›

Khóa luận Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC-MS/MS

pdf 74 trang thiennha21 18/04/2022 4150
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC-MS/MS", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_xay_dung_phuong_phap_dinh_luong_aflatoxin_trong_du.pdf

Nội dung text: Khóa luận Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC-MS/MS

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC  HÀ ANH TUẤN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG AFLATOXIN TRONG DƢỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội – 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC  HÀ ANH TUẤN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG AFLATOXIN TRONG DƢỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC KHÓA: QH.2014.Y Ngƣời hƣớng dẫn 1: TS. Nguyễn Thị Phƣơng Ngƣời hƣớng dẫn 2: TS. Nguyễn Hữu Tùng Hà N ộ@i – 2019School of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Bản luận văn này đƣợc hoàn thành tại Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Thị Phƣơng và TS. Nguyễn Hữu Tùng. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Phƣơng (Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu) và TS. Nguyễn Hữu Tùng (Bộ môn Hóa dƣợc và kiểm nghiệm, Khoa Y Dƣợc - ĐHQGHN) là những ngƣời thầy đã hƣớng dẫn, chỉ bảo, góp ý và đƣa ra những ý kiến quý báu để em hoàn thiện khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Phƣơng Thiện Thƣơng (Trƣởng khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu) cùng với các anh chị,bạn bè, cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu đã giúp đỡ em, đặc biệt là anh Nguyễn Đình Quân - ngƣời đã luôn theo sát, hƣớng dẫn cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Khoa Y – Dƣợc đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại trƣờng. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên cạnh, ủng hộ, động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Cuối cùng, em xin chúc các thầy cô mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công trong công việc cũng nhƣ trong cuộc sống. Hà Nội, ngày 16 tháng 04 năm 2019 Sinh viên @ SchoolHà of Anh Medicine Tuấn and Pharmacy, VNU
  4. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về aflatoxin 2 1.1.1. Giới thiệu về aflatoxin 2 1.1.2. Tính chất hóa lý 2 1.1.3. Điều kiện sinh aflatoxin 7 1.1.4. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin 8 1.1.5. Độc tính của aflatoxin lên cơ thể ngƣời 9 1.1.6. Những nghiên cứu về phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu 10 1.2. Tổng quan về sắc ký ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng – khối phổ (LC- MS/MS) 15 1.2.1. Sắc ký ái lực miễn dịch 15 1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ 16 CHƢƠNG2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 21 2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị 21 2.2.1. Chất chuẩn 21 2.2.2. Hóa chất 21 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
  5. 2.2.3. Thiết bị, dụng cụ 22 2.3. Nội dung nghiên cứu 22 2.3.1. Thu thập mẫu nghiên cứu 22 2.3.2. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu 22 2.3.3. Áp dụng phƣơng pháp đánh giá hàm lƣợng aflatoxin trong các mẫu dƣợc liệu giàu tinh bột trên thị trƣờng Hà Nội 23 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.4.1. Phƣơng pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử 23 2.4.2. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc kí 23 2.4.3. Quy trình thẩm định phƣơng pháp 23 2.4.3.1. Tính đặc hiệu/ chọn lọc 23 2.4.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lƣợng (LOQ) 24 2.4.3.3. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn 24 2.4.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi 25 2.4.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu 26 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1. Khảo sát điều kiện khối phổ 27 3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký 29 3.2.1. Lựa chọn pha tĩnh 29 3.2.2. Khảo sát pha động 30 3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 33 3.3.1. Khảo sát dung môi chiết mẫu 33 3.3.2. Khảo sát dung môi làm sạch 34 3.4. Thẩm định phƣơng pháp @ School of Medicine and 35 Pharmacy, VNU 2
  6. 3.4.1. Độ chọn lọc của phƣơng pháp 35 3.4.2. Tính phù hợp hệ thống 36 3.4.3. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính 37 3.4.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) 39 3.4.5. Độ lặp lại và độ thu hôi 40 3.5. Áp dụng phƣơng pháp đánh giá hàm lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu . 42 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  7. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt AF Aflatoxin AFB1 Aflatoxin B1 AFB2 Aflatoxin B2 AFG1 Aflatoxin G1 AFG2 Aflatoxin G2 AFM1 Aflatoxin M1 AFM2 Aflatoxin M2 Association of Official Analytical Hiệp hội các nhà phân AOAC Chemists tích hóa học Capillary Electrophoresis – Mass Điện di mao quản – CE/MS Spectrometry khối phổ CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử CV% Coefficient of Variation Hệ số biến thiên Enzyme – Linked Immuno Sorbent Kỹ thuật miễn dịch liên ELISA Assay kết với enzyme ESI Electrospray Ionization Ion hóa bằng tia điện tử Ung thƣ biểu mô tế bào HCC Hepatocellular carcinoma gan High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng HPLC Chromatography cao High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng HPLC-FLD chromatography- Fluorescence cao đầu dò huỳnh quang Detection IARC International Agency for Research Cơ quan nghiên cứ ung @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
  8. on Cancer thƣ quốc tế Liquid Chromatography Mass LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ Spectrometry Liquid Chromatography tandem Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS Mass Spectrometry hai lần LOD Limit of detetion Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lƣợng MeOH Methanol Dung dịch đệm PBS Phosphate-Buffered Saline phosphat R% Recovery Độ thu hồi Độ lệch chuẩn tƣơng RSD Relative Standard Deviation đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extract Chiết pha rắn Chiết pha rắn với cột ái SPE-IM Solid phase extract-Immuno lực miễn dịch TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TLPT Trọng lƣợng phân tử TLTK Tài liệu tham khảo @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  9. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1. Tính chất của một vài aflatoxin 4 Bảng 1. 2. Một số nghiên cứu định lượng aflatoxin trong và ngoài nước 11 Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu mua 21 Bảng 3.1. Thông số MS tối ưu 28 Bảng 3. 2. Một số chương trình gradient khảo sát 30 Bảng 3. 3. Các thông số sắc ký ứng với chương trình gradient 2 32 Bảng 3. 4. Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi khác nhau. 34 Bảng 3. 5. Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi làm sạch 35 Bảng 3. 6. Ion mẹ và ion con của các aflatoxin 35 Bảng 3. 7. Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp 37 Bảng 3. 8. Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc của các chất 38 Bảng 3. 9. Kết quả xác định LOD và LOQ của phương pháp 40 Bảng 3. 10. Độ lặp lại và độ thu hồi của aflatoxin trên nền mẫu dược liệu 41 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  10. DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1. Sơ đồ khối của máy khối phổ 18 Hình 1.2. Bộ phân tích tử cực chập ba 19 Hình 3.1. Phổ khối của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 quan sát dưới chế độ ESI-positive 28 Hình 3. 2. Phổ khối của ion con các aflatoxin 29 Hình 3. 3. Sắc ký đồ chương trình gradient 1 31 Hình 3. 4. Sắc ký đồ chương trình gradient 2 31 Hình 3. 5. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp 36 Hình 3. 6. Đường chuẩn của các độc tố aflatoxin 39 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
  11. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, dƣợc liệu cũng nhƣ các sản phẩm từ dƣợc liệu đƣợc nhân dân sử dụng ngày càng nhiều. Để đảm bảo ngƣời dân đƣợc sử dụng những sản phẩm tốt nhất, cũng nhƣ an toàn cho sức khỏe, ngoài việc đảm bảo các tiêu chí trong Dƣợc điển các sản phầm này cũng nên đƣợc kiểm tra đánh giá mức độ ô nhiễm các độc tố nấm, trong đó phổ biến nhất là aflatoxin. Hiện nay trên thế giới nhiều tác giả đã tiến hành xây dựng phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong nhiều nền mẫu dƣợc liệu khác nhau. Tuy nhiên, trong nƣớc hiện tại các nghiên cứu công bố cho thấy quy trình xử lý mẫu trải qua nhiều công đoạn, tốn nhiều thời gian nên hiệu suất còn chƣa đƣợc cao. Vì vậy, nhằm đƣa ra đƣợc phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu với hiệu suất thu hồi cao và phƣơng pháp đơn giản, cũng nhƣ tiết kiệm thời gian hơn, chúng tôi đề xuất đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu bằng LC-MS/MS”, áp dụng để xác định hàm lƣợng aflatoxin trong một số dƣợc liệu với mục tiêu: - Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời 4 độc tố aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) trong dƣợc liệu bằng phƣơng pháp LC-MS/MS sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn với cột ái lực miễn dịch (SPE-IM). - Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng đánh giá mức độc ô nhiễm một số aflatoxin trên các mẫu dƣợc liệu thu mua trên thị trƣờng Hà Nội. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
