Luận án Thực trạng lây nhiễm lao ở Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình, một số giải pháp can thiệp

116 trang yendo 3960

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Thực trạng lây nhiễm lao ở Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình, một số giải pháp can thiệp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

luan_an_thuc_trang_lay_nhiem_lao_o_benh_vien_lao_va_benh_pho.pdf

Nội dung text: Luận án Thực trạng lây nhiễm lao ở Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình, một số giải pháp can thiệp

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lao là một bệnh nhiều người mắc, tỷ lệ tử vong cao và có tính chất dễ lây lan trong cộng đồng [02]. Tiếp xúc trực tiếp với người bệnh là nguy cơ lây nhiễm bệnh cao nhất [25], [38]. Bệnh Lao được xếp vào một trong các bệnh lây truyền theo đường thở cho nhân viên y tế [42], [129]. Nguy cơ bị nhiễm khuẩn liên quan đến nghề nghiệp là một phần không thể tránh khỏi trong công tác tiếp xúc và chăm sóc bệnh nhân hàng ngày. Trong giai đoạn 1985 đến 1991, một số nghiên cứu tại Đan mạch, Ý và Thụy sỹ đã chỉ ra các nguy cơ nhiễm lao của nhân viên y tế [37], [98], [57]. Ở Mỹ, tình hình nhiễm lao ở các nhân viên y tế đã được báo cáo trong nhiều nghiên cứu [44], [110],[128] . Kết quả điều tra trong một số bệnh viện cho thấy từ 18 đến 35% các nhân viên y tế có phản ứng Mantoux chuyển từ âm tính sang dương tính [103], [34], [63]. Cho tới năm 1995, ít nhất có 17 nhân viên y tế (trong đó có 8 người nhiễm HIV) mắc lao do các chủng lao đa kháng thuốc và 5 (4 nhiễm HIV) đã chết [126]. Tham khảo kết quả khám sức khỏe định kỳ của nhân viên y tế Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình năm 1998, có 58/65 người (89,2%) cho kết quả phản ứng Mantoux dương tính. Một số nhân viên y tế của bệnh viện có tiền sử điều trị bệnh lao. Cơ quan An toàn và Sức khỏe nghề nghiệp của Mỹ (OSHA - Occupational Safety Health Administration) công nhận bệnh lao là một trong những bệnh liên quan đến nghề nghiệp [39]. Ở Việt Nam, bệnh lao được xếp vào nhóm các bệnh nhiễm khuẩn nghề nghiệp nằm trong danh mục 25 bệnh nghề nghiệp được bảo hiểm [9].
2 Những năm gần đây, vấn đề kiểm soát lây nhiễm đã được Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) ưu tiên quan tâm như một cấu phần cơ bản trong kiểm soát bệnh lao nhất là lao đa kháng và siêu kháng thuốc, trong đó có vấn đề kiểm soát và phòng ngừa lây nhiễm lao cho nhân viên y tế [05]. Kiểm soát lây nhiễm trong bệnh viện là vấn đề ưu tiên hiện nay của Chương trình Chống lao Quốc gia. Tuy nhiên, chưa có một nghiên cứu cụ thể nào về vấn đề ô nhiễm vi khuẩn lao và nguy cơ lây nhiễm lao của nhân viên y tế làm việc trong môi trường Bệnh viện Lao và Bệnh phổi tại Việt Nam. Đề tài luận án “Thực trạng lây nhiễm lao ở Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình, một số giải pháp can thiệp ” có các mục tiêu sau: 1. Xác định thực trạng nhiễm lao của nhân viên y tế tại Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình và cộng đồng dân cư xung quanh bệnh viện trước can thiệp (năm 2002). 2. Mô tả kết quả xét nghiệm vi khuẩn lao tại một số vị trí trong Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình trước can thiệp (năm 2002). 3. Đánh giá hiệu quả của một số biện pháp can thiệp kiểm soát lây nhiễm lao trong môi trường Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình (năm 2006 và 2011).
3 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO HIỆN NAY 1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới Bệnh lao là một trong những bệnh có tỷ lệ mắc và tử vong hàng đầu trên thế giới [131]. Theo số liệu ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG), hiện nay trên thế giới có khoảng 1/3 dân số (2,2 tỷ người) đã nhiễm lao và con số đó sẽ tăng 1% hàng năm [07] . Theo báo cáo năm 2010 của TCYTTG [133], ước tính năm 2009 có thêm khoảng 9,4 triệu người mắc lao mới (137/100.000 dân). Trong đó có khoảng 3,3 triệu phụ nữ (chiếm 35%) và số người mắc lao/HIV là 1,1 triệu (chiếm 12%), số mắc lao/ HIV tập trung phần lớn ở Châu Phi (80%). Số liệu cụ thể tại các khu vực được tổng hợp như sau: Bảng 1.1: Ước tính số mới mắc và tử vong do lao trên thế giới năm 2009 [133]. Số mới mắc trong Số chết trong năm Khu vực năm Số lượng Tỷ lệ (1) Số lượng (2) Tỷ lệ (1) Đông Nam Á 3.300.000 185 480.000 27 Tây TBD 1.900.000 105 240.000 13 Châu Phi 2.800.000 339 430.000 52 Trung Cận Đông 660.000 110 99.000 17 Châu Mỹ 270.000 29 20.000 2 Châu Âu 420.000 47 62.000 7 Chung toàn cầu 9.400.000 137 1.300.000 19 (1) Tỷ lệ trên 100.000 dân (2) Không bao gồm các trường hợp lao/HIV dương tính
4 Phần lớn bệnh nhân lao tập trung ở Châu Á (55%) và Châu Phi (30%), Khu vực Trung Cận Đông, Châu Âu và Châu Mỹ là những khu vực có tỷ lệ bệnh nhân lao thấp (7%, 4% và 3%) [133]. 81% số bệnh nhân lao nằm ở 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao trên toàn cầu. Năm nước có số lượng bệnh nhân lao cao nhất là Ấn Độ (2.000.000), Trung Quốc (1.300.000), Nam Phi (490.000), Nigeria (460.000) và Indonesia (430.000). 35% số bệnh nhân lao tập trung ở Ấn Độ và Trung Quốc. Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực Đông-Nam Á [133]. Tổ chức Y tế Thế giới cũng ước tính năm trong 2008 có khoảng 440.000 bệnh nhân lao kháng thuốc, trong đó 86% thuộc 27 nước có gánh nặng bệnh nhân lao kháng thuốc cao (bao gồm 15 nước Châu Âu). Bốn nước ước tính có số lượng bệnh nhân lao kháng thuốc cao nhất là Trung Quốc, Ấn Độ, Liên bang Nga và Nam Phi [133]. Đến tháng 7.2010 đã có 58 nước và vùng lãnh thổ báo cáo phát hiện trường hợp lao kháng thuốc [133]. Năm 2009, TCYTTG ước tính có 1,7 triệu người tử vong do lao, trong đó có 400 nghìn bệnh nhân lao/HIV và 380 nghìn phụ nữ. Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 86%, nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 63% số bệnh nhân ước tính. Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, cũng theo ước tính của TCYTTG, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao [133]. 1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam Ở nước ta, bệnh lao còn phổ biến và ở mức độ trung bình cao. Theo báo cáo của TCYTTG năm 2010, TCYTTG ước tính Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao trên toàn cầu [133].
5 Một số số liệu chính về tình hình bệnh lao ở Việt Nam được thể hiện ở bảng sau: Bảng 1.2: Một vài số liệu về tình hình bệnh lao ở Việt Nam hiện nay Dân số (2009) 88.000 Phân thứ tự gánh nặng bệnh lao toàn cầu 12 Tỷ lệ tử vong do lao (loại trừ HIV)/100.000 dân 36 (21 – 56) Tỷ lệ lao hiện mắc các thể / 100.000 dân 333 (143 – 577) Tỷ lệ lao mới mắc các thể / 100.000 dân 200 (150 – 256) Tỷ lệ lao / HIV dương tính mới mắc 8,4 (5,3 – 12) Tỷ lệ phát hiện, các thể (%) 54 (42 – 72) Tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong bệnh nhân mới (%) 2,7 (2 – 4) Tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong BN điều trị lại (%) 19 (15 – 25) % bệnh nhân lao được xét nghiệm HIV 37% % HIV dương tính trong số bệnh nhân lao được xét 17% nghiệm HIV Theo ước tính của TCYTTG, tỷ lệ tử vong do lao là 36/100.000 dân, tương đương với khoảng 32.000 người tử vong do lao. Tỷ lệ lao hiện mắc các thể là 333/100.000 dân, tương đương với khoảng 290.000 bệnh nhân. Tỷ lệ lao mới mắc các thể hàng năm là 200/100.000 dân, tương đương với khoảng 180.000 bệnh nhân. Tuy nhiên, ước tính tỷ lệ phát hiện bệnh lao các thể của Việt Nam mới chỉ đạt 54% (45-72). Năm 2009, có 34.907 bệnh nhân lao được xét nghiệm HIV, chiếm tỷ lệ 37% tổng số bệnh nhân lao. Tỷ lệ HIV dương tính trong số bệnh nhân lao xét nghiệm là 17%, cao hơn so với tỷ lệ nhiễm HIV ước tính trong số bệnh nhân lao tại báo cáo năm 2009 của TCYTTG (8,1%). Đồng nhiễm lao/HIV không chỉ làm tăng số bệnh nhân lao, mà còn làm giảm hiệu quả điều trị của CTCLQG và tăng tỷ lệ tử vong do lao.[133], [10].
6 Tỷ lệ lao kháng đa thuốc là 2,7% trong số bệnh nhân lao mới và 19% trong số bệnh nhân điều trị lại. Theo ước tính của CTCLQG, năm 2009 có khoảng 3.952 (95% CI: 2.944 – 5226) bệnh nhân lao kháng đa thuốc trong số bệnh nhân lao phổi được khám phát hiện. Trong đó, mới chỉ có 307 bệnh nhân lao kháng đa thuốc được điều trị. Theo kết quả điều tra tình hình nhiễm và mắc lao toàn quốc năm 2006-2007, nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở Việt Nam là 1,67; tỷ lệ mắc lao phổi AFB dương tính các thể ở Việt Nam là 145/100.000 dân và tỷ lệ hiện mắc lao phổi AFB dương tính mới là 114/100.000 dân. Như vậy, còn một số lượng lớn bệnh nhân lao phổi AFB dương tính trong cộng đồng vẫn chưa được phát hiện và Chương trình chống lao cần có sự nỗ lực hơn nữa trong công tác phát hiện, quản lý để hạn chế nguồn lây và giảm dịch tễ bệnh lao trong cộng đồng. 1.1.3. Tình hình bệnh lao tại tỉnh Thái Bình. Bảng 1.3: Tình hình phát hiện bệnh nhân lao các thể tỉnh Thái Bình từ năm 2007 - 2011: AFB AFB AFB AFB Ng. AFB(-) AFB Tổng Năm (+) (+) (+) TB (-) Phổi &NgPh (+) cộng * Mới TP ĐT lại khác khác 2007 883 85 04 490 312 0 0 1774 2008 834 73 02 551 345 0 0 1805 2009 779 97 04 520 349 06 01 1756 2010 653 78 05 464 266 07 0 1473 9th 543 79 04 370 255 08 01 1260 2011 Tỷ lệ phát hiện bệnh nhân lao các thể và lao phổi dương tính mới có xu hướng giảm, năm 2007, tỷ lệ bệnh nhân lao phổi AFB(+)/100.000 dân là 48,4; năm 2010 tỷ lệ này là 34,7.
7 Bệnh viện Lao và Bệnh phổi của tỉnh xây dựng từ năm 1975 tại xã Vũ Chính là 1 xã ngoại thị (cách trung tâm thành phố 3-4 km) gồm 120 giường có nhiệm vụ phát hiện và điều trị bệnh nhân lao chung của toàn tỉnh. Trung bình 1 năm bệnh viện khám 15.000 lượt người và tiếp nhận điều trị 800 bệnh nhân lao chủ yếu là bệnh nhân lao phổi dương tính mới và tái phát. Bảng 1.4: Số bệnh nhân lao phổi AFB dương tính và số tiêu bản đờm xét nghiệm tại bệnh viện từ năm 1998 – 2011 Năm Tiêu bản XN Tiêu bản XN Số BN lao phổi dương dương tính âm tính tính 1998 621 7607 349 1999 681 7340 338 2000 612 7533 299 2001 739 17245 340 2002 602 8443 280 2003 517 8736 239 2004 565 9019 264 2005 721 10504 325 2006 901 10406 404 2007 739 12925 348 2008 759 13008 328 2009 847 12836 376 2010 713 12393 306 9th 2011 645 9862 294 1.2. VI KHUẨN LAO VÀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN 1.2.1. Vi khuẩn lao [20], [23], [59], [70].[151], [07] Hình thể: Vi khuẩn lao hình que mảnh, không di động, có độ dài từ 3 đến 5 μm và đường kính từ 0,3 đến 0,5μm, hơi cong, hai đầu tròn. Trong bệnh phẩm đứng riêng biệt hoặc thành đám nhỏ đôi khi xoắn thừng hoặc thành dây [02]. Đặc tính sinh hóa:
8 Hoạt độ Catalaza ở 220C = (+++) Hoạt độ Catalaza khi đun nóng 700C trong 15 phút = 0 Hoạt độ Peroxydaza ở 220C = (+++) Hoạt độ Peroxydaza khi đun nóng 700C trong 15 phút = 0 Thạch cận Lebek: trực khuẩn hoàn toàn ưa khí, mọc trên bề mặt Test Niacin hoặc test Kono = (+++) Test khử Nitrat = (+++) Thành phần hóa học và cấu trúc cơ bản Thành phần hóa học: gồm nước chiếm 85,9% trọng lượng các chất đạm, đường, mỡ và chất khoáng. Chất đạm (protid) gồm các tuberculoprotein khác nhau (chiếm 56% trọng lượng khô của vi khuẩn). Các tuberculoprotein được cấu tạo từ các acid amin và là cơ sở của các kháng nguyên của vi khuẩn lao, khi đưa vào cơ thể động vật sẽ gây ra hiện tượng phản vệ. Chất đường (glucid) chiếm khoảng 15% trọng lượng khô của vi khuẩn. Phần lớn chúng ở dưới dạng Polysarcharid, hoặc liên kết với các protein hoặc phophat. Các Polysarcharid không độc, ít có tính kháng nguyên, không gây hiện tượng mẫn cảm, nhưng có hoạt tính trong các phản ứng huyết thanh như tăng cường phản ứng liên kết. Chất mỡ (lipid) chiếm 10 đến 40% trọng lượng khô của vi khuẩn, chúng tan trong cồn, ether và chloroform. Các chất lipid của vi khuẩn: mycozit C, cord-factor và các chất sáp được nghiên cứu nhiều. Theo nhiều tác giả, các lipid này của vi khuẩn có liên quan đến độc tính và khả năng gây bệnh của chúng. Cấu trúc hóa học cơ bản của vi khuẩn lao gồm: Vỏ của vi khuẩn lao dầy từ 10-20 nm, gồm có 4 lớp khác nhau: Lớp 1: Peptido-glycane
9 Lớp 2 và 3: Mycolate arabino galactane Lớp 4: glycolipide với 3 chất: sáp D, yếu tố thừng và micoside Vỏ của vi khuẩn lao chi phối 3 đặc tính của vi khuẩn lao: khả năng gây bệnh, tạo ra tính mẫn cảm, tạo ra tính kháng cồn, kháng toan. Cấu trúc vỏ tế bào của vi khuẩn lao tạo ra các tính chất nhuộm. Khi nhuộm Gram,vi khuẩn bắt mầu của vi khuẩn Gram dương. Cấu trúc mycolic acid tạo ra khả năng kháng lại các chất tẩy aniline là cồn acid. Tính chất nuôi cấy và khả năng đề kháng: Vi khuẩn lao hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ thích nghi 37oC, pH thích nghi 6,7 - 7.Vi khuẩn được nuôi cấy ở môi trường giàu chất dinh dưỡng như môi trường đặc Loeweinstein - Jensen, Ogawa Mark, môi trường lỏng Sauton. Ở môi trường Loeweinstein- Jensen khuẩn lạc xuất hiện khoảng sau một tháng, khô nhăn nheo giống như hoa súp lơ, màu trắng ngà. Ở môi trường lỏng Sauton vi khuẩn mọc nhiều ở bề mặt chất lỏng thành những mảng nhăn nheo, khô và dính vào thành ống. Vi khuẩn lao phát triển chậm, thời gian nhân đôi là 12-24 giờ trong khi của E.coli là 20 phút. Những chủng độc lực tạo thành những khuẩn lạc R. Những chủng độc lực kém tạo thành những khuẩn lạc ít nhăn nheo hơn và phát triển ít có trật tự hơn. Khả năng gây bệnh Khả năng gây bệnh của vi khuẩn lao phụ thuộc vào độc lực của vi khuẩn và sức đề kháng của cơ thể. Sự bền vững của vi khuẩn lao với môi trường bên ngoài [02]. Ở điều kiện tự nhiên, vi khuẩn có thể tồn tại 3-4 tháng. Trong phòng thí nghiệm người ta có thể bảo quản vi khuẩn trong nhiều năm. Dưới ánh nắng mặt trời, vi khuẩn bị chết sau 1,5 giờ. Khi chiếu tia cực tím chúng chỉ tồn tại được 2-3 phút. Ở 420C vi khuẩn ngừng phát triển và chết sau 10 phút ở 800C.
