh vt .Đây là khâu quyt đnh mt quy trình lên men. Đ thc hin lên men, ngưi ta thưng s dng hai phương pháp là lên men b mt và lên men chìm.
21. 21 1.7.3.1. Lên men b mt Lên men b mt là thc hin nuơi cy vi sinh vt trên b mt mơi trưng dch th hoc bán rn. Nuơi cy trên b mt dch th (dùng cho nhĩm vi sinh vt hiu khí): Tuỳ tng loi vi sinh vt mà chn mơi trưng thích hp. Mơi trưng đưc pha lỗng vi nng đ thích hp, sau đĩ đưc b sung ngun nitrogen (N), ngun khống Khi mơi trưng cho vào thit b lên men phi đm bo cĩ b mt thống, rng. Nuơi cy theo phương pháp này đơn gin nhưng địi hi din tích s dng ln, khĩ t đng quy trình sn xut nên hin nay phương pháp này ít đưc s dng. Nuơi cy b mt s dng mơi trưng bán rn: Cĩ th dùng vi sinh vt hiu khí, hoc bán hiu khí, k khí. phương pháp lên men này nguyên liu thưng dùng là: Các loi ht go, đu tương; Các loi mnh: mnh sn, mnh ngơ; các loi ph liu hu cơ: bã mía, rơm r Các loi nguyên liu cha tinh bt trưc khi s dng phi x lý bng cách nu chín. Ngồi các nguyên liu nĩi trên ngưi ta phi b sung các cht dinh dưng vào mơi trưng đ đm bo cho dinh dưng ca vi sinh vt trong quá trình nhân sinh khi (lên men). Đi vi vi sinh vt hiu khí cn phi cĩ qut thi khí vơ trùng. Trong lên men bán rn, ngồi yêu cu v nguyên liu thì đ m rt cn thit cho quá trình lên men. Phi luơn luơn đm bo đ m 60 75% (đ m khơng khí 90 100%). 1.7.3.2. Lên men chìm Áp dng cho c vi sinh vt hiu khí và k khí. Khi lên men chìm, vi sinh vt đưc nuơi cy mơi trưng dch th s phát trin theo chiu đng ca ct mơi trưng.
22. 22 ∗ Đ thc hin quá trình lên men chìm cn thc hin tng bưc sau: Thc hin quá trình khuy đo và sc khí. Theo dõi s to bt trong lên men và bin pháp phá bt. Điu chnh pH ca mơi trưng lên men. Theo dõi và điu chnh nhit đ ca mơi trưng lên men. Tip thêm nguyên liu và b sung các cht tin th. Trng thái t bào ca chng ging dùng trong quá trình lên men và đ tp khun. Kim tra s tiêu hao năng lưng, s to thành trong quá trình lên men. Điu cui cùng cũng là quan trng nht đĩ là xác đnh thi gian ca quá trình lên men. ∗ Thu hi sn phm: Khi quá trình lên men kt thúc ngưi ta tin hành thu hi sn phm. Các sn phm ca quá trình tng hp vi sinh vt thưng đưc tích lu trong t bào hoc trong dung dch nuơi cy. 1.8. Tng quan v vic s dng phân bĩn sinh hc Trong nhng nhân t to nên sc bt ca nn kinh t, vn đ sn xut nơng nghip gi mt vai trị ht sc quan trng. Vì vy, đ đt đưc nhng thành tu trong sn xut thì vic ng dng nhng tin b khoa hc k thut vào lĩnh vc nơng nghip là điu kin cn thit. Hin nay, vi sinh vt hc là ngành mũi nhn trong cuc cách mng sinh hc. Vi trình đ phát trin ca khoa hc, các nhà nghiên cu đã to ra đưc mt loi phân bĩn mang tính cht đc hiu đi vi cây trng đĩ là phân bĩn vi sinh vt gi tt là phân vi sinh,cĩ tác dng nâng cao năng sut và cht lưng nơng sn, gim chi phí ,tit kim phân bĩn vơ cơ và gĩp phn to cân bng sinh thái. Phân bĩn vi sinh cĩ ý nghĩa quan trng trong vic bo v mơi trưng và xây dng nn nơng nghip sch
23. 23 bn vng, do vy vic nghiên cu s dng rng rãi phân bĩn vi sinh trong nơng lâm nghip đã và đang đưc nhiu nưc trên th gii quan tâm phát trin[13]. Các loi bĩn phân vi sinh đang đưc th gii nghiên cu và s dng cĩ th k đn là: Phân vi sinh c đnh nitơ cng sinh, hi sinh và t do, phân vi sinh vt phân gii lân, ch phm vi khun lam, ch phm nm r Tuỳ theo điu kin t nhiên, đc đim canh tác ca tng vùng và phương thc s dng ca tng đa phương mà phân bĩn vi sinh vt đưc sn xut t mt chng hay nhiu chng vi sinh vt, s dng cho mt đi tưng hay nhiu đi tưng cây trng trên nn cơ cht tit trùng hay khơng tit trùng khác nhau. Trong gii hn đ tài chúng tơi quan tâm đn phân vi sinh phân gii lân. Như chúng ta đã bit hàm lưng lân trong hu ht các loi đt đu rt thp, vì vy vic bĩn lân cho đt nhm nâng cao năng sut cây trng là vic làm cn thit. Ngưi ta cũng bit rng khong 2/3 lưng lân đưc bĩn b đt hp ph tr thành dng cây trng khơng s dng đưc hoc b ra trơi. Phân vi sinh phân gii photphat khĩ tan khơng ch cĩ tác dng nâng cao hiu qu ca phân bĩn khống nh hot tính phân gii và chuyn hố ca các chng vi sinh vt, mà cịn cĩ tác dng tn dng ngun photphat đa phương cĩ hàm lưng lân thp , khơng đ điu kin sn xut phân lân khống qui mơ cơng nghip. Bĩn phân lân sinh hc cĩ tác dng làm tăng s lưng vi sinh vt phân gii lân trong đt,dn đn tăng cưng đ phân gii lân khĩ tan trong đt 23 35%. Cây trng phát trin tt hơn , thân lá cây mp hơn, to hơn, bn lá dày hơn, tăng sc đ kháng sâu bnh. Năng sut đu tương tăng 5 – 11%, lúa 4,7 – 15% so vi đi chng [21]. Nhiu cơng trình nghiên cu Châu Âu và M cũng như các các nưc Châu Á đu cho thy hiu qu to ln ca phân vi sinh phân gii lân. ti n Đ , vi sinh vt phân gii lân đưc đánh giá cĩ tác dng tương đương vi
24. 24 50 kg P2O5/ha. S dng vi sinh vt phân gii lân cùng qung photphat cĩ th thay th đưc 50% lưng lân khống cn bĩn mà khơng nh hưng đn năng sut cây trng. Hin nay, hai nưc Trung Quc và n Đ đang đy mnh nghiên cu và ng dng cơng ngh sinh hc trong sn xut phân lân vi sinh vi quy mơ cơng nghip, ng dng trên hàng chc triu ha [19]. Ti Vit Nam các cơng trình nghiên cu gn đây nht cho bit mt gĩi ch phm vi sinh vt phân gii lân s dng cho cà phê trên vùng đt đ bazan cĩ tác dng tương đương vi 34,3 kg P 2O5/ha [27]. Lâm Tú Minh và các cng s đã xây dng quy trình sn xut phân vi sinh phân gii lân kích thích sinh trưng trên nn cht mang là than bùn đã đm bo đưc mt đ t bào là 10 7 CFU/g sau 150 ngày bo qun đng thi qua tin hành kho nghim cho thy phân bĩn đã làm tăng sn lưng cây rau, c lên 18 33% [20]. Đăklăk, vic th nghim sn xut và th nghim phân bĩn hu cơ vi sinh cĩ ngun gc t ph ph phm nơng nghip như v cà phê, thân cành sn, rác thi sinh hot hu cơ cho thy s lưng vi sinh vt trong phân bĩn đt 10 7 10 8 CFU/g đng thi hàm lưng mùn và các khống cht đu cao hơn hoc bng các loi phân bĩn hu cơ trên th trưng. Cao Ngc Đip (2002) nghiên cu sn xut phân lân sinh hc ng dng cây lúa cao sn trng trên đt phèn Đng Tháp Mưi. Kt qu cho thy khi s dng vi sinh vt hồ tan lân làm phân lân sinh hc trong qui trình canh tác lúa cao sn là bin pháp kinh t cao vì hiu qu s dng lưng lân tt hơn so vi bĩn phân hố hc . Bĩn dch lân hồ tan cĩ hiu qu cao tương đương vi bĩn 60 kg P 2O5/ha [9] . .]. Như vy, đ đáp ng nhu cu rt ln v phân bĩn ca nn nơng nghip Vit Nam thì vic nghiên cu sn xut ra nhiu loi phân bĩn vi sinh là mt điu cn thit. Tip tc nghiên cu đ m rng vic s dng phân bĩn vi sinh nhm tit kim hoc thay th mt phn phân bĩn vơ cơ và xây dng nn nơng nghip
25. 25 sch bn vng khơng ch là mi quan tâm ca các nhà qun lý mà cịn là nhim v quan trng đi vi các cơ quan khoa hc và sn xut trong c nưc. 1.9. Tình hình nghiên cu vi sinh vt phân gii photphat khĩ tan. 1.9.1 Tình hình nghiên cu trên th gii Vic nghiên cu vi sinh vt phân gii photphat đã đưc quan tâm mt s nưc trên th gii. H đã nghiên cu và ng dng nhiu chng vi sinh vt phân gii photphat trong sn xut nơng nghip. Các chng vi khun đc bit thuc lồi Pseudomonas và Bacillus , các chng nm thuc lồi Penicillium , Aspergillus cĩ kh năng chuyn hố photphat khĩ tan thành dng d hồ tan trong đt nh tit ra các axit hu cơ như formic, acetic, lactic, propionic, fumaric, glucolic và axit succinic. Nhng axit này làm gim pH và hồ tan các dng photphat khĩ tan (Sen và Paul, 1957; Katznelson và Bose,1967; Ostwal và Bhide,1972) [37]. Liên xơ (cũ) sn phm phân bĩn vi sinh vt thương mi vi tên gi “Photphobacterin” vi s cĩ mt ca B.megateirum var phosphaticum đã đưc s dng rng rãi Liên xơ và các nưc Đơng âu , làm tăng năng sut cây trng 5 – 10% so vi đi chng.Vin nghiên cu nơng nghip n đ đã s dng Phosphobacterium trên lúa mì, lúa và ngơ cũng đã cho kt qu tăng đáng k so vi đi chng [19]. ElKomy (2005) nghiên cu phi hp hai chng c đnh N Azospirillum và phân gii lân Bacillus megaterium x lý cho lúa mì. Kt qu cho thy hàm lưng N trong thân lúa mì ca các thí nghim cĩ x lý hai chng này tăng 3753%; hàm lưng P trong thân tăng 48,6%; hàm lưng K tăng 1014,3% so vi đi chng khơng x lý. Kt qu nghiên cu cũng cho thy x lý phi hp hai chng cĩ tác dng cng hưng, tt hơn x lý đơn chng [36]