  12. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về aflatoxin 1.1.1. Giới thiệu về aflatoxin Aflatoxin đƣợc phát hiện và phân lập lần đầu tiên vào năm 1960 sau sự kiện Bệnh Gà tây X ở Anh làm chết hơn 100.000 con gà tây. Những con gà tây này bị hoại tử gan sau khi đƣợc cho ăn lạc mốc và aflatoxin đƣợc xác định là nguyên nhân gây bệnh [15,25]. Aflatoxin là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp đƣợc sản xuất bởi một vài loại vi nấm, đặc biệt là nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus. Nấm mốc có thể phát triển và sinh aflatoxin trƣớc và sau khi thu hoạch, khi bảo quản cũng nhƣ chế biến. Nhiều nông sản có thể bị nhiễm aflatoxin nhƣ ngũ cốc, lúa gạo; các loại hạt có dầu nhƣ hạt đậu, hạt hƣớng dƣơng, bông; các loại gia vị nhƣ ớt , hạt tiêu, nghệ, gừng; hạnh nhân, quả óc chó và sữa cùng các sản phẩm từ sữa (bơ, pho mát ) [10,20]. Aflatoxin là một nhóm chất gồm các chất có cấu tạo tƣơng tự nhau và đều là dẫn chất của difuranocoumarin, đƣợc tổng hợp nhờ con đƣờng polyketide. Ngày nay, ngƣời ta đã xác định đƣợc khoảng 20 loại aflatoxin trong đó 6 loại aflatoxin quan trọng nhất lần lƣợt là B1, B2, M1, M2, G1 và G2 [27]. Aflatoxin B1là loại aflatoxin độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80% tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lƣơng thực, thực phẩm. Thông thƣờng, nếu không có aflatoxin B1 thì cũng sẽ không có AFB2, AFG1 và AFG2 [10,14]. 1.1.2. Tính chất hóa lý Aflatoxin hòa tan trong dung môi phân cực nhẹ nhƣ cloroform, methanol, dimethyl sulfoxid. Độ tan của aflatoxin trong nƣớc vào khoảng 10– 20 mg/l. Dung dịch aflatoxin trong dung môi cloroform hay benzen có thể đƣuọc trong nhiều năm nếu bảo quản ở điều kiện lạnh và tối [3]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  13. Ở nhiệt độ đun nấu thông thƣờng không thể phân hủy đƣợc aflatoxin, nhƣng dƣới ánh sáng tử ngoại các aflatoxin bị phân hủy. Trong công thức cấu tạo có vòng lacton nội phân tử, nên các aflatoxin dễ bị phân hủy bởi base mạnh và nếu tiếp tục acid hóa nhẹ thì aflatoxin ban đầu đƣợc tái tạo [3]. Các aflatoxin phát huỳnh quang rất mạnh, dựa vào tính chất này ta có thể phát hiện chúng ở nồng độ rất thấp (trên sắc ký đồ lớp mỏng có thể phát hiện với lƣợng chất khoảng 0,5ng hay nhỏ hơn). Đây chính là cơ sở hóa lý cho việc phát hiện và định lƣợng các hợp chất này [3]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  14. Bảng 1. 1. Tính chất của một vài aflatoxin Loại TLPT STT CTPT Tính chất CTCT TLTK aflatoxin (đvC) - Nhiệt độ nóng chảy 268-269 oC - Huỳnh quang màu xanh da trời. o - [α]D: -480 (0,1M/dimethyl 1 AFB1 C17H12O6 312 [22] formamid) - Hấp thụ UV cực đại trong môi trƣờng ethanol: 223; 265; 362 nm. - Nhiệt độ nóng chảy 286-289 oC - Huỳnh quang màu xanh da trời. o 2 AFB2 C17H14O6 314 - [α]D: -492 (0,1M/cloroform) [22] - Hấp thụ UV cực đại trong môi trƣờng ethanol: 265; 363 nm. 4 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  15. - Nhiệt độ nóng chảy 244-246 oC - Huỳnh quang màu xanh lá cây. o - [α]D: -556 (0,1M/cloroform) 3 AFG1 C17H12O7 328 [22] - Hấp thụ UV cực đại trong môi trƣờng ethanol: 243; 257; 264; 362nm. - Nhiệt độ nóng chảy 237-240 oC - Huỳnh quang màu xanh lá cây. o 4 AFG2 C17H14O7 330 - [α]D: -430 (0,084M/cloroform) [22] - Hấp thụ UV cực đại trong môi trƣờng ethanol: 265; 363 nm. - Nhiệt độ nóng chảy 299 oC - Huỳnh quang màu xanh tím. o - [α]D: -280 (0,1M/dimethyl 5 AFM1 C17H12O8 344 [22] formamid) - Hấp thụ UV cực đại trong môi trƣờng ethanol: 266; 265; 357 nm. 5 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  16. - Nhiệt độ nóng chảy 293 oC - Huỳnh quang màu tím. 6 AFM2 C17H14O8 346 [22] - Hấp thụ UV cực đại trong môi trƣờng ethanol: 221; 264; 357 nm. 6 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  17. 1.1.3. Điều kiện sinh aflatoxin  Chủng giống: Các loài nấm mốc có thể sinh aflatoxin gồm các loài thuộc chi Aspergillus, thuộc họ nấm cúc: A. flavus, A. arachidicola, A. bombycis, A. minisclerotigenes, A. nomius, A. ochraceoroseus, A. parasiticus, A. pseudotamarii, A. rambellii, trong đó A. flavus và A. parasiticus là hai chủng nấm chủ yếu thƣờng gặp sinh aflatoxin B1 [12]. Hầu hết các chủng nấm Aspergillus sinh trƣởng tốt trong điều kiện nhiệt độ 30-35oC và độ ẩm không khí trên 55% trong khoảng pH rộng từ 3-10 trên những cơ chất giàu năng lƣợng dạng tinh bột [6]. Tuy nhiên, sự có mặt của chủng nấm mốc sinh aflatoxin không đồng nghĩa với nhiễm aflatoxin do sự tổng hợp aflatoxin còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố vật lý, hóa học và sinh học.  Điều kiện môi trƣờng và cơ chất: Các chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm mốc và sự hình thành aflatoxin bao gồm: năng lƣợng (thƣờng dƣới dạng tinh bột), vitamin, acid béo, amino acid và chất khoáng, đặc biệt cần có mặt Kẽm (Zn). Vì thế, nhiễm độc aflatoxin thƣờng có trong những sản phẩm nhiều tinh bột, các hạt có dầu nhƣ hạt bông, đậu nành tỷ lệ nhiễm ít hơn [14]. Nhiệt độ và độ ẩm cũng ảnh hƣởng đến sự tạo thành aflatoxin. Nhiệt độ tối thiểu và tối đa cho tổng hợp aflatoxin theo nghiên cứu lần lƣợt là 12oC và 42oC. Nhiệt độ tối ƣu để hình thành aflatoxin là 25-35oC, nhiệt độ tối ƣu để o tổng hợp aflatoxin B1 là 24-28 C. Độ ẩm cần thiết cho tổng hợp aflatoxin của nấm mốc là trên 62%, hàm ẩm nông sản cho tổng hợp aflatoxin tối đa ở nông sản nhiều tinh bột là 18% và trong quả, hạt có dầu là 9-10% [10,14,21]. Nhƣ vậy, khí hậu và điều kiện bảo quản ảnh hƣởng rất lớn đến sự nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm. Các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới trong đó có Việt nam có khí hậu nóng @ ẩ m,School nhiệt độ ofcao, Medicine mƣa nhiều ph andần lớ nPharmacy, VNU 7
  18. thời gian trong năm, thƣờng có sản phẩm bị nhiễm aflatoxin nhiều hơn so với các nƣớc ôn đới. Các nƣớc đang phát triển nhƣ ở khu vực Đông Nam Á, Châu Phi chƣa có nền nông nghiệp hiện đại hóa với những điều kiện trồng trọt và bảo quản chƣa đạt tiêu chuẩn làm tăng nguy cơ xuất hiện aflatoxin trong các sản phẩm nông nghiệp nói chung và dƣợc liệu nói riêng. 1.1.4. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin Trong số các loại aflatoxin thì AFB1 là loại độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80% tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lƣơng thực, thực phẩm. AFB1 đƣợc chuyển hóa chủ yếu tại gan thành dạng có hoạt tính aflatoxin exo- 8,9-epoxide hoặc hydroxyl hóa thành AFM1 ít độc tính hơn bởi cytochrome P450, một họ enzyme trong tế bào gan. Sự epoxide hóa AFB1 là một bƣớc nguy hiểm gây nguy cơ đột biến gen và ung thƣ. Aflatoxin exo-8,9-epoxide là một chất rất ái điện tử, không bền vững, nó liên kết ái lực cao với guanine base trong DNA tạo thành aflatoxin-N7-guanine. Aflatoxin-N7-guanine methyl hóa biến G thành T, gây đột biến gen và có thể là nguyên nhân dẫn đến ung thƣ [13,19]. Aflatoxin exo-8,9-epoxide và sản phẩm hydrat hóa của nó là dihydrodiol, gắn kết cộng hóa trị với DNA, RNA làm thay đổi cấu trúc và ảnh hƣởng chức năng của acid nucleic và protein. Aflatoxin exo-8,9-epoxide còn ức chế enzyme RNA polymerase và ribosomal translocase, ảnh hƣởng đến quá trình phiên mã và dịch mã [12]. AFB1 ức chế enzyme glycogen synthetase và transglycosylase làm giảm glycogen ở gan và tăng glucose trong máu. AFB1 ức chế phosphoglucomutase – một enzyme xúc tác thuận nghịch phản ứng chuyển G6P Glucose-6-phosphate thành Glucose-1-phosphate, dẫn đến tích lũy G6P Glucose-6-phosphate và giảm tổng hợp glycogen [12]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
  19. Aflatoxin còn ảnh hƣởng đến DNA và cấu trúc ty thể. Aflatoxin-8,9- epoxide ƣu tiên gắn vào DNA của ty thể hơn là DNA nhân tế bào cản trở sản xuất ATP làm mất chức năng tổng hợp năng lƣợng dƣới dạng ATP của ty thể và gây tăng chết tế bào theo chƣơng trình (apoptosis) [12,13]. 1.1.5. Độc tính của aflatoxin lên cơ thể ngƣời Aflatoxicosis là tình trạng bệnh lý do nhiễm độc aflatoxin, ở ngƣời phơi nhiễm với aflatoxin có thể xảy ra aflatoxicosis cấp hoặc mạn tính [9,13]. Độc tính cấp bao gồm: sốt cao, xuất huyết, tổn thƣơng gan cấp với biểu hiện nhiễm độc gan nặng (tỷ lệ tử vong 25%), phù, rối loạn tiêu hóa, rối loạn hấp thu và/hoặc chuyển hóa chất dinh dƣỡng, thậm chí có thể gây tử vong. Aflatoxicosis nguyên phát cấp tính xuất hiện khi phơi nhiễm với lƣợng trung bình đến lƣợng lớn aflatoxin [12,14]. Độc tính mạn của aflatoxin B1 do tiêu thụ lƣợng thấp đến trung bình aflatoxin, thƣờng không có biểu hiện lâm sàng và khó nhận ra. Sau thời gian phơi nhiễm kéo dài, AFB1 có thể gây quái thai và tật nguyền bẩm sinh; đột biến gen làm thay đổi mã gen và DNA, phá vỡ nhiễm sắc thể, tái sắp xếp các mảnh nhiễm sắc thể, tăng thêm hoặc mất hoàn toàn nhiễm sắc thể; gây ung thƣ trong đó HCC (ung thƣ biểu mô tế bào gan) là loại ung thƣ thƣờng gặp do AFB1 [12,14]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng những thức ăn nhiễm độc AFB1 là yeus tố nguy cơ chính dẫn đến ung thƣ gan. IARC phân loại AFB1 là tác nhân gây HCC nhóm I [23]. Cơ chế HCC do AFB1 đƣợc chứng minh là do đột biến gen p53 – gen ức chế khối u. Một số nghiên cứu tại Trung Quốc và Nam Phi cho thấy có đột biến ở codon 249 (guanine (G) thành thymine (T), kết quả là argenine (R) chuyển thành serine (S)), exon 7 trên gen p53 ở những bệnh nhân HCC [14]. Nguy cơ mắc HCC tăng lên khi đồng phơi nhiễm với AFB1 và virus HBV hoặc HCV [27]. Ở những cá thể có HbsAg dƣơng tính, aflatoxin có tiềm năng gây độc gấp 30 lần ở những ngƣời không nhiễm virus. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
