›

Luận văn Xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ

pdf 78 trang phuongvu95 10450
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận văn Xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfluan_van_xac_dinh_ham_luong_crinamidin_trong_thuoc_va_thuc_p.pdf

Nội dung text: Luận văn Xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ LIÊN XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CRINAMIDIN TRONG THUỐC VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2018
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ LIÊN XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CRINAMIDIN TRONG THUỐC VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Nguyên Hà PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo HÀ NỘI 2018
  3. LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện luận văn này, tôi đã rất may mắn khi nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các chuyên gia, các nghiên cứu viên, các anh chị kỹ thuật viên cùng tình cảm và sự khích lệ mà gia đình và bạn bè đã dành cho tôi. Tôi xin được bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Nguyên Hà và PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo đã giao đề tài, luôn tâm huyết và tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn. Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành tới TS. Trần Cao Sơn đã cho tôi những lời khuyên quý báu, dành nhiều thời gian và tạo điều kiện tối đa giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Cao Công Khánh cùng các anh chị, các bạn khoa Nghiên cứu thực phẩm, khoa Độc học & dị nguyên, khoa Chất lượng, phụ gia và chất hỗ trợ chế biến thực phẩm – Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu, phòng Sau đại học, bộ môn Hóa phân tích – trường Đại học Dược Hà Nội, cùng các thầy cô đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè – những người đồng hành không thể thiếu trong học tập và cuộc sống đã luôn động viên và khích lệ tôi những ngày qua. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 28 tháng 03 năm 2018 Học viên Lê Thị Liên
  4. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦN 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về cây trinh nữ hoàng cung 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật 3 1.1.2. Nguồn gốc và phân bố, bộ phận sử dụng 4 1.1.3. Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L. 4 1.1.4. Tác dụng sinh học 5 1.2. Tổng quan về crinamidin 5 1.3. Một số nghiên cứu xác định crinamidin 7 PHẦN 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 15 2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 15 2.2.1. Chất chuẩn 15 2.2.2. Hóa chất, dung môi 16 2.2.3. Thiết bị, dụng cụ 16 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK 17 2.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng crinamidin bằng kỹ thuật GC-MS/MS 19 2.4. Ứng dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng crinamidin trong thuốc và TPBVSK 21 2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu 21 PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22 3.1. Xây dựng phƣơng pháp phân tích 22 3.1.1. Kết quả khảo sát các điều kiện tối ưu cho phương pháp định lượng crinamidin bằng GC-MS/MS 22
  5. 3.1.2. Kết quả khảo sát quá trình xử lý mẫu cho phương pháp định lượng crinamidin bằng GC-MS/MS 29 3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 39 3.2.1. Tính thích hợp của hệ thống 39 3.2.2. Tính đặc hiệu, chọn lọc 40 3.2.3. Khoảng tuyến tính 44 3.2.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 45 3.2.5. Độ lặp lại 46 3.2.6. Độ thu hồi 48 3.3. So sánh phƣơng pháp xây dựng với phƣơng pháp tiêu chuẩn Dƣợc điển Việt Nam IV 52 3.3.2. So sánh về giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của hai phương pháp 54 3.3.3. So sánh về hiệu suất của quy trình chiết trên nền mẫu lá TNHC của hai phương pháp 55 3.4. Kết quả xác định hàm lƣợng crinamidin trên một số mẫu thuốc và TPBVSK 57 PHẦN 4. BÀN LUẬN 61 4.1. Về phƣơng pháp chiết xuất crinamidin từ các chế phẩm chứa TNHC 61 4.2. Về xác định hàm lƣợng crinamidin bằng GC-MS/MS 61 4.3. Ứng dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng crinamidin trên mẫu thực 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 Kết luận 64 Kiến nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO
  6. DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ tiếng Việt (tiếng Anh) ACN Acetonitril AOAC Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức (Association of Official Analytical Communities) CE Điện di mao quản (Capillary electrophoresis) CHCl3 Cloroform DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV EI Bắn phá electron (Electron ionization) GC Sắc ký khí (Gas Chromatography) HCl Acid hydrocloric H3PO4 Acid phosphoric HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantification) MEKC Sắc ký điện động micell (Micellar electrokinetic chromatography) MeOH Methanol m/z Tỷ số khối lượng và điện tích của ion (Mass-to-charge ratio) MRM Giám sát đa phản ứng (Multiple reaction monitoring) MS Khối phổ (Mass Spectrometry) NH3 Amoniac NXB Nhà xuất bản PDA Dãy diod quang (Photodiode array) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) SFE Chiết lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction) tR Thời gian lưu TNHC Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) TPBVSK Thực phẩm bảo vệ sức khỏe UV-VIS Tử ngoại – khả kiến (Ultra violet – Visible)
  7. DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Tính chất lý hóa và tác dụng sinh học của crinamidin 6 Bảng 1.2: Một số nghiên cứu xác định crinamidin và nhận xét 7 Bảng 3.1: Các mảnh ion mẹ và ion con của crinamidin sau khi bắn phá 23 Bảng 3.2: Các mảnh ion mẹ và ion con của cafein sau khi bắn phá 23 Bảng 3.3: Điều kiện tối ưu hóa GC-MS/MS 28 Bảng 3.4: Khảo sát quy trình xử lý mẫu 29 Bảng 3.5: Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu 30 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát số lần chiết mẫu 33 Bảng 3.7: Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu 35 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết 37 Bảng 3.9: Thời gian lưu và diện tích pic qua 6 lần tiêm mẫu 40 Bảng 3.10: Tỷ lệ các ion crinamidin của dung dịch thêm chuẩn crinamidin 43 Bảng 3.11: Phương trình đường chuẩn crinamidin và hệ số tương quan tuyến tính 44 Bảng 3.12: Giá trị LOD và LOQ của crinamidin 45 Bảng 3.13: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền viên nang cứng 46 Bảng 3.14: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền trà túi lọc 47 Bảng 3.15: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền cao lỏng 47 Bảng 3.16: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền viên nang cứng 49 Bảng 3.17: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền trà túi lọc 50 Bảng 3.18: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền cao lỏng 51 Bảng 3.19: Quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký của phương pháp tiêu chuẩn và phương pháp xây dựng 52 Bảng 3.20: Giá trị LOD và LOQ của crinamidin 54 Bảng 3.21: Kết quả phân tích hàm lượng crinamidin trong mẫu chuẩn và thử bằng phương pháp tiêu chuẩn và phương pháp xây dựng 56 Bảng 3.22: Kết quả xác định hàm lượng crinamidin từ các mẫu thuốc và TPBVSK 58 Bảng 3.23: Kết quả xác định hàm lượng crinamidin từ các mẫu cao và trà túi lọc. 59
  8. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) 3 Hình 1.2: Công thức cấu tạo crinamidin 6 Hình 2.1: Hệ thống sắc ký khí khổi phổ 2 lần (GC-MS/MS) 18 Hình 3.1: Phổ khối của crinamidin sau khi bắn phá ion 23 Hình 3.2: Phổ khối của cafein sau khi bắn phá ion 23 Hình 3.3: Sắc ký đồ tổng (TIC) của crinamidin và chuẩn nội cafein 24 Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi MeOH 25 Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi ACN 25 Hình 3.6: Sắc ký đồ chuẩn crinamidin 20 µg/mL chế độ tiêm không chia dòng 26 Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL, chương trình nhiệt độ (*) . 27 Hình 3.8: Sắc đồ của dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi CHCl3, chế độ tiêm chia dòng 10 : 1, chương trình nhiệt độ ( ) 27 Hình 3.9: Biểu đồ kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu trên ba nền mẫu 31 Hình 3.10: Sơ đồ quy trình chiết xuất crinamidin từ chế phẩm TNHC 32 Hình 3.11: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và số lần chiết mẫu 34 Hình 3.12: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và thời gian chiết mẫu 36 Hình 3.13: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và tỷ lệ dung môi chiết 38 Hình 3.14: Quy trình xử lý mẫu tối ưu 39 Hình 3.15: Sắc ký đồ dung môi CHCl3 41 Hình 3.16: Sắc ký đồ placebo viên nang thêm chuẩn nội cafein 41 Hình 3.17: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL, chuẩn nội cafein 42 Hình 3.18: Sắc ký đồ của dung dịch thêm chuẩn crinamidin 42 Hình 3.19: Sắc ký đồ tỷ lệ ion của crinamidin và cafein của dung dịch chuẩn 20 µg/mL . 43 Hình 3.20: Đồ thị đường chuẩn crinamidin, chuẩn nội cafein 44 Hình 3.21: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 0,3 µg/mL 45 Hình 3.22: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền viên nang cứng 48 Hình 3.23: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền trà túi lọc 48 Hình 3.24: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền cao lỏng 48 Hình 3.25: Sắc ký đồ mẫu thực viên nang cứng 49
  9. Hình 3.26: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 160 µg chuẩn crinamidin 49 Hình 3.27: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 200 µg chuẩn crinamidin 50 Hình 3.28: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 240 µg chuẩn crinamidin 50 Hình 3.29: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 2 µg/mL (HPLC) 55 Hình 3.30: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 0,3 µg/mL (GC-MS/MS) 55 Hình 3.31: Đường chuẩn crinamidin từ 10 đến 100 µg/mL (HPLC) 57 Hình 3.32: Đường chuẩn crinamidin từ 5 đến 50 µg/mL, chuẩn nội cafein (GC-MS/MS) 57
  10. ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với sự phát triển của xã hội, mô hình bệnh tật ngày càng trở nên phức tạp. Bệnh tật không chỉ làm rút ngắn tuổi thọ mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng cuộc sống con người. Khoa học và y – dược học ngày nay đã có những bước tiến vượt bậc và đạt được nhiều thành tựu to lớn trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh. Sự phát triển này đã góp phần phong phú hóa số lượng và đa dạng hóa chủng loại thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) trên thị trường, trong đó thuốc và sản phẩm có nguồn gốc thảo dược ngày càng tỏ ra ưu thế và chiếm được niềm tin của người sử dụng vì sự an toàn của các hợp chất thiên nhiên. Tại Việt Nam, với mục tiêu bảo vệ, chăm sóc và nâng cao sức khỏe nhân dân, nhiều chính sách, chiến lược quốc gia trong lĩnh vực y – dược học được đưa ra, trong đó bảo tồn và phát triển ngành dược liệu Việt Nam là một định hướng quan trọng trong thời gian tới [6], [15]. Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) là loại dược liệu quý được biết đến với tác dụng hỗ trợ điều trị u xơ tử cung, phì đại tuyến tiền liệt và ung thư tuyến tiền liệt [10]. Lá trinh nữ hoàng cung (TNHC) chứa nhiều thành phần, trong đó đáng quan tâm nhất là nhóm alkaloid vì có tác dụng sinh học, điển hình như crinamidin, ambellin, lycorin, Sự hiện diện của TNHC được biểu thị qua hoạt chất đặc trưng điển hình, đồng thời là hoạt chất chính trong cây cho tác dụng sinh học là crinamidin. Chế phẩm chứa TNHC được bán tại các nhà thuốc, quầy thuốc, cửa hàng đông y, thậm chí cửa hàng tạp hóa và các kênh bán hàng online. Mỗi chế phẩm lại có một công thức bào chế khác nhau, từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau, hệ quả là hàm lượng crinamidin trong từng chế phẩm cũng không như nhau. Trong khi tiêu chuẩn cho các chế phẩm này chưa được hoàn thiện, nhà sản xuất đã lợi dụng kẽ hở để trục lợi, sử dụng nhiều nguồn nguyên liệu không rõ nguồn gốc đưa vào sản xuất, sử dụng các nguyên liệu khác thay thế mà không có tác dụng sinh học theo công bố trên nhãn. Đây cũng chính là mấu chốt của vấn nạn thuốc và TPBVSK thật hay giả hiện đang là chủ đề mang tính thời sự, nhận được nhiều sự quan tâm của báo chí và dư luận thời gian qua. Vì vậy, việc tiêu chuẩn hóa chất lượng chế phẩm chứa TNHC là vô cùng quan trọng và cấp thiết. 1
  11. Hiện nay, Dược điển Việt Nam IV bản bổ sung năm 2015 quy định hàm lượng crinamidin (C17H19NO5) trong nguyên liệu lá TNHC không thấp hơn 0,08% tính theo khối lượng khô kiệt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [3], mà chưa đưa ra quy định đối với các chế phẩm chứa thành phần TNHC. Để xác định chất lượng sản phẩm TNHC, hàm lượng crinamidin là đại lượng quy chiếu được lựa chọn. Bên cạnh đó, phương pháp sắc ký khí khối phổ hai lần (GC- MS/MS) là phương pháp ưu việt, có khả năng xác định các hợp chất hữu cơ trong hỗn hợp với độ phân giải cao, chọn lọc và đặc hiệu hơn nhiều so với phương pháp HPLC. GC-MS/MS là phương pháp rất thích hợp cho việc định lượng hoạt chất trong các chế phẩm thuốc và TPBVSK với nền mẫu phức tạp đồng thời hàm lượng crinamidin giảm nhiều lần so với hàm lượng trong nguyên liệu lá TNHC. Để góp phần kiểm soát chất lượng của các chế phẩm trên thị trường, đảm bảo quyền lợi của người sử dụng và sự chặt chẽ trong quản lý, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ”, với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK bằng sắc ký khí khối phổ. 2. Ứng dụng phương pháp xây dựng để xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK. 2
  12. Phần 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây trinh nữ hoàng cung 1.1.1. Đặc điểm thực vật Cây trinh nữ hoàng cung (TNHC), còn gọi là hoàng cung trinh nữ, tây nam văn châu lan, thập bát học sĩ (Trung Quốc), tỏi Thái Lan, tỏi lơi lá rộng, có tên khoa học là Crinum latifolium L., thuộc họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) [7], [10]. TNHC là một loại cây cỏ, thân hành như củ hành tây to, đường kính 10 – 15cm, bẹ lá úp vào nhau thành một thân giả dài 10 – 15cm, có nhiều lá mỏng kéo dài từ 80 – 100cm, rộng 3 – 8cm, hai bên mép lá lượn sóng. Gân lá song song, mặt trên lá lõm thành rãnh, mặt dưới lá có một sống lá nổi rất rõ, đầu bẹ lá nơi sát đất có màu đỏ tím. Hoa mọc thành tán gồm 6 – 18 hoa, trên một cán hoa dài 30 – 60cm. Cánh hoa màu trắng có điểm màu tím đỏ, từ thân hành mọc rất nhiều củ con có thể tách ra trồng riêng dễ dàng [10], [14], [39]. Hình 1.1: Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) 3
  13. 1.1.2. Nguồn gốc và phân bố, bộ phận sử dụng TNHC là cây ưa ẩm, ưa sáng hoặc có thể chịu bóng một phần, sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới. Cây TNHC hiện được trồng rộng rãi ở nhiều nước trong khu vực như Thái Lan, Malaysia, Philippin, Campuchia, Lào, Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc. Ở Việt Nam, cây mọc hoang ven suối trong rừng một số nơi thuộc tỉnh Đồng Nai và Bà Rịa-Vũng Tàu, tự mọc và được trồng chủ yếu ở Huế, Đà Nẵng, Nha Trang và một số tỉnh phía Nam, sau được trồng ở các tỉnh phía Bắc [7], [18]. TNHC được xếp vào nhóm Thanh nhiệt giải độc [5]. Bộ phận sử dụng là lá (Folium Crinii latifolii) dùng tươi hay phơi hoặc thái nhỏ sao vàng dùng dần. [10], [13], [18]. 1.1.3. Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L. Các nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản và Việt Nam đã nghiên cứu thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L. như sau: + Crinum latifolium L. Ấn Độ: 11-O-Acetylambellin, 11-O-Acetyl-1,2-β- epoxyambellin, Ambelin, Crinafolidin, Crinafolin, (-) 2-Epilycorin, 2- Epipancrassidin, 1,2-β-epoxyambellin, Hippadin (Pratorin, Alkalois N3), Latindin, Latisodin, Latisolin (Latisodin-O-β-D-glucopyranosyl), (-) Lycorin, (-) Lycorin-1- 0-β-glucosid, Pratorimin, Pratorinin, Pratosin, Pseudolycorin-1-0-β-D-glucosid [27]. + Crinum latifolium L. Nhật Bản: 3-O-Acetylhamayn, (-) Acetyllycorin, Cheryllin (S), (+) Crinamin, (-) Crinin (Vittatin, Crinidin), Hamayn (Bulbispermin, Demethylcrinamin), Hipeastrin, Latifin (S), Powellin, Undulatin [35]. + Crinum latifolium L. Việt Nam: 9-Octadecenamid, Dihydro-oxo- demethoxyhaemanthamin, Augustamin, Oxoassoanin, Crinan-3-α-ol, Buphannidrin, Powellin, Undulatin, Ambellin, 6-hydroxybuphannidrin, 1β,2β-epoxyambellin, 6-hydroxycrinamidin, Epoxy-3,7-dimethoxycrinan-11-one, Lycorin và Pratorin (Hippadin) và các flavonoid: 4’7-dihydroxy-3-vinyloxyflavan, 4’7-dihydroxyflavan, kaemperol-3-O-β-glucopyranosid [8], [14], [39]. Từ lá cây TNHC, Võ Thị Bạch Huệ cũng đã tách được 18 vết bằng kỹ thuật sắc ký ghép khối phổ, trong đó xác định được cấu trúc của 3 vết là ambellin, 4
  14. crinamidin và 6 – OH – crinamidin sau khi so sánh thời gian lưu, khối phổ với 3 alkaloid đơn chất [8]. Thành phần hóa học khác của cây Crinum latifolium L. + Crinum latifolium L. Nhật Bản có Glucan a và Glucan b. + Crinum latifolium L. Việt Nam có 32 chất bay hơi và saponin, acid hữu cơ, amino acid, p-hydroxycinnamat metyl, 3,4’-dihydroxycinnamat ethyl, keampferol- 3-4-di-O-β-D-glucopyranosit. 1.1.4. Tác dụng sinh học Ở Ấn Độ, người ta dùng bẹ của cây xào nóng giã đắp làm thuốc trị bệnh thấp khớp; cũng dùng đắp mụn nhọt và áp xe để gây mưng mủ. Còn dịch lá dùng làm thuốc nhỏ tai chữa đau tai [18]. Từ những năm 1989 – 1990, người dân Việt Nam đã biết cách sử dụng TNHC để chữa những trường hợp u xơ và ung thư cổ tử cung (ở phụ nữ) và ung thư tuyến tiền liệt (ở nam giới) [10], [31]. TNHC còn được sử dụng để hỗ trợ điều trị bệnh u xơ tử cung, ung thư vú, tử cung, dạ dày, phổi và tuyến tiền liệt, viêm da lở loét, dị ứng mẩn ngứa. Hoạt tính chống oxi hóa, giảm đau, chống viêm, chống lại sự tăng sinh quá mức của các tế bào và sự phát triển của khối u [32]. Ngoài ra còn có khả năng chống ngưng kết tiểu cầu, chống độc tế bào [29], ức chế sự hình thành mạch máu của các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của người (HUVECs) và điều hòa hệ miễn dịch của cơ thể [33], [40]. Các tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm, E. Zvetkova và cộng sự cũng đã chứng minh dịch chiết nước nóng từ lá cây TNHC Việt Nam có thể kích thích hữu hiệu sự sinh sản của tế bào lympho T và đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp lên các tế bào TCD3, TCD4 invitro [20]. Lá tươi và thân hành dùng ngoài, hơ nóng xoa bóp vào chỗ sưng đau do thấp khớp, sang chấn [3]. 1.2. Tổng quan về crinamidin Crinamidin là alkaloid trong cây TNHC (Crinum latifolium L.), có công thức cấu tạo như hình 1.2. 5
  15. Hình 1.2: Công thức cấu tạo crinamidin Bảng 1.1: Tính chất lý hóa và tác dụng sinh học của crinamidin Crinamidin Công thức phân tử C17H19NO5 (Khối lượng phân (M = 317,34 g/mol) tử) Tên IUPAC (1β,2β,3α)-7-Methoxy-1,2-epoxycrinan-3-ol Phổ IR có các băng hấp thụ cực đại (cm-1) ở 3200 – 3400 (- OH), 1499, 1278 (epoxy), 1035, 918 (-OCH2O-), 802 (epoxy). Phổ hấp thụ Phổ UV – VIS có bước sóng hấp thụ cực đại ở 220 và 285 nm. Phổ HR – MS cho mảnh có số khối 318,1369 m/z tương ứng với mảnh ion phân tử giả [M+H]+ [19], [26]. Tính chất vật lý, hóa Crinamidin là chất bột kết tinh màu trắng, điểm chảy 215 – o o học 217 C, – 10 (CHCl3; 0,1 g/ml) [19], [26]. 6
  16. Crinamidin là một alkaloid trong cây TNHC, cùng với các alkaloid khác cho tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư tử cung, ung thư tuyến tiền liệt, kháng khối u, kháng viêm, chống oxi hóa và kích thích miễn dịch [20], [32]. Các nhà khoa học đã chứng minh tác dụng đối một số bệnh ung thư như ung thư vú, tử cung, dạ dày, phổi và các bệnh Tác dụng sinh học viêm da lở loét, dị ứng mẩn ngứa, chống oxi hóa, giảm đau, chống viêm, chống lại sự tăng sinh quá mức của các tế bào và sự phát triển của khối u [32]. Ngoài ra còn có khả năng chống ngưng kết tiểu cầu, chống độc tế bào [29], ức chế sự hình thành mạch máu của các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của người [33], [40]. 1.3. Một số nghiên cứu xác định crinamidin Các nghiên cứu xác định crinamidin bao gồm khảo sát, định tính, định lượng và tinh chế, trong đó có tiêu chuẩn DĐVN IV đưa ra quy định về hàm lượng crinamidin trong lá TNHC. Kỹ thuật chính được sử dụng để định lượng là HPLC. Kỹ thuật GC-MS được sử dụng để khảo sát thành phần trong cây và định tính. Chưa có nghiên cứu về định lượng crinamidin bằng GC-MS/MS. Các nghiên cứu xác định crinamidin được tổng hợp trong bảng 1.2. Bảng 1.2: Một số nghiên cứu xác định crinamidin và nhận xét Tài Phương pháp nghiên cứu Kết quả Nhận xét liệu [2] Điều kiện phân tích HPLC: Thời gian lưu của Thời gian sắc ký Cột C18. Pha động: ACN – đệm crinamidin khoảng dài, quy trình chiết phosphat 100 mM, pH 3,0. 33 phút. chưa thực sự tối Gradient thành phần pha động Khoảng tuyến tính ưu, cụ thể: (0 – 65 phút). Detector UV 285 của crinamidin từ - Quy trình áp nm. Tốc độ dòng: 1 – 1,5 30 µg/mL đến 300 dụng cho lá: phải mL/phút. Thể tích tiêm: 50 µL. µg/mL. siêu âm và lọc 7
  17. Phương pháp xử lý mẫu: LOQ trong lá nhiều lần, phương - Lá: Làm ẩm bột dược liệu bằng TNHC là 4,2 pháp chưa có bước NH3, sau 1 giờ, thêm 50 mL µg/mL, trong viên loại tạp. CHCl3 – MeOH (3:1), siêu âm 30 nang là 4,9 µg/mL. - Quy trình áp phút, lọc. Bã chiết thêm 4 lần. Cô dụng cho viên dịch chiết. Hòa cắn bằng 20 mL nang: quy trình HCl 0,1N. chiết xuất mất - Viên nang: Làm ẩm bột bằng nhiều thời gian do NH3, sau 1 giờ, chiết Soxhlet, thời gian ngấm kiệt ngâm qua đêm. Đun hồi lưu 5 kéo dài và một số giờ. Cô dịch chiết. Hòa cắn bằng giai đoạn tiến hành HCl nhiều lần. Kiềm hóa đến pH làm lặp nhiều lần 10 – 11, lắc với CHCl3 5 lần. Cô dịch CHCl3. Hòa cắn bằng 20 mL HCl 0,1N. [3] Điều kiện phân tích HPLC: Yêu cầu hàm Thời gian sắc ký Cột C18. Pha động: ACN – đệm lượng crinamidin dài, quy trình chiết phosphat 100 mM, pH 3,0. không nhỏ hơn chưa thực sự tối Gradient thành phần pha động 0,08% (theo khối ưu, phải siêu âm và (0 – 65 phút). Detector UV, bước lượng) crinamidin lọc nhiều lần, sóng phát hiện 285 nm. (C17H19NO5) tính phương pháp chưa Tốc độ dòng: 1 – 1,5 mL/phút. theo dược liệu khô có bước loại tạp. Thể tích tiêm: 50 µL. kiệt. Phương pháp xử lý mẫu: Làm ẩm bột lá bằng NH3, sau 1 giờ, thêm 50 mL CHCl3 – MeOH (3:1), siêu âm 30 phút, lọc. Bã được chiết thêm 4 lần. Cô dịch chiết. Hòa cắn bằng HCl 0,1N. 8
  18. [17] Điều kiện phân tích HPLC: Xây dựng được bộ Cao alkaloid toàn Cột C8. Pha động: MeOH – dữ liệu chuẩn phần có thể chất H3PO4 pH 2,3 (15 : 85). Nhiệt độ crinamidin và thiết sạch, ít tạp nhày, cột 40oC. Thể tích tiêm 10 µL. lập được 500 mg nhựa, tuy nhiên hệ Detector PDA 214 nm. chất chuẩn với độ thống chiết SFE Phương pháp xử lý mẫu: tinh khiết 98,74%. không phổ biến tại Bột lá TNHC được chiết với CO2 các phòng thí lỏng siêu tới hạn (SFE), chiết cao nghiệm, vận hành toàn phần bằng cách ngấm kiệt. phức tạp, tốn kém. GĐ1: Làm ẩm bột lá TNHC bằng Thời gian chiết cồn 96% trong 12 giờ. Nạp vào xuất kéo dài. bình chiết, thu hồi dung môi được cao SFE. GD2: Chiết cao alkaloid toàn phần bằng phương pháp ngấm kiệt. [19] Điều kiện phân tích HPLC: Crinamidin cho Quy trình được xây Cột C8. Pha động: thời gian lưu ~ 6,8 dựng để thiết lập MeOH – H3PO4 0,1% (35 : 65). phút. chuẩn crinamidin Tốc độ dòng: 1 mL/phút. Nhiệt Thu được 1,5 g và phương pháp độ cột: 30oC. Thể tích tiêm: 20 crinamidin đạt tiêu này chưa thật sự µL. chuẩn chuẩn gốc phù hợp để cải tiến Phương pháp xử lý mẫu: với hàm lượng thành phương pháp Bột lá TNHC (100kg) được chiết 99,85%. định lượng ngấm kiệt với ethanol 96%, cô crinamidin trong thu hồi dung môi được cao TNHC do thời gian ethanol. chiết xuất kéo dài. Tiếp tục chiết xuất thu được cao chiết pH = 4 (2,5kg), cao chiết 9
  19. pH = 9 (210g). Cao pH 9 (130g) được sắc ký cột nhanh (VLC) trên silicagel với hệ dung môi: dicloromethan – MeOH. [16] Điều kiện phân tích HPLC: Xây dựng được Kết hợp chiết Cột: C8. Pha động: MeOH – quy trình định alkaloid và H3PO4 pH 3,0 và 0,2% lượng đồng thời 6 flavonoid, định Triethanolamin. alkaloid bằng lượng đồng thời Gradient thành phần pha động (0- phương pháp được nhiều 30 phút). Detector PDA ở 214 HPLC. alkaloid và nm. Chiết SFE thu flavonoid. Tuy Tốc độ dòng: 1 mL/phút. Thể tích được alkaloid nhiên trang thiết bị tiêm: 10 µL. Nhiệt độ cột: 40oC. 0,24%, ngấm kiệt SFE tốn kém, vận Phương pháp xử lý mẫu được 0,60%. hành phức tạp, cần (HPLC) Không có sự khác phải thực hiện Chiết cao cồn: làm ẩm dược liệu biệt kết quả định nhiều khảo sát để bằng dung môi chiết 12 giờ, lượng alkaloid và tìm các thông số ngâm dược liệu 24 giờ. Gộp dịch flavonoid trong lá tối ưu áp suất, thời chiết, cô cách thủy được cao cồn. TNHC bằng gian, nhiệt độ, khối Hòa tan cao cồn trong HCl. Lắc phương pháp lượng mẫu, dung dịch acid với ethyl acetat. Kiềm HPLC hoặc CE. môi hỗ trợ và tỷ lệ hóa dịch acid, lắc với CHCl3. Cô dung môi hỗ trợ. thu hồi dung môi CHCl3 được Phương pháp này phân đoạn alkaloid. tốn nhiều thời gian Phương pháp xử lý mẫu (CE): và chi phí cao, khó Chiết SFE bột lá thu được cao phổ biến trên thực SFE và dược liệu sau SFE. Hòa tế. tan cao trong acid, kiềm hóa, lắc Alkaloid trong cây 10
  20. với CHCl3 được phân đoạn tồn tại chủ yếu ở alkaloid. dạng muối cũng là Dược liệu sau SFE được chiết trở ngại lớn trong ngấm kiệt với cồn. Lấy phần dịch chiết SFE. chiết đã loại cồn, acid hóa, lắc với ethyl acetat. Dịch chiết được kiềm hóa, thêm CHCl3 được phân đoạn alkaloid. [8] Điều kiện sắc ký: Kết quả (A) tách Nghiên cứu này Cột DB 15m silica tan chảy, khí được 17 vết có nêu phương thức mang heli. Chương trình nhiệt thời gian lưu từ 15 chuyển đổi 60oC/phút, tăng đến 120oC đến 35 phút. Còn alkaloid chiết xuất (30oC/phút) rồi tăng đến 320oC (B) tách không tốt từ lá TNHC thành (10oC/phút), 1µL không chia nên được tạo thành những chất dễ bay dòng (1 phút). dẫn chất dễ bay hơi để có thể dễ GC – EIMS, cột silica tan chảy hơi để tách bằng dàng tách bằng sắc 30m x 0,25 mm x 0,25 µm. Tiêm sắc ký khí. Kết quả ký khí. mẫu chia dòng 1/30, 1 µL, nhiệt (B) tách được 18 Nghiên cứu này độ interface 280oC. Chương trình vết có thời gian mới chỉ dừng ở nhiệt 60oC/phút, tăng dần đến lưu từ 3 đến 15 việc khảo sát sơ bộ 120oC (30oC/phút) rồi tăng đến phút, trong đó xác các alkaloid chiết 320oC (10oC/phút). Thế năng 70 định được cấu trúc từ cây TNHC, xác eV. EIMS với nhiệt độ nguồn của 3 vết ambellin, định sự hiện diện 200oC, thế năng 70 eV, dòng bẫy crinamidin và 6- của một số chất 200 µA. Chương trình nhiệt 300C hydroxo- phân lập từ cắn tăng lên đến 520oC (1oC/giây). crinamidin sau khi alkaloid toàn phần Phương pháp xử lý mẫu: so sánh thời gian (phải qua giai Lá TNHC ngấm kiệt bằng cồn lưu, khối phổ với 3 đoạn tinh chế) mà 50o chứa HCl (pH = 6). Dịch alkaloid đơn chất. chưa đưa ra 11
  21. chiết cồn được trung hòa, cô thu phương pháp định hồi dung môi và chỉnh đến pH = lượng cho các 8, lắc với heptan, rồi tiếp tục thành phần chỉnh đến pH = 10, lắc với alkaloid của CHCl3. Cô thu hồi dung môi TNHC. heptan được cắn (A) và thu hồi CHCl3 được cắn (B). Tinh chế để được alkaloid toàn phần tinh khiết, cắn (A) và (B) được thực hiện sắc ký khí. [38] Điều kiện phân tích GC-MS: Xác định được 16 Quy trình chiết đơn Cột sắc ký 30 m x 0,25 mm x alkaloid (trong đó giản, có bước loại 0,25 µm. Chương trình nhiệt độ có 1 là tạm thời). tạp. Tuy nhiên hiệu từ 150oC đến 270oC với tốc độ Một số thành phần suất chiết không 5oC/phút, thời gian chuyển nhiệt không xác định cao, phù hợp hơn độ: 10 phút. Khí mang: heli tốc được do thiếu chất trong định tính độ 0,9 mL/phút. Điện thế ion hóa chuẩn và thư viện alkaloid. 70 eV. phổ chuẩn. Phương pháp xử lý mẫu Lá TNHC được chiết với nước sôi, acid hóa, rồi chiết với light petroleum và CHCl3, kiềm hóa dịch acid, chiết với CHCl3. Dịch chiết CHCl3 (0,02g). Tiêm sắc ký. 12
  22. Nhận xét: Hiện nay, duy nhất DĐVN IV bản bổ sung đưa ra tiêu chuẩn cho lá khô TNHC thông qua hàm lượng crinamidin, sử dụng kỹ thuật HPLC. Các nghiên cứu trên đã đưa ra nhiều quy trình chiết xuất khác nhau; định tính, định lượng và phân lập crinamidin chủ yếu trên đối tượng nguyên liệu lá TNHC. Quy trình chiết xuất cần nhiều thời gian và công sức, đa phần các nghiên cứu dừng lại ở định tính hoạt chất trong cây. Các nghiên cứu về chế phẩm chứa TNHC còn hạn chế. Việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất đóng vai trò quan trọng trong tiêu chuẩn hóa. Về chiết xuất, có 2 cách chính để chiết alkaloid ra khỏi dược liệu [9]: - Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ ít phân cực cho hiệu suất chiết cao do dịch chiết rút ra sạch, dễ tinh chế loại tạp. Hiện nay, đây vẫn là phương pháp được sử dụng nhiều để chiết alkaloid từ dược liệu, đặc biệt là các dược liệu có nhiều chất nhầy có độ trương nở cao. - Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước có ưu điểm là dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, thiết bị đơn giản, đầu tư ít. Tuy nhiên dịch chiết rút ra lẫn nhiều tạp, mất mát nhiều trong khâu tinh chế nên thường cho hiệu suất chiết thấp. Với mục đích tạo được hiệu suất chiết cao nhất trong thời gian chiết xuất ngắn nhất phục vụ việc định lượng một cách chính xác nhất, chúng tôi cải tiến phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ dựa trên phương pháp tiêu chuẩn của DĐVN IV đồng thời so sánh với phương pháp chiết bằng dung dịch acid. Về kỹ thuật định lượng, các nghiên cứu chủ yếu sử dụng phương pháp HPLC. Đây là phương pháp phổ biến trong định lượng hầu hết các chất hiện nay. Tuy nhiên thời gian phân tích kéo dài; hình dạng pic, độ phân giải chịu ảnh hưởng nhiều của pH. Có thể xuất hiện nhiều pic tạp quanh thời gian lưu của pic chính dẫn đến khó xác định đúng pic crinamidin, do đó tính đặc hiệu không cao. Nhận thấy phương pháp GC–MS được sử dụng ở nghiên cứu [8], [38] tách các pic khá tốt, độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, các nghiên cứu này chỉ tập trung tách và 13
  23. phân lập hoạt chất crinamidin trong lá TNHC. Các nghiên cứu này cần mẫu có hàm lượng lớn của TNHC mà các chế phẩm thuốc và TPBVSK trên thị trường là sự kết hợp của nhiều thành phần dược liệu và tá dược nên hàm lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK cũng khác nhau và nhỏ hơn nhiều lần so với hàm lượng crinamidin trong nguyên liệu lá TNHC. Với hàm lượng crinamidin giảm nhiều lần trong chế phẩm, nền mẫu phức tạp, để trả lời chính xác nhất hàm lượng crinamidin, cần lựa chọn phương pháp có độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn. Trên cơ sở các ưu điểm của phương pháp GC–MS/MS và các nghiên cứu đã thực hiện, với mục đích xác định hoạt chất trong những chế phẩm chứa TNHC ở hàm lượng nhỏ, GC–MS/MS là phương pháp có độ nhạy, độ chọn lọc cao được lựa chọn để xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK. 14
  24. Phần 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là hoạt chất crinamidin (C17H19NO5). Đối tượng mẫu được lựa chọn là một số mẫu thuốc thảo dược, cao và TPBVSK TNHC trên thị trường cùng một số mẫu cao và TPBVSK tại Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia. Đối tượng mẫu được lựa chọn để khảo sát điều kiện và thẩm định phương pháp là mẫu nang cứng, mẫu trà túi lọc và mẫu cao lỏng TNHC. 2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 2.2.1. Chất chuẩn Chất chuẩn crinamidin – Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh. Số lô: ATNHC01 Hàm lượng: 93,1% C17H19NO5 (Nguyên trạng) Pha dung dịch chuẩn crinamidin: Dung dịch chuẩn gốc crinamidin: cân chính xác khoảng 4,30 mg chất chuẩn crinamidin hòa tan bằng CHCl3, chuyển vào bình định mức 20 mL và định mức tới vạch. Dung dịch chuẩn gốc crinamidin có nồng độ 200 µg/mL được bảo quản ở 2-8°C. Dung dịch chuẩn trung gian crinamidin: dùng pipette có bầu hút 5 mL dung dịch chuẩn gốc crinamidin 200 µg/mL vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng CHCl3 được dung dịch chuẩn trung gian crinamidin có nồng độ 100 µg/mL. Dung dịch chuẩn trung gian crinamidin 100 µg/mL được bảo quản ở 2-8°C. Dung dịch chuẩn làm việc crinamidin: pha các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ từ 0,5 đến 50 µg/mL từ dung dịch chuẩn trung gian crinamidin 100 µg/mL trong CHCl3 . Các dung dịch chuẩn làm việc được bảo quản ở 2-8°C. Chất chuẩn cafein – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương SKS: 0316099.03 Hàm lượng: 99,57% C8H10N4O2 (Nguyên trạng) 15
  25. Pha dung dịch chuẩn nội cafein: Dung dịch chuẩn gốc cafein: cân chính xác khoảng 10,04 mg chất chuẩn cafein hòa tan bằng CHCl3, chuyển vào bình định mức 10 mL và định mức tới vạch. Dung dịch chuẩn gốc cafein có nồng độ 1000 µg/mL được bảo quản ở 2-8°C. Dung dịch chuẩn làm việc cafein: dùng micropipette hút chính xác 2500 µL dung dịch chuẩn gốc cafein 1000 µg/mL vào bình định mức 20 mL, định mức đến vạch bằng CHCl3 được dung dịch chuẩn làm việc cafein có nồng độ 125 µg/mL trong CHCl3. Dung dịch chuẩn làm việc cafein được bảo quản ở 2-8°C. 2.2.2. Hóa chất, dung môi Là những chất tinh khiết sử dụng cho sắc ký: NH3 25% (Merck); CHCl3 (Merck); MeOH (Merck); HCl 0,1N; Kali dihyrophosphat (Merck); H3PO4 (Merck); ACN (Merck). 2.2.3. Thiết bị, dụng cụ 2.2.3.1. Thiết bị: Hệ thống sắc ký khối phổ hai lần GC-MS/MS gồm thiết bị khối phổ kiểu ba tứ cực 7000B Tripple Quad kết nối với máy sắc ký khí GC7890 và bộ tiêm mẫu tự động CTC của hãng Agilent, Mỹ. Khí Heli (Messer, Đức) được sử dụng làm khí mang và khí va chạm. Sử dụng cột tách DB5-MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) của Agilent, Mỹ để khảo sát quá trình tách và xác định crinamidin. Hệ thống HPLC của Shimadzu, Nhật gồm bơm LC20ADVP, detector PDA và bộ phận tiêm mẫu tự động. Cột Symmetry C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) và tiền cột C18 (3,9 mm x 5 mm x 5m µm) của Waters, Mỹ được sử dụng để tách crinamidin. Cân phân tích Metler Toledo; cân kỹ thuật XT220A của Precisa; máy đồng nhất mẫu, Philips; máy lắc Vortex Genie; máy rung siêu âm; bếp đun bình cầu Wise Therm; máy lắc ngang; máy ly tâm Hermle; bơm chân không Ca-mi; máy cô nitơ Organomation; máy cô quay chân không và các thiết bị cần thiết của phòng thí nghiệm. 16
  26. 2.2.3.2. Dụng cụ: Bình định mức dung tích 10, 20, 25 mL; micropipet 10-100 µL, 100-1000 µL, 500-5000 µL của Eppendorf và đầu côn tương ứng; pipet Pasteur. Cốc có mỏ dung tích 50, 100, 250 mL; ống đong chia vạch dung tích 25, 100, 500 mL; ống nhựa ly tâm 50 mL; bình cầu đáy tròn 250 mL. Phễu lọc, giấy lọc thô; kim tiêm, màng lọc 0,45 µm; 0,2 µm; vial 2,0 mL. Các dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn dùng cho phòng thí nghiệm. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK 2.3.1.1. Tối ưu hóa điều kiện khối phổ xác định crinamidin và chuẩn nội a. Khảo sát lựa chọn chuẩn nội Dựa vào công thức hóa học, tính chất lý hóa, nhiệt độ bay hơi, các mảnh đặc trưng của các chất để lựa chọn chuẩn nội, để đảm bảo chuẩn nội được chọn bền vững, tách hoàn toàn khỏi pic crinamidin trên sắc ký đồ và không có mảnh đặc trưng nào trùng với mảnh đặc trưng của crinamidin. Dựa vào tính chất lý hóa của cafein đồng thời tham khảo tài liệu [16], cafein được lựa chọn để khảo sát làm chất chuẩn nội cho crinamidin. b. Tối ưu hóa điều kiện khối phổ xác định crinamidin và chuẩn nội cafein Xác định các mảnh phổ đặc trưng cho crinamidin, cafein. Mỗi chất chọn 1 ion con có cường độ cao và ổn định nhất để định lượng, và ít nhất 1 ion con để xác nhận. Tối ưu hóa các điều kiện nguồn ion hóa, năng lượng và chạm đối với từng ion. 2.3.1.2. Khảo sát các điều kiện tối ưu cho phương pháp định lượng crinamidin bằng kỹ thuật GC–MS/MS Tiến hành trên thiết bị GC-MS/MS có bộ phân tích khối dạng tứ cực chập ba. GC–MS/MS bao gồm 2 thiết bị chính, GC sử dụng cột để tách các thành phần trong hỗn hợp khí, và MS để nhận biết những thành phần này. MS là phương pháp phân tích dựa trên sự ion hóa. Có thể coi MS là một loại detector nhưng là một detector đặc biệt vì ngoài vai trò phát hiện MS còn có khả năng tách các chất dựa trên sự 17
  27. khác nhau về khối lượng của chúng. MS là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Phương pháp này mang tính đồng bộ vì những chất phù hợp cho sắc ký khí đều tương thích với yêu cầu của phân tích bằng MS [22], [24], [25]. Khảo sát chọn điều kiện phân tích thích hợp nhằm định lượng crinamidin trong các mẫu nghiên cứu để tách hoạt chất và chuẩn nội, sắc ký đồ rõ nét và thời gian phân tích không quá dài bằng thiết bị GC-MS/MS. Hình 2.1: Hệ thống sắc ký khí khổi phổ 2 lần (GC-MS/MS) Các điều kiện cần khảo sát bao gồm: Trong sắc ký khí, pha tĩnh đóng vai trò chủ yếu trong việc tách các chất khỏi nhau. Khảo sát và lựa chọn cột DB5-MS (5% phenyl, 95% methylpolysiloxane), kích thước 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm. Khảo sát lựa chọn chương trình GC-MS/MS: Khí mang và tốc độ khí mang: Trong sắc ký khí, pha động (khí mang) giữ vai trò vận chuyển chất phân tích qua cột. Khí mang thường là các khí trơ về mặt hóa học, có phân tử lượng nhỏ, đảm bảo độ tinh khiết và phù hợp với từng loại detector. Hiện nay, phổ biến nhất là khí heli [1], [4], [11], [22]. Chế độ tiêm mẫu: chia dòng hoặc không chia dòng Nhiệt độ buồng tiêm mẫu và chương trình nhiệt độ cột tách 18
  28. Nhiệt độ đường chuyển giữa GC và MS Từ kết quả khảo sát có thể lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp để có thể định lượng crinamidin trong các chế phẩm bằng GC-MS/MS. 2.3.1.3. Khảo sát và xây dựng quy trình xử lý mẫu Dựa trên các nguyên tắc của chiết alkaloid từ dược liệu, dựa trên các tính chất hóa lý của crinamidin, tiến hành khảo sát hai phương pháp xử lý mẫu: - Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực: sử dụng hỗn hợp dung môi CHCl3 và MeOH với các tỷ lệ khác nhau, môi trường NH3 đặc. - Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước acid: sử dụng nước nóng và acid hydrocloric. Xây dựng quy trình xử lý mẫu chung cho các đối tượng nền mẫu. 2.3.1.4. So sánh quy trình đã xây dựng với phương pháp tiêu chuẩn của DĐVN IV Minh chứng bằng thực nghiệm nhằm so sánh hiệu quả của 2 phương pháp: phương pháp tiêu chuẩn DĐVN IV bản bổ sung (sử dụng kỹ thuật HPLC) và phương pháp xây dựng (sử dụng kỹ thuật GC-MS/MS) dựa trên các tiêu chí: LOD, LOQ, hàm lượng crinamidin chiết xuất được theo mỗi quy trình. 2.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng crinamidin bằng kỹ thuật GC-MS/MS Tính thích hợp của hệ thống [23] Xác định tính thích hợp của hệ thống bằng cách tiến hành sắc ký lặp lại dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic qua các lần chạy. - Yêu cầu: chênh lệch đáp ứng giữa các lần chạy của cùng một dung dịch, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) không lớn hơn 5% [37]. Tính đặc hiệu, chọn lọc của phương pháp [12] Tính đặc hiệu: trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác. Tính chọn lọc: là khái niệm rộng hơn và bao trùm tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung một quy trình. Nếu chất cần xác định phân biệt rõ với các chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc. 19
  29. Cách xác định: Tiến hành đo và so sánh các mẫu: mẫu dung môi, mẫu placebo thêm chuẩn nội, mẫu chuẩn và mẫu thử thêm chuẩn. Yêu cầu: Thời gian lưu của pic chính xuất hiện trong sắc ký đồ mẫu chuẩn tương ứng với pic cùng thời gian lưu trong mẫu thử. Trong mẫu trắng tại thời điểm đó không xuất hiện pic. Ngoài ra theo tiêu chuẩn EC của châu Âu, đối với phương pháp GC-MS/MS thì cần chọn tối thiểu 3 ion, số điểm IP tối thiểu là 4. Khoảng tuyến tính [12], [21] Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích. Cách xác định: Chuẩn bị dãy 5 – 7 dung dịch chuẩn crinamidin có chứa cafein trong CHCl3. Tiến hành sắc ký theo các thông số đã khảo sát. Mối tương quan giữa tỷ lệ tín hiệu chất ngoại chuẩn chia cho nội chuẩn phụ thuộc vào nồng độ ngoại chuẩn được biểu diễn bằng phương trình và hệ số tương quan hồi quy. Yêu cầu: đường hồi qui thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan phải không nhỏ hơn 0,995. Ngoài ra, độ chệch của từng điểm không được vượt quá 15%. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. Trong sắc ký LOD có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và nhiễu đường nền bằng 3 (S/N=3). Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chụm nhận được. Trong sắc ký LOQ có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và nhiễu đường nền bằng 10 (S/N=10). Có thể tính LOQ từ LOD bằng công thức: . Độ chính xác [12], [21] 20
  30. Độ lặp lại (đánh giá độ chụm) thể hiện sự gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại, độ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD%. Cách xác định: tiến hành phân tích ở mức nồng độ 100% với 6 mẫu thử độc lập của cùng một chế phẩm, tính toán hàm lượng crinamidin tìm lại được. Đánh giá độ phân tán của số liệu dựa vào giá trị RSD (%). Yêu cầu: Tại mức hàm lượng hoạt chất trong mẫu từ 0,01% tới nhỏ hơn 0,1%, theo AOAC, độ lặp lại của phương pháp (RSD) phải ≤ 5,3%. Độ đúng [12], [21] Độ đúng của phương pháp được biểu diễn định lượng dưới dạng độ thu hồi. Cách xác định: xác định trên mẫu tự tạo. Khảo sát với 3 nồng độ của mẫu tự tạo: thêm chuẩn ở các mức 80%, 100% và 120% so với hàm lượng trên nhãn vào mẫu thử. Ở mỗi mức nồng độ của mẫu tự tạo, tiến hành thực nghiệm 3 phép thử riêng biệt Yêu cầu: độ đúng được phản ánh qua tỷ lệ phần trăm giữa kết quả định lượng so với hoạt chất cho vào. Theo AOAC, lượng chuẩn tìm lại nằm trong khoảng 90 – 107% với hàm lượng hoạt chất trong mẫu từ 0,01% tới nhỏ hơn 0,1%. 2.4. Ứng dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng crinamidin trong thuốc và TPBVSK Thu thập một số mẫu cao, thuốc và TPBVSK TNHC trên thị trường. Xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng. Tiến hành phân tích trên thiết bị GC– MS/MS. 2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu Các kết quả được định tính và định lượng bằng phần mềm Mass Hunter của Agilent. Tính toán và xác định các đại lượng đặc trưng của các mẫu thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel. 21
  31. Phần 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Xây dựng phƣơng pháp phân tích 3.1.1. Kết quả khảo sát các điều kiện tối ưu cho phương pháp định lượng crinamidin bằng GC-MS/MS 3.1.1.1. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký khí khối phổ và lựa chọn chuẩn nội Qua tham khảo tính chất lý hóa của crinamidin và cafein, điều kiện khối phổ từ các nghiên cứu [8], [30], [34], [38] và điều kiện thực tế, chúng tôi tiến hành khảo sát nguồn ion hóa EI với năng lượng bắn phá 70 eV, bộ phân tích khối phổ loại ba tứ cực, chế độ MRM (Multiple Reaction Monitoring). Chuẩn bị 3 dung dịch chuẩn như sau: . Dung dịch chuẩn crinamidin nồng độ khoảng 20 µg/mL trong CHCl3. . Dung dịch chuẩn nội cafein nồng độ khoảng 0,5 µg/mL trong CHCl3. . Dung dịch chuẩn hỗn hợp crinamidin nồng độ khoảng 20 µg/mL và chuẩn nội cafein nồng độ khoảng 0,5 µg/mL trong CHCl3. Tiêm lần lượt dung dịch chuẩn crinamidin, dung dịch chuẩn nội cafein vào hệ thống GC-MS/MS, lựa chọn chế độ quét toàn phổ (full scan). Mẫu sau khi qua cột sắc ký ở dạng hơi đi qua buồng ion hóa, ở đây xảy ra tương tác với chùm electron có năng lượng là 70 eV tạo thành các ion ban đầu. Ion đặc trưng có cường độ cao và ổn định được lựa chọn để tiếp tục phân mảnh ở tứ cực thứ 2 tạo thành các ion con. Trong số các ion con được tạo thành, ion con có cường độ cao và ổn định nhất được lựa chọn để định lượng, các ion còn lại được dùng để xác nhận. Trong nghiên cứu này, ion có số khối m/z 217 của crinamidin và ion có số khối m/z 82 của chuẩn nội cafein được lựa chọn để định lượng. Kết quả sắc ký của crinamidin và chuẩn nội cafein sau khi bắn phá được thể hiện qua bảng 3.1, bảng 3.2, hình 3.1 và hình 3.2. 22
  32. Bảng 3.1: Các mảnh ion mẹ và ion con của crinamidin sau khi bắn phá Chất phân tích Mảnh mẹ Mảnh con Vai trò 288 Xác nhận Crinamidin 317 244 Xác nhận 217 Định lượng Hình 3.1: Phổ khối của crinamidin sau khi bắn phá ion Bảng 3.2: Các mảnh ion mẹ và ion con của cafein sau khi bắn phá Chất phân tích Mảnh mẹ Mảnh con Vai trò 109 Xác nhận Cafein 194 82 Định lượng Hình 3.2: Phổ khối của cafein sau khi bắn phá ion 23
  33. Với điều kiện tối ưu hóa GC-MS/MS đã xây dựng, tiến hành tiêm dung dịch chuẩn hỗn hợp crinamidin và cafein, nhận thấy trong cùng một điều kiện khối phổ, trên sắc ký đồ tổng (TIC – Total ion chromatogram), các pic sắc ký tách khỏi nhau hoàn toàn, hình dạng pic cân xứng, không có các mảnh đặc trưng của chuẩn crinamidin và chuẩn nội cafein trùng nhau. Với điều kiện sắc ký này, crinamidin cho thời gian lưu ở 16,7 phút còn cafein cho thời gian lưu ở 8,0 phút. Điều kiện trên là tối ưu hóa cho phân tích đồng thời crinamidin và chuẩn nội cafein. Vì vậy, cafein được lựa chọn là chuẩn nội cho xác định hàm lượng crinamidin. Crinamidin Cafein Hình 3.3: Sắc ký đồ tổng (TIC) của crinamidin và chuẩn nội cafein 3.1.1.2. Khảo sát lựa chọn dung môi pha mẫu và chương trình nhiệt độ GC-MS/MS Các dung môi được lựa chọn khảo sát bao gồm: MeOH, ACN và CHCl3. Pha các dung dịch sau: dung dịch chuẩn crinamidin nồng độ 20 µg/mL trong dung môi MeOH, dung dịch chuẩn crinamidin nồng độ 20 µg/mL trong dung môi ACN, dung dịch chuẩn crinamidin nồng độ 20 µg/mL trong dung môi CHCl3. Tiến hành phân tích trên thiết bị GC-MS/MS. Khảo sát lựa chọn dung môi và chương trình nhiệt độ phù hợp để pic crinamidin trên sắc ký đồ gọn, hình dạng pic cân xứng. Kết quả thu được các sắc ký đồ hình 3.4, hình 3.5 và hình 3.8. 24
  34. Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi MeOH Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi ACN 25
  35. Nhận thấy khi sử dụng dung môi pha mẫu là MeOH hoặc ACN thì pic bị chẻ. Hiện tượng chẻ pic được khắc phục khi thay đổi dung môi là CHCl3 (hình 3.8). Vì vậy, CHCl3 là dung môi được lựa chọn để phân tích trên hệ thống GC-MS/MS. Tiếp tục khảo sát chế độ tiêm không chia dòng (splitless) và chế độ tiêm chia dòng (split) 10 : 1 với dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong CHCl3. Kết quả được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.6 và 3.8. Hình 3.6: Sắc ký đồ chuẩn crinamidin 20 µg/mL chế độ tiêm không chia dòng Nhận thấy chế độ tiêm chia dòng 10 : 1 cho pic đẹp và cân xứng hơn (hình 3.8). Vì vậy lựa chọn chế độ tiêm chia dòng 10 : 1 để xác định hàm lượng crinamidin. Sử dụng dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong CHCl3 để khảo sát chương trình nhiệt độ tối ưu cho phân tích trên thiết bị GC-MS/MS. Có 2 chương trình nhiệt độ được lựa chọn để khảo sát là: . Chương trình đẳng nhiệt: nhiệt độ đầu 100oC, giữ 1 phút, tăng nhiệt với tốc độ 10oC/phút đến 290oC, giữ 5 phút (*). . Chương trình gradient nhiệt độ ( ) bao gồm 2 chương trình nhiệt độ:  Chương trình nhiệt độ 1: nhiệt độ đầu 100oC, giữ 1 phút, tăng nhiệt với tốc độ 20oC/phút đến 240oC, giữ 1 phút.  Chương trình nhiệt độ 2: tăng 5oC/phút lên đến 290oC, giữ 6 phút. 26
  36. Kết quả được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.7 và 3.8. Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL, chương trình nhiệt độ (*) Hình 3.8: Sắc đồ của dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi CHCl3, chế độ tiêm chia dòng 10 : 1, chương trình nhiệt độ ( ) Chương trình nhiệt độ ( ) cho thời gian lưu của crinamidin chỉ khoảng 17 phút, pic gọn và đối xứng. Dựa trên điều kiện thực nghiệm, chúng tôi tiến hành đề tài với các điều kiện tối ưu hóa được thể hiện trong bảng 3.3. 27
  37. Bảng 3.3: Điều kiện tối ưu hóa GC-MS/MS Thông số điều kiện sắc ký khí Cột DB5-MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) Nhiệt độ buồng tiêm mẫu 250oC Khí mang Heli Tốc độ khí mang 1,0 mL/phút Chế độ tiêm Chia dòng 10 : 1 Chương Chương trình Nhiệt độ đầu 100oC, giữ 1 phút, tăng nhiệt với tốc độ trình nhiệt độ 1 20oC/phút đến 240oC, giữ 1 phút nhiệt độ Chương trình Tăng 5oC/phút lên đến 290oC, giữ 6 phút gồm: nhiệt độ 2 Tổng thời gian phân tích 27 phút Thể tích tiêm 1 µL Dung môi pha mẫu CHCl3 Thông số điều kiện khối phổ Kiểu khối phổ Khối phổ ba tứ cực 7000 QQQ Nguồn ion hóa EI Năng lượng bắn phá 70 eV Nhiệt độ nguồn ion 270°C Nhiệt độ đường chuyển 260oC Thông số MRM Năng lượng bắn phá (eV) Mảnh định lượng 217 30 Crinamidin 244 25 Mảnh xác nhận 288 20 Mảnh m/z Mảnh định lượng 82 30 Cafein Mảnh xác nhận 109 25 Thời gian cắt dung môi 5 phút 28
  38. 3.1.2. Kết quả khảo sát quá trình xử lý mẫu cho phƣơng pháp định lƣợng crinamidin bằng GC-MS/MS 3.1.2.1. Xây dựng quy trình chiết mẫu Dựa trên nguyên lý về chiết xuất alkaloid ra khỏi dược liệu [9], chúng tôi tiến hành khảo sát 3 quy trình xử lý mẫu, gồm có: Quy trình 1, quy trình 2: chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ dựa trên phương pháp tiêu chuẩn DĐVN IV bản bổ sung [3] và cải tiến phương pháp phù hợp với điều kiện sắc ký GC-MS/MS. Quy trình 3: chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung dịch acid loãng dựa trên nghiên cứu [38]. Khảo sát điều kiện chiết trên 3 nền mẫu riêng biệt: viên nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng. Viên nang cứng được loại bỏ vỏ nang, đồng nhất bột dược liệu trong nang bằng máy đồng nhất mẫu. Trà túi lọc được loại bỏ túi lọc, xay nhỏ đồng nhất. Cao lỏng được trộn đều đồng nhất. Tiến hành xử lý các mẫu song song theo quy trình xử lý mẫu bảng 3.4. Bảng 3.4: Khảo sát quy trình xử lý mẫu Quy trình 1 Quy trình 2 Quy trình 3 Kiềm hóa mẫu bằng NH3 Kiềm hóa mẫu bằng NH3 Thêm nước nóng vào mẫu. đặc trong bình cầu. Sau 1 đặc trong bình cầu. Sau 1 Sau 30 phút, acid hóa mẫu giờ, thêm hỗn hợp dung giờ, thêm hỗn hợp dung bằng acid acetic đến pH 4. môi CHCl3 : MeOH, siêu môi CHCl3 : MeOH, đun Loại tạp bằng light âm 30 phút mỗi lần đến hồi lưu 1 giờ mỗi lần đến petroleum và CHCl3. Kiềm khi chiết kiệt hoạt chất. Cô khi chiết kiệt hoạt chất. Cô hóa dịch acid đến pH 9,0 dịch chiết đến cắn, hòa tan dịch chiết đến cắn, hòa tan bằng NH3 đặc. Chiết lỏng cắn bằng HCl 0,1N. Loại cắn bằng HCl 0,1N, loại – lỏng bằng CHCl3. tạp bằng CHCl3. Kiềm hóa tạp bằng dung môi hữu cơ. bằng NH3 và chiết lỏng – Kiềm hóa và chiết lỏng – lỏng bằng CHCl3. lỏng bằng CHCl3. 29
  39. Khảo sát và so sánh hiệu suất chiết của 3 quy trình trên dựa trên hàm lượng crinamidin của mỗi phương pháp trong cùng điều kiện sắc ký. Tiến hành làm 3 mẫu, mỗi mẫu tiêm lặp 2 lần đối với mỗi dạng bào chế. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.5 và hình 3.9. Bảng 3.5: Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu Spic crinamidin Spic cafein trung Nồng độ Hàm lượng Quy trình trung bình (n = 3) bình (n = 3) (µg/mL) (µg/g) Viên nang cứng 1 1105 1201 14,80 ± 0,60 147,4 ± 6,0 2 1421 1289 16,86 ± 0,71 167,7 ± 7,1 3 800 1174 12,10 ± 0,63 121,6 ± 6,3 Trà túi lọc 1 1707 1328 18,93 ± 0,66 188,7 ± 6,6 2 1821 1255 20,80 ± 0,75 200,4 ± 7,5 3 1226 1232 15,65 ± 0,82 157,1 ± 8,2 Cao lỏng 1 1116 1198 14,93 ± 0,72 149,9 ± 7,2 2 1228 1164 16,32 ± 0,70 163,3 ± 7,0 3 1076 1217 14,39 ± 0,61 143,1 ± 6,1 30
  40. Hình 3.9: Biểu đồ kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu trên ba nền mẫu Nhìn chung, trên cả 3 đối tượng nền mẫu, quy trình chiết sử dụng kiềm trong dung môi hữu cơ (quy trình 1 và quy trình 2) cho hiệu suất chiết cao hơn quy trình chiết sử dụng dung dịch acid (quy trình 3), phù hợp với tài liệu tham khảo [9]. Có sự khác biệt lớn về hàm lượng crinamidin đối với các nền viên nang cứng và trà túi lọc, tuy nhiên không có sự khác biệt nhiều về hàm lượng crinamidin đối với nền cao lỏng khi phân tích khi phân tích theo 3 quy trình xử lý mẫu trên. Quy trình 1 được cải tiến dựa trên phương pháp xử lý mẫu của DĐVN IV bản bổ sung, phải siêu âm và lọc 5 lần, cần nhiều thời gian và khả năng mất mẫu trong quá trình xử lý lớn hơn. Quy trình 2 được cải tiến dựa trên quy trình 1 bằng cách thay thế 5 lần siêu âm bằng 2 lần đun hồi lưu. Quy trình 2 cho kết quả định lượng với hiệu suất chiết cao hơn, tiết kiệm thời gian và dung môi hơn so với quy trình 1. Vì vậy, quy trình 2 được lựa chọn để tiếp tục khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất như: tỷ lệ dung môi chiết, số lần chiết xuất và thời gian chiết xuất. Quy trình xây dựng và các yếu tố khảo sát được thể hiện trong hình 3.10. 31
  41. Cân 2,5 g mẫu đã đồng nhất. Kiềm hóa bằng NH3. Để yên 1 giờ Thêm dung môi CHCl3 : MeOH và khảo sát tỷ lệ dung môi Đun sôi hồi lưu, lọc và khảo sát số lần đun hồi lưu, thời gian đun hồi lưu Cô dịch chiết đến cắn. Hòa tan bằng HCl 0,1N Loại tạp bằng CHCl3. Kiềm hóa dịch acid. Chiết lỏng – lỏng bằng CHCl3. Bổ sung chuẩn nội. Phân tích trên thiết bị GC-MS/MS Hình 3.10: Sơ đồ quy trình chiết xuất crinamidin từ chế phẩm TNHC 3.1.2.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu a. Khảo sát số lần chiết mẫu Số lần chiết mẫu là yếu tố quyết định hiệu suất chiết xuất. Không thể chiết kiệt hoạt chất nếu số lần chiết ít. Ngược lại số lần chiết quá nhiều gây lãng phí thời gian, công sức và dung môi. Để đạt được hiệu suất chiết cao nhất, tiết kiệm thời gian và dung môi, tiến hành khảo sát số lần chiết mẫu để lựa chọn số lần chiết tối ưu cho quy trình xử lý. Chiết mẫu với quy trình đã xây dựng. Giữ các thông số cố định và thay đổi số lần chiết mẫu. Sử dụng 100 mL hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1 cho lần chiết đầu tiên và 50 mL hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1 cho mỗi lần chiết tiếp theo, đun sôi hồi lưu 1 giờ cho mỗi lần chiết mẫu. Tiến hành làm 3 mẫu, mỗi mẫu tiêm lặp 2 lần. Lấy giá trị trung bình. Kết quả khảo sát được thể hiện trong bảng 3.6 và hình 3.11. 32
  42. Bảng 3.6: Kết quả khảo sát số lần chiết mẫu Số lần Spic crinamidin Spic cafein trung Nồng độ Hàm lượng chiết mẫu trung bình (n = 3) bình (n = 3) (µg/mL) (µg/g) Viên nang cứng 1 1333 1586 14,93 ± 0,77 149,0 ± 7,7 2 1863 1882 16,57 ± 0,73 166,1 ± 7,3 3 1615 1624 16,62 ± 0,85 166,9 ± 8,5 Trà túi lọc 1 1431 1416 16,80 ± 0,87 168,9 ± 8,7 2 1667 1348 20,80 ± 0,69 199,5 ± 6,9 3 1932 1527 19,59 ± 0,81 196,8 ± 8,1 Cao lỏng 1 1169 1624 13,61 ± 0,64 138,6 ± 6,4 2 1595 1853 15,15 ± 0,75 150,3 ± 7,5 3 1064 1317 14,57 ± 0,68 146,1 ± 6,8 Nhìn chung, hiệu suất chiết tăng khi tăng số lần chiết, tuy nhiên không có sự chênh lệch nhiều về hàm lượng crinamidin giữa 2 lần và 3 lần chiết. Vì vậy, để đạt được kết quả tối ưu nhất cho quy trình xử lý mẫu đồng thời tiết kiệm nhất, lựa chọn 2 lần chiết cho quy trình xử lý mẫu. Kết quả khảo sát số lần chiết xuất được thể hiện qua biểu đồ hình 3.11. 33
  43. Hình 3.11: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và số lần chiết mẫu b. Khảo sát thời gian chiết Thời gian chiết là yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết và lượng tạp trong mẫu. Thời gian chiết xuất ngắn, không chiết kiệt được hoạt chất. Tuy nhiên thời gian chiết xuất quá dài sẽ kéo theo nhiều tạp, mất nhiều thời gian. Để khảo sát thời gian chiết xuất tối ưu cho mỗi lần chiết xuất, tiên hành chiết mẫu theo quy trình đã xây dựng. Giữ các thông số cố định và thay đổi thời gian chiết mẫu ở các thời điểm 30 phút; 60 phút; 90 phút và 120 phút. Đun sôi hồi lưu 2 lần. Sử dụng 100 mL hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1 cho lần chiết đầu tiên và 50 mL hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1 cho lần chiết thứ hai. Tiến hành làm 3 mẫu, mỗi mẫu tiêm lặp 2 lần. Kết quả khảo sát được thể hiện qua bảng 3.7 và hình 3.12. 34
  44. Bảng 3.7: Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu Thời gian Spic crinamidin Spic cafein trung Nồng độ Hàm lượng chiết mẫu trung bình (n = 3) bình (n = 3) (µg/mL) (µg/g) Viên nang cứng 30 phút 1607 1988 14,58 ± 0,81 145,5 ± 8,1 60 phút 1658 1625 16,91 ± 0,76 169,7 ± 7,6 90 phút 1800 1813 16,60 ± 0,71 166,7 ± 7,1 120 phút 2060 2024 16,88 ± 0,77 169,5 ± 7,7 Trà túi lọc 30 phút 1496 1523 16,49 ± 0,76 163,6 ± 7,6 60 phút 1688 1375 19,18 ± 0,82 190,5 ± 8,2 90 phút 1842 1578 18,52 ± 0,79 186,8 ± 7,9 120 phút 2274 1862 19,11 ± 0,74 191,7 ± 7,4 Cao lỏng 30 phút 1008 1578 12,72 ± 0,64 128,6 ± 6,4 60 phút 1460 1704 15,11 ± 0,75 152,3 ± 7,5 90 phút 1754 1941 15,63 ± 0,68 156,1 ± 6,8 120 phút 1345 1428 16,04 ± 0,75 160,7 ± 7,5 35
  45. Hình 3.12: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và thời gian chiết mẫu Nhận thấy hiệu suất tăng khi tăng thời gian chiết. Qua biểu đồ thấy hiệu suất chiết tăng khi tăng thời gian chiết từ 30 lên 60 phút trên cả 3 đối tượng nền mẫu, và không có sự thay đổi đáng kể về hiệu suất chiết thời điểm 60 phút và 2 thời điểm 90 phút và 120 phút. Vì vậy để đạt được kết quả tối ưu nhất đồng thời tiết kiệm thời gian và dung môi, khoảng thời gian 60 phút được lựa chọn cho mỗi lần chiết mẫu. c. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết Độ phân cực của dung môi phụ thuộc vào tỷ lệ các thành phần trong hỗn hợp dung môi chiết, ảnh hưởng đến hiệu suất chiết hoạt chất ra khỏi nền mẫu. Chiết mẫu với quy trình đã xây dựng. Giữ các thông số cố định và thay đổi tỷ lệ MeOH của hỗn hợp dung môi chiết mẫu (CHCl3 và MeOH) từ 25%; 50%; 75% và 100%. Đun sôi hồi lưu 2 lần, mỗi lần 1 giờ. Sử dụng 100 mL hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1 cho lần chiết đầu tiên và 50 mL hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1 cho lần chiết thứ hai. Mỗi tỷ lệ làm 3 mẫu, mỗi mẫu tiêm lặp 2 lần. Kết quả khảo sát được thể hiện qua bảng 3.8 và hình 3.13. 36
  46. Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết Tỷ lệ %MeOH trong Spic crinamidin Spic cafein trung Nồng độ Hàm lượng hỗn hợp dung môi trung bình bình (n = 3) (µg/mL) (µg/g) CHCl3:MeOH (n = 3) Viên nang cứng 25% 2835 2798 16,91 ± 0,69 169,0 ± 6,9 50% 2592 2630 16,59 ± 0,84 165,4 ± 8,4 75% 2517 2601 16,39 ± 0,74 163,6 ± 7,4 100% 2735 2819 16,42 ± 0,77 164,1 ± 7,7 Trà túi lọc 25% 3035 2532 18,86 ± 0,53 186,4 ± 5,3 50% 2599 2473 17,21 ± 0,64 173,5 ± 6,4 75% 2513 2638 16,12 ± 0,65 162,8 ± 6,5 100% 2435 2325 17,17 ± 0,79 170,4 ± 7,9 Cao lỏng 25% 1988 2415 14,67 ± 0,57 147,3 ± 5,7 50% 1800 2317 14,15 ± 0,73 142,1 ± 7,3 75% 1880 2535 13,76 ± 0,66 138,8 ± 6,6 100% 1883 2612 13,53 ± 0,62 136,2 ± 6,2 37
  47. Hình 3.13: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và tỷ lệ dung môi chiết Nhìn chung, tỷ lệ 25% methanol (tức là tỷ lệ CHCl3 : MeOH = 3 : 1) cho hiệu suất chiết cao nhất trên cả 3 đối tượng nền mẫu, phù hợp với tài liệu tham khảo [38]. Đối với nền cao lỏng, hàm lượng crinamidin không thay đổi nhiều bởi tỷ lệ CHCl3 và MeOH. Vì vậy trong nghiên cứu này, tỷ lệ hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1 được sử dụng làm dung môi chiết mẫu. Sau khi khảo sát các điều kiện cho quy trình xử lý mẫu trên ba nền mẫu: nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng, chúng tôi xây dựng quy trình xử lý mẫu chung và tối ưu theo sơ đồ hình 3.14. 38
  48. Hình 3.14: Quy trình xử lý mẫu tối ưu Cân 2,5 g mẫu sau khi đồng nhất. Kiềm hóa bằng NH3 đến pH 9,0. Để yên 1 giờ Lần 1: thêm 100 mL dung môi CHCl3 : MeOH (3 : 1). Lần 2: thêm 50 mL dung môi CHCl3 : MeOH (3 : 1). Đun hồi lưu 1 giờ, lọc Gộp dịch chiết, cô đến cắn. Hòa tan cắn bằng 20 mL HCl 0,1N Loại tạp bằng CHCl3. Kiềm hóa dịch acid bằng NH3 đặc Chiết lỏng – lỏng bằng CHCl3 (lần 1: 15 mL, lần 2: 8 mL) Thêm chuẩn nội cafein. Định mức 25 mL bằng CHCl3 Phân tích trên thiết bị GC-MS/MS 3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 3.2.1. Tính thích hợp của hệ thống Tiến hành sắc ký lặp lại dung dịch chuẩn crinamidin có nồng độ 20 µg/mL chứa chuẩn nội cafein 0,5 µg/mL. Ghi lại thời gian lưu và diện tích crinamidin qua 6 lần sắc ký. Kết quả thời gian lưu, diện tích pic của crinamidin và cafein, tỷ lệ diện tích crinamidin/cafein được thể hiện trong bảng 3.9. 39
  49. Bảng 3.9: Thời gian lưu và diện tích pic qua 6 lần tiêm mẫu Thời gian Tỷ lệ diện Diện tích Thời gian lưu Diện tích tích pic pic lưu cafein crinamidin pic cafein crinamidin/ crinamidin (phút) (phút) cafein Lần tiêm 1 16,737 982 8,054 1180 0,83220 Lần tiêm 2 16,732 1040 8,058 1233 0,84347 Lần tiêm 3 16,732 924 8,071 1145 0,80699 Lần tiêm 4 16,737 950 8,063 1178 0,80645 Lần tiêm 5 16,737 954 8,075 1254 0,76077 Lần tiêm 6 16,732 913 8,075 1135 0,80441 Trung bình 16,735 960,5 8,066 1187,5 0,80905 RSD (%) 0,02 4,78 0,11 3,99 3,53 Nhận xét: Từ kết quả trên nhận thấy độ lệch chuẩn trung bình của thời gian lưu và diện tích pic crinamidin của cùng dung dịch chuẩn qua 6 lần tiêm đều nằm trong giới hạn cho phép. Vì vậy, hệ thống đạt yêu cầu cho phân tích. Khi sử dụng cafein làm chuẩn nội để định lượng crinamidin, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của tỷ lệ diện tích pic crinamidin/diện tích pic cafein qua các lần tiêm là 3,53%; giá trị này nhỏ hơn độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic crinamidin khi không sử dụng chuẩn nội là 4,78%. Vậy việc sử dụng chuẩn nội cafein là hoàn toàn hợp lý trong nghiên cứu này. 3.2.2. Tính đặc hiệu, chọn lọc Tiến hành sắc ký dung môi CHCl3; dung dịch placebo viên nang chứa chuẩn nội cafein 0,5 µg/mL; dung dịch placebo cao lỏng chứa chuẩn nội cafein 0,5 µg/mL; dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL và mẫu thêm chuẩn crinamidin chứa chuẩn nội cafein 0,5 µg/mL. So sánh thời gian lưu của dung dịch chuẩn và mẫu thêm chuẩn crinamidin. 40
  50. Sử dụng kỹ thuật tính số điểm điểm IP (điểm nhận dạng – identification point) để xác định tính đặc hiệu của phương pháp GC-MS/MS. Đối với kỹ thuật GC- MS/MS, mỗi ion mẹ được tính 1 điểm và mỗi ion con được tính 1,5 điểm [12], [37]. Crinamidin được đặc trưng bởi 1 ion mẹ và 3 ion con, số điểm IP đạt được là 5,5. Cafein được đặc trưng bởi 1 ion mẹ và 2 ion con, số điểm IP đạt được là 4. Do đó đều đạt số điểm IP (điểm nhận dạng – identification point) quy định là 4 của EC về nhận dạng pic. Hình 3.15: Sắc ký đồ dung môi CHCl3 Hình 3.16: Sắc ký đồ placebo viên nang thêm chuẩn nội cafein 41
  51. Hình 3.17: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL, chuẩn nội cafein Hình 3.18: Sắc ký đồ của dung dịch thêm chuẩn crinamidin 42
  52. Nhận xét: Trên sắc ký đồ dung môi không xuất hiện pic crinamidin và cafein. Trên sắc ký đồ của 3 dung dịch placebo không xuất hiện pic crinamidin. Trên sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn có xuất hiện các pic với thời gian lưu tương tự mẫu chuẩn. Chọn pic của ion có cường độ mạnh nhất của crinamidin là pic cơ bản, chấp nhận là 100 để tính cường độ tương đối của các ion khác. Tỷ lệ cường độ tương đối các ion của crinamidin được tính toán và trình bày trong bảng 3.10 và hình 3.19. Bảng 3.10: Tỷ lệ các ion crinamidin của dung dịch thêm chuẩn crinamidin Chất phân Tỷ lệ cường Khoảng sai số tối Tỷ lệ cường độ ion Ion m/z tích độ ion chuẩn đa cho phép (%) trên mẫu thêm chuẩn 317/288 38,1 ± 30 38,3 Crinamidin 317/244 17,2 ± 30 17,5 Hình 3.19: Sắc ký đồ tỷ lệ ion của crinamidin và cafein của dung dịch chuẩn 20 µg/mL Nhận xét: Tỷ lệ cường độ tương đối các ion trên mẫu thêm chuẩn nằm trong giới hạn cho phép theo quy định châu Âu (EC/657/2002). Phương pháp sắc ký có tính đặc hiệu cao. 43
  53. 3.2.3. Khoảng tuyến tính Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn crinamidin có nồng độ thay đổi từ 5 đến 50 µg/mL và chuẩn nội cafein có nồng độ cố định 0,5 µg/mL. Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu ngoại chuẩn và nội chuẩn tương ứng vào nồng độ. Kết quả được thể hiện qua bảng 3.11 và hình 3.20. Bảng 3.11: Phương trình đường chuẩn crinamidin và hệ số tương quan tuyến tính Nồng độ Phương trình Hệ số tương crinamidin Spic crinamidin Spic cafein đường chuẩn quan (R2) (µg/mL) 5 79 1372 10 620 1509 y = 0,0890747 x 20 1964 1566 R² = 0,9970 – 0,444131 40 4696 1442 50 5881 1495 y y = 0,0890747 x - 0,444131 R ^ 2 = 0,99697186 0,1 x Hình 3.20: Đồ thị đường chuẩn crinamidin, chuẩn nội cafein 44
  54. Nhận xét: đường chuẩn có hệ số tương quan R2 > 0,995 do đó trong khoảng nồng độ 5 – 50 µg/mL (tương ứng với 50 đến 500 µg/g) có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ tương ứng. Phù hợp để định lượng các chế phẩm có hàm lượng hoạt chất crinamidin nhỏ. 3.2.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Phân tích mẫu trắng thêm chuẩn với nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu chất phân tích. Phân tích lặp lại 6 lần, xác định tỷ lệ S/N tự động theo phần mềm của máy. Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ tại đó tỷ lệ S/N = 3, giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N = 10. Kết quả xác định LOD và LOQ được thể hiện trong bảng 3.12 và hình 3.21. Bảng 3.12: Giá trị LOD và LOQ của crinamidin LOD LOQ Nồng độ (µg/mL) 0,3 1 Hàm lượng (µg/g) 3 10 Hình 3.21: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 0,3 µg/mL 45
  55. Nhận xét: Với giá trị LOQ ở nồng độ 1 µg/mL (tương ứng 10 µg/g) cho thấy phương pháp hoàn toàn phù hợp để ứng dụng xác định hàm lượng crinamidin trong các chế phẩm có chứa TNHC, đặc biệt ở các chế phẩm thuốc và TPBVSK kết hợp nhiều thành phần, hàm lượng crinamidin giảm nhiều lần so với trong dược liệu TNHC. 3.2.5. Độ lặp lại Tiến hành phân tích lặp lại 6 lần trên 3 nền mẫu: viên nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng. Xử lý và phân tích trên thiết bị GC-MS/MS theo quy trình đã xây dựng. Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua hệ số biến thiên RSD (%). Các kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp được thể hiện từ bảng 3.13 đến bảng 3.15, từ hình 3.22 đến hình 3.24. Bảng 3.13: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền viên nang cứng Hàm lượng STT Spic crinamidin Spic cafein Nồng độ (µg/mL) (µg/g) 1 2644 1567 17,07 167,5 2 3420 1912 17,91 172,7 3 2793 1827 15,76 157,3 4 2791 1722 16,52 162,9 5 2395 1630 15,27 150,7 6 3080 1979 15,99 158,3 TB 161,6 RSD(%) 4,9 46
  56. Bảng 3.14: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền trà túi lọc Hàm lượng STT Spic crinamidin Spic cafein Nồng độ (µg/mL) (µg/g) 1 3774 1957 19,60 189,5 2 3864 1801 20,99 205,7 3 4343 1960 21,86 211,1 4 3714 1752 20,17 204,9 5 3321 1715 19,13 191,6 6 3259 1645 19,50 193,4 TB 199,4 RSD(%) 4,5 Bảng 3.15: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền cao lỏng Nồng độ Hàm lượng STT Spic crinamidin Spic cafein (µg/mL) (µg/g) 1 2248 1870 13,06 127,8 2 2293 2089 12,20 120,4 3 1854 1529 13,15 129,6 4 2311 2046 12,46 121,8 5 2058 1558 14,04 136,8 6 1914 1615 12,92 126,3 TB 127,1 RSD(%) 4,6 47
  57. Hình 3.22: Sắc ký đồ độ lặp Hình 3.23: Sắc ký đồ độ lặp Hình 3.24: Sắc ký đồ độ lại trên nền viên nang cứng lại trên nền trà túi lọc lặp lại trên nền cao lỏng Các kết quả trên cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt với hệ số biến thiên RSD (%) nằm trong khoảng từ 4,5% - 4,9%; đều < 5,3%. Do đó độ lặp lại trên ba đối tượng nền mẫu: nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng đều đạt yêu của AOAC. 3.2.6. Độ thu hồi Để khảo sát độ đúng của phương pháp, thêm chuẩn ở 3 nồng độ khác nhau (thấp, trung bình, cao) vào 3 nền mẫu khác nhau bao gồm: viên nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng. Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng trên 3 đối tượng nền mẫu riêng biệt: nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng. Độ chính xác của phương pháp được đánh giá thông qua độ thu hồi R (%). Kết quả đánh giá độ thu hồi trên nền mẫu nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng được thể hiện từ bảng 3.16 đến bảng 3.18. 48
  58. Bảng 3.16: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền viên nang cứng Lượng chuẩn Độ Nồng Hàm Crinamidin/mẫu crinamidin Spic Spic thu độ lượng (µg/g) thêm vào crinamidin cafein hồi (µg/mL) (µg/g) (µg) (%) 1120 1650 14,02 140,0 90,1 160 1108 1614 14,39 143,8 96,0 841 1234 14,17 141,5 92,5 991 1386 15,72 157,2 93,5 82,4 200 851 1180 16,03 160,1 97,2 870 1221 15,59 155,5 91,5 927 1227 17,62 175,8 97,5 240 1153 1546 17,16 171,5 92,8 1146 1509 17,81 177,6 99,4 Hình 3.25: Sắc ký đồ mẫu thực viên Hình 3.26: Sắc ký đồ mẫu viên nang nang cứng cứng thêm 160 µg chuẩn crinamidin 49
  59. Hình 3.27: Sắc ký đồ mẫu viên nang Hình 3.28: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 200 µg chuẩn crinamidin cứng thêm 240 µg chuẩn crinamidin Kết quả phân tích độ thu hồi R% trên nền viên nang cứng nằm trong khoảng từ 90,1% - 99,4%, cho thấy phuơng pháp đáp ứng yêu cầu thuộc khoảng giới hạn 90% - 107% của AOAC. Kết quả độ thu hồi trên nền trà túi lọc và cao lỏng được thể hiện trong bảng 3.17 và 3.18. Bảng 3.17: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền trà túi lọc Lượng chuẩn Nồng Hàm Độ thu Crinamidin/mẫu Spic Spic crinamidin độ lượng hồi (µg/g) crinamidin cafein thêm vào (µg) (µg/mL) (µg/g) (%) 1064 2480 14,96 149,5 96,0 160 1203 2748 15,23 152,0 99,8 1189 2786 14,89 148,8 94,9 1367 2885 16,33 163,1 93,8 88,1 200 1529 3177 16,56 165,2 96,4 1307 2751 16,37 163,7 94,5 1578 2873 18,64 186,3 102,3 240 2023 3733 18,41 184,0 99,9 1945 3645 18,16 181,6 97,4 50
  60. Bảng 3.18: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền cao lỏng Lượng chuẩn Nồng Hàm Độ thu Crinamidin/mẫu crinamidin S S pic pic độ lượng hồi (µg/g) thêm vào crinamidin cafein (µg/mL) (µg/g) (%) (µg) 284 811 12,55 125,2 96,9 80 214 621 12,38 123,7 94,5 195 572 12,27 122,5 92,7 291 712 14,34 143,1 99,8 63,2 100 238 575 14,50 144,9 102,2 239 575 14,55 145,7 103,1 472 1042 15,69 156,9 97,6 120 533 1141 16,13 161,1 102,0 705 1516 16,06 160,5 101,4 Nhận xét: Kết quả phân tích độ thu hồi R%: . Độ thu hồi R% trên nền nang cứng nằm trong khoảng từ 90,1% đến 99,4%. . Độ thu hồi R% trên nền trà túi lọc nằm trong khoảng từ 93,8% đến 102,3%. . Độ thu hồi R% trên nền cao lỏng nằm trong khoảng từ 92,7% đến 103,1%. Phuơng pháp xây dựng trên 3 nền mẫu: nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng đều đáp ứng yêu cầu thuộc khoảng giới hạn 90% - 107% của AOAC. Phương pháp đã xây dựng có độ lặp lại, độ thu hồi tốt, đạt yêu cầu của AOAC, phù hợp để xác định hàm lượng crinamidin trong nền chế phẩm khác nhau, với hàm lượng crinamidin giảm nhiều lần so với trong nguyên liệu lá TNHC. 51
  61. 3.3. So sánh phƣơng pháp xây dựng với phƣơng pháp tiêu chuẩn Dƣợc điển Việt Nam IV 3.3.1. So sánh về phương pháp thực hiện Xử lý mẫu sơ bộ: mẫu lá khô TNHC được nghiền nhỏ và trộn đồng nhất. Xác định hàm ẩm. Tiến hành phân tích song song trên 2 thiết bị HPLC và GC-MS/MS bằng 2 phương pháp được thể hiện trong bảng 3.19. Bảng 3.19: Quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký của phương pháp tiêu chuẩn và phương pháp xây dựng Phương pháp tiêu chuẩn Phương pháp xây dựng (HPLC) (GC-MS/MS) Quy trình xử lý mẫu Cân chính xác khoảng 2,5 g Cân chính xác khoảng 2,5 bột dược liệu (rây qua số g mẫu vào bình nón nút 355) vào bình nón nút mài mài 250 mL. Kiềm hóa 100 mL. Làm ẩm bằng NH3, bằng NH3 đặc đến pH 9,0, để yên 1 giờ. Thêm 50 mL để yên 1 giờ. Thêm 100 CHCl3 : MeOH (3 : 1), siêu mL CHCl3 : MeOH (3 : 1), âm 30 phút, lọc. Bã được đun hồi lưu 1 giờ, lọc. Bã chiết thêm 4 lần bằng 40 mL được đun sôi hồi lưu 1 giờ hỗn hợp dung môi trên. Gộp với 50 mL hỗn hợp dung dịch chiết, cô cách thủy đến môi trên. Gộp dịch chiết, cạn. Dùng HCl 0,1N để hòa cô quay chân không đến tan và chuyển toàn bộ cắn cắn. Sử dụng 20 mL HCl vào bình định mức 20 mL. 0,1N để hòa tan và chuyển Định mức bằng HCl 0,1N. toàn bộ cắn vào ống ly tâm Lọc qua màng lọc 0,45µm. 50 mL. Quy trình loại tạp Thêm 20mL CHCl3, lắc ngang 3000 vòng/phút trong 30 phút, ly tâm 6000 52
  62. Phương pháp tiêu chuẩn Phương pháp xây dựng (HPLC) (GC-MS/MS) vòng/ phút trong 5 phút. Lấy dịch acid thêm 5 mL NH3, lắc đều. Thêm 15 mL CHCl3, lắc ngang 30 phút, ly tâm. Chuyển dịch CHCl3 vào bình định mức 25 mL. Tiếp tục thêm 8 mL CHCl3, lắc ngang 30 phút, ly tâm. Gộp dịch CHCl3 và định mức 25 mL bằng CHCl3. Lọc qua màng lọc 0,2 µm. Điều Thiết bị phân Máy HPLC Shimadzu, Máy sắc ký khối phổ hai lần kiện tích detector PDA. GC-MS/MS (kiểu ba tứ cực) sắc ký 7000 Tripple Quad, Agilent. Cột Cột Symmetry C18 (250mm DB5-MS (30 m × 0,25 mm x 4,6mm x 5µm) và tiền cột × 0,25 µm) C18 (3,9mm x 5mm x 5µm) Pha động ACN : đệm phosphate 100 Heli mM pH 3,0 Tốc độ dòng 1,0 mL/phút 1,0 mL/phút Chương trình Gradient pha động Gradient chương trình sắc ký nhiệt độ Thể tích tiêm 20 µL 1 µL Kết Thời gian lưu 35,5 phút 16,7 phút quả Tổng thời 65 phút 27 phút sắc ký gian phân tích 53
  63. Phương pháp xây dựng đã thay bước chiết siêu âm bằng cách đun hồi lưu mẫu. Do đó, quy trình xử lý mẫu của phương pháp xây dựng tiết kiệm thời gian, công sức và dung môi hơn phương pháp tiêu chuẩn. Không dừng lại ở đó, chúng tôi đã cải tiến phương pháp bằng cách loại tạp và thay đổi dung môi để đáp ứng tốt nhất điều kiện sắc ký của máy sắc ký khí khối phổ, bảo vệ cột, tránh nhiễm bẩn bộ phận khối phổ và kéo dài tuổi thọ máy. Phương pháp xây dựng tiết kiệm thời gian sắc ký so với phương pháp tiêu chuẩn, thể tích tiêm nhỏ hơn, độ đặc hiệu cũng tăng lên nhiều lần. Vì vậy, chúng tôi tiến hành so sánh giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) cũng như hàm lượng crinamidin có thể chiết xuất được bằng mỗi phương pháp. 3.3.2. So sánh về giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của hai phương pháp Để xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp chúng tôi tiến hành phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng độ nhỏ khác nhau, mỗi nồng độ lặp lại 6 lần. LOD được xác định thông qua đánh giá tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) và được xác định tại nồng độ thu được S/N bằng 3. LOQ được xác định tại nồng độ thu được S/N bằng 10. Kết quả xác định LOD và LOQ được tóm tắt trong bảng 3.20 và sắc đồ của crinamidin tại nồng độ LOD được trình bày như ở hình 3.29 và hình 3.30. Bảng 3.20: Giá trị LOD và LOQ của crinamidin Phương pháp LOD (µg/g) LOQ (µg/g) Tiêu chuẩn DĐVN IV 16 40 Xây dựng 3 10 54
  64. mAU 285nm,4nm (1.00) 2.5 2.4 2.3 2.2 /35.707 2.1 /20.504 2.0 1.9 1.8 1.7 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 min Hình 3.29: Sắc ký đồ của crinamidin ở Hình 3.30: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 2 µg/mL (HPLC) LOD 0,3 µg/mL (GC-MS/MS) Khi tiến hành sắc ký theo tiêu chuẩn DĐVN IV bằng HPLC, giá trị LOQ của crinamidin là 40 µg/g. Với phương pháp đã xây dựng phân tích bằng GC-MS/MS, giá trị LOQ của crinamidin là 10 µg/g. Nhận thấy định lượng bằng GC-MS/MS có độ đặc hiệu cao hơn so với khi sử dụng HPLC, có thể định lượng những chế phẩm có hàm lượng crinamidin nhỏ hơn nhiều lần so với phương pháp tiêu chuẩn hiện có. 3.3.3. So sánh về hiệu suất của quy trình chiết trên nền mẫu lá TNHC của hai phương pháp Kết quả định lượng crinamidin trên mẫu lá TNHC được thực hiện như sau: . Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 10 đến 100 µg/mL trong HCl 0,1N. Tiến hành sắc ký trên thiết bị HPLC. . Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 5 đến 50 µg/mL trong CHCl3. Tiến hành sắc ký trên thiết bị GC-MS/MS. Xây dựng mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chuẩn. Tiến hành trên 3 mẫu thử. Tính hàm lượng crinamidin dựa vào phương trình đường chuẩn đã xây dựng cho mỗi phương pháp. 55
  65. Bảng 3.21: Kết quả phân tích hàm lượng crinamidin trong mẫu chuẩn và thử bằng phương pháp tiêu chuẩn và phương pháp xây dựng Thời gian lưu Thời gian lưu Diện tích pic Hàm lượng Diện tích pic Hàm lượng (phút) (phút) (mAU.phút) (µg/g) (µg/g) crinamidin cafein crinamidin cafein Chuẩn crinamidin 5µg/mL 16,814 8,073 79 1372 Chuẩn crinamidin 10µg/mL 35,323 41742 16,741 8,067 620 1509 Chuẩn crinamidin 20µg/mL 35,588 83586 16,737 8,063 1964 1566 Chuẩn crinamidin 40µg/mL 35,195 169925 16,741 8,075 4696 1442 Chuẩn crinamidin 50µg/mL 35,204 228731 16,741 8,079 5881 1495 Chuẩn crinamidin 100µg/mL 35,034 469971 Mẫu Khối lượng (g) Khối lượng (g) Thử 1 2,5035 35,192 70890 138,36 2,5011 16,745 8,029 1871 1700 173,30 Thử 2 2,5066 35,214 73371 142,32 2,5034 16,745 8,024 1886 1882 162,11 Thử 3 2,5071 35,14 70261 137,12 2,5042 16,745 8,024 1695 1611 167,66 TB 35,2363 139,27 16,751 8,054 167,69 RSD (%) 0,46 1,95 0,15 0,3 3,34 56
  66. Hình 3.31: Đường chuẩn crinamidin từ Hình 3.32: Đường chuẩn crinamidin từ 10 đến 100 µg/mL (HPLC) 5 đến 50 µg/mL, chuẩn nội cafein (GC- MS/MS) Nhận xét: Trên cùng một đối tượng mẫu lá, phương pháp xây dựng cho hiệu suất chiết cao hơn so với phương pháp tiêu chuẩn. Phương pháp đã xây dựng cho hiệu suất chiết cao, giới hạn phát hiện nhỏ, độ nhạy và độ chọn lọc cao có thể định lượng trên các chế phẩm hàm lượng crinamidin nhỏ đồng thời có sự kết hợp của nhiều thành phần dược liệu và tá dược, nền mẫu phức tạp. 3.4. Kết quả xác định hàm lƣợng crinamidin trên một số mẫu thuốc và TPBVSK Trên cơ sở phương pháp đã xây dựng, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng để xác định hàm lượng crinamidin từ các mẫu thuốc, cao và TPBVSK đã được mã hóa từ M1 đến M48. Kết quả xác định hàm lượng crinamidin và trình bày trong bảng 3.22 và bảng 3.23. 57
  67. Bảng 3.22: Kết quả xác định hàm lượng crinamidin từ các mẫu thuốc và TPBVSK Mẫu thực Hàm lƣợng STT Dạng bào chế đƣợc mã hóa (µg/viên) 1 M1(*) Viên nang cứng 206,9 2 M2 Viên nang cứng 45,0 3 M3 Viên nang cứng (-) 4 M4 Viên nang cứng 40,1 5 M5 Viên nang cứng 33,4 6 M6 Viên nang cứng 42,2 7 M7 Viên nang cứng 19,5 8 M8 Viên nang cứng 18,3 9 M9 Viên nang cứng 35,6 10 M10 Viên nang cứng 103,8 11 M11 Viên nang cứng (-) 12 M12 Viên nang cứng (-) 13 M13 Viên nang cứng 42,9 14 M14 Viên nang cứng 94,9 15 M15 Viên nang cứng (-) 16 M16 Viên nang cứng (-) 17 M17 Viên nang cứng (-) 18 M18 Viên nang cứng (-) 19 M19 Viên nang cứng (-) 20 M20 Viên nang cứng 60,2 21 M21 Viên nang cứng 105,3 22 M22 Viên nang cứng 54,0 23 M23 Viên nang cứng (-) 24 M24 Viên nang cứng 223,7 25 M25 Viên nén 117,8 26 M26 Viên nén 110,5 58
  68. Mẫu thực Hàm lƣợng STT Dạng bào chế đƣợc mã hóa (µg/viên) 27 M27 Viên nén (-) 28 M28 Viên nén 181,4 29 M29 Viên nén 54,6 30 M30 Viên nén 100,9 Bảng 3.23: Kết quả xác định hàm lượng crinamidin từ các mẫu cao và trà túi lọc Mẫu thực Hàm lƣợng STT Dạng bào chế đƣợc mã hóa (mg/100g) 31 M31 Cao khô 6,33 32 M32 Cao khô 14,2( ) 33 M33 Cao khô 1,56 34 M34 Cao khô 6,33 35 M35 Cao khô 0,95 36 M36 Cao khô 2,70 37 M37 Cao phun sấy 4,11 38 M38 Cao phun sấy 1,63 39 M39 Cao phun sấy 9,61 40 M40 Cao phun sấy 0,065( ) 41 M41 Cao phun sấy 0,97 42 M42 Cao lỏng 0,26 43 M43 Cao lỏng 2,17 44 M44 Trà túi lọc 1,31 45 M45 Trà túi lọc 0,99 46 M46 Trà túi lọc 2,18 47 M47 Trà túi lọc 1,73 48 M48 Trà túi lọc 2,05 Chú thích: (-) là không phát hiện. 59
  69. (*): Mẫu thuốc thảo dược ( ): Khối lượng cân mẫu là 1 g. ( ): Khối lượng cân mẫu là 5 g Nhận xét: Qua khảo sát 48 mẫu cao, thuốc và TPBVSK trên thị trường, nhận thấy hàm lượng crinamidin trong các chế phẩm thay đổi trong khoảng rộng, cụ thể: . Hàm lượng crinamidin trong 30 chế phẩm dạng viên (viên nang cứng và viên nén) dao động trong khoảng từ 0 đến 223,7 µg/viên. Trong đó có 10 mẫu không phát hiện crinamidin, chủ yếu ở dạng viên nang cứng. . Hàm lượng crinamidin trong 13 mẫu dạng cao thay đổi rộng, cụ thể: dao động từ 0,95 mg/100g đến 14,2 mg/100g đối với dạng cao khô, từ 0,065 mg/100g đến 9,61 mg/100g đối với dạng cao phun sấy và cao lỏng. Điều này cho thấy chất lượng nguyên liệu đưa vào sản xuất chưa được chuẩn hóa và/hoặc quy trình chiết xuất chưa được tối ưu hóa. . Hàm lượng crinamidin trong 5 mẫu trà túi lọc đồng đều hơn do quy trình sản xuất đơn giản, chỉ bao gồm xay thô và đóng gói. 60
  70. Phần 4. BÀN LUẬN 4.1. Về phƣơng pháp chiết xuất crinamidin từ các chế phẩm chứa TNHC Trên cơ sở 2 phương pháp chính chiết alkaloid từ dược liệu [9]: - Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ ít phân cực cho hiệu suất chiết cao do dịch chiết rút ra sạch, dễ tinh chế loại tạp. Hiện nay, đây vẫn là phương pháp được sử dụng nhiều để chiết alkaloid từ dược liệu, đặc biệt là các dược liệu có nhiều chất nhầy có độ trương nở cao. - Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước có ưu điểm là dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, thiết bị đơn giản, đầu tư ít. Tuy nhiên dịch chiết rút ra lẫn nhiều tạp, mất mát nhiều trong khâu tinh chế nên thường cho hiệu suất chiết thấp. Qua thực tế nghiên cứu, nhận thấy phương pháp chiết kiềm trong dung môi hữu cơ cho hiệu suất cao hơn so với phương pháp chiết alkaloid bằng dung dịch acid loãng, phù hợp với tài liệu tham khảo [9]. Vì vậy, với mục đích tạo được hiệu suất chiết cao nhất trong thời gian chiết xuất ngắn nhất phục vụ việc định lượng một cách chính xác nhất, cần lựa chọn và cải tiến phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ dựa trên phương pháp tiêu chuẩn của DĐVN IV. Tiến hành khảo sát trên 3 đối tượng nền mẫu: nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng nhằm xây dựng phương pháp chiết chung áp dụng cho các nền mẫu của các chế phẩm chứa TNHC. 4.2. Về xác định hàm lƣợng crinamidin bằng GC-MS/MS GC-MS/MS là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có độ lặp lại tốt nên rất thích hợp để phân tích các chế phẩm chứa TNHC. DĐVN IV bản bổ sung đã đưa ra tiêu chuẩn cho hàm lượng crinamidin trong lá TNHC (Crinum latifolium L.) bằng HPLC. Đây là phương pháp phổ biến, có thể áp dụng đại trà tại các đơn vị kiểm nghiệm tuy nhiên tiêu chuẩn này chỉ dừng lại ở đối tượng nguyên liệu lá TNHC. Bên cạnh đó, chế phẩm TNHC trên thị trường vô cùng phong phú và đa dạng, được bào chế từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau, theo tiêu chuẩn và phương pháp của từng cơ sở sản xuất, do đó hàm lượng crinamidin không đồng nhất 61
  71. giữa các cơ sở sản xuất và giữa các dạng bào chế. Ngoại trừ trà túi lọc có quy trình sản xuất đơn giản, chỉ bao gồm xay thô và đóng gói, các chế phẩm khác đều trải qua quá trình chế biến và kết hợp với nhiều thành phần dược liệu và tá dược khác nhau, do đó hàm lượng crinamidin giảm nhiều lần so với nguyên liệu lá TNHC đồng thời nền mẫu trở nên phức tạp hơn. Phương pháp xây dựng sử dụng chuẩn nội cafein, kết quả thu được độ lặp lại tốt hơn so với khi không có chuẩn nội và được biểu thị bằng RSD (%) giữa các lần tiêm. Cafein là alkaloid nhân purin tìm thấy trong hạt cà phê và các bộ phận của cây chè (Camellia sinensis L.) [9], cacao (Theobroma cacao L.), cây cô la (Cola sp.) [10], công thức phân tử: C8H10N4O2 (M = 194,19 g/mol). Cafein ở dạng tinh thể, không màu, không mùi, vị đắng. Thăng hoa ở 178oC, nhiệt độ nóng chảy 238oC. Tan nhiều trong nước và CHCl3 [36]. Cafein có tác dụng trợ tim và lợi tiểu nhẹ [9], kích thích thần kinh trung ương, tăng cường sự tỉnh táo, có thể gây nhịp tim nhanh, khả năng gây nghiện [28]. Khoảng tuyến tính giữa nồng độ và tỷ lệ diện tích pic crinamidin/diện tích cafein với R2 = 0,9970 > 0,995 trong khoảng nồng độ từ 5 đến 50 µg/mL (tương ứng với 50 – 500 µg/g). Phương pháp xây dựng có độ lặp lại tốt, độ thu hồi trên ba nền mẫu khác nhau (viên nang cứng, trà túi lọc, cao lỏng) đều đạt yêu cầu của AOAC. Do đó phương pháp này phù hợp để xác định crinamidin trong các chế phẩm TNHC. Tuy nhiên, chỉ ba đối tượng nền mẫu của các chế phẩm phổ biến được lựa chọn để thẩm định mà chưa thẩm định được trên tất cả các đối tượng nền mẫu. Qua thực nghiệm so sánh hiệu quả của phương pháp tiêu chuẩn của DĐVN IV sử dụng phương pháp HPLC và phương pháp xây dựng sử dụng kỹ thuật GC- MS/MS, đồng thời tham khảo tài liệu [11], nhận thấy phương pháp xây dựng cho hiệu suất chiết cao hơn, LOD và LOQ nhỏ hơn nhiều lần, có thể định lượng chế phẩm hàm lượng nhỏ hơn nhiều lần, tiết kiệm thời gian và dung môi, hóa chất. Vì vậy phương pháp xây dựng phù hợp trong việc góp phần tiêu chuẩn hóa các chế phẩm có chứa thành phần TNHC. 4.3. Ứng dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng crinamidin trên mẫu thực 62
  72. Qua xác định hàm lượng crinamidin từ 48 mẫu viên nang cứng, viên nén, trà túi lọc, cao khô, cao phun sấy và cao lỏng thu thập trên thị trường và mẫu tại Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia. Kết quả hàm lượng crinamidin không đồng đều, cụ thể như sau: . Hàm lượng crinamidin trong 30 chế phẩm dạng viên (viên nang cứng và viên nén) dao động trong khoảng từ 0 đến 223,7 µg/viên. Trong đó có 10 mẫu không phát hiện crinamidin, chủ yếu ở dạng viên nang cứng. Viên nang cứng và viên nén chủ yếu được bào chế từ nguyên liệu lá TNHC với dung môi chiết là nước. Qua khảo sát quy trình chiết xuất nhận thấy việc sử dụng dung môi nước cho hiệu suất chiết không cao, là một trong những nguyên nhân gây ra sự dao động hàm lượng crinamidin trong các chế phẩm. Bên cạnh đó, 10 mẫu chứa hàm lượng crinamidin nhỏ hơn giá trị LOQ có thể do nguồn nguyên liệu không đạt tiêu chuẩn, sử dụng các bộ phận khác của cây TNHC hoặc có sự nhầm lẫn, thay thế bằng các loại dược liệu khác không chứa crinamidin. . Hàm lượng crinamidin trong 13 mẫu cao thay đổi rộng, cụ thể: dao động từ 0,95 mg/100g đến 14,2 mg/100g đối với dạng cao khô, từ 0,065 mg/100g đến 9,61 mg/100g đối với dạng cao phun sấy và cao lỏng. Dạng cao phun sấy và cao lỏng chủ yếu được bào chế từ nguyên liệu lá TNHC với dung môi chiết là nước. Dạng cao lỏng thay đổi trong khoảng rộng do được chiết xuất ban đầu từ hỗn hợp nguyên liệu. Điều này cho thấy chất lượng nguyên liệu đưa vào sản xuất chưa được chuẩn hóa và/hoặc quy trình chiết xuất chưa được tối ưu hóa. . Hàm lượng crinamidin trong 5 mẫu trà túi lọc có hàm lượng đồng đều hơn do quy trình sản xuất đơn giản, chỉ bao gồm xay thô và đóng gói. Hàm lượng crinamidin trong các chế phẩm TNHC thay đổi trong khoảng rộng. Nghiên cứu đã góp phần trong từng bước tiêu chuẩn hóa các chế phẩm chứa thành phần TNHC để đạt được sự đồng đều hàm lượng crinamidin trong các chế phẩm, bảo đảm quyền lợi người sử dụng, đồng thời giải quyết được vấn nạn thuốc và TPBVSK thật hay giả hiện nay. 63
  73. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1. Đã khảo sát và lựa chọn điều kiện chiết xuất crinamidin từ các chế phẩm viên nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng bằng phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base sử dụng dung môi hữu cơ. Từ đó xây dựng quy trình chiết chung cho cả 3 nền mẫu đã khảo sát. Cụ thể: - Lựa chọn số lần chiết cho mỗi đối tượng là 2 lần. - Lựa chọn được thời gian chiết tối ưu cho mỗi lần chiết xuất là 1 giờ. - Lựa chọn tỷ lệ hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1. 2. Lựa chọn được chuẩn nội là cafein cho định lượng crinamidin. 3. Đã lựa chọn được điều kiện phân tích crinamidin bằng GC-MS/MS - Tách bằng sắc ký khí sử dụng cột DB5-MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm). Chương trình nhiệt độ: nhiệt độ đầu 100oC, giữ 1 phút, tăng nhiệt với tốc độ 20oC/phút đến 240oC, giữ 1 phút. Tiếp tục tăng 5oC/phút lên đến 290oC, giữ 6 phút. - Phân tích MS/MS với EI 70 eV, chế độ MRM. 4. Đã thẩm định phương pháp xác định hàm lượng crinamidin trong chế phẩm với các kết quả như sau: - Phương pháp có tính chọn lọc đáp ứng yêu cầu; sau khi bắn phá crinamidin qua MS/MS lựa chọn ba ion con, một ion được sử dụng để định lượng và hai ion dùng để khẳng định sự có mặt của crinamidin trong mẫu. Bên cạnh đó lựa chọn hai ion của cafein, một ion con được sử dụng để định lượng và một ion con được dùng để xác nhận. - Khoảng tuyến tính với R2 = 0,9970 trong khoảng nồng độ từ 5 đến 50 µg/mL (tương ứng với 50 – 500 µg/g). - Giới hạn định lượng của crinamidin là 1 µg/mL (tương ứng 10 µg/g). - Độ lặp lại của phương pháp có độ lệch chuẩn tương đối từ 4,5% đến 4,9 % trên các nền nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng. 64
  74. - Độ thu hồi trên nền nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng thuộc khoảng 90,0% đến 107,0% đáp ứng yêu cầu AOAC. 5. So sánh phương pháp đã xây dựng với phương pháp tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam IV, phương pháp đã xây dựng có các ưu điểm sau: - Quy trình chiết đã xây dựng cho hiệu suất chiết cao hơn so với quy trình chiết của tiêu chuẩn DĐVN IV. Phương pháp đã xây dựng sử dụng chuẩn nội là cafein, độ lặp tốt, giảm thiểu được các sai số trong phân tích. - Phương pháp đã xây dựng có giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng thấp hơn so với phương pháp tiêu chuẩn DĐVN IV, có thể định lượng những mẫu có hàm lượng nhỏ hơn. - Thời gian phân tích bằng GC-MS/MS không quá dài, chỉ khoảng một nửa thời gian phân tích so với HPLC, đồng thời tiết kiệm thời gian hoạt hóa, rửa cột mà HPLC cần cho mỗi lần phân tích. Bên cạnh đó, thời gian lưu của pic chính và chuẩn nội khi phân tích bằng GC-MS/MS ổn định, RSD thời gian lưu tR (các lần phân tích, các ngày phân tích khác nhau) < 2%, ít chịu ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài. 6. Đánh giá xác định hàm lượng crinamidin trên 48 mẫu thuốc và TPBVSK. Trong đó có 10 mẫu không phát hiện crinamidin. Hàm lượng crinamidin trong 38 mẫu còn lại thay đổi trong khoảng rộng giữa các chế phẩm có cùng dạng bào chế. Kiến nghị 1. Áp dụng phương pháp xây dựng tại các phòng thí nghiệm có thiết bị GC-MS/MS để xác định hàm lượng crinamidin đại trà. 2. Tiếp tục nghiên cứu liên phòng thí nghiệm nhằm bổ sung phương pháp đã xây dựng vào hệ thống tiêu chuẩn kiểm nghiệm quốc gia phục vụ cho việc quản lý thuốc và TPBVSK. 65
  75. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2012), Hóa phân tích tập II, NXB Y học. 2. Nguyễn Tuấn Anh, Phạm Thị Giảng, Trịnh Văn Quỳ (2006), "Nghiên cứu định tính, định lượng Crinamidin trong dược liệu và viên nang Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao", Tạp chí KIỂM NGHIỆM THUỐC, 4(4), pp. 10 - 14. 3. Bộ Y Tế (2015), Dược điển Việt Nam IV Bản bổ sung, NXB Y học, Hà Nội, pp. 1182 - 1184. 4. Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y Học, pp. PL 125 - 127. 5. Bộ Y Tế, Thông tư ban hành Danh mục thuốc thiết yếu lần VII Bản dự thảo. p. 51 - 52. 6. Chính phủ Nghị định 65/2017/NĐ-CP, Chính sách đặc thù về giống, vốn và công nghệ trong phát triển nuôi trồng, khai thác dược liệu. 2017. 7. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, Hà Nội, pp. 500. 8. Võ Thị Bạch Huệ, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Ngô Vân Thu, Delome Frederic, Daniel F. Michel Bechi (1999), "Khảo sát alcaloid chiết từ lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae) bằng kỹ thuật GC-MS", Tạp chí Dược học, 4, pp. 9-11. 9. Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học Tập II, NXB Y học. 10. Đỗ Tất Lợi (2015), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, pp. 510 - 512; 915-918; 924-926. 11. Phạm Luận (2014), Phương pháp phân tích sắc ký và chiết tách, Nhà xuất bản Bách khoa Hà Nội. 12. Trần Cao Sơn - Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học & vi sinh vật, NXB khoa học và kỹ thuật. 13. Nguyễn Viết Thân (2004), Những cây thuốc, vị thuốc thường dùng. 14. Nguyễn Nhật Thành, Phạm Thị Ninh, Trần Thị Phương Thảo, Hoàng Minh Châu, Trần Văn Sung (2011), "Nghiên cứu thành phần hóa học lá cây trinh
  76. nữ hoàng cung (Crinum latifolium) trồng ở Đồng Nai, Việt Nam", Tạp chí Hóa học, (49), pp. 355 -361. 15. Thủ tướng chính phủ 1976/QĐ-TTg, Quyết định phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030. 2013. 16. Nguyễn Hữu Lạc Thủy (2014), Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alkaloid và flavonoid cho cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae), Luận án tiến sĩ Dược học, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh. 17. Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Nguyễn Hồng Thiên Thanh, Võ Thị Bạch Huệ (2013), "Phân lập và xây dựng chất chuẩn crinamidin từ lá trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L.", Tạp chí Dược học, 441, pp. 38 - 41. 18. Tuệ Tĩnh 3033 cây thuốc đông y y học cổ truyển Tuệ Tĩnh. 19. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Dương Thị Thúy Nga, Nguyễn Thị Tường Vy, Phạm Quỳnh Khoa, Hà Diệu Ly, Hà Hồi, Nguyễn Minh Đức (2016), "Điều chế và thiết lập chất chuẩn crinamidin", Tạp chí Dược học, 477, pp. 52-57. 20. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Phan Thị Phi Phi, Phan Thị Thu Anh (2008), "Tác dụng phục hồi thương tổn tế bào Lympho T và dòng tủy của viên nang Crila trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)", Tạp chí Dược học, 5, pp. 10 - 14. Tiếng Anh 21. Association of Official Analytical Chemists (2002), AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals. 22. Daniel C. Harris (2006), Quantitative Chemical Analysis, seventh edition Craig Bleyer, W.H Freeman and Company, New York, pp. 474-555. 23. David M. Bliesner (2006), Validating chromatographic methods - A pratical guide, Wiley - interscience. 24. Edmond de Hoffmann, Vincent Stroobant (2007), Mass Spectrometry Principles and Applications, Third edition, Wiley, pp. 217-221.
  77. 25. Elena Stashenko and Jairo René Martínez (2014), Gas Chromatography - Mass Spectroscopy, Advances in Gas Chromatography, Xinghua Guo (Ed.), Intech. 26. Francesc Viladomat, Giovanna R. Almanza, Carles Codina, Jaume Bastida, William E. Campbell, Shaheed Mathee (1996), "Alkaloid from Brunsvigia orientalis", Phytochemistry, 43(6), pp. 1379-1384. 27. Shibnath Ghosal, Kulwant S. Saini, August Wilhelm Frahm (1983), "Alkaloids of Crinum latifolium", Phytochemistry, 22, pp. 2305 - 2309. 28. Jasvinder Chawla, Amer Suleman (2017), "Neurologic Effects of Caffeine", Medscape. 29. John Refaat, Mohamed S. Kamel, Mahmoud A. Ramadan and Ahmed A. Ali (2013), "Crinum; an endless source of bioactive principles: A review. Part V. Biological profile", International journal of pharmaceutaical sciences and research, 4(4), pp. 1239 - 1252. 30. Jonathan MELVILLE (2014), "GC/MS Analysis of Caffeine", UC Berkeley College of Chemistry. 31. Levin S "Traditional Vietnamese herb Crinum latifolium shows promise for prostate and ovarian health", International Journal of Immunopharmacology, 1(12), pp. 2143-2150. 32. Marcel Jenny, Angela Wondrak , Elissaveta Zvetkova, Nguyen Thi Ngoc Tram, Phan Thi Phi Phi, Harald Schennach, Zoran Culig, Florian Ueberall, Dietmar Fuchs (2011), "Crinum latifolium leave extracts suppress immune activation cascades in peripheral blood mononuclear cells and proliferation of prostate tumor cells", Scientia Pharmaceutica, 79(2), pp. 323 - 336. 33. Nguyen Hai Nam, Kim Yong, et al. (2004), "New constituents from Crinum latifolium with inhibitory effects against tube-like formation of human umbilical venous endothelial cells", Natural Product Research 18(6), pp. 485 - 491. 34. Quincy A. Edwards Sherry-Anne S. Hinkson, Leah D. Garner-O’neale And Sergei M. Kulikov (2015), "Quantification of caffeine in selected beverages via gas chromatography mass spectroscopy", Sadguru Publications.
  78. 35. Shigeru Kobayashi, Tokumoto Toshihiro, Kihara Masaru, Imakura Yasuhiro, Shingu Tetsuro, Taira Zenei (1984), "Alkaloidal constituents of Crinum latifolium and Crinum bulbispermum (Amaryllidaceae)", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 32, pp. 3015 - 3022. 36. Tadelech Atomssa and A.V. Gholap (2011), "Characterization of caffeine and determination of caffeine in tea leaves using uv-visible spectrometer", African Journal of Pure and Applied Chemistry, 5(1), pp. 1-8. 37. The Commission of The European Communities (2012), "Comission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results (2002/657/EC)", Official Journal of the European Communities. 38. Nguyen Thi Ngoc Tram, Maya Mitova, Vassya Bankova, Nedyalka Handjieva, Simeon S. Popov (2002), "GC-MS of Crinum latifolium L. Alkaloids", Z. Naturforsch C., 57 (3-4), pp. 239 - 242. 39. Nguyen Thi Ngoc Tram, Zornitza G. Kamenarska, Nedyalka V. Handjieva, Vassya S. Bankova, Simeon S. Popov (2003), "Volatiles from Crinum latifolium", Journal of Essential Oil Research, 15(3), pp. 195-197. 40. Zvetkova E, Wirleitner B, Tram N, Schennach H and Fuchs D (2001), "Aqueous extracts of Crinum latifolium (L.) and Camellia sinensis show immunomodulatory properties in human peripheral blood mononuclear cells", Journal of International Immunopharmacology, 1(12), pp. 2143-2150.