26. 26 S dng chng Pseudomonas striata khi bĩn qung photphat và superphotphat cũng làm tăng đáng k năng sut khoai tây (Gaur và Negi – 1980). Kt qu nghiên cu mi nht Canada cho thy bĩn vi sinh vt phân gii lân cĩ th thay th 50 – 75% lưng lân cn bĩn bng qung nghèo P 2O5 mà năng sut, cht lưng khơng h thay đi (Gaur, 1992) Perez (2007) đã nghiên cu phân lp đưc 130 chng vi khun cĩ kh năng phân gii photphat khĩ tan Venezuela. Tuy nhiên, khơng cĩ chng nào cĩ hot tính phân gii photphat Fe và Al. Tác gi cũng chn đưc 10 chng cĩ tim năng đ nghiên cu tip thuc các chi Ralstonia, Pantoea, Serrati [44] Alvaro (2009) đã phân lp đưc 2 chng vi khun t r c Tây Ban Nha cĩ hot tính phân gii photphat và kích thích sinh trưng đi vi cây trng thuc chi mi là Acenitobacter [33]. Amal (2007) n Đ nghiên cu s dng phi hp các chng vi khun c đnh N và vi khun phân gii photphat khĩ tan đã làm tăng năng sut lúa đn 20% so vi đi chng. 1.9.2 Tình hình nghiên cu trong nưc Nhm mc tiêu phát trin nơng nghip sinh thái bn vng. Vit Nam đã cĩ khá nhiu nghiên cu v vi sinh vt phân gii lân. Thp k 90 th k XX các vi sinh vt phân gii lân sau khi đưc nhân sinh khi đưc tm nhim vào cht mang to thành ch phm vi sinh vt phân gii lân hoc phi trn vi cht hu cơ đ to thành phân lân hu cơ vi sinh vt. Ngồi tác dng phân gii lân ,VSV phân gii lân cịn cĩ kh năng sn sinh ra các cht kích thích sinh trưng thc vt hoc các cht kháng sinh giúp cây trng phát trin tt hơn, chng chu tt hơn đi vi điu kin bt li t bên ngồi. Nguyn Th Phương Chi đã nghiên cu kh năng tit enzym photphataza ca 10 chng VSV hồ tan photpho và nhn thy rng ngồi kh năng hồ tan photpho khĩ tan các chng VSV này cĩ kh năng sn sinh enzyme photphataza (ch yu là nm si và vi khun) enzyme này đĩng vai trị xúc tác khơng th thiu cho
27. 27 quá trình phân hu sinh hc các hp cht hu cơ cha photphat. Vũ thuý Nga (2003) nghiên cu kh năng sinh tng hp IAA và phân gii photphat vơ cơ khĩ tan ca vi khun Bradyrhizobium . Kt qu cho thy chúng cĩ kh năng tng hp 20 – 100 microgam/ml mơi trưng nuơi cy[21]. Phm Thanh Hà, Nguyn Th Phương Chi (1999) nghiên cu nh hưng ca các ngun nitơ lên kh năng phân gii photphat khĩ tan ca hai chng nm si Aspergillus awamori MN1 và Penicillum cyaneofulvum ĐT1.Tác gi nghiên cu 7 ngun cung cp nitơ khác nhau lên kh năng phân gii photphat ca Aspergillus awamori MN1 và Penicillum cyaneofulvum ĐT1. Kt qu cho thy KNO 3, NaNO 3, (NH 4)2SO 4 là nhng ngun nitơ tt nht cho mơi trưng nuơi chng MN1 to kh năng phân gii photphat cao. Cịn đi vi chng ĐT1 là NH 4Cl [11]. Đ la chn thành cơng các chng vi sinh vt dùng sn xut phân bĩn vi sinh, các tác gi rt quan tâm đn tác đng ca nhit đ , pH , tc đ lc lên sinh trưng và hot tính ca chúng. Nguyn Th Phương Chi (2003) nghiên cu biên đ pH đ sinh trưng và phân gii photphat ca mt s chng vi khun. Kt qu cho thy pH = 6 7 là pH thích hp cho s phát trin ca phn ln các chng vi khun [4]. Phm Thanh Hà , Nguyn th Quỳnh Mai , H Th Kim Anh (2004) nghiên cu nh hưng ca nhit đ đi vi vi sinh vt hồ tan photphat kt qu các chng vi khun cĩ kh năng sinh trưng tt trong khong t 20°C – 40 oC. Ba chng vi khun RTL6, Q5 và IIIe th hin hot tính phân gii photphat cao nht 15 oC. By chng cịn li hồ tan nhiu photphat nht khi nuơi trong nhit đ 20 oC [12].
28. 28 CHƯƠNG2 NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 2.1. Ni dung nghiên cu Đ đt đưc mc tiêu đ tài đt ra , chúng tơi đã tin hành nghiên cu các ni dung sau: 2.1.1. Phân lp và tuyn chn các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan trên đt bazan nâu đ Đak Lak. 2.1.2. Đánh giá hot tính phân gii photphat khĩ tan ca các chng vi khun. 2.1.3. Xây dng quy trình nuơi cy vi khun phân gii photphat khĩ tan. Nghiên cu v thành phn mơi trưng Nghiên cu nh hưng ca pH Nghiên cu nh hưng ca tc đ lc Nghiên cu nh hưng ca thi gian nuơi cy. 2.1.4. Nghiên cu th nghim nh hưng ca các chng phân gii photphat khĩ tan tuyn chn trên cây lúa trng trong chu. 2.2. Phương pháp nghiên cu 2.2.1. Đi tưng, đa đim nghiên cu Đi tưng nghiên cu: Chng vi khun phân gii photphat khĩ tan thu thp trên đt mt s loi đt Đak Lak: đt bazan nâu đ (Rhode ferrasol), đt xám bc màu, đt bazan dc t. Đa đim nghiên cu: Phịng thí nghim B mơn Sinh hc, Khoa Nơng Lâm nghip, Trưng Đi hc Tây Nguyên. 2.2.2. Phương pháp nghiên cu 2.2.2.1. Phương pháp phân lp và tuyn chn các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan
29. 29 + Phương pháp ly mu đt: Mi loi đt ly 5 đim khác nhau, trn đu, mi đim khong 100g, ly t lp đt mt đn 10cm. Mu đưc đng trong túi nilon polypropylen đã đưc kh trùng. Các mu sau khi ly đưc ghi nhãn nơi ly, ngày ly và ngưi thu mu. Mu đt sau khi thu đưc đem ngay ti phịng thí nghim đ tin hành phân lp. Mu sau khi thu thp đưc phơi trong mát, đp nh, qua rây 2mm. + Đa đim ly đt Chn 3 loi đt ch yu Đak Lak là: Đt bazan nâu đ ly ti s 64 tnh l 8 đưng đi Cư Mga, Tp. Buơn Ma Thut. Đt xám bc màu ly ti thơn 11, xã Cư M’Lan, huyn Ea Soup. Đt Bazan dc t ly ti thơn 8, xã Hồ Phú, Tp. Buơn ma Thut. + Phương pháp phân lp Mơi trưng phân lp chng vi khun phân gii photphat khĩ tan là mơi trưng ti thiu NBRIP (Perez, 2007)[44]. Thành phn mơi trưng gm: 5,0 g Ca 3(PO 4)2; 0,25g MgSO 4; 0,2g KCl; 0,1g (NH 4)2SO 4; 5 g MgCl 2. 6 H 2O; 10g glucose; 20g agar tinh sch; 1lit nưc ct. Kh trùng 121 oC trong 20 phút. Khi phân lp vi khun phân gii photphat khĩ tan bng cách nuơi cy trên mơi trưng NBRIP , vi khun phân gii photphat khĩ tan vn sng, sinh trưng và phát trin đưc là do trong mơi trưng NBRIP cĩ cha Ca 3(PO 4)2 đây là mt trong nhng loi lân khĩ tan. Vì vy nhng khun lc mc lên, sinh trưng và phát trin tt trên mơi trưng NBRIP là nhng vi sinh vt cĩ kh năng phân gii lân khĩ tan thành lân d tan. Tin hành phân lp trên mơi trưng NBRIP : Pha lỗng các mu đt đn nng đ cn dùng. Hút 1 ml dch mu đã pha lỗng cho vào đĩa petri
30. 30 cha mơi trưng phân lp. Dùng que gt thy tinh đã vơ trùng phân phi dch mu tri đu khp mt thch. Nhúng que gt trong nưc ct vơ trùng ri hơ trên ngn la đèn cn, đ ngui ri tip tc gt mu cho đu khp mt thch các đĩa petri tip theo. Dùng băng keo dán kín mép ca cp đĩa, đt các đĩa petri đã cy vào t m nhit đ 30 0C. Sau 3 5 ngày, quan sát hình thái và đm s lưng khun lc ca vi khun. Vi sinh vt phân gii hp cht photphat khĩ tan đưc tính là s khun lc to vịng phân gii (vịng trịn trong sut) bao quanh khun lc trên đĩa petri cha mơi trưng nuơi cy đã chn. Đm s lưng t bào (CFU/ml) theo Trn Linh Thưc (2007) [30]. Đm tt c các khun lc xut hin trên các đĩa sau khi . Chn các đĩa cĩ s đm t 25 – 250 khun lc đ tính kt qu. Mt đ vi sinh vt phân gii photphat khĩ tan tng s đưc tính theo cơng thc: N A ( CFU / ml ) = n1Vf 1 + n iVf i Trong đĩ: A: s t bào (đơn v hình thành khun lc ) vi khun trong mt gram hay 1ml mu. N: là tng s khun lc đm đưc trên tt c các đĩa petri đã chn. ni: là s dĩa đưc gi li đ pha lỗng th i. V: Th tích dch mu (ml) cy vào trong mi đĩa. fi: đ pha lỗng tương ng. * Phương pháp pha lỗng dung dch Chun b ng nghim: Ly đ ng nghim cho mc đích pha lỗng. Ra sch ng nghim và sy kh trùng 160 0C trong 2 gi. Đt ng nghim vào bung cy vơ trùng và bt đèn cc tím trong 30 phút.
31. 31 Hút 9 ml nưc ct vơ trùng cho vào các ng. Cân 1 g đt trng khơ mn cho vào 100 ml nưc ct vơ trùng đã đưc hp kh trùng. Hịa tan mu. Hút 1 ml dung dch đã hịa tan cho vào ng th nht, lc đu. Sau đĩ, hút 1 ml dch t ng th nht sang ng th hai ri lc đu và c như vy tip tc hút sang các ng tip theo cho đn nng đ cn pha. Sau khi đưc dung dch cĩ nng đ cn thit ta tin hành cy ria mu lên các đĩa petri. * Phương pháp bo qun và gi ging thí nghim Bo qun và gi ging thí nghim bng cách cy truyn trong ng thch nghiêng và đĩa petri. Dùng que cy hơ trên ngn la đèn cn, đ ngui, sau đĩ gt nh lên ging gc ri ria lên mt thch ca ng và đĩa theo nhng hình dng khác nhau. Dùng nút bơng đã kh trùng nút kín ming ng, đu ng đưc gĩi kín bng báo đã đưc sy kh trùng. Ghi ngày tháng cy lên ng và đĩa, sau đĩ đ vào t m 30 0C. Sau 3 5 ngày, khi vi khun đã mc đu và mnh, gĩi bc ng ging và đ vào t lnh nhit đ khong 2 50C. Các ng ging cĩ th gi đưc trong thi gian là 1 2 tháng và phi cy truyn gi ging trong khong thi gian đĩ. * Phương pháp chun b ging thí nghim Chun b các bình tam giác cha 100 ml mơi trưng NBRIP đã đưc kh trùng đ hot hĩa ging. Dùng que cy ly ging t các ng ging quy nh vào các bình tam giác cho vi khun tan. Lc đu bng tay hoc dùng máy lc và đ hot hĩa trong 24 gi nhit đ phịng 26 28 0C. Khi tin hành các thí nghim tip theo, s dng ging t các bình này. Lưu ý: Tt c các dng c đu phi vơ trùng và mi thao tác phi đưc thc hin trong box cy vơ trùng. 2.2.2.2. Phương pháp đánh giá hot tính phân gii photphat khĩ tan Đánh giá hot tính phân gii photphat ca các chng vi sinh vt da 3 3 trên nng đ PO 4 cĩ trong dch nuơi cy. Nng đ PO 4 càng cao chng t lưng photphat khĩ tan b phân gii càng nhiu.