  20. Nhiễm HBV tăng nguy cơ ung thƣ gan lên 5 lần trong khi đồng phơi nhiễm virus HBV và aflatoxin tăng nguy cơ ung thƣ gan lên 60 lần [17]. Ngoài ra ung thƣ phổi do AFB1 cũng đƣợc báo cáo ở những ngƣời phơi nhiễm kéo dài với sản phẩm đã nhiễm độc aflatoxin qua đƣờng hô hấp [19]. AFB1 còn đƣợc báo cáo có liên quan đến hội chứng giống nhƣ hội chứng Reye ở trẻ em với những triệu chứng nhƣ ho, sốt, thay đổi trƣơng lực cơ, nôn. Giải phẫu cho thấy hình ảnh gan to nhiễm mỡ, phù não, thoái hóa mỡ nội tạng, thoái hóa thần kinh. Khi gan bị tổn thƣơng do AFB1 dẫn đến amoniac – sản phẩm chuyển hóa protein và acid amin – không đƣợc giải độc khỏi cơ thể, đạt nồng độ cao trong cơ thể, đi qua hàng rào máu não và gây hội chứng não gan [12]. Do có độc tính cao, nhiều quốc gia đã đƣa ra các quy định để kiểm soát hàm lƣợng aflatoxin trong thực phẩm và các sản phẩm nông nghiệp có nguy cơ lây nhiễm cao. Trong Dƣợc điển Trung Quốc 2015 và Dƣợc điển Hồng Kông, quy định giới hạn tổng hàm lƣợng aflatoxin (AFG1, AFG2, AFB1, AFB2) trong dƣợc liệu không đƣợc quá 10 µg/kg và hàm lƣợng AFB1 không đƣợc quá 5 µg/kg. Liên minh châu Âu (EU) quy định tổng hàm lƣợng aflatoxin không đƣợc quá 4 µg/kg và hàm lƣợng AFB1 không quá 2 µg/kg [18]. Thep FDA, nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm nông nghiệp và dƣợc liệu là khó tránh khỏi, hàng năm có rất nhiều ngƣời có nguy cơ phơi nhiễm với aflatoxin. Tuy nhiên, nguy cơ nhiễm độc và độc tính aflatoxin có thể đƣợc giảm tới mức tối thiểu nhờ các phƣơng pháp kiểm soát và phát hiện aflatoxin trong sản phẩm và dƣợc liệu. 1.1.6. Những nghiên cứu về phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  21. Bảng 1. 2. Một số nghiên cứu định lượng aflatoxin trong và ngoài nước Phƣơng pháp Phƣơng Hoạt chất định TT Dung môi chiết Điều kiện sắc ký TLTK phân tích pháp chiết lƣợng I Các nghiên cứu trên Thế giới Phƣơng + Pha tĩnh: LiChrocart C18 short column pháp chiết (30mm × 4 mm, 3ϻm) aflatoxin B1, B2, lạnh + methanol : nƣớc + Pha động: methanol – nƣớc 1 LC-MS/MS G1, G2 trên nến mẫu [26] chiết pha (80:20, v/v) (30:70) Rhammus purshiana rắn để làm + Tốc độ dòng: 1mL/phút giàu + Detector phát hiện: ESI (+) - SIM methanol : + Pha tĩnh: Scharlau Chemie C18 aflatoxin B1, B2, Phƣơng column (250 × 4.6 mm i.d.) G1, G2 trên các nền nƣớc (70:30, pháp chiết + Pha động: methanol:nƣớc (52:48, v/v) mẫu nhƣ Valeriana v/v), methanol: lạnh + với 119 mg/L Kali bromide và 100µL/L officinalis, 2 LC-FLD nƣớc (80:20, [16] chiết pha acid nitric 65%. Hypericum v/v) và rắn để làm + Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút perforatum, Cassia methanol : giàu + Detector phát hiện: máy dò huỳnh angustifolia, Mentha nitric acid1% quang FP-1520, bƣớc sóng kích thích và pulegium và 11 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  22. (70:30, v/v) phát xạ tƣơng ứng là 365 và 435nm. Chrysanthemum parthenium + Pha tĩnh: Shim-Pack CLC – ODS Column (5µm, 4.6 x 250 mm) + Pha động: dung dịch khử ion hon hợp Phƣơng nƣớc-acetonitrile-methanol (60:20:20, pháp chiết methanol : v/v/v) bổ sung 350 µL HNO3 4M and AFB1 trong thuốc lạnh + 3 LC-FLD nƣớc (85:15, 120 mg KBr. từ thảo dƣợc và [24] chiết pha v/v) + Tốc độ dòng: 1 mL/phút dƣợc liệu rắn để làm + Detector phát hiện: máy dò huỳnh giàu quang Shimadzu LC-10 AD Model, bƣớc sóng kích thích và phát xạ tƣơng ứng là 360 và 435nm. II Các nghiên cứu trong nƣớc Phƣơng + Pha tĩnh: Betabasic 18 (2,0mm x pháp chiết methanol : 50mm, 5ϻm) Các loại aflatoxin 4 LC-MS lạnh + nƣớc (85:15, + Pha động: kênh A: nƣớc; kênh B: [2] trong dƣợc liệu chiết pha v/v) methanol; chạy chế độ Gradient. rắn để làm + Tốc độ dòng: 0,2ml/phút. 12 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  23. giàu + Detector phát hiện: ESI (+) - SIM + Pha tĩnh: cột C18 Acquity UPLC BEH Phƣơng (2,1x100 mm, 1,7ϻm) pháp chiết + Pha động: kênh A: amoni acetat lạnh + methanol : aflatoxin B1 trong 5 LC-MS 10mM; kênh B: methanol; chạy chế độ [7] chiết pha nƣớc (6:4, v/v) dƣợc liệu Gradient. rắn để làm + Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút giàu + Detector phát hiện: ESI (+) - SIM 13 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  24.  Nhận xét: Từ những nghiên cứu trên, ta có thể thấy hiện nay trong nƣớc và trên thế giới nhiều tác giả đã tiến hành xây dựng phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong nhiều nền mẫu dƣợc liệu khác nhau. Tuy nhiên, trong nƣớc hiện tại các nghiên cứu công bố cho thấy quy trình xử lý mẫu trải qua nhiều công đoạn, tốn nhiều thời gian nên hiệu suất còn chƣa đƣợc cao. Vì vậy, nhằm đƣa ra đƣợc phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu với hiệu suất thu hồi cao và phƣơng pháp đơn giản, cũng nhƣ tiết kiệm thời gian hơn, chúng tôi đề xuất đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu bằng LC-MS/MS”, áp dụng để xác định hàm lƣợng aflatoxin trong một số dƣợc liệu. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
  25. 1.2. Tổng quan về sắc ký ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng – khối phổ (LC-MS/MS) 1.2.1. Sắc ký ái lực miễn dịch a) Sắc ký ái lực Sắc ký ái lực là một kỹ thuật sắc ký lỏng sử dụng một thuốc thử liên kết đặc biệt để làm sạch hoặc phân tích các thành phần trong hỗn hợp. Lƣu giữ chất phân tích là do tƣơng tác thuận nghịch và chọn lọc của các cặp có trong cơ thể sống nhƣ: kháng nguyên – kháng thể, enzyme – cơ chất, hormone – receptor [1]. Để thực hiện sắc ký ái lực ngƣời ta cố định một thành phần của cặp (phối tử - ái lực) trên một chất mang rắn làm pha tĩnh đƣa vào cột. Mẫu phân tích có thành phần thứ hai đƣợc đƣa vào cột nhờ một pha động có pH xác định, lực ion và thành phần dung môi phù hợp gọi là dung dịch đệm rửa giải. Khi mẫu phân tích qua cột, các thành phần khác khuếch tán dễ dàng, chỉ có hai thành phần của cặp tƣơng tác đặc hiệu và liên kết với nhau. Nhờ một dung dịch đệm rửa giải, liên kết trên bị phá vỡ và thành phần chọn lọc với phối tử ái lực đi ra khỏi cột. Phát hiện và định lƣợng bằng một detector thích hợp [1]. - Phối tử ái lực: là những chất có tính đặc hiệu cao với chất phân tích, quyết định thành công của kỹ thuật tách ái lực. Phối tử ái lực có thể có nguồn gốc sinh học (kháng thể, protein ) hoặc nguồn gốc hóa học (boronat, phức càng cua kim loại ). - Chất mang: là những chất rắn đƣợc dùng để cố định phối lực ái tử trong cột sắc ký. Một số chất mang thƣờng dùng trong sắc ký ái lực là agarose và agarose liên kết, cellulose, silica b) Sắc ký ái lực miễn dịch Sắc ký ái lực miễn dịch là một loại hình sắc ký ái lực sử dụng phối tử ái lực là kháng thể hoặc kháng nguyên. Do tính đặc hiệu cao của tƣơng tác kháng thể - kháng nguyên và khả năng @ t ạSchoolo kháng th ofể c ủMedicinea nhiều loại ch andất, k ỹPharmacy, VNU 15
  26. thuật sắc ký ái lực miễn dịch trở thành một công cụ phổ biến và quan trọng trong phân tích các chất có nguồn gốc sinh học [1]. Kỹ thuật sắc ký ái lực miễn dịch còn đƣợc ứng dụng để tinh chế và làm giàu chất phân tích trong cột chiết pha rắn (SPE) với nhiều ƣu điểm [25]: - Sử dụng ít dung môi. - Có tính đặc hiệu cao với chất phân tích. - Làm giàu mẫu cho kết quả phân tích tốt hơn. Nhƣợc điểm của kỹ thuật này là chi phí cao do cột chỉ dùng đƣợc một lần (kháng thể bị biến tính) [25]. 1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ a) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tƣơng đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thời gian chất phân tích đƣợc rửa giải đƣợc ghi lại nhờ detector gọi là thời gian lƣu. Thời gian lƣu phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích và thành phần của pha động và pha tĩnh [1].  Pha tĩnh Trong HPLC, pha tĩnh là các hợp chất đƣợc gắn lên chất mang thƣờng là các hạt hình cầu có đƣờng kính 1,5–10 ϻm, có nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích. Pha tĩnh có độ phân cực khác nhau, dựa vào độ phân cực của pha tĩnh mà ngƣời ta phân ra hai loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo. - Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực (các silica có chứa nhóm alkyl ít cacbon mang nhóm chức phân cực –CN, -NH2 ). - Sắc ký pha đảo: pha tĩnh không phân cực (các silica gắn mạch cacbon dài C18, C8 ).  Pha động @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
