›

Khóa luận Xây dựng mô hình và bước đầu đánh giá tác dụng chống huyết khối của cao giàu saponin tam thất hoang trên chuột thực nghiệm

pdf 51 trang thiennha21 18/04/2022 5821
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Xây dựng mô hình và bước đầu đánh giá tác dụng chống huyết khối của cao giàu saponin tam thất hoang trên chuột thực nghiệm", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_xay_dung_mo_hinh_va_buoc_dau_danh_gia_tac_dung_cho.pdf

Nội dung text: Khóa luận Xây dựng mô hình và bước đầu đánh giá tác dụng chống huyết khối của cao giàu saponin tam thất hoang trên chuột thực nghiệm

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y – DƢỢC NGUYỄN THỊ GIANG XÂY DỰNG MÔ HÌNH VÀ BƢỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG HUYẾT KHỐI CỦA CAO GIÀU SAPONIN TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội - 2018
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y – DƢỢC NGUYỄN THỊ GIANG XÂY DỰNG MÔ HÌNH VÀ BƢỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG HUYẾT KHỐI CỦA CAO GIÀU SAPONIN TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa : QH.2013.Y Ngƣời hƣớng dẫn : PGS.TS.DƢƠNG THỊ LY HƢƠNG © School of Medicine and Pharmacy, VNU Hà Nội – 2018
  3. LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cám ơn đến toàn thể Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Bộ môn Y Dược học cơ sở đã tạo điều kiện cho em được làm khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa đã dìu dắt, giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PSG.TS. Dương Thị Ly Hương người đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô ở Bộ môn Dược lí – Dược lâm sàng đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận. Em cũng xin cảm ơn đề tài thuộc chương trình Tây Bắc: “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13-18 đã tài trợ kinh phí để em thực hiện nội dung nghiên cứu này. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, động viên giúp em hoàn thành khóa luận này. Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy cô để khoá luận thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Giang © School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải nghĩa BĐT Bơm điện tử COX – 1 Cyclooxygenase 1 DMSO Dimethyl sulfoxide Heparin TLPT Heparin trọng lượng phân tử thấp thấp HKTMS Huyết khối tĩnh mạch sâu IC50 Liều ức chế 50% đối tượng thử (Inhibitory Concentration 50%) κ - carrageenan Kappa – carrageenan LD50 Liều gây chết 50% đối tượng thử ( Lethal Dose 50%) TDD Tiêm dưới da © School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Quá trình đông máu 4 Hình 1.2 Sơ đồ tóm tắt quá trình điều trị huyết khối tĩnh mạch 8 Hình 1.3 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) 14 Hình 1.4 Saponin dẫn chất acid oleanolic 16 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất cao giàu hoạt chất từ tam thất hoang 19 Hình 2.2 Sơ đồ tiến hành mô hình gây huyết khối đuôi chuột 22 Hình 3.1 Huyết khối đuôi chuột gây bởi ĸ-carrageenan tiêm phúc mạc 23 Hình 3.2 Phần trăm huyết khối đuôi chuột sau 24 giờ gây huyết khối (A), 24 48 giờ gây huyết khối (B), 72 giờ gây huyết khối (C) Hình 3.3 Phần trăm huyết khối 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ sau khi tiêm κ- 25 