32. 32 Xác đnh hàm lưng photphat bng phương pháp Blue molipdate ca Olsen và Somner (1982). 3 Nguyên tc ca phương pháp là ion PO 4 s phn ng vi (NH 4)2SO 4 to ra phc cht (NH 4)2PO 4.12MoO 3 màu vàng. Trong mơi trưng axit và cĩ ion Sn 2+ phc màu vàng s chuyn thành phc màu xanh (NH 4)3(4MoO 2.2MoO 3): 3 + + PO 4 + 12(NH 4)2SO 4 + 24H = (NH 4)2PO 4.12MoO 3 + 21NH 4 + 12H 2O. 2+ + 4+ (NH 4)2PO 4.12MoO 3 + Sn + 16H = (NH 4)3(4MoO 2.2MoO 3) + Sn + 8H 2O Phc màu xanh cĩ bưc sĩng hp th cc đi 690nm. S dng máy UV Vis đo bưc sĩng 690nm đ xác đnh đ hp th màu ca phc cht. Đ hp th màu càng ln chng t nng đ ion PO 4 càng cao. Đ tính tương quan gia ch s mt đ quang (OD) và nng đ PO 4 cn thit lp phương trình tương quan gia hai ch s đĩ bng KH 2PO 4. S dng dung dch KH 2PO 4 5mg/l đ pha dãy nng đ theo bng sau: Th tích Nng đ PO 4 Th tích STT KH 2PO 4 5mg/l (mg/l) nưc ct (ml) (ml) 1 0 0 100 2 0,1 2 98 3 0,2 4 96 4 0,3 6 94 5 0,4 8 92 6 0,5 10 90 * Thuc th + Dung dch Molipdat amon trong H 2SO 4 10N a, 500ml H 2O ct, 280ml H 2SO 4 (d= 1,84) đ ngui;
33. 33 b, 25g Molipdat amon tinh th tinh khit hịa vào 200ml nưc ct đem đun 60 oC quy đu, nu cĩ cn thì lc tách đ ngui. Rĩt dung dch Molipdat amon vào dung dch axit, rĩt t t và khuy đu sau khi ngui thêm nưc ct thành 1 lit. + Dung dch SnCl 2.H 2O Ly 2,5g SnCl 2 hịa tan trong 24ml HCl (d=1,19) đem đun nĩng nh, sau khi ngui thêm nưc ct thành 100ml (Đưc dung dch SnCl 2 trong HCl 10% vi nng đ 25% SnCl 2). Thc hin phn ng xanh molipdate các nng đ KH 2PO 4 ri đo OD bưc sĩng 690nm. Đưng chun và phương trình tương quan gia ch s OD và nng đ mg/l đưc xây dng trên phn mm Excel. Chun b bình tam giác 250ml, mi bình cha 50ml mơi trưng NBRIP đã đưc kh trùng. Cy các chng vi sinh vt đã phân lp đưc vào và 60h, nhit đ phịng thí nghim 2628 oC. Sau đĩ, ly 1,5ml dch mơi trưng nuơi cy đem ly tâm 6000rpm trong 10 phút. Hút cn thn 1ml dch phía trên đ làm phn ng xanh molipdate : 1ml dch ni cng vi nưc ct cho đ 10ml. Sau đĩ thêm 0,4 ml molipdate và 1 git SnCl 2 , lc đu ri đ yên 5 phút cho 3 bn màu. Đo OD bưc sĩng 690nm, xác đnh nng đ PO 4 . Chn ra 3 chng vi sinh vt cĩ hot tính phân gii photphat khĩ tan mnh nht đ tip tc thí nghim. 2.2.2.3. Phương pháp quan sát hình thái khun lc và t bào To khun lc đơn trên đĩa thch: s dng k thut ria ch T (T streak), sau đĩ 30 oC trong 72h, quan sát hình thái khun lc vt kính 10x Khun lc s đưc xác đnh hình thái theo Nguyn Lân Dũng (1979). Mơ t các đc đim sau: hình dng, kích thưc, b mt, đc tính quang hc, màu sc, mt ct ngang [8].
34. 34 Làm tiêu bn t bào bng thuc nhum methyl blue và quan sát bng kính hin vi quang hc đ phĩng đi 40x ,100x. 2.2.2.4 Phương pháp th nghim hot tính phân gii photphat khĩ tan ca các chng vi sinh vt tuyn chn trên ngun AlPO 4 khĩ tan S dng mơi trưng NBRIP vi ngun photphat khĩ tan đưc thay đi là AlPO 4 (3,9g/l). Thc hin 2 lơ thí nghim: Lơ 1: s dng ngun photphat khĩ tan là Ca 3(PO 4)2. Mơi trưng đưc phân phi vào 9 ng nghim và mi ng cha 10ml mơi trưng, đem hp kh trùng 121 oC và 1atm. Cy ging vi sinh vt vào các ng mơi trưng, mi ging lp li 3 ln. Lơ 2: S dng ngun photphat khĩ tan là AlPO 4. Mơi trưng đưc phân phi vào 9 ng nghim, mi ng cha 10ml mơi trưng, đem hp kh trùng 121 oC và 1atm. Cy ging vi sinh vt vào các ng mơi trưng, mi ging lp li 3 ln. Sau 60h nuơi cy, nhit đ phịng thí nghim khong 26 – 28 oC, tin hành thu dch ni mơi trưng ca các ng nghim đ làm phn ng xanh molipdate, xác đnh nng đ PO 4. So sánh hot tính phân gii photphat khĩ tan khi s dng AlPO 4 vi đi chng là Ca 3(PO 4)2 lơ 1. 2.2.2.5. Phương pháp nghiên cu xây dng quy trình nuơi cy vi khun phân gii photphat khĩ tan + Nghiên cu nh hưng ca thành phn mơi trưng Lơ 1: S dng mơi trưng NBRIP. Mơi trưng đưc phi vào 6 bình tam giác 250ml, mi bình cha 100 ml mơi trưng, đem hp kh trùng 121 oC và 1atm. Cy các chng vi khun la chn đã hot hĩa vào các bình mơi trưng. Lơ 2: S dng mơi trưng NBRIP, tuy nhiên thành phn cha nitơ đưc thay đi. Ngun nitơ s dng là urê (0,053g/l). Mơi trưng đưc phân
35. 35 phi vào 6 bình tam giác 250ml, mi bình cha 100 ml mơi trưng, đem hp kh trùng 121 oC và 1atm. Cy các chng vi khun đã đưc hot hĩa vào các bình mơi trưng. Lơ 3: S dng mơi trưng NBRIP, tuy nhiên thành phn cha cacbon đưc thay đi. S dng ngun cacbon là saccharose (10g/l). Mơi trưng đưc phân phi vào 6 bình tam giác 250ml , mi bình cha 100ml mơi trưng, đem hp kh trùng 121 oC và 1atm. Cy các chng vi sinh vt đã đưc hot hĩa vào các bình mơi trưng. Sau 60h nuơi cy nhit đ phịng (26 28 oC), tc đ lc 150 rpm, tin hành phân tích mt đ vi khun bng cách đm s lưng khun lc hình thành trên thch đĩa theo phương pháp ca Koch. Thí nghim vi ba ln lp li. + Nghiên cu nh hưng ca pH đn sinh trưng ca vi khun La chn mơi trưng thích hp t thí nghim trên, cùng mt loi mơi trưng nhân ging ta tin hành chun đ pH ca mơi trưng bng cách s dng máy đo pH meter và hĩa cht chun đ là KOH 1N và HCl 1N. Thí nghim pH cĩ 5 cơng thc và 3 ln lp li: 5,5; 6,0; 7,0; 7,5 và 8,0. Lơ 1: Mơi trưng đưc điu chnh pH v giá tr 5,5 Lơ 2: Mơi trưng đưc điu chnh pH v giá tr 6,0 Lơ 3: Mơi trưng đưc điu chnh pH v giá tr 7,0 Lơ 4: Mơi trưng đưc điu chnh pH v giá tr 7,5 Lơ 5: Mơi trưng đưc điu chnh pH v giá tr 8,0 Mi lơ thí nghim, mơi trưng đưc phân phi vào 6 ng nghim, mi ng nghim cha 10ml mơi trưng. Sau đĩ hp kh trùng 121 oC và 1atm trong 20 phút, đ ngui và cy ging vi sinh vt đã hot hĩa vào 5 lơ. Sau 60h nuơi cy nhit đ phịng (2628 oC), tc đ lc 150 rpm, tin hành phân tích mt đ vi khun bng cách đm s lưng khun lc hình thành trên thch đĩa theo phương pháp ca Koch và đo pH mơi trưng sau nuơi cy
36. 36 + Nghiên cu nh hưng ca tc đ lc đn sinh trưng ca vi khun Chun b 3 lơ thí nghim, mi lơ thí nghim gm 06 ng nghim. Phân phi vào mi ng nghim10ml mơi trưng . Các điu kin nuơi cy khác là ti ưu t các thí nghim trên. Đem hp kh trùng 121 oC, 1atm trong 20 phút, đ ngui, cy ging vi sinh vt đã hot hĩa vào các bình mơi trưng. Mi lơ đưc lc các tc đ khác nhau: Lơ 1 : Lc tc đ 100rpm Lơ 2 : Lc tc đ 150rpm. Lơ 3 : Lc tc đ 200 rpm. Ch tiêu theo dõi: Sau 60h nuơi cy, tin hành phân tích mt đ vi sinh vt bng cách đm s lưng khun lc hình thành trên thch đĩa theo phương pháp ca Koch. Thí nghim vi ba ln lp li. + Nghiên cu nh hưng ca thi gian nuơi cy Chun b 6 bình tam giác 250ml. Phân phi vào mi bình tam giác 100ml mơi trưng nuơi cy. Các điu kin nuơi cy khác là ti ưu t các thí nghim trên. Đem hp kh trùng 121 oC, 1atm, thi gian 20 phút. Cy ging vi sinh vt vào các bình tam giác, mi ging cy 2 bình. Các bình ging đưc nuơi cy các khong thi gian 12h; 24h; 48h; 72h; 96h và 120h . Sau mi khong thi gian nuơi cy tin hành phân tích mt đ vi khun bng cách đm s lưng khun lc trên thch đĩa theo phương pháp ca Koch. Thí nghim đưc thc hin vi ba ln lp li. 2.2.2.6. Phương pháp xây dng quy trình nuơi cy vi khun phân gii photphat khĩ tan Da vào kt qu ca các nghiên cu trong ni dung 2.2.2.5 đ xây dng mơi trưng nuơi cy thích hp v các ch tiêu: Mơi trưng nuơi cy ti ưu pH mơi trưng ti ưu Tc đ lc ti ưu
37. 37 Thi gian nuơi cy ti ưu 2.2.2.7. Nghiên cu th nghim hot tính phân gii photphat khĩ tan trên cây lúa trng thí nghim trong chu Đi tưng nghiên cu: +Cây lúa ( Oryza sativa), ging lúa ML 48. + Các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan tuyn chn. Lúa đưc gieo trong chu (20 cây/chu), 5 chu đi chng; 3 chng chn lc đưc tin hành th nghim, mi chng th nghim cĩ 5 chu thí nghim, s dng 20 ml (10 8 CFU/ml) dung dch vi khun phân gii photphat khĩ tan tưi vào đt, ch đ chăm sĩc ca tồn thí nghim là như nhau. Đt s dng cho thí nghim trong chu là lp đt mt (010cm), mi chu cĩ khi lưng đt là 5 kg. Sau 1 tháng , 2 tháng , 3 tháng ly lá lúa đem phân tích hàm lưng N (phương pháp Kjieldahl), P tng s (phương pháp so màu blue molipdate) và đo chiu cao ca cây đ so sánh s sinh trưng và phát trin ca mi cơng thc. Khi lúa chín sáp tính năng sut ca lúa bng cách cân khi lưng tuơi, khơ ca tồn b sinh khi thân lá và r lúa và năng sut ca mi chu trong mi cơng thc. 2.2.2.8. Phương pháp x lý s liu thng kê S liu đưc phân tích thng kê theo phn mm MSTATC version 2.10 ca Đi hc bang Michigan. Các s liu đưc phân tích ANOVA và đưc trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,05 và 0,01. Đ th tương quan và phương trình tương quan gia ch s mt đ 3 quang OD và nng đ PO 4 đưc x lý trên phn mm EXCEL 2007 ca Microsoft, các biu đ khác cũng đưc x lý trên phn mm này.