  27. Pha động trong HPLC là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc ký. Trong sắc ký pha thuận, pha động là các dung môi ít phân cực nhƣ hexan, iso propyl ether , ngƣợc lại trong sắc ký pha đảo, pha động là các dung môi phân cực nhƣ nƣớc, methanol, acetonitril Có hai cách dùng pha động để rửa giải [1]: - Đẳng dòng: các thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình chạy sắc ký. - Gradient: tỷ lệ các thành phần dung môi pha động thay đổi trong quá trình chạy sắc ký. Chế độ này phù hợp với mẫu phân tích nhiều thành phần với khả năng phân cực khác nhau, tăng khả năng rửa giải, rút ngắn thời gian phân tích. b) Khối phổ (MS)  Nguyên tắc: Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lƣợng và điện tích của ion (m/z) đƣợc tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Các ion đƣợc tạo thành trong buồng ion hóa, đƣợc gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trƣớc khi đến detector. Tất cả các quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân không: áp suất trong hệ dao động từ 10-3 Pa đến 10-6 Pa. Tín hiệu tƣơng ứng với các ion sẽ đƣợc thể hiện bằng một số vạch (pic) có cƣờng độ khác nhau tập hợp lại thành phổ khối. Nó cung cấp thông tin định tính xác định cấu trúc và định lƣợng các chất [1]. Máy khối phổ gồm có 5 bộ phận: bộ nạp mẫu, bộ nguồn ion, bộ phân tích khối, detector, bộ xử lý dữ liệu: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
  28. Hệ chân không Nạp mẫu Nguồn ion Phân tích Detector khối Bơm chân Xử lý dữ không liệu Hình 1.1. Sơ đồ khối của máy khối phổ - Bộ nạp mẫu: là bộ phận đƣa mẫu vào máy. Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn cần chuyển sang dạng hơi bằng cách thích hợp. Bộ nạp mẫu có thể phân thành hai nhóm chính là nhóm nạp mẫu trực tiếp và nhóm nạp mẫu gián tiếp. Trong nạp mẫu gián tiếp, bộ nạp mẫu là đầu ra của một thiết bọ phân tích khác đƣợc kết nối với khối phổ nhƣ sắc ký khí (GC/MS), sắc ký lỏng (LC/MS), điện di mao quản (CE/MS) - Bộ nguồn ion: trong máy khối phổ, có nhiều cách để ion hóa phân tử và nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi. Một số kỹ thuật thƣờng dùng nhƣ ion hóa bằng va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa bằng tia điện, ion hóa bằng giải hấp Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ion hóa bằng tia điện ESI. Kỹ thuật này tạo ra ion từ phân tử trong dung dịch. Dung dịch ở trong một mao quản kim loại (tốc độ dòng dao động từ 1mL đến 10mL/phút). Ngƣời ta đặt một điện trƣờng giữa đầu mao quản và một điện cực, các giọt mịn hạt sƣơng mang điện tích đƣợc tạo thành và gia tốc đến điện cực. Kỹ thuật ESI thích hợp để ion hóa các chất phân cực và nghiên cứu các phân tử sinh học có khối lƣợng phân tử lớn (M ≤ 100000). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
  29. - Bộ phân tích khối: có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt. Tính năng của máy khối phổ chủ yếu phụ thuộc vào bộ phân tích khối. Có 4 loại bộ phân tích khối chính thƣờng đƣợc sử dụng: 1. Bộ phân tích từ 2. Bộ phân tích tứ cực 3. Bộ phân tích thời gian bay 4. Bộ phân tích cộng hƣởng ion cyclotron Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi chỉ đề cập đến bộ phân tích khối tử cực chập ba. Bộ phân tích khối tử cực chập ba gồm ba bộ tứ cực nối tiếp nhau. Mỗi bộ gồm 4 cực bằng kim loại đặt song song và sát nhau. Có một khoảng không giữa 4 cực đó để các ion bay qua. Q1 Q2 Q3 Detector Hình 1.2. Bộ phân tích tử cực chập ba Q1 sẽ tách các ion; một số ion đƣợc chọn lọc từ đây vào Q2. Trong buồng Q2 với áp suất cao, các tiền ion bị phân ly do va chạm với khí trơ có mặt nhƣ nitơ, heli, argon, Bộ Q2 tạo ra phân ly do va chạm. Nhờ va chạm này năng lƣợng động học của các ion chuyển thành nội năng nên chúng bị phan mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn gọi là ion con/ion sản phẩm. Các ion con mới hình thành đƣợc dẫn đến Q3 tách riêng và đến detector. Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này đƣợc gọi là kỹ thuật khối phổ hai lần MS/MS. - Detector: là bộ phận có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ. Có 2 dạng detector truyền thống: nhân electron và nhân quang. c) Sắc ký lỏng – khối phổ @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
  30. Sắc ký lỏng – khối phổ là kỹ thuật sắc ký lỏng có đầu ra kết nối với khối phổ. Bộ nguồn ion hóa bằng phun sƣơng khử solvat cho phép chuyền chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi để ion hóa. Phƣơng pháp sắc ký lỏng – khối phổ đƣợc ứng dụng nhiều trong phân tích các chất độc và xác định nồng độ thuốc trong cơ thể do có nhiều ƣu điểm nhƣ [1]: - Cho thông tin về cấu trúc chất phân tích. - Tính chọn lọc cao. - Độ nhạy cao, giới hạn phát hiện có thể đến 10-14 gam nên kỹ thuật này thƣờng đƣợc dùng để phân tích hàm lƣợng siêu vết. - Có thể phân tích các chất dựa vào tỷ lệ m/z của ion phân tử và ion sản phẩm mà không cần tách hoàn toàn các thành phần trong mẫu có nhiều thành phần. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
  31. CHƢƠNG2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Nền mẫu giàu tinh bột có nguy cơ nhiễm aflatoxin cao nên chúng tôi lựa chọn dƣợc liệu giàu tinh bột nhƣ Cát căn, Trạch tả, Hoài sơn, để xây dựng quy trình định lƣợng các aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) trong dƣợc liệu. Các mẫu đƣợc thu mua trên thị trƣờng Hà Nội. Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu mua Tên dƣợc Địa điểm lấy Tên dƣợc Địa điểm lấy STT STT liệu mẫu liệu mẫu 1 Cát căn 1 11 Trạch tả 3 Chợ Ninh Phố Lãn Ông 2 Cát căn 2 12 Trạch tả 4 Hiệp 3 Cát căn 3 Chợ Ninh 13 Ý dĩ 1 Phố Lãn Ông 4 Cát căn 4 Hiệp 14 Ý dĩ 2 5 Bạch linh 1 15 Ý dĩ 3 Chợ Ninh Phố Lãn Ông 6 Bạch linh 2 16 Ý dĩ 4 Hiệp 7 Bạch linh 3 Chợ Ninh 17 Hoài sơn 1 Phố Lãn Ông 8 Bạch linh 4 Hiệp 18 Hoài sơn 2 9 Trạch tả 1 19 Hoài sơn 3 Chợ Ninh Phố Lãn Ông 10 Trạch tả 2 20 Hoài sơn 4 Hiệp 2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị 2.2.1. Chất chuẩn Chuẩn Aflatoxin (Supelco, USA): AFB1 (Lot: LB04859); AFB2 (Lot: LB04871); AFG1 ( Lot: LB02201); AFG2 (Lot: LB04861) dạng lỏng có nồng độ 1 ppm. 2.2.2. Hóa chất - Các dung môi dùng cho LCMS: methanol, acetonitril của hãng Merck. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
  32. - Các dung môi, hóa chất dùng để xử lý mẫu methanol, ethanol mua của Trung Quốc và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích P.A. - Hóa chất tinh khiết phân tích: natri clorid (Merck, Đức). - Nƣớc cất sử dụng là nƣớc cất hai lần đã đƣợc deion hóa. 2.2.3. Thiết bị, dụng cụ - Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ 2 lần LC-MS/MS 8045 của Shimadzu - Cột sắc ký Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 µm) của Shimadzu - Máy lắc ngang HS 260 (IKA, Đức) - Cột chiết pha rắn Aflatest chứa kháng thể đơn dòng (VICAM, Mỹ) - Bộ dụng cụ chiết pha rắn Visiprep TM 24 (Supelco, Mỹ) - Cân phân tích Mettle Toledo có độ chính xác 0,1mg (Mettle Toledo, Thụy Sĩ) - Cân kỹ thuật XT1200c có độ chính xác 0,01g (Precisa Gravimetry, Thụy Sĩ) - Pipet chính xác có thể điều chỉnh thể tích 10-100ϻL và 100-1000ϻL - Ống ly tâm nhựa 50 mL - Vial 1,8 mL - Pipet Pasteur - Giấy lọc. 2.3. Nội dung nghiên cứu 2.3.1. Thu thập mẫu nghiên cứu - Thu thập mẫu Cát căn, Trạch tả, hạt Sen để tiến hành nghiên cứu. - Thái mẫu, sấy mẫu dƣợc liệu ở nhiệt độ 50oC đến khi độ ẩm đạt khoảng 5%. - Bảo quản trong túi kín cho tới khi đƣa vào nghiên cứu chiết xuất. 2.3.2. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu Nghiên cứu xây dựng và thẩm định phƣơng pháp phân tích: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
  33. - Tối ƣu hóa điều kiện khối phổ (MS) - Tối ƣu hóa điều kiện sắc ký lỏng - Nghiên cứu phƣơng pháp chiết xuất và làm sạch mẫu với mục đích thu đƣợc hàm lƣợng aflatoxin là lớn nhất. - Thẩm định phƣơng pháp theo hƣớng dẫn của AOAC 2.3.3. Áp dụng phƣơng pháp đánh giá hàm lƣợng aflatoxin trong các mẫu dƣợc liệu giàu tinh bột trên thị trƣờng Hà Nội Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng đánh giá mức độc ô nhiễm aflatoxin trên các mẫu dƣợc liệu thu mua trên thị trƣờng Hà Nội. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phƣơng pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử - Thời gian lấy mẫu: Từ 01/10/2018 – 20/04/2019. - Địa điểm lấy mẫu: chợ Ninh Hiệp, phố Lãn Ông. - Khối lƣợng mẫu: 0,5 kg/mẫu. - Dƣợc liệu đƣợc xay nhỏ, đựng trong túi nilon - Bảo quản ở nơi thoáng mát. 2.4.2. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc kí - Tối ƣu hóa điều kiện khối phổ (MS): Lựa chọn ion mẹ, ion con, các thế Q1, Q2, Q3 thích hợp để thu đƣợc tín hiệu phân tích cao nhất. - Tối ƣu hóa điều kiện sắc ký lỏng: Thành phần pha động, chƣơng trình gradient. - Nghiên cứu phƣơng pháp chiết xuất và làm sạch mẫu với mục đích thu đƣợc hàm lƣợng aflatoxin là lớn nhất: Khảo sát thành phần dung môi chiết, dung môi loại tạp. 2.4.3. Quy trình thẩm định phƣơng pháp 2.4.3.1. Tính đặc hiệu/ chọn lọc - Khái niệm @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  34. Tính đặc hiệu: là khả năng phát hiện chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác nhƣ: các tiền chất, các chất chuyển hóa, tạp chất. Tính chọn lọc: là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung quy trình. - Xác định: Phƣơng pháp sắc kí lỏng khối phổ Sử dụng phƣơng pháp xác nhận (confirmation method) là một cách rất tốt để đảm bảo tính đặc hiệu của phƣơng pháp. Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP (điểm nhận dạng – indenfication point) đối với các phƣơng pháp khác nhau để khẳng định chắc chắn sự có mặt của một chất. 2.4.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lƣợng (LOQ) - Khái niệm Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ hoặc khối lƣợng nhỏ nhất có thể đƣợc phát hiện với mức tin cậy xác định. Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lƣợng bằng phƣơng pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn. - Xác định: Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) Phân tích mẫu ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N). Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích. N: Nhiễu đƣờng nền. LOD đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đƣờng nền, thông thƣờng lấy S/N=3. LOQ đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10-20 lần nhiễu đƣờng nền, thông thƣờng lấy S/N=10. 2.4.3.3. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn - Khái niệm: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  35. Khoảng tuyến tính của một phƣơng pháp phân tích: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ chất phân tích. Đường chuẩn: là đƣờng biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ các chất phân tích. - Xác định: Đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu và nồng độ. Vẽ đƣờng cong phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính. 2.4.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi Độ lặp lại (độ chụm): là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và đƣợc biểu diễn bằng độ lệch chuẩn S hay độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%): ( ) ⃐ ∑ ( ̅) √ Trong đó: - xi : Nồng độ tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ i. - ̅ : Nồng độ trung bình tính đƣợc của N lần thử nghiệm. - N: Số lần thử nghiệm. Độ đúng của phương pháp: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị đƣợc chấp nhận là đúng. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
  36. Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu đƣợc so với giá trị lý thuyết. ( ) Trong đó: - R: độ thu hồi (%). - C: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/mL). - Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/mL). 2.4.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu Các kết quả đƣợc tính toán tự động theo phần mềm phân tích của thiết bị (phần mềm LCSolution). Xử lý kết quả bằng phần mềm Microsotf Excel. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  37. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát điều kiện khối phổ Kỹ thuật FIA (Flow injection analysis) là một kỹ thuật phân tích sử dụng trong HPLC mà không sử dụng cột sắc ký. Ứng dụng trong khảo sát phổ khối, dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có nồng độ mỗi chất 100 ppb đƣợc tiến hành tiêm vào hệ thống khối phổ với các điều kiện nhƣ sau: - Điều kiện sắc ký: + Pha tĩnh: không lắp cột. + Pha động: ACN: amoni acetat 10 mM (50:50, v/v) + Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút + Thể tích tiêm: 1 uL. - Điều kiện khối phổ: + Nebulizing Gas Flow: 3 L/ phút. + Heating Gas Flow: 10 L/ phút. + Interface Temperature: 300 oC. + DL Temperature: 250oC. + Heat block Temperature: 400oC. + Drying Gas Flow: 10 L/ phút. + Interface Voltage: -5kV đối với ESI-positive Kết quả thu đƣợc khi quan sát ở chế độ ESI-positive, thấy có mảnh ion mẹ [M+H]+ của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có giá trị m/z tƣơng ứng là 313,20; 315,20; 329,15 và 331,15. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu đã đƣợc công bố trƣớc đây. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
  38. Inten.(x10,000,000) 313.20 1.00 0.75 329.15 0.50 315.20 0.25 331.15 0.00 307.5 310.0 312.5 315.0 317.5 320.0 322.5 325.0 327.5 330.0 332.5 335.0 m/z Hình 3.1. Phổ khối của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 quan sát dƣới chế độ ESI-positive Sau đó tiếp tục áp dụng kỹ thuật FIA để tiến hành tối ƣu hóa điều kiện MS/MS tự động. Tiến hành tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có nồng độ mỗi chất 100 ppb, cài đặt thông số máy để tiến hành tối ƣu hóa điều kiện phân mảnh 2 ion con đối với mỗi chất. Kết quả thu đƣợc đƣợc trình bày trong Bảng 3.1. Bảng 3.1. Thông số MS tối ƣu Ion mẹ Mảnh Dwell Time CE Q3 TT Độc tố Q1 (V) [M+H]+ con (msec) (eV) (V) 241,05 25 -11,0 -39,0 -23,0 1 AFB1 313,20 284,95 25 -20,0 -25,0 -25,0 286,95 25 -12,0 -25,0 -27,0 2 AFB2 315,20 259,20 25 -12,0 -33,0 -27,0 243,10 25 -24,0 -23,0 -30,0 3 AFG1 329,15 311,05 25 -23,0 -27,0 -22,0 313,00 25 -25,0 -25,0 -29,0 4 AFG2 331,15 245,00 25 -22,0 -29,0 -23,0 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  39. Inten.(x100,000) Inten.(x10,000) 241.05 2.25 286.95 1.0 284.95 2.00 0.9 269.00 0.8 1.75 0.7 1.50 0.6 259.20 1.25 243.10 0.5 1.00 0.4 0.75 0.3 0.50 0.2 0.25 0.1 0.0 0.00 245.0 250.0 255.0 260.0 265.0 270.0 275.0 280.0 m/z 245.0 250.0 255.0 260.0 265.0 270.0 275.0 280.0 285.0 m/z AFB1 AFB2 Inten.(x10,000) Inten.(x10,000) 5.5 243.10 4.5 313.00 5.0 4.5 4.0 4.0 3.5 3.5 311.05 3.0 245.00 3.0 2.5 2.5 2.0 2.0 1.5 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 250 260 270 280 290 300 310 m/z 250 260 270 280 290 300 m/z AFG1 AFG2 Hình 3.2. Phổ khối của ion con các aflatoxin Nhận xét: Trong định lƣợng bằng phƣơng pháp MRM, ion con có tín hiệu cao hơn thƣờng đƣợc lựa chọn để định lƣợng hàm lƣợng của chất phân tích, còn ion con có tín hiệu thấp hơn đƣợc lựa chọn để xác nhận sự có mặt của chất phân tích đó. Kết quả tối ƣu hóa thu đƣợc cho thấy, các ion con 241,05; 286,95; 243,10 và 313,00 đƣợc lựa chọn để định lƣợng tƣơng ứng AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2. Còn các ion con 284,95; 259,20; 311,05 và 245,00 đƣợc lựa chọn để định tính tƣơng ứng các độc tố này. 3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký 3.2.1. Lựa chọn pha tĩnh Qua tham khảo các nghiên cứu trƣớc đây, các tác giả thƣờng sử dụng cột C18 để phân tích các độc tố aflatoxin. Đây cũng là loại pha tĩnh đƣợc sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm. Các cột pha tĩnh nhồi các hạt có kích thƣớc nhỏ (1,7 µm, 1,9 µm ) và chiều dài cột ngắn cho hiệu lực tách cao cũng nhƣ giảm thời gian phân tích. @ D Schoolựa trên đi ềofu ki Medicineện phòng thí nghi andệm, Pharmacy, VNU 29
  40. chúng tôi lựa chọn cột Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 µm) của Shimadzu để tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký khác. 3.2.2. Khảo sát pha động Trong phƣơng pháp sắc kí lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hƣởng tới quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hƣởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích. Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion dƣơng, quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất nhƣ acid acetic, acid formic, amoni acetat. Qua tham khảo các nghiên cứu trƣớc đây, các tác giả thƣờng lựa chọn amoni acetat để tiến hành phân tích các aflatoxin. - Các điều kiện sắc ký đƣợc giữ cố định nhƣ sau: + Pha tĩnh: Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 µm) + Pha động: Kênh A: ACN; Kênh B: amoni acetat 10 mM + Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút + Thể tích tiêm: 5 uL. + Nhiệt độ cột: 30oC - Điều kiện khối phổ: Nhƣ mục 3.1. Chế độ quan sát MRM. Chúng tôi dùng dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 nồng độ mỗi chất10 ppb để tiến hành khảo sát tỷ lệ thành phần pha động với 2 chƣơng trình gradient nhƣ sau Bảng 3.2. Một số chƣơng trình gradient khảo sát Gradient 1 Gradient 2 Thời gian Thời gian %ACN %ACN (phút) (phút) 0,01 - 1,5 10 - 30 0,01 - 1,5 30 - 60 1,5 - 3 30 - 90 1,5 - 3 60 - 90 3 – 3,5 90 3 – 3,5 90 3,5 - 4 90 - 10 3,5 - 4 90 - 30 4 - 5,5 10 @ School4 - 5,5 of Medicine30 and Pharmacy, VNU 30
  41. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Hình 3. 3. Sắc ký đồ chƣơng trình gradient 1 Hình 3. 4. Sắc ký đồ chƣơng trình gradient 2 Nhận xét: Với chƣơng trình gradient 1, píc bị chẻ píc và kéo đuối. Với chƣơng trình gradient 2, píc của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 tƣơng đối @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
