›

Luận án Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng

pdf 117 trang yendo 7220
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_nuoi_cay_te_bao_cay_nghe_den_curcuma_zedo.pdf

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng

  1. LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc và PGS. TS. Cao Đăng Nguyên đã quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn tận tình. Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, giảng viên của Phòng thí nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên-Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế; Bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban Đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Phòng Đào tạo Sau đại học Trường đại học Khoa học; Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đã có nhiều giúp đỡ quí báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng tôi hoàn thành luận án. Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình đã đóng góp một phần không nhỏ trong việc hoàn thành luận án này. Huế, ngày 15 tháng 02 năm 2014 Tác giả Võ Châu Tuấn
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tác giả Võ Châu Tuấn
  3. MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU 1 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 3 4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 4 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT 5 1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật 5 1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật 6 1.1.2.1. Nuôi cấy callus 6 1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào 7 1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào 10 1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào 12 1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn 16 1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT NUÔI CẤY IN VITRO 19 1.2.1. Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật 19 1.2.2. Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật 19 1.2.2.1. Nhóm terpene 20 1.2.2.2. Nhóm phenol 20 1.2.2.3. Các hợp chất chứa nitrogen 20
  4. 1.2.3. Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật 21 1.2.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước 21 1.2.3.2. Những nghiên cứu trong nước 25 1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN 28 1.3.2. Thành phần hóa học 28 1.3.3. Công dụng 30 1.3.3.1. Công dụng cổ truyền 30 1.3.3.2. Các hoạt tính sinh học 30 1.3.4. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro của cây nghệ đen 35 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.37 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 37 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 37 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.3.1. Nuôi cấy callus 39 2.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào 39 2.3.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác 39 2.3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men 40 2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của tế bào 40 2.3.4. Định lượng tinh dầu 41 2.3.5. Định lượng curcumin 41 2.3.6. Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước 42 2.3.7. Xác định sesquiterpene 42 2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu 43 2.3.9. Xử lý thống kê 43 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44 3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN 44 3.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC 47 3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy 47
  5. 3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc 49 3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST 51 3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA 51 3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D 52 3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA 52 3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon 54 3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose 54 3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose 56 3.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO HUYỀN PHÙ TRONG HỆ LÊN MEN 59 3.3.1. Khảo sát sinh trưởng của tế bào 59 3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 61 3.3.2.1. Cỡ mẫu 61 3.3.2.2. Tốc độ khuấy 62 3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí 63 3.4. KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆ ĐEN 65 3.4.1. Hàm lượng tinh dầu 65 3.4.2. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số 67 3.4.3. Hàm lượng curcumin 68 3.4.4. Xác định sesquiterpene 73 3.5. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TẾ BÀO NGHỆ ĐEN 77 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 80 NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC
  6. BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT BAP : 6-benzylaminopurine BA : 6-benzyladenine CIB : centrifugal impeller bioreator cs : cộng sự DMSO : dimethyl sulfoxide ĐC : đối chứng ĐHST : điều hòa sinh trưởng HPLC : high performance liquid chromatography (sắc ký hiệu năng cao áp) IAA : indoleacetic acid IBA : indolebutyric acid Kin : kinetin L : lít L-DOPA : L-3,4 -dihydrooxyphenylamine LPS : lipopolysaccharide MS : Murashige và Skoog (1962) NAA : naphthaleneacetic acid Nxb : nhà xuất bản TNF-α : tumor necrosis factor-alpha 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
  7. DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 1 Bảng 3.1.Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro 44 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng và phát 2 46 sinh hình thái của callus Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào 3 48 nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào 4 50 nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi 5 51 cấy huyền phù trong bình tam giác Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh trưởng của tế bào nuôi 6 52 cấy huyền phù trong bình tam giác Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh trưởng của tế 7 53 bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào 8 54 nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào 9 56 nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng của tế bào 10 57 nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào 11 62 nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế 12 63 bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế 13 64 bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L
  8. Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi cấy 14 66 trong hệ lên men 10 L Bảng 3.15. Hàm lượng polysaccharide của tế bào nghệ đen nuôi 15 67 cấy trong hệ lên men 10 L Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy 16 69 trong hệ lên men 10 L Bảng 3.17. Chiều cao phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene 17 trong tế bào nuôi cấy ở hệ lên men 10 L và tế bào củ nghệ tự 74 nhiên 18 Bảng 3.18. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen 78
  9. DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang 1 Hình 2.1. Cây nghệ đen nuôi cấy in vitro 37 2 Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm 38 Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro 3 45 (A) callus trắng và xốp, (B) callus trắng và mọng nước 4 Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn, rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy 47 Hình 3.3. Dịch huyền phù tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy 5 55 trong bình tam giác trên môi trường có 3% sucrose Hình 3.4. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình 6 tam giác trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA và 58 1,5 mg/L 2,4-D, lắc 120 vòng/phút Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml 7 59 đặt trên máy lắc 8 Hình 3.6. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L 60 Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5 9 60 mg/L 2,4-D ; khuấy 120 vòng/phút; sục khí 2,0 L/phút, cỡ mẫu 100 g Hình 3.8. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào 10 61 nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 L Hình 3.9. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hê lên men nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5 11 65 mg/L 2,4-D ; khuấy 150 vòng/phút; sục khí 2,5 L/phút, cỡ mẫu 200 g 12 Hình 3.10. Phổ HPLC của curcumin chuẩn (0,5 mg/ml) 71
  10. Hình 3.11. Phổ HPLC curcumin của củ nghệ đen 01 năm tuổi 13 72 ngoài tự nhiên Hình 3.12. Phổ HPLC curcumin của tế bào nghệ đen sau 2 đến 14 73 18 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít Hình 3.13. Phổ HPLC của sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự 15 nhiên; B: tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L từ 2 76 đến 18 ngày 16 Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen 77
  11. 1 MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Trong nhiều thế kỷ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm. Hơn nữa, thực vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc các chất phụ gia thực phẩm có giá trị [132]. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây (thường nhỏ hơn 1% khối lượng khô) và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ. Chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật [177]. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX và đến nay có khoảng hơn 80.000 hợp chất thứ cấp khác nhau ở thực vật đã đuợc công bố [19], [23]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng thảo dược làm thuốc để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe. Việc khai thác nguồn dược liệu tự nhiên từ thực vật đang trở thành một vấn đề quan trọng mang tính toàn cầu và chúng ngày càng được thương mại hóa nhiều hơn. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra hiện nay là nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc đang bị biến mất nhanh chóng do sự biến đổi của khí hậu toàn cầu cũng như sự khai thác bừa bãi của con người. Như vậy, sản xuất các hợp chất thứ cấp thực vật bằng con đường canh tác truyền thống và tổng hợp hóa học sẽ có nhiều hạn chế, khó có thể đáp ứng đủ nhu cầu dược liệu ngày càng tăng trong tương lai [188]. Điều này buộc các nhà khoa học cần phải tính đến công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật như một con đường tiềm năng để cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược phẩm [106].
  12. 2 Nuôi cấy tế bào thực vật đã được quan tâm nghiên cứu từ những năm 1950. Nhiều nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy tế bào thực vật là một phương thức có hiệu quả trong sản xuất các hợp chất có hoạt chất sinh học hoặc các chất chuyển hóa của chúng [132]. Ưu điểm của nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu dồi dào để tách chiết ở quy mô công nghiệp các hoạt chất mà không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên [106]; có thể tạo ra các hợp chất mới và chủ động nâng cao khả năng sản xuất chúng bằng cách thay đổi các điều kiện nuôi cấy [128]; các hoạt chất thu được không bị nhiễm bẩn bởi thuốc trừ sâu, diệt cỏ, kháng côn trùng cũng như tránh được sự không đồng nhất về nguồn nguyên liệu và những biến động hàm lượng của các sản phẩm thực vật ngoài tự nhiên. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học tích lũy trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro tương đương hoặc cao hơn nhiều lần so với cơ quan tích lũy của chúng trong cây ngoài tự nhiên [140], [167]. Đến nay, người ta đã thành công trong sản xuất rất nhiều loại hợp chất có giá trị theo phương thức này trên qui mô lớn như anthraquinone ở cây Rubia akane, vincristine ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus), berberin ở cây Coscinium fenustratum, diosgenin ở cây Dioscorea doryophora, taxol ở các loài thuộc chi Taxus, ginsenoside ở các loài thuộc chi Panax [163]. Nghệ đen còn gọi là nga truật thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) có nguồn gốc từ Đông Bắc Ấn Độ, được trồng ở khắp khu vực Nam Á, Đông Nam Á, Trung Quốc, Đài Loan, và Madagasca [9], [115]. Củ của cây nghệ đen có chứa các hoạt chất sinh học chủ yếu là curcumin, terpenoid và tinh dầu. Ngoài ra nó còn có tinh bột, chất dẻo và một số chất có vị đắng như tannin và flavonoid [82]. Các nghiên cứu cho thấy, curcumin có khả năng chống được sự phát sinh khối u; một số dạng ung thư ở chuột như ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung thư buồng trứng [55], [66], [152]; curcumin cũng có tác dụng chống đông máu và hạ huyết áp; curcuminoid và sesquiterpene là những chất có khả năng ức
  13. 3 chế sự hình thành TNF-α của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng chống viêm nhiễm [152]; curcumin còn là một chất chống oxy hóa có khả năng bảo vệ tế bào. Nhiều công trình nghiên cứu cũng cho thấy, tinh dầu nghệ đen có tác dụng kháng khuẩn và kháng đột biến rất cao [176]. Bên cạnh đó, polysaccharide của nghệ đen ức chế hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt (sarcoma 180) được cấy dưới da của chuột, ngăn cản đột biến nhiễm sắc thể, có hoạt tính kích thích đại thực bào [75], [105], [169]. Trong tự nhiên, nghệ đen là loài nhân giống bằng thân rễ, phải mất một thời gian dài để tạo củ nên hệ số nhân kém; năng suất thu hoạch thường thấp, đặc biệt là phụ thuộc rất lớn vào điều kiện đất đai, khí hậu, mùa vụ, chi phí nhân công và vật tư sản xuất. Mặt khác, nghệ đen trong tự nhiên còn dễ mắc các bệnh như thối củ và đốm lá [29]. Vì vậy, rất khó có đủ nguồn nguyên liệu dồi dào và ổn định để sản xuất lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học quý của cây nghệ đen sử dụng trong bào chế dược phẩm. Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng” 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp để sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định được khả năng tích lũy và hoạt tính sinh học một số hợp chất trong tế bào nghệ đen nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L. 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới, có tính hệ thống về nuôi cấy in vitro tế bào cây nghệ đen và sự tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng; đồng thời là nguồn tài liệu tham khảo hữu
  14. 4 ích trong nghiên cứu, giảng dạy về nuôi cấy tế bào và sản xuất các hoạt chất sinh học có giá trị cao từ nuôi cấy tế bào thực vật. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của luận án là cơ sở khoa học để phát triển hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen ở qui mô lớn nhằm sản xuất nhanh sinh khối, cung cấp nguồn nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất có giá trị cao dùng làm thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng. 4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Đã tạo ra dòng tế bào callus (rắn và rời rạc) từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro thích hợp để nuôi cấy huyền phù, đồng thời xác định một cách có hệ thống các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng nhanh và ổn định của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml và trong hệ lên men 10 L. - Đã khảo sát sự tích lũy các chất có hoạt tính sinh học như: tinh dầu, curcumin, sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy. Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng và thời điểm tích lũy cao nhất của các hợp chất này theo đường cong sinh trưởng và đồng thời cho thấy có sự chuyển hóa sinh học các chất như curcumin và sesquiterpene xảy ra trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen. - Đã khảo sát được khả năng kháng khuẩn của tinh dầu chiết rút từ tế bào cây nghệ đen nuôi cấy in vitro và nhận thấy, tinh dầu của tế bào có khả năng ức chế sinh trưởng một số loài vi sinh vật gây bệnh ở mức tương đương hoặc cao hơn so với tinh dầu chiết rút từ củ nghệ đen 01 năm tuổi ngoài tự nhiên.
