›

Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao giàu saponin của dược liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)

pdf 51 trang thiennha21 18/04/2022 5950
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao giàu saponin của dược liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfbuoc_dau_xay_dung_tieu_chuan_co_so_cao_giau_saponin_cua_duoc.pdf

Nội dung text: Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao giàu saponin của dược liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC CAO THỊ PHƯƠNG THẢO BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO GIÀU SAPONIN CỦA DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC CAO THỊ PHƯƠNG THẢO BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO GIÀU SAPONIN CỦA DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2014.Y Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN HỮU TÙNG Hà Nội - 2019
  3. LỜI CẢM ƠN Sau khi kết thúc 5 năm học tại Khoa Y Dược – Đại học quốc gia Hà Nội, tôi đã được đăng kí và làm khóa luận nghiên cứu về đề tài “Tiêu chuẩn cơ sở cao giàu saponin của dược liệu Sâm vũ diệp (Panax Bipinnatifidus Seem.)”. Để khóa luận đạt kết quả tốt đẹp, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, các cơ quan, tổ chức, cá nhân. Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn đến lãnh đạo Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội và đặc biệt là Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã tạo điều kiện cho tôi được làm khóa luận tốt nghiệp. Tôi cũng xin cảm ơn những sự quan tâm, dạy dỗ và chỉ bảo nhiệt tình, chu đáo của các thầy cô trong suốt thời gian tôi theo học tại đây để tôi có thể suất sắc hoàn thành khóa luận này. Đặc biệt, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới thầy giáo – TS. Nguyễn Hữu Tùng đã quan tâm giúp đỡ và chỉ bảo, hướng dẫn trực tiếp tôi làm khóa luận trong thời gian qua. Tôi cũng rất vinh dự và cảm ơn sự hỗ trợ, giúp đỡ từ đề tài cấp Bộ “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M. Feng) vùng Tây Bắc” do PGS.TS. Dương Thị Ly Hương làm chủ nhiệm. Tôi cũng xin cảm ơn đến chị Đặng Thị Ngần, Nguyễn Thị Thu Thủy - những người đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ bảo giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Đồng thời xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Dược học khóa QH.2014.Y, đặc biệt là các bạn Hà, Nhung, Hoa, Vân đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình đã nuôi dạy, khích lệ và sát cánh, giúp tôi có thêm động lực cố gắng để có kết quả như ngày hôm nay. Với điều kiện và vốn kiến thức còn hạn chế, khóa luận này không thể tránh được nhiều thiếu sót. Vì vậy tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô để tôi có thể hoàn thiện bài luận văn một cách tốt nhất.
  4. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Cao Thị Phương Thảo
  5. DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril (CH3CN) DAD Đầu dò mảng điốt (Diode Array Detector) DĐVN Dược điển Việt Nam EtOAc Ethyl acetat (CH3COOC2H5) EtOH Ethanol (C2H5OH) FLD Đầu dò huỳnh quang (Fluorescence Detector) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performace liquid chromatography) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limid of Quantitation) MeOH Methanol (CH3OH) PDA Photometric Diode Array Detector R2 Hệ số tương quan tuyến tính RI Chỉ số khúc xạ (Refractive Index) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SVD Sâm Vũ Diệp
  6. DANH MỤC CÁC BẢNG Số bảng Tên bảng Số trang Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm của các mẫu SVD 27 Bảng 3.2 Kết quả xác định tro toàn phần của các mẫu SVD 28 Bảng 3.3 Chương trình rửa giải của pha động trong HPLC 29 Bảng 3.4 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký 30 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid 32 R2 Bảng 3.6 Khảo sát độ thu hồi 33 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 34 Bảng 3.8 Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu cao thử của 35 SVD
  7. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Số hình Tên hình Số trang Hình 1.1 Cây Sâm vũ diệp – Panax bipinnatifidus Seem. 4 Hình 1.2 Các thành phần hóa học trong SVD 5, 6 Hình 1.3 Công thức của Stipuleanosid R2 6 Hình 1.4 10 hợp chất saponin tách từ rễ của cây SVD 7 Hình 1.5 Công thức của một số nhóm Saponin 9, 10 Hình 2.1 Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái 17 tại Sa Pa, Lào Cai Hình 2.2 Quy trình chiết xuất cao giàu saponin từ SVD 18 Hình 2.3 Hệ thống HPLC Agilent Technologies 1260 Infinity với 21 đầu dò PDA, FLD và RI (Agilent, Mỹ) Hình 3.1 Cao khô giàu saponin của SVD 27 Hình 3.2 Sắc ký đồ của mẫu trắng (A), mẫu chất chuẩn 31 stipuleanosid R2 (B) và mẫu cao thử của SVD (C) Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 32
  8. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về dược liệu Sâm Vũ Diệp 3 1.1.1. Danh pháp 3 1.1.2. Phân bố và sinh thái 3 1.1.3. Đặc điểm thực vật 4 1.1.4. Thành phần hóa học 5 1.1.5. Tác dụng dược lý 8 1.1.6. Công dụng 8 1.2. Tổng quan về thành phần Saponin 9 1.2.1. Khái niệm 9 1.2.2. Cấu trúc hóa học 9 1.2.3. Phân loại 9 1.2.4. Tính chất của saponin 11 1.2.5. Kiểm nghiệm dược liệu chứa Saponin 12 1.2.6. Tác dụng và công dụng 12 1.3. Tổng quan về cao dược liệu (cao thuốc) 12 1.3.1. Định nghĩa 12 1.3.2. Phân loại 13 1.3.3. Phương pháp điều chế 13 1.3.4. Yêu cầu chất lượng 14 1.3.5. Bảo quản 14 1.4. Tổng quan về tiêu chuẩn cơ sở của cao dược liệu 15 1.4.1. Phương pháp xây dượng tiêu chuẩn về phương pháp thử 15
  9. 1.4.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.1. Nguyên liệu 17 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 20 2.1.3. Dung môi, hóa chất 21 2.2. Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1. Mô tả 21 2.2.2. Độ ẩm 22 2.2.3. Tro toàn phần 22 2.2.4. Định tính, định lượng 22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1. Kết quả nghiên cứu 27 3.1.1. Mô tả 27 3.1.2. Độ ẩm 27 3.1.3. Tro toàn phần 28 3.1.4. Định tính, định lượng 28 3.2. Thảo luận 35 3.2.1. Về mô tả cao dược liệu 35 3.2.2. Về khảo sát các tiêu chí của cao dược liệu 35 3.2.3. Về định tính và định lượng 36 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 4.1. Kết luận 37 4.2. Đề xuất 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC
  10. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam được biết đến là một quốc gia “rừng vàng, biển bạc” với nguồn tài nguyên hết sức phong phú mà thiên nhiên đã ưu ái ban tặng. Đặc biệt, nước ta là một trong số những quốc gia sở hữu số lượng cây thuốc lớn nhất trên thế giới. Trong số đó cũng bao gồm cả những dược liệu quý hiếm hiện nay như Ba kích (Morinda officinalis), Vàng đắng (Coscinium fenestratum), Hoàng liên chân gà (Coptis quinquesecta), Bình vôi (Stephania glabra (Roxb.) Miers.), đặc biệt phải kể đến các loài thuộc chi Panax L. như Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.); Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.); Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng); Tam thất (Panax noto-ginseng Burk.) [1]. Trong đó, Sâm vũ diệp (SVD) (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm – Araliaceae) là loại dược liệu quý hiếm với rất nhiều tác dụng tốt với cơ thể như tăng cường sức đề kháng, hệ miễn dịch, tăng cường trí nhớ, tỉnh táo, bổ máu, tăng cường lưu thông máu và được sử dụng trong rất nhiều bài thuốc dân gian. Tuy nhiên, hiện nay loại dược liệu này đang bị khai thác ồ ạt mà không chú ý đến vấn đề tái sinh của cây, dẫn đến chúng có nguy cơ bị xóa sổ, mất đi nguồn gen, khiến cho việc nghiên cứu chúng trở nên khó khăn hơn. Theo như tìm hiểu, hiện nay có rất ít các nghiên cứu tìm hiểu về thành phần hóa học, tác dụng dược lý của SVD. Đặc biệt chưa có tài liệu nào đưa ra được một tiêu chuẩn đầy đủ để đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của Sâm vũ diệp, cũng như dạng cao thuốc của loại dược liệu này. Việc xây dựng tiêu chuẩn chất lượng có thể giúp định danh, xác định thành phần có hoạt tính, đồng thời đảm bảo chất lượng của nguồn nguyên liệu cũng như việc sử dụng dược liệu giả ngày càng phổ biến hiện nay. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao giàu saponin của dược liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)”. Đề tài này là một phần trong đề tài cấp Bộ “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 1
  11. và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M. Feng) vùng Tây Bắc” của Khoa Y Dược, Đại Học Quốc Gia Hà Nội. Mục tiêu đề tài: Khi thực hiện luận văn này tôi đã đề ra một số mục tiêu cụ thể như sau: 1. Khảo sát, đề xuất các tiêu chí giới hạn ban đầu đối với cao giàu saponin của dược liệu SVD. 2. Tiến hành phân tích các tiêu chí đã đề xuất. 2
  12. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về dược liệu Sâm Vũ Diệp 1.1.1. Danh pháp Tên khoa học: Panax bipinnatifidus Seem. Tên khác: Ngật đáp thất, Tam thất hoang, Tam thất xẻ lá, Trúc tiết nhân sâm, Vũ diệp tam thất [4]. Giới (Kingdom): Thực vật (Plantae) Ngành (Division): Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp (Class): Ngọc Lan (Magnoliophyta) Bộ (Order): Hoa tán (Apiales) Họ (Family): Ngũ gia bì hay Nhân sâm (Araliaceae) Giống (Genus): Panax Loài (Species): P. bipinnatifidus [3,28,31] 1.1.2. Phân bố và sinh thái Ở Việt Nam, SVD là loài sâm tự nhiên được phát hiện tương đối sớm [2], chúng chủ yếu phân bố ở Lai Châu (Tả Phình), Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát, Than Uyên: núi Hoàng Liên Sơn) [14,16]. Gần đây, SVD đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa phương như Hà Giang và Lào Cai [17]. Trên thế giới, SVD được phát hiện và định tên khoa học từ năm 1868. Cây phân bố ở một số quốc gia như Trung Quốc, Ấn Độ, Nêpan (vùng cận Himalaya) [2]. SVD là cây thảo ưa bóng và đặc biệt ưa ẩm, thường mọc rải rác hay tập trung (vài chục khóm) dưới tán rừng ẩm, gần như quanh năm có sương mù ở độ cao từ 1.600-2.300 m. SVD còn là cây ưa khí hậu ẩm mát, chúng có thể tồn tại và phát triển vững bền trong điều kiện khí hậu có nền nhiệt độ khá thấp qua nhiều thế hệ [2,4]. 3
  13. SVD sinh trưởng, phát triển mạnh trong mùa mưa ẩm. Mùa hoa thường rơi vào tháng 4-5, quả thường ra vào tháng 5-9 (10). Gieo giống tự nhiên từ hạt. Quả chín chim thường ăn (bỏ hạt), hạt rơi xuống lại bị một loại sóc nâu nhỏ ăn nhân hạt. Thân rễ bị gãy hoặc khai thác mất phần già, phần đầu thân rễ (có chồi ngủ) còn lại vẫn có khả năng tái sinh. Toàn bộ phần thân mang lá tàn lụi vào mùa đông, đến đầu mùa xuân năm sau từ đầu mầm thân rễ sẽ mọc lên các chồi thân mới [4]. 1.1.3. Đặc điểm thực vật Cây thảo, sống lâu năm, cao 0,3 – 0,5 m. Thân rễ mập, vặn vẹo, phân nhánh, có nhiều đốt và những vết sẹo to do thân cây rụng để lại, đầu rễ có hình con quay. Chúng thường nằm ngang và nổi trên mặt đất, đường kính 1,5 – 3,5 cm. Phần thân mang lá mảnh, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, đường kính thân từ 0,3 – 0,6 cm. Lá kép chân vịt gồm 2 – 3 cái mọc vòng ở ngọn, lá chét 5 – 7 (ít khi 3), thuôn, dài 2,5 – 14 cm, rộng 1,5 – 4 cm, gốc tròn, dài thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy lông chim không đều, mép khía răng, có lông [2,4]. Cụm hoa mọc ở ngọn thân thành tán đơn. Hoa màu trắng lục hoặc vàng xanh; 5 cánh hoa; 5 nhị; bầu 2 - 3 ô. Quả mọng, hình cầu hơi dẹt, đường kính 0,6-1,2 cm, khi chín màu đỏ, có chàm đen to ở đầu. Hạt 2 – 3, hình cầu hoặc gần giống hạt đậu; màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [2,4]. Hình 1.1: Cây Sâm vũ diệp – Panax bipinnatifidus Seem. 4
  14. 1.1.4. Thành phần hóa học Năm 2002, Trần Công Luận và các cộng sự đã chỉ ra được 2 nhóm chất chính trong thân rễ của SVD là polyacetylen và saponin cùng với các acid béo, acid amin. Các saponin này sau đó được thủy phân và kết tinh phần sapogenin thu được acid oleanolic [13]. Như vậy, rễ SVD có thành phần chính là các saponin triterpen thuộc nhóm oleanan, bao gồm những chất như: chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [2,23]. Chikusetsusaponin IV Zingibrosid R1 Ginsenosid Ro Ginsenosid Rd 5
  15. R1 R2 Ginsenosid Re Glc-Rha Glc Ginsenosid Rg1 Glc Glc Ginsenosid Rg2 Glc-Rha H Hình 1.2: Các thành phần hóa học trong SVD Trong số các saponin khung oleanan đã được tìm thấy thì hợp chất quan trọng nhất là Stipuleanosid R2 [29,32]. Hình 1.3: Công thức của Stipuleanosid R2 Năm 2011, một nhóm nghiên cứu hợp tác của Việt Nam – Hàn Qu ốc cũng đã tiến hành một phân tích trên mẫu dịch chiết methanol từ rễ củ a SVD thu hái ở dãy núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam. Kết quả đã phân lập thêm đượ c 3 saponin loại oleanan mới là bifinoside A – C (1-3) trong tổng số 10 saponin có khung oleanan được phát hiện [29]. 6
  16. Comp. R1 R2 R3 R4 R5 1: Ara(p) H H Me H 2: H Xyl (1→ 6) glc H Me H 3: Xyl Ara(p) H Me Glc 4: H H Ara(p) Me H 5: H H H Me Glc 6: Xyl H H Me H 7: H Glc Ara(f) H H 8: Xyl H H Me Glc 9: Xyl Ara(p) H H Glc 10: H Glc Ara(f) Me Glc Me : methyl Ara(f) : α-L-arabinofuranosyl Ara(p) : α-L-arabinopyranosyl Glc : β-D-glucopyranosyl Xyl : β-D-xylopyranosyl Hình 1.4: 10 hợp chất saponin tách từ rễ của cây SVD 7