38. 38 CHƯƠNG 3 KT QU NGHIÊN CU VÀ THO LUN 3.1. Phân lp các chng vi sinh vt phân gii photphat khĩ tan Phân lp tuyn chn chng vi sinh vt phân gii photphat t đt theo phương pháp nuơi cy pha lỗng trên mơi trưng đc. Khi đĩ, các chng vi sinh vt phân gii lân s to vịng phân gii, tc là vịng trịn trong sut bao quanh khun lc. Vịng phân gii đưc hình thành nh kh năng hịa tan hp cht photphat khơng tan đưc b sung vào mơi trưng nuơi cy. Trong phm vi đ tài này, đ phân lp vi sinh vt phân gii photphat khĩ tan chúng tơi s dng mơi trưng phân lp là mơi trưng NBRIP (Perez, 2007) [44]. Bng 3.1. Mt đ vi sinh vt phân gii photphat khĩ tan ba mu đt S khun lc các đ pha lỗng Mu đt Tng mt đ vi 10 2 10 3 sinh vt (CFU/ml) 129 32 Xám bc màu 14,8 x 10 4 157 38 95 25 Bazan nâu đ 9,3 x 10 4 75 28 117 33 Bazan dc t 11,7 x 10 4 104 27 NBRIP là mơi trưng ti thiu vì cĩ cha Ca 3(PO 4)2 là mt loi photphat khĩ tan. Trong mơi trưng này, đ cĩ th tn ti và phát trin thì vi khun phi cĩ kh năng phân gii hp cht lân khĩ tan thành dng d tan mi cĩ th cung cp đưc axit amin, tng hp protein cho cơ th
39. 39 chúng. mơi trưng NBRIP, vi sinh vt khơng đưc cung cp bt kì ngun lân d tan nào đ sinh trưng và phát trin, tt c tùy thuc vào kh năng phân gii ca chúng. Ch cĩ nhng cá th nào cĩ kh năng phân gii đưc Ca 3(PO 4)2 thì s tn ti và phát trin, ngưc li chúng s b đào thi. Kt qu đưc nêu trong bng 3.1 cho thy tng mt đ vi sinh vt cĩ kh năng phát trin trên mơi trưng NBRIP ca đt xám bc Ea Soup đt cao nht 14,8 x 10 4 CFU/ml. Sau đĩ là Hịa Phú ( Buơn Ma Thut) cĩ mt đ 11,7 x 10 4 CFU/ml. Cịn tng mt đ vi sinh vt phân gii photphat trong đt đ bazan Buơn Ma Thut thp nht: 9,3 x 10 4 CFU/ml. Kt qu này cũng tương t như nghiên cu ca Hu (2009) trên mt s loi đt ca Trung Quc. Tác gi cũng nghiên cu cho thy vai trị ca phân hu cơ đi vi mt đ vi sinh vt phân gii photphat khĩ tan [40]. Các khun lc s đưc phân loi sơ b da vào hình thái ca khun lc và hình thái t bào ca vi sinh vt. Bng 3.2. Các chng vi sinh vt phân gii photphat khĩ tan Nhĩm vi sinh vt Ký hiu chng Vi khun XB1, XB2, XB3, XB4, NĐ1, NĐ2, NĐ3, NĐ4, DT1, DT2 Mu đt xám bc màu Ea Soup phân lp đưc 4 chng vi sinh vt. Mu đt bazan nâu đ thành ph Buơn ma Thut đưc 4 chng. Mu đt bazan dc t xã Hịa Phú, Buơn Ma Thut đưc 2 chng. Như vy, mu đt xám bc màu và mu đt bazan nâu đ cĩ s lưng các chng vi sinh vt phân gii photphat khĩ tan nhiu nht. Đc đim hình thái khun lc ca 10 chng vi khun phân gii photphat khĩ tan đưc mơ t trong bng 3.3.
40. 40 Bng 3.3. Hình thái khun lc ca10 chng vi sinh vt tuyn chn Ký Hình thái khun lc sau 3 ngày nuơi cy hiu ĐT Màu HD KT B mt MKL MCN CT chng QH sc Bng Ht XB1 Trịn 2,5mm Trơn Đc Trng Li phng ln Trịn 2 – 3 Gh Lưn Li Ht XB2 răng Đc Nâu mm gh Sĩng cong nh cưa Gh Li Ht XB3 Trịn 4 mm Đc Si Trng gh cong nh Gh Lưn Ht XB4 Trịn 1mm Đc Vàng Phng gh Sĩng nh Trịn Bng Ht NĐ1 răng 3mm Trơn Đc Trng Li phng ln cưa Gh Lưn Ht NĐ2 Trịn 1,5mm Đc Trng Phng gh Sĩng ln Li Ht NĐ3 Trịn 1,5mm Trơn Đc Si Trng cong nh Bng Vàng Li Đng NĐ4 Trịn 1mm Trơn Đc phng nht cong nht Trịn Gh Lưn Vàng Đng DT1 răng 1,5cm Đc Phng gh Sĩng nht nht cưa Trịn Bng Ht DT2 1mm Trơn Đc Trng Li phng nh
41. 41 Ghi chú:HD: hình dng; KT: kích thưc; ĐTQH: đc tính quang hc; MCN: mt ct ngang; CT: cu trúc . 3.2.Nghiên cu đánh giá hot tính phân gii photphat khĩ tan ca các chng vi sinh vt 3.21. Xây dng đưng chun và phương trình tương quan gia ch s 3 OD và nng đ mg/l ca dung dch PO 4 Trong nghiên cu này, chúng tơi s dng phương pháp blue molypdate đ đánh giá kh năng phân gii photphat khĩ tan ca các chng vi sinh vt. Do đĩ vic dng đưng chun và phương trình tương quan gia ch s OD và 3 nng đ mg/l ca dung dch PO 4 là cn thit cho các đánh giá sau này cũng như cĩ th so sánh kt qu ca nghiên cu này vi các nghiên cu khác. KH 2PO 4 đưc pha các nng đ khác nhau ri thc hin phn ng xanh molipdate. Kt qu th hin qua bng 3.4 như sau: Bng 3.4. Ch s OD ca các nng đ KH 2PO 4 khác nhau STT Nng đ KH 2PO 4 (mg/l) Ch s OD 690nm 1 0,5 0,872 2 0,4 0,699 3 0,3 0,513 4 0,2 0,355 5 0,1 0,163 6 0 0 Đưng chun và phương trình tương quan gia ch s OD và nng đ 3 mg/l ca dung dch PO 4 đưc th hin qua hình 3.1
42. 42 Đ TH ĐƯNG CHUN y = 1.7503x 0.0039 R2 = 0.9996 1 0.9 0.8 0.7 Series1 0.6 0.5 0.4 0.3 Linear C H S OD 0.2 (Series1) 0.1 0 0.1 0 0.2 0.4 0.6 NNG Đ Hình 3.1. Đ th đưng chun ca dung dich photphat Theo đ th 3.1, phương trình tương quan gia ch s OD và nng đ mg/l ca dung dch PO 4 là: y = 1,7503x 0,0039 3 Trong đĩ: x là nng đ PO 4 (mg/l). y là ch s OD. 3.2.2. Đánh giá và tuyn chn các chng vi sinh vt cĩ hot tính phân gii photphat khĩ tan cao Các chng vi sinh vt khác nhau cĩ kh năng phân gii photphat khĩ tan khơng ging nhau. Vì vy, đánh giá kh năng phân gii ca tng chng là rt cn thit. Chúng tơi tin hành nuơi 10 chng vi sinh vt trong mơi trưng NBRIP lng trong 60h, sau đĩ xác đnh nng đ PO 4 đưc phân gii. Kt qu v kh năng phân gii photphat khĩ tan ca 10 chng vi sinh vt đưc ghi nhn trong bng 3.5.
43. 43 Bng 3.5. Hot tính phân gii photphat khĩ tan ca 10 chng vi sinh vt STT Ký hiu chng Nng đ PO 4 mg/l 1 XB1 12,7b 2 XB2 7,92d 3 XB3 7,11 e 4 XB4 7,62 d 5 NĐ1 16,33 a 6 NĐ2 10,71 c 7 NĐ3 7,01 e 8 NĐ4 6,11 f f 9 DT1 5,88 10 DT2 7,013e (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01) Qua kt qu bng 3.5 chúng tơi xác đnh kh năng phân gii photphat khĩ tan ca 10 chng vi sinh vt như sau: kh năng phân gii photphat khĩ tan ca 10 chng vi sinh vt đưc chia thành 6 nhĩm theo th t t cao đn thp: a, b, c, d, e, f. Trong đĩ nhĩm a cĩ chng NĐ1 cĩ nng đ PO 4 phân gii cao nht 16,33 mg/l, nhĩm b là chng XB1cĩ nng đ PO 4 phân gii 12,7 mg/l, nhĩm c là chng NĐ2 cĩ nng đ PO 4 phân gii là 10,71 mg/l. nhĩm d cĩ chng XB2, XB4 cĩ nng đ PO 4 phân gii ln lưc là 7,92mg/l, 7,62mg/l , nhĩm tip theo là nhĩm e cĩ các chng XB3, NĐ3 , nng đ PO 4 phân gii khá thp 7,11mg/l, 7,01mg/l. Nhĩm f gm chng NĐ4 và DT1 là nhĩm cĩ nng đ PO 4 phân gii thp nht 6,11mg/l và 5,88mg/l. S khác bit v kh năng phân gii photphat khĩ tan ca các chng là cĩ ý nghĩa thng kê.