  15. 5 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT 1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy vô trùng các tế bào, mô, cơ quan và các bộ phận của chúng dưới các điều kiện về vật lý và hóa học in vitro [93]. Thử nghiệm đầu tiên về nuôi cấy tế bào bên ngoài một cơ thể thực vật hoàn chỉnh được công bố vào năm 1902 bởi Haberlandt - nhà Sinh lý thực vật người Đức, người được biết đến như nhà sáng lập ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật. Trong bài viết nổi tiếng với tiêu đề “Những thử nghiệm nuôi cấy các tế bào thực vật tách rời”, ông đã mô tả những nổ lực trong thiết lập có hệ thống nuôi cấy các tế bào thịt lá, biểu bì và lông hút. Mặc dù không thành công trong nuôi cấy phân chia tế bào, nhưng ông dự đoán sẽ có khả năng đạt được sự phân chia tế bào trong nuôi cấy các tế bào riêng rẽ, điều này đã ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự nghiệp của nhiều nhà nhà khoa học sau này. Tiếp sau đó là những nghiên cứu rộng rãi theo hướng cải thiện các dung dịch dinh dưỡng và khám phá về các chất ĐHST thực vật nhằm kiểm tra lại những dự đoán của Haberlandt [164]. Trong những năm 1960, nhiều nổ lực hơn nữa để cải thiện dung dịch dinh dưỡng đã đưa đến 2 công bố đáng chú ý của Skoog và cs, với hai môi trường nuôi cấy đã được dùng và mô tả đó là môi trường Murashige và Skoog [107] và môi trường Linsmaier và Skoog [85]. Nuôi cấy các tế bào đơn và các khối nhỏ tế bào thành công đầu tiên trong nuôi cấy tế bào cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) và cây Tagetes erecta trên máy lắc. Nuôi cấy tế bào thực vật trên qui mô lớn đầu tiên thành công ở tế bào của các cây bạch quả, bắt ruồi, cỏ Lolium và hoa hồng trong hệ lên men kiểu ráy nước dạng đơn giản với dung tích 20 L [164]. Những thử nghiệm đầu tiên trong nuôi cấy tế bào đơn để sản xuất dược
  16. 6 phẩm đã được tiến hành trong những năm 1950 tại công ty Charles Pfizer [164]. Đến năm 1987, đã có 30 hệ thống nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật có khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp cao hơn trong các thực vật tương ứng [177]. Đến nay, một thế kỷ sau những nghiên cứu của Haberlandt, nhiều hợp chất thứ cấp đã được sản xuất thương mại bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật như berberine, paclitaxel, ginseng saponin, polysaccharide [177]. 1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật Mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, chứa đầy đủ thông tin di truyền của một cơ thể. Trong những điều kiện nhất định, mỗi tế bào có thể hình thành lại được một cơ thể hoàn chỉnh. Hoàn toàn có thể tách riêng và nuôi cấy tế bào độc lập để nghiên cứu mọi quá trình sống xảy ra trong đó [12]. 1.1.2.1. Nuôi cấy callus Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào không phân hóa, được gọi là callus. Nuôi cấy callus đạt được bằng cách nuôi cấy các mẫu mô tách từ thực vật trên môi trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn là agar. Môi trường dinh dưỡng cơ bản này chứa các chất dinh dưỡng khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn carbon và nhiều loại chất ĐHST thực vật. Đánh giá chính xác các ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng hoặc chất ĐHST lên khả năng sinh trưởng của callus là yêu cầu quan trọng để xác định môi trường tối ưu cho nuôi cấy. Các thông số phổ biến nhất dùng trong đánh giá sinh trưởng trong nuôi cấy callus bao gồm khối lượng tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh trưởng [93]. Trong nuôi cấy callus, các tế bào của callus có thể trải qua biến dị dòng soma trong quá trình cấy chuyển. Vì vậy, các dòng tế bào ổn định di truyền nên được lựa chọn để tránh sự sản xuất thất thường các chất trao đổi thứ cấp trong nuôi cấy. Thông thường, sau một số lần cấy chuyển, callus có thể được xem là dòng tế bào đồng nhất khi các thông số sinh trưởng của dòng tế bào được lặp lại
  17. 7 trong quá trình cấy chuyển trên cùng một loại môi trường nuôi cấy [35]. Bouque và cs (1998) đã nghiên cứu nuôi cấy 217 dòng callus khác nhau từ các loài của chi Psoralea nhận thấy, sau 16 lần cấy chuyển (48 tuần), có khoảng 90% số dòng callus sinh trưởng ổn định [22]. Fett-Neto và cs (1994) nuôi cấy tế bào cây Taxus cuspidate và thu được dòng tế bào ổn định sinh trưởng sau 2 năm cấy chuyển [42]. 1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào Nuôi cấy huyền phù tế bào thường được khởi đầu bằng cách chuyển các khối callus vào nuôi cấy trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay hoặc màng lọc xoay. Mô callus nuôi cấy nên là loại mô dễ vỡ vụn để có thể thiết lập được dịch huyền phù tế bào với mức độ phân tán cao nhất. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong môi trường lỏng cung cấp một hệ thống duy nhất cho những nghiên cứu chi tiết về sinh trưởng và sản xuất các chất chuyển hóa. So với nuôi cấy callus, nuôi cấy huyền phù sản xuất ra lượng lớn sinh khối tế bào mà từ đó các chất chuyển hóa thứ cấp có thể dễ dàng chiết tách [35]. Nuôi cấy dịch huyền phù là sự tiến triển từ thực vật đến mẫu vật, đến callus và cuối cùng đến dịch huyền phù [7]. Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi callus do những chuyển động xoáy của môi trường. Sau một thời gian ngắn nuôi cấy, trong dịch huyền phù là hỗn hợp các tế bào đơn, các khối tế bào với kích thước khác nhau và các tế bào chết. Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù tốt, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. Khả năng tách rời của các tế bào trong môi trường có thể cải thiện bằng cách thay đổi thành phần môi trường nuôi cấy [104]. Mặc dù sự kết khối của tế bào có thể được loại bỏ bởi sự thay đổi điều kiện môi trường nuôi cấy, nhưng thường trong cuối pha lag của quá trình nuôi cấy, các tế bào trở nên kết dính với nhau như là một qui luật. Để thu được dịch huyền phù gồm phần lớn các tế bào đơn, người ta thường sử dụng các enzyme phá hủy thành tế bào hoặc dùng các sàng (rây). Tuy nhiên, các dịch huyền phù
  18. 8 đồng nhất đã được thiết lập thường chúng có xu hướng quay trở lại tình trạng kết khối ban đầu (Fowler và cs 1982) [104]. Cho đến nay, hầu hết các dịch huyền phù tế bào đã được nuôi cấy có sự hiện diện của cả những tế bào đơn và các khối tế bào. Nhìn chung, môi trường thích hợp cho nuôi cấy callus thì cũng thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nồng độ của các auxin và cytokinin đòi hỏi cao hơn. Thông thường, động học sinh trưởng của các tế bào nuôi cấy huyền phù là đường hàm mũ; các hợp chất thứ cấp chủ yếu tạo ra trong pha ổn định, liên quan với trao đổi chất sơ cấp và phân chia tế bào [35]. Nuôi cấy huyền phù tế bào là tiến hành nuôi tế bào trong môi trường lỏng có dung tích nhất định để thiết lập hệ huyền phù tế bào. Trong quá trình nuôi cấy, bình nuôi cấy không chỉ thường xuyên có sự tăng lên của các sản phẩm trao đổi chất mà còn luôn luôn diễn ra sự trao đổi không khí với bên ngoài. Khi các chất dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy bị tiêu hao, cùng với sự tạo thêm một số sản phẩm trao đổi chất có hại, thì sự phân chia và sinh trưởng của tế bào sẽ bị ức chế. Khi đó, thông qua cấy chuyển hoặc thay đổi môi trường nuôi cấy sẽ kích thích sự sinh trưởng mạnh mẽ trở lại của huyền phù tế bào [12]. Nhìn chung, có ba phương thức nuôi cấy huyền phù tế bào là nuôi cấy mẻ, nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục. - Nuôi cấy mẻ Nuôi cấy mẻ là phương thức mà trong suốt thời gian nuôi cấy không thêm vào chất dinh dưỡng cũng như không loại bỏ sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất. Do vậy, các điều kiện môi trường luôn thay đổi theo thời gian, mật độ tế bào tăng lên còn nồng độ cơ chất giảm xuống. Nuôi cấy mẻ được xem là một hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh trưởng và phát triển theo một số pha nhất định với những điều kiện đặc trưng [7]. Mặc dù tế bào thực vật và tế bào vi sinh vật có một số điểm khác nhau như kích thước của tế bào thực vật lớn hơn, chu kỳ sinh trưởng của tế bào thực vật dài hơn, sự trao đổi chất chậm hơn
  19. 9 nhưng nhìn chung sinh trưởng của tế bào thực vật trong nuôi cấy mẻ cũng trải qua các giai đoạn như tế bào vi sinh vật, gồm có bốn pha. Pha lag (pha tiềm phát): bắt đầu từ khi callus được đưa vào môi trường cho đến khi có dấu hiệu phân chia tế bào đầu tiên; trong pha này không xảy ra sự tăng về khối lượng và số lượng tế bào. Pha log (pha lũy thừa): ở pha này, sự phân chia và tăng khối lượng tế bào diễn ra với tốc độ lớn nhất (số lượng tế bào tăng theo hàm mũ); Pha ổn định: ở pha này, khả năng phân bào giảm mạnh, số lượng và khối lượng tế bào ổn định. Pha suy vong: sự sinh trưởng của tế bào ra khỏi đỉnh cao, giảm xuống và dần đến ngừng sinh trưởng nếu không được cấy chuyển [12]. - Nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng Đây là một hình thức khác của phương thức nuôi cấy mẻ. Sau khi tế bào nuôi cấy sinh trưởng cực đại, các chất dinh dưỡng sẽ dần cạn kiệt, lúc này người ta sẽ cung cấp thêm các chất dinh dưỡng mới vào hệ lên men mà không loại bỏ dịch nuôi cũ. Trong hệ lên men này, có các bộ phận điều khiển hàm lượng các chất dinh dưỡng được thêm vào giúp hạn chế hay tăng cường tốc độ sinh trưởng hoặc sự tích lũy hợp chất thứ cấp. Tuy nhiên, như vậy thể tích hệ lên men sẽ tăng lên, để hạn chế việc này người ta thường sử dụng dung dịch chất dinh dưỡng dưới dạng đậm đặc. Phương thức này vẫn được gọi là nuôi cấy mẻ, vì toàn bộ thể tích của hệ lên men cuối cùng được thu hồi theo từng mẻ [129]. - Nuôi cấy liên tục Những hạn chế chính của nuôi cấy mẻ đó là tốn thời gian nhiều cho quá trình khử trùng, bổ sung vào và lấy môi trường ra, làm sạch hệ thống lên men [48]. Nuôi cấy liên tục là phương pháp kinh tế vì có thể kéo dài thời gian nuôi cấy hay kéo dài pha log trong một thời gian nhất định. Trong phương thức nuôi cấy này, dòng đi vào (môi trường mới) bằng với dòng đi ra (gồm môi trường, tế bào và các chất chuyển hóa) để giữ cho thể tích bình nuôi không thay đổi, và điều kiện nuôi cấy của hệ thống luôn ổn định [138].
  20. 10 Nhìn chung, các phương thức nuôi cấy có tính truyền thống như nuôi cấy mẻ, nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục trong nuôi cấy vi sinh vật có thể được dùng trong nuôi cấy tế bào thực vật. Về cơ bản, thiết lập một phương thức nuôi cấy tế bào phụ thuộc bởi (1) mối quan hệ giữa sinh trưởng và tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp và (2) khả năng các sản phẩm thứ cấp tiết ra hoặc không tiết ra môi trường [23]. 1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào Trong nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật, cần phải theo dõi chặt chẽ sự sinh trưởng và sức sống của tế bào để tăng hiệu suất nuôi cấy tế bào cũng như cải thiện điều kiện nuôi cấy [12]. Một số chỉ tiêu dùng để đánh giá động học sinh trưởng tế bào thực vật trong nuôi cấy, bao gồm thể tích lắng, thể tích đóng gói, khối lượng tươi và khối lượng khô, mật độ, chỉ số sinh trưởng, thời gian nhân đôi và một số chỉ tiêu khác của tế bào [135]. - Thể tích lắng và thể tích đóng gói của tế bào Thể tích lắng của tế bào được xác định bằng cách cho các huyền phù tế bào trầm tích trong một cái ống có chia vạch và được biểu thị bằng phần trăm thể tích chung của dịch huyền phù, bao gồm cả sinh khối tế bào. Thể tích đóng gói của tế bào được xác định bằng cách tương tự sau khi tế bào được nén chặt bởi quay ly tâm. Hai thông số này cho phép đánh giá nhanh sinh trưởng của tế bào trong khi vẫn duy trì được điều kiện vô trùng mẫu. Các phương pháp này thuận lợi để giám sát sự sinh trưởng của tế bào suốt một chu kỳ nuôi cấy trong các bình tam giác với điều kiện nuôi cấy như nhau, bởi vì dịch huyền phù có thể đưa trở lại các điều kiện nuôi cấy trước đó. Tuy nhiên, dựa vào thể tích tế bào có lẽ không phải là cách chính xác để kiểm tra sinh trưởng vì nó phụ thuộc vào hình thái tế bào [93]. - Khối lượng tươi và khối lượng khô của tế bào Khối lượng tươi và khối lượng khô của tế bào cho phép đánh giá sinh
  21. 11 trưởng của tế bào chính xác hơn các chỉ tiêu về thể tích tế bào. Tuy nhiên, yêu cầu của các thao tác mẫu lại tiến hành trong điều kiện không vô trùng. Việc xác định khối lượng tươi của tế bào ít tốn thời gian hơn khối lượng khô, nhưng nó không phản ánh được sự gia tăng sinh khối thực của tế bào, đặc biệt là cuối giai đoạn nuôi cấy, khi mà hầu hết sự tăng trưởng của tế bào trong nuôi cấy là do sự hấp thu nước [161]. - Mật độ tế bào nuôi cấy Để thu được giá trị tin cậy về số lượng tế bào trong nuôi cấy huyền phù, trước hết các khối tế bào phải được phá vỡ bằng cách ủ dịch huyền phù với dung dịch chromium trioxide 8% hoặc với các enzyme thủy phân như cellulase và pectinase. Phương pháp sử dụng chromium trioxide thì nhanh hơn và ít phức tạp hơn dùng các enzyme thuỷ phân, tuy nhiên nó gây trở ngại trong ước tính các tế bào sống của cùng một mẫu. Phương pháp dùng enzyme duy trì được các tế bào sống và đánh giá về số lượng các tế bào sống trong cùng một mẫu bởi nhuộm màu tế bào có thể thực hiện được [122]. - Chỉ số sinh trưởng Khối lượng tươi và khô của tế bào chỉ cho phép đánh giá sinh khối thuần túy của mô tại thời điểm lấy mẫu, chỉ số sinh trưởng tương quan với dữ liệu sinh khối tại thời điểm lấy mẫu và nuôi cấy ban đầu. Nó được tính toán bằng tỉ lệ sinh khối được tích lũy với sinh khối ban đầu nuôi cấy [93]. - Thời gian tế bào nhân đôi Thời gian nhân đôi là thời gian để lượng sinh khối của một quần thể tế bào đạt gấp hai lần so với ban đầu. Một trong những điểm khác biệt lớn nhất giữa sinh trưởng của tế bào thực vật và tế bào vi sinh vật có liên quan tới tốc độ sinh trưởng riêng của chúng. Mặc dù kiểu sinh trưởng có thể giống nhau, tế bào thực vật có thời gian nhân đôi hoặc tốc độ phân chia đo theo ngày, trong khi đó ở trong nhiều loài vi sinh vật thì xác định theo phút đến giờ. Thời gian nhân đôi
  22. 12 nhanh nhất trong nuôi cấy tế bào thực vật được ghi nhận trong nuôi cấy tế bào cây thuốc lá là 15 giờ [24]. 1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào - Môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào. Trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, các chất dinh dưỡng giảm nhanh, sản phẩm trao đổi chất mới bắt đầu được tích tụ và tăng dần. Ba hợp phần của môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy tế bào thực vật là carbon, nitrogen và phospho. Tuy nhiên, cũng không thể coi nhẹ các hợp phần khác của môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các nguyên tố vi lượng và các chất ĐHST. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất mặc dù nồng độ của chúng có trong môi trường ở mức độ rất thấp [17]. + Các chất ĐHST Nhiều nghiên cứu cho thấy, các chất ĐHST có ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các chất của mô thực vật trong nuôi cấy in vitro cũng như trong cây hoàn chỉnh. Zhao và cs (2001) đã nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D và NAA phối hợp với BAP ở các nồng độ khác nhau lên sinh trưởng và tích lũy jaceosidin của tế bào cây hoa sen tuyết (Saussurea medusa). Kết quả cho thấy, các môi trường có sự phối hợp giữa BAP với 2,4-D thì không thích hợp cho sinh trưởng của tế bào; khi nồng độ 2,4-D gia tăng lên, khả năng sinh trưởng của tế bào giảm đi rõ rệt. Sử dụng các môi trường bổ sung phối hợp giữa BAP với NAA, lượng jaceosidin tích lũy trong tế bào tăng tỷ lệ thuận với sự gia tăng nồng độ của NAA [189]. Mô của cây cà trái vàng (Solanum xanthocarpum) khi nuôi cấy trên môi trường chứa 2,4-D thì có khả năng sản xuất được solasodine, nhưng khi nuôi cấy trên môi trường có chứa IAA hoặc IBA thì không sản xuất được chất này [111]. Năm 1993, khi nghiên cứu sản xuất berberine từ nuôi cấy huyền phù tế bào cây Thalictrum minus, Hara và cs nhận
  23. 13 thấy, môi trường nuôi cấy có bổ sung 2,4-D và NAA không có tác dụng kích thích sản xuất berberine, trong khi đó khả năng sản xuất berberine của tế bào tăng khi sử dụng BAP [56]. + Nguồn carbon Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu dựa theo phương thức dị dưỡng. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật thường được cung cấp dưới dạng carbohydrate. Carbon vừa tham gia tổng hợp các thành phần của tế bào vừa cung cấp năng lượng cho quá trình sinh trưởng và tồn tại của tế bào. Ngoài ra, carbohydrate cũng là nguồn cung cấp carbon cần thiết cho sự hình thành các sản phẩm trung gian thông qua trao đổi chất [191] Trong phần lớn các môi trường nuôi cấy, nguồn carbon được bổ sung chủ yếu là đường sucrose và glucose với nồng độ 20 - 40 g/L. Gautheret (1959) cho rằng đối với phần lớn các mô và tế bào nuôi cấy, đường sucrose và glucose là nguồn carbon tốt nhất, trong một số trường hợp khác, có thể dùng fructose, galactose và maltose (Nguyễn Đức Thành, 2000) [14]. Ảnh hưởng của nồng độ sucrose trong môi trường nuôi cấy đã được nghiên cứu ở nuôi cấy tế bào tam thất (Panax notoginseng). Khối lượng khô của tế bào tăng tỷ lệ thuận với sự gia tăng nồng độ sucrose từ 20 đến 40 g/L, nhưng khi nồng độ sucrose lên đến 60 g/L thì dường như ức chế sự sinh trưởng của tế bào [140]. Theo Gunter và cs (2003), nuôi cấy tế bào cây Silene vulgaris ở các môi trường có nồng độ đường sucrose thấp (dưới 30 g/L), khả năng sinh trưởng và tổng hợp polysaccharide của tế bào không cao. Khi tăng nồng độ sucrose lên dến 30 g/L khả năng tích lũy sinh khối tế bào cũng gia tăng. Môi trường có chứa 30 g/L sucrose hoặc phối hợp giữa đường sucrose (15 g/L) và glucose (15 g/L) là thích hợp nhất cho sinh trưởng của tế bào [50].