10 Đờm của bệnh nhân lao trong phòng tối, ẩm sau 3 tháng vi khuẩn vẫn tồn tại và giữ được độc lực; nhưng khi đun sôi đờm trong 5 phút chúng đã bị chết. Với cồn 900 vi khuẩn lao tồn tại được 3 phút, trong acid phenic 5% vi khuẩn chết ngay sau 1 phút. Đặc điểm kháng thuốc của vi khuẩn lao[25], [70]. Vi khuẩn lao trong quá trình sinh sản có thể xuất hiện những loại đột biến kháng thuốc. Những vi khuẩn lao kháng thuốc này là loại kháng thuốc trong nhiễm sắc thể. Cơ chế là do chọn lọc tự nhiên, có thể từ một quần thể vi khuẩn đa số chịu thuốc trở thành một quần thể vi khuẩn kháng thuốc hoàn toàn kháng một hoặc nhiều loại thuốc. Các chủng vi khuẩn chưa bao giờ tiếp xúc với một loại thuốc chống lao nào được gọi là “Chủng hoang dại”. Một chủng kháng thuốc tự nhiên là một chủng hoang dại kháng với một thuốc mà vi khuẩn chưa bao giờ tiếp xúc. Như vậy, cả vi khuẩn kháng thuốc tự nhiên và bệnh nhân có vi khuẩn này đều chưa bao giờ tiếp xúc với thuốc chống lao. Kháng thuốc tự nhiên xảy ra ở những nơi thuốc chống lao chưa bao giờ được sử dụng. Nguyên nhân của kháng thuốc tự nhiên là do đột biến gien. Tần xuất những đột biến kháng thuốc tự nhiên phụ thuộc vào nguồn gốc của chủng, loại thuốc, nồng độ thuốc và tổng số vi khuẩn. Số lượng vi khuẩn giảm sẽ giảm đột biến kháng thuốc. 1.2.2. Một số phương pháp chẩn đoán vi khuẩn lao. 1.2.2.1. Các phương pháp cổ điển Soi trực tiếp Nhuộm Ziehl – Neelsen và soi kính cho đến nay vẫn là một phương pháp đơn giản, rẻ tiền và cho kết quả nhanh. Tuy nhiên, soi kính chỉ cho phép phát hiện được trực khuẩn lao ở nồng độ 105 trực khuẩn/ml trở lên, vì vậy độ nhậy của phương pháp thấp, từ 40% - 60% (bệnh phẩm của bệnh nhân lao
11 người lớn) và chỉ đạt từ 10% - 20% (bệnh phẩm của bệnh nhân lao ngoài phổi). [25], [69], [83]. Soi kính không cho phép định danh vi khuẩn lao ở mức độ loài, chỉ xác định được hình thể, không phân biệt được vi khuẩn sống hay chết và không có hiệu quả trong việc xác định vi khuẩn lao kháng thuốc. Hơn nữa, kết quả soi kính cần phải được khẳng định bằng nuôi cấy và các thử nghiệm chẩn đoán xác định khi có dấu hiệu nghi ngờ nhiễm khuẩn gây ra bởi vi khuẩn lao thuộc nhóm không điển hình hoặc khi cần xác định độ nhạy cảm đối với kháng sinh điều trị [83], [97]. Tuy nhiên soi kính là phương pháp duy nhất để xác định nguồn lây chính: những người có ho khạc ra nhiều vi khuẩn lao có kết quả soi AFB(+) Nuôi cấy. Là những phương pháp phát hiện sự có mặt của vi khuẩn lao trên môi trường nuôi cấy in vitro. Hiện nay có rất nhiều loại môi trường để nuôi cấy vi khuẩn lao, được chia làm hai loại: môi trường đặc và môi trường lỏng. Cho đến nay, nuôi cấy trên môi trường đặc vẫn là một phương pháp kinh điển được sử dụng rộng rãi trong hầu hết các phòng thí nghiệm lâm sàng [119]. Môi trường rắn có thể là môi trường trứng (Egg-Base Medium) Loeweinstein- Jensen, American Trudeau Society (AST) hoặc môi trường agar (Agar-Base Medium) như Middlebrook 7H10 và Middlebrook 7H11. 1.2.2.2. Một số kỹ thuật hiện đại. Sử dụng Hệ Bactec Nguyên lý: Người ta gắn cacbon phóng xạ vào acid palmitric và acid formic trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn lao. Khi vi khuẩn chuyển hoá sẽ lấy các acid béo này và giải phóng ra CO2 (chứa cacbon phóng xạ) được đo bằng máy Bactec 460 [30], [02].
12 Hệ thống đo phóng xạ BATEC ra đời cho phép phát hiện sớm quá trình mọc của vi khuẩn trên môi trường bằng việc tự động phát hiện lượng 14 CO2 do vi khuẩn giải phóng ra trong quá trình trao đổi chất và carboxi hoá cơ chất có đánh dấu phóng xạ 14C. Kỹ thuật này có ưu điểm là cho kết quả nhanh (5 - 7 ngày) và cũng phát hiện được chủng vi khuẩn kháng thuốc. [30], [02]. Phương pháp MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tubes) Người ta sử dụng biện pháp đặc biệt để kích thích vi khuẩn lao sinh sản nhanh, vi khuẩn lao khi phát triển sẽ sử dụng oxy (O2) và thải CO2. Bằng bộ phận nhận cảm có phát quang có thể nhận biết được CO2 (chuyển môi trường từ màu xanh lục sang màu vàng). Phương pháp này cũng cho kết quả nhanh trong vòng từ 3-10 ngày [02]. Nguyên lý: Một phức hợp huỳnh quang được gắn ở đáy týp nuôi cấy. Phức hợp này nhậy cảm với sự có mặt của O2 hoà tan trong môi trường. Đầu tiên, do lượng O2 hoà tan lớn nên kìm chế sự phát quang từ phức hợp, khi đó chỉ một lượng nhỏ ánh sáng huỳnh quang có thể được phát hiện. Sau đó, khi có mặt vi khuẩn trong môi trường, do hoạt động của vi khuẩn trong quá trình trao đổi chất, đã tiêu thụ bớt O2 dẫn đến việc phát sáng của chất huỳnh quang, phát hiện được ở bước sóng 365 nm. Sự phát triển của vi khuẩn cũng có thể được phát hiện bởi sự xuất hiện độ đục không đồng nhất hoặc những hạt nhỏ hay mảnh vụn trong môi trường nuôi cấy [25],[20]. Phản ứng chuỗi polymeraza (PCR) Một phát minh quan trọng của sinh học phân tử trong những năm gần đây là kỹ thuật khuyếch đại acid nucleic (ADN và ARN). Kỹ thuật hiện nay được sử dụng ở nhiều nước là phản ứng chuỗi polymeraza (PCR). Ra đời vào năm 1986, kỹ thuật PCR đã nhanh chóng cung cấp những ứng dụng mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực công nghệ sinh, y học [81]. Việc áp dụng PCR trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm, đặc biệt là bệnh lao đã cung cấp một công cụ
13 đầy triển vọng, đáp ứng với nhu cầu cấp thiết, đã cho ra đời một phương pháp chẩn đoán nhanh, hiệu quả và an toàn khi mà đa số các phương pháp chẩn đoán bệnh lao cổ điển đều còn nhiều bất cập. Kỹ thuật PCR cho phép xác định vi khuẩn lao trực tiếp trong bệnh phẩm nhờ khả năng sao chép để khuyếch đại về mặt số lượng đoạn trình tự đặc hiệu trên gienom của vi khuẩn [81], [84], [86]. Cũng giống như phương pháp soi kính, phương pháp PCR có thể cho kết quả nhanh trong vòng 1 ngày nhưng độ nhạy và độ đặc hiệu lại cao hơn nhiều. Trong một số nghiên cứu khi nuôi cấy được coi là tiêu chuẩn vàng, độ nhạy của PCR đạt tới 71% đến 91%, độ đặc hiệu từ 95% - 100% [83]. Cho tới nay hầu hết các phòng thí nghiệm trên thế giới khi sử dụng phương pháp PCR trong chẩn đoán bệnh lao đều phát hiện các thường quy riêng. Đoạn khuôn mẫu được sử dụng nhiều nhất là đoạn trình tự acid nucleic nằm trên gien nhảy IS 6110. IS 6110 chỉ có mặt trong nhóm Mycobacterium tuberculosis và các Mycobacteria khác thuộc nhóm M.complex và thường có độ lặp lại cao trong hệ gien của vi khuẩn lao do vậy là một trình tự lý tưởng để đóng vai trò đoạn ADN đích. Sự phân biệt giữa M. tuberculosis và M. Bovis cũng có thể bằng đoạn IS 6110 vì M. Bovis chỉ có một đoạn IS 6110 [123]. Người ta cũng sử dụng nhiều trình tự khác nhau như IS 986, P36 (đây là các gien nhảy có đặc điểm tương tự như IS 6110), rARN 16S, các gien mã hoá cho protein 65 kD và 38 Kd [82]. Ngoài ra sự khác nhau về trình tự acid nucleic đích, phương pháp tách chiết ADN, số chu kỳ nhân gien và các phương pháp phát hiện sản phẩm sao chép của PCR cũng khác nhau ở mỗi phòng thí nghiệm. Kỹ thuật điện di trên gel agarose hoặc lai ghép với các đoạn mồi đặc hiệu có đánh dấu phóng xạ là các kỹ thuật phổ biến để phát hiện sản phẩm sao chép, tuy nhiên một số tác giả cũng đã sử dụng các đoạn mồi đánh dấu với chất không phóng xạ [82]. Bên cạnh những ưu điểm, kỹ thuật PCR cũng có những mặt hạn chế:
14 - Do phân tử ADN có thể được phát hiện ngay cả khi vi khuẩn đã bị chết nên kỹ thuật PCR không cho biết vi khuẩn lao còn sống hay đã chết mà điều này rất cần thiết cho việc theo dõi kết quả điều trị. - Có thể có dương tính giả, âm tính giả. Chống nhiễm: Do PCR có độ nhạy cao, khả năng dương tính giả có thể xảy ra nếu trong quá trình thực hiện, bệnh phẩm hoặc vật liệu sử dụng bị nhiễm một lượng nhỏ ADN vi khuẩn lao có trong môi trường, hoặc từ các bệnh phẩm có chứa vi khuẩn, hoặc bị nhiễm các đoạn ADN là sản phẩm sao chép của những lần chạy PCR trước. Sản phẩm sao chép của PCR có thể trở thành một mối đe doạ nếu không có biện pháp xử lý hiệu quả. Một ống phản ứng sau 40 chu kỳ nhân gien có thể chứa tới 1012 bản sao, và chỉ cần một bản sao lọt vào ống mới cũng đủ để phản ứng cho kết quả dương tính giả đối với ống đó [84]. Tuy nhiên ngày nay người ta đã có thể loại bỏ khả năng dương tính giả do nhiễm các đoạn ADN bản sao bằng việc sử dụng ezyme uracil DNA glycosylase (UNG) kết hợp với dUTP thay vì dTTP trong hỗn dịch phản ứng. UNG được hoạt hoá ở 400C trước khi phản ứng xảy ra phá huỷ toàn bộ các bản sao nếu do sơ xuất bị nhiễm vào hỗn dịch phản ứng. UNG phá huỷ các bản sao bằng cách cắt tại các vị trí Uraxin trên trình tự phân tử của nó vì vậy chỉ loại bỏ các bản sao do chúng có chứa Uraxin trong khi trình tự ADN đích tách chiết từ vi khuẩn thì vẫn được bảo vệ. UNG sẽ bị bất hoạt ở nhiệt độ cao hơn khi quá trình nhân gien xảy ra vì vậy không ảnh hưởng đến sản phẩm của phản ứng [87]. Ngoài ra để chống nhiễm chéo, các nguyên tắc ngặt nghèo về vô trùng phải được tuân thủ trong suốt quá trình thực hiện. Phòng thí nghiệm phải được sắp xếp sao cho các bước thực hiện kỹ thuật được tiến hành trong các khu vực riêng biệt, dụng cụ, hoá chất phải tuyệt đối vô khuẩn.
15 Chất ức chế PCR: Bên cạnh dương tính giả, PCR cũng có thể cho âm tính giả khi có sự can thiệp của các chất ức chế hoặc kìm hãm phản ứng. Các chất này thường là một trong những thành phần có trong bệnh phẩm có khả năng ức chế hoặc làm giảm hoạt tính enzyme ADN polymeraza, khiến cho phản ứng khuyếch đại gien xảy ra hoặc không xảy ra [82]. Tỷ lệ chất ức chế phản ứng PCR trong một số nghiên cứu dao động từ 3% đến 52% đối với bệnh phẩm đường hô hấp [86]. Người ta đã tìm cách phát hiện sự có mặt của chất ức chế bằng cách khuyếch đại ADN tách chiết từ mỗi bệnh phẩm trong 2 ống phản ứng trong đó một lượng nhỏ ADN của vi khuẩn lao được thêm vào một ống. Kết quả âm tính của ống này sẽ cho phép khẳng định sự có mặt của chất ức chế trong bệnh phẩm. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi số ống phản ứng tăng lên đáng kể khi làm với một số lượng mẫu lớn. Để khắc phục người ta sử dụng ADN của M. smegmatis thay thế cho ADN của M. tuberculosis. Do trình tự nhận biết trên IS 6110 của M. smegmatis nhưng bị sửa đổi bằng cách thêm vào 56 đôi bazơ. Sản phẩm PCR được nhân từ trình tự trên M. smegmatis sẽ được phân biệt với sản phẩm nhân từ trình tự trên vi khuẩn lao nhờ sự khác nhau về độ dài phân tử của chúng. M. smegmatis có thể được sử dụng như một nội chứng ngay trong bệnh phẩm. Một lượng xác định vi khuẩn M. smegmatis được cho vào trong bệnh phẩm trước khi tiến hành xử lý mẫu và tách chiết ADN sẽ kiểm tra được hiệu quả tách chiết ADN đồng thời đánh giá được sự có mặt của chất ức chế nếu có trong bệnh phẩm và định lượng một cách tương đối vi khuẩn vi khuẩn lao có trong bệnh phẩm [82]. Các kỹ thuật tách chiết ADN từ bệnh phẩm ít nhiều đều đã cố gắng để loại bỏ các chất ức chế. Tuy vậy khi so sánh phương pháp của Boom và cộng sự với
16 phương pháp truyền thống dùng phenol để xử lý các bệnh phẩm có chất ức chế PCR, kết quả nghiên cứu của A.Kolk cho thấy phương pháp của Boom sử dụng đơn giản và hiệu quả hơn do cùng một lúc vừa tách chiết, vừa tinh sạch được ADN lại không sử dụng phenol [82]. Phát hiện vi khuẩn lao sống bằng phương pháp RT – PCR, ELISA Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, người ta đã chứng minh được rằng sự có mặt của ARN chính là một dấu hiệu để đánh giá mức độ sống của vi khuẩn. Chỉ những vi khuẩn còn sống mới được phát hiện bằng cách sử dụng mARN làm khuôn trong phản ứng RT – PCR (Reverse transcriptase PCR). Hầu hết các phân tử mARN đều rất dễ bị phân huỷ và có vòng đời ngắn. Do vậy sự có mặt của mARN thường biểu thị quá trình sao chép liên tục của gien. Patel và các cộng sự đã sử dụng phản ứng RT – PCR để xác định khả năng sống sót của M. leprae bị giết bằng nhiệt và ông đã phát hiện dnaK mARN chỉ tồn tại trong các tế bào sống. Gần đây, Hellyer và các cộng sự đã nhận thấy rằng lượng fobB ( 85B, entigien) mARN của vi khuẩn lao giảm từ <4 và 0,01% sau 24 giờ điều trị Isoniazid và Rifampixin. Một nghiên cứu mới đây cũng chỉ ra rằng mARN chỉ tồn tại trong vi khuẩn lao sống. Tương tự như vậy, ở các vi khuẩn khác, mARN không phát hiện thấy trong các tế bào bị giết bằng nhiệt hoặc bằng các điều trị hoá học. Do có vòng đời ngắn, nên mARN bị phân huỷ rất nhanh trong các tế bào chết, vì vậy, nó được coi là một dấu hiệu lý tưởng cho việc phát hiện vi khuẩn sống. 1.2.3. Phát hiện vi khuẩn lao trong môi trường Sự lây truyền lao trong các khu vực đặc biệt như nhà dưỡng lão, nhà tù, trung tâm cai nghiện, bệnh viện được phát tán rất nhanh. Khả năng nhiễm lao sau khi hít phải những giọt khí dung chứa vi khuẩn lao có kích thước nhỏ hơn 5 µm do bệnh nhân lao giải phóng ra không khí trong phòng khi ho hoặc nói chuyện [35]. Vì vậy việc kiểm soát không khí trong các khu vực kín có bệnh
17 nhân lao là cần thiết và được thực hiện với các lý do chính sau: kiểm tra mức độ nhiễm vi khuẩn trong không khí để có biện pháp kiểm soát không khí đúng theo quy định về an toàn, để thu thập các số liệu dịch tễ liên quan đến giới hạn về mức độ phơi nhiễm của nhân viên y tế và cho các mục đích chung của khoa học và nghiên cứu. Việc kiểm soát không khí trong các vùng ô nhiễm lao có hiệu quả phụ thuộc vào kỹ thuật thu thập vi khuẩn từ không khí và môi trường và các kỹ thuật phát hiện vi khuẩn lao trong các mẫu đó. Một cách truyền thống là tập trung vào việc phân tích mẫu là đếm vi khuẩn có trong mẫu dựa trên nuôi cấy với một số hạn chế liên quan đến việc vi khuẩn lao có thời gian phát triển chậm và chỉ mọc trên các môi trường chọn lọc với các điều kiện thuận lợi [78], [41], [77]. Do vậy, những kỹ thuật nhanh và chính xác để phát hiện vi khuẩn lao trong môi trường cần được áp dụng để khắc phục các nhược điểm trên [29]. Thu thập mẫu môi trường Một nghiên cứu năm 1962 do Ridley và cộng sự tiến hành đã cho hàng trăm chuột lang được thở không khí trực tiếp từ bệnh phòng có bệnh nhân lao. Số chuột lang bị nhiễm lao sẽ được thử nghiệm da, mổ tử thi và phát hiện các hạch lao trong phổi là kết quả của việc hít các hạt khí dung có chứa vi khuẩn lao trong không khí từ buồng bệnh nhân lao. Vi khuẩn lao sẽ được nuôi cấy từ phổi bị nhiễm, thời gian nhiễm và số lượng chuột bị nhiễm lao cũng được xác định [112]. Đây là một phương pháp rất tốn thời gian và phải có máy hút trực tiếp không khí từ phòng bệnh tới lồng kín nhốt hàng trăm chuột lang làm cho việc áp dụng trong những nghiên cứu khác bị hạn chế [112]. Một nghiên cứu khác sử dụng mô hình chuột lang cũng được tiến hành tại Châu Phi khi một bệnh viện lao được xây dựng để có thể nối trực tiếp với phòng kín nhốt chuột lang. Nhưng nhược điểm của nghiên cứu này là môi trường sống của chuột lang bị nhốt không tự nhiên gây căng thẳng cho chuột tham gia thí
18 nghiệm, hơn nữa hệ thống thải nước tiểu và phân chuột cũng cần được thiết kế để đảm bảo vệ sinh môi trường cho chuột [101]. Trong những năm gần đây, việc phát hiện vi khuẩn lao trong không khí dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử, xác định ADN của vi khuẩn lao với đầu dò đặc hiệu gắn với enzym tạo mầu khi phản ứng với cơ chất [114]. Máy hút được sử dụng để thu không khí nhiễm vi khuẩn lao, sử dụng các màng lọc (polytetrafluoroethylene) PTFE và polycarbonate (PC). Năm 1999, kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện vi khuẩn lao trong hầm mỏ [88] và phòng áp lực âm sử dụng để thu thập vi khuẩn lao trong không khí [94]. Vào năm 2004, các nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao trong không khí tại các bệnh viện lao được tiến hành, sử dụng máy hút không khí và phương pháp PCR [73], [65]. 1.3. NHIỄM LAO VÀ BỆNH LAO 1.3.1. Nguồn lây Tất cả các bệnh nhân lao đều có thể là nguồn lây, nhưng mức độ lây rất khác nhau [07]. Đối với các thể lao ngoài phổi (lao màng não, màng bụng, hạch, xương khớp ) là các thể lao ít có khả năng đào thải vi khuẩn lao ra bên ngoài môi trường. Lao phổi là thể bệnh dễ đưa vi khuẩn ra môi trường bên ngoài (lượng không khí lưu thông trong một chu kỳ hô hấp trung bình là 500ml), vì vậy bệnh nhân lao phổi là nguồn lây quan trọng nhất. Nhưng ngay đối với lao phổi thì mức độ lây cũng khác nhau. Những bệnh nhân lao phổi trong đờm có nhiều vi khuẩn lao có thể phát hiện bằng phương pháp nhuộm soi trực tiếp thì khả năng lây cho người khác gấp 2 đến 10 lần các bệnh nhân lao phổi phải nuôi cấy mới phát hiện được vi khuẩn [07]. Như vậy, bệnh nhân lao phổi có vi khuẩn trong đờm phát hiện được bằng phương pháp soi trực tiếp là nguồn lây nguy hiểm nhất (còn gọi là nguồn lây chính). Trẻ em bị bệnh lao không phải là nguồn lây quan trọng vì có tới 95% bệnh lao ở trẻ em không tìm thấy vi khuẩn trong các bệnh phẩm.