44. 44 Kt qu nghiên cu này tương đương vi nghiên cu ca Vũ Thuý Nga và Nguyn Ngc Quyên (2003). Matias và cng s (2009) nghiên cu kh năng phân gii photphat khĩ tan Brasil ca các chng nm cĩ hot tính khá 3 mnh t 2060 mg PO 4 /lit sau 5 ngày . Hot tính phân gii photphate khĩ tan tuỳ thuc vào chng, sinh thái đt và ch đ canh tác [42] Kh năng phân gii photphate khĩ tan ca các chng vi sinh vt đưc th hin qua biu đ 3.1: 18 16 14 12 10 Series1 8 6 NngPO4(mg/l) đ 4 2 0 XB1 XB2 XB3 XB4 NĐ1 NĐ2 NĐ3 NĐ4 DT1 DT2 Chng vi sinh vât Hình 3.2 Biu đ kh năng phân gii photphat khĩ tan ca 10 chng vi sinh vt Như vy đã xác đnh đưc 3 chng vi sinh vt cĩ kh năng phân gii photphat cao là XB1, NĐ1, NĐ2 . Trong các thí nghim tip theo chúng tơi chn các chng này đ làm đi tưng nghiên cu. 3.3. Đc đim sinh hc ca các chng vi sinh vt tuyn chn Ba chng vi sinh vt tuyn chn s đưc cy ria ch T trên đĩa petri. Sau 3 ngày, chúng tơi
45. 45 làm tiêu bn t bào đ xem trên kính hin vi. Tiêu bn t bào đưc quan sát vt kính 40x, 100x. Bng 3.6. Hình thái t bào ca 3 chng vi sinh vt tuyn chn đưc Ký hiu Hình thái t bào sau 3 ngày nuơi cy chng Hình dng Kích thưc NĐ2 Hình cu 1 – 2m NĐ1 Hình que 3 – 4m. XB1 Hình cu 5 – 6m x 23m 3.4. Th nghim hot tính phân gii photphat khĩ tan ca các chng vi sinh vt tuyn chn trên ngun photphat nhơm Đt bazan nâu đ cĩ hàm lưng photphat tng s rt giàu, nhưng photphat d tiêu rt thp. Photphat khĩ tan ch yu tn ti dng photphat st và photphat nhơm (Nguyn Tin S, 2010). Theo Lê Hng Lch (2009) cơng b thì trên 90% phân lân bĩn vào đt bazan đu b c đnh dng khĩ tan. Chính vì vy, vic nghiên cu tìm ra các chng vi sinh vt cĩ kh năng phân gii photphat st và photphat nhơm cĩ ý nghĩa đc bit quan trng. Chúng tơi tin hành thí nghim trên 2 lơ: lơ1 s dng Ca 3(PO 4)2 đ làm đi chng. Lơ 2 s dng AlPO 4. Kt qu th hin trong bng 3.7: Bng 3.7. Kh năng phân gii photphat khĩ tan ca 3 chng vi sinh vt đưc tuyn chn trên ngun photphat là Ca 3(PO 4)2 và AlPO 4 . 3 Đơn v: mgPO 4 /l Ngun photphat Ca 3(PO 4)2 AlPO 4 Ký hiu chng XB1 12.05 b 3.910 c NĐ1 16.31 a 9.100 b NĐ2 9.78 b 1.590 c
46. 46 ( Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt hàng khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01). Qua bng 3.7 cho thy c ba chng tuyn chn đu cĩ kh năng phân gii photphat khĩ tan trên ngun photphat là AlPO 4. Mc dù hot tính phân gii trên ngun photphat nhơm thp hơn photphat canxi. Trong ba chng tuyn chn, cĩ chng NĐ1 cĩ hot tính phân gii photphat nhơm cao nht (9,1 3 mg PO 4 /l). Kt qu này cao hơn nhiu so vi nghiên cu ca Chang (2009) trên mt s chng nm Aspergillus fumigatus và Streptomyces, Bacillus licheniformis cĩ hot tính phân gii AlPO 4 t 12mg/l [35]. Điu này rt cĩ ý nghĩa khoa hc, cũng như thc tin. Kt qu th hin rõ trong biu đ 3.3: 18 16 14 12 10 Ca3(PO4)2 8 ALPO4 Nng6 đ PO4 4 2 0 XB1 NĐ1 NĐ2 Chng vi sinh vt Hình 3.3. Biu đ kh năng phân gii photphat khĩ tan ca 3 chng vi sinh vt đưc tuyn chn trên ngun photphat là Ca 3(PO 4)2 và AlPO 4
47. 47 3.5. Xây dng qui trình nuơi cy các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan XB1, NĐ1, NĐ2 3.5.1 Xác đnh mơi trưng nuơi cy thích hp vi s sinh trưng, phát trin cu các chng vi khun XB1, NĐ1, NĐ2. Đ cĩ cơ s khoa hc cho vic gi ging, nghiên cu quy trình sn xut và s dng các ch phm vi sinh vt phân gii photphat khĩ tan, cn phi nm rõ các đc đim sinh hc ca các chng và dinh dưng là mt trong nhng đc đim đĩ. Dinh dưng là yêu cu cn thit đi vi mi lồi sinh vt sng. Vi khun phân gii photphat khĩ tan cũng vy, các ngun dinh dưng khác nhau đu nh hưng đn s sinh trưng và phát trin ca chúng. Vì vy, chúng tơi tin hành nuơi cy các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan XB1, NĐ1, NĐ2 đã đưc hot hĩa trên 3mơi trưng là: Mơi trưng NBRIP làm đi chng và MT1(NBRIP nhưng ngun nitơ là urê), MT2 (NBRIP nhưng ngun cacbon là sascarose) đ xác đnh mơi trưng nào thích hp hơn cho vic nhân sinh khi t bào. Các thí nghim đu tin hành nhit đ phịng thí nghim 26 28 0C và đt trên máy lc 150 vịng/phút, thi gian nuơi cy là 60h .Sau đĩ ly dung dch nuơi cy pha lỗng các nng đ khác nhau (10 1 10 8) ri 1ml dch pha lỗng lên mơi trưng NBRIP dng thch đĩa . Sau 2 đn 3 ngày tin hành phân tích mt đ vi khun bng cách đm s lưng khun lc hình thành trên thch đĩa theo phương pháp ca Koch. Áp dng cơng thc tính mt đ t bào đ xác đnh s sinh trưng ca các chng vi khun XB1, NĐ1 và NĐ2, kt qu đưc trình bày bng 3.8:
48. 48 Bng 3.8. nh hưng ca thành phn mơi trưng nuơi cy đn mt đ ca các chng vi khun XB1, NĐ1và NĐ2 (CFU/ml) Chng vi khun Mơi trưng Mơi trưng Mơi trưng NBRIP MT1 MT2 XB1 3.07x10 8 ab 1.56x10 8 bc 0.99x10 8c NĐ1 3.87x10 8 a 1.29x10 8 bc 1.31x10 8bc NĐ2 3.00x10 8 ab 1.10x10 8 c 1.05x10 8c ( Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt hàng khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01). Kt qu bng 3.8 cho thy thành phn mơi trưng đã nh hưng đn s sinh trưng và phát trin ca vi sinh vt, th hin trong biu đ hình 3.4. 4 3.5 3 2.5 XB1 2 NĐ1 1.5 NĐ2 1 Mt 0.5đ vi sinh vt(CFU/m l) 0 NBRIP MT1 MT2 Mơi trưng nuơi cy Hình 3.4. Biu đ nh hưng ca thành phn mơi trưng đn sinh trưng ca các chng vi khun đã la chn Như vy c 3 mơi trưng đu cĩ mt Ca 3(PO 4)2, đây chính là yu t gii hn s sinh trưng, phát trin ca vi khun phân gii photphat khĩ tan.
49. 49 Ch cĩ nhng vi khun nào cĩ th phân gii Ca 3(PO 4)2 thì mi cĩ kh năng tn ti và phát trin, ngưc li s b đào thi. Mt khác vi sinh vt cĩ th s dng nitơ, cacbon t nhiu ngun khác nhau. Tuy nhiên, khơng phi ngun nitơ, cacbon nào cũng thích hp cho vi sinh vt phát trin. Vì vy, xác đnh ngun nitơ cũng như ngun cacbon thích hp cho nuơi cy vi sinh vt là rt cn thit. Trong trưng hp này mt đ t bào mơi trưng NBRIP cao hơn so vi 2 mơi trưng kia cĩ th do nguyên nhân là s t hp nhng yu t mơi trưng NBRIP thích hp cho s sinh trưng và phát trin ca vi khun phân gii photphat khĩ tan hơn là t hp nhng yu t trong mơi trưng MT1 và MT2. Chính lí do này đã chi phi to nên mt mơi trưng thun li giúp cho vi khun tăng nhanh v sinh khi. Da vào kt qu bng 3.8 chúng tơi thy rng mơi trưng NBRIP là mơi trưng thích hp cho vic nuơi cy và thu sinh khi ca các chng vi khun XB1, NĐ1 và NĐ2 . Trong các thí nghim sau, chúng tơi ch s dng mơi trưng NBRIP là mơi trưng nhân ging nuơi cy các chng vi khun XB1, NĐ1 và NĐ2. 3.5.2. nh hưng ca pH mơi trưng đn s sinh trưng và phát trin ca các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan XB1, NĐ1 và NĐ2 Phn ng ca mơi trưng cĩ nh hưng khá rõ rt đi vi hot đng sng ca vi sinh vt. Gii hn pH thích ng ca tng loi vi sinh vt rt khác nhau. Mt s loi vi sinh vt cĩ th phát trin trong các mơi trưng axit, ngưc li cũng cĩ mt s loi thích hp vi mơi trưng cĩ pH trung tính hoc mơi trưng kim cho nên vic xác đnh pH thích hp đi vi vi khun phân gii photphat khĩ tan là điu cn thit. Bên cnh đĩ, nng đ các ion H + và OH nh hưng trc tip đn quá trình trao đi cht ca t bào, làm nh hưng đn din tích b mt và mc đ hồ tan ca mt s mui khống (lân, kali, magiê, mt s nguyên t vi lưng). Ngồi ra, pH ca mơi trưng cịn nh hưng đn
50. 50 các sn phm hot đng sng ca vi sinh vt và đn quá trình sinh trưng, phát trin ca chúng, cho nên xây dng pH thích hp cho quá trình nhân nuơi vi khun là rt quan trng. Đ thăm dị nh hưng ca pH mơi trưng đn s sinh trưng và phát trin ca các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan XB1, NĐ1 và NĐ2 đã chn , chúng tơi tin hành nuơi cy các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan đã chn trên mơi trưng nhân ging 5 mc pH khác nhau: 5,5 ; 6,0 ; 7,0 ; 7,5 và 8,0. Thí nghim đưc tin hành nhit đ phịng thí nghim 26 28 0C, tc đ lc 150 vịng/phút. Sau 60 gi nuơi cy, chúng tơi ly dung dch nuơi cy đem pha lỗng các nng đ khác nhau (10 1 – 10 8) ri ri 1ml dch pha lỗng lên mơi trưng NBRIP dng thch đĩa. Sau 2 đn 3 ngày tin hành phân tích mt đ vi khun bng cách đm s lưng khun lc hình thành trên thch đĩa theo phương pháp ca Koch. Áp dng cơng thc tính mt đ t bào đ xác đnh s sinh trưng ca các chng vi khun XB1, NĐ1 và NĐ2, k t qu đưc trình bày bng 3.9: Bng 3.9. nh hưng ca pH mơi trưng nuơi cy đn mt đ ca các chng vi sinh vt XB1, NĐ1và NĐ2 (CFU/ml) Kí hiu pH ca mơi trưng nuơi cy chng 5,5 6,0 7,0 7,5 8,0 XB1 0,82x10 8fg 1,22x10 8de 2,74x10 8b 1,26x10 8de 0.008x10 8h NĐ1 0,92x10 8f 1,28x10 8de 2,99x10 8a 1,53x10 8de 0.009x10 8h NĐ2 0,70x10 8g 1,33x10 8d 2,57x10 8c 1,15x10 8e 0.008x10 8h ( Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt hàng khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01).