  42. gọn, cân xứng và giảm hiện tƣợng chẻ píc. Vì vậy chúng tôi lựa chọn chƣơng trình gradient 2 để tiến hành các khảo sát tiếp theo. Bảng 3. 3. Các thông số sắc ký ứng với chƣơng trình gradient 2 Thông số AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Hệ số đối xứng (As) 1,077 1,121 1,082 1,203 tR (phút) 3,130 3,038 3,040 2,940 Nhƣ vậy, chúng tôi đã khảo sát đƣợc điều kiện sắc ký và điều kiện khối phổ nhƣ sau: Điều kiện khối phổ: + Nebulizing Gas Flow: 3 L/ + Heat block Temperature: 400oC. phút. + Drying Gas Flow: 10 L/ phút. + Heating Gas Flow: 10 L/ phút. + Interface Voltage: -5kV. + Interface Temperature: 300 oC. + Chế độ: ESI + DL Temperature: 250oC. Ion mẹ Mảnh Dwell Time CE Q3 TT Độc tố Q1 (V) [M+H]+ con (msec) (eV) (V) 241,05 25 -11,0 -39,0 -23,0 1 AFB1 313,20 284,95 25 -20,0 -25,0 -25,0 286,95 25 -12,0 -25,0 -27,0 2 AFB2 315,20 259,20 25 -12,0 -33,0 -27,0 311,05 25 -23,0 -27,0 -22,0 3 AFG1 329,15 243,10 25 -24,0 -23,0 -30,0 313,00 25 -25,0 -25,0 -29,0 4 AFG2 331,15 245,00 25 -22,0 -29,0 -23,0 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
  43. Điều kiện sắc ký: + Pha tĩnh: Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 µm) + Pha động: Kênh A: ACN; Kênh B: amoni acetat 10 mM + Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút + Thể tích tiêm: 5 uL. + Nhiệt độ cột: 30oC Thời gian 0 - 1,5 1,5 – 3 3 - 3,5 3,5 – 4 4– 5,5 (phút) % ACN 30 - 60 60 - 90 90 90 - 30 30 3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 3.3.1. Khảo sát dung môi chiết mẫu Trong các nghiên cứu trƣớc đây, các tác giả thƣờng sử dụng hỗn hợp methanol : nƣớc với tỷ lệ 80 : 20 hoặc 75 : 25 để tiến hành phân tích các aflatoxin. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát các dung môi chiết mẫu khác nhau nhằm tìm ra điều kiện phụ hợp với phòng thí nghiệm. Quy trình xử lý mẫu nhƣ sau: Cân chính xác khoảng 25 g dƣợc liệu vào bình nón dung tích 250 ml. Thêm khoảng 5 g NaCl. Thêm chính xác 100 ml dung môi chiết methanol : nƣớc (với 2 tỷ lệ khảo sát là 80 : 20 và 60 : 40). Lắc ngang trên máy lắc ngang 30 phút. Lọc lấy dịch lọc. Lấy chính xác 10 ml dịch lọc, pha loãng với 40 ml nƣớc. Ly tâm, lấy dịch lọc. Lấy chính xác 10 ml dịch lọc mẫu bên trên. Cho qua cột SPE-IM với tốc độ 1 ml/phút. Rửa tạp bằng 20 ml dung dịch đệm PBS. Rửa giải bằng 1 ml methanol. Lọc qua màng lọc 0,22 µm thu đƣợc dung dịch sắc ký. Cả 2 khảo sát đều đƣợc tiến hành thêm chuẩn hỗn hợp AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 sao cho dịch chạy sắc ký có nồng độ khoảng 5 ppb. Kết quả đƣợc đánh giá trên hiệu suất thu hổi so với dung dịch chuẩn có nồng độ tƣơng ứng. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.4. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
  44. Bảng 3.4. Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi khác nhau Dung môi chiết TT Độc tố MeOH : H2O (60 : 40) MeOH : H2O (80 : 20) 1 AFB1 85,1% 87,2% 2 AFB2 75,2% 90,1% 3 AFG1 62,5% 85,6% 4 AFG2 61,2% 84,2% Nhận xét: Khi tiến hành thay đổi dung môi chiết, hiệu suất thu hồi của AFB1 thay đổi không đáng kể, trong khi AFB2, AFG1 và AFG2 có hiệu suất thu hồi cao hơn khi sử dụng dung môi chiết là MeOH : nƣớc (80 : 20). Vì vậy để hiệu suất thu hồi đạt cao nhất chúng tôi lựa chọn dung môi MeOH : nƣớc (80 : 20) để tiến hành các khảo sát tiếp theo. 3.3.2. Khảo sát dung môi làm sạch Khi tiến hành làm sạch dịch chiết bằng cột ái lực miễn dịch SPE-IM, dung môi làm sạch có vai trò quan trọng đối với hiệu suất thu hồi của các chất phân tích. Chúng tôi tiến hành khảo sát các dung môi làm sạch nhƣ dung dịch đệm PBS, dung môi MeOH : H2O (5 : 95) và MeOH (10 : 95). Tiến hành xử lý mẫu nhƣ mục 3.3.1, dịch lọc trƣớc khi làm sạch bằng cột SPE-IM đƣợc tiến hành thêm chuẩn AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 sao cho dịch chạy sắc ký có nồng độ khoảng 5 ppb. Kết quả thu đƣợc đánh giá trên hiệu suất thu hồi của chất phân tích so với dung dịch chuẩn có nồng độ tƣơng ứng. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.5. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
  45. Bảng 3.5. Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi làm sạch Dung môi làm sạch TT Độc tố PBS MeOH : H2O (5 : 95) MeOH : H2O (25 : 75) 1 AFB1 88,5% 83,5% 80,1% 2 AFB2 89,1% 84,4% 81,2% 3 AFG1 86,2% 80,1% 78,4% 4 AFG2 86,3% 81,2% 75,3% Nhận xét: Kết quả thu đƣợc cho thấy, khi sử dụng dung môi làm sạch là MeOH : H2O với tỷ lệ MeOH tăng dần thì hiệu suất thu hồi giảm đi. Vì vậy chúng tôi lựa chọn dung dịch PBS làm dung môi làm sạch. 3.4. Thẩm định phƣơng pháp 3.4.1. Độ chọn lọc của phƣơng pháp Để xác định tính chọn lọc đối với sắc kí khối phổ, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp xác nhận. Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP (điểm nhận dạng – indenfication point) đối với sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LC- MS/MS) là 4. Tức là cần có 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con. Bảng 3.6. Ion mẹ và ion con của aflatoxin Ion mẹ TT Độc tố Ion con Vai trò Số điểm IP [M+H]+ 241,05 Định lƣợng 1 AFB1 313,20 4 284,95 Định tính 286,95 Định lƣợng 2 AFB2 315,20 4 259,20 Định tính 243,10 Định lƣợng 3 AFG1 329,15 4 311,05 Định tính 313,00 Định lƣợng 4 AFG2 331,15 4 245,00 Định tính @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
  46. Nhƣ vậy phƣơng pháp có tính đặc hiệu đáp ứng yêu cầu. Để xác định chắc chắn phƣơng pháp có tính đặc hiệu cao, chúng tôi đã tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu thử thêm chuẩn và mẫu chuẩn. Kết quả cho thấy mẫu trắng không cho các mảnh m/z của chất phân tích. Trên sắc đồ mẫu thử xuất hiện các píc của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có thời gian lƣu trùng khớp với thời gian lƣu trên mẫu chuẩn. Nhƣ vậy, phƣơng pháp có tính đặc hiệu cao. A. Mẫu thử thêm chuẩn B. Mẫu chuẩn C. Mẫu trắng Hình 3.5. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phƣơng pháp 3.4.2. Tính phù hợp hệ thống Để xác định tính phù hợp hệ thống của phƣơng pháp, chúng tôi tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch hỗn hợp chuẩn AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có nồng độ là 5 ppb với điều kiện đã khảo sát. Tiến hành ghi lại thời gian lƣu và diện tích píc tƣơng ứng. Kết quả thu đƣợc nhƣ Bảng 3.7. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
  47. Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phƣơng pháp AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 TT tR S píc tR S píc tR S píc tR S píc (phút) (mAu.s) (phút) (mAu.s) (phút) (mAu.s) (phút) (mAu.s) 1 3,130 44067 3,035 22233 3,047 41642 2,954 26136 2 3,131 45179 3,031 24103 3,045 42011 2,955 26269 3 3,135 44906 3,037 23211 3,057 42099 2,956 27016 4 3,137 46022 3,031 23089 3,042 44013 2,949 25076 5 3,139 47031 3,033 24093 3,041 41098 2,951 28031 6 3,136 45056 3,039 23093 3,050 43072 2,956 27904 TB 3,135 45376 3,034 23303 3,047 42322 2,954 26738 SD 0,004 1022,93 0,003 708,15 0,006 1051,57 0,003 1136,07 RSD(%) 0,11 2,25 0,11 3,04 0,19 2,48 0,10 4,25 Nhận xét: Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tƣơng đối của diện tích píc và thời gian lƣu của các aflatoxin đều nhỏ hơn 5,0%, cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống LC-MS/MS sử dụng là phù hợp và đảm bảo độ ổn định của phép phân tích định lƣợng aflatoxin. 3.4.3. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính Để xây dựng khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn. Chúng tôi tiến hành chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn aflatoxin với khoảng nồng độ từ 0,1 – 10 ppb. Tiến hành sắc ký với điều kiện đã khảo sát. Ghi lại tín hiệu píc và tiến hành xây dựng mối tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích píc. Kết quả khảo sát sự tƣơng quan giữa diện tích píc và nồng độ aflatoxin trình bày trong Bảng 3.8. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 37
  48. Bảng 3.8. Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc của các chất AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Nồng Nồng Nồng Nồng S S S S độ píc độ píc độ píc độ píc (mAU.s) (mAU.s) (mAU.s) (mAU.s) (ppb) (ppb) (ppb) (ppb) 0,1 2012 0,5 4812 0,1 2181 0,5 5771 0,5 10990 1 9922 0,5 10254 1 14652 1 19686 2,5 22233 1 19990 2,5 26136 2,5 44067 5 52060 2,5 41642 5 50601 5 105197 10 116191 5 94393 10 91849 10 185637 10 184789 Y = 18795x + Y = 8891,2x Y = 18475x + Y = 11779x - 1434,6 +4015,3 63,89 37178 R2 = 0,9949 R2 = 0,9967 R2 = 0,9989 R2 = 0,9967 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 38
  49. Đường chuẩn của AFB1 Đường chuẩn AFB2 200000 100000 y = 18795x + 1434.6 y = 8891.2x + 4015.3 80000 150000 R² = 0.9949 R² = 0.9967 60000 100000 40000 Diện tích píc Diện Diện tích Diện píc 50000 20000 0 0 0 5 10 15 0 5 10 15 Nồng độ (ppb) Nồng độ (ppb) Đường chuẩn của AFG1 Đường chuẩn của AFG2 200000 140000 120000 y = 18475x + 63.89 y = 11779x - 3717.8 150000 R² = 0.9989 100000 R² = 0.9956 80000 100000 60000 40000 Diện tích Diện píc Diện tích Diện píc 50000 20000 0 0 0 5 10 15 0 5 10 15 Nồng độ (ppb) Nồng độ (ppb) Hình 3.6. Đƣờng chuẩn của các độc tố aflatoxin Nhận xét: Đƣờng chuẩn đƣợc đánh giá thông qua hệ số tƣơng quan R2. Kết quả đánh giá đƣờng chuẩn đƣợc trình bày trong Bảng 3. cho thấy R2 lớn hơn 0,99 cho thấy đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng có độ tuyến tính cao đảm bảo để thực hiện phép phân tích định lƣợng các aflatoxin. 3.4.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) Để đánh giá LOD và LOQ của phƣơng pháp, chúng tôi thêm chuẩn vào mẫu thử không chứa chất phân tích sao cho mức nồng độ cuối cùng ở mức 5 ppb. Sau đó tiến hành pha loãng trên nền mẫu thực không chứa chất phân tích và phân tích đến khi thu đƣợc chiều cao chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu đƣờng nền. Từ đó xác định LOD và LOQ. Kết quả thu đƣợc nhƣ Bảng 3.9. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 39