19 1.3.2. Đường xâm nhập của vi khuẩn vào cơ thể. Vi khuẩn lao vào cơ thể qua đường hô hấp là phổ biến nhất. Khi bệnh nhân lao phổi ho, khạc, hắt hơi hay nói chuyện tạo ra những hạt nước bọt rất nhỏ chứa đầy vi khuẩn lao lơ lửng trong không khí, người lành có thể hít phải những hạt này vào phổi và mắc bệnh [07]. Những người sống càng gần gũi bệnh nhân, số lượng vi khuẩn có thể hít vào càng lớn. Bệnh lao cũng có thể lây theo đường ăn uống khi uống sữa bò tươi của các con bò bị lao mà sữa chưa tiệt khuẩn, khi ăn các thức ăn bị lây nhiễm trực khuẩn lao (không phải trực khuẩn lao người, đây là lao bò M. bovis) , có thể bị lao khi trực khuẩn lao qua các vùng cơ thể bị tổn thương (da, mắt v.v ) lọt vào cơ thể, nhưng các con đường này rất ít gặp. Vi khuẩn cũng có thể lây nhiễm qua thai nhi bằng đường máu qua tĩnh mạch rốn, nếu mẹ bị lao cấp tính (như lao kê), hoặc qua nước ối (khi chuyển dạ), nếu mẹ bị lao niêm mạc tử cung, âm đạo. Trong thực tế con đường truyền bệnh này càng hiếm gặp. Như vậy con đường truyền bệnh quan trọng nhất với bệnh lao là đường hô hấp[02], [07]. 1.3.3. Nhiễm lao. Quá trình nhiễm bệnh lao Có 5 giai đoạn trong việc vi khuẩn lao thâm nhập và gây nhiễm trong cơ thể [124]: 1. Bệnh lao bắt đầu khi vi khuẩn lao có mặt trong các hạt khí dung thâm nhập các phế nang, ở nơi bắt đầu sự nhiễm lao. 2. Sự lan truyền bệnh bắt đầu từ 7 đến 21 ngày sau khi vi khuẩn lao xâm nhiễm đại thực bào và nhân lên trong đó. Mặc dù đại thực bào đã nuốt vi khuẩn lao nhưng không tiêu diệt được chúng vì đã bị bất hoạt. 3. Trong giai đoạn này các hạch lao được hình thành. Vi khuẩn lao bên trong các hạch này sẽ không nhân lên được do pH thấp và thiếu oxy nhưng có thể sống sót trong các hạch này dài ngày (lao tiềm ẩn).
20 4. Vi khuẩn lao có thể sử dụng các đại thực bào đã bị bất hoạt để tiếp tục nhân lên dẫn đến việc phát triển các u hạt và xâm chiếm phế quản. Từ đây vi khuẩn lao có thể xâm nhiễm các phần khác của phổi. 5. Cùng với thời gian, phế quản sẽ bị hoại tử và vỡ ra, cho phép vi khuẩn lao xâm nhập các vùng khác của phổi. Trong đa số trường hợp tổn thương có thể tự khỏi (có hiện tượng lắng đọng calci, hình thành nốt vôi) và không có biểu hiện lâm sàng. Phản ứng da với Tuberculin bắt đầu dương tính ở tuần lễ thứ ba sau khi vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể , nhưng miễn dịch đầy đủ của cơ thể chống lại bệnh lao phải sau 2 – 3 tháng [02], [07]. Như vậy, nhiễm lao là giai đoạn đầu tiên khi vi khuẩn vào cơ thể gây tổn thương đặc hiệu (thường là ở phổi). Đa số trường hợp không có biểu hiện lâm sàng, cơ thể hình thành dị ứng và miễn dịch chống lao. Khi chưa có đại dịch HIV/AIDS thì chỉ có khoảng 10% Bệnh lao chỉ thực sự xảy ra khi số lượng và độc tính của trực khuẩn lao vượt quá sức đề kháng của cơ thể. Những người bị nhiễm lao chuyển thành bệnh lao. Khi nhiễm lao phối hợp với nhiễm HIV thì khả năng từ nhiễm lao chuyển sang bệnh lao ít nhất cũng gấp 3 lần những trường hợp chỉ có nhiễm lao [02]. Khả năng nhiễm lao trở thành bệnh lao phụ thuộc vào hai yếu tố: mức độ nhiễm nhiều hay ít và sức đề kháng của cơ thể. 1.3.4. Bệnh lao. Bệnh lao có thể xảy ra rất sớm ngay trong giai đoạn nhiễm lao, trẻ càng nhỏ thì bệnh lao càng dễ xảy ra. Ở giai đoạn nhiễm lao vi khuẩn đã vào máu lan tràn tới các cơ quan gây tổn thương như màng não, xương khớp, hạch Vì vậy ở trẻ nhỏ hay gặp bệnh cảnh lao kê phổi kèm theo lao nhiều bộ phận khác trong cơ thể [07].
21 Thời gian trung bình từ khi bị tổn thương tiên phát đến lúc bị bệnh lao ở một số bộ phận trong cơ thể không giống nhau. Lao kê, lao màng não có thể xảy ra rất sớm cùng với tổn thương tiên phát, các thể lao khác xảy ra muộn hơn: lao màng phổi trung bình là 6 tháng, sau đó là lao hạch, lao xương khớp (1 đến 5 năm sau). Lao sinh dục, tiết niệu, lao da xảy ra muộn nhất, thậm chí trẻ đã trở thành người lớn mới xảy ra mắc bệnh [02]. 1.3.5. Phản ứng da với Tuberculin – Phản ứng Mantoux. Năm 1890, Rober Koch đã phát hiện ra Tuberculin, là một chất lọc từ canh thang nuôi cấy vi khuẩn lao. Đến năm 1926, F.B.Seibert đã thành công trong việc chiết xuất ra được những thành phần protein tinh khiết của Tuberculin là PPD (Purified Protein Derivative – dẫn xuất tinh khiết protein) [25]. Hiện nay các loại được dùng phổ biến là PPDS của Mỹ, IP48 của Pháp, tuy nhiên loại Tuberculin được WHO coi là chuẩn dùng trong điều tra dịch tễ học là Tuberculin PPDRT23 của Đan Mạch sản xuất. Phản ứng Tuberculin dương tính là một thí dụ cho phản ứng miễn dịch type 4, phản ứng quá mẫn muộn type 4: Kháng nguyên được tiêm trong da được các tế bào trình diện kháng nguyên có mặt ở vùng da tiêm nuốt và trình diện trên bề mặt của chúng. Nếu hệ thống miễn dịch có tiếp xúc với vi khuẩn lao trước đây, các tế bào T trí nhớ miễn dịch sẽ được huy động đến nhận biết các kháng nguyên được trình diện này và hoạt hóa các phản ứng viêm đặc trưng bởi sự tiết các cytokines, quan trọng nhất là IFN-gamma, và các đặc trưng bằng hiện tượng sưng đỏ tại chỗ tiêm [102]. Phản ứng Tuberculin chỉ có giá trị chẩn đoán với điều kiện trước đấy được biết bệnh nhân đã được thử có kết quả âm tính. Phản ứng Mantoux: Có nhiều kỹ thuật làm phản ứng Tuberculin như rạch da, đâm nhiều mũi qua da, dán trên da .Nhưng kỹ thuật tiêm trong da do Mantoux đề xướng vào năm 1908 đã được sử dụng hơn một thế kỷ qua ở hầu hết các nước trên thế giới [02], [92].
22 Kỹ thuật làm phản ứng Mantoux: Dùng loại bơm tiêm chuyên dụng, tiêm dung dịch Tuberculin vào trong da (vị trí 1/3 trên mặt trước ngoài cẳng tay) với liều lượng 1/10 ml (tương đương với 5 hoặc 10 đơn vị Tuberculin tùy từng loại). Đọc kết quả sau 72 giờ, đo đường kính của nốt sẩn theo chiều vuông góc với trục của cẳng tay (tính bằng mm). Khi đọc kết quả phản ứng cần ghi kích thước cụ thể cho từng người. Phản ứng Mantoux dương tính chỉ biểu hiện tình trạng nhiễm vi trùng lao của cơ thể, song khi phản ứng âm tính cũng không thể phủ nhận bệnh nhân đã nhiễm lao [25]. Phản ứng Mantoux âm tính thường gặp trong những tình huống sau: - Suy giảm miễn dịch - Suy dinh dưỡng - Nhiễm vi rút (sởi, cúm ) - Dùng corticoide kéo dài - Người già Phản ứng Mantoux dương tính có thể giúp định hướng chẩn đoán trong những trường hợp lao phổi AFB (-), lao trẻ em, lao ngoài phổi có tiếp xúc với nguồn lây. Phản ứng Mantoux thường được dùng cho những mục đích sau: - Về lâm sàng để xác định có nhiễm lao - Phát hiện những nhóm có nguy cơ cao dễ bị bệnh lao - Đánh giá kỹ thuật tiêm chủng BCG - Xác định tổng số nhiễm lao và số nhiễm lao mới (CTCL) 1.4. PHƠI NHIỄM LAO NGHỀ NGHIỆP Phải chờ đến khi Wells, Ridley và những cộng sự của họ chứng minh được rằng trực khuẩn gây bệnh lao được lây truyền theo đường không khí , lao mới được xếp vào một trong hơn 15 bệnh lây truyền theo đường thở cho nhân viên y tế [112], [128]. Nguy cơ bị nhiễm khuẩn liên quan đến nghề
23 nghiệp là một phần không thể tránh khỏi trong công tác tiếp xúc và chăm sóc bệnh nhân hàng ngày.Tuy nhiên, những rủi ro nghề nghiệp này đã không được chú ý đúng mức mặc dù nhiều nhân viên y tế, sau khi mắc lao đã bị chết [125]. Ở Mỹ, tình hình nhiễm lao ở các nhân viên y tế đã được báo cáo trong nhiều nghiên cứu [44], [110], [128]. Những điều tra cơ bản được tiến hành trong những năm 1940 đã cho thấy nguy cơ lây nhiễm trong cộng đồng này là rất cao. Những nghiên cứu đại diện tiến hành trên 1053 học viên trung cấp y tế đã chỉ ra 906 người có phản ứng tuberculin dương tính (86%) và 209 người khác bị mắc lao (20%). Trong những nghiên cứu mới đây, tỷ lệ những người có nguy cơ tiếp xúc với trực khuẩn lao tại nơi làm việc cao nhất là nhân viên vệ sinh bệnh phòng, giặt quần áo bệnh nhân, nhân viên nhà ăn (khoảng 8%/năm) và y tá (từ 4% – 8%/năm) [46], [47]. Trong những vụ dịch, từ 20% đến 50% những nhân viên mẫn cảm bị nhiễm lao đã trở thành bệnh nhân lao [38], [53]. Nhiễm trùng liên quan đến công việc được ghi nhận đối với nhân viên y tế làm việc ở khoa truyền nhiễm, đặc biệt trong các phòng xét nghiệm vi khuẩn gây bệnh [27], [28]. Một số nghiên cứu trong lĩnh vực này đã chỉ ra rằng nguy cơ nhiễm vi khuẩn lao ở những nhân viên phòng xét nghiệm cao hơn từ 3 đến 5 lần những nhân viên làm việc ở những bộ phận khác trong cùng một cơ sở y tế [50], [54]. Đường lây truyền vi khuẩn lao đối với nhân viên y tế là qua đường thở. Những địa điểm có đông bệnh nhân như phòng khám, phòng bệnh, phòng chụp X quang và xử lý bệnh phẩm như phòng xét nghiệm, phòng đọc kết quả cũng là những nơi có nguy cơ ô nhiễm không khí cao [33]. Hít phải những giọt chứa trực khuẩn lao được tạo thành trong không khí là cách lây truyền chủ yếu đối với nhân viên y tế. Những hạt có đường kính nhỏ hơn 5 µm, có thể chỉ chứa 1 đến 2 trực khuẩn lao sống, có thể bay lơ lửng trong không khí nếu không có hệ thống thông gió hoặc lọc khí [38].