51. 51 3.5 3 2.5 2 XB1 NĐ1 1.5 NĐ2 1 Mt đ t bào (CFU/ml) bào t đ Mt 0.5 0 5.5 6 7 7.5 8 pH Hình 3.5. Biu đ nh hưng ca pH mơi trưng đn sinh trưng và phát trin ca 3chng vi sinh vt phân gii photphat đưc tuyn chn. T kt qu ghi nhn đưc bng 3.9, chúng tơi thy rng pH cĩ nh hưng rõ rt đn s sinh trưng, phát trin ca các chng vi khun XB1, NĐ1 và NĐ2. C th là mt đ t bào vi khun tăng dn t pH = 5,5 đn pH = 6,0 và đt s lưng mt đ t bào cao nht pH = 7,0, sau đĩ gim dn khi pH = 7,5 và thp nht khi pH = 8,0. Kt qu này hồn tồn phù hp vi kt qu nghiên cu ca nhiu tác gi đĩ là vi khun nĩi chung sinh trưng và phát trin tt mơi trưng cĩ pH trung tính t 6,5 đn 7,5. Vi khun phân gii photphat khĩ tan cũng nm trong gii hn đĩ khi chúng tơi nghiên cu. Và mt khác, trong quá trình nghiên cu chúng tơi tin hành đo pH mơi trưng sau 60 gi nuơi cy và nhn thy rng trong quá trình nuơi cy thì pH mơi trưng gim rõ rt, kt qu đưc ghi nhn bng 3.10.
52. 52 Bng 3.10. Giá tr pH ca dch nuơi cy vi khun trong các mơi trưng cĩ pH ban đu khác nhau. pH sau nuơi cy pH ban đu XB1 NĐ1 NĐ2 5,5 4,61 4,93 4,79 6,0 4,76 4,56 4,81 7,0 5,53 4,60 4,43 7,5 5,40 5,01 4,58 8,0 5,00 5,40 5,10 Kt qu bng 3.10 cho thy trong quá trình nuơi cy vi khun phân gii photphat khĩ tan , hot đng ca chúng đã tit ra axit làm cho pH dung dch gim đi nhanh chĩng. Điu này chng minh rng vi khun XB1, NĐ1, NĐ2 đã hot đng mnh m trong quá trình phân gii photphat khĩ tan thành d tan. Mt khác các giá tr pH trong dch nuơi cy vi sinh vt gim so vi pH ban đu, nhưng đu khơng thp hơn 4, chng t các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan đưc la chn nghiên cu khơng gây axit hĩa mnh cho mơi trưng. 3.5.3. nh hưng ca tc đ lc đn s sinh trưng và phát trin ca các chng vi khun XB1 , NĐ1 và NĐ2 Vi khun phân gii photphat khĩ tan là lồi vi khun k khí khơng bt buc nên khi cĩ oxy chúng thc hin quá trình hơ hp hiu khí ging như các vi sinh vt hiu khí khác, vì th nhu cu v oxy ca chúng là rt ln. Nh oxy, vi khun cĩ th tin hành các quá trình hơ hp, trao đi cht, trao đi năng lưng vi mơi trưng bên ngồi. Vì vy, hàm lưng oxy trong mơi trưng sng cĩ nh hưng ln đn s sinh trưng và phát trin ca chúng.
53. 53 Trong các thí nghim, các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan XB1, NĐ1 và NĐ2 đưc nuơi cy mơi trưng dch th, mơi trưng này s hn ch vic s dng oxy ca vi khun. Khi nhân nuơi và thc hin các thí nghim, các bình nuơi cy luơn đưc lc tc đ 150 vịng/phút đ cung cp oxy hịa tan cho vi khun. Tuy nhiên, đ tìm hiu nh hưng ca tc đ lc đn sinh trưng và phát trin ca các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan XB1, NĐ1 và NĐ2, chúng tơi tin hành nuơi cy các chng vi khun trên mơi trưng NBRIP lng, pH = 7 , nhit đ phịng thí nghim 26 – 28 oC và đt 3 tc đ lc khác nhau là 100, 150, 200 vịng/phút. Sau 60 gi nuơi cy chúng tơi ly dung dch nuơi cy đem pha lỗng các nng đ khác nhau ( 10 1 10 8 ) ri ri 1ml dch pha lỗng lên mơi trưng NBRIP dng thch đĩa. Sau 2 đn 3 ngày tin hành phân tích mt đ vi khun bng cách đm s lưng khun lc trên thch đĩa theo phương pháp ca Koch. Áp dng cơng thc tính mt đ t bào đ xác đnh s sinh trưng ca các chng vi khun XB1, NĐ1 và NĐ2, kt qu đưc ghi nhn bng 3.11: Bng 3.11. nh hưng ca tc đ lc đn sinh trưng ca các chng vi khun XB1, NĐ1 và NĐ2 Kí hiu chng Mt đ vi khun (CFU/ml) các tc đ lc 100rpm 150rpm 200rpm XB1 1,28x10 9 d 1,47x10 9cd 2,46x10 9ab NĐ1 1,46x10 9cd 1,78x10 9bcd 2,80x10 9a NĐ2 1,18x10 9d 1,34x10 9c 2,26x10 9ab ( Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt hàng khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01) T bng 3.11 xây dng biu đ v nh hưng ca tc đ lc đn mt đ ca các chng vi khun.Ta thy mt đ t bào ca các chng vi khun phân
54. 54 gii photphat tăng dn theo tc đ lc ca bình nuơi và đt cc đi 200 vịng/phút. 3 2.5 2 XB1 1.5 NĐ1 NĐ2 1 0.5 Mt đ vi sinh vt (CFU/ml) 0 100 150 200 Tc đ lc (v/p) Hình 3.6. Biu đ nh hưng ca tc đ lc đn sinh trưng ca các chng vi khun Như vy vi khun phân gii photphat khĩ tan là lồi vi khun k khí khơng bt buc, nên khi đưc cung cp oxy s làm tăng kh năng trao đi gia cơ th vi mơi trưng bên ngồi giúp vi khun thun li trong quá trình sinh trưng và phát trin. T đĩ dn đn sinh khi ca chúng gia tăng. Mt khác, khi nhân nuơi chúng trong mơi trưng dch th s dn đn s hn ch tip xúc gia vi khun và oxy, cho nên khi tc đ lc ca bình càng cao s làm cho kh năng hịa tan hàm lưng oxy trong dung dch càng mnh, vi khun càng cĩ nhiu oxy cho quá trình hơ hp, sinh trưng và phát trin. Vì vy, tc đ lc là 200 vịng/phút thì mt đ vi khun đt cao nht khi chúng tơi kho sát.Tuy nhiên, tc đ lc cũng cĩ mt gii hn nht đnh cho nên cn tip tc nghiên cu tăng tc đ lc cho phù hp vi mc đích và điu kin nghiên cu. Vì điu kin thí nghim cĩ gii hn nên chúng tơi ch nghiên cu 3 tc đ lc 100, 150 và 200 vịng/phút .
55. 55 3.5.4. nh hưng ca thi gian nuơi cy đn s sinh trưng và phát trin ca các chng vi khun phân gii photphat tuyn chn Mi lồi vi khun sinh trưng, phát trin theo mt quy lut nht đnh. Chính vì th, khi nghiên cu cn nm rõ quá trình này đ xác đnh các thi đim thích hp cho các cơng đon nghiên cu tip theo. Đ nghiên cu s sinh trưng và phát trin ca các chng vi sinh vt đã la chn chúng tơi tin hành nuơi cy chúng trong bình tam giác 250ml vi các điu kin nuơi cy: mơi trưng nuơi cy NBRIP lng, pH = 7, nhit đ phịng thí nghim 2628 oC, tc đ lc 200 vịng / phút vi các khong thi gian nuơi cy 12h, 24h, 48h, 72h, 96h và 120h . Sau nhng khong thi gian nuơi cy chúng tơi ly dung dch nuơi cy pha lỗng các nng đ khác nhau (10 1 10 8) ri 1ml dch pha lỗng lên mơi trưng NBRIP dng thch đĩa. Sau 2 đn 3 ngày tin hành phân tích mt đ vi khun bng cách đm s lưng khun lc trên thch đĩa theo phương pháp ca Koch. Áp dng cơng thc tính mt đ t bào đ xác đnh s sinh trưng ca các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan XB1, NĐ1 và NĐ2. Kt qu thu đưc bng 3.12: Bng 3.12. nh hưng ca thi gian nuơi cy s sinh trưng và phát trin ca các chng vi sinh vt phân gii photphat đã la chn Thi gian Mt đ vi khun phân gii photphat khĩ tan ( 10 9 CFU/ml) nuơi cy XB1 NĐ1 NĐ2 12h 0,80 b 0,69 c 0,80 b 24h 0,89 b 0,85 bc 0,85 b 48h 1,35 b 1,53 ab 1,33 ab 72h 2,25 a 2,32 a 2,03 a 96h 2,14 a 2,19 a 1,97 a 120h 1,41 b 1,51 ab 1,29 ab
56. 56 (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01) Theo kt qu thu nhn đưc bng 3.12 chúng tơi nhn thy chng vi khun phân gii photphat khĩ tan XB1, mt đ t bào sau 12 gi nuơi cy là 0,08. Đn 24 gi mt đ ca chúng tăng nh 0,89 và đn 48 gi mt đ ca chúng đã tăng lên nhanh chĩng đt 1,35. Đn 72 gi mt đ ca chúng đã đt cc đi là 2,25. Sau đĩ, mt đ t bào ca chúng đã bt đu gim nh 96 gi cịn 2,14 và đn 120 gi thì mt đ t bào bt đu gim mnh.Tương t đi vi chng NĐ1 mt đ t bào sau 12h nuơi cy là 0,65. Đn 24h mt đ tăng lên 0,85 và đn 48 gi mt đ ca chúng đã tăng lên nhanh chĩng đt 1,53. Đn 72 gi mt đ ca chúng đã đt cc đi 2,34 và n đnh sau đĩ mt đ gim nh 96 gi cịn 2,20 và đn 120 gi mt đ t bào cũng gim mnh cịn 1,51. Cịn chng vi khun NĐ2 mt đ t bào sau 12,24 gi nuơi cy ln lưt là 0,80; 0,85 đn 48 gi mt đ t bào tăng lên nhanh chĩng đt 1,33 và mt đ t bào cũng đt cc đi 72 gi là 2,03, sau đĩ gim nh 96 gi cịn 1,97. Đn 120 gi mt đ t bào gim mnh cịn 1,23. Ta cĩ đ th đưng cong sinh trưng ca các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan đưc tuyn chn như sau.