  50. Bảng 3.9. Kết quả xác định LOD và LOQ của phƣơng pháp AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 LOD (µg/kg) 0,010 0,020 0,015 0,025 LOQ (µg/kg) 0,033 0,066 0,045 0,075 3.4.5. Độ lặp lại và độ thu hôi Độ lặp lại và độ thu hồi của phƣơng pháp đƣợc đánh giá bằng cách phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các mức nồng độ khác nhau 50, 100, 150 ng/mL (tƣơng ứng 500, 1000, 1500 µg/kg trên mẫu), phân tích lặp lại 6 lần cho mỗi nồng độ. Các kết quả tính độ lệch chuẩn tƣơng đối và độ thu hồi đƣợc trình bày trong bảng 3.12. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 40
  51. Bảng 3.10. Độ lặp lại và độ thu hồi của aflatoxin trên nền mẫu dƣợc liệu Mức Nồng độ (ppb) Độ thu hồi (%) thêm Mẫu chuẩn AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 TT-1 1,21 1,12 1,33 1,26 96,8 89,6 106,4 100,8 TT-2 1,20 1,41 1,35 1,35 96,0 112,8 108,0 108,0 2,5 TT-3 1,19 1,02 1,05 1,37 95,2 81,6 84,0 109,6 µg/kg tƣơng TT-4 1,35 1,11 1,43 1,09 108,0 88,8 114,4 87,2 ứng TT-5 1,09 1,09 1,11 1,13 87,2 87,2 88,8 90,4 1,25 TT-6 1,42 1,31 1,34 1,39 113,6 104,8 107,2 111,2 ppb TB 1,24 1,18 1,27 1,27 SD 0,11 0,14 0,14 0,12 RSD(%) 8,81 11,61 10,89 9,28 TT-1 2,32 2,43 2,47 2,33 92,8 97,2 98,8 93,2 TT-2 2,46 2,16 2,59 2,34 98,4 86,4 103,6 93,6 5 TT-3 2,39 2,33 2,23 2,17 95,6 93,2 89,2 86,8 µg/kg TT-4 2,22 2,37 2,34 2,29 88,8 94,8 93,6 91,6 tƣơng TT-5 2,09 2,19 2,21 2,47 ứng 83,6 87,6 88,4 98,8 2,5 TT-6 2,04 2,12 2,25 2,52 81,6 84,8 90,0 100,8 ppb TB 2,25 2,27 2,35 2,35 SD 0,17 0,13 0,15 0,13 RSD(%) 7,40 5,59 6,49 5,37 TT-1 3,71 3,65 3,47 3,44 98,9 97,3 92,5 91,7 TT-2 3,55 3,45 3,79 3,67 94,7 92,0 101,1 97,9 7,5 TT-3 3,35 3,49 3,55 3,73 89,3 93,1 94,7 99,5 µg/kg TT-4 3,79 3,67 3,89 3,53 101,1 97,9 103,7 94,1 tƣơng TT-5 3,42 3,51 3,65 3,69 ứng 91,2 93,6 97,3 98,4 3,75 TT-6 3,84 3,93 3,74 3,45 102,4 104,8 99,7 92,0 ppb TB 3,61 3,62 3,68 3,59 SD 0,20 0,18 0,16 0,13 RSD(%) 5,58 4,90 4,24 3,56 Nhận xét: Theo quy định của AOAC, phần trăm tìm lại tại khoảng nồng độ 1 – 5 µg/Kg đạt trong khoảng 40 – 120% và RSD(%) ≤ 30 [3]. Kết quả thu đƣợc có độ đúng từ 81,6 -@ 113,6 School% và RSD(%) of Medicine từ 3,56 - 11,6 and1% Pharmacy, VNU 41
  52. chứng tỏ phƣơng pháp có độ chính xác cao, độ lặp lại tốt khi phân tích các aflatoxin trong dƣợc liệu. 3.5. Áp dụng phƣơng pháp đánh giá hàm lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng, tiến hành đánh giá hàm lƣợng aflatoxin trong các mẫu dƣợc liệu giàu tinh bột thu mua trên thị trƣờng Hà Nội. Mỗi mẫu đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần độc lập. Kết quả nhƣ Bảng 3.11. Bảng 3.11. Kết quả hàm lƣợng aflatoxin trên các mẫu dƣợc liệu giàu tinh bột Tên dƣợc Địa điểm lấy AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 STT liệu mẫu (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) 1 Cát căn 1 (-) (-) (-) (-) Phố Lãn Ông 2 Cát căn 2 (-) (-) (-) (-) 3 Cát căn 3 Chợ Ninh (-) (-) (-) (-) Hiệp 4 Cát căn 4 (-) (-) (-) (-) 5 Bạch linh 1 (-) (-) (-) (-) Phố Lãn Ông 6 Bạch linh 2 (-) (-) (-) (-) 7 Bạch linh 3 Chợ Ninh (-) (-) (-) (-) 8 Bạch linh 4 Hiệp (-) (-) (-) (-) 9 Trạch tả 1 (-) (-) (-) (-) Phố Lãn Ông 10 Trạch tả 2 (-) (-) (-) (-) 11 Trạch tả 3 Chợ Ninh (-) (-) (-) (-) 12 Trạch tả 4 Hiệp (-) (-) (-) (-) 13 Ý dĩ 1 (-) (-) (-) (-) Phố Lãn Ông 14 Ý dĩ 2 (-) (-) (-) (-) 15 Ý dĩ 3 Chợ Ninh (-) (-) (-) (-) 16 Ý dĩ 4 Hiệp 0,37 (-) 0,60 (-) 17 Hoài sơn 1 Phố Lãn Ông (-) (-) (-) (-) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 42
  53. 18 Hoài sơn 2 (-) (-) (-) (-) 19 Hoài sơn 3 Chợ Ninh (-) (-) (-) (-) 20 Hoài sơn 4 Hiệp (-) (-) (-) (-) *Ghi chú: (-) : Không phát hiện chất phân tích Nhận xét: Kết quả thu đƣợc cho thấy hầu hết các mẫu dƣợc liệu thu mua trên địa bạn Hà Nội đều không phát hiện aflatoxin. Mẫu YD4 đƣợc thu mua tại chợ Ninh Hiệp có phát hiện AFB1 và AFG1 hàm lƣợng lần lƣợt là 0,37 và 0,60 µg/kg. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 43
  54. CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN Nhƣ vậy, nhóm nghiên cứu đã tiến hành xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng các aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2) trong dƣợc liệu với quy trình phân tích nhƣ sau: Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 25 g dƣợc liệu vào bình nón dung tích 250 ml. Thêm khoảng 5 g NaCl. Thêm chính xác 100 ml dung môi chiết methanol : nƣớc tỷ lệ 80 : 20. Lắc ngang trên máy lắc ngang 30 phút. Lọc lấy dịch lọc. Lấy chính xác 10 ml dịch lọc, pha loãng với 40 ml nƣớc. Ly tâm, lấy dịch lọc. Lấy chính xác 10 ml dịch lọc mẫu bên trên. Cho qua cột SPE-IM với tốc độ 1 ml/phút. Rửa tạp bằng 20 ml dung dịch đệm PBS. Rửa giải bằng 1 ml methanol. Lọc qua màng lọc 0,22 µm thu đƣợc dung dịch sắc ký. + Nebulizing Gas Flow: 3 L/ + Heat block Temperature: 400oC. phút. + Drying Gas Flow: 10 L/ phút. + Heating Gas Flow: 10 L/ phút. + Interface Voltage: -5kV. + Interface Temperature: 300 oC. + Chế độ: ESI + DL Temperature: 250oC. Ion mẹ Mảnh Dwell Time CE Q3 TT Độc tố Q1 (V) [M+H]+ con (msec) (eV) (V) 241,05 25 -11,0 -39,0 -23,0 1 AFB1 313,20 284,95 25 -20,0 -25,0 -25,0 286,95 25 -12,0 -25,0 -27,0 2 AFB2 315,20 259,20 25 -12,0 -33,0 -27,0 311,05 25 -23,0 -27,0 -22,0 3 AFG1 329,15 243,10 25 -24,0 -23,0 -30,0 313,00 25 -25,0 -25,0 -29,0 4 AFG2 331,15 245,00 25 -22,0 -29,0 -23,0 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 44
  55. Điều kiện sắc ký: + Pha tĩnh: Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 µm) + Pha động: Kênh A: ACN; Kênh B: amoni acetat 10 mM + Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút + Thể tích tiêm: 5 uL. + Nhiệt độ cột: 30oC Thời gian 0 - 1,5 1,5 – 3 3 - 3,5 3,5 – 4 64– 5,5 (phút) % ACN 30 - 60 60 - 90 90 90 - 30 30 - Nhóm nghiên cứu đã tiến hành định lƣợng aflatoxin trong các mẫu dƣợc liệu giàu tinh bột (Cát căn, Hoài sơn, Ý dĩ, Trạch tả, Bạch linh) thu mua tại một số cửa hàng dƣợc liệu trên thị trƣờng Hà Nội. Kết quả thu đƣợc cho thấy hầu hết các mẫu dƣợc liệu đều không phát hiện aflatoxin. Trong đó có mẫu YD4 phát hiện hàm lƣợng AFB1 và AFG1 lần lƣợt là 0,37 và 0,60 µg/kg. Mức này thấp hơn so với quy định trong Dƣợc điển Hồng Kông (Hàm lƣợng AFB1 không quá 5 µg/kg và tổng hàm lƣợng AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 không quá 10 µg/kg).  Kiến nghị: 1. Mở rộng đối tƣợng nghiên cứu trên các nền mẫu khác, nghiên cứu các độc tố vi nấm khác trong dƣợc liệu. 2. Khảo sát số lƣợng mẫu lớn hơn để sàng lọc các đối tƣợng dƣợc liệu có tỷ lệ nhiễm aflatoxin cao. 3. Khảo sát sâu các dƣợc liệu có nguy cơ nhiễm aflatoxin cao để có phƣơng hƣớng khắc phục, xử lý. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 45
  56. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. GS.TS Trần Từ An (2007), Hóa phân tích, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr.107-316. 2. Nguyễn Thị Kim Ánh (2008), Nghiên cứu phân tích độc tố nấm Aflatoxin trong dược liệu bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS, Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. 3. Bộ môn Hóa phân tích (2006), Môi trường và độc chất môi trường, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, tr.142-147. 4. Bộ Y tế (2011), Thông tƣ Ban hành các Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm hóa học trong thực phẩm, Số 02/2011/TT-BYT, tr.20-22. 5. Lê Thị Hồng Hảo (2014), Khảo sát mức độ nhiễm mycotoxin trong ngô và lạc tại tỉnh Bắc Giang, Luận văn tốt nghiệp Dƣợc sĩ, Đại học Dƣợc Hà Nội, tr.18-19. 6. GS.TS Từ Quang Hiển, GS.TS Đậu Ngọc Hào, TS Lê Thị Ngọc Diệp, TS Từ Trung Kiên (2012), Độc tố trong thức ăn chăn nuôi, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, tr.8-10. 7. Phan Thanh Lam (2016), Đánh giá hàm lượng afaltoxin B1 trong một số loại dược liệu, Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. 8. Nguyễn Đình Nga, Nguyễn Thị Kiều Khanh, Văn Phố (2012), “Khảo sát mức độ nhiễm nấm và aflatoxin B1 (AFB1) trên một số mẫu dƣợc liệu đƣợc bán ở quận 5-thành phố Hồ Chí Minh”, Y Học TP Hồ Chí Minh, tập 16, số 1, tr.93-96. 9. TS. Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, tr.5-35. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 46