carrageenan 20mg/kg Hình 3.4 Ảnh hưởng của đường tiêm κ-carrageenan đến sự hình thành 26 huyết khối Hình 3.5 Ảnh hưởng của sự nhúng đuôi nước đá đến sự hình thành huyết 27 khối Hình 3.6 Ảnh hưởng của aspirin và heparin đến sự hình thành huyết khối 28 Hình 3.7 Ảnh hưởng của tam thất hoang đến sự hình thành huyết khối 30 đuôi chuột © School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng Trang Bảng 1.1 Các thuốc sử dụng trong dự phòng huyết khối 7 Bảng 3.1 Mức độ gây huyết khối đuôi chuột sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ 23 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian nhúng đuôi nước đá đến phần trăm 26 huyết khối Bảng 3.3 Ảnh hưởng của aspirin và heparin đến sự hình thành huyết 28 khối Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tam thất hoang đến sự hình thành huyết khối 29 © School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Huyết khối 2 1.1.1. Định nghĩa 2 1.1.2. Phân loại 2 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh huyết khối 3 1.2. Phòng và điều trị huyết khối 6 1.2.1. Phòng và điều trị huyết khối tĩnh mạch 6 1.2.2. Phòng và điều trị huyết khối động mạch 12 1.3. Tam thất hoang 14 1.3.1. Đặc điểm thực vật 14 1.3.2. Phân bố 15 1.3.3. Thành phần hóa học 15 1.3.4. Tác dụng dược lý 16 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 18 2.2. Động vật nghiên cứu 18 2.3. Hóa chất 18 2.4. Thiết bị và dụng cụ 19 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.5.1. Xây dựng mô hình huyết khối đuôi chuột bằng κ-carrageenan 20 2.5.2. Đánh giá tác dụng chống huyết khối của tam thất hoang 21 2.6. Phƣơng pháp phân tích số liệu 22 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1. Kết quả 23 3.1.1. Xây dựng mô hình huy ©ế tSchool khối đuôi chuof ộMedicinet bằng ĸ-carrageenan and Pharmacy, 23 VNU 3.1.2. Xác định thuốc chứng dương 27
  8. 3.1.3. Tác dụng chống huyết khối của tam thất hoang 29 3.2. Bàn luận 30 3.2.1. Mô hình gây huyết khối bằng κ-carrageenan 30 3.2.2 Thuốc chứng dương 33 3.2.3. Tác dụng chống huyết khối của tam thất hoang 35 3.2.4 Hạn chế nghiên cứu 37 KẾT LUẬN 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO © School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Huyết khối là nguyên nhân quan trọng dẫn đến tắc nghẽn mạch máu gây ra tử vong hoặc để lại những di chứng nặng nề cho người bệnh [39]. Huyết khối có thể hình thành ở động mạch hoặc tĩnh mạch. Huyết khối động mạch có thể dẫn đến nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não hoặc đột quỵ. Huyết khối tĩnh mạch thường gặp ở chi dưới gây biến chứng thuyên tắc phổi dẫn đến tử vong đột ngột hoặc hội chứng hậu huyết khối với biểu hiện loét, đau nhức và giới hạn vận động chi dưới. Theo Global Burden of Disease Study năm 1997, có khoảng 6,3 triệu người trên toàn thế giới tử vong do thiếu máu cơ tim và 4,4 triệu người tử vong do đột quỵ [46] và đây cũng là nguyên nhân hàng đầu gây gánh nặng bệnh tật ở Hoa Kỳ năm 2013 [42]. Nhóm thuốc được sử dụng chủ yếu hiện nay là thuốc chống đông và thuốc ức chế kết tập tiểu cầu với thời gian và liều dùng phải tuân thủ theo chế độ điều trị nghiêm ngặt thì mới có hiệu quả. Tuy nhiên, các thuốc này thường kèm theo những tác dụng không mong muốn như: clopidogrel hoặc aspirin dùng