57. 57 2.5 2 XB1 1.5 NĐ1 NĐ2 1 0.5 Mt đt bào ( CFU/ml) 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Thi gian nuơi cy (h) Hình 3.7. Đ th đưng cong sinh trưng ca các chng vi khun đưc tuyn chn Qua hình 3.7 chúng tơi nhn thy rng s sinh trưng và phát trin ca các chng vi sinh vt nuơi cy trong mơi trưng dch th tri qua 4 pha là: Pha tim phát (pha lag): Pha này đưc tính t lúc bt đu cy vi khun vào bình cho đn khi chúng bt đu sinh trưng. Trong pha này s lưng vi khun chưa nhiu do lúc này t bào mi bt đu tăng v trng lưng và th tích, đng thi trong pha này chúng phi tng hp ADN và các enzyme cn thit cho s phân bào. Pha lũy tha ( pha log): Trong giai đon này, vi khun tăng nhanh v trng lưng đng thi ln nhanh v kích thưc, chúng tng hp mnh m nhng cht cn thit cho quá trinh sinh trưng và phát trin. Pha cân bng: Trong pha này tc đ sinh trưng và trao đi cht ca vi khun gim dn, s lưng t bào đt cc đi đã đi vào n đnh dn v hình thái. S lưng t bào sinh ra cân bng s lưng t bào cht đi. Mt s nguyên nhân khin vi khun chuyn sang pha cân bng như cht dinh dưng bt đu cn kit , các cht đc tích lũy, pH thay đi
58. 58 Pha suy vong: S lưng t bào cht vưt tri s lưng t bào mi đưc to thành nguyên nhân do cht dinh dưng cn kit, cht đc hi tích lũy nhiu Như vy ti thi đim 72 gi sau nuơi cy, s lưng vi khun tăng nhanh, mt đ cc đi và bt đu đi vào giai đon n đnh cho nên vi mc đích thu sinh khi t bào, s tin hành vào thi đim 72h sau nuơi cy. 3.5.5. Xây dng quy trình nuơi cy nhân sinh khi các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan XB1, NĐ1 và NĐ2 T kt qu ca các thí nghim trên và qua phân tích tho lun, chúng tơi đã xác đnh đưc các điu kin nuơi cy thích hp cho các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan XB1, NĐ1, NĐ2 vi mc đích thu sinh khi t bào là: Mơi trưng nuơi cy là mơi trưng NBRIP pH=7,0 là pH thích hp đ nuơi cy. Tc đ lc đt sinh khi 200 vịng/phút. Trong quá trình nuơi cy đ thu đưc sinh khi t bào cao nht và tránh lãng phí, cn chn thi đim thu phù hp. Vì vy qua các thí nghim chúng tơi thy rng: Thi đim thu sinh khi tt nht đi vi các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan XB1, NĐ1, NĐ2 là 72h. T kt qu này, chúng tơi đã xây dng mt quy trình nuơi cy nhân sinh khi vi quy mơ nh( như nghiên cu trong phịng thí nghim) các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan mà chúng tơi đã phân lp đưc mt s mu đt ca Đak Lak, đt hiu qu cao nht qua sơ đ:
59. 59 Sơ đ: Tĩm tt quy trình nuơi cy nhân sinh khi các chng vi khun phân gii phosphat khĩ tan XB1, NĐ1, NĐ2 Chun b mơi trưng nuơi cy (mơi trưng NBRIP lng) Ging gc (Ging cp I) Đ 100ml mơi trưng vào các bình tam giác 250ml Mơi trưng hot hĩa là NBRIP lng (Thi gian hot hĩa 24h) Kh trùng mơi trưng t=120 0C, 1atm trong 30 phút Cy ging ( Lưng ging khong 510% mơi trưng nuơi cy) Mơi trư ng nuơi cy l à NBRIP lng, pH mơi trưng: 7, Nhit đ: 28 26 oC, Tc đ lc: 200 vịng/phút, Thi gian nuơi: 72 gi Thu sinh khi (Hp ph lên cht mang, s dng và bo qun)
60. 60 3.6. Nghiên cu th nghim hot tính phân gii photphat khĩ tan trên cây lúa Như chúng ta đã bit, đi vi vi khun nuơi cy n đnh trong phịng thí nghim khơng phi chu nhiu tác đng bt li ca mơi trưng, nên nu chuyn sang mt mơi trưng mi thì s gp rt nhiu khĩ khăn. Mơi trưng mi này luơn cha đng nhng yu t bt ng và bt li cho s thích nghi, cũng như s sinh trưng, phát trin ca vi khun. Ch cĩ nhng cá th thích nghi đưc mi tn ti và phát trin, ngưc li chúng s b đào thi. Khi đã tn ti và n đnh, chúng s bt đu sinh trưng, phát trin làm cho s lưng vi khun tăng lên đáng k, đây là ngun dinh dưng cung cp cho cây trng đem li hiu qu cao. Mt khác, do h vi sinh vt trong đt rt đa dng và mi vi sinh vt trong đt đu chu nhiu tác đng qua li ca các vi sinh vt khác cũng như điu kin mơi trưng nên hiu qu ca sn phm vi sinh trong các điu kin khác nhau là khơng ging nhau. Thí nghim đưc b trí gm 4 cơng thc trong 20 chu đt, mi chu cĩ 5kg đt đ bazan trng 20 cây lúa (ging ML48). Mi cơng thc b trí 5 ln lp li . Sau khi gieo ht 10 ngày, tin hành tưi vào đt 20 ml dung dch nuơi cy vi khun phân gii photphat khĩ tan tuyn chn đưc (10 8 CFU/ml). Sau 1tháng, 2 tháng và 3 tháng ly lá lúa phân tích hàm lưng N và P tng s và tin hành đo chiu cao ca lúa. Kt qu đưc trình bày các bng 3.13.
61. 61 Bng 3.13. nh hưng ca ch phm vi khun phân gii photphat khĩ tan ti hàm lưng N ca cây lúa . Cơng 1 tháng 2 tháng 3 tháng thc % cht % so vi % cht % so vi % cht % so vi khơ ĐC khơ ĐC khơ ĐC ĐC 1,186 c 100,0 1,252 c 100,0 1,175 c 100,0 CT1 1,891 b 159,4 1,596 b 127,0 1,192 bc 101,4 CT2 2,576 a 217,2 2,104 a 167,7 1,402 a 119,1 CT3 2,800 a 236,0 2,141 bc 170,2 1,232 b 104,9 (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01) ĐC: Cơng thc đi chng khơng bĩn dung dch vi khun phân gii photphat khĩ tan CT1: Cơng thc bĩn 20 ml dch nuơi vi khun phân gii photphat khĩ tan XB1 cho 5 kg đt. CT2: Cơng thc bĩn 20 ml dch nuơi vi khun phân gii photphat khĩ tan NĐ1cho 5 kg đt. CT3: Cơng thc bĩn 20 ml dch nuơi vi khun phân gii photphat khĩ tan NĐ2 cho 5 kg đt. Qua kt qu bng 13 cho thy hàm lưng N lúa ML48 1 tháng tui, các cơng thc thí nghim cĩ lây nhim các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan như CT1, CT2, CT3 tăng so vi cơng thc đi chng là 59,4%, 117,2% và 136%. Hàm lưng N lúa ML48 khi 2 tháng tui cơng thc CT1, CT2, CT3 tăng so vi cơng thc đi chng ln lưt là 27%, 67,7% và 70,2% . Cịn tháng th 3 CT1, CT2, CT3 tăng so vi cơng thc đi chng ln lưt là 1,4%, 19,1% và 4,9% . Như vy trong các giai đon
62. 62 sinh trưng và phát trin ca lúa ML48, các cơng thc thí nghim cĩ lây nhim các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan XB1, NĐ1, NĐ2 vào đt kh năng tích lũy N tăng mt cách đáng k so vi cơng thc đi chng. 3 2.5 2 ĐC CT1 1.5 khơ) CT2 1 CT3 0.5 Hàm lưng N (g/100g cht cht (g/100g N lưng Hàm 0 1 2 3 Thi gian gieo trng (tháng) Hình 3.8. Biu đ biu din nh hưng ca các ch phm vi khun phân gii photphat khĩ tan ti hàm lưng N ca cây lúa. Bng 3.14. nh hưng ca ch phm vi khun phân gii photphat khĩ tan ti hàm lưng P ca lá cây lúa. Cơng 1 tháng 2 tháng 3 tháng thc % cht % so vi % cht % so vi % cht % so vi khơ ĐC khơ ĐC khơ ĐC ĐC 0,090 b 100,0 0,075 100,0 0,050 b 100,0 CT1 0,190 a 211,0 0,087 116,0 0,090 a 180,8 CT2 0,184 a 204,0 0,090 120,0 0,050a 110,6 CT3 0,177 a 196,6 0,079 105,3 0,050 b 102,1 (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01)
63. 63 Cũng tương t như kh năng tích lũy N, các ch phm vi khun phân gii photphat khĩ tan tác đng cĩ hiu qu đn s tích lũy P ca ging lúa ML48 các giai đon. C th lúa ML48 mt tháng tui các cơng thc thí nghim cĩ lây nhim các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan như CT1, CT2 và CT3 hàm lưng P tăng so vi cơng thc đi chng ln lưt là 111% , 104% và 96% ,hai tháng tui CT1 , CT2, CT3 tăng so vi cơng thc đi chng ln lưt là 16%, 20%, 25% tuy nhiên s khác bit tháng th 2 khơng cĩ ý nghĩa thng kê. Cịn 3 tháng tui là 80,8%, 10,6% và 2,1%. Điu này th rõ qua hình 3.9. 0.2 0.18 0.16 0.14 ĐC 0.12 CT1 0.1 CT2 0.08 CT3 0.06 0.04 0.02 Hàm lưng P (mg/100g0 cht khơ) 1 2 3 Thi gian gieo trng ( tháng) Hình 3.9. Biu đ biu din nh hưng ca các ch phm vi khun phân gii photphat khĩ tan ti hàm lưng P trong lá cây lúa. Qua các nghiên cu ca Cao Ngc Đip (2002), Phm Th Ngc Lan và Trương Văn Lung (2003) trên đi tưng là lúa cũng cho thy rõ vai trị ca các vi sinh vt phân gii photphat khĩ tan trong đt cĩ nh hưng rt ln đn s hp thu cht dinh dưng ca cây nht là s tích lũy P.