  17. Năm 2017, một nhóm sinh viên nghiên cứu cũng đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa họ c của 3 hợp chất β-sitosterol , oleanolic acid và daucosterol từ phân đoạn ethyl acetat từ thân rễ SVD [9,10]. Tiến hành thí nghiệm trên lá SVD, một nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã phân lập được 13 saponins có khung dammaran vào năm 1989, trong đó bao gồm ginsenoside F1, F2, F3, Rb, Rb3, Rd, Re, Rg2 [27 ]. 1.1.5. Tác dụng dược lý Các thành phần chính trong rễ của SVD đã được chỉ ra có các tác dụng chính là gây động dục , hướng sinh dục, tăng sức dẻo dai của động vật thí nghiệm, tăng cường sức đề kháng chung của cơ thể [2,8]. Năm 2016 , nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố SVD là một trong số những loài trong cơ sở dược liệu của Trung Quốc thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư [26]. Năm 2017, một nghiên cứu về SVD chỉ ra chúng có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn ethylacetat có tác dụng ở các mức liều: 0,5 - 1 - 2 - 5 mg/mL, phân đoạn ether ở các mức liều 1-2-5 mg/mL [ 15]. Năm 2018, một nhóm nghiên cứu người Trung Quốc khác đã xác định SVD cũng có tác dụng cầm máu giống với nhiều loài sâm khác trong chi Panax [24]. Các nghiên cứu mới đây cũng chỉ ra SVD có khả năng ảnh hưởng đ ối với hệ thần kinh trung ương , có tác dụng chống stress [18,19 ], chống trầm cảm, có tác dụng b ảo vệ gan và kích thích tăng miễn dịch [11 ,12]. Về độc tính cấp, SVD dùng đường uống có độ độc tính cấp rất thấp [2]. 1.1.6. Công dụng SVD là nguồn gen đặc biệt quý hiếm của Việt Nam và thế giới. Tất cả các bộ phận của cây đều được sử dụng để làm thuốc. Thân rễ (củ) làm thuốc bổ huyết (nhất là cho ph ụ n ữ sau sinh và người cao tuổi); cầm máu, tán ứ tiêu sưng; tăng cường sinh dục, chống stress. Lá, thân, nụ hoa làm trà uống kích thích tiêu hóa, an thần và chữa bệ nh thận. Ở Trung Quốc, SVD là thuốc chữa hư lao, thổ huyết, chảy máu cam, đòn ngã tổ n thương. Tuy nhiên cho đến nay chưa tìm 8
  18. thấy nghiên cứu nào ở cả Việt Nam và thế giới công bố về tác dụng sinh học của SVD chứng minh cho các công dụng này [2,4]. 1.2. Tổng quan về thành phần Saponin [20,21] 1.2.1. Khái niệm Saponin hay saponosid là một nhóm các glycoside với phần genin có cấu trúc triterpen hay steroid 27 carbon, gặp rộng rãi trong thực vật, cũng được tìm thấy trong động vật thân mềm như Hải sâm, Sao biển. 1.2.2. Cấu trúc hóa học Cấu trúc của Saponin gồm có hai phần là phần đường và phần aglycon (hay genin) [30]. Phần aglycon thường được gọi là sapogenin, có cấu trúc triterpen với khung cơ bản 30 carbon hoặc steroid với 27 carbon dẫn xuất từ khung cholestan. Trên phần sapogenin thường gắn các nhóm thế hydroxyl (OH). Nhóm OH này trong đa số trường hợp có định hướng β. Phần đường ở đa số saponin thường được gắn vào các nhóm OH ở trên. Với số lượng không nhiều của các sapogenin, sự đa dạng của các saponin chủ yếu là do thành phần, số lượng và vị trí của các đường trong phân tử. 1.2.3. Phân loại Dựa theo cấu trúc hóa học của phần genin, người ta chia saponin là 2 nhóm lớn là saponin triterpenoid và saponin steroid. a) Saponin triterpenoid - Saponin triterpenoid năm vòng: + Có phần sapogenin có khung 30 carbon với 5 vòng và 8 nhóm methyl. + Nhóm được phân làm 5 phân nhóm nhỏ: • Nhóm Oleanan • Nhóm Ursan Oleanan • Nhóm Taraxasteran 9
  19. • Nhóm Lupan • Nhóm Hopan Ursan - Saponin triterpenoid bốn vòng: gồm 4 phân nhóm nhỏ là • Nhóm Dammaran • Nhóm Lanostan • Nhóm Tirucallan • Nhóm Cucurbitan Dammaran Lanostan Hình 1.5: Công thức của một số nhóm Saponin 10
  20. Theo như các nghiên cứu, thành phần saponin chủ yếu được tìm thấy trong các cây thuộc họ nhân sâm thuộc nhóm Dammarane (bao gồm ginsenosides Rb1, Rb2, Re và Rg1) [25]. b) Saponin steroid Nhóm này có cấu trúc cơ bản là khung cholestan với 27 carbon trong đó mạch nhánh của khung steroid thường đóng vòng với dị tố oxy hay nitơ tạo thành một hay hai dị vòng là E (năm cạnh) và F (6 cạnh). Các saponin nhóm này ít có các nhóm thế trên khung, ngoại trừ nhóm OH C-3. Sự khác biệt giữa các saponin chủ yếu là trên mạch nhánh để tạo nên các nhóm khác nhau. Saponin steroid được chia thành 2 phân nhóm là: - Saponin steroid thông thường: với dị tố trong vòng E và F chỉ là Oxy. - Saponin steroid alkaloid: với Nitơ trong phân tử. 1.2.4. Tính chất của saponin Saponin thường là những chất vô định hình, không màu tới màu trắng ngà. Đa số saponin có vị nhẫn đắng, ngoài ra vẫn có một số loại có vị ngọt. Saponin là những chất phân cực nên có thể tan trong các dung môi phân cực như các alcol, hỗn hợp cồn – nước, nước và các dung môi phân cực khác như dimethyl sulfoxid, dioxin, pyridine Với saponin có mạch đường ngắn đến trung bình, butanol là một dung môi hòa tan tương đối chọn lọc. Với saponin có mạch đường dài có thể tan tốt trong nước. Saponin có những tính chất hết sức đặc trưng như: - Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước. - Khối lượng phân tử lớn nên khó bị thẩm tích. - Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng. - Độc với cá, diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên - Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt. - Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3β-hydroxysteroid khác. Tuy nhiên, không phải tất cả các saponin đều thể hiện đầy đủ các tính chất trên. 11
  21. 1.2.5. Kiểm nghiệm dược liệu chứa Saponin ✓ Dựa trên tính chất tạo bọt. ✓ Dựa trên tính chất phá huyết. ✓ Dựa trên độ độc đối với cá. ✓ Khả năng tạo phức với cholesterol. ✓ Các phản ứng màu. ✓ Sắc ký lớp mỏng. ✓ Xác định bằng quang phổ. ✓ Định lượng: Phương pháp cân, phương pháp đo quang, phương pháp sắc ký lỏng cao áp. 1.2.6. Tác dụng và công dụng Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho (viễn chí, cát cánh, cam thảo, thiên môn, mạch môn ). Một số dược liệu chứa saponin có tác dụng thông tiểu (rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch môn), tác dụng chống viêm (cam thảo, ngưu tất), kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus Saponin trong một số cây thuộc họ Nhân sâm có tác dụng bổ tăng lực ( Nhân sâm, Tam thất, Sâm vũ diệp ). Gần đây có báo cáo chỉ ra saponin steroid có tác dụng chống ung thư theo nhiều cơ chế khác nhau , như ức chế sự tăng sinh, gây ra apoptosis và autophagy , và điều chỉnh vi môi trường khối u, thông qua nhiều con đườ ng truyền tín hiệu liên quan [17]. 1.3. Tổng quan về cao dược liệu (cao thuốc) [5] 1.3.1. Định nghĩa Cao thuốc là chế phẩm được điều ch ế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu đượ c từ dược liệu thực vật hoặc động vật với các dung môi thích h ợp. Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (rửa sạch, phơi khô hoặc sấy khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp). Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa men làm phân hủy hoạt chất, cần phải diệt men trước khi đưa 12