đơn thuần hay kết hợp có liên quan đến tăng nguy cơ loét dạ dày tá tràng [7, 49], sử dụng heparin có nguy cơ gây chảy máu [7, 48] Để hạn chế những nhược điểm nói trên Y – Dược học trong nước và thế giới có xu hướng quay trở về với liệu pháp thiên nhiên. Tam thất hoang có tên khoa học là Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng, họ Nhân sâm - Araliaceae, phân bố chủ yếu ở Hoàng Liên Sơn. Các kết quả nghiên cứu phân tích và tách chiết thành phần hóa học trước đây của tam thất hoang chỉ ra rằng phần thân rễ của cây chứa nhiều saponin khung olean với hàm lượng tương đối cao, các báo cáo về tác dụng của loài này còn rất hạn chế, hầu hết là các nghiên cứu in vitro. Nghiên cứu của Lê Thị Tâm và Nguyễn Thị Tuyết Trinh đã chứng minh rằng phân đoạn n-butanol chứa nhiều saponin của tam thất hoang có tác dụng chống kết tập tiểu cầu ở liều 5 mg/mL [12] và tác dụng chống đông ở liều 2 – 5 mg/mL [15] trên in vitro. Mà sự hình thành huyết khối lại phụ thuộc vào quá trình đông máu và sự hoạt hóa tiểu cầu, như vậy, với tác dụng chống đông và chống kết tập tiểu cầu in vitro của phân đoạn n-butanol, liệu chúng có tác dụng chống huyết khối in vivo hay không? Để trả lời câu hỏi đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng mô hình và bước đầu đánh giá tác dụng chống huyết khối của cao giàu saponin tam thất hoang trên chuột thực nghiệm” với mục đích : 1. Xây dựng được mô hình gây huy ©ết khSchoolối đuôi chu ofộ tMedicine nhắt bằng κ- carrageenanand Pharmacy,. VNU 2. Bước đầu đánh giá tác dụng chống huyết khối của cao giàu saponin tam thất hoang trên mô hình đã xây dựng. 1
  10. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Huyết khối 1.1.1. Định nghĩa Huyết khối là tình trạng bệnh lý do sự phát động và lan rộng bất hợp lý của phản ứng đông cầm máu của cơ thể, dẫn đến hình thành cục máu đông trong lòng (tắc hoàn toàn, bán tắc hay nghẽn mạch). Trong đó, tiểu cầu và một loạt các protein đông máu (các yếu tố đông máu) góp phần hình thành cục máu đông [44]. 1.1.2. Phân loại Tuỳ theo loại huyết khối (tĩnh mạch, động mạch hay vi mạch) mà có sự khác nhau về thành phần huyết khối cũng như vai trò của các yếu tố khác nhau trong hình thành huyết khối.  Huyết khối động mạch Thành phần chủ yếu của cục máu đông trong huyết khối động mạch là tiểu cầu, sau đó mới là fibrin và những thành phần khác [40]. Sự tổn thương thành mạch và tăng hoạt hoá tiểu cầu đóng vai trò chủ yếu trong tăng đông, từ đó gây ra huyết khối động mạch. Các yếu tố nguy cơ thường gặp như: tăng huyết áp, đái tháo đường, rối loạn lipid, hút thuốc  Huyết khối tĩnh mạch. Thành phần chính của huyết khối tĩnh mạch là fibrin [40]. Tăng đông do giảm các chất ức chế đông máu (như giảm antithrombin III, protein C, protein S ) hoặc tăng hoạt hoá các yếu tố đông máu (như động mạch sau phẫu thuật, tai biến, sản khoa do thoái hóa các yếu tố tổ chức ) là nguyên nhân chính gây huyết khối tĩnh mạch. Tình trạng bất động, nhiễm trùng, có thai sẽ làm tăng khả năng bị huyết khối tĩnh mạch ở những bệnh nhân này.  Huyết khối ở các vi quản. Thường gặp ở bệnh nhân có hội chứng đông máu rải rác trong lòng mạch (DIC: Disseminated Intravasscular Coagulation), xuất huyết giảm tiểu cầu huyết khối (TTP: Thrombotic Thrombocytopenic Purpura) Thường do một tình trạng tăng đông gây nên bởi đa yếu tố: thành mạch, tiểu cầu, hoạt hoá các yếu tố đông máu huyết tương. © School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  11. 