24 Những giọt nhỏ này sẽ vào phổi theo đường thở và gây ra những vị trí nhiễm tiên phát. Do liều gây nhiễm lao rất nhỏ, chỉ một vi khuẩn lao đã có thể gây nhiễm nên hít vào bất kỳ một giọt khí dung chứa vi khuẩn lao nào cũng sẽ gây nhiễm vì vậy những giọt khí dung này đều có thể là nguồn lây lao mới. Những người tiếp xúc liên tục lâu dài với nguồn lây sẽ có nguy cơ nhiễm lao, ước tính với tỷ lệ nhiễm là khoảng 22%. Sự lây truyền chỉ có thể xẩy ra khi tiếp xúc với bệnh nhân lao tiến triển [54]. Ngoài ra còn các kiểu lây truyền khác như lây từ tiêu bản phổi giải phẫu tử thi chứng tỏ khả năng lây nhiễm lao khi tiếp xúc với tiêu bản tổ chức đã được cố định trong formaline [69]. Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ người mắc lao cao nhất thế giới, mục tiêu chung của Chương trình Chống lao Quốc gia là: Giảm 50% số lượng bệnh nhân lao hiện mắc và 50% số bệnh nhân lao phổi AFB(+) mới vào năm 2015 nhằm làm giảm tỷ lệ chết và tỷ lệ nhiễm lao. Giảm tối đa nguy cơ kháng thuốc của vi khuẩn lao bằng duy trì kết quả khỏi bệnh cao trên 85% bằng hoá trị liệu ngắn ngày có kiểm soát (DOTS). Để thực hiện được các mục tiêu đề ra , hàng vạn cán bộ đang công tác tại các cơ sở y tế như Bệnh viện Lao và Bệnh phổi, khoa lao hàng ngày phải tiếp xúc với hàng chục lượt bệnh nhân lao mới, đối mặt với nguy cơ nhiễm lao hàng giờ. Các cơ sở y tế này cũng trở nên một môi trường ô nhiễm vi khuẩn lao. Theo dõi tình hình bệnh tật ở Châu Âu từ thế kỷ 18 tới nay cho thấy, sự cải thiện lớn lao tình hình sức khoẻ và thủ tiêu về cơ bản các bệnh truyền nhiễm là do có các biện pháp vệ sinh môi trường, cung cấp nước sạch và ý thức vệ sinh. Điều này khẳng định, sự thủ tiêu các bệnh dịch (hiện nay đang phổ biến ở các nước kém và đang phát triển) không phải chủ yếu do kết quả của chữa bệnh mà là do môi trường được làm trong sạch. Có thể dẫn ra ví dụ
25 sau đây về tình hình bệnh lao ở Châu Âu: đầu thế kỷ 19, tỷ lệ chết của bệnh này trên 1 triệu dân là 4.000, vào năm 1940 chỉ còn 500, trong khi đó thuốc chống lao có vào năm 1947 và vắc xin phòng lao có vào năm 1953. Tuy nhiên, cho tới nay, vẫn chưa có một nghiên cứu cụ thể nào về vấn đề ô nhiễm vi khuẩn lao trong môi trường bệnh viện tại Việt Nam. Các nhân viên y tế làm việc trong các bệnh viện hoặc phòng khám lao sẽ có nguy cơ cao lây nhiễm bệnh vì họ phải thường xuyên tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân. Làm các thủ thuật y tế như nội soi tiêu hóa, soi họng cho những bệnh nhân lao chưa được phát hiện hoặc điều trị khả năng lây là rất cao. Vì vậy, cần phải tiến hành những nghiên cứu ở lĩnh vực này nhằm đưa ra được những sách lược kiểm soát việc lây lan bệnh lao nhằm hoàn thiện biện pháp bảo vệ các nhân viên y tế giúp họ yên tâm hơn trong quá trình làm việc. 1.5. DỰ PHÒNG PHƠI NHIỄM LAO NGHỀ NGHIỆP Có 3 biện pháp chính để chương trình phòng ngừa phơi nhiễm lao có hiệu quả, đó là biện pháp hành chính, kiểm soát môi trường và bảo vệ đường hô hấp cá nhân [38], [48], [49], [120]. 1.5.1. Kiểm soát hành chính nhằm làm giảm phơi nhiễm cho nhân viên, bao gồm: Nhận biết bệnh nhân có nguy cơ bị mắc lao và những thủ thuật có nguy cơ. Bệnh nhân có nguy cơ – triệu chứng lâm sàng phù hợp với lao, bệnh nhân suy giảm miễn dịch (như bệnh nhân HIV dương tính) có tiếp xúc với bệnh nhân lao. Thủ thuật có nguy cơ cao là các thủ thuật tạo những giọt bắn trong không khí như lấy đờm, soi phế quản Cần phải cách ly bệnh nhân nghi ngờ hoặc đã chẩn đoán mắc lao và thực hiện những quy trình để giảm thiểu nguy cơ lan truyền các giọt bắn. Khu vực phòng khám: chọn bệnh nhân lao cách ly ở khu vực khám hoặc chờ riêng. Cho bệnh nhân lao được “phục vụ ưu tiên” để giảm thời gian họ ngồi
26 chờ ở phòng chờ hay khu khám bệnh. Giảm thời gian phải xếp hàng hay tụ tập gần nhau, trong lúc ngồi chờ vào khám, để bệnh nhân ngồi chờ ở những nơi thông khí tốt hơn. Khu vực nội trú: cách ly bệnh nhân lao ở phòng riêng, ở cách xa nơi bệnh nhân không phải lao. Sắp xếp những thủ thuật cho bệnh nhân lao vào cuối ngày hay vào những thời điểm ít bận rộn nhất (chẳng hạn như lúc vắng bệnh nhân). 1.5.2. Kiểm soát môi trường. Loại kiểm soát này nhằm: làm giảm nồng độ của các giọt khí nhiễm khuẩn xung quanh bệnh nhân lao; - Thực hiện thông khí sao cho lưu thông không khí được tối đa và hòa loãng những giọt khí nhiễm khuẩn. Có hai cách: Cách đơn giản: thông khí tự nhiên với không khí lưu thông qua cửa sổ mở. Khu vực bệnh nhân phải mở vào môi trường và cấu trúc thiết kế sao cho khí bên trong di chuyển ra bên ngoài. Cách phức tạp: thông khí cơ học bằng hệ thống quạt hút; phòng cách ly áp lực âm, lọc khí hoặc tia khử trùng cực tím. Luôn luôn hướng luồng khí từ bệnh nhân lao ra môi trường bên ngoài. - Cải thiện cơ sở và môi trường bệnh viện qua việc cải thiện quản lý chất thải, làm sạch và khử khuẩn môi trường, thiết bị. + Chiếu tia cực tím diệt khuẩn là phương pháp làm sạch không khí có thể dùng để hỗ trợ các biện pháp kiểm soát lao khác. Đèn cực tím có hiệu quả tốt hơn nếu được lắp đặt ở ống thông khí vì tạo ra sự phát tia cực tím mạnh và vì ánh sáng cực tím ở trong ống nên nguy cơ phơi nhiễm với tia cực tím được giảm hay loại trừ. Gắn thêm đèn cực tím vào ống thông khí hay ở những khu vực nguy cơ cao như phòng soi phế quản, phòng sinh thiết hay những khu vực nơi có thể gặp những bệnh nhân lao. Chưa có tài liệu nào khuyến khích sử
27 dụng đèn cực tím ở phòng bệnh nhân, ánh sáng cực tím có thể gây bỏng da và mắt, trên lý thuyết có thể gây đục thủy tinh thể và ung thư da. 1.5.3. Vật dụng bảo vệ hô hấp cá nhân. Vật dụng bảo vệ hô hấp cá nhân nhằm bảo vệ nhân viên y tế không hít phải những phân tử nhiễm trùng tại những nơi mà kiểm soát môi trường và hành chính không đủ để làm giảm nồng độ phân tử nhiễm khuẩn . Sử dụng khẩu trang hô hấp (Mask N95 hoặc P97, P100) trong phòng cách ly, hoặc trong khi làm những thủ thuật có xâm lấn. Người mang khẩu trang cần sử dụng đúng cách để bảo vệ được chính mình. 1.5.4. Cải thiện chương trình phòng ngừa phơi nhiễm nghề nghiệp. Bảo vệ nhân viên y tế qua chương trình phòng ngừa phơi nhiễm nghề nghiệp là rất quan trọng. Cần quan tâm đến vấn đề phơi nhiễm nghề nghiệp với các bệnh nguyên đường máu như HIV, viêm gan B,C và đường hô hấp như lao. Các biện pháp bao gồm: 1.5.4.1. Nâng cao kiến thức cho nhân viên y tế: Các điều tra cho thấy rằng hiểu biết về nguy cơ lan truyền bệnh cũng như về kiểm soát nhiễm bệnh vẫn còn hạn chế trong số nhân viên y tế. Như thế, giáo dục và đào tạo cho nhân viên y tế về những phơi nhiễm do nghề nghiệp và hướng dẫn các biện pháp thực hiện an toàn là cần thiết. Triển khai hệ thống báo cáo phơi nhiễm do nghề nghiệp 1.5.4.2. An toàn phòng xét nghiệm lao. Nguy cơ nhiễm lao của nhân viên các phòng xét nghiệm có hơn 3 – 5 lần so với những nhân viên làm công tác khác trong cùng một đơn vị công tác (nhân viên hành chính, thư ký ) Chính vì vậy, chúng ta cần phải biết những quy trình nào, thao tác nào tạo ra các “hạt mù” để có biện pháp phòng ngừa làm giảm hạt mù hoặc giám sát được điều đó. Trong trường hợp trực khuẩn lao, các hạt mù nguy hiểm nhất là nơi phát sinh ra các phần tử nhỏ (≤ 5µm),
28 các phần tử này tồn tại, lơ lửng, di động tự do trong phòng xét nghiệm và có thể gây nhiễm bệnh ở những nơi khá xa so với vị trí phát sinh ra chúng. Một số thao tác trong phòng xét nghiệm tạo ra “hạt mù” mà phần lớn < 5 µm như: Mở nắp lọ đờm; Dàn tiêu bản; Mở nắp hộp đựng bệnh phẩm; Mở nắp ống nghiệm đựng chất dịch; Lắc bệnh phẩm bằng tay hoặc bằng máy để thuần nhất đờm; Ly tâm, vỡ ống nghiệm trong khi ly tâm; Vỡ đổ các hộp đờm; Vỡ ống bệnh phẩm nuôi cấy vi khuẩn lao; Trộn dịch bằng pipette; Loại bỏ nước nổi sau ly tâm. Để giảm bớt tình trạng lây nhiễm trong phòng xét nghiệm, các biện pháp an toàn dựa trên nguyên tắc sau: - Giảm bớt sự tạo thành các hạt mù - Bảo quản các bệnh phẩm tạo ra hạt mù - Diệt vi khuẩn tồn tại trong hạt mù Sắp xếp phòng làm việc và giữ đúng trật tự đã sắp xếp. - Phòng có diện tích từ 15 – 18 mét vuông, có đầy đủ trang thiết bị cần thiết để xử lý bệnh phẩm từ lúc nhận đến lúc có kết quả cuối cùng. - Đường thải không khí ra ngoài phải ở mái cạnh nhà, nơi khả năng khí quay trở lại là tối thiểu. - Hệ thống nước thải thuốc nhuộm đảm bảo kín. - Có khu vực dành riêng để lồng kính bảo vệ. - Mọi thao tác có thể tạo thành hạt mù gây nhiễm đều phải làm trong lồng kính (mở nắp lọ đờm làm tiêu bản, cấy bệnh phẩm ). Đường thoát không khí của lồng kính an toàn phải đi qua màng lọc HEPA (High – Efficiency – Partiailate – AIR) để lọc các phần tử trong không khí trước lúc khí thoát ra ngoài. Lây theo đường không khí không phải là đường lây lao duy nhất. Hàng loạt quy trình tiến hành để chẩn đoán bệnh do trực khuẩn hay để phân lập vi
29 khuẩn đều có cơ hội gây lây nhiễm bất thường. Vết cắt hay vết xước ở da không buộc băng bó cũng có diện tích tiếp xúc với khu vực nhiễm khuẩn. Một người làm việc trong khoa vi sinh có thể gặp tai biến do khi cấy vi khuẩn bằng kim và bơm tiêm bất chợt chọc qua da, hoặc do các mảnh thủy tinh vỡ có nhiễm khuẩn. Còn các cách lây nhiễm khác tuy ít nhưng vẫn có vì vậy mọi diện tích và dụng cụ trong phòng xét nghiệm phải được coi là khu vực thường xuyên lây nhiễm. Các bộ phận đó được thường xuyên lau chùi sạch sẽ bằng các phương tiện diệt khuẩn sẵn có: giẻ lau hoặc gạc thấm chất xát trùng, nồi hấp, ánh sáng đèn cực tím. Giữ sạch sẽ nơi làm việc là điều cơ bản của an toàn phòng xét nghiệm. 1.5.4.3. Các biện pháp an toàn. Tủ an toàn sinh học(biosafety cabinet)Trang bị này hết sức cần thiết để giảm khả năng nhiễm khuẩn trong phòng xét nghiệm. Cấu tạo của lồng bảo vệ gồm: Hệ thống màng lọc HEPA: lọc giữ vi khuẩn lại trên màng nên không khí thoát ra ngoài là không khí sạch. Khi màng lọc bẩn (không khí không đi qua được) thì cần thay màng mới. Màng lọc bẩn phải được ngâm vào dung dịch Aldehylformie + Methanol để khử khuẩn trước khi thải bỏ. Quạt ly tâm hút gió: hút không khí đi qua màng lọc. Không khí luôn tràn từ ngoài vào trong lồng bảo vệ nhằm mục đích bảo vệ cho người thao tác kỹ thuật. Cách kiểm tra quạt có hoạt động hay không: đóng cửa ra vào phòng xét nghiệm, bật quạt ly tâm hút gió, để ngọn đèn cồn ở cửa lồng bảo vệ, nếu ngọn đèn tạt nghiêng mạnh về phía trong lồng bảo vệ là quạt ly tâm có chạy, còn ngược lại, nếu ngọn lửa đèn cồn đứng im là quạt không chạy. Cần phải kiểm tra quạt hàng ngày. Hệ thống đén chiếu sáng.
30 Hệ thống đén cực tím UV: Gồm đèn UV trước và sau màng lọc. + Đèn UV trước màng lọc: diệt khuẩn ở mặt bằng lồng bảo vệ. Chỉ bật sau khi kết thúc mọi thao tác trong lồng bảo vệ. + Đèn UV sau màng lọc: bật trong khi thao tác kỹ thuật trong lồng bảo vệ để diệt khuẩn còn sót lại trong không khí sau khi đi qua màng lọc (mặc dù số lượng vi khuẩn này không nhiều) Chú ý: Sử dụng đèn cực tím UV 2 – 4 giờ/ ngày. Khi đèn UV hết tác dụng (sau khoảng 600 giờ) tiến hành thay đèn mới. Khi nguồn sáng giảm xuống dưới 70% so với lúc ban đầu thì thay bóng. Đặt lớp gạc (4 – 6 lớp) hay khăn mặt thấm chất diệt khuẩn (Crezyl 5% hoặc amphyl 3%) trong lúc làm việc trên mặt chỗ làm trong lồng kính; điều này giúp diệt vi khuẩn có trong chất vương vãi trong lồng kính). Các biện pháp an toàn khác - Chuẩn bị dụng cụ đầy đủ, trước khi thao tác một kỹ thuật. - Có bình chứa Crezyl 5% hoặc amphyl 3% ở mọi phòng. Khi gặp tai biến như vỡ ống nuôi cấy, đổ lọ đờm – thì thấm ngay các hóa chất trên và để đó 1 giờ trước khi gắp bỏ đi. - Tất cả các thùng chứa vật liệu, đồ thủy tinh nhiễm bẩn đều phải có nắp đậy. Luôn đảm bảo các thùng này có chất khử khuẩn hoặc nước trước lúc đặt vào nồi hấp. - Dùng các lọ đờm đúng quy định, ống nghiệm, ống ly tâm có nắp xoáy. - Ly tâm: chỉ mở ống nghiệm sau khi ly tâm trong lồng an toàn (để hạn chế sự lan tỏa của hạt mù) - Nồi hấp: để nồi hấp nơi phù hợp để tiệt trùng các vật phẩm bẩn, các vật sử dụng lại hoặc diệt khuẩn trước lúc loại bỏ hay rửa sạch dung lại.
31 (Nếu không có nồi hấp, mọi dụng cụ sẽ được luộc sôi 1000 trong 30 phút) -Không hút chất dịch qua pipette bằng miệng, phải sử dụng máy hút hoặc quả bóp cao su. 1.5.4.4. Các dung dịch sát khuẩn lao: Vi khuẩn lao bền vững hơn các vi khuẩn khác khi tiếp xúc với hóa chất, cho nên thời gian cần để diệt vi khuẩn lao dài hơn, có thể từ vài phút đến hàng giờ tùy thuộc vào thành phần hóa chất. Nhưng không phải dung dịch sát trùng nào cũng có tác dụng diệt vi khuẩn lao. Chỉ sử các dung dịch đã chứng minh bằng thực nghiệm. Các dung dịch sát trùng thường được sử dụng: crezyl 5%, phenol 5%, Lysol 3%, formol 5% - 10% để xông phòng. Để sát trùng tay dung cồn Ethyl 70% sau đó rửa tay lại bằng xà phòng. Ngoài ra có thể dung nước Javel 5 Cl2 để lau chùi, ngâm rửa dụng cụ. 1.5.4.5. Các biện pháp an toàn cho nhân viên. - Được đào tạo về kỹ thuật và quy chế an toàn sinh học. - Thử phản ứng Mantoux 6 tháng/lần. - Chụp X quang cho người có phản ứng Mantoux dương tính. - Trang phục đầy đủ (áo choàng, khẩu trang, găng tay cao su, mũ). Tuy vậy, cần nhớ rằng cho dù trang bị phòng xét nghiệm an toàn đến đâu cũng không bỏ qua việc thao tác kỹ thuật thận trọng, tỷ mỉ và ý thức cảm nhận an toàn của kỹ thuật viên.
32 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu: Bảng 2.1. Xác định đối tượng nghiên cứu Nguồn Môi trường Đối tượng phơi Đối tượng chọn vào lây nhiễm nghiên cứu Nhân viên y tế khu - Bác sỹ vực phòng khám, - Y tá điều dưỡng điều trị, chống - KTV Xét nghiệm nhiễm khuẩn (tiếp - Hộ lý xúc trực tiếp với BN lao) - Kế toán Môi trường bên trong Bệnh viện - Dược sỹ Lao và Bệnh Nhân viên hành - Văn thư phổi Thái Bình chính (tiếp xúc - Lái xe gián tiếp với BN - Bảo vệ lao) - Bác sỹ CĐT - Cán bộ thống kê Bệnh - CB quản lý nhân lao Người nhà bệnh Không chọn nhân Người dân sống liền kề Dân cư sống xung bệnh viện trong vòng bán quanh bệnh viện kính 500 m. Dân cư sống cách Người dân ở một thôn Môi trường bên xa bệnh viện thuộc một xã cách BV 6 ngoài Bệnh viện (nhóm chứng) km. Lao và Bệnh phổi Bác sỹ, y tá điều dưỡng, Bệnh viện Tâm hộ lý, KTV XN, Kế toán, thần Thái Bình Dược sỹ, Văn thư, Lái xe, (nhóm chứng) Bảo vệ, Bác sỹ CĐT, Cán bộ thống kê, CB quản lý
33 Đối tượng nghiên cứu: - Nhân viên y tế đang làm việc tại: Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình; Bệnh viện Tâm thần tỉnh Thái Bình. - Dân cư : Sống xung quanh Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình trong vòng bán kính 500 m Dân cư thôn Thắng Cựu, xã Phú Xuân, TP Thái Bình Tự nguyện tham gia nghiên cứu, hoàn toàn khoẻ mạnh, không mắc các bệnh nhiễm trùng cấp tính hoặc mãn tính, không sử dụng bất cứ một loại thuốc nào tại thời điểm nghiên cứu - Không khí, nước thải, bụi bề mặt trên các thiết bị, dụng cụ của BV. - Sổ sách, báo cáo của bệnh viện. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu : Từ 2002 đến năm 2011. 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu : - Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình - Bệnh viện Tâm thần Thái Bình - Xã Vũ Chính, xã Phú Xuân – thành phố Thái Bình 2.2. Phương pháp nghiên cứu. 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu Sơ đồ nghiên cứu : 1998 2002 2004 2005 2006 2011 Hồi cứu số liệu NC trước CT: Can thiệp: Đánh giá MT Đánh giá Mantoux sau Mantoux của - CBBV Lao và BP - Sắp xếp bố trí sau can thiệp: can thiệp: CBBV LVBP so với BVTT lại phòng, dây - Không khí - Nhóm tiếp xúc trực truyền KCB tiếp với BN lao - Dân cư quanh BV - Bụi bề mặt - Truyền thông - Nhóm tiếp xúc gián - Môi trường (Không - Quệt mũi khí, bụi bề mặt, quệt - VSMT tiếp với BN lao mũi, nước thải) - Tập huấn - Nhóm nghỉ hưu, chuyển công tác
34 Nghiên cứu được tiến hành từ năm 2002 đến năm 2011 và được chia làm ba giai đoạn : 2.1.1.1. Giai đoạn 1(2002) : Nghiên cứu trước can thiệp. Nghiên cứu cắt ngang có so sánh với nhóm chứng và các số liệu trong các nghiên cứu có liên quan (năm 1998) nhằm : - Xác định nguy cơ nhiễm lao, mắc lao của cán bộ và dân cư sống xung quanh Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình (có so sánh với nhóm chứng tương ứng là cán bộ Bệnh viện Tâm thần và dân cư thôn Thắng Cựu xã Phú Xuân) - Phát hiện sự có mặt của trực khuẩn lao trong môi trường bệnh viện ở 2 thời điểm theo mùa (ngày nắng khô và ngày mưa ẩm) - Xác định các yếu tố ảnh hưởng nhằm đề xuất biện pháp can thiệp phù hợp. 2.1.1.2. Giai đoạn 2 (2004 – 2005) : Tiến hành một số biện pháp can thiệp nhằm làm giảm nguy cơ phơi nhiễm với vi khuẩn lao của cán bộ Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình dựa trên kết quả nghiên cứu trước can thiệp. Trên cơ sở phân tích kết quả trước can thiệp, nhóm nghiên cứu đã đề xuất và phối hợp với cán bộ Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình thực hiện một số biện pháp can thiệp trong điều kiện cho phép của Bệnh viện. Các biện pháp can thiệp nhằm vào 3 nhóm đối tượng : - Cơ sở vật chất: Bố trí các phòng làm việc đảm bảo điều kiện thông gió và đủ ánh sáng, lắp đèn cực tím. - Cán bộ Y tế: Tập huấn, sử dụng các biện pháp vệ sinh cá nhân - Bệnh nhân: Quản lý, giáo dục sức khỏe 2.1.1.3 Giai đoạn 3 : Nghiên cứu cắt ngang nhằm đánh giá lại môi trường (2006) và Mantoux cho nhân viên y tế Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình (2011). Bảng 2.2. Các biện pháp can thiệp
35 Nhóm can Nội dung can thiệp Đối tượng can thiệp Thời gian thực thiệp hiện Sắp xếp bàn đón tiếp bệnh Phòng khám bệnh Liên tục nhân, đặt tấm kính chắn. Mở cửa ra vào và cửa sổ Phòng khám, phòng Giờ làm việc Cơ sở vật XN, khoa điều trị chất Lắp đặt và sử dụng đèn PK, phòng XN, 18 giờ tối - 6 giờ cực tím phòng chụp XQ. sáng. Khử khuẩn dụng cụ, đồ đạc đúng quy trình. Sau khi sử dụng Trang phục quần áo blu, Bác sỹ, y tá điều Giờ làm việc mũ, khẩu trang đầy đủ dưỡng, hộ lý. trong quá trình khám, điều trị cho bệnh nhân Rửa tay đúng quy trình, Bác sỹ, y tá điều Sau các thủ Cán bộ y sát trùng bằng cồn Ethyl dưỡng, kỹ thuật viên thuật khám chữa tế 70% sau đó rửa lại bằng xét nghiệm, hộ lý. bệnh, làm xét xà phòng nghiệm. Tắm gội, thay quần áo, Bác sỹ, y tá điều Cuối giờ làm mũ khẩu trang. dưỡng, kỹ thuật viên việc hàng ngày. xét nghiệm, hộ lý. Tập huấn các quy định an Kỹ thuật viên xét toàn sinh học, an toàn nghiệm. phòng xét nghiệm Quy định chỗ ngồi chờ Bệnh nhân Trong thời gian khám bệnh ở nơi thoáng chờ khám bệnh. gió. Thông qua Hội đồng BN Bệnh nhân Tuần 1 lần Bệnh giáo dục ý thức phòng lây nhân bệnh cho những người xung quanh Nhổ đờm đúng nơi quy Thường xuyên định Đeo khẩu trang Thường xuyên
36 2.2.2. Chọn mẫu [13] 2.2.2.1. Chọn nhóm nghiên cứu: Chọn mẫu có mục đích nhằm xác định nguy cơ nhiễm lao của cán bộ Bệnh viện Lao và Bệnh phổi và dân cư sống xung quanh bệnh viện. Chọn nhân viên y tế : Toàn bộ cán bộ Bệnh viện Lao và Bệnh phổi là 72 người. Tuy nhiên tại thời điểm nghiên cứu trước can thiệp, có 4 cán bộ Bệnh viện Lao và Bệnh phổi đi học nên số đối tượng thực sự tham gia nghiên cứu là 68 người. Chọn dân cư Toàn bộ dân cư sống gần Bệnh viện Lao và Bệnh phổi (trong vòng bán kính 500m) gồm 300 người, vì vậy cỡ mẫu của nghiên cứu là 300 người và cỡ mẫu của nhóm chứng cũng là 300 người. 2.2.2.2. Chọn nhóm chứng để so sánh : Chọn nhân viên y tế : Chọn toàn bộ cán bộ Bệnh viện Tâm thần gồm có 72 người. Lý do chọn cán bộ Bệnh viện Tâm thần Thái Bình vào nhóm chứng là vì Bệnh viện này có một số đặc trưng tương tự Bệnh viện Lao và Bệnh phổi như: số lượng cán bộ, cùng là cơ sở điều trị bệnh xã hội, cơ sở vật chất và điều kiện vệ sinh tương tự nhau, cách nhau 3 km. Chọn dân cư Chọn 300 người ở nhóm chứng (xã Phú Xuân) như sau: Chọn ngẫu nhiên 1 xóm trong danh sách 13 xóm của xã Phú Xuân. Sau đó chọn ngẫu nhiên 300 người trong danh sách dân cư của xóm đã được chọn. Dân cư thôn Thắng Cựu, xã Phú Xuân (xã cách Bệnh viện Lao và Bệnh phổi 6 km, có đặc điểm tương tự như xã Vũ Chính là xã có Bệnh viện Lao và Bệnh phổi đóng trên địa bàn về đặc điểm địa lý, kinh tế, văn hóa và xã hội )
37 2.2.2.3. Khảo sát mức độ phân tán trực khuẩn lao trong môi trường trong và ngoài bệnh viện Cỡ mẫu nghiên cứu được tính theo công thức [13], [26]. Với: n: số mẫu p: tỷ lệ tìm thấy vi khuẩn lao trong các mẫu xét nghiệm môi trường. Qua tham khảo tài liệu nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi chưa thấy có nghiên cứu nào đề cập đến tỷ lệ này, trong khi chúng tôi cũng không có điều kiện để làm nghiên cứu thử, do vậy chúng tôi đã giả định là trong nghiên cứu này 20% số mẫu xét nghiệm môi trường sẽ phát hiện ra vi khuẩn lao để đưa vào tính cỡ mẫu và khi điều tra thực tế chúng tôi đã phát hiện ra 21,4% số mẫu xét nghiệm môi trường có chứa vi khuẩn lao, do vậy giả định trên đây của chúng tôi là có cơ sở và cỡ mẫu tính cho nghiên cứu này là đủ lớn. δ: là mức sai số tương đối mong muốn là 0,35 α: mức ý nghĩa thống kê, chọn bằng 0,05 Thay vào công thức ta có 2 0.2 x (1 - 0.2) n= (1,96) x (0.2 x 0.35) = 125 Ở nghiên cứu này chúng tôi lấy cỡ mẫu trước can thiệp là 140, cỡ mẫu sau can thiệp là 74. 2.2.2.4. Thời gian lấy mẫu: - Mẫu được thu thập vào 2 ngày có thời tiết khác nhau, ngày mưa ẩm và ngày nắng, khô. - Mẫu không khí, mẫu bụi bề mặt và mẫu ngoáy mũi nhân viên y tế được lấy vào 2 thời điểm trong ngày: buổi sáng, trước giờ làm việc và buổi chiều cuối giờ làm việc. Riêng mẫu nước thải lấy ở vị trí trước và sau xử lý.
38 2.2.3.Phương pháp thu thập số liệu 2.2.3.1. Mẫu môi trường: Để thu được 100% vi khuẩn có trong mẫu, giấy lọc gelatin được dùng trong thiết bị thu mẫu không khí và các tâm bông lấy mẫu quệt cũng được phủ gelatin trong điều kiện vô khuẩn. - Thu mẫu không khí: 46 mẫu không khí được lấy tại các vị trí: + Khu vực phòng khám: 7 mẫu + Khu vực chụp X-quang: 7 mẫu + Khu vực xét nghiệm: 13 mẫu + Khu vực bệnh phòng (có BN lao phổi AFB dương tính): 7 mẫu + Khu vực hành chính: 4 mẫu + Khu vực sân chơi, vườn: 4 mẫu + Khu vực cổng bệnh viện: 4 mẫu Thiết bị thu mẫu không khí Airport MD8 là thiết bị dùng để kiểm soát phòng sạch trong bệnh viện và các phòng thí nghiệm , sử dụng màng lọc gelatin có giá đỡ Cyrolit, đường lọc 80mm, cỡ lỗ 03 μm, lưu tốc khí cài đặt trong quá trình lấy mẫu là 50m3/phút, thể tích 1000 m3. Như vậy, để lấy một mẫu không khí cần 20 phút. Ưu điểm của gelatin là có thể hoà tan hoàn toàn trong nước và môi trường nuôi cấy vì vậy vi khuẩn thu được là 100%. Thiết bị AirPort MD8 dùng để lấy mẫu không khí
39 - Thu mẫu bụi bề mặt: gồm 68 mẫu quệt bề mặt các đồ vật, dụng cụ tại các vị trí: + Khu vực bệnh phòng: 22 mẫu + Khu vực chụp X-quang: 17 mẫu + Khu vực xét nghiệm: 15 mẫu + Phòng khám: 11 mẫu + Chống nhiễm khuẩn: 1 mẫu + Khoa điều trị: 2 mẫu Kỹ thuật thu mẫu: dùng tăm bông đã được phủ gelatin trong môi trường vô khuẩn quệt lên bề mặt đồ vật nhằm thu được toàn bộ vi khuẩn khi hòa tan trong trong dung dịch đệm. - Mẫu quệt trong mũi nhân viên y tế: gồm 96 mẫu quệt trong mũi nhân viên y tế tại các khoa, phòng: + Phòng xét nghiêm: 9 mẫu + Phòng khám: 6 mẫu + Phòng X-quang: 2 mẫu + Bệnh phòng: 38 mẫu + Phòng hành chính: 12 mẫu Dùng tăm bông đã được phủ gelatin trong môi trường vô khuẩn, đưa sâu vào trong mũi, quệt theo chiều từ trong ra ngoài. - Mẫu nước thải: 2000ml nước thải, bao gồm 1000ml trước xử lý và 1000ml sau xử lý. Nước thải được lọc qua màng 1,2 μm. Sau khi lọc, cắt nhỏ màng, trộn với nước cất, ly tâm hút bỏ nước nổi để thu cặn, thêm vào cặn 01 ml nước siêu sạch. Bảo quản và vận chuyển mẫu: - Mẫu sau khi thu thập, được bảo quản trong các dụng cụ vô khuẩn, đựng trong bình tích lạnh, nhiệt độ 00C.
40 - Mỗi loại mẫu được chia làm 2 phần bằng nhau: một phần tiến hành xác định vi khuẩn lao bằng phương pháp soi trực tiếp và nuôi cấy sau khi xử lý tại Khoa vi sinh - Bệnh viện Phổi trung ương (trước đây là BV Lao và Bệnh phổi Trung ương). Phần còn lại bảo quản ở - 700C để xác định vi khuẩn lao bằng kỹ thuật PCR tại Phòng miễn dịch, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương. 2.2.3.2. Xác định nguy cơ nhiễm lao của nhân viên y tế làm trong Bệnh viện Lao và Bệnh phổi và dân cư xung quanh bệnh viện. - Làm phản ứng Mantoux, kiểm tra sẹo lao. * Tuberculin : Dùng Tuberculin PPD RT23+Tween80 2TU do Viện Huyết thanh quốc gia Copenhagien, Đan Mạch sản xuất. * Kỹ thuật tiêm : - Vị trí 1/3 trên mặt trước ngoài cẳng tay trái, khi tiêm kéo da căng nhẹ theo chiều của kim và theo chiều dọc của cánh tay, tiêm phải đạt yêu cầu mũi tiêm phải làm nổi lên một nốt sần không chảy máu, có bờ rõ rệt. - Liều lượng thuốc đúng 0,1ml đo bằng vạch trên bơm tiêm. * Đọc kết quả phản ứng Mantoux : Đọc kết quả sau 72 giờ, đo đường kính của nốt sẩn theo chiều vuông góc với trục của cẳng tay (tính bằng mm), không tính kích thước của quầng đỏ xung quanh nốt sẩn. - Khám lâm sàng, chụp XQ và xét nghiệm đờm cho những trường hợp nghi ngờ (cho cả nhóm nghiên cứu và nhóm chứng) * Khám lâm sàng phát hiện những triệu chứng nghi lao. * Chụp X quang phổi: phim 30 x 40 chụp thẳng lồng ngực cho những đối tượng có phản ứng Mantoux dương tính từ 10 mm trở lên và những đối tượng có triệu chứng nghi ngờ qua khám lâm sàng * Xét nghiệm đờm: cho những đối tượng có ho khạc kéo dài trên 2 tuần và trên phim chụp phổi có tổn thương nghi ngờ. Soi trực tiếp: làm tiêu bản từ các mẫu bệnh phẩm, nhuộm theo phương pháp Ziehl.Neelsen và đọc kết quả bằng kính hiển vi thường.
41 - Kết hợp phương pháp nghiên định tính để làm rõ kết quả nghiên cứu định lượng : Thảo luận nhóm với 3 nhóm đối tượng, mỗi nhóm gồm 8 người. • Nhóm dân cư là CBCNV. • Nhóm dân cư làm nghề nông • Nhóm CB Bệnh viện Lao và Bệnh phổi - Phỏng vấn sâu: Cán bộ xã sở tại và nhân viên y tế Bệnh viện Lao và Bệnh phổi. 2.2.4. .Các bước tiến hành một số kỹ thuật dùng trong nghiên cứu. 2.2.4.1. Phương pháp soi kính trực tiếp. Chuẩn bị tiêu bản: - Nhỏ một giọt dung dịch bệnh phẩm đã xử lý trên tiêu bản, sau đó dàn mỏng tiêu bản. - Hơ tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn ba lần khoảng từ 3 đến 5 giây để cố định tiêu bản. Kỹ thuật nhuộm Ziehl - Neelsen - Nhuộm: phủ dung dịch fuchsin phenic đã lọc trước lên đầy tiêu bản, hơ nóng đến khi bốc hơi, để 5 phút. Rửa bằng nước đến khi thuốc nhuộm trôi hết - Tẩy màu: + Tẩy lần 1: nhỏ dung dịch cồn acid lên đầy tiêu bản, để trong 3 phút, rửa nước cho sạch hết cồn. + Tẩy lần 2: nhỏ dung dịch cồn tẩy lên đầy tiêu bản, để 1-3 phút, đến khi không nhìn thấy màu, rử nước cho sạch hết cồn tẩy. - Nhuộm nền: + Nhỏ dung dịch Xanh Methylen 0,3% (đã lọc) lên đầy tiêu bản, để trong 60 giây + Rửa nước cho đến khi trôi hết thuốc nhuộm. + Để khô tiêu bản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
42 Cách đọc kết quả khi soi kính: - Soi kính hiển vi thường (vật kính dầu x 100, thị kính x 8) - Đánh giá kết quả: Số lượng AFB soi thấy Đọc kết quả 0/100 vi trường Âm 1-9/100 vi trường Ghi số lượng AFB 10-99/100 vi trường 1+ 1-10/1 vi trường 2+ + > 10/1 vi trường 3 Ảnh 2.1: Vi khuẩn lao nhuộm Ziehl - Neelsen 2.2.4.2. Phương pháp nuôi cấy (tiến hành tại khoa Vi sinh, Bệnh viện Phổi Trung ương) Dụng cụ và hóa chất - Dung dịch Natri hydroxit (NaOH) 4% - Nước muối sinh lý 0,9%
43 - Chất dinh dưỡng ODAC: Bovine abumin, Dextroza, Catalaza, acid oleic - Hỗn hợp kháng sinh PANTA: Polymixin B, Amphotericin B, acid nalidixic, Trimethoprim, Azlocillin - Dung dịch fuchsin phenic o,3% - Dung dịch cồn acid 25% - Dung dịch XanhMethylen - Ống ly tâm 50ml - Eppendorf 1,5ml - Môi trường Chuẩn bị bệnh phẩm - Mẫu không khí (gelatin): cho mẫu vào một ống 50ml có nắp xoáy, thêm 03ml nước muối sinh lý, ngâm trong 15 phút, sau đó lắc cho đến khi tan hoàn toàn. - Mẫu tăm bông: cho vào ống chứa mẫu 03ml nước muối sinh lý, ngâm 15 phút, lắc thật kỹ, sau đó dung pipette Pasteur hút hết dung dịch mẫu sang 1 ống 50ml vô khuẩn. - Nước thải: cho 2,5ml nước muối sinh lý, 500µl nước thải sau xử lý vào 1 ống 50ml có nắp xoáy, ngâm 15 phút, lắc kỹ. Xử lý bệnh phẩm - Thêm 1 thể tích NaOH 4% bằng với thể tích bệnh phẩm đựng trong ống nghiệm. - Lắc trên máy lắc cho đến khi bệnh phẩm tan ra hoàn toàn. Để ống nghiệm đứng thẳng 15 phút ở 370C để khử tạp khuẩn. - Thêm 40ml nước muối sinh lý, ly tâm 15 phút (3000 vòng/phút) - Hút bỏ nước nổi, thu cặn.
44 - Thêm 01ml nước muối sinh lý, lắc kỹ. Dung dịch này để cấy vào môi trường Loeweinstein – Jensen, môi trường MGIT và nhuộm Ziehl – Neelsen để tìm vi khuẩn lao. Nuôi cấy trên môi trường Loeweinstein – Jensen: - Cấy vào môi trường: + Cấy vào môi trường Loeweinstein – Jensen mỗi ống 5 giọt cặn đã trung hòa, láng đều trên bề mặt của mỗi ống môi trường. + Để ống môi trường nằm nghiêng trên giá nằm. + Giữ ở nhiệt độ 35 – 370C (mở lỏng nắp 1 tuần để làm khô và cung cấp đủ không khí cho nuôi cấy vì vi khuẩn lao là vi khuẩn hiếu khí). + Khi bề mặt môi trường đã khô, đóng chặt nắp tiếp tục ủ ấm từ 4-8 tuần. - Đọc kết quả: sau 3 ngày, 7 ngày, 4 tuần và 8 tuần. Đọc sau 3 ngày để bỏ đi những ống nuôi cấy bị nhiễm trùng, sau 7 ngày để phát hiện khuẩn lạc mọc nhanh, sau 4 tuần để phát hiện khuẩn lạc mọc chậm, sau 8 tuần không thấy có khuẩn lạc mọc trên môi trường thì mẫu âm tính. - Ghi kết quả: + Âm : không có khuẩn lạc. + + 1 : 1 – 200 khuẩn lạc, ghi số khuẩn lạc (ví dụ +12). + 2+ : ½ môi trường khuẩn lạc mọc dày không đếm được, tương ứng 200 – 500 khuẩn lạc. + 3+ : 3/4 môi trường khuẩn lạc mọc dày không đếm được, xấp xỉ 500 – 2000 khuẩn lạc. + 4+ : khuẩn lạc mọc dầy đặc toàn bộ ống môi trường, xấp xỉ 2000 khuẩn lạc. - Khi nuôi cấy có khuẩn lạc mọc, làm phản ứng sinh vật hóa học để định danh vi khuẩn mọc trên môi trường (Niacin)
45 Ảnh 2.2: Nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trường Loeweinstein - Jensen Nuôi cấy trên môi trường MGIT + Thêm 0,5ml ODAC (chất dinh dưỡng) và 0,1ml PANTA (hỗn hợp kháng sinh) vào ống môi trường MGIT. + Lấy 0,5ml bệnh phẩm đã xử lý cấy vào ống môi trường MGIT. + Đóng chặt nút, lắc trộn đều, giữ ở tủ ấm 370C. Đọc và ghi kết quả: + Đọc kết quả hàng ngày bằng đèn cực tím có bước song 365 nm, bắt đầu từ ngày thứ 2 sau nuôi cấy. + Kết quả âm tính: ánh sáng huỳnh quang yếu hoặc không có (tiêp tục kiểm tra hàng ngày cho tới 8 tuần mới được kết luận âm tính). + Kết quả dương tính: ánh sáng có màu vàng da cam hoặc được phát hiện bởi độ đục không đồng nhất hay những hạt nhỏ trong môi trường nuôi cấy. + Các mẫu dương tính được tiếp tục làm phản ứng vi sinh vật hóa học để định danh vi khuẩn (Niacin).
46 Ảnh 2.3: Nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trường MGIT 2.2.4.3. Thử nghiệm tích luỹ niacin để định danh vi khuẩn lao. Nguyên lý: Tất cả các vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp niacin, nhưng chúng cũng có enzyme chuyển hóa niacin thành niacin ribonucleotide, vi khuẩn lao không có enzyme chuyển hóa, nên sản phẩm này được tích lũy trong môi trường nuôi cấy và có thể phát hiện bằng phản ứng hóa học với cyanogienbromur khi có mặt của aniline sẽ tạo phức hợp màu vàng hoàng yến nhận biết được bằng mắt thường. Vì vậy xác định niacin tích lũy trong môi trường nuôi cấy là một thử nghiệm rất có giá trị để nhận biết vi khuẩn lao. Dụng cụ và hóa chất: - Anilin tinh khiết. - Cyanogien bromide 10%. - Dụng cụ vô khuẩn: ống nghiệm cỡ 12, Pipette Pasteur. Các bước thực hiện: - Nhỏ vào ống nuôi cấy dương tính (42 ngày) 1ml nước cất vô trùng. Để nước ở một độ nghiêng sao cho nước phủ kín bề mặt nuôi cấy, giữ ở 370C trong 20 phút. - Hút hết huyền dịch này cho vào một ống nghiệm vô trùng. - Cho 5 giọt Anilin vào các ống phản ứng và ống chứng.
47 - Thêm 01ml cyanogiens bromide 10%, để 5 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Đọc kết quả: - Phản ứng dương tính: có màu hoàng yến. - Phản ứng âm tính: không có sự đổi màu. - Chứng dương tính: chủng H37Rv. - Chứng âm tính: chủng Mycobacteria avium. 2.2.4.4. Kỹ thuật PCR phát hiện vi khuẩn lao (thực hiện tại phòng Miễn dịch, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương) Tách ADN của vi khuẩn lao trong mẫu (theo phương pháp Boom) Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên nguyên tắc dung Guanidin thiocyant (GuSCN) để ly giải hoạt tính nucleaza, các ADN trong mẫu sẽ bám vào các hạt Silica, nhờ đó phá vỡ tế bào và tinh khiết được ADN từ mẫu bệnh phẩm. Hóa chất phản ứng: - Huyền dịch silica. - Dung dịch ly giải L6: 5M GuSCN; 50mM Tris-HCL, pH6,4; 20mM EDTA, pH8; 0,1% Triston X-100. - Dung dịch rửa L2: 5M GuSCN; 50 mM Tris-HCL. - Dung dịch rửa etanol 70%. - Dung dịch acetone. - Dung dịch TE: 10mM Tris-HCL và 1mM EDTA pH8,3. - ProK-Prep: protein K/detergient. Chuẩn bị bệnh phẩm: - Mẫu không khí (gelatin): hòa mỗi mẫu với 3ml nước siêu sạch, lắc kỹ cho đến khi tan hoàn toàn. - Mẫu tăm bông gelatin: cho 600µl nước siêu sạch vào các eppendorf đựng các mẫu tăm bông, lắc kỹ cho gelatin cố định vi khuẩn được bọc ngoài các tăm bông tan hoàn toàn.
48 - Mẫu nước thải: lấy nước thải sau xử lý. - Chứng dương: chủng H37Rv. - Chứng âm: nước siêu sạch. Các bước tiến hành: - Cho 100 µl mẫu, 10 µl ProK-prep vào một eppedorf vô khuẩn, ủ 560C trong 2 giờ. - Trong 1 tube Eppedorf nắp khóa 1,5ml, cho vào 900 µl L6, 30 µl Silica và 100 µl bệnh phẩm đã được xử lý với ProK-prep. Voltex hỗn dịch này và sau đó lắc ngang 100rpm hay lắc tay úp ngửa trong 10 phút. Voltex lần nữa trong 5 giây và ly tâm 13.000 rpm trong 15 giây. - Dùng máy hút chân không hút bỏ phần nước nổi. Để tránh mất Silica, chừa lại khoảng 10 µl trên lớp Silica. - Rửa 2 lần, mỗi lần với 01ml đễm rửa L2. - Rửa tiếp 2 lần, mỗi lần với 01ml etanol 70%, sau đó 1 lần với 01ml acetone. - Hút bỏ phần nước nổi sau đó làm khô Silica ở 560C trong khoảng 10 phút trong máy ủ nhiệt. - Thêm 60µl đệm TE. Voltex cho đến khi Silica tan hoàn toàn. Ủ ở 560C trong khoảng 10 phút. Ly tâm 13.000rpm trong 2 phút, hút cẩn thận 40-50µl dịch nổi vào một tube Eppedorf mới. - Thêm 40µl TE vào cặn Silica. Voltex, ủ 10 phút ở 560C, ly tâm 13.000rpm trong 2 phút, hút cẩn thận 20 – 30 µl dịch nổi vào tube trước đó để có dung dịch cuối cùng. Tiến hành phản ứng PCR (theo phương pháp của A.H.J.Kolk) Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên sự khuyếch đại một đoạn ADN kích thước 249bp nằm trên đoạn chèn IS 6110 của Vi khuẩn lao, cặp đoạn mồi INS2/Pt18. Hỗn hợp phản ứng:
49 Sử dụng bộ kít chuẩn TB PCR kít (Nam Khoa, Việt Nam) gồm các thành phần: PCR buffer, Tag polymerase, dNTP, cặp đoạn mồi INS2/Pt18 đặc hiệu cho IS 6110 của Vi khuẩn lao (cho sản phẩm khuyếch đại 249bp), UDG và dUTP (giữ ở -200C cho đến khi dùng). Cho mẫu vào ống phản ứng: - Cho 10 µl dịch tinh khiết ADN từ bệnh phẩm vào ống PCR chứa 40 µl hỗn hợp phản ứng. - Chứng dương: chủng H37Rv. - Chứng âm: dung dịch TE. Chạy chương trình luân nhiệt gồm: - Bước 1: 400C trong 10 phút. - Bước 2: lặp lại 40 lần chu kỳ sau: 940C trong 1,5 phút; 650C trong 2 phút; 720C trong 3 phút. - Bước 3: 720C trong 30 phút. Phát hiện sản phẩm PCR qua điện di: Đun agaroza 2% (dung dịch TBE 10X: 2,5ml; nước siêu sạch: 50ml; agaroza: 1g) bằng lò vi song. Để hạ nhiệt độ đến 560C, cho 2 µl Ethidium bromide nồng độ 10mg/ml, lắc đều, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch TBE 0,5. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 94V, cho đến khi loading buffer chạy cách giếng 3cm. Quan sát trên máy soi gel và chụp ảnh. Do PCR có độ nhạy cao (có thể phát hiện được 10fg tương đương 1-3 vi khuẩn trở lên) nên kết quả cần được phân tích, đánh giá so với chứng âm (chỉ có dung dịch phản ứng) và chứng dương (ADN của Vi khuẩn lao). Bệnh phẩm có kết quả PCR dương tính nếu vạch đặc hiệu của đoạn ADN có độ dài là 249bp.
50 2.4.4.5. Kỹ thuật RT – PCR khuyếch đại trình tự 16S rARN, ELISA phát hiện vi khuẩn lao sống. Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên sự phiên mã ngược một đoạn ARN từ rARN của Mycobacterium thành cDNA rồi sau đó dung PCR khuyếch đại cDNA thành các sản phẩm có kích thước 208bp (cặp mồi thứ 1) và 461bp (cặp mồi thứ 2). Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hai cặp mồi khác nhau để khuyeesch đại 16S rARN của vi khuẩn nói chung (sử dụng cho các mẫu thu thập trước can thiệp) và của Vi khuẩn lao complex nói riêng (dùng cho các mẫu thu thập sau can thiệp). Mồi và mẫu dò (probe) dùng cho phản ứng PCR-ELISA: 1) 16SF: GRG RTA CTC GAG TGG CGA AC 16SR: GGC CGG CTA CCC GTC GTC Mồi được thiết kế dựa trên trình tự mã hóa cho gien 16S rARN của vi khuẩn cho sản phẩm PCR có kích thước 208bp 2)16Sf: 5’TAATACCGGATAGGACCACGG 3’ 16Sr: 5’ GCGACGCTCACAGTTAAGCCGTG 3’ Mồi được thiết kế dựa trên trình tự mã hóa gien 16S rARN ở vùng đặc hiệu cho M.complex, cho sản phẩm PCR có kích thước 461bp. Probe: Biotinated-ACC ACA AGA CAT GCA TCC CG, dặc hiệu cho Vi khuẩn lao 16S rARN. .Tách chiết ARN của vi khuẩn lao: - Hóa chất phản ứng: sử dụng kít tách chiết ARN của Qiagien-Mỹ Bộ Kít gồm: đệm TE, pH8.0; đệm RLT; đệm RPE; đệm RW1; Ethanol (96 – 100%); nước RNase-free. - Các bước tiến hành: + Ly tâm 12.000rpm trong 10 phút ở 40C, loại nước nổi.
51 + Cho 100µl đệm TE chứa lysozym (3mg/ml) vào mẫu, để 10 phút ở nhiệt độ phòng. + Bổ sung 350µl đệm RLT, trộn mẫu. Ly tâm 12.000rpm trong 2 phút, lấy nước nổi cho vào tuýp mới. + Cho vào 50µl ethanol để hòa tan, trộn đều bằng pipette. + Lấy 700µl mẫu thu được cho vào tuýt 2ml. Ly tâm 10.000rpm trong 15 giây, loại nước. + Cho vào 700µl đệm RW1, ly tâm 10.000rpm trong 15 giây, loại nước. + Tiếp tục bổ sung 500µl đệm RPE, ly tâm 10.000rpm trong 15 giây, loại nước. + Cho vào 500µl đệm RPE, ly tâm 10.000rpm trong 2 phút, loại nước + Bổ sung 50µl nước RNase-free, ly tâm 10.000rpm trong 1 phút. Xử lý ADN còn lẫn trong ARN + 10µl đệm DNA, 5µl RNase inhibitor, 10µl DNase; ủ ở 370C trong 30 phút. + Bổ sung 6µl EDTA (25µM) ủ ở 700C trong 10 phút, nhằm phá hủy DNase còn lại. Phản ứng RT-PCR: - Phản ứng RT: cho vào mỗi ống PCR 10µl dung dịch ARN, 4µl đệm PCR, 10pmol mồi đặc hiệu cho phiên mã ngược trình tự mARN của Vi khuẩn lao, 1µl dNTP (40µM), 0.5µM BSA, 1µM RNase inhibitor, 2.5U reverse trancriptaza trên tổng số 20µl dung dịch phản ứng; ủ 420C trong 1 giờ. - Phản ứng PCR: phương pháp PCR sử dụng digoxigienin dUTP. Thành phần phản ứng bao gồm 1,5mM MgCl2 , 0,2µM mồi 16S R, 200µM dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), 1,5 đơn vị tag polymerase, 5µl dịch cADN mẫu, 2,4nmol diogoxigienin-dUTP, bổ xung nước cất vô trùng vừa đủ 50µl dung dịch phản ứng. + Chứng dương: chủng H37rv + Chứng âm: nước DEPC (nước đã được xử lý RNase) + Chương trình PCR
52 Bước 1: 940C trong 10 phút Bước 2: lặp lại 35 chu kỳ sau: 940C trong 1,5 phút, 660C trong 2 phút, 720C trong 3 phút Bước 3: 720C trong 20 phút Cặp mồi 16Sf-16Sr được thiết kế để nhân bản trình tự ADN có kích thước 461bp nằm trong vùng trình tự mã hóa cho gien 16S rARN của vi khuẩn. Qua tính toán, dựa trên nhiệt độ biến tính (Tm) của cặp mồi, chúng tôi sử dụng nhiệt độ lai trong phản ứng PCR là 660C. Phát hiện sản phẩm PCR qua điện di: - Đun agaroza 2% trong dung dịch đệm TBE 0,5X. - Để nguội thạch đến nhiệt độ khoảng 560C, cho 2µl ẹthidium bromide nồng độ 10mg/ml, lắc đều, sau đó đổ thạch agaroza vào khuôn và tạo giếng bằng tấm lược nhựa. - Khi thạch đông, cho ít nước lên mặt thạch sau đó nhẹ nhàng rút lược ra và đặt thạch vào hộp điện di. - Đổ đệm TBE 0,5X vào hộp điện di cho ngập trên mặt thạch khoảng 1mm. - Trộn đều 10µl sản phẩm PCR trong 3ml loading buffer và cho vào các giếng của bản gel. - Nối hộp điện di với bộ nguồn sao cho ADN di động theo chiều dòng điện từ cực âm đến cực dương, với hiệu điện thế 94V. - Điện di kết thúc, quan sát kết quả trên máy soi thạch và chụp ảnh. Bệnh phẩm có kết quả PCR dương tính nếu vạch đặc hiệu của đoạn ADN có độ dài là 461bp. Phản ứng lai bằng ELISA: Để khẳng định chắc chắn mẫu thí nghiệm là dương tính với chủng M.tuberculosis, chúng tôi đem các sản phẩm PCR dương tính chạy ELISA được lai với probe đặc hiệu của M.tuberculosis.
53 2.2.5. Xử lý số liệu Số liệu sau khi thu thập được xử lý bằng phần mềm EPI – INFO 6.04, phần mềm GraphPad Prism và áp dụng phương pháp thống kê y sinh học. 2.2.6. Hạn chế sai số trong nghiên cứu. - Chọn điều tra viên là những nhân viên y tế có kinh nghiệm, được tập huấn kỹ. - Chọn các bác sỹ chuyên khoa lao, có nhiều năm kinh nghiệm trong chẩn đoán và điều trị bệnh lao phụ trách khám lâm sàng. - Các kỹ thuật chẩn đoán bệnh lao dùng trong nghiên cứu theo đúng tiêu chuẩn của Chương trình Chống lao Quốc gia quy định. - Giai đoạn trước và sau nghiên cứu đều dùng một loại Tuberculin tiêu chuẩn là Tuberculin PPD RT23+Tween80 2TU do Viện Huyết thanh quốc gia Copenhagien, Đan Mạch sản xuất. - Kỹ thuật viên thử phản ứng Mantoux và đọc kết quả là kỹ thuật viên chuyên khoa, được đào tạo, tập huấn theo chương trình chống lao quốc gia và có kinh nghiệm lâu năm trong lĩnh vực này. - Xử lý chống nhiễm kỹ thuật PCR theo đúng quy trình. 2.3. Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu - Đề tài được Lãnh đạo Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình, Bệnh viện Tâm thần Thái Bình đồng ý cho thực hiện. - Các đối tượng tham gia nghiên cứu hoàn toàn tự nguyện, cam kết. - Đề tài nghiên cứu được thông qua Hội đồng khoa học và đạo đức của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. 2.4. Hạn chế của đề tài: - Do điều kiện các nguồn lực có hạn, ở đề tài này, chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu và can thiệp nhằm cải thiện môi trường bệnh viện, làm giảm nguy cơ phơi nhiễm nghề nghiệp cho nhân viên y tế.
54 - Thực hiện các kỹ thuật (nuôi cấy, PCR, RT-PCR) đòi hỏi nguồn kinh phí lớn nên trong khuôn khổ đề tài, giai đoạn sau can thiệp chúng tôi chỉ tập trung vào việc phát hiện vi khuẩn lao sống là nguy cơ lây nhiễm lao cho nhân viên bệnh viện và số lượng mẫu môi trường cũng tập trung thu thập ở những khu vực liên quan trực tiếp đến sự có mặt của bệnh nhân lao trong quá trình làm việc của nhân viên bệnh viện. dựa trên phân tích kết quả mẫu môi trường giai đoạn trước nghiên cứu.
55 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu là cán bộ Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình, Bệnh viện Tâm thần Thái Bình. Bảng 3.1: Mô tả đối tượng nghiên cứu là cán bộ 2 bệnh viện. BV LAO VÀ BP BV TÂM THẦN BIẾN CHỈ SỐ Tần số Tỷ lệ % Tần số Tỷ lệ % p SỐ Tổng số 68 100,0 72 100,0 Nam 34 50,0 29 40,3 Giới >0,05 Nữ 34 50,0 43 59,7 15 – 24 03 4,4 05 6,9 25 – 34 14 20,6 18 25,0 Tuổi 35 – 44 19 27,9 16 22,2 >0,05 45 – 54 30 44,1 29 40,3 >= 55 02 2,9 04 5,6 Bác sỹ 22 32,4 21 29,2 Y sỹ 2 2,9 1 1,4 Y tá 16 23,5 25 34,7 Kế toán 3 4,4 7 9,7 Nghề Hộ lý 9 13,2 9 12,5 >0,05 nghiệp Hành chính 10 14,7 5 6,9 Dược sỹ 2 2,9 1 1,4 Dược tá 0 0,0 3 4,2 KTV XN 4 5,9 0 0,0 Cấp 1 0 0,0 0 0,0 Cấp 2 3 4,4 7 9,7 Cấp 3 12 17,6 9 12,5 Trình độ Sơ, trung cấp 28 41,2 31 43,1 >0,05 văn hoá Cao đẳng 1 1,5 2 2,8 Đại học 18 26,5 23 31,9 Trên đại học 6 8,8 0 0,0
56 Tổng số 140 cán bộ, nhân viên đang làm việc tại hai bệnh viện đã được tiến hành làm phản ứng Mantoux và khám lâm sàng, trong đó nữ là 63 người (45%), 126 người trong độ tuổi từ 25 – 54 (90%), 97 người có trình độ chuyên môn y, dược (69,3%), trình độ học vấn từ trung cấp trở lên là 107 người (76,4%). Các đặc điểm về tuổi, giới, nghề nghiệp, trình độ văn hóa tương đối giống nhau ở hai nhóm đối tượng thuộc hai bệnh viện (p > 0,05). Điều này chứng tỏ rằng hai nhóm cán bộ có điều kiện khá tương đồng để so sánh. 3.1.2. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu là dân cư sống xung quanh Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình (Xã Vũ Chính) và dân cư xã Phú Xuân. Bảng 3.2. Đặc điểm về giới và tuổi của dân cư hai xã. VŨ CHÍNH PHÚ XUÂN p BIẾN CHỈ SỐ Tần số Tỷ lệ % Tần Tỷ lệ SỐ số % Tổng số 300 100,0 300 100,0 Nam 142 47,3 129 43,0 >0,05 Giới Nữ 158 52,7 171 57,0 0 – 14 95 31,7 104 34,7 >0,05 15 – 24 39 13,0 13 4,3 0,05 Tuổi 35 – 44 39 13,0 50 16,7 >0,05 45 – 54 41 13,7 24 8,0 >0,05 55 – 64 13 4,3 13 4,3 >0,05 >= 65 17 5,7 53 17,7 <0,05
57 Bảng 3.3. Đặc điểm về nghề nghiệp và trình độ văn hóa của dân cư hai xã VŨ CHÍNH PHÚ XUÂN p BIẾN CHỈ SỐ Tần số Tỷ lệ % Tần Tỷ lệ SỐ số % Tổng số 300 100,0 300 100,0 Còn nhỏ 40 13,3 38 12,7 >0,05 Làm ruộng 135 45,0 178 59,3 >0,05 Nghề CBCNV 31 10,3 10 3,3 0,05 Buôn bán 4 1,3 0 0,0 >0,05 Lao động tự do 2 7,3 5 1,7 >0,05 Chưa đi học 40 13,3 38 12,7 >0,05 Mù chữ 5 1,7 12 4,0 >0,05 Biết đọc, viết 15 5,0 24 8,0 >0,05 Trình Cấp 1 44 14,7 70 23,3 0,05 Cấp 3 34 11,3 29 9,7 >0,05 Trung cấp, CĐ 13 4,3 2 6,7 0,05). Điều này cũng chứng tỏ nhóm đối chứng (xã Phú Xuân) là tương thích để so với nhóm nghiên cứu (xã Vũ Chính). 3.1.3. Các mẫu môi trường 3.1.3.1. Mẫu không khí. - Trước can thiệp: lấy mẫu không khí vào hai thời điểm có đặc điểm thời tiết khác nhau (ngày mưa, ẩm và ngày nắng, khô) nhằm xem xét ảnh hưởng của điều kiện khí hậu tới sự tồn tại của vi khuẩn lao ngoài môi trường. Đồng thời
58 mẫu cũng được lấy vào trước và sau giờ làm việc để xem xét sự tồn lưu của vi khuẩn lao và hiệu quả của biện pháp khử khuẩn đang được áp dụng tại bệnh viện. - Sau can thiệp: Dựa trên kết quả phân tích sự tồn tại của vi khuẩn lao trong không khí trước can thiệp, mẫu không khí được lấy tại các vị trí được nghi ngờ có tồn tại vi khuẩn lao sống. Bảng 3.4. Các vị trí lấy mẫu và số lượng mẫu không khí tại Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình (1 mẫu = 1000m3 không khí) SL mẫu sau SL mẫu trước CT CT Ngày ẩm Ngày nắng Ngày ẩm Vị trí lấy mẫu Đầu Sau Đầu Sau Đầu Sau giờ giờ giờ giờ giờ giờ LV LV LV LV LV LV Phòng khám 1 2 1 2 - 1 Phòng XQ 1 2 1 2 - 1 Phòng XN 2 4 2 4 - 1 Phòng BN 1 2 1 2 - 1 Phòng HC 1 1 1 1 - - Sân chơi, vườn 1 1 1 1 - - Ngoài cổng BV 1 1 1 1 - - Tổng số 8 13 8 13 - 4
59 3.1.3.2. Mẫu quệt bề mặt đồ đạc, dụng cụ. Bảng 3.5. Các vị trí lấy mẫu và số lượng mẫu quệt bề mặt dụng cụ, đồ đạc tại Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình. SL mẫu sau SL mẫu trước CT CT Khu Ngày ẩm Ngày nắng Ngày ẩm Vị trí lấy mẫu vực Đầu Sau Đầu Sau Đầu Sau giờ giờ giờ giờ giờ giờ LV LV LV LV LV LV Phòng Mặt bàn 1 - 1 1 1 2 bệnh Tay nắm tủ 1 - 1 1 1 2 nhân Thành giường 1 - 1 1 1 1 Cọc màn 1 - 1 1 1 1 X Nơi chụp phim 1 1 1 2 1 3 quang Nơi cắm phiếu 1 1 1 1 1 3 Khay để đờm 2 - 2 2 1 2 XN Bồn rửa tiêu bản - - - - 1 2 Thành trên hốt - - - - 1 2 CNK Bàn giặt - - - - - 1 ĐT Bàn phát thuốc. - - - - 1 1 Bàn đón tiếp BN - - - - 1 3 Phòng Bàn khám - - - - 1 3 khám Bàn thu viện phí - - - - 1 2 Tổng số 8 2 8 9 13 28
60 - Trước can thiệp: Chúng tôi tập trung lấy các mẫu quệt bề mặt dụng cụ đồ vật tại các vị trí bệnh nhân hay cầm nắm, động chạm trong phòng bệnh. Nơi cắm phiếu và nơi chụp phim ở khu X – quang là nơi bệnh nhân trực tiếp tiếp xúc trong quá trình chụp phim, ở khu vực xét nghiệm chúng tôi chọn khay để đờm là nơi để bệnh phẩm ban đầu trực tiếp của bệnh nhân, nếu nắp các hộp bệnh phẩm không được đậy chặt hoặc trong quá trình lấy bệnh phẩm bệnh nhân làm vương lên thành hộp, bệnh phẩm chứa vi khuẩn lao rất dễ dây ra ngoài. - Sau can thiệp: mẫu được lấy ở hầu hết các vị trí mà bệnh nhân lao có mặt trong quá trình khám bệnh và điều trị. 3.1.3.3. Mẫu quệt mũi Bảng 3.6. Các vị trí lấy mẫu và số lượng mẫu quệt mũi cán bộ Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình. SL mẫu sau SL mẫu trước CT CT Ngày ẩm Ngày nắng Ngày ẩm Khu vực lấy mẫu Đầu Sau Đầu Sau Đầu Sau giờ giờ giờ giờ giờ giờ LV LV LV LV LV LV Phòng khám - 4 - 2 - 3 Phòng XQ - 2 - - - 2 Phòng XN - 8 - 1 - 4 Khoa điều trị - 30 - 8 - 20 Phòng HC - - - 12 - - Tổng số - 44 - 23 - 29 Mẫu quệt mũi được lấy sau giờ làm việc, ở các nhân viên trong quá trình làm việc có tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân, trong đó các nhân viên trực tiếp điều trị cho bệnh nhân tại các khoa là nhiều nhất (38/67 mẫu) do thời gian tiếp xúc của họ với bệnh nhân là thường xuyên hơn. Chúng tôi cũng lấy mẫu
61 quệt mũi của các nhân viên hành chính là những người hầu như không tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân như một nhóm chứng. 3.1.3.4. Mẫu nước thải. Mẫu nước thải được thu thập theo mùa, vị trí lấy trước khi chảy vào bể chứa xử lý và vị trí sau khi đã được xử lý đổ vào mương dẫn nước ra cánh đồng sau bệnh viện. Bảng 3.7. Các vị trí lấy mẫu và số lượng mẫu nước thải Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình (trước can thiệp) Loại Ngày ẩm Ngày nắng Tổng số (mẫu) (mẫu) (mẫu) Trước khử khuẩn 1 1 2 Sau khử khuẩn 1 1 2 Tổng số 2 2 4 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.2.1. Thực trạng nhiễm lao của nhân viên y tế tại Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình, cộng đồng dân cư xung quanh bệnh viện trước can thiệp (năm 2002). 3.2.1.1. Thực trạng nhiễm lao của nhân viên y tế Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình (so sánh với Bệnh viện Tâm thần) 3. 2.1.1.1 Kết quả phản ứng Mantoux và một số triệu chứng lâm sàng của nhân viên y tế Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình, Bệnh viện Tâm thần Thái Bình. Kết quả phản ứng Mantoux dương tính của nhân viên Bệnh viện Lao và Bệnh phổi là 64/68 người (94,1%), có 36/72 (50%) nhân viên Bệnh viện Tâm thần có kết quả dương tính với phản ứng Mantoux. Đường kính trung bình
62 của phản ứng Mantoux nhóm nhân viên Bệnh viện Lao và Bệnh phổi là 16.7 ± 6.4, chỉ số này của nhân viên Bệnh viện Tâm thần là 10.3 ± 3.2 (Bảng 3.8) Bảng 3.8: Kết quả thử phản ứng Mantoux của nhân viên y tế hai BV Biến số BV Lao BV Tâm P thần Kết quả xét nghiệm Mantoux (+) 94,1 % 50,0 % 2 tuần Không 68 100,0 72 100,0 Có 0 0,0 0 0,0 Tổn thương trên Không 65 95,6 29 40,3 phim chụp phổi Không chụp 3 4,4 43 59,7 AFB(+) 0 0,0 0 0,0 Kết quả xét nghiệm AFB(-) 0 0,0 10 13,9 đờm Không làm 68 100,0 62 86,1 *Các triệu chứng không liên quan đến bệnh lao
63 Phân tích kết quả hỏi và khám lâm sàng cho 68 cán bộ Bệnh viện Lao và Bệnh phổi và 72 cán bộ Bệnh viện Tâm thần cho thấy chỉ có xấp xỉ 10% số cán bộ Bệnh viện Lao và Bệnh phổi có triệu chứng ho tại thời điểm khám, tuy nhiên không có đối tượng nghiên cứu nào có triệu chứng ho khạc kéo dài trên hai tuần, cũng chưa thấy có tổn thương nghi ngờ trên phim phổi. 3.2.1.1.2. Kết quả đường kính phản ứng Mantoux của nhân viên Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình năm 2002 so với kết quả đường kính Mantoux hồi cứu năm 1998. Chúng tôi tiến hành so sánh kết quả phản ứng Mantoux (2002) của đối tượng nghiên cứu với kết quả Mantoux của chính họ 4 năm trước (1998). 120 100 80 60 40 20 0 Âm tính >=5mm >=10mm >=15mm >=20mm 1998 2002 Biểu đồ 3.1. Kích thước đường kính phản ứng Mantoux năm 1998 và 2002 của nhân viên BV Lao và Bệnh phổi Thái Bình Kết quả phản ánh tại Biểu đồ 3.1 cho thấy trên cùng một đối tượng nghiên cứu, đường kính phản ứng Mantoux có xu hướng tăng lên rõ rệt ở lần thử sau (p<0,001)
64 3.2.1.1.3. Liên quan giữa số năm làm việc và kích thước Mantoux của nhân viên Bệnh viện Lao & Bệnh phổi Thái Bình và Bệnh viện Tâm thần Thái Bình. Chúng tôi tiến hành phân tích để xem xét sự liên quan giữa số năm làm việc tại bệnh viện của nhân viên y tế cả hai bệnh viện với kích thước đường kính phản ứng Mantoux Bảng 3.10. Năm công tác và kết quả Mantoux của nhân viên Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình. Mantoux Dương tính Âm tính P Năm Tần số % Tần số % công tác ≤ 3 năm 06 9,4 01 33,3 >0,05 > 3 năm 58 90,6 02 66,7 ≤ 5 năm 06 9,4 02 66,7 5 năm 58 90,6 01 33,3 35 r = 0.37; p= 0.002 manl ng kính Mantoux Đườ 0 1 3232 Tutuoiổi nghenghề Biểu đồ 3.2: Mối liên hệ giữa đường kính Mantoux và số năm làm việc của nhân viên Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình
65 Bảng 3.10 và Biểu đồ 3.2 cho thấy không có sự khác biệt về kết quả Mantoux giữa các cán bộ có thời gian công tác dưới và trên 3 năm tại bệnh viện, tuy nhiên sự khác biệt này lại có ý nghĩa thống kê giữa 2 nhóm cán bộ có thời gian công tác dưới và trên 5 năm. Trong khi đó ở nhóm nhân viên Bệnh viện Tâm thần, không thấy có sự khác biệt giữa số năm công tác và đường kính Mantoux (Biểu đồ 3.3) r = 0.11; 20 20 p = 0.38 mantt ng kính Mantoux Đườ 0 0 123 3057 Tuổituoitt nghề Biểu đồ 3.3: Mối liên hệ giữa đường kính Mantoux và năm công tác của cán bộ Bệnh viện Tâm thần 3.2.1.1.4. Liên quan giữa tính chất công việc và kích thước Mantoux của nhân viên Bệnh viện Lao & Bệnh phổi Thái Bình. Ở nghiên cứu này chúng tôi chia đối tượng nghiên cứu thành hai nhóm theo tính chất công việc, nhóm điều trị là những người tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân lao, nhóm hành chính là những người làm công việc gián tiếp, không tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân.