  22. vào sử dụng bằng cách dùng hơi cồn sôi, hơi nước hoặc bằng phương pháp thích hợp khác. 1.3.2. Phân loại Theo thể chất cao thuốc được chia làm 3 loại: - Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng, trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai). Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc. - Cao đặc: Là khối đặc quánh. Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20%. - Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất những rất dễ hút ẩm. Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%. 1.3.3. Phương pháp điều chế Quá trình điều chế cao thuốc thường có 2 giai đoạn: ❖ Giai đoạn 1: Chiết xuất dược liệu bằng các dung môi thích hợp. Tùy theo các điều kiện cụ thể mà có thể sử dụng các phương pháp chiết xuất khác nhau: ngâm, hầm, hãm, sắc, ngâm nhỏ giọt (thường được sử dụng), chiết xuất ngược dòng, chiết xuất bằng thiết bị siêu âm, chiết xuất bằng phương pháp sử dụng điện trường và các phương pháp khác. ❖ Giai đoạn 2: - Cao lỏng: Sau khi thu được dịch chiết, tiến hành lọc và cô dịch chiết bằng phương pháp khác nhau để thu được cao theo tỷ lệ quy ước (1ml cao lỏng tương đương với 1g dược liệu). - Cao đặc và cao khô: Dịch chiết được cô đặc đến khi dung môi dùng để chiết xuất còn lại không quá 20% được cao đặc. Trong trường hợp điều chế cao khô, tiếp tục sấy khô đến khi dung môi còn lại không quá 5%. Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết thường được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 600C. Nếu không 13
  23. có các thiết bị cô đặc và sấy dưới áp suất giảm thì được phép cô cách thủy (không được cô trực tiếp trên lửa) và sấy ở nhiệt độ không quá 800C. 1.3.4. Yêu cầu chất lượng Đạt các yêu cầu theo quy định trong chuyên luận riêng và các yêu cầu chung sau đây: - Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã sử dụng để điều chế cao. - Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng. Ngoài ra, cao lỏng còn phải đồng nhất, không có váng mốc, không có cặn bã dược liệu và vật lạ. - Mất khối lượng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác): Cao đặc không quá 20% Cao khô không quá 5% - Hàm lượng cồn: Đạt từ 90 – 110% lượng ethanol ghi trên nhãn (áp dụng cho cao lỏng và cao đặc). - Kim loại nặng: Không được quá 20 phần triệu nếu không có chỉ dẫn khác. - Dung môi tồn dư. - Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật. - Giới hạn nhiễm khuẩn. 1.3.5. Bảo quản Cao thuốc được đựng trong bao bì kín, để nơi khô, mát, tránh ánh sáng, nhiệt độ ít thay đổi. Nhãn: theo qui định hiện hành và có ghi tên bộ phận dùng của cây thuốc, tên dung môi, hàm lượng (%) của hoạt chất hoặc của hợp chất nhận dạng được quy định theo từng chuyên luận riêng, tên và nồng độ của chất bảo quản thêm vào. Khi hoạt chất chưa biết, tỷ lệ giữa dược liệu và sản phẩm cuối cùng phải được nêu rõ. Đối với cao đặc và cao khô, loại và số lượng tá dược thêm vào cũng được nêu ra và tỷ lệ phần trăm của cao tự nhiên cũng phải được ghi rõ. 14
  24. 1.4. Tổng quan về tiêu chuẩn cơ sở của cao dược liệu [5] 1.4.1. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn về phương pháp thử Khi tiến hành xây dựng tiêu chuẩn cơ sở người ta chia các phương pháp thử thành ba loại: - Các phương pháp thử đ ịnh tính: là phép thử cần thiết để nhận biết m ột dược chất hay những thành phần chính của thuốc dựa trên tính chất vật lý hay hóa học đặc trưng. Định tính có thể dựa theo: + Các kinh nghiệm truyền thống, phương pháp vi học. + Các phương pháp lý học: xác định chỉ số về độ tan, tỉ trọng, chiết xuất , năng suất quay cực + Các phương pháp hóa học: thử một vài thành phần trong mẫu bằng các phản ứng hóa h ọc. + Định tính sắc ký: dùng các phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để phát hiện một số thành phần có trong mẫu thử; so sánh với chất chuẩn hay thành phần trong mẫu chuẩn. - Các phương pháp thử tinh khiết: là tập hợp các phép thử nhằm phát hiện những tạp chất nhiễm vào thuốc. Để kiểm tra độ tinh khiết, phải thử xác định sự có mặt các tạp chất, số lượng và giới hạn của chúng cũng như những yêu cầu khác tùy theo mỗi chuyên luận. Tùy theo từng mẫu thử mà thử tinh khi ết có thể bao gồm một số hay tất cả các chỉ tiêu dưới đây: + Mất khối lượng do làm khô (Phụ lục 9.6 hay Phụ lục 12.13 DĐVN V). + Tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrochloric (Ph ụ l ục 9.7 và Phụ lục 9.8 DĐVN V). + Hàm lượng kim loại nặ ng (Phụ lục 9.4.11 DĐVN V). + Dư lượng các chất bảo vệ th ực vật (Phụ lục 12.17 DĐVN V ). + Xác định chất chiết được là xác định hàm lượng các chất trong mẫu thử có th ể chiết được bằng dung môi (nước, ethanol hay một dung môi khác) ( Phụ l ục 12.10 DĐVN V). - Các phép thử định lượng : là những phép thử được sử dụng để xác định hàm lượng của một hay một số chất có trong các mẫu thử mà ta quan tâm bằng các phương pháp hóa học, lý học hoặc sinh học. 15
  25. 1.4.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở Thông thường đối với một mẫu cao khô, các chỉ tiêu luôn phải có bao gồm: - Những yêu cầu về hình thức, tính chất cảm quan: thể chất, màu sắc, mùi vị, các đặc điểm đặc biệt (chỉ tiêu tính chất). - Những yêu cầu về định tính: xác nhận sự hiện diện của các hoạt chất chính trong sản phẩm. - Những yêu cầu về định lượng: giới hạn cho phép của hàm lượng các hoạt chất. 16
  26. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu ❖ Mẫu dược liệu SVD Cây SVD trồng ở huyện Sa Pa, Lào Cai 6 năm tuổi được thu vào ngày 15/07/2016. Mẫu được giám định tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm (Araliaceae) bởi ThS. Nguyễn Quỳnh Nga, Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu. Mẫu tiêu bản (DL -150716) được lưu giữ tại Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu (Phụ lục 1). Hình 2.1: Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem .) thu hái tại Sa Pa, Lào Cai ❖ Mẫu cao SVD Mẫu cao khô SVD sử dụng trong đề tài là sản phẩm của quy trình chiế t cao được thừa kế từ “quy trình chiết cao giàu saponin từ SVD” trong đề tài cấp nhà nước “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển ngu ồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.tsai et K.M. Feng) vùng Tây Bắc” của đại học Quốc gia Hà Nội. Cao SVD (Panax bipinnatifidus Seem., họ nhân sâm Araliaceae ) (cao SVD) là cao giàu saponin được điều chế bằng cách cô dịch chiết cồn 50% của dược liệu SVD và đã được loại tạp. 17
  27. Tiến hành khảo sát các điều kiện cần thiết để có thể có được hiệu suất chiết cao đạt tỉ lệ cao nhất bao gồm: - Lựa chọn phương pháp chiết xuất. - Khảo sát kích thước dược liệu. - Khảo sát thời gian chiết. - Khảo sát số lần chiết/ mẻ và dung môi chiết. - Khảo sát nhiệt độ chiết. - Phương pháp loại tạp và tinh chế. - Phương pháp điều chế cao khô. Sau khi tiến hành các khảo sát đã xây dựng được quy trình chiết cao khô SVD phù hợp nhất như sơ đồ ở Hình 2.2: Hình 2.2: Quy trình chiết xuất cao giàu saponin từ SVD 18