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh huyết khối Sự cầm máu là quá trình duy trì tính toàn vẹn của hệ thống tuần hoàn khép kín sau khi mạch máu bị tổn thương. Khi xảy ra một tổn thương mạch máu, các yếu tố đông máu sẽ cùng với nội mạc mạch máu nhanh chóng bắt đầu hàng loạt phản ứng để tạo nút cầm máu. Các tiểu cầu tuần hoàn sẽ di chuyển đến và bám dính vào chỗ tổn thương, nơi chúng trở thành một thành phần chính của huyết khối đang phát triển; sự đông máu bắt nguồn từ yếu tố mô, sau đó là sự hình thành thrombin và fibrin. Những sự kiện này diễn ra đồng thời, và trong điều kiện bình thường, các cơ chế điều chỉnh có thể tạo thành huyết khối tạm thời nhờ sự cân bằng giữa hệ thống hoạt hóa và ức chế đông máu. Khi mất cân bằng giữa hệ thống hoạt hóa và ức chế đông máu thì quá trình hình thành huyết khối cũng bắt đầu. 1.1.3.1. Co mạch máu Ngay khi mạch máu bị tổn thương, thành mạch co lại làm hạn chế máu chảy ra khỏi thành mạch. Mạch máu bị tổn thương càng nhiều thì mức độ co mạch càng mạnh. Sự co mạch tại chỗ có thể kéo dài nhiều phút hoặc thậm chí đến vài giờ. Trong thời gian này sẽ diễn ra sự hình thành nút tiểu cầu và đông máu. 1.1.3.2. Sự hình thành nút tiểu cầu Sự kết dính và hoạt hóa tiểu cầu Bình thường, tiểu cầu lưu thông trong lòng mạch và không bám dính vào tế bào nội mạc. Thành mạch máu với lớp lót bên trong của nội mô, rất quan trọng cho việc duy trì sự toàn vẹn của mạch máu. Các yếu tố nội mô tham gia điều hòa huyết khối bao gồm: oxit nitric (NO), prostacyclin và ectonucleotidase CD39 - cùng nhau tạo ra một hệ thống phòng chống sự hình thành huyết khối [41]. Collagen ở lớp dưới nội mô và yếu tố mô giúp duy trì một hệ thống tuần hoàn kín. Nhưng khi thành mạch bị tổn thương, lớp collagen nằm bên dưới tế bào nội mạc mạch máu được bộc lộ. Tiểu cầu sẽ đến kết dính vào lớp collagen này qua các thụ thể glycoprotein Ia/IIa bề mặt đặc hiệu với collagen. Sự gắn kết này sau đó được gia cố bởi yếu tố von Willebrand, với vai trò tạo các liên kết giữa glycoprotein Ib - V - IX tiểu cầu với các sợi collagen. Sau đó tiểu cầu được hoạt hóa, phình to ra, thò các chân giả và giải phóng một lượng lớn ADP, thromboxan A2 , serotonin Đến lượt mình, các chất này hoạt hóa các tiểu cầu khác. Tiểu cầu thay đ ổ©i hình School dạng, b ộofc lộMedicine bề mặt phospholipid and Pharmacy, cần VNU cho sự bám dính của các yếu tố đông máu. Fibrinogen kết nối các tiểu cầu gần nhau 3
  12. bằng cách tạo ra các liên kết thông qua glycoprotein IIb/IIIa. Ngoài ra, tiểu cầu còn được hoạt hóa bởi thrombin. Kết tập tiểu cầu ADP và thromboxan A2 vừa được giải phóng ra sẽ hoạt hoá các tiểu cầu ở gần và làm chúng dính vào lớp tiểu cầu ban đầu gọi là kết tập tiểu cầu. Rồi lớp tiểu cầu đến sau này lại giải phóng các chất hoạt động làm hoạt hoá và dính thêm lớp tiểu cầu khác. Cứ như vậy, các lớp tiểu cầu kế tiếp nhau dính vào tổn thương càng lúc càng nhiều tạo nên nút tiểu cầu. Tuy nhiên, nút tiểu cầu là một nút cầm máu lỏng lẻo, nó chỉ hiệu quả đối với các thương tổn nhỏ của thành mạch. Nếu tổn thương mạch máu lớn hơn, cần phải có cục máu đông phối hợp để cầm máu. Quá trình kết tụ tiểu cầu có vai trò quan trọng của các glycoprotein IIb, IIIa và các yếu tố fibrinogen, fibronectin 1.1.3.3. Quá trình đông máu Hình 1.1: Quá © trìnhSchool đông máuof Medicine and Pharmacy, VNU 4
  13. Quá trình đông máu có sự tham gia của các yếu tố đông máu (của huyết tương, tiểu cầu và của tổ chức). Hầu hết các yếu tố đông máu có bản chất là protein (trừ yếu tố IV là Ca++) có vai trò như những enzym. Bình thường các yếu tố đông máu có trong huyết tương, tiểu cầu và tổ chức tồn tại ở dạng không hoạt động khi xuất hiện một yếu tố bất thường chúng được hoạt hóa một cách trình tự theo kiểu bậc thang để cuối cùng tạo thành cục máu đông. Quá trình đông máu là một chuỗi các phản ứng xảy ra theo kiểu bậc thang được chia thành 3 giai đoạn như sau: a) Giai đoạn hình thành prothrombinase theo con đường nội sinh và ngoại sinh [1] Con đường ngoại sinh: Mô bị tổn thương giải phóng yếu tố III (thromboplastin tổ chức, thành phần có phospholipid và lipoprotein). Yếu tố III sẽ hoạt hoá yếu tố VII. Rồi yếu tố VII hoạt hóa (VIIa: activate) cùng với thromboplastin tổ chức và Ca2+ hoạt hoá tiếp yếu tố X. Yếu tố Xa kết hợp với phospholipid (từ tổ chức hoặc tiểu cầu) và yếu tố Va cùng với sự có mặt Ca2+ tạo nên phức hợp prothrombinase. Thời gian tạo nên phức hợp prothrombinase theo con đường ngoại sinh xảy ra rất nhanh, khoảng 15 giây. Con đường nội sinh: xảy ra chậm hơn, khoảng 1-6 phút và được khởi phát khi bản thân thành mạch máu bị tổn thương hoặc máu tiếp xúc với collagen (được lộ ra do tế bào nội mạc bị tổn thương). Điều này dẫn đến sự hoạt hoá yếu tố XII và tiểu cầu hoạt hóa giải phóng phospholipid tiểu cầu. Yếu tố XIIa sẽ hoạt hoá yếu tố XI, phản ứng này cần có kininogen và kallikrein. Yếu tố XIa tiếp tục hoạt hoá yếu tố IX. Yếu tố VIIa trong con đường ngoại sinh cũng tham gia hoạt hoá yếu tố IX. Yếu tố IXa cùng với yếu tố VIIIa (được hoạt hoá bởi thrombin) và phospholipid tiểu cầu sẽ hoạt hoá yếu tố X. Yếu tố Xa kết hợp với phospholipid (từ tổ chức hoặc tiểu cầu) và yếu tố Va cùng sự có mặt Ca2+ tạo nên phức hợp prothrombinase. b) Giai đoạn hình thành thrombin Sau khi prothrombinase được hình thành, nó chuyển prothrombin thành thrombin chỉ sau vài giây. Trong phức hợp prothrombonase, yếu tố Xa là một enzym phân giải protein thực sự, nó chuyển prothrombin thành thrombin. Một khi thrombin được hình thành, nó sẽ hoạt hoá yếu tố V. Rồi yếu tố Va càng thúc đẩy tác dụng của yếu tố Xa tạo nên sự điều hoà ngược dương tính. © School of Medicine and Pharmacy, VNU Thrombin cũng là enzym phân giải protein, nó có thể tác động lên chính prothrombin để tăng tạo thrombin. Ngoài ra nó còn thúc đẩy hoạt hoá các yếu tố 5
  14. VIII, IX, X, XI, XII, và sự kết tập tiểu cầu. Khi thrombin được hình thành, nó sẽ khởi phát sự điều hoà ngược dương tính để tạo ra nhiều thrombin hơn nữa và quá trình đông máu tiếp tục phát triển cho đến khi có một cơ chế ngăn chặn nó lại. c) Giai đoạn hình thành fibrin và cục máu đông Thrombin cùng với Ca2+ chuyển fibrinogen thành phân tử fibrin đơn phân. Các fibrin đơn phân này nối với nhau tạo thành các sợi fibrin để từ đó hình thành mạng lưới của cục máu đông. Lúc đầu các cầu nối giữa các fibrin là cầu nối hydro lỏng lẻo nên cục máu đông yếu, dễ tan rã. Sau vài phút, nhờ sự có mặt của yếu tố ổn định fibrin (yếu tố XIII, được hoạt hoá bởi thrombin) các cầu nối đồng hoá trị thay thế cầu nối hydro, đồng thời có thêm các dây nối chéo giữa các sợi fibrin kế cận tạo nên mạng lưới fibrin bền vững. Mạng lưới này giam giữ các tế bào máu, tiểu cầu, huyết tương tạo nên cục máu đông. Tiểu cầu bị giam giữ trong cục máu đông đóng vai trò quan trọng trong việc co cục máu này, nhờ vào các protein co như thrombosthenin, actin và myosin. Tiểu cầu dính với các sợi fibrin nên khi co lại chúng làm các sợi này càng nối chặt với nhau. Các tiểu cầu này còn tiếp tục tiết yếu tố ổn định fibrin làm tăng cường các cầu nối giữa các sợi fibrin kế cận. Ngoài ra, sự co này còn được thúc đẩy bởi thrombin và bởi Ca2+ được tiết ra từ các kho dự trữ trong tiểu cầu. Cuối cùng, cục máu đông trở thành một khối nhỏ hơn và đặc hơn. Sự co cục máu đông đã kéo các bờ của thương tổn mạch máu sát vào nhau nên càng làm vết thương được bít kín hơn và ổn định được sự chảy máu. 1.2. Phòng và điều trị huyết khối 1.2.1. Phòng và điều trị huyết khối tĩnh mạch Huyết khối tĩnh mạch bao gồm huyết khối tĩnh mạch sâu (HKTMS) và thuyên tắc phổi, xảy ra như là kết quả của sự hình thành huyết khối trong tĩnh mạch. 1.2.1.1. Dự phòng huyết khối tĩnh mạch Tất cả bệnh nhân phải trải qua kiểm tra đánh giá nguy cơ huyết khối tĩnh mạch khi nhập viện. Bệnh nhân được coi là có nguy cơ cao bao gồm những người giảm đáng kể khả năng vận động, có bệnh béo phì, bệnh ác tính, tiền sử huyết khối tĩnh mạch hoặc bệnh nhân trên 60 tuổi. Bệnh nhân có nguy cơ chảy máu (ví dụ: đột quỵ cấp tính, giảm tiểu cầu, rối loạn ch ả©y máuSchool di truy ofền) Medicinechỉ nên được điandều tr ịPharmacy, bằng VNU thuốc khi nguy cơ chảy máu không vượt quá nguy cơ huyết khối tĩnh mạch [40]. 6
  15. Dự phòng huyết khối bằng thuốc trong phẫu thuật nói chung thường nên dùng liên tục trong 5-7 ngày, hoặc cho đến khi bệnh nhân có thể vận động trở lại. Điều trị dự phòng bằng thuốc nên được kéo dài đến 28 ngày sau khi phẫu thuật ung thư lớn ở vùng bụng hoặc xương chậu. Phẫu thuật thay thế hông hoặc đầu gối, và phẫu thuật gãy xương hông, đòi hỏi thời gian dự phòng kéo dài, điều này tùy thuộc vào chế phẩm được sử dụng. Bảng 1.1 Các thuốc sử dụng trong dự phòng huyết khối [40] Thuốc dự phòng Chỉ định Heparin trọng lượng phân tử Tất cả các loại phẫu thuật tổng quát và chỉnh hình. thấp (TLPT thấp) Heparin (không phân đoạn) Ưu tiên cho bệnh nhân suy thận. Fondaparinux natri Bệnh nhân trải qua phẫu thuật thay khớp hông hoặc đầu gối, phẫu thuật gãy xương hông, thủ thuật dạ dày-ruột, nhi khoa hoặc phẫu thuật hàng ngày. Apixaban, dabigatran Điều trị huyết khối sau phẫu thuật thay khớp hông etexilate, và rivaroxaban hoặc đầu gối. Edoxaban Dự phòng đột quỵ và thuyên tắc hệ thống ở những bệnh nhân rung nhĩ không van tim và ít nhất có một yếu tố nguy cơ khác. Bệnh nhân có nguy cơ cao về huyết khối tĩnh mạch nên được cung cấp thuốc dự phòng khi nhập viện. Bệnh nhân nên dùng heparin trọng lượng phân tử thấp, heparin (không phân đoạn) (nếu bệnh nhân suy thận) hoặc natri fondaparinux. Dự phòng cơ học (ví dụ: băng chun) có thể được cung cấp cho các bệnh nhân khi dự phòng bằng thuốc không được chỉ định và được dùng cho đến khi bệnh nhân có thể vận động trở lại. Edoxaban - một chất ức chế yếu tố Xa, uống để điều trị và dự phòng huyết khối tĩnh mạch, mặc dù nó không nên được sử dụng thay thế cho heparin không phân đoạn trong thuyên tắc phổi ở bệnh nhân mất ổn định huyết động, những người có thể bị tan huyết khối hoặc những người bị thuyên tắc phổi. Thời gian điều trị nên được xác định bằng cách cân bằng lợi ©ích Schoolcủa việc đi ofều Medicinetrị với nguy cơ and chảy Pharmacy, máu; VNU thời gian điều trị ngắn hơn (ít nhất 3 tháng) nên dựa trên các yếu tố nguy cơ: phẫu 7
  16. thuật gần đây, chấn thương, bất động và thời gian dài hơn nên dựa trên các yếu tố nguy cơ vĩnh viễn, huyết khối tĩnh mạch vô căn hoặc thuyên tắc phổi. 1.2.1.2. Điều trị huyết khối tĩnh mạch Hình 1.2 Sơ đồ tóm tắt quá trình điều trị huyết khối tĩnh mạch (Khuyến cáo về chẩn đoán, điều trị và dự phòng thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch của hội tim mạch học quốc gia Việt Nam) a) Điều trị huyết khối tĩnh mạch sâu [9] Giai đoạn cấp - Heparin TLPT thấp: Hầu hết trường hợp huyết khối tĩnh mạch sâu chi dưới (HKTMS chi dưới) (trừ bệnh nhân suy thận nặng). Đặc biệt ưu tiên trong HKTMS chi dưới do ung thư, hoặc phụ nữ có thai. Liều dùng: Phác đồ 1: Enoxaparin 1mg/kg x 2 lần/ngày (cách nhau 12 giờ) tiêm dưới da (TDD) bụng. Phác đồ 2: Enoxaparin © School 1,5mg/kg of Medicine x 1lần/ngày TDDand b ụPharmacy,ng VNU 8
  17. - Fondaparinux: Thay thế cho heparin TLPT thấp (trừ phụ nữ có thai, suy thận nặng). Liều dùng: Dựa vào cân nặng: 5 mg/ngày TDD với bệnh nhân 100 kg. - Heparin không phân đoạn: bệnh nhân suy thận nặng (mức lọc cầu thận 80 tuổi, bệnh nhân suy thận, hoặc đang điều trị verapamil). - Kháng vitamin K: Phối hợp với heparin TLPT thấp, heparin không phân đoạn, Fondaparinux. Liều dùng: Warfarin 3 – 5 mg/ngày; Sintrom 1 – 2 mg/ngày. Giai đoạn duy trì Tất cả bệnh nhân thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch được khuyến cáo duy trì điều trị chống đông hiệu quả ít nhất 3 tháng. Không nên kéo dài quá 3 tháng, với những trường hợp thuyên tắc huyết khố ©i tĩnh School mạch có ofyế uMedicine tố thúc đẩy t ạandm thờ iPharmacy, (như VNU phẫu thuật), hoặc nguy cơ chảy máu cao. Thời gian điều trị có thể kéo dài tới tận 6 9
  18. tháng, hoặc 12 tháng đối với những bệnh nhân chọn lọc, như thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch vẫn còn tồn tại yếu tố thúc đẩy (như ung thư), hoặc không rõ căn nguyên. - Kháng vitamin K: được chỉ định trong hầu hết trường hợp HKTMS chi dưới sau giai đoạn phối hợp với thuốc chống đông đường tiêm, với INR mục tiêu từ 2 – 3. - Heparin TLPT thấp: Chỉ định ưu tiên với bệnh nhân ung thư, hoặc thai phụ trong 3 tháng đầu. - Fondaparinux: chỉ định thay thế cho heparin TLPT thấp (trừ trường hợp có thai), hoặc ở bệnh nhân có giảm tiểu cầu do heparin. - Thuốc chống đông đường uống thế hệ mới: Trường hợp HKTMS chi dưới có chức năng thận bình thường, không muốn dùng đường tiêm. Không cần theo dõi xét nghiệm thường quy. Chỉ làm xét nghiệm đông máu trong một số trường hợp đặc biệt: suy thận nặng, chảy máu nặng do nghi ngờ quá liều thuốc, cần phẫu thuật cấp cứu. Giai đoạn duy trì kéo dài Thời gian điều trị duy trì kéo dài được cá thể hóa, dựa vào đánh giá định kỳ và cân nhắc giữa nguy cơ tái phát và nguy cơ chảy máu. - Bệnh nhân thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch có yếu tố nguy cơ thúc đẩy, được khuyến cáo dùng thuốc chống đông 3 tháng. - Bệnh nhân thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch không có yếu tố nguy cơ thúc đẩy, được khuyến cáo dùng thuốc chống đông tối thiểu 3 tháng. - Bệnh nhân thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch lần đầu, không rõ yếu tố nguy cơ thúc đẩy, nguy cơ chảy máu thấp: có thể cân nhắc điều trị thuốc chống đông kéo dài. - Bệnh nhân thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch tái phát, không rõ yếu tố nguy cơ thúc đẩy, nguy cơ chảy máu thấp: có thể cân nhắc điều trị thuốc chống đông kéo dài (không hạn định). - Với bệnh nhân điều trị thuốc chống đông kéo dài, cần phải định kỳ đánh giá lợi ích và nguy cơ khi dùng thuốc. - Bệnh nhân bị thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch do nguyên nhân bẩm sinh, nguy cơ thuyên tắc cao (thiếu hụt protein C, S, antithrombin III), hoặc mắc phải (hội chứng kháng phosphlipid) nên duy trì điều trị thuốc chống đông kéo dài, nếu nguy cơ chảy máu thấp. © School of Medicine and Pharmacy, VNU - Bệnh nhân ung thư tiến triển, bị thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch và có nguy cơ chảy máu thấp được khuyến cáo điều trị bằng heparin TLPT thấp trong vòng 3 – 10
  19. 6 tháng, sau đó duy trì thuốc chống đông đường uống kéo dài, hoặc tới khi ung thư được chữa khỏi. - Bệnh nhân ung thư tiến triển, bị thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch và có nguy cơ chảy máu cao, nên được duy trì điều trị chống đông kéo dài, hơn là chỉ dùng trong 3 tháng. b) Điều trị thuyên tắc phổi [9] Điều trị thuốc tiêu sợi huyết Chỉ định: Thuốc tiêu sợi huyết được khuyến cáo điều trị cho bệnh nhân thuyên tắc phổi cấp có sốc, tụt huyết áp; được cân nhắc điều trị cho bệnh nhân thuyên tắc phổi cấp nguy cơ tử vong sớm ở mức trung bình cao và có rối loạn huyết động. Ngoài ra, có thể cân nhắc chỉ định cho từng trường hợp chọn lọc như: phải hồi sinh tim phổi, mà nghi ngờ nguyên nhân ngừng tim là do thuyên tắc phổi, có bằng chứng của huyết khối lan rộng (trên phim cắt lớp vi tính, hoặc có vùng giảm tưới máu rộng trên xạ hình/thông khí tưới máu phổi), có huyết khối di động trong buồng tim phải, có giảm oxy máu nặng, có thuyên tắc phổi kèm theo tồn tại lỗ bầu dục. Điều trị thuốc chống đông Bệnh nhân thuyên tắc phổi cấp có sốc và tụt huyết áp: heparin không phân đoạn truyền tĩnh mạch được khuyến cáo điều trị cho ngay sau khi chẩn đoán. Khuyến cáo điều trị thuốc chống đông đường tiêm ngay khi nghi ngờ bệnh nhân có xác suất cao hoặc trung bình bị thuyên tắc phổi cấp, trong khi chờ chẩn đoán xác định. Heparin TLPT thấp hoặc Fondaparinux được khuyến cáo điều trị cho hầu hết bệnh nhân thuyên tắc phổi cấp huyết động ổn định. Kháng Vitamin K với INR mục tiêu từ 2 – 3 được khuyến cáo điều trị cho bệnh nhân thuyên tắc phổi cấp, phối hợp với thuốc chống đông đường tiêm. Thuốc chống đông thế hệ mới: Nếu không điều trị bằng heparin và kháng vitamin K, nhóm ức chế yếu tố Xa (rivaroxaban, apixaban) được khuyến cáo sử dụng điều trị cho bệnh nhân thuyên tắc phổi cấp có huyết động ổn