66 Bảng 3.11: Mối quan hệ giữa tính chất công việc và kết quả phản ứng Mantoux của cán bộ Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Mantoux Nhóm Điều trị Nhóm Hành chính p Dương tính 94,9 % 96,4 % > 0,05 Âm tính 5,1 % 4,6 % ĐK ≥ 10 mm 21,6 % 14,8 % > 0,05 ĐK ≥ 20 mm 78,4 % 85,2 % ĐK trung bình 17,9 ± 1,1 13,7 ± 2,0 > 0,05 Kết qủa ở bảng 3.11 cho thấy tỷ lệ Mantoux dương tính ở nhóm cán bộ, nhân viên trực tiếp điều trị và tiếp xúc với bệnh nhân lao là 94,9% và tỷ lệ đường kính Mantoux ≥ 20 mm của nhóm này là 78,4%, trong khi các chỉ số tương tự của nhóm làm việc mang tính chất hành chính lần lượt là 96,4% và 85,2%. Không thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa hai nhóm. Thảo luận nhóm với nhóm nhân viên y tế Bệnh viện Lao và Bệnh phổi, họ cho chúng tôi biết thực tế thì hầu như không có khoảng cách giữa bệnh nhân và thầy thuốc, bệnh nhân có thể đi lại hoặc đến chơi ở cả những khu vực chỉ dành cho nhân viên y tế trong bệnh viện như sân cầu lông, vườn hoa phía trước khu hành chính và khi người bệnh không có ý thức về giữ gìn vệ sinh thì chính họ là nguồn lây nguy hiểm trực tiếp cho nhân viên y tế. Qua phỏng vấn sâu, một nhân viên y tế đã cho biết thêm về tình trạng này: "Bệnh nhân vẫn làm cổ động viên cho bác sỹ đánh cầu lông là chuyện bình thường, ngay cả khi bác sỹ đang ăn cơm trực, bệnh nhân đi qua còn khạc nhổ, hành lang thường xuyên có những bãi đờm to tướng." Bác sĩ B. Khoa Nội nữ
67 Kết quả thảo luận nhóm với nhóm nhân viên y tế Bệnh viện Lao và Bệnh phổi, họ đều khẳng định môi trường của bệnh viện là môi trường dễ làm nhiễm bệnh lao cho không những bản thân họ mà còn cho cả những người dân sống trong khu vực phụ cận bệnh viện. "Chắc chắn là có lây nhiễm, không những cán bộ bị mà còn cả những người sống xung quanh nữa vì chất thải không được xử lý đúng quy định, bệnh nhân thì đi lung tung khạc nhổ bừa bãi" Y tá N. khoa Cấp cứu 3.2.1.2. Thực trạng nhiễm lao của dân cư xã Vũ Chính sống xung quanh Bệnh viện Lao Thái Bình (so với dân cư xã Phú Xuân) Bảng 3.12. Kết quả xét nghiệm Mantoux của đối tượng nghiên cứu VŨ PHÚ CHÍNH XUÂN BIẾN SỐ LOẠI OR, p Tần Tỷ lệ Tần Tỷ lệ số % số % Dương tính 165 55,0 70 23,3 OR = 4,0 Mantoux Âm tính 135 45,0 230 76,7 p 15 tuổi * Âm tính 65 32,2 144 73,8 p<0,001 Đường kính Mantoux trung bình (mm) 10,2 ± 5,7 7,7 ± 3,1 p < 0,05 * Không tính các đối tượng nghiên cứu dưới 15 tuổi vì đã được tiêm phòng vacxin BCG. Kết quả phản ứng Mantoux thể hiện ở bảng 3.12 cho thấy tỷ lệ Mantoux dương tính ở cả đối tượng nghiên cứu chung và cả đối tượng nghiên
68 cứu độ tuổi > 15 tuổi ở Vũ Chính đều cao hơn có ý nghĩa thống kê so với Phú Xuân (với OR = 4, p 0,05 Số thành viên Có người mắc lao 16 5,3 5 1,7 OR = gia đình có 3,3 Không 284 94,7 295 98,3 người mắc lao p 0,05 Mệt mỏi, sút cân 5 1,7 14 4,7 Ra mồ hôi đêm 3 1,0 2 0,7 Khác 9 3,0 3 1,0 Ho khạc đờm Có 33 7,7 28 9,3 p > 0,05 >3 tuần Không 267 92,3 272 90,7 Có triệu chứng Có 22 7,3 15 5,0 p > 0,05 nghi lao phổi Không 278 92,7 28595,0
69 Bảng 3.13 trình bày kết quả hỏi và khám lâm sàng 600 đối tượng nghiên cứu thuộc 2 xã Vũ Chính và Phú Xuân. Kết quả cho thấy cả số người đã mắc lao và số thành viên trong gia đình có bệnh nhân lao ở Vũ Chính đều cao hơn đáng kể so với Phú Xuân, tuy nhiên, sự khác biệt về các triệu chứng cơ năng liên quan đến lao giữa hai xã là không có ý nghĩa thống kê, mặc dù ở Vũ Chính có cao hơn so với Phú Xuân. Về triệu chứng lâm sàng nghi lao, Vũ Chính cũng có số người nghi lao cao hơn đáng kể so với Phú Xuân, nhưng sự khác biệt cũng chưa có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên về tiền sử gia đình có người đã từng điều trị bệnh lao ở xã Vũ Chính cao hơn xã Phú Xuân với p<0,05. Qua thảo luận nhóm với người dân sống xung quanh bệnh viện kết quả cho thấy họ đều nhận thức được những nguy cơ có thể có của môi trường Bệnh viện Lao và Bệnh phổi tới sức khoẻ của họ. Những nguyên nhân chủ yếu được họ đề cập tới là nước thải của bệnh viện chưa được xử lý đúng quy định đổ chung ra đường máng của dân, bệnh viện đốt chất thải khói ra xung quanh khu vực dân cư có mùi khó chịu, bệnh nhân ra ngoài khu vực khạc nhổ bừa bãi và những nguyên nhân đó gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng tới sức khoẻ và dễ làm lây nhiễm bệnh lao. "Nước thải của bệnh viện chảy ra máng rất đen, dân đi làm đồng lấy nước đó tưới rau, có khi lại rửa tay chân, dụng cụ rất mất vệ sinh và dễ lây bệnh." Ông C. xã Vũ chính "Bệnh nhân đi lại tự do ra ngoài vất rác và khạc nhổ bừa bãi, có khi còn nói chuyện với dân bên ngoài bệnh viện, nhà có cả trẻ con nên chúng tôi cũng rất sợ" Chị L. xã Vũ chính
70 Người dân sống gần bệnh viện cho biết trong thực tế có những người dân tiếp xúc hàng ngày với bệnh nhân mà không có một sự phòng hộ nào, bệnh nhân có thể ra ngoài mua bán, uống nước ở quán như những người bình thường "Bệnh nhân vẫn ra ngoài uống nước, thậm chí uống bia bình thường, mọi người có khi không biết tưởng là người nhà bệnh nhân nên cũng nói chuyện bình thường thôi" Ông S. xã Vũ Chính Cũng có khi những người bán quán biết là bệnh nhân nhưng vì bán được hàng thì họ cũng cứ bán, điển hình là một gia đình làm nghề bán quán nước ngay cạnh cổng Bệnh viện Lao và Bệnh phổi khi chúng tôi bắt đầu tiến hành nghiên cứu này thì bà chủ quán đang nằm điều trị tại Bệnh viện Lao và Bệnh phổi (lần thứ 3) và sau đó đã chết vì mắc lao mãn tính, những người còn lại trong gia đình đã không cho chúng tôi kiểm tra sức khoẻ như những đối tượng nghiên cứu khác có lẽ vì sợ bị phát hiện mắc bệnh. Chúng tôi còn thấy có một nhóm khoảng 5-6 bệnh nhân thường hay ra đứng chơi ở khu vực ngoài cổng bệnh viện nơi có nhiều người qua lại, nếu họ muốn ho khạc thì có thể nhổ đờm ra bất cứ chỗ nào và đây chính là nguồn gieo rắc vi khuẩn lao ra môi trường rất nguy hiểm. 3.2.2. Kết quả xét nghiệm vi khuẩn lao tại một số vị trí trong Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình trước can thiệp (năm 2002). 3.2.2.1. Kết quả phát hiện vi khuẩn lao bằng các phương pháp. Ở nghiên cứu này, để phát hiện vi khuẩn lao trong các mẫu thu thập từ môi trường, chúng tôi sử dụng nhiều phương pháp khác nhau nhằm xem xét khả năng phát hiện vi khuẩn lao của các phương pháp.
71 Bảng 3.14: Kết quả phát hiện vi khuẩn lao bằng các phương pháp trong các mẫu môi trường Ngày mưa ẩm Ngày nắng khô Loại mẫu PCR MGIT LJ* NS* PCR MGI LJ* NS* (+) (+) (+) (+) (+) T (+) (+) (+) Không khí 5/21 0/21 0/21 3/21 3/21 0/21 0/21 0/21 Quệt dụng cụ 3/10 0/10 1/10 1/10 8/17 0/17 0/17 0/17 Quệt mũi NV 10/44 0/44 0/44 0/44 1/23 0/23 0/23 1/23 Nước thải 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 Tổng số 18/77 0/77 1/77 4/77 12/63 0/63 0/63 1/63 * LJ: Loeweinstein – Jensen; NS: nhuộm soi trực tiếp Kết quả trình bày ở bảng 3.14 cho thấy trong bốn phương pháp phát hiện vi khuẩn lao được áp dụng trong đề tài là PCR, MGIT, nuôi cấy bằng môi trường Loeweinstein – Jensen và nhuộm soi trực tiếp; phương pháp PCR cho kết quả cao nhất (18/77 mẫu lấy ngày mưa ẩm và 12/63 mẫu lấy vào ngày nắng khô). Kết quả này là phù hợp vì kỹ thuật PCR cho kết quả dương tính cả khi có ít vi khuẩn (<10 vi khuẩn) [151], mặt khác, các mẫu cho kết quả dương tính bằng các phương pháp nuôi cấy và nhuộm soi đều dương tính với PCR. Ở các mẫu không khí, mẫu quệt tăm bông chúng tôi đều tìm thấy sự có mặt của vi khuẩn lao, không phát hiện được vi khuẩn lao trong mẫu nước thải.
72 3.2.2.2. Kết quả xét nghiệm vi khuẩn lao trong các mẫu theo khu vực lấy mẫu. Ở các mẫu không khí, mẫu quệt tăm bông chúng tôi đều tìm thấy sự có mặt của vi khuẩn lao, chúng tôi không phát hiện được vi khuẩn lao trong mẫu nước thải. Bảng 3.15. Kết quả xét nghiệm vi khuẩn lao trong các loại mẫu theo khu vực lấy mẫu Khu vực X - Xét Phòng Điều trị, Hành Quang nghiệm khám phòng chính* Loại mẫu (mẫu) (mẫu) (mẫu) BN (mẫu) (mẫu) Không khí 3/6 4/12 1/6 0/6 0/12 Quệt mũi 1/2 1/9 0/6 9/38 0/12 Quệt dụng cụ 3/9 4/6 0 4/12 0 (+)/Tổng số 7/17 9/27 1/12 13/56 0/24 (41,2%) (33,3%) (0,8%) (23,2%) *Bao gồm các khu vực: hành chính, sân chơi, vườn, cổng bệnh viện. Kết quả ở bảng 3.15, cho thấy khu vực chụp X quang có tỷ lệ dương tính cao nhất 7/17 mẫu (3 mẫu lấy vào ngày mưa ẩm, 4 mẫu lấy vào ngày nắng khô), sau đó đến khu vực xét nghiệm với 9/27 mẫu dương tính (6 mẫu lấy vào ngày mưa ẩm, 3 mẫu lấy vào ngày nắng khô), thứ ba là khu vực điều trị và phòng bệnh nhân với 13/56 mẫu, đứng thứ tư là khu vực khám bệnh với tỷ lệ dương tính là 1/12; khu vực hành chính, sân chơi, vườn và cổng bệnh viện không có mẫu nào dương tính.
73 Một số mẫu dương tính được thể hiện trên các ảnh điện di (3.1 – 3.3) như sau: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1. Marker 2. Chứng âm 3 – 8: Mẫu 9. Chứng dương 6. Mẫu (+): X quang Ảnh 3.1: Mẫu không khí dương tính 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1. Marker 2. Chứng dương 9. Chứng âm 3 – 8. Mẫu 8. Mẫu (+): khoa xét nghiệm Ảnh 3.2: Mẫu quệt bề mặt dụng cụ dương tính
74 1 2 3 4 5 6 7 8 1. Marker 2. Chứng dương 8. Chứng âm 3 - 7. Mẫu 7. Mẫu (+): Nhân viên khoa điều trị Ảnh 3.3: Mẫu quệt mũi dương tính 3.2.2.3. Kết quả xét nghiệm vi khuẩn lao trong các mẫu theo thời tiết Bảng 3.16.Kết quả xét nghiệm vi khuẩn lao trong các mẫu thu thập theo thời tiết Mẫu Ngày mưa ẩm(1) Ngày nắng khô (2) Tổng (+) (1)/(2) (+) (-) (+) (-) Không khí 5 16 3 18 5/3 Quệt dụng cụ 3 7 8 9 3/8 Quệt mũi 10 34 1 22 10/1 Nước thải 0 2 0 2 0/0 Tổng số 18 59 12 51 18/12 Kết quả ở bảng 3.16 thấy vi khuẩn lao được tìm thấy trong các mẫu không khí, mẫu quệt mũi lấy vào ngày mưa ẩm nhiều hơn ngày nắng khô (3/8 và 10/8), trong khi các mẫu quệt dụng cụ được lấy vào ngày mưa ẩm lượng vi khuẩn lao lại tìm thấy ít hơn (3/8).