  57. 10. Nguyễn Tƣờng Vy, Trần Việt Hùng (2012), “Nghiên cứu phân tích afaltoxin trong dƣợc liệu bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS)”, Nghiên cứu dược và thông tin thuốc, Số 2, tr.5-55. Tài liệu tiếng Anh 11. Agag BI (2004), “Mycotoxins in foods and feeds: 1-aflatoxins”, Univ Bull Env Res, Vol 7(1), pp.173-205. 12. Bbosa GS, A. Lubega, David B. Kyegombe, David Kitya, Jasper Ogwal- Okeng, William W. Anokbonggo (2013), “Review of the biological and health effects of aflatoxins on body organs and body system”, Aflatoxins- Recent Adv Future Prospects, pp.239-256. 13. Bbosa GS, Kitya D, Odda J, Ogwal-Okeng J (2013), “Aflatoxins metabolism, effects on epigenetic mechanisms and their role in carcinogenesis”, Health, tập 5, pp.14-34. 14. D. Dhanasekaran, A. Panneerselvam, N. Thajuddin, S. Shanmugapriya (2011), “Aflatoxins and aflatoxicosis in human and animals”, Aflatoxins – Biochem Mol Biol, INTECH, pp.221-244. 15. Goldblatt L (2012), Aflatoxin: scientific background, control, and implications, Elsevier, Dutch. 16. Gómez‐Catalán, J. Piqué, E. Falcó, G. Borrego, N. Rodamilans, M. & Llobet, J. M. (2005). Determination of aflatoxins. 17. Hamid AS, Tesfamariam IG, Zhang Y, Zhang ZG (2013), “Aflatoxin B1- induced hepatocellular carcinoma in developing countries: Geographical distribution, mechanism of action and prevention (Review)”, Oncology Letter, Vol 5(4), pp.1087-1092. 18. Hong Kong Chinese Materia Media Standards (HKCMMS) Oficce, "Determination of Mycotoxin (Aflatoxins)", Vol 4, pp.29-30. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 47
  58. 19. Humans IWG on the E of CR to, Organization WH, Cancer IA for R on (2002), Some traditional herbal medicines, some mycotoxins, naphthalene and styrene, World Health Organization. 20. Laura Mejía-Teniente, Angel María Chapa-Oliver, Irineo Torres- Pacheco, Moises Alejandro Vazquaez-Cuz, Ramón Gerardo Guevara- González (2011), “Aflatoxins Biochemistry and Molecular Biology – Biotechnological Approaches for Control in Crops”, Aflatoxins – Detect Meas Control, INTECH Open Access Publisher, pp.317-343. 21. Magda Carvajal, Pasvel Castillo (2002), “Effects of aflatoxins contaminating food on human health”, Trop Biol Conserv Manag, Số 3, pp.1-6. 22. Merk index (2001), Vol 1, pp.34-35. 23. Jonathan H. Williams, Timothy D. Phillips, Pauline E. Jolly, Jonathan K. Stiles, Curtis M. Jolly, Deepak Aggarwal (2004), “Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences and interventions”, Am J Clin Nutr, Số 80.(5), pp.1106- 1122. 24. Prado, G., Altoé, A. F., Gomes, T. C., Leal, A. S., Morais, V. A., Oliveira, M. S., & Silva, D. A. (2012), “Occurrence of aflatoxin B1 in natural products”, Brazilian Journal of Microbiology, 43(4), pp.1428- 1435. 25. Turner NW, Sreenath Subrahmanyam, Sergy A. Piletsky (2009), “Analytical methods for determination of mycotoxins: a review”, Analytica Chimica Acta, Số 632.(2), pp.168-180. 26. Ventura, M. Gómez, A. Anaya, I. Díaz, J. Broto, F. Agut, M. & Comellas, L. (2004), “Determination of aflatoxins B1, G1, B2 and G2 in medicinal herbs by liquid chromatography–tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography A, 1048(1), pp.25-29. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 48
  59. 27. Wu F, Stacy SL, Kensker TW (2013), “Global risk assessment of aflatoxins in maize and peanuts: Are regulatory standards adequately protective?”, Toxicol Sci, Số 135.(1), pp.251-259. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 49
  60. PHỤ LỤC Dung dịch chuẩn AFB1 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 55000 185637 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 528 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 10 ppb 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 35000 105197 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 5 ppb 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 12500 41745 10000 7500 5000 2500 53 0 145 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 @3.0 School3.5 4.0 of4.5 Medicine5.0 min and Pharmacy, VNU
  61. Nồng độ 2,5 ppb 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 7000 19686 6000 5000 4000 3000 2000 1000 130 256 89 0 173 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 1 ppb 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 4000 10990 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 89 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 0,5 ppb 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 3000 2500 2000 1500 1000 2012 500 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 @3.0 School3.5 4.0 of Medicine4.5 5.0 min and Pharmacy, VNU
  62. Nồng độ 0,1 ppb Dung dịch chuẩn AFB2 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 125000 100000 75000 50000 91741 25000 12103 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 10 ppb 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 70000 60000 50000 40000 30000 20000 50601 10000 7022 133 122 0 66 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 5 ppb 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 30000 25000 20000 15000 10000 26136 5000 3852 316 290 0 290 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 @3.0 School3.5 4.0 of4.5 Medicine5.0 min and Pharmacy, VNU
  63. Nồng độ 2.5 ppb 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 15000 12500 10000 7500 5000 14652 2500 207 165 111 0 154 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 1 ppb 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 5771 2000 1000 809 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 0,5 ppb Dung dịch chuẩn AFG1 125000 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 100000 75000 185161 50000 25000 0 173 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 @3.0 School3.5 4.0 of4.5 Medicine5.0 min and Pharmacy, VNU
  64. Nồng độ 10 ppb 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 110000 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 94393 20000 10000 0 591 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 5 ppb 55000 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 41745 10000 5000 53 0 145 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 2,5 27500 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 25000 22500 20000 17500 15000 12500 10000 7500 19990 5000 2500 738 166 130 0 @ School131 of Medicine and Pharmacy, VNU 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min
  65. Nồng độ 1 ppb 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 12500 10000 7500 5000 10254 2500 0 94 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 0.5 ppb 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 2181 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 0.1 ppb Dung dịch chuẩn AFG2 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  66. 4:AFG2 331.15>313.00(+) CE: -25.0 40000 35000 30000 25000 20000 66040 15000 10000 5000 289 234 256 0 264 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 10 ppb 4:AFG2 331.15>313.00(+) CE: -25.0 60000 50000 40000 30000 20000 52060 10000 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 5 ppb 4:AFG2 331.15>313.00(+) CE: -25.0 25000 22500 20000 17500 15000 12500 10000 7500 22599 5000 2500 363 306 307 0 259 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Nồng độ 2.5 ppb @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  67. Nồng độ 1 ppb Nồng độ 0.5 ppb SẮC KÝ ĐỒ MẪU THỬ Mẫu phát hiện Mẫu YD4 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 4890 500 179 244 199 254 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min AFG1 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  68. 4:AFG2 331.15>313.00(+) CE: -25.0 600 500 400 300 200 100 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min AFG2 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 3000 2500 2000 1500 5639 1000 500 100 167 67 67 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min AFB1 1750 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min AFB2 Mẫu không phát hiện Mẫu BL1 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  69. 200 1:AFB1 TIC(+) 175 150 125 100 75 50 25 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 2:AFB2 TIC(+) 250 225 200 175 150 125 100 75 50 25 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 3:AFG1 TIC(+) 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  70. 2750 4:AFG2 TIC(+) 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Mẫu TT1 1:AFB1 TIC(+) 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  71. 500 2:AFB2 TIC(+) 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 3:AFG1 TIC(+) 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 4:AFG2 TIC(+) 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Mẫu CC1 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  72. 1:AFB1 TIC(+) 700 600 500 400 300 200 100 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 2:AFB2 TIC(+) 300 250 200 150 100 50 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 3:AFG1 TIC(+) 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  73. 4:AFG2 TIC(+) 12500 10000 7500 5000 2500 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Mẫu HS1 2250 1:AFB1 TIC(+) 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 600 2:AFB2 TIC(+) 500 400 300 200 100 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  74. 2250 3:AFG1 TIC(+) 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 4:AFG2 TIC(+) 11000 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min @ School of Medicine and Pharmacy, VNU