64. 64 C th nghiên cu ca Phm Th Ngc Lan và Trương Văn Lung, khi b sung hai chng nm si phân gii photphat khĩ tan M37 và M 39 vào đt trng lúa Khang Dân và 13/2 cho thy hàm lưng N tăng mt cách đáng k so vi cơng thc đi chng t 17,78 – 33,94% ging lúa Khang Dân và t 15,67% 27,74% đi vi ging 13/2.Cịn hàm lưng P trong giai đon đ nhánh 25,00 – 31,84%, giai đon chín sáp tăng 16,29 19,66% ging lúa Khang Dân, cịn ging 13/2 giai đon làm địng tăng 20.09 – 24,79% [16] Nghiên cu ca Cao Ngc Đip ging lúa OMCS 2000 khi trng trong chu kt qu cho thy bĩn phân lân sinh hc c dng nm và vi khun hịa tan lân khĩ tan làm tăng hàm lưng trong sinh khi (rơm r + ht lúa) nhưng gim lưng photpho d tiêu trong đt [9] Bng 3.15. Chiu cao trung bình ca lúa ML48 các cơng thc sau 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng gieo trng. Đơn v: cm/cây Cơng 1 tháng 2 tháng 3 tháng thc Chiu % so vi Chiu % so Chiu % so cao cây ĐC cao cây vi ĐC cao cây vi ĐC (cm) (cm) (cm) ĐC 25,5 b 100,0 50,6 c 100,0 59,4 c 100,0 CT1 29,7 a 116,4 56,2 ab 111,1 69,8 a 117,5 CT2 29,5 a 115,7 57,6 a 113,8 67,2 a 113,1 CT3 28,6 a 112,2 53,8 b 106,3 63,4 b 106,7 ( Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01) Theo bng 3.15 ta thy đã cĩ s chênh lch nhau v chiu cao các cơng thc. Sau 1tháng gieo trng chiu cao thp nht là cơng thc đi chng đt trung bình 25,5cm, cịn cơng thc CT1 chiu cao lúa đt trung bình cao nht 29,7cm tăng 16.4% so vi đi chng cịn các cơng
65. 65 thc CT2, CT3 cũng cĩ s gia tăng chiu cao so vi cơng thc đi chng ln lưt là 15,7% , 12,2%. Tương t sau 2 tháng gieo trng chiu cao thp nht vn là cơng thc đi chng đt trung bình 50,6cm, cịn cơng thc CT2 chiu cao lúa đt trung bình cao nht 57,6cm tăng 13,8% so vi cơng thc đi chng. Cịn cơng thc CT1 , CT3 chiu cao cũng cĩ s gia tăng so vi cơng thc đi chng c th là CT1tăng 11,2%, CT3 tăng 6,3%. Khi lúa 3 tháng tui chiu cao chúng tơi đo đưc thp nht là cơng thc đi chng trung bình 59,4cm, cịn CT1 chiu cao lúa đt trung bình cao nht 69,8 cm tăng 17,5% so vi cơng thc đi chng cịn cơng thc CT2 tăng 13,1%, CT3 tăng 6,7% so vi cơng thc đi chng. Như vy, vic bĩn dung dch vi khun phân gii photphat khĩ tan vào đt đã nh hưng tích cc đn s sinh trưng, phát trin ca lúa các giai đon, làm cho chiu cao cây tăng lên đáng k. Điu này đưc th hin rõ hơn qua hình 3.10. 80 70 60 ĐC 50 CT1 40 CT2 30 20 CT3 Chiu cao10 (cm) 0 1 2 3 Thi gian (tháng) Hình 3.10 Biu đ nh hưng ca các ch phm vi khun phân gii photphat khĩ tan đn chiu cao cây lúa
66. 66 Đ đánh giá rõ ràng hơn v nh hưng ca vic bĩn dung dch vi khun phân gii photphat khĩ tan lên cây lúa chúng tơi tin hành cân khi lưng 1000 ht, sinh khi (rơm r) cây lúa (thí nghim vi 3 ln lp li). Kt qu thu đưc các bng : Bng 3.16. Khi lưng ca 1000 ht trên mi cơng thc bĩn Cơng Khi lưng tươi Khi lưng khơ thc g/1000 ht % so ĐC g/1000 ht % so ĐC ĐC 23,40 c 100,0 18,30 d 100,0 CT2 28,90 a 123,5 21,20 a 115,8 CT3 27,57 b 117,8 20,40 b 111,5 CT3 27,00 b 115,4 19,10 c 104,4 ( Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01) Qua các kt qu bng 3.16 cho thy khi lưng 1000 ht tươi ca ging lúa ML48 các cơng thc thí nghim đu tăng so vi cơng thc đi chng. Tht vy, so vi cơng thc đi chng thì vic bĩn các ch phm trên đã làm tăng rõ rt năng sut lúa. cơng thc CT1, CT2 và CT3 khi lưng tươi 1000 ht tăng so vi đi chng ln lưt là 23,5%, 17,8% và 15,4%, khi lưng 1000 ht khơ các cơng thc cĩ lây nhim các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan, cơng thc CT1, CT2 và CT3 đu tăng so vi cơng thc đi chng ln lưt là 15,8%, 11,9% và 4,4%.
67. 67 Bng 3.17 . nh hưng ca các chng phân gii photphat khĩ tan đn sinh khi ca cây lúa Cơng Khi lưng cây Khi lưng cây Khi lưng r thc tươi khơ khơ g/cây % ĐC g/cây % ĐC g/cây % ĐC ĐC 6,66 c 100,0 3,00 b 100,0 1,18 c 100,0 CT1 7,84a 117,7 3,61 a 120,0 1,94 a 164,4 CT2 7,65 ab 114,9 3,52 a 117,3 1,71 ab 144,9 CT3 7,40b 111,1 3,46 a 115,3 1,54 b 130,5 ( Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01) Qua các kt qu bng 3.17 cho thy khi lưng tươi cây lúa ca ging lúa ML48 các cơng thc thc thí nghim cĩ lây nhim ch phm vi khun phân gii photphat khĩ tan CT1, CT2, CT3 đu tăng so vi cơng thc đi chng là 17,7%, 14,9%, 11,1%. Vic b sung ch phm vi khun phân gii photphat khĩ tan XB1, NĐ1 và NĐ2 vào đt đã tăng s tích lũy cht khơ, ht chc hơn và my hơn. So vi cơng thc đi chng thì vic bĩn các ch phm trên đã làm tăng khi lưng khơ cây lúa các cơng thc CT1, CT2 và CT3 ln lưt là 20,0%, 17,3%, 15,3% và khi lưng r khơ là 64,4%, 44,9% và 30,5%. Theo Hồng Minh Tn, Nguyn Quang Thch (2006) khi bĩn các ch phm vi sinh phân gii photphat khĩ tan vào đt đã làm tăng kh năng phân gii các hp cht lân khĩ tan và c đnh đm trong đt làm cho cây trng sinh trưng và phát trin tt, h thng r phát trin, trao đi cht và năng lưng mnh m, xúc tin các hot đng sinh lý đc bit là quang hp và hơ hp kt qu là tăng năng sut cây trng [26].
68. 68 V mt cm quan, các cơng thc cĩ bĩn vi khun phân gii photphat thì lúa cĩ màu xanh đm, lá dày và to hơn, cây mc khe, ít sâu bnh, thân cao và mp, nhiu r. Cịn cơng thc đi chng cây lúa nh, lá xanh nht và vàng, ít r, nguyên nhân : Do thiu lân làm cho các quá trình sinh lý trong cây b ri lon, s tng hp dip lc trong cây b nh hưng, các quá trình hút dinh dưng, tng hp cht hu cơ và cht thơm b gim sút, kéo dài quá trình hình thành, phân hĩa mm hoa, cht lưng nơng sn gim (hình minh ha trong ph lc). Hamdali (2008) nghiên cu s dng ba chng Strptomyces griseus cĩ kh năng phân gii phosphat khĩ tan đưc phân lp t m phosphat trên lúa mì trong điu kin nhà kính cũng làm tăng sinh khi lúa mì t 2532% trong điu kin khơng bĩn phân so vi đi chng [39]. Artunes (2007) làm thí nghim nh hưng ca chng phân gii P Glomus intraradis trên cây cà rt vi các ngun phân P khác nhau. Kt qu cho thy x lý chng vi sinh này làm tăng chiu dài r cà rt, tăng sinh khi c 9% so vi đi chng và hàm lưng P% trong c tăng nh t 0,24% lên 0,26% [34]. ElKomy (2005) cũng nghiên cu phi hp hai chng c đnh N Azospirillum và phân gii lân Bacillus megaterium x lý cho lúa mì. Kt qu cho thy hàm lưng N trong thân lúa mì ca các thí nghim cĩ x lý hai chng này tăng 3753%; hàm lưng P trong thân tăng 48,6%; hàm lưng K tăng 1014,3% so vi đi chng khơng x lý. Kt qu nghiên cu cũng cho thy x lý phi hp hai chng cĩ tác dng cng hưng, tt hơn x lý đơn chng [ 36]. S dng chng Pseudomonas striata khi bĩn qung phosphat và superphosphat cũng làm tăng đáng k năng sut khoai tây (Gaur và Negi – 1980). Kt qu nghiên cu mi nht Canada cho thy bĩn vi sinh vt phân
69. 69 gii lân cĩ th thay th 50 – 75% lưng lân cn bĩn bng qung nghèo P 2O5 mà năng sut, cht lưng khơng h thay đi (Gaur, 1992) .
70. 70 KT LUN VÀ KIN NGH 1. Kt lun Qua quá trình nghiên cu chúng tơi rút ra nhng kt lun như sau: Đã phân lp đưc 10 chng vi khun t các mu đt bazan nâu đ Tp. Buơn Ma Thut, bazan dc t xã Hịa Phú, Tp. Buơn Ma Thut và đt xám bc màu huyn Ea Soup. Mt đ các chng vi sinh vt phân gii phosphat khĩ tan trong các loi đt phát trin trên mơi trưng NBRIP xp x 10 4 – 10 5 CFU/ml. Tuyn chn 03 chng chng vi khun cĩ kh năng phân gii photphat khĩ tan mnh nht là XB1, NĐ1 và NĐ2. Hot tính phân gii photphat khĩ tan dng Ca 3(PO 4)2 là t 10,71 16,33 mg/l. Ba chng đưc tuyn chn đu cĩ kh năng phân gii photphat khĩ tan dng AlPO 4. Chng NĐ1 cĩ hot tính phân gii AlPO 4 là cao nht. Đã xây dng đưc qui trình nuơi cy các chng phân gii photphat khĩ tan tuyn chn. Mơi trưng nuơi cy tt nht cho các chng vi khun phân gii photphat khĩ tan XB1, NĐ1 và NĐ2 là mơi trưng NBRIP vi pH = 7, nhit đ nuơi cy t 2628oC, tc đ lc là 200 vịng/phút, thi gian nuơi cy là 72 gi. Mt đ nuơi cy theo qui trình đt 1 2.10 9 CFU/ml. Ba ch phm vi khun phân gii photphat khĩ tan XB1, NĐ1 và NĐ2 cĩ nh hưng tích cc đn s sinh trưng và phát trin ca cây lúa. Kh năng tích lũy cht dinh dưng, chiu cao, sinh khi và năng sut ca lúa đã tăng lên đáng k so vi đi chng và đt hiu qu cao nht cơng thc 2 là chng XB1. Tng sinh khi khơ và năng sut ht cao hơn so vi đi chng t 10 20%.