  28. ➢ Kiểm nghiệm nguyên liệu Dược liệu thân rễ SVD vào phải đạt tiêu chuẩn cơ sở được nhóm nghiên cứu xây dựng và Viện Dược liệu thẩm định. Hàm lượng saponin toàn phần có trong dược liệu sâm vũ diệp không được thấp hơn 0,4% acid oleanolic tương đương tính theo dược liệu khô tuyệt đối. ➢ Công đoạn chiết cồn Dược liệu được cân trước khi nạp vào bình chiết và được chiết 3 lần bằng cồn 50% (tỉ lệ về khối lượng dược liệu/dung môi cồn 50 % = 1/7). Thời gian chiết mỗi lần 2 giờ, tính từ lúc đạt nhiệt độ sôi, t = 900 C. Sau khi chiết xong, dịch chiết được rút ra, lọc, gộp dịch chiết của 3 lần lại rồi chuyển sang thiết bị cô chân không, cô thành dịch lỏng 1:1 (1g DL/1 ml dịch chiết). ➢ Công đoạn loại tạp thô a. Chiết lỏng-lỏng với n-hexan Cho cao lỏng 1000 ml/nước (tương đương thu được từ 1 kg dược liệu khô) rồi chiết phân bố với n-hexan theo tỷ lệ 1:1 qua 3 lần (dùng phễu chiết 2L). Cất loại thu hồi dung môi n-hexan để tái sử dụng. Lớp nước sau chiết lỏng- lỏng chứa toàn lượng saponin đã được loại dầu béo và tạp chất thân dầu. b. Sắc ký cột diaion HP-20 Dịch nước sau khi chiết hexan được hấp phụ vào cột resin diaion HP-20 bằng cách bơm từ từ lên cột theo tỉ lệ 10 ml dịch mẫu thử/1g hạt resin, kiểm tra bằng TLC đến khi mẫu thử chảy ra thì dừng bơm. Ngâm khoảng 8 h để cột cân bằng hấp phụ. Rửa sạch bằng 2 lần thể tích nước cất (2000 ml) để loại bỏ saccarid rồi rửa giải bằng EtOH 96% (1000 mL), kiểm tra TLC. Thu dịch rửa giải EtOH 96%. ➢ Công đoạn cô, sấy Phần dịch rửa giải ở trên đem cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay được cao đặc, sau đó được sấy bằng tủ sấy chân không ở 55-60oC, độ chân không – 0,8 cho tới khi khô (có độ ẩm < 5 %). 19
  29. ➢ Kiểm nghiệm cao giàu saponin Cao giàu saponin từ sâm vũ diệp sau khi được tiến hành kiểm nghiệm theo TCCS đã được phê duyệt, nếu đạt thì nhập kho. Cao giàu saponin được đựng trong túi ni long, buộc kín, bảo quản nơi khô, mát, tránh ánh sáng. ➢ Đóng gói và bảo quản: Sau khi đạt TCCS, cao giàu hoạt chất được đóng gói theo đúng qui cách và nhập kho, bảo quản ở nhiệt độ <20oC. 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ - Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, Cân phân tích Precisa 262SMA-FR (Precisa – Thụy Sỹ). - Cân xác định độ ẩm Prescisa HA 60. - Máy siêu âm Power sonin 405 (Powersonic – Hàn Quốc). - Cột sắc ký các loại kích cỡ. - Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sỹ). - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động. - Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000 ml. - Máy ly tâm HSCEN-204-MRC. - Kính hiển vi điện tử. - Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức). - Bếp điện, bếp đun cách thủy. - Các dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm như bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức, ống nghiệm, ống đong, pipet, kim tiêm 20
  30. Hình 2.3: Hệ thống HPLC Agilent Technologies 1260 Infinity với đầu dò PDA, FLD và RI (Agilent, Mỹ) 2.1.3. Dung môi, hóa chất - Dung môi chạy sắc ký HPLC : Methanol ( MeOH ), Ethanol (EtOH ), Ethyl acetat (EtOAc), Acetonitril (ACN), Acid acetic (CH3COOH) của Merk, Đức; nước cất 2 lần dùng cho phân tích HPLC. - Thuốc thử: Acid sulfuric (Merk), Acid acetic (CH3COOH) (Merk). - Chất chuẩn liên kết Stipuleanosid R2 (Wako Chemicals, Nhật Bản, độ tinh khiết 98%, mã sản phẩm 155-01701). 2.2. Phương pháp nghiên cứu Xây dựng tiêu chuẩn cao giàu saponin của dược liệu SVD dựa trên các tiêu chí chung đối với cao khô dược liệu được quy định trong DĐVN V, bao gồm: - Mô tả - Độ ẩm - Tro toàn phần - Định tính - Đ ịnh lượng 2.2.1. Mô tả Kiểm tra hình thái, màu sắc, mùi vị bằng cảm quan; kiểm tra kích thước bằ ng rây 180 /125. 21
  31. 2.2.2. Độ ẩm Thử theo DĐVN V, Phụ lục 9.6, xác định mất khối lượng do làm khô (cân chính xác khoảng 1g mẫu cao, sấy trong tủ sấy ở 1050C, áp suất thường trong 5 giờ). 2.2.3. Tro toàn phần Độ tro toàn phần của mẫu nghiên cứu được xác định theo DĐVN V, phụ lục 9.8. Lấy một chén sứ nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy khoảng 1,00 g mẫu thử rải đều vào chén nung, sấy 1 giờ ở 100 - 105ºC rồi đem nung trong lò nung ở 600ºC ± 25ºC đến khối lượng không đổi (nung trong 4 giờ). Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Tỉ lệ % tro toàn phần (X%) của cao chiết được tính theo công thức: X % = x 100% Trong đó: a là khối lượng tro (g) m là khối lượng cao chiết đã dùng (g) 2.2.4. Định tính, định lượng Ta tiến hành định tính, định lượng thành phần Stipuleanosid R2 ( Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, DĐVN V, Phụ lục 5.3). a) Xây dựng phương pháp • Chuẩn bị dung dịch: - Dung dịch mẫu thử: Cân chính xác khoảng 100 mg cao dược liệu cho vào bình tam giác dung tích 50 ml, thêm chính xác 5,0 ml methanol, siêu âm 30 phút, để nguội, bổ sung bằng dung môi trên cho đủ 10 ml (bình định mứ c 10 ml), lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45m được dung dịch để tiêm sắc ký. - Dung dịch mẫu chuẩn : Chu ẩn bị một dãy dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 trong methanol có các đi ểm nồng độ chính xác gồm: 15 ,625 g/ml; 37,5 g/ml ; 75 g/ml; 150 g/ml; 200 g/ml; 300 g/ml và 400 g/ml. 22
  32. - Dung dịch mẫu trắng: Methanol tinh khiết. • Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký: Tham khảo một s ố tài liệu và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát định lượng thành phần saponin trong thân rễ SVD như sau: - Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột C18 pha đảo. - Pha động: Khảo sát các loại pha động với thành phần, tỷ lệ, tốc độ dòng khác nhau. - Detector: Lựa chọn sử d ụng detector thích hợp trong 3 loại detector UV, FLD, DAD để đảm bảo vừa phát hiệ n được chất phân tích, vừa tiện lợi cho quá trình phân tích và phù hợp trong điều kiện phòng thí nghi ệm. - Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nh ất. b) Thẩm định và đánh giá phương pháp Tiến hành thẩm định các chỉ tiêu định lượng saponin trong thân rễ SVD so với chất đối chiếu của chất đó đã qua nhận dạng cấu trúc và xác định tổng tạp chất bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích. Sau khi tham khảo các tài liệu [6-8], quy trình đánh giá được tiến hành trên các chỉ tiêu sau : ❖ Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Yêu cầu: - Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn. - Sắc ký đồ mẫu trắng không được xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chu ẩn. ❖ Độ tương thích hệ thống Tính thích hợp của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý. Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn, ghi lại các giá trị về thờ i gian lưu, diện tích pic. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích. 23
  33. Yêu cầu: RSD ≤ 5,0 %. ❖ Độ tuyến tính Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng đ ộ ở đó có s ự ph ụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất phân tích (x ). Độ tuyến tính được biểu thị bằng phương trình y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R 2. Cách xác định: Chuẩn b ị một dãy chất đối chiếu gồm 6 mẫu có nồng độ tăng dần trong khoảng thích hợp. Xác định sự tuyến tính giữa đáp ứng của pic và nồng độ chất cần phân tích trong mẫ u thử bằng phương trình hồi quy tuyến tính. Yêu cầu: R2 > 0,998. ❖ Độ lặp lại Độ lặp lại của phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng các lần lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân , pha, xử lý mẫu ) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích. Tiến hành: Pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu th ử rồi tiêm vào hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại nhiều lần, lấy giá trị trung bình. Độ lặp lại được biểu thị bằng giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích . Yêu cầu: RSD ≤ 5,0 %. ❖ Độ đúng Độ đúng của phương pháp là chỉ mức độ gần nhau giữa giá tr ị trung bình của kế t qu ả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng. Tiến hành: Pha dung d ịch thử và dung dịch chuẩn theo quy trình chu ẩn bị mẫu. Thêm vào mẫu thử những lượng chất chuẩn khác nhau (lượng chất chuẩn thêm vào không nên quá 40% lượng hoạt chất đã có sẵn và tổng lượng ho ạt chất có trong mẫu nằm trong khoảng tuyến tính ) rồi tiế n hành định lượng để xác định hàm lượng của các chất trong mẫu thử và mẫu thử có thêm chất 24
  34. chuẩn dựa trên phương trình đường chuẩn, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Độ đúng sẽ được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất chuẩn tìm được so với lượng chất chuẩn thêm vào. Yêu cầu: Độ thu hồi nằm trong khoảng từ 95,0 - 105,0%. ❖ Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp, là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được. Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ đúng và độ chính xác mong muốn. Tiến hành: Xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đường nền (S/N). Pha loãng dung dịch đối chiếu từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được bằng sắc ký. Đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng và mẫu thử. Thiết lập tỷ số S/N. - LOD: Là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà tại đó có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N =3/1). - LOQ: Là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà tại đó có tín hiệu bằng 10 lần nhiễu đường nền (S/N =10/1). c) Phương pháp xử lý kết quả - Kết quả định tính: + Trên sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic trên sắc ký đồ mẫu đối chiếu. + Trên sắc ký đồ mẫu thử, xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic xuất hiện trên sắc ký đồ mẫu đối chiếu. - Kết quả định lượng: Hàm lượng stipuleanosid R2 có trong dược liệu SVD (%) tính theo dược liệu khô kiệt được tính bằng công thức: 10 100% X (%) = x (100−a) 10 25
  35. Trong đó: C: nồng độ của stipuleanosid R2 trong dung dịch mẫu thử (g/ml). mc: lượng cân mẫu thử (mg). a: Độ ẩm mẫu thử (%). 26
  36. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu 3.1.1. Mô tả Bột mịn, tơi xốp, đồng nhất; màu vàng nâu, dễ hút ẩm (Hình 3.1). Có mùi thơm đặc trưng của dược liệu, vị hơi ngái. Hình 3.1: Cao khô giàu saponin của SVD 3.1.2. Độ ẩm Tiến hành xác định độ ẩm của các mẫu cao giàu saponin của SVD, kết quả được trình bày ở bảng 3.1: Bảng 3.1: Kết quả xác định độ ẩm của các mẫu SVD TT Tên mẫu Hàm ẩm (% ) 1 Mẫu 1 3,3 2 Mẫu 2 3,2 3 Mẫu 3 3,0 Trung bình 3,17 % Nhận xét: Độ ẩm của cao khô giàu saponin của SVD nằm trong ngưỡng an toàn theo qui định của DĐVN V. Qui định hàm ẩm không quá 5%. 27
  37. 3.1.3. Tro toàn phần Tiến hành xác định tro toàn phần của các mẫu cao SVD, kết quả được trình bày tại bảng 3.2: Bảng 3.2: Kết quả xác định tro toàn phần của các mẫu SVD TT Tên mẫu cao SVD Tro toàn phần (% ) 1 Mẫu 1 5,78 2 Mẫu 2 5,14 3 Mẫu 3 5,67 Trung bình 5,52% Nhận xét: Ta thấy độ tro toàn phần của dược liệu SVD trung bình khoảng 5,52%. Chúng tôi qui định độ tro toàn phần của cao khô SVD không quá 6,0%. 3.1.4. Định tính, định lượng Chương trình sắc ký HPLC tiến hành dưới đây sử dụng theo phương pháp đã được nhóm nghiên cứu của Th.S Nguyễn Thị Thu Thủy xây dựng [22] như sau: a) Lựa chọn điều kiện sắc ký • Điều kiện sắc ký: Sau khi đã thực hiện khảo sát các yếu tố, chúng tôi đã xây dựng được chương trình chạy sắc ký trên hệ hống HPLC Agilent 1260 Infinity như sau: Pha tĩnh: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm). Detector UV: Bước sóng 203 nm. Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút, điều chỉnh nếu cần thiết . Nhiệt độ buồng cột: Nhiệt độ phòng (250C ) Thể tích tiêm: 20 µL. Pha động: Acetonitril (A) và 0,5% acid acetic/ H2O (B). 28
  38. Pha động được rửa giải theo chương trình như trong bảng 3.3: Bảng 3.3: Chương trình rửa giải của pha động trong HPLC Thời gian A (%, v/v) B (%, v/v) Kiểu rửa giải (phút) 0-5 20 80 Đẳng dòng 5-15 20→40 80→60 Gradient 15-20 40 60 Đẳng dòng 20-25 40→20 60→80 Gradient 25-30 20 80 Đẳng dòng • Cách tiến hành: - Kiểm tra tính thích hợp của hệ th ống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 75 g/ml đã chuẩn bị ở trên, độ lệch chuẩn tương đối (RSD ) của các diện tích pic đáp ứng từ 6 lần tiêm lặp lại không được lớn hơn 2,0 %. - Tiêm dung dịch mẫu trắng. - Tiêm riêng biệt các dung dịch chuẩn, tiến hành sắc ký, ghi nhận các sắ c ký đồ. Thiết lập đường chuẩn của stipuleanosid R2 giữa nồng độ dung dịch ( g/ml) và diện tích pic tương ứng theo phương trình y = ax + b. - Tiêm dung dịch thử, tiến hành sắc ký, ghi nhậ n sắc ký đồ. Xác định tín hiệu stipuleanosid R2 (định tính), tính nồng độ stipuleanosid R2 trong dung dịch thử (g/ml) dựa trên phương trình đường chuẩn đã xây dựng (định lượng ). b ) Thẩm định phương pháp phân tích ❖ Tính thích hợp của hệ thống sắc ký Tiến hành phân tích 01 dung dịch chuẩn của stipuleanosid R2 lặp lại 06 lần. Tiến hành sắc ký, ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic, hệ số đối xứng. Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu, diện tích pic và hệ số bất đối lần lượt là 0,15%; 2,75% và 1,21% đều thấp hơn 5% (Bảng 3.4). Điều đó cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và 29
  39. hệ thống sắc ký HPLC sử dụng là ổn định, phù hợp cho phép phân tích stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD. Bảng 3.4: Tính thích hợp của hệ thống sắc ký STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU*s) Hệ số bất đối 1 15,707 424,728 0,90 2 15,698 421,771 0,89 3 15,674 449,195 0,92 4 15,658 419,380 0,90 5 15,680 418,038 0,92 6 15,729 440,903 0,91 TB 15,691 429,003 0,913 RSD (%) 0,15 2,75 1,21 ❖ Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng, mẫu chuẩn stipuleanosid R2 và mẫu thử theo quy trình phân tích ở trên. Ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu và phổ UV của pic stipuleanosid R2 trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn. Kết quả thu được được trình bày trong Hình 3.2: 30