  24. 14 - Điều kiện nuôi cấy + Cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu Cỡ mẫu đưa đưa vào nuôi cấy ban đầu rất quan trọng khi cấy chuyển tế bào thực vật, và cũng có thể ảnh hưởng đến sự sản xuất hợp chất trao đổi thứ cấp. Khi lượng mẫu ban đầu thấp hơn lượng mẫu tới hạn thấp nhất thì tế bào thường không sinh trưởng được [78]. Matsubara và cs (1989) trong nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây Coptis japonica đã nhận thấy, khi lượng mẫu đưa vào nuôi cấy cao thì sinh khối tế bào và berberine thu được cũng cao. Lượng mẫu đưa vào nuôi cấy thích hợp nhất cho sinh trưởng và tích lũy berberine của tế bào là 8 g/L, đạt 55 g/L sinh khối và 3,5 g/L berberine sau nuôi cấy [97]. Lượng mẫu nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng tế bào được tìm thấy trong nuôi cấy tế bào cây Gymnema sylvestre. Với lượng mẫu tế bào đưa vào nuôi cấy là 60 g/L thì khả năng sinh trưởng của tế bào là cao nhất, nếu lượng mẫu đưa vào nuôi cấy là 80 hoặc 100 g/L thì sinh trưởng tế bào bị giảm rõ rệt [78]. Kết quả nghiên cứu nuôi cấy ở mật độ cao tế bào của cây tía tô (Perilla frutescens ) để sản xuất anthocyanin cho thấy, lượng mẫu đưa vào nuôi cấy ảnh hưởng đáng kể lên động học của quá trình sinh trưởng và tích lũy anthocyanin của tế bào. Sinh trưởng và tích lũy anthocyanin của tế bào tốt nhất khi nuôi cấy với lượng mẫu nuôi cấy là 50 g/L, sinh khối tế bào đạt 38,3 g/L sau 11 ngày nuôi cấy, và anthocyanin đạt 5,8 g/L sau 10 ngày nuôi cấy; cao gấp 3,3 lần (lượng sinh khối) và 24 lần (lượng anthocyanin) so với nuôi cấy mà lượng mẫu chỉ sử dụng là 15 g/L [191]. + Khuấy trộn Khuấy trộn là điều cần thiết để phân bố đồng đều tế bào, mô, chất dinh dưỡng trong pha lỏng [77]. Việc khuấy trộn thường được thực hiện bằng cách sục khí hoặc dùng cánh khuấy cơ học hoặc kết hợp cả 2 phương pháp trên. Thủy động lực cho việc hòa trộn cần phải nhỏ để không làm hư hại mô hay tế bào nhưng phải đủ để kích thích chức năng của tế bào [116]. Hầu hết các chất dinh dưỡng đều có khả năng hòa tan cao trong nước, do đó trong thời gian lên
  25. 15 men nếu chỉ để phân bố đều môi trường thì sự khuấy trộn không thật cần thiết. Tuy nhiên, đối với oxy hòa tan thì phải có sự khuấy trộn tốt vì khả năng hòa tan của nó trong môi trường lên men là rất kém, trong khi yêu cầu oxy cho sự sinh trưởng của các vi sinh vật hiếu khí (hoặc tế bào thực vật và động vật) lại rất cao [7]. Nghiên cứu của Wang và cs (2010) cho thấy, nuôi cấy tế bào cây Glycyrrhiza inflata trong hệ lên men, với tốc độ khuấy đạt 150 vòng/phút thì sinh khối tế bào đạt cao nhất, trong khi đó với tốc độ khuấy ở 100 và 300 vòng/phút thì sự tích lũy sinh khối tế bào kém hơn [171]. Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế bào cây dầu cọ, Choi và cs (2008) đã khảo sát ở các tốc độ khuấy từ 80 - 335 vòng/phút. Kết quả cho thấy, ở tốc độ khuấy 120 và 225 vòng/phút, sinh khối tế bào tăng 200%; ở tốc độ khuấy 335 vòng/phút sinh khối tế bào chỉ tăng khoảng 7% so với sinh khối tế bào đưa vào nuôi cấy ban đầu [33]. + Sục khí Sục khí trong nuôi cấy tế bào thực vật nhằm đáp ứng ba chức năng chính đó là duy trì điều kiện hiếu khí, giảm hấp thụ các sản phẩm bay hơi và loại bỏ nhiệt sinh ra từ quá trình trao đổi chất. Tốc độ tiêu thụ oxy đặc trưng của tế bào thực vật phụ thuộc vào dòng tế bào, điều kiện nuôi cấy và giai đoạn sinh trưởng, −4 nhưng nhìn chung là khoảng 6 x 10 g O2/g khối lượng khô/phút [72]. Tốc độ hấp thụ oxy phải đủ lớn để cung cấp đầy đủ lượng oxy cần thiết cho nhu cầu hô hấp của tế bào và vì thế nó hỗ trợ cho sinh trưởng tế bào và sản xuất các hợp chất mong muốn, tuy nhiên không nên quá cao bởi vì cả việc cung cấp dư thừa hoặc thiếu oxy đều có thể ức chế sự sinh trưởng và trao đổi chất thứ cấp của tế bào. Để tránh những mặt hạn chế của oxy, hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy phải được giữ trên mức hàm lượng oxy hòa tan tới hạn (thông thường khoảng 15-20% bão hòa không khí) [72].
  26. 16 Lee và cs (2006) nghiên cứu khảo sát sự ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của tế bào cây Gymnema sylvestre trong hệ lên men 2 L. Kết quả cho thấy, trong các tốc độ sục khí khảo sát từ 0,1 đến 0,4 L/L/phút thì tốc độ sục khí 0,1 L/L/phút là thích hợp nhất cho sinh trưởng của tế bào [78]. Thông thường, tốc độ dòng khí thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật nằm trong khoảng 0,1-0,5 L/L/phút [40]. Tuy nhiên, việc tăng dần tốc độ dòng khí phù hợp với tình trạng sinh lý tế bào trong suốt quá trình nuôi cấy có thể có lợi cho sinh trưởng của tế bào. Bằng cách áp dụng kiểu sục khí như vậy (2 ngày đầu nuôi cấy, sục khí tốc độ dòng 0,5 L/phút và sau đó là 1,0 L/phút) trong nuôi cấy tế bào cây hoa hướng dương (Helianthus annuus) Haas và cs (2008) đã nhận thấy, sinh khối tế bào tích lũy cao và đạt đến 15 g/L khối lượng khô [53]. Ảnh hưởng của nồng độ oxy (20,8 - 50%) môi trường nuôi cấy trong hệ lên men lên khả năng sinh trưởng của tế bào Panax ginseng đã được nghiên cứu. Nồng độ oxy 40% thì thích hợp cho tích lũy sinh khối và sản xuất ginsenoside, đạt 12,8 g/L sinh khối khô và 4,5 mg/g ginsenoside. Các nồng độ oxy: 20,8; 30 và 50% thì không thích hợp cho sự sinh trưởng cũng như tích ginsenoside của tế bào nuôi cấy [159]. Véronique và cs (1992) nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ oxy lên sinh trưởng của tế bào cây cà rốt (Daucus carota) trong hệ lên men nhận thấy, nồng độ oxy giảm thì tốc độ sinh trưởng tế bào cũng giảm theo. Kết quả cũng cho thấy, phản ứng của các loại tế bào khác nhau đối với nồng độ oxy cũng khác nhau. Đối với nuôi cấy tạo phôi soma, nồng độ oxy 75% đã ức chế khả năng sinh trưởng của tế bào [166]. 1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn Nhìn chung, nuôi cấy tế bào thực vật lên qui mô lớn là thực hiện quá trình sinh học ở qui mô phòng thí nghiệm lặp lại gần như có thể để sản xuất một lượng lớn hơn các sản phẩm mong muốn. Trình tự của một quá trình nâng cấp điển hình bắt đầu từ nuôi cấy tế bào trong các chai, lọ đến bình tam giác nuôi cấy
  27. 17 lắc có dung tích 1 L, sau đó đến hệ lên men bằng thuỷ tinh từ 1-10 L, và sau đó nâng cấp đến hệ lên men bằng thép không rỉ từ 30-150 L rồi đến 1000 L [181]. Hệ lên men là một hệ thống nuôi cấy tự động mà chức năng chính của nó là cải thiện khả năng kiểm soát môi trường nuôi để đạt được các điều kiện tối ưu cho sinh trưởng của tế bào và/hoặc hình thành sản phẩm. Tế bào thực vật được nuôi cấy trong hệ lên men đầu tiên vào những năm 1960, sử dụng những thiết bị được làm phù hợp cho nuôi cấy tế bào thực vật từ những thiết bị lên men thương mại hoặc không thương mại dùng trong nuôi cấy tế bào động vật [123], [144]. Các nghiên cứu trong hệ lên men là khâu cuối cùng của nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật để thương mại hóa các chất trao đổi thứ cấp. Đây là bước quan trọng vì có nhiều vấn đề có thể phát sinh khi nâng cấp từ nuôi cấy lắc trong các bình tam giác đến nuôi cấy ở các hệ lên men [181]. Hệ lên men hoạt động như một nhà máy sinh học sản xuất các sản phẩm có lượng cao với nhiều ưu điểm như sau: Các sản phẩm được kiểm soát không phụ thuộc vào nguồn thực vật sẵn có; Tăng các dung tích làm việc; Nuôi cấy đồng nhất do có cơ chế khuấy trộn bằng cơ học hoặc sục khí; Kiểm soát tốt hơn môi trường nuôi cấy và điều kiện vật lý vì vậy có thể dễ dàng tối ưu hóa các thông số sinh trưởng như: dinh dưỡng, pH, nhiệt độ trong sản xuất các chất chuyển hóa; Có thể kiểm soát các sản phẩm cuối cùng dưới các điều kiện sinh trưởng; Cải thiện khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng để kích thích tốc độ nhân nhanh và sản xuất hàm lượng cao hơn các hoạt chất sinh học; Thu hồi các tế bào đơn giản và nhanh hơn; Thuận lợi trong các khảo nghiệm về sinh tổng hợp hoặc/và chuyển hóa sinh học có liên quan với sản xuất các chất trao đổi bởi các enzyme sẵn có; Dễ dàng hơn trong phân tách các hợp chất mong muốn bởi tính phức tạp thấp của các dịch chiết; Kiểm soát tốt hơn trong nâng cấp sản xuất trên qui mô lớn [44], [52]. Các hệ lên men được dùng chủ yếu cho nuôi cấy trên qui mô lớn tế bào thực vật để sản xuất sinh khối tế bào hoặc các chất chuyển hóa [181]. Hiệu suất của bất kỳ hệ lên men nào đều tùy thuộc một số khả năng sau: Duy trì nồng độ
  28. 18 sinh khối phải cao; Duy trì điều kiện vô trùng; Phân bố đồng đều dinh dưỡng và các nguyên liệu sống trong nồi lên men thông qua sự khuấy trộn hiệu quả; Tăng hoặc giảm nhiệt tùy vào yêu cầu nuôi cấy; Tạo ra lực trượt vừa phải. Mức độ trượt cao có thể nguy hại cho tế bào nuôi cấy, nhưng lực trượt thấp cũng có thể không mong muốn bởi vì hình thành bọt hoặc bám dính của các khối tế bào lên cánh khuấy và thành của nồi lên men [86]. Có nhiều kiểu của hệ lên men đã được dùng trong nuôi cấy tế bào thực vật. Các hệ lên men có tính truyền thống như các hệ lên men khuấy trộn bằng cánh khuấy, airlift reactors và sủi bọt khí dạng cột sử dụng trong nuôi cấy in vitro tế bào thực vật đã được phiên bản từ các hệ lên men dùng trong công nghệ sinh học vi sinh vật [48]. Những nổ lực thiết kế hệ lên men dành riêng cho nuôi cấy tế bào thực vật được thực hiện vào cuối những năm 1970. Với sự nhận thức sâu về tính mẫn cảm của các tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro với lực trượt, vì vậy trong hơn một thập niên, chỉ có dạng hệ lên men airlift được xem là thích hợp cho nuôi cấy tế bào thực vật [165]. Tuy nhiên, đã có nhiều nghiên cứu tiến hành nuôi cấy tế bào thực vật trong hệ lên men khuấy trộn bằng cánh khuấy. Ritterhaus và cs (1990) đã sử dụng các hệ lên men khuấy trộn bằng cánh khuấy với dung tích 75, 750, 7.500, 15.000 và 75.000 L để nuôi cấy tế bào cây Echinacea purpurea, Rauwolfia serpentina và một số thực vật khác trên qui mô lớn [133]. Wang và Zhong (1996) đã phát triển một loại hệ lên men mới dùng nuôi cấy in vitro thực vật mẫn cảm với lực trượt đó là hệ lên men khuấy trộn bằng cánh khuấy ly tâm (CIB) [172]. Zhang và Zhong (2002) cũng đã dùng hệ lên men CIB (3 L) để nuôi cấy huyền phù tế bào cây tam thất, với tốc độ khuấy 145 vòng/phút, sinh khối tế bào tích lũy đạt 22 g/L [186]. Hơn nữa, các tác giả này cũng đã nuôi cấy thành công tế bào cây P. notoginseng khi nâng cấp dung tích hệ lên men này lên đến 30 L, sự tích luỹ sinh khối đạt trên 25 g/L, sản lượng saponin và polysaccharide cũng cao hơn (1,7 so với 1,5 g/L và 2,9 so với 2,7 g/L). Từ các nghiên cứu này, Zhang và Zhong (2002) cho rằng, hệ lên men CIB
  29. 19 có tiềm năng lớn trong sản xuất sinh khối tế bào để chiết tách các chất mong muốn trên qui mô lớn [186]. Năm 2007, Prakash và Srivastava cũng đã nuôi cấy thành công tế bào cây Azadirachta indica để sản xuất sinh khối và azadirachtin trong hệ lên men CIB và nhận thấy, hệ men lên men này tạo ra lực trượt thấp và khả năng trao đổi oxy cũng được cải thiện [125]. 1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT NUÔI CẤY IN VITRO 1.2.1. Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật Ở thực vật, có nhiều loại hợp chất hữu cơ hoặc các chất chuyển hóa được tạo ra trong quá trình trao đổi chất. Những chất chuyển hóa này được xếp thành nhóm các chất trao đổi sơ cấp và thứ cấp. Các hợp chất thứ cấp tìm thấy chỉ trong một số loài thực vật hoặc trong nhóm loài có liên quan nhau, trong khi đó các hợp chất sơ cấp được tìm thấy trong hầu hết các loài [153]. Trong vài thập kỷ qua, những bằng chứng từ thực nghiệm và thực tế cho thấy, các hợp chất thứ cấp ở thực vật có các chức năng cơ bản sau: Bảo vệ cơ thể chống lại các loài động vật ăn cỏ; Kháng nấm, vi khuẩn, virus; Chống lại sự canh tranh về ánh sáng, nước và chất dinh dưỡng; Thu hút các loài động vật trong quá trình thụ phấn và phát tán hạt; Tạo ra các tín hiệu trong giao tiếp giữa thực vật với các loài vi sinh vật cộng sinh; Chống lại tia tử ngoại và các tác nhân vật lý bất lợi khác [177]. Arnason và cs (1995) đã công bố thực vật sản xuất hơn 80.000 hợp chất khác nhau thông qua con đường trao đổi thứ cấp. Các sản phẩm thứ cấp được dự trữ chủ yếu trong các cấu trúc đặc biệt hoặc các cơ quan dự trữ như rễ, các tế bào dự trữ, không bào, hệ thống màng [19]. Các hợp chất hóa học này được dùng trong dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, thuốc nhuộm, gia vị, chất tạo mùi, thuốc trừ sâu; chúng đã đóng góp nhiều tỷ đô la trong sản xuất công nghiệp [47]. 1.2.2. Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật Các hợp chất thứ cấp của thực vật có thể phân thành ba nhóm chính đó là terpene, phenol và các hợp chất chứa nitrogen.
  30. 20 1.2.2.1. Nhóm terpene Terpene, terpenoid hoặc isoprenoid là các dimer, trimer hoặc polymer của các đơn vị isoprene. Các đơn vị isoprene thường liên kết để hình thành nên các hợp chất mạch thẳng hoặc mạch vòng phổ biến với 10 carbon (monoterpenoid), 15 carbon (sesquiterpenoid), 20 carbon (diterpenoid) hoặc 30 carbon (triterpenoid) và rất hiếm dạng terpenoid được tìm thấy với 25 carbon [153]. Các monoterpene được tìm thấy rộng rãi trong tinh dầu thực vật, ví dụ như menthol, borneol, linalool Chúng được sử dụng như là các chất kháng côn trùng và các chất có hoạt tính dược lý như giảm đau và kháng viêm. Sesquiterpene là thành phần của tinh dầu ở nhiều loài thực vật, những hợp chất này có hoạt tính như kháng khuẩn, kháng nấm, diệt trừ giun sán, chống sốt rét [51]. Diterpennoid được tìm thấy trong nhiều loài thực vật và động vật. Một số chất của chúng được ứng dụng trong điều trị bệnh, chẳng hạn như taxol và các dẫn xuất của chúng được dùng làm thuốc điều trị ung thư, forskolin chống tăng huyết áp. Triterpene là hợp chất terpene chứa 30 carbon, chúng cũng được sử dụng nhiều trong dược phẩm [51]. 1.2.2.2. Nhóm phenol Tất cả các hợp chất nhóm phenol có một vòng thơm gắn với các nhóm chức như hydroxyl, methoxy và các cấu trúc vòng không thơm khác. Chúng có cấu trúc từ đơn giản với một vòng thơm cho đến các polymer phức tạp như tannin, lignin. Các hợp chất phenol được tổng hợp bằng con đường shikimate hoặc con đường acetate. Chúng có hoạt tính dược lý phổ rộng như kháng viêm, giảm đau, kháng khối u, kháng virus HIV, kháng vi sinh vật, chống oxy hóa, chống loét, bảo vệ gan [51], [177]. 1.2.2.3. Các hợp chất chứa nitrogen Phần lớn các hợp chất thứ cấp của thực vật đều có chứa nitrogen trong cấu trúc của chúng. Các hợp chất này được biết đến như là các hợp chất chống lại các động vật ăn cỏ như alkaloid và cyanogenic glycoside. Chúng
  31. 21 được quan tâm nhiều bởi tính độc đối với con người và các thành phần dược chất của chúng [153]. Các alkaloid có dạng tinh thể, có hoạt tính sinh lý trên tất cả các động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Alkaloid thường độc với liều lượng lớn nhưng với liều lượng nhỏ, chúng được sử dụng làm thuốc chữa bệnh [104]. Các cyanogenic glycoside là vũ khí bảo vệ của thực vật. Chúng không độc cho chính bản thân thực vật mà sẵn sàng hình thành các phân tử bay hơi có tính độc khi thực vật bị đe doạ. Một số chất trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi thực phẩm và dược phẩm [79]. 1.2.3. Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật 1.2.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước Nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy đã được tiến hành bởi các nhà khoa học thực vật và vi sinh vật ở nhiều quốc gia. Hầu hết các ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong công nghệ sinh học đều nhằm vào mục đích sản xuất các hợp chất thứ cấp và gần đây là sản xuất các chất điều trị ung thư quan trọng như taxol, vinblastine và vincristine [113]. Những thành tựu đạt được trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất dùng để chữa bệnh đã tạo ra khả năng có thể sản xuất trên qui mô lớn các chất alkaloid, terpenoid, steroid, saponin, phenol, flavonoid và các amino acid [167]. Taxol là một trong những tác nhân kháng ung thư triển vọng nhất được biết đến bởi dạng hoạt động độc nhất của nó trên hệ thống vi tế bào hình ống [113]. Hiện nay, sản xuất taxol nhờ nuôi cấy tế bào của các loài Taxus đã trở thành một trong những ứng dụng rộng rãi trong nuôi cấy tế bào thực vật và đang làm chủ các giá trị thương mại to lớn của taxol, một chất chỉ có dạng vết trong cây thủy tùng và tổng hợp hóa học rất đắt tiền [65]. Christen và cs (1989) công bố đầu tiên về sản xuất taxol (paclitaxel) bởi nuôi cấy tế bào Taxus [34]. Fett-Neto và cs (1995)
  32. 22 đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và các yếu tố khác lên sản xuất trong nuôi cấy tế bào, kết quả sản xuất paclitaxel đạt 0,02% khối lượng khô [41]. Kim và cs (1995) cũng đã tạo ra paclitaxel trong nuôi cấy tế bào cây Taxus brevifolia sau 10 ngày trên môi trường tối ưu chứa 6% fructose [74]. Bên cạnh sự tích lũy paclitaxel, một số toxoid cũng đã được tìm thấy cả trong tế bào và môi trường nuôi cấy tế bào Taxus [71]. Parc và cs (2002) đã sản xuất toxoid bằng nuôi cấy callus của các cây Taxus được chọn lọc [121]. Để tăng sản xuất toxoid, bổ sung các amino acids vào môi trường nuôi cấy cũng đã được khảo sát, kết quả cho thấy, phenylalanine đã tăng sản xuất taxol tối đa trong nuôi cấy tế bào cây T. cuspidata [92]. Từ xưa, rễ của cây nhân sâm đã được sử dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quí giá [148]. Ginseng đã được biết đến như là nhân tố kỳ diệu để tăng cường sức khoẻ và kéo dài tuổi thọ. Thành phần hoạt chất chính có trong nhân sâm được xác định là ginsenoside, thuộc nhóm saponin triterpenoid [167]. Furuya (1988) đã nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường và ĐHST để tăng lượng ginsenoside [45]. Nuôi cấy tế bào cây nhân sâm trên quy mô lớn đã được Yasuda và cs (1972) công bố [180]. Sau đó, quy trình nuôi cấy ở quy mô công nghiệp đã được công ty Nitto Denko (Ibaraki, Osaka, Nhật Bản) thực hiện trong hệ lên men có cánh khuấy với dung tích 2000 và 20.000 L, năng suất ginsenoside đạt được là 500-700 mg/L/ngày [60]. Quy trình này được xem như là một bước ngoặc quan trọng trong thương mại hóa nuôi cấy mô và tế bào ở quy mô lớn. Wang và Zhong (2002) nhận thấy bổ sung methyljasmonate hoặc dihydro-methyl jasmonate vào môi trường nuôi cấy đã tăng khả năng hiệu suất ginsenoside của tế bào cây nhân sâm [173]. Nuôi cấy rễ được gây nhiễm Agrobacterium rhizogenes đã được tiến hành và hiệu suất ginsenoside đạt được cao hơn 3 lần so với nuôi cấy loại callus tạo từ rễ bình thường [60]. Các kết quả nghiên cứu này cho thấy, nuôi cấy tế bào cây nhân sâm vẫn là lĩnh vực thu hút nhằm thương mại hóa trên thế giới và là tiềm năng to lớn cho công nghiệp hóa sinh [138].
  33. 23 L-DOPA là một tiền chất của các alkaloid, betalain và melanine; được tách chiết từ các cây Vinca faba, Mucuna, Baptisia và Lupinus [148]. Nó còn là một tiền chất của catecholamine ở động vật và được sử dụng như là một loại thuốc tiềm năng cho điều trị bệnh Parkinson [62]. L-DOPA được dùng rộng rãi trong điều trị bệnh nên có nhu cầu lớn và giá thành cao, chính vì thế nuôi cấy tế bào được xem như là phương thức thay thế để sản xuất L-DOPA nhiều hơn [26]. Teramoto và Komamine (1988) đã tạo callus của cây Mucuna hassjoo, M. pruriense, M. deeringia và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ cao nhất của L-DOPA thu được khi nuôi cấy tế bào của cây M. hassjoo trên môi trường MS bổ sung 0,025 mg/L 2,4-D và 10 mg/L kinetin [156]. Hàm lượng L-DOPA trong tế bào nuôi cấy đạt khoảng 80 mmol/g khối lượng tươi cũng đã được Vanisree và cs (2004) công bố [162]. Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong rễ của cây Coptis japonica và trong vỏ của cây Phellondendron amurense. Bằng cách chọn dòng có năng suất cao, nhóm nghiên cứu của Mitsui và cs đã tạo ra berberine trên quy mô lớn với năng suất 1,4 g/L sau hơn 2 tuần nuôi cấy [167]. Với việc sử dụng chất kích kháng polysaccharide của nấm men, Sarin (2005) đã thành công trong việc sản xuất với mức tương đối cao của berberine trong nuôi cấy tế bào cây T. rugosum [138]. Ảnh hưởng của permidine lên sản xuất berberine trong nuôi cấy tế bào cây T. minus cũng đã được công bố bởi Hara và cs (1991) [57]. Diosgenin là tiền chất cho tổng hợp hóa học của thuốc steroidal và cực kỳ quan trọng trong công nghiệp dược phẩm [39]. Tal và cs (1983) đã nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào cây D. deltoidea. Họ nhận thấy rằng hàm lượng carbon và nitrogen ảnh hưởng lớn đến sự tích lũy diosgenin trong một dòng tế bào nuôi cấy [154]. Ishida (1988) nhận thấy sản xuất diosgenin được kích thích khi tiến hành nuôi cấy cố định tế bào cây D. deltoidea, với sản lượng tăng 25%. Kaul và cs (1969) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên sản xuất diosgenin trong nuôi cấy callus và huyền phù tế bào cây D. deltoidea [70]
  34. 24 Campothecin là một alkaloid kháng ung thư tiềm năng có trong cây Camptotheca acuminate (Padmanabha, 2006). Sakato và Misawa (1974) đã nghiên cứu tạo callus của cây C. acuminata trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/L 2,4-D và l mg/L kinetin và nuôi cấy lỏng với sự có mặt của gibberellin và L-tryptophan; hàm lượng camptothecin thu được khoảng 0,0025% khối lượng khô [136]. Nghiên cứu của Thengane và cs (2003) cho thấy, khi nuôi cấy tế bào cây C. acuminata trên môi trường MS có bổ sung 4 mg/L NAA thì sự tích lũy camptothecin đạt được là 0,998 mg/L [160]. Vincristine và vinblastine là các indole alkaloid nhị trùng ngưng đã trở thành thuốc có giá trị trong hóa trị liệu ung thư bởi hoạt tính kháng ung thư tiềm năng của chúng chống lại nhiều khối u rắn và bạch cầu. Những hợp chất này chiết tách thương mại từ số lượng lớn của cây dừa cạn. Do hàm lượng vincristine và vinblastine chứa trong cây thấp (0,0005%), vì vậy nuôi cấy tế bào đã được nghiên cứu như một sự thay thế cho sản xuất một lượng lớn các alkaloid này [113]. Vinblastine hợp thành từ catharanthine và vindoline. Vì vindoline có nhiều catharanthin trong cây hoàn chỉnh nên nó ít đắt tiền hơn [20]. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiều hợp chất như vanadyl sulphate, abscisic acid và sodium chloride lên sản xuất catharanthin cũng đã được công bố bởi Smith và cs (1987) [146]. Ảnh hưởng của nhiều yếu tố như stress, bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, các chất kích kháng và các tiền chất tổng hợp lên sản xuất indole alkaloid cũng đã được Zhao và cs (2001a; 2001b) công bố [189], [190]. Các chất tanshinone thuộc nhóm quinoid diterpenoid được cho là những chất có hoạt tính của cây Salvia miltiorrhiza, chúng được dùng làm dược liệu truyền thống của Trung Quốc [174]. Nakanishi và cs (1983) đã thiết lập được một dòng tế bào có chứa một lượng lớn cryptotanshinone từ cây S. miltiorrhiza [110]. Shimomura và cs (1991) nghiên cứu nuôi cấy rễ bất định cây S. miltiorrhiza và khảo nghiệm các điều kiện nuôi cấy cho hiệu suất tanshinone cao [141]. Sản xuất diterpenoid ở rễ tơ của cây S. miltiorrhiza cũng đã được Hu và Alfermann (1993) nghiên cứu [61].
  35. 25 Podophyllotoxin là nguyên liệu khởi đầu cho việc điều chế các dẫn xuất bán tổng hợp như toposide, teniposide và được dùng rộng rãi trong điều trị kháng khối u [31]. Các cây Podophyllum peltatum và Podophyllum hexandrum sinh trưởng rất chậm, việc thu hồi podophyllotoxin từ tự nhiên cũng gặp khó khăn. Do đó, những hạn chế trong việc cung cấp podophyllotoxin từ tự nhiên cần phải được khắc phục [117]. Nuôi cấy tế bào cây P. peltatum để sản xuất podophyllotoxin được nghiên cứu đầu tiên bởi Kadkade (1982) [69]. Để tăng sản lượng của podophyllotxin, Woerdenberg và cs (1990) đã sử dụng phức chất conifery1 alcohol và b-cyclodextrin để nuôi cấy huyền phù tế bào cây P. hexandrum [178]. 1.2.3.2. Những nghiên cứu trong nước Ở nước ta, công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật phát triển vào những năm 1970 và đến nay đã đạt được một số thành công. Một trong những kết quả nuôi cấy tế bào thành công nhất đó là nuôi cấy tế bào cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis). Sâm Ngọc Linh có tác dụng phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan, kích thích hệ miễn dịch, chống stress và trầm cảm, chống oxy hóa, lão hóa. Hiện nay, loài cây này bị khai thác cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng [157]. Thanh và cs (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường lên sản xuất sinh khối và ginsenoside trong nuôi cây huyền phù tế bào cây sâm Ngọc Linh. Kết quả cho thấy, môi trường ½MS và MS thích hợp cho cả sản xuất sinh khối cũng như ginsenoside, sinh khối và ginsenoside đạt lần lượt là 9,8 g/L và 6,81 mg/g khối lượng khô. Nồng độ sucrose tăng từ 20-50 g/L đã tăng sản xuất sinh khối, tuy nhiên khi sucrose tăng đến 70 g/L thì ức chế cả sinh trưởng và tích lũy ginsenoside của tế bào. Nồng độ nitrogen thích hợp cho cả sinh trưởng và tích lũy ginsenoside là 30 mM [157]. Nghiên cứu của Thanh và cs (2008) cũng cho thấy, NH4NO3 nồng độ 0,5 g/L cho sinh khối lớn nhất và hàm lượng ginsenoside đạt cao nhất là 6,5 mg/g khối lượng khô. Nồng độ 1,0 g/L của KNO3 thích hợp cho sinh trưởng tế bào nhưng ginsenoside thu được lớn nhất (6,1 mg/g
  36. 26 khối lượng khô) lại ở nồng độ 2,0 g/L KNO3. Nghiên cứu còn cho thấy, sinh trưởng cũng như hàm lượng ginsenoside của tế bào tăng đáng kể khi bổ sung CaCl2 vào môi trường nuôi cấy [158]. Nghiên cứu sản xuất taxol từ các hệ thống tế bào in vitro cũng đã và đang được quan tâm bởi các nhà khoa học trong nước. Lê Thị Thuỷ Tiên và cs ( 2006) đã nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây thông đỏ (Taxus wallichiana). Callus hình thành và sinh trưởng tốt trên môi trường B5 có bổ sung auxin và cytokinin. Môi trường có 4 mg/L 2,4-D và 1 mg/L kinetin thích hợp cho sự hình thành và sinh trưởng callus từ thân non. Callus từ lá non sinh trưởng tốt trên môi trường có 3 mg/L NAA và 0,25 mg/L kinetin. Nuôi cấy tế bào được thiết lập trên môi trường lỏng có cùng thành phần với môi trường nuôi cấy callus; phân tích cho thấy, có sự hiện diện của taxol trong callus và huyền phù tế bào, và không tìm thấy taxol trong môi trường nuôi cấy [16]. Ảnh hưởng của các nguồn carbon lên sinh trưởng của tế bào cây thông đỏ đã được Nhut và cs (2006) nghiên cứu. Kết quả cho thấy, môi trường nuôi cấy có bổ sung 30g/L glucose và 30 g/L fructose là thích hợp nhất cho sinh trưởng của tế bào [112]. Dương Tấn Nhựt và cs (2007) cũng đã nghiên cứu thiết lập điều kiện nuôi cấy tế bào cây thông đỏ và tái sinh callus từ tế bào dịch huyền phù. Các tế bào và callus thu nhận được có thể sử dụng để nhân, định lượng và tách chiết taxoid [11]. Cà gai leo (Solanum hainanense) là một cây thuốc quý, rễ của chúng thường được dùng làm thuốc chữa các bệnh phong thấp, đau nhức xương, ho [4]. Rễ cây cà gai leo là nơi tích lũy chủ yếu glycoalkaloid, tuy nhiên chúng có hàm lượng thấp và phụ thuộc nhiều vào nguồn nguyên liệu tự nhiên [15]. Lê Thị Hà Thanh và cs (2009) đã nghiên cứu sản xuất glycoalkaloid từ tế bào cây cà gai leo. Kết quả cho thấy, môi trường MS rắn có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D thích hợp nhất để tạo callus. Huyền phù tế bào cà gai leo sinh trưởng tốt nhất trên môi trường MS có 40 g/L sucrose; 1,0 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D, với tốc độ lắc 150 vòng/phút. Hàm lượng glycoalkaloid
  37. 27 toàn phần tích lũy cao nhất trong tế bào sau 4 tuần nuôi cấy đạt 48,41 mg/g khối lượng khô, cao gấp 5,9 lần hàm lượng glycoalkaloid trong rễ cây cà gai leo tự nhiên 1 năm tuổi [13]. Loc và cs (2010) cũng đã khảo sát sự tích lũy glycoalkaloid trong nuôi cấy callus của cây cà gai leo [88]. Cây rau má (Centella asiatica) là loài dược thảo có chứa asiaticoside và madecassoside. Asiaticoside có hoạt tính chống oxy hóa, chữa bỏng, bảo vệ tế bào thần kinh và sinh tổng hợp collagen [9]. Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2008) đã nghiên cứu tạo callus và khảo sát khả năng tích lũy asiaticoside trong callus cây rau má. Kết quả cho thấy, môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L NAA và 2,0 mg/L BAP thích hợp nhất để cảm ứng tạo callus; môi trường có 1,5 mg/L NAA và 0,5 mg/L kinetin kích thích callus sinh trưởng mạnh. Hàm lượng asiaticoside tích lũy cao nhất trong callus là 3,12 mg/g tương đương với 0,31% khối lượng khô [8]. Thiết lập nuôi cấy huyền phù tế bào cây rau má và khảo sát sự tích lũy asiaticoside trong tế bào nuôi cấy cũng đã được nghiên cứu Loc và An (2010) nghiên cứu [87]. Cây dừa cạn là một trong những loài cây dược liệu chứa nhiều alkaloid, diển hình là các chất chữa ung thư rất tốt như vincristine và vinblastine. Bùi Văn Lệ và Nguyễn Ngọc Hồng (2006) đã nghiên cứu sinh trưởng và tích lũy alkaloid toàn phần của tế bào cây dừa cạn. Kết quả cho thấy, trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L NAA và 0,5 mg/L Kin, sinh khối tế bào và alkaloid toàn phần đạt cao nhất; nồng độ sucrose 60 g/L tối ưu cho sự tích lũy alkaloid toàn phần. Khi kết hợp nồng độ chất ĐHST tối ưu. Các tác giả đã thu được lượng vincristin cao trong tế bào khi nuôi cấy trên môi trường có 1 mg/L NAA; 0,5 mg/L Kin và 60 g/L sucrose, trong khí đó lá của cây dừa cạn tự nhiên không tìm thấy loại alkaloid này [5]. Cây đinh lăng (Polyscias fruticosa) là một loài thực vật chứa nhiều saponin. Phạm Thị Tố Liên và Võ Thị Bạch Mai (2007) đã tạo callus từ các mẫu cây con trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L 2,4-D. Callus tạo thành sau 14 tuần được chuyển sang nuôi cấy trên môi trường lỏng bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D và 20% nước dừa để thu sinh khối và chiết rút saponin [6].
  38. 28 Như vậy, nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp ở nước ta cũng có được một số kết quả nhất định. Tuy nhiên, những nghiên cứu nói trên vẫn còn ở quy mô phòng thí nghiệm. Phát triển các kỹ thuật nuôi cấy trong các hệ lên men ở quy mô công nghiệp để sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học vẫn còn là một con đường đầy tiềm năng chưa được khai phá hết của nền công nghệ nuôi cấy tế bào của Việt Nam. 1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN 1.3.2. Thành phần hóa học Nghệ đen là loài cây thảo dược không độc, chứa nhiều các hợp chất hóa học có giá trị dược liệu cao. Nhiều nghiên cứu đã công bố về thành phần hóa học của cây nghệ đen. Từ năm 1928, Rao và cs đã khảo sát sơ bộ thành phần hóa học tinh dầu từ thân rễ của nghệ đen và tìm thấy các hợp chất như -pinen, camphen, cineol, camphor và borneol bên cạnh các sesquiterpene, tuy nhiên không phân lập và xác định được một sesquiterpene nào [131]. Shiobara và cs (1985) đã tách chiết từ củ nghệ đen được 3 loại sesquiterpenoid đó là curcumeone, curcumanolide-A, curcumanolide-B [143]. Xingyi (1999) đã nghiên cứu cho thấy, tinh dầu nghệ đen có chứa 37 thành phần khác nhau, trong đó chủ yếu là curzerenone, curcumenol, b-elemene, isocurcumenol [179]. Singh và cs (2002) đã khảo sát thành phần tinh dầu của một số loài nghệ của Ấn Độ cho thấy, nó có chứa các thành phần chính như: 1,8 cineol, cymene, α-phellandrene (14,9%) [145]. Mau và cs (2003) đã xác định được 36 hợp chất từ nghệ đen gồm 17 terpenes, 13 alcohol, và 6 ketones [100]. Garg và cs (2005) đã nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu từ lá cây nghệ đen Ấn Độ. Kết quả cho thấy, tinh dầu có chứa 23 hợp chất khác nhau [46]. Makabe và cs (2006) đã xác định được hơn 10 loại sesquiterpene từ củ nghệ đen [94]. Champakaew và cs (2007) phân tích tinh dầu bay hơi của củ nghệ đen nhận thấy, thành phần chính của tinh dầu bao gồm β-tumerone, 1,8-cineole và 7- zingiberene [28].
  39. 29 Bên cạnh các nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu nghệ đen, các nghiên cứu về thành phần hợp chất màu vàng có trong nghệ đen cũng đã được tiến hành. Syu và cs (1998) đã nghiên cứu nhận thấy dịch chiết ethanol của củ nghệ đen có chứa curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin [152]. Paramapojn và Gritsanapan (2007) đã nghiên cứu về thành phần curcuminoid trong củ nghệ đen ở các vùng sinh thái khác nhau của Thái Lan. Kết quả cho thấy, hàm lượng curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin lần luợt từ 1,46% đến 5,73% w/w (trung bình 2,73% w/w); từ 3,15% đến 10,98% w/w (trung bình 7,37%) và từ 0,49% đến 2,99% w/w (trung bình 1,40% w/w) [119]. Ở nước ta, khảo sát thành phần hóa học của nghệ đen cũng đang rất được quan tâm. Tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đánh giá thành phần hóa học của tinh dầu nghệ đen trồng ở các vùng khác nhau. Phan Minh Giang và cs (1997) đã công bố thành phần chính trong tinh dầu thân rễ nghệ đen ở Sóc Sơn (Hà Nội) là zurumbon (chiếm 79,08%) [2]. Lê Quý Bảo và cs (2004) đã công bố thành phần tinh dầu trong thân rễ nghệ đen ở Đô Lương (Nghệ An) và Hương Sơn (Hà Tĩnh) [1]. Trần Thị Việt Hoa và cs (2007) đã nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu củ nghệ đen trồng ở Đà Lạt được trích ly theo phương pháp gia nhiệt thông thường và phương pháp gia nhiệt bằng lò vi sóng. Kết quả nghiên cứu cũng đã chỉ ra sự khác biệt lớn về thành phần sesquiterpene của nghệ đen ở Việt Nam và các nước khác [3]. Tóm lại, nghệ đen là cây thảo dược có chứa các nhóm chất như tinh dầu bao gồm các chất thuộc sesquiterpene và monosesquiterpene; curcuminoid bao gồm: curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin. Ngoài ra, nghệ đen còn chứa các chất như tinh bột, chất dẻo và một số chất có vị đắng khác như tannin và flavonoiod [82].
  40. 30 1.3.3. Công dụng Ngoài nghệ vàng, loài cây được nghiên cứu liên tục và được xem là loại thảo dược tiềm năng có nhiều hoạt chất sinh học, nghệ đen cũng đang được quan tâm ngày càng nhiều nhờ các hoạt chất mới được xác định từ nó [32]. 1.3.3.1. Công dụng cổ truyền Cây nghệ đen được trồng rộng rãi dùng làm rau hoặc đồ gia vị ở các quốc gia Đông, Nam và Đông Nam Á bao gồm Trung Quốc, Việt Nam, Ấn Độ, Nhật Bản và Thái Lan [137], [58]. Từ lâu, nghệ đen đã được con người dùng trong bài thuốc Đông y cổ truyền để chữa bệnh. Nghệ đen có trong Dược điển XIII của người Nhật Bản và sử dụng trong thuốc cổ truyền của người Trung Quốc. Nghệ đen đã từng được kê trong các đơn thuốc dùng để chữa bệnh dạ dày, điều kinh, điều trị hội chứng “Oketsu” gây ra do tắt ngẽn mạch máu và cải thiện kinh nguyệt trong nhiều dạng thuốc pha chế khác nhau [98], [99], [182]. Từ lâu ở Thái Lan, nghệ đen đã được dùng để làm dịu cơn đau dạ dày, chống tiêu chảy, chống nôn mửa và sốt. Nó cũng được dùng ngoài da như chất làm se các vết thương [137]. Người Ấn Độ đã dùng củ nghệ đen để trị chứng viêm da, bong gân, ung nhọt và vết thương. Củ nghệ đen giàu tinh bột, được dùng như là nguồn thay thế cho tinh bột của cây hoàng tinh, lúa mạch và được chú ý dùng làm thực phẩm cho trẻ sơ sinh, người đang dưỡng bệnh. Bột màu đỏ gọi là “Abir” làm từ củ nghệ đen khô xử lý với nước sắc cây tô mộc được dùng trong nghi lễ tôn giáo Hindu. Nó cũng được dùng để sản xuất rượi, nhiều loại nước hoa, mỹ phẩm và các loại hương liệu khác [36]. Ngoài ra, củ nghệ đen còn được dùng để chữa giun sán ở trẻ em; bột nghệ dùng để chống dị ứng; lá nghệ có tác dụng chữa bệnh phù [108], phong hủi [68]. 1.3.3.2. Các hoạt tính sinh học - Hoạt tính giảm đau Shin và cs (1994) khảo sát hoạt tính dược lý của 2 sesquiterpene:
  41. 31 cuzerenone (I) và curcumenol (II) từ củ nghệ đen. Kết quả cho thấy, cả hai chất này đều thể hiện hoạt tính giảm đau tương đối. Nghiên cứu khác cũng cho thấy, hợp chất curcumenol có tác dụng giảm đau cao gấp mấy lần so với các loại thuốc giảm đau thông thường. Dịch chiết dichloromethane từ củ nghệ đen thu được trong mùa thu và mùa đông đều có tác dụng ức chế sự co thắt ở bụng [142]. - Hoạt tính kháng ung thư Nghiên cứu của Hong và cs (2002) cho thấy, dịch chiết nghệ đen có hoạt tính chống ung thư và kháng viêm [58]. Dịch chiết bằng nước của củ nghệ có hoạt tính chống lại di căn phổi của các tế bào khối u ác tính B16 [139]. Priosoeryanto và cs (2001) nghiên cứu khả năng ức chế sinh trưởng các dòng tế bào ung thư của dịch chiết ethanol và chloroform củ nghệ đen nhận thấy, dịch chiết chloroform đã ức chế sinh trưởng tế bào myeloma và tế bào carcinoma; dịch chiết ethanol ức chế sinh trưởng tế bào myeloma và tế bào carcinoma [126]. Syu và cs (1998) nghiên cứu nhận thấy các curcuminoid có hoạt tính chống các tế bào ung thư buồng trứng OVCAR-3 ở người [152]. Jang và cs (1997); Hanif và cs (1997) cũng đã nhận thấy, các curcuminoid phân lập từ nghệ đen có khả năng ức chế sinh trưởng khối u và gây độc cho các dòng tế bào ung thư ruột kết và ung thư biểu mô gan ở người. Moon và cs (1985) đã nghiên cứu hoạt tính kháng khối u của polysaccharide nghệ đen. Kết quả cho thấy, polysaccharide ức chế dòng tế bào ung thư sarcoma 180 với tỷ lệ là 61,1% [105]. Theo Kim và Kim (2000), polysaccharide nghệ đen làm giảm kích thước khối u trên chuột đã được cấy tế bào sacrom 180 với tỷ lệ 52% và ngăn chặn đột biến nhiễm sắc thể [75]. Wang và cs (2004) đã thử hoạt tính kích thích miễn dịch, chống oxy hóa và ung thư trên chuột của polysaccharide nghệ đen. Kết quả nghiên cứu cho thấy, polysaccharide có hoạt tính kháng ung thư, oxy hóa và tăng cường miễn dịch [170]. Lee và cs (2002) nghiên cứu ảnh hưởng của một số sesquitertene phân lập từ các cây họ Gừng lên hoạt tính của các enzyme: cyclooxygenase (COX-2) và
  42. 32 nitric oxide synthase (iNOS) trong nuôi cấy đại thực bào chuột được kích hoạt bởi lipopolysaccharide. Các sesquiterpenoid của nghệ đen có khả năng ức chế mạnh hoạt tính các enzyme: cyclooxygenase và nitric oxide synthase. Các tác giả này cũng cho rằng, các sesquiterpene phân lập từ nghệ đen có thể phát triển thành các chất ức chế COX-2 và iNOS, sản xuất các tác nhân phòng ngừa ung thư và kháng viêm [80]. Carvalho và cs (2010) nghiên cứu nhận thấy có sự tăng đáng kể lượng tế bào hồng cầu và bạch cầu tổng số; giảm số tế bào màng bụng và kích thước khối u trên chuột được tiêm dịch chiết của nghệ đen so với đối chứng [27]. - Hoạt tính bảo vệ gan Matsuda và cs (1998) đã nhận thấy dịch chiết acetone-nước của củ nghệ đen có hoạt tính bảo vệ gan. Các sesquiterpene và curcumin bảo vệ chống lại sự hình thành D-galactosamine/lipopolysaccharide, giảm tổn thương gan ở chuột [99]. Kết quả nghiên cứu của Kim và cs (2005) cho thấy, nghệ đen thể sử dụng như thuốc tiềm năng cho điều trị chứng xơ gan mãn tính [73]. - Hoạt tính kháng loét Nghệ đen được sử dụng như là phương thuốc chủ yếu trong việc điều trị các chỗ loét trong hệ tiêu hóa. Tác động của bột rễ nghệ đen lên dịch dạ dày, pH dạ dày, acid tự do và acid tổng số trong hệ thống tiêu hóa của chuột đã được nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu của Raghuveer và cs (2003) cho thấy, dịch chiết nghệ đen có khả năng chống lại tình trạng tiết nhiều acid và viêm loét trong dạ dày [127]. Watanabe và cs (1986) đã nghiên cứu hoạt tính kháng loét của 8 dịch chiết từ nghệ đen trên chuột gây viêm loét dạ dày cấp tính. Các hợp chất furanogermenone và (4S, 5S)- (+) germencrone 4,5-epoxide của tinh dầu nghệ có hoạt tính ức chế sự hình thành vết loét trên chuột thực nghiệm [175]. - Hoạt tính kháng viêm Jang và cs (2001) nhận thấy 3 hợp chất 7-bis (4-hydroxyphenyl)-1,4,6-
  43. 33 heptatrien-3-one, procurcumenol và epiprocurcumenol từ dịch chiết củ nghệ đen có hoạt tính kháng viêm bởi khả năng ức chế sự giải phóng yếu tố TNF-α ở đại thực bào chuột [63]. Makabe và cs (2006) nghiên cứu khả năng kháng viêm của các sesquiterpene phân lập từ dịch chiết ethanol của củ nghệ đen cho thấy, hai hợp chất curzenone và dehydrocurdione có tác dụng ức chế sự hình thành chất 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (chất tạo thành khi chuột bị viêm tai) với hiệu quả ức chế tương ứng là 75% và 53% [94]. Yoshioka và cs (1998) đã dùng chất dehydrocurdione, một sesquiterpene chiết tách từ cây nghệ đen để khảo sát hoạt tính kháng viêm in vivo và in vitro ở chuột. Kết quả cho thấy, dehydrocurdione, thành phần chính của nghệ đen có tiềm năng kháng viêm đi cùng với tác dụng chống oxy hóa [182]. - Hoạt tính chống oxy hóa Mau và cs (2003) nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu nghệ đen. Ở nồng độ 20 mg/ml, tinh dầu nghệ đen có hoạt tính tốt trong việc quét gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl [100]. Các hợp chất curcuminoid phân lập từ nghệ đen được công bố có hoạt tính chống oxy hóa và kháng viêm tương đương với các chất này tách từ cây nghệ vàng [96]. Kết quả nghiên cứu của Paramapojn và cs (2009) đã chứng minh rằng, dịch chiết ethanol củ nghệ đen có hoạt tính quét gốc tự do. Khả năng quét gốc tự do của các curcuminoid nghệ đen cao nhất là curcumin rồi đến demethoxycurcumin và thấp nhất là bisdemethoxycurcumin [120]. Ở nước ta, Trần Thị Việt Hoa và cs (2007) cũng đã khảo sát hoạt tính chống oxy hóa và nhận thấy tinh dầu nghệ đen trồng ở Đà Lạt ở nồng độ 20 mg/ml có khả năng chống oxy hóa tương đối cao từ 74,8-77,8%. Cao ether dầu hỏa của củ nghệ đen có khả năng chống oxy hóa cao nhất từ 61,4-84,5%, với nồng độ từ 5-20 mg/ml [3]. - Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm Hoạt tính kháng các loại vi khuẩn và nấm gây bệnh ở người và thực vật
  44. 34 của nghệ đen đã được nhiều nghiên cứu đề cập. Wilson (2005) đã khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của dịch chiết từ củ nghệ đen trên 6 loài vi khuẩn và 2 loài nấm. Kết quả cho thấy, các loại dịch chiết của củ nghệ đen đều có khả năng ức chế sinh trưởng của các loài vi khuẩn và nấm kiểm định (trừ Staphylococcus aureus) [176]. Nghiên cứu của Ficker và cs (2003) về khả năng kháng nấm gây bệnh ở người của các loại dịch chiết từ 11 loài cây họ Gừng cho thấy, dịch chiết từ củ nghệ đen có khả năng chống lại các loại nấm gây bệnh ở người, gồm những loài nấm chống chịu với các chất diệt nấm phổ biến như amphotericin B và ketoconazole [43]. Joshi và cs (1989) nghiên cứu nhận thấy, tinh dầu của nghệ đen chứa methyl-p-methoxy-cinnamate là thành phần kháng các nấm gây bệnh ở người [67]. Philip và cs (2009) nghiên cứu khả năng kháng khuẩn 32 loại dịch chiết từ 8 loài dược liệu trong các bài thuốc cổ truyền ở Malaysia trên các loài vi khuẩn nhận thấy dịch chiết của củ nghệ đen ức chế sinh trưởng của các loài vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, Bacillus. subtilis và không ức chế sinh trưởng của vi khuẩn E. coli [124]. Dịch chiết nghệ đen Thái Lan có hoạt tính kháng 3 chủng vi khuẩn E. coli, 2 chủng vi khuẩn Salmonella typhimurium, B. cereus, Listeria monocytogenes, S. aureus, 1 chủng vi khuẩn B. subtilis, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica, và 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas sp. [155]. Hiệu quả kháng khuẩn của dịch chiết nghệ đen tương đương với các sản phẩm kháng khuẩn thương mại và sự phối hợp dịch chiết nghệ đen với các sản phẩm kháng khuẩn đã cải thiện hiệu quả của các sản phẩm này [25]. Singh và cs (2002) đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bay hơi của củ cây nghệ đen nhận thấy, tinh dầu ức chế hoàn toàn khả năng sinh trưởng của các sợi nấm Colletotrichum falcatum [145]. Srvidya và cs (2009) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết củ nghệ đen. Kết quả cho thấy, dịch chiết hydro ethanolic của nghệ đen có khả năng kháng B. cereus và ức chế tương đối với K. pneumonia và C. albicans [149].
  45. 35 1.3.4. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro của cây nghệ đen Mello và cs (2001b) đã thành công trong tái sinh chồi từ callus nghệ đen trên môi trường lỏng có bổ sung 13,4 mM NAA và 2,2 mM BAP sau 70 ngày nuôi cấy [102]. Miachir và cs (2004) đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây nghệ đen ở từ chồi của thân củ [103]. Bharalee và cs (2005) cũng đã nghiên cứu nhân giống bằng chồi củ của cây nghệ đen, các cây tạo rễ in vitro có thể đưa ra trồng ngoài đất [21]. Loc và cs (2005) đã thành công trong nhân giống in vitro cây nghệ đen và có hơn 95% cây in vitro hình thành rễ sinh trưởng tốt trong chậu [90]. Anisuzzaman và cs (2008) đã nghiên cứu tạo củ in vitro cây nghệ đen ở Bangladesh. Chồi in vitro khoảng 10-12 tuần tuổi được nuôi cấy trên môi trường MS với nồng độ khác nhau của BA, NAA và các nguồn carbon khác nhau. Củ hình thành tốt nhất trên môi trường có 4,0 mg/L BA và 6% sucrose sau 7-9 tuần nuôi cấy [18]. Stanly và cs (2010) nghiên cứu nhân giống in vitro cây nghệ đen ở Malaysia thông qua nhân nhanh chồi in vitro trên môi trường rắn; nuôi cấy lắc trong bình tam giác và nuôi cấy ngập chìm tạm thời [150]. Ngoài các nghiên cứu nhân giống in vitro, nghiên cứu nuôi cấy callus và huyền phù tế bào cây nghệ đen cũng đã được công bố. Mello và cs (2001a, b) đã tạo callus từ đoạn rễ của cây nghệ đen in vitro trên môi trường MS có 3% sucrose, 13,4 μM NAA và 2,2 μM BAP trong điều kiện tối [101], [102]. Theo Miachir và cs (2004), callus không hình thành từ mô lá và rễ của cây nghệ đen in vitro trên môi trường có 2,4-D. Callus hình thành tốt nhất từ đoạn rễ trên môi trường MS bổ sung 1 mg/L NAA và nuôi cấy trong tối [103 ]. Mello và cs (2001a) đã nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen. Kết quả cho thấy, với 0,5 g tế bào trong bình tam giác 125 ml chứa 10 ml môi trường MS có 3% sucrose, 13,4 μM NAA và 2,2 μM BAP, tốc độ lắc 60 vòng/phút đã thu được khoảng 6 g sinh khối tươi của tế bào sau 35 ngày nuôi cấy. Kết quả cũng cho thấy, sucrose là nguồn carbon thích hợp cho sinh
  46. 36 trưởng của tế bào nghệ đen, các nguồn carbon khác như galactose glycerol và sorbitol không có vai trò đáng kể trong kích thích sinh trưởng của tế bào [101]. Miachir và cs (2004) cũng đã thiết lập nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ trong bình tam giác 250 ml trên máy lắc. Nuôi cấy 1 g tế bào trong 75 ml môi trường MS có bổ sung 1 mg/L NAA đã thu được sinh khối tế bào cao nhất là 8 g sau hơn 20 ngày nuôi cấy ở tốc độ lắc 100 vòng/phút [103].
  47. 37 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu là cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) thuộc chi nghệ (Curcuma), họ Gừng (Zingiberaceae), bộ Gừng (Zingiberales). Nguyên liệu nghiên cứu là các tế bào callus được tạo ra từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro (Hình 2.1) [90]. Hình 2.1. Cây nghệ đen nuôi cấy in vitro 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nuôi cấy tạo callus từ nguyên liệu bẹ lá của cây nghệ đen in vitro. - Nuôi cấy huyền phù tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml và trong hệ lên men 10 L. - Khảo sát sự tích lũy các hợp chất tự nhiên như tinh dầu, curcumin, sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L. - Thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L.
  48. 38 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Cây nghệ đen tự nhiên Cây nghệ đen in vitro Callus có nguồn gốc từ bẹ lá Chọn loại callus thích hợp cho nuôi cấy huyền phù Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác ở các điều kiện và môi trường nuôi cấy khác nhau Cỡ mẫu Tốc độ lắc Nguồn carbon Chất ĐHST Môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp Nuôi cấy TB trong hệ lên men ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau Cỡ mẫu Tốc độ khuấy Tốc độ sục khí Điều kiện nuôi cấy thích hợp Khảo sát sự tích lũy của tinh dầu, curcumin, polysaccharide, và sesquiterpene Phân tích hoạt tính kháng khuẩncủa tinh dầu Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm
  49. 39 Các thí nghiệm của luận án được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế. 2.3.1. Nuôi cấy callus Bẹ lá (0,2×1,0 cm) của cây nghệ đen in vitro được nuôi trên môi trường MS [107] có 2% sucrose và 0,8% agar, bổ sung 0,5-4,0 mg/L 2,4-D và 0,5-4,0 mg/L BA để tạo callus. Các callus sơ cấp hình thành từ bẹ lá (có màu trắng, xốp) được cắt thành các khối nhỏ (đường kính 2-3 mm) cấy chuyển lên môi trường MS có bổ sung 0,25-4,0 mg/L 2,4-D và 0,25-4,0 mg/L BA để phát triển thành callus thứ cấp. Các callus thứ cấp có màu vàng, rắn và rời rạc được tách thành những khối nhỏ (đường kính 1-2 mm) nuôi cấy trên trên cùng môi trường để nhân sinh khối. Callus được cấy chuyển 2 tuần/lần để tạo nguồn nguyên liệu nuôi cấy huyền phù tế bào. 2.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào 2.3.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác Thiết lập nuôi cấy huyền phù tế bào bằng cách cấy chuyển 2 g callus (14 ngày tuổi) vào bình tam giác 250 ml, chứa 50 ml môi trường MS có 2% sucrose, bổ sung 2,4-D 0,5 mg/L và BA 0,5 mg/L, nuôi trên máy lắc với tốc độ lắc 100 vòng/phút. Sau 10 ngày nuôi cấy, 2 g tế bào được chuyển sang môi trường mới có thành phần tương tự và nuôi trong cùng một điều kiện cho đến khi thu được dịch tế bào huyền phù đồng nhất. Sau 3 lần cấy chuyển, dịch huyền phù tế bào đồng nhất, sinh khối của tế bào 10 ngày tuổi được sử dụng nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml, chứa 50 ml môi trường MS có 2% sucrose, bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA với các điều kiện khác nhau như: cỡ mẫu 2-5 g, tốc độ lắc từ 80-180 vòng/phút để đánh giá ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của tế bào. Sau khi khảo sát một số điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của tế bào trong bình tam giác, trên máy lắc (cỡ mẫu, tốc độ lắc), sử dụng 3 g sinh khối
  50. 40 tế bào (10 ngày tuổi) từ thí nghiệm thăm dò điều kiện nuôi cấy thích hợp tiếp tục nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml, chứa 50 ml môi trường MS bổ sung các nguồn carbon khác nhau: sucrose, fructose và glucose (nồng độ: 20-70 g/L), và các chất ĐHST khác nhau: BA (0,25-2,5 mg/L) và 2,4-D (0,25-2,5 mg/L) ở dạng riêng rẽ hoặc phối hợp. Nuôi ở tốc độ lắc 120 vòng/phút để đánh giá ảnh hưởng của yếu tố môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của tế bào. 2.3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men 100 g sinh khối tế bào (10 ngày tuổi) nuôi cấy trên bình tam giác 250 ml trong môi trường cơ bản MS có 3% sucrose, bổ sung thêm BA 0,5 mg/L và 2,4-D 1,5 mg/L được đưa vào hệ lên men có tổng thể tích 14 L, thể tích làm việc 10 L (BioFlo 110, New Brunswick Scientific, USA) chứa môi trường MS lỏng có 3% sucrose, bổ sung 2,4-D 1,5 mg/L và BA 0,5 mg/L, cỡ mẫu 100- 250 g, tốc độ khuấy 100-200 vòng/phút, tốc độ sục khí 1,5-3,5 l/phút. Sinh khối tế bào được thu 2 ngày một lần trong suốt 18 ngày để khảo sát khả năng sinh trưởng của chúng. Tất cả môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH 5,8 trước khi khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro được duy trì ở nhiệt độ 25 2oC, điều kiện chiếu sáng khoảng 2000 lux (cho các thí nghiệm nuôi cấy callus) và khoảng 500 lux (cho các thí nghiệm nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác 250 ml và hệ lên men 10 L), thời gian chiếu sáng 8-10 giờ/ngày. 2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của tế bào Khả năng sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù được đánh giá thông qua khối lượng tươi, khối lượng khô, chỉ số sinh trưởng của tế bào. Sinh khối tươi của tế bào thu được bằng cách lọc chân không dịch huyền phù tế bào, sau đó rửa bằng nước cất để loại bỏ môi trường, cân để xác định khối lượng tươi.
  51. 41 Sinh khối tươi của tế bào được sấy khô trong tủ sấy ở 500C cho đến khi khối lượng không đổi, cân để xác định khối lượng khô của tế bào. WF Chỉ số sinh trưởng (GI) được tính theo công thức: G I WI Trong đó, WF: khối lượng tươi tế bào sau một thời gian nuôi cấy, WI: khối lượng tươi tế bào lúc đưa vào nuôi cấy. 2.3.4. Định lượng tinh dầu Xác định tinh dầu được thực hiện theo phương pháp của (Manzan và cs 2003) [95]. 4 g khô của tế bào nghệ đen được nghiền mịn và cho vào bình nút mài chứa 50 ml dung môi petrol ether, lắc 180 vòng/phút ở 40ºC trong 6 giờ. Quá trình chiết lặp lại 3 lần. Sau khi chiết, dung dịch được cô trên máy cô quay chân không (Heidolph, Đức) để loại bỏ dung môi và thu tinh dầu. 2.3.5. Định lượng curcumin Tách chiết curcumin được tiến hành theo phương pháp của Paramapojn và Gritsanapan (2009) [120]. Hòa 2 g bột mịn của tế bào nghệ đen trong 20 ml ethanol 70%. Hỗn hợp được phá bằng sóng siêu âm trên máy T 700/H (Elma, Đức) trong 30 phút ở 30oC. Sau đó, thể nổi được lọc bằng giấy Whatman (No. 1), bã được chiết lại với cùng dung môi cho tới khi hết hoàn toàn (dịch chiết cuối cùng là không màu). Dịch chiết nhiều lần được trộn lại và làm giàu bằng máy cô quay chân không (Heidolph, Đức) . Mẫu sau khi cô được hòa tan với ethanol 70% đến 10 ml, lọc bằng màng Millipore 0,25 μm (Sartorius, Đức) và pha loãng dịch chiết 5 lần. 20 μl của dịch chiết được đưa vào máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) bằng Hamilton syringe. Điều kiện chạy HPLC ở nhiệt độ phòng: cột Vertisep GES C18 (5 µm; 4,6×150 mm), tốc độ chạy 1,2 ml/min, thời gian chạy 10 phút, detector đọc ở bước sóng 420 nm, pha tĩnh là silica gel (pha ngược) và pha động là acetonitrile:acetic acid 2% (50:50, v/v).
  52. 42 Phân tích HPLC được thực hiện trên máy Spectra System (Thermo Electron, Mỹ) bằng chương trình ChromQuest (ver. 4.2.34). Tất cả dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích được mua từ các hãng Sigma (Mỹ) và Merck (Đức). Hòa tan curcumin chuẩn (≥ 94%) bằng ethanol 70% ở các nồng độ từ 0,1-1 mg/ml để dựng đường chuẩn. Hàm lượng curcumin (% khối lượng khô) của tế bào được tính theo phương trình đường chuẩn y = 10805,46 x (r2 = 0,966). 2.3.6. Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước Tách chiết polysaccharide được thực hiện theo phương pháp của Sun và cs (2005) [151]. 1 g bột mịn của tế bào nghệ đen được chiết Soxhlet (Selecta, Tây Ban Nha) trong 3 giờ với ethanol 80% để loại bỏ chất màu, làm bất hoạt các enzyme, và biến tính các protein tự do. Phần cặn được cho vào bình tam giác 150 ml, thêm vào 30 ml nước cất, sau đó chiết trong thiết bị làm sạch bằng sóng siêu âm T 700/H (Elma, Đức) ở 600C trong 30 phút. Dịch chiết được thêm vào 40 ml ethanol 95%, ủ qua đêm ở 40C để kết tủa polysaccharide. Ly tâm thu kết tủa và rửa sạch bằng hỗn hợp diethyl ether và acetone (1:1 v/v) để thu polysaccharide. Hòa tan kết tủa polysaccharide trong 3 ml nước cất, sau đó thêm vào 1 ml 0 phenol và 7 ml H2SO4, ủ trong bể điều nhiệt ở 40 C trong 30 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong 20 phút. So màu trên máy quang phổ BioMate 3 UV-Vis (Thermo Spectronic, Mỹ) ở bước sóng 485 nm. Mẫu trắng có thành phần giống như mẫu phân tích nhưng không có polysaccharide. Hàm lượng polysaccharide được xác định dựa vào đường chuẩn D-glucose (4-20 mg/ml) (Chaplin và cs 1994) [30] và tính toán theo hệ số chuyển đổi sang polysaccharide là 3,168 (Li và cs 2007) [83]. Phương trình đường chuẩn D-glucose như sau: y = 0,0668x với R2 = 0,996. 2.3.7. Xác định sesquiterpene Xác định sesquiterpene theo phương pháp của Jang và cs (2004) [64]. Lấy 1 g mẫu bột mịn của tế bào nghệ đen chiết trong 3 giờ với dung môi methanol.
  53. 43 Quá trình chiết lặp lại 3 lần. Dịch chiết trộn lại, lọc và cô bằng hệ thống cô quay chân không (Heidolph, Đức) cho tới khô. Mẫu sau đó được hòa tan trong hỗn hợp ethyl acetate và nước (1:1 v/v). Phần hòa tan trong ethyl acetate được cô cho tới khô, sau đó hòa tan trong methanol, lọc bằng màng Millipore 0,25 μm (Sartorius, Đức), lấy 50 μl để chạy HPLC pha ngược. Điều kiện chạy HPLC ở nhiệt độ phòng như sau: cột Vertisep GES C18 (5 µm, 4,6 ×150 mm), pha động methanol 60%, tốc độ dòng 1 ml/min, độ hấp thu quang đo ở bước sóng 254 nm. Phân tích HPLC được thực hiện trên máy Spectra System (Thermo Electron, Mỹ) bằng chương trình ChromQuest (ver. 4.2.34). Tất cả dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích được mua từ hãng Merck (Đức). 2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen được xác định theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch của Lehrer và cs (1991) [81]. Sử dụng dịch huyền phù (106 - 108 CFU/ml) của các chủng vi khuẩn Bacillus cereus ATCC 11778, Staphylococcus aureus ATCC 6538, và Escherichia coli ATCC 25922 (Bansal, 2003). 100 µl dịch huyền phù của mỗi chủng được bổ sung lên đĩa Petri chứa 20 ml môi trường dinh dưỡng dạng rắn, dùng que cấy dàn đều tế bào vi khuẩn trên mặt thạch. Khoan 3 lỗ đường kính 6 mm trên đĩa môi trường, sau đó cho vào mỗi lỗ 70 µl tinh dầu (50 mg/ml), dung dịch DMSO được dùng làm đối chứng. Đặt đĩa môi trường trong tủ lạnh khoảng 8 giờ, sau đó nuôi trong tủ ấm ở 37oC, sau 24 giờ xác định đường kính vô khuẩn D - d (D: đường kính vòng vô khuẩn; d: đường kính lỗ khoan). 2.3.9. Xử lý thống kê Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu thực nghiệm được tính trung bình mẫu ± sai số chuẩn và phân tích Ducan’s test (p<0,05) bằng chương trình SAS.
  54. 44 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN Callus thường được dùng làm nguồn nguyên liệu khởi đầu để thiết lập nuôi cấy huyền phù tế bào của thực vật. Vì vậy, tìm ra môi trường dinh dưỡng thích hợp cho nuôi cấy callus là rất cần thiết. Bảng 3.1 trình bày kết quả tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro trên các môi trường khác nhau sau 90 ngày nuôi. Bảng 3.1. Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro 2,4-D BA % mẫu vật Sinh trưởng Hình thái callus (mg/L) (mg/L) tạo callus của callus - - - - - 0,5 0,5 15,74c ++ Trắng, mọng nước 1,0 1,0 46,01a ++++ Trắng, xốp 2,0 2,0 40,10b ++++ Trắng, xốp 3,0 3,0 10,20d +++ Trắng, mọng nước 4,0 4,0 8,20cd + Trắng, mọng nước Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 (Duncan’s test). ++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +: sinh trưởng kém; - : không xuất hiện callus. Các môi trường có bổ sung BA và 2,4-D đều kích thích tạo callus, trong khi đó môi trường không bổ sung chất ĐHST lại không tạo callus. Môi trường có bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D và 1,0 mg/L BA hoặc 2,0 mg/L 2,4-D và 2,0 mg/L BA
  55. 45 là thích hợp nhất (tỷ lệ tạo callus từ 40,1-46,01%), callus có màu trắng, xốp và có khả năng sinh trưởng tốt (Hình 3.1A). Ở các môi trường còn lại tỷ lệ tạo callus thấp (8,2-15,74%), callus có màu trắng và mọng nước (Hình 3.1B). A B Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro. (A) callus trắng và xốp, (B) callus trắng và mọng nước. Mello và cs (2001b) đã tạo được callus nghệ đen từ đoạn rễ trên môi trường MS có 3% sucrose, bổ sung 13,4 µM NAA và 2,2 µM BA, nuôi trong điều kiện tối. Nghiên cứu của Miachir và cs (2004) cho thấy, callus nghệ đen hình thành từ đoạn rễ sinh trưởng trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L NAA, nhưng nếu nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4 D trong điều kiện tối thì callus sẽ không xuất hiện [102]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, các ĐHST như NAA và KIN cũng đã được thăm dò khi nuôi cấy bẹ lá, tuy nhiên chúng cho kết quả rất kém, callus sinh trưởng yếu trên môi trường có NAA và hóa nâu trên môi trường có KIN. Chúng tôi cũng đã khảo sát khả năng hình thành callus từ đoạn rễ trên các môi trường có bổ sung 2,4-D, BA, KIN, và NAA. Trên hầu hết các môi trường thí nghiệm, mô rễ tạo callus rất kém hoặc callus có màu trắng, mọng nước và hơi nhầy, sinh trưởng rất chậm. Trong việc chọn dòng tế bào callus để thiết lập nuôi cấy huyền phù, các dòng callus rắn và dễ vỡ vụn (friable) thường được lựa chọn làm nguyên liệu
  56. 46 nuôi cấy huyền phù tế bào do chúng có khả năng sinh trưởng nhanh và ổn định trong môi trường lỏng [165]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, callus điều có khả năng sinh trưởng mạnh trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D và 1,0 mg/L BA hoặc 2,0 mg/L 2,4-D và 2,0 mg/L BA. Tuy nhiên, các callus này có dạng xốp và khó vở vụn nên không thích hợp để làm nguyên liệu nuôi cấy huyền phù tế bào. Vì thế, cần phải chọn các dòng tế bào callus thích hợp hơn để thiết kế nuôi cấy huyền phù. Callus sơ cấp có màu trắng, xốp và sinh trưởng mạnh được cấy chuyển lên môi trường MS có bổ sung 2,4-D và BA từ 0,25-4 mg/L. Kết quả cho thấy, các callus sinh trưởng trên môi trường có 2 mg/L 2,4-D và 2 mg/L BA dần dần hóa nâu và chết sau khi cấy chuyển. Các callus trên môi trường có 1 mg/L 2,4-D và 1 mg/L BA phát triển thành dạng callus thứ cấp có khả năng sinh trưởng tốt nhất trên môi trường có chứa 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA (Bảng 3.2). Các môi trường còn lại không có tác dụng kích thích sinh trưởng callus (callus sinh trưởng kém hoặc hóa nâu và chết) sau 4 tuần cấy chuyển. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng và phát sinh hình thái của callus 2,4-D BA Sinh trưởng Hình thái callus (mg/L) (mg/L) của callus 0,25 0,25 + Trắng và mọng nước 0,50 0,50 ++++ Vàng sáng, rắn và rời rạc 1,00 1,00 ++ Trắng và xốp 2,00 2,00 ++ Trắng và mọng nước 4,00 4,00 - Hóa nâu và chết Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 (Duncan’s test). ++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +: sinh trưởng kém; - : không sinh trưởng.
  57. 47 Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn và rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy Các calus thứ cấp có màu vàng sáng, rắn và dễ vỡ vụn (Hình 3.2) thu được trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA sau 4 tuần được cấy chuyển 2 tuần một lần lên môi trường có thành phần tương tự để nhân sinh khối callus, tạo nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác. 3.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC 3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy Sinh khối tế bào (10 ngày tuổi) nuôi cấy trên môi trường MS có 2% sucrose, bổ sung 2,4-D 0,5 mg/L và BA 0,5 mg/L được dùng làm nguyên liệu để khảo sát. Tế bào với các cỡ mẫu ban đầu khác nhau (2, 3, 4, 5 g tế bào) được nuôi cấy trên môi trường lỏng có thành phần giống như môi trường sinh trưởng tốt nhất của callus, ở tốc độ lắc 100 vòng/phút. Kết quả ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy lên sinh trưởng của tế bào trong khoảng thời gian từ 2 đến 18 ngày được trình bày ở bảng 3.3. Kết quả cho thấy, với cỡ mẫu 2 g, sinh khối đạt cao nhất sau 16 ngày là 4,12 g tươi (0,37 g khô) và chỉ số sinh trưởng là 2,06. Với 3 g tế bào nuôi cấy thì sinh trưởng của tế bào đạt cực đại chỉ sau 14 ngày là 5,61 g tươi (0,41 g khô) và chỉ số sinh trưởng là 1,87. Khi tăng cỡ mẫu lên 4-5 g, sinh khối đạt cực đại sau 12 ngày, tương ứng là 6,12 g tươi (0,46 g khô) và 7,22 g tươi (0,51 g khô) nhưng chỉ số sinh trưởng thấp chỉ đạt 1,54 và 1,44.
  58. 48 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 2 g tế bào 3 g tế bào 4 g tế bào 5 g tế bào TN FW DW GI FW DW GI FW DW GI FW DW GI 2 2,22c 0,18d 1,11 3,14d 0,28c 1,05 4,07c 0,32b 1,02 5,20d 0,39c 1,04 4 2,52c 0,24c 1,26 3,52c 0,32c 1,17 4,34c 0,35b 1,09 5,32d 0,42c 1,06 6 3,00b 0,24c 1,50 4,00c 0,35b 1,33 4,94c 0,37b 1,24 5,61c 0,44c 1,12 8 3,30b 0,30b 1,65 4,53b 0,38b 1,51 5,65b 0,40b 1,41 6,09c 0,47b 1,22 10 3,50b 0,33b 1,75 4,92b 0,40a 1,64 6,04a 0,42b 1,51 7,02b 0,48b 1,40 12 3,70a 0,35b 1,85 5,15b 0,40a 1,72 6,15a 0,44a 1,54 7,22a 0,51a 1,44 14 4,00a 0,35b 2,00 5,61a 0,41a 1,87 6,12a 0,46a 1,53 5,68c 0,41c 1,14 16 4,12a 0,37a 2,06 5,21b 0,37b 1,74 5,20b 0,35b 1,30 5,00d 0,32cd 1,00 18 4,01a 0.23c 2,01 4,67b 0,29c 1,56 4,56c 0,27c 1,14 4,12e 0,22d 0,82 Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 TN: thời gian nuôi cấy (ngày); FW: khối lượng tươi (g); DW: khối lượng khô (g), GI: chỉ số sinh trưởng Nghiên cứu cũng cho thấy, mặc dù với cỡ mẫu nuôi cấy là 2 g, sau 14 ngày chỉ số sinh trưởng của tế bào có cao (2,0), nhưng chất lượng dịch huyền phù tế bào kém hơn (dịch tế bào có màu vàng nhạt, ít đồng nhất) so với khi sử dụng 3 g tế bào nuôi cấy (dịch huyền phù tế bào có màu vàng đậm, tươi và đồng nhất). Vì thế, theo nhận định của chúng tôi, sử dụng 3 g tế bào callus nuôi cấy trong bình tam giác có thể tích 250 ml chứa 50 ml môi trường là thích hợp hơn cả. Nói chung, xác định cỡ mẫu là rất cần thiết để đảm bảo cho quá trình sinh trưởng diễn ra hiệu quả. Khi mật độ tế bào trong bình nuôi cấy quá cao hoặc quá thấp đều làm cho tế bào sinh trưởng kém [111]. Mật độ ban đầu thấp có thể dẫn đến kéo dài pha sinh trưởng hàm mũ; trong khi đó, nếu mật độ tế bào ban đầu cao hơn có thể nhanh chóng dẫn đến pha tử vong (Ling và cs 2008) [84]. Ảnh
  59. 49 hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù đã được khảo sát trên nhiều loài thực vật khác nhau. Gou và Zhang (2005), khi nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào cây gừng nhận thấy, nếu lượng mẫu ban đầu thấp hơn 0,5% (w/v) thì tế bào sẽ sinh trưởng chậm, trong khi với lượng mẫu cao hơn 2,0% (w/v) thì tế bào sẽ sinh trưởng nhanh [49]. Ling và cs (2008) nuôi cấy tế bào cây Ficus deltoidea với cỡ mẫu là 2,5-10 ml dịch tế bào huyền phù, kết quả tế bào sinh truởng tốt nhất ở 10 ml và sinh khối đạt cực đại sau 12 ngày. Nếu lượng mẫu thấp hơn 2,5 ml thì pha thích nghi (pha lag) của tế bào sẽ kéo dài đến hết ngày thứ 9 [84]. Nagella và Murthy (2010) cũng đã khảo sát ảnh hưởng của cỡ mẫu ban đầu từ 2,5- 20 g/L lên tích lũy sinh khối của tế bào cây Withania somnifera nhận thấy, nuôi cấy với lượng mẫu khoảng 10 g/L là thích hợp nhất cho sinh trưởng của tế bào [109]. Từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen cho thấy, tế bào nghệ đen sinh trưởng tốt với cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu là 3 g trong bình tam giác thể tích 250 ml, chứa 50 ml môi trường và sau 14 ngày sinh khối sẽ đạt cực đại. Trong các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sử dụng cỡ mẫu nuôi cấy là 3 g và thu hoạch sinh khối sau 14 ngày nuôi cấy để khảo sát ảnh hưởng các điều kiện nuôi cấy khác lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen. 3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc Tế bào được nuôi cấy trên môi trường MS có BA 0,5 mg/L và 2,4-D 0,5 mg/L, sucrose 20 g/L, cỡ mẫu ban đầu là 3 g với tốc độ lắc thay đổi từ 80 đến 180 vòng/phút. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.4. Nhìn chung, tốc độ lắc đã ảnh hưởng lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen. Với tốc độ lắc tăng từ 80 đến 120 vòng/phút, sinh khối tế bào đã tăng dần lên và đạt cực đại là 5,91 g tươi (0,44 g khô), chỉ số sinh trưởng là 1,97 và dịch huyền phù tế bào có màu vàng sáng, đồng nhất. Khi tăng tốc độ lắc lên cao hơn (150-180 vòng/phút), tế bào sinh trưởng chậm lại, đặc biệt bị ức chế
  60. 50 mạnh ở tốc độ lắc 180 vòng/phút, sinh khối cao nhất chỉ là 4,75 g tươi (0,35 g khô), dịch huyền phù tế bào chuyển sang màu nâu sau 14 ngày nuôi cấy. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác Tốc độ lắc (vòng/phút) FW DW GI 80 5,00ab 0,34c 1,67 100 5,61b 0,41b 1,87 120 5,91a 0,44a 1,97 150 5,60b 0,42b 1,87 180 4,75ab 0,35c 1,58 Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 (Duncan’s test). FW: khối lượng tươi (g); DW: khối lượng khô (g), GI: chỉ số sinh trưởng Tốc độ lắc ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng tế bào do liên quan đến việc cung cấp oxy và chất dinh dưỡng. Lượng oxygen trong môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng quá trình trao đổi chất của tế bào thực vật. Lượng oxy này chủ yếu phụ thuộc vào lớp không khí trên bề mặt môi trường. Môi trường lỏng được trộn đều sẽ tăng tốc độ hòa tan của oxy, đồng thời tạo điều kiện dễ dàng cho tế bào hấp thụ chất dinh dưỡng. Vì vậy, tốc độ sinh trưởng của tế bào sẽ tăng khi tăng tốc độ lắc đến một giới hạn thích hợp, tuy nhiên khi tốc độ lắc quá cao sẽ ức chế sinh trưởng do tế bào bị biến dạng gây nên hiện tượng tự phân làm chết tế bào (Narayanaswany 1994) [111], (Ziv 2000) [193]. Theo nghiên cứu của Choi và cs (2008), tốc độ lắc thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào cây cọ dầu nằm trong khoảng từ 120-300 vòng/phút. Nếu tốc độ lắc thấp hoặc cao hơn (80 và 335 vòng/phút) đều bất lợi cho sinh trưởng của tế bào [33]. Nghiên cứu của chúng tôi nhận thấy, sinh trưởng của tế bào nghệ nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml cũng chịu ảnh hưởng đáng kể khi thay đổi tốc độ lắc, tế bào sinh trưởng tốt nhất khi nuôi cấy trên máy lắc ở tốc độ 120 vòng/phút.
  61. 51 3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST Khảo sát ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng của tế bào cây nghệ đen bằng cách nuôi 3 g tế bào trên môi trường MS có 20 g/L sucrose, bổ sung các chất 2,4-D và BA ở các nồng độ khác nhau, tốc độ lắc ở 120 vòng/phút. 3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA Khả năng sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong môi trường có bổ sung BA từ 0,25-2,5 mg/L sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.5. Kết quả nghiên cứu cho thấy, môi trường có bổ sung BA 0,25 mg/L và 0,5 mg/L có hiệu quả tương đương (p<0,05) trong kích thích sinh trưởng của tế bào, khối lượng tươi của tế bào đạt từ 2,06-2,08 g (0,45-0,46 g khô) và chỉ số sinh trưởng xấp xỉ 2,1 là cao nhất. Trên các môi trường có nồng độ BA cao hơn (1,0 -2,5 mg/L), sinh trưởng của tế bào giảm nhanh và bị ức chế mạnh ở nồng độ BA 2,5 mg/L, sinh khối tế bào chỉ đạt 4,55 g tươi (0,32 g khô), chỉ số sinh trưởng là 1,52 sau 14 ngày nuôi cấy. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác BA (mg/L) FW DW GI 0,25 6,17a 0,45a 2,06 0,5 6,25a 0,46a 2,08 1,0 5,76b 0,42ab 1,92 1,5 5,92b 0,37b 1,97 2,0 5,41bc 0,35b 1,80 2,5 4,55bc 0,32b 1,52 Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 (Duncan’s test). FW: khối lượng tươi (g); DW: khối lượng khô (g), GI: chỉ số sinh trưởng