  40. Hình 3.2: Sắc ký đồ của mẫu trắng (A), mẫu chất chuẩn stipuleanosid R2 (B) và mẫu cao thử của SVD (C) Kết quả cho thấy: Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với dung dịch mẫu đối chiếu stipuleanosid R2. Trên sắc ký đồ dung dịch mẫu thử xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng là 15,569 phút, tương ứng với pic xuất hiện ở mẫu đối chiếu stipuleanosid R2 có thời gian lưu tương ứng là 15,565 phút . ❖ Độ tuyến tính Chuẩn bị các dung dịch chuẩn bằng cách pha loãng từ một dung dịch chuẩn gốc ban đầu với các hệ số pha loãng khác nhau. Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm 3 lần) ghi lại sắc ký đồ và xác định đáp ứng của pic. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính , h ệ số tương quan tuyến tính giữa nồ ng độ chất chuẩn trong mẫu so và đáp ứng pic thu được trên sắc ký 31
  41. đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu. Kết quả cho thấy tương quan tuyến tính giữa diện tích pic trên sắc ký đồ và nồng độ stipuleanosid R2 trong dung dịch theo phương trình y = 2,6081x + 49,1185 với hệ số tương quan R2 = 0,9988 (Bảng 3.5 và Hình 3.3). Trong khoảng nồng độ khảo sát 15,625 – 400 µg/ml có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ stipuleanosid R2 với hệ số tương quan rất cao. Bảng 3.5: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2 STT Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (mAU*s) 1 15,625 90,65283 2 37,5 154,6339 3 75 239,247 4 150 418,038 5 200 589,441 6 300 836,676 7 400 1087,77 Đồ thị đường chuẩn của stipuleanosid R2 1200 y = 2,6081x + 49,1185 1000 R² = 0,9988 AU*s) 800 600 400 200 Diện tích pic tích (m Diện 0 0 100 200 300 400 500 Nồng độ (µg/ml) Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 32
  42. ❖ Độ đúng Khi thêm các lượng stipuleanosid R2 chuẩn khác nhau, phương pháp đều cho độ thu hồi nằm trong khoảng và độ lệch chuẩn tương đối RSD. Kết quả này chứng tỏ phương pháp xây dựng có độ thu hồi tốt, phù hợp với định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.6. Bảng 3.6: Khảo sát độ thu hồi Lượng có sẵn Lượng thêm vào Diện tích pic Lượng tìm lại Độ thu hồi STT (µg) (µg) (mAU*s) (µg) (%) 1 711,754 75 2094,160 72,358 96,48 2 711,754 75 2093,725 72,191 103,68 3 711,754 100 2167,998 100,668 100,67 4 711,754 100 2175,860 103,683 96,25 5 711,754 200 2416,990 196,137 98,07 6 711,754 200 2451,260 209,277 104,64 Trung bình 99,96 RSD (%) 3,31 ❖ Độ lặp lại Tiến hành định lượng 6 mẫu thử độc lập, mỗi mẫu thử tiêm lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình. Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu cao tổng bằng cách sử dụng đường chuẩn ở phần xác định khoảng tuyến tính. Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 trong 6 mẫu. Kết quả cho độ lệch chuẩn tương đối RSD < 5% (bảng 3.7) 33
  43. Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp Thí Khối lượng (g) Diện tích pic Hàm lượng nghiệm (mAU*s) 1 0.0968 660.082 2.42 2 0.0921 644.829 2.48 3 0.1060 743.029 2.51 4 0.1135 780.286 2.47 5 0.1245 880.372 2.56 6 0.0926 638.403 2.44 Trung bình 2.48 ± 0.05 RSD (%) 2.02 ❖ Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ Tiến hành pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn và phân tích HPLC đế n khi tín hiệu của chất định phân tích trên sắc ký đồ có tỉ lệ S/N (tín hiệu/ nhiễu) đạt khoảng từ 2-3, trong đó S là chiều cao pic chất phân tích, N là chiều cao tín hiệu nhiễu trên nền lớn nhất. Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện ( LOD) của phương pháp ứng với chất định phân tích. Giới hạn định lượng LOQ: Giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện LOQ = 3,3 x LOD. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có giới hạn phát hiện là LOD = 1,953 µg/ml, giới hạn định lượng LOQ = 3,3 x LOD = 6,445 µg/ml. Kết quả cho thấy phương pháp đã xây dựng có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tương đối phù hợp để xác định hàm lượng stipuleanosid R 2 trong dược liệu SVD . c) Kết quả định tính, định lượng Kết quả khảo sát cho thấy khoảng nồng độ của stipuleanosid R2 từ 15 , 625 g/ml đến 400 g/ml có sự tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích píc tương ứng. 34
  44. Dựa vào phương trình đường chuẩn đã xây dựng được ở trên là y = 2,6081x + 49,1185, ta có kết quả định lượng thành phần stipuleanosid R2 trong các mẫu cao giàu saponin của SVD được trình bày tại bảng 3.8. Bảng 3.8: Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu cao thử của SVD TT Tên mẫu % hàm lượng stipuleanosid R2 tính theo khối lượng khô tuyệt đối 1 Mẫu 1 2,21 2 Mẫu 2 2,24 3 Mẫu 3 2,28 Trung bình 2,24% ± 0,04 Nhận xét: Ta thấy hàm lượng Stipuleanosid R2 trong các mẫu thử nằm trong khoảng từ 2,2% đến 2,28%, trung bình 2,24% ± 0,04 . Giới hạn hàm lượng stipuleanosid R2 trong cao giàu saponin của dược liệu SVD qui định trong tiêu chuẩn không được thấp hơn 2, 0%. 3.2. Thảo luận 3.2.1. Về mô tả cao dược liệu Thử nghiệm đã chỉ ra được những đặc điểm bên ngoài giúp nhận biết sơ bộ về cao giàu saponin của SVD. Tuy nhiên, nghiên cứu mới chỉ được thực hiện trên mẫu cao đã được giám định tên khoa học thu hái tại Sa Pa – Lào Cai năm 2016, vì vậy chưa thể đảm bảo tính khách quan về độ chính xác của mô tả. Kết quả sẽ tốt hơn nếu thực hiện quan sát trên nhiều mẫu cao chiết của SVD được thu hái ở các vùng khác nhau. 3.2.2. Về khảo sát các tiêu chí của cao dược liệu Việc khảo sát về độ ẩm, tro toàn phần là những chỉ tiêu hết sức cần thiết đối với các mẫu cao dược liệu. Các mẫu thử nghiệm đều đạt được các chỉ tiêu theo quy định trong DĐVN V. Tuy nhiên, do thời gian và kinh phí có hạn nên mới chỉ khảo sát sơ bộ được hai chỉ tiêu này. Cần thiết phải thực hiện thêm các 35
  45. chỉ tiêu khác như: cắn không tan trong nước, pH, mất khối lượng do làm khô, tỉ lệ kim loại nặng 3.2.3. Về định tính và định lượng Sau khi tiến hành các thử nghiệm bằng phương pháp HPLC, xác định được trong mẫu SVD thu hái được ở Sa Pa có chứa thành phần stipuleanosid R2 và hàm lượng của chúng cũng nằm trong giới hạn theo quy định trong DĐVN V, không được thấp hơn 2%. Ngoài ra, nếu muốn thực hiện riêng thử nghiệm định tính ta có thể tiến hành theo phương pháp sắc kí lớp mỏng trên bản mỏng silicagel. Tuy nhiên, số lượng mẫu lấy để tiến hành thí nghiệm vẫn còn hạn chế, mới chỉ thu hái được một mẫu ở Sa Pa, chưa thể có tính đại diện cho chất lượng của cao khô SVD. Đồng thời, việc lấy mẫu ở các thời điểm khác nhau cũng có thể ảnh hưởng đến chất lượng của mẫu dược liệu để điều chế ra cao khô SVD. Vì vậy cần tiến hành thu thập thêm các mẫu dược liệu ở các địa phương khác nhau, cũng như thời điểm thu hái khác nhau để đưa ra sự thống nhất về các kết quả nghiên cứu. 36
  46. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. Kết luận Sau thời gian tiến hành thử nghiệm, chúng tôi đã đạt được một số kết quả theo đúng các mục tiêu đã đề ra: - Đã khảo sát và đưa ra được các chỉ tiêu cần thiết của một mẫu cao dược liệu đối với SVD bao gồm: mô tả, độ ẩm, tro toàn phần, định tính, định lượng. - Khảo sát và xây dựng được quy trình định lượng saponin bằng phương pháp HPLC tính theo stipuleanosid R2. 4.2. Đề xuất Do thời gian thực hiện luận văn có giới hạn nên bài luận văn chưa thể hoàn thiện đầy đủ các tiêu chuẩn đúng như quy định, sau đây tôi xin được đưa ra một số đề xuất để giúp hoàn thiện đề tài hơn: - Cần bổ sung thêm các chỉ tiêu chất lượng như: xác định lượng cắn không tan trong nước, độ pH, tỉ lệ kim loại nặng - Thẩm định các tiêu chuẩn cơ sở đối với cao giàu saponin của dược liệu SVD. - Mở rộng số lượng cỡ mẫu cao khô dược liệu SVD khác nhau về địa điểm, thời gian thu hái để có thể đảm bảo tính chính xác, sự thống nhất của các kết quả và đưa ra được ngưỡng giới hạn. 37
  47. TÀI LIỆU THAM KHẢO A – TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Tiến Bân (2003), Danh mục các loài thực vật Việt Nam-Tập II, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 1063-1093. [2] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung và cộng sự (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam - tập II, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 711-714. [3] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học - tập 1, NXB Y học, Hà Nội. [4] Bộ Khoa học và Công nghệ & Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam (2007), Sách đỏ Việt Nam – Phần II. Thực Vật, NXB Khoa học tự nhiên và công nghệ, tr. 86. [5] Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V – tập 2, NXB Y học. [6] Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích, Phụ lục 7 - Thông tư 22/2009 TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc. [7] Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr.107-113, 216- 250. [8] Nguyễn Thượng Dong, TS. Trần Công Luận, TS. Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 327-338. [9] Đỗ Văn Hào (2017), Nghiên cứu thành phàn hóa học của cây sâm vũ diệp thu hái ở Tây Bắc, Khóa luận tốt nghiệp, Trường đại học Quốc gia Hà Nội. [10] Nguyễn Thị Huệ (2017), Phân tích acid oleanolic và thành phần saponin trong rễ cây sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái ở Sa Pa, Khóa luận tốt nghiệp, Trường đại học Quốc gia Hà Nội.
  48. [11] Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự (2001), Công trình nghiên cứu Khoa học 1987-2000, Tác dụng kích thích miễn dịch của sâm Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 464-466. [12] Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích và Đoàn Thị Ngọc Hạnh (2005), "Nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam và đinh lăng trên trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 10(6), tr. 196-200. [13] Trần Công Luận (2002), Phân tích thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng), Đề tài cấp Bộ, tr. 1- 65. [14] Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên, Nguyễn Tập (2009), "Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)", Tạp chí dược liệu, 14(1), tr. 17-23. [15] Lê Thị Tâm (2017), Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các phân đoạn dịch chiết sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T sai et K. M. Feng) trên in vitro, Khoá luận tốt nghiệp đại học, Khoa y dược, ĐHQGHN. [16] Nguyễn Văn Tập (2005), "Các loài thuộc chi Panax L. ở Việt Nam", Tạp chí dược liệu, 10(3), tr. 71-76. [17] Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn (2006), “Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh thái sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 11(5), tr. 177-180. [18] Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2005), "Nghiên cứu một số tác dụng dược lý của lá sâm Việt Nam - Tác dụng chống stress và tác dụng chống oxy hóa", Tạp chí Dược liệu, 10(1), tr. 27-32. [19] Trần Mỹ Tiên, Nguyễn Thị Thu Hương (2006), "Xây dựng thử nghiệm tránh né thụ động để nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam trên trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 11(5), tr. 202-206.
  49. [20] Ngô Vân Thu (1990), Hóa học Saponin, Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, tr. 109-114. [21] Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu học – Tập 1, NXB Y học, tr. 191 – 213. [22] Nguyễn Thị Thu Thủy (2018), Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) trồng ở Sa Pa, luận văn thạc sĩ dược học, Trường đại học dược Hà Nội. B – TIẾNG ANH [23] Gurung, B., Bhardwaj, P. K., Rai, A. K., & Sahoo, D. (2017), “Major ginsenoside contents in rhizomes of Panax sokpayensis and Panax bipinnatifidus”, Natural Product Research, 32(2), 234–238. [24] Yang, B. R., Yuen, S. C., Fan, G. Y., Cong, W.-H., Leung, S.-W., & Lee, S. M.-Y. (2018), “Identification of certain Panax species to be potential substitutes for Panax notoginseng in hemostatic treatments”, Pharmacological Research, 134, 1–15. [25] Shin, B.-K., Kwon, S. W., & Park, J. H. (2015), “Chemical diversity of ginseng saponins from Panax ginseng”, Journal of Ginseng Research, 39(4), 287–298. [26] Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al. (2016), "In silico identification of anti-cancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database", Scientific Reports, 6(1). [27] Wang DQ, Fan J, Feng BS, Li SR, Wang XB, Yang CR, Zhou J (1989), “Studies on saponins from the leaves of Panax japonicas var. bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng”, “Yao Xue Xue Bao”, 24 (8), 593- 599. [28] International Plant Names Index, “Panax bipinnatifidus”. [29] Tung, N. H., Quang, T. H., Ngan, N.T.T., Minh, C.V., Anh, B.K., Long, P.Q., Kim, Y. H. (2011), “Oleanolic Triperpene Saponins from the Roots
  50. of Panax bipinnatifidus”, CHEMICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN, 59(11), 1417- 1420. [30] Moses, T., Papadopoulou, K. K., & Osbourn, A. (2014), “Metabolic and functional diversity of saponins, biosynthetic intermediates and semi- synthetic derivatives”. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 49(6), 439–462. [31] The Plant List (2010), “Panax bipinnatifidus”. [32] Vu Thi Thom et al (2018), “Antithrombotic activity and saponin coposition of the roots of Panax bipinnatifidus Seem. growing in Vietnam”, Pharmacognosy Research, 10(4), 333-338. [33] Ya-Zheng Zhao, Yuan-Yuan Zhang (10/2018), “Advances in the antitumor activities and mechanisms of action of steroidal saponins”, Chinese Journal of Natural Medicines, 16(10), 732-748.
  51. PHỤ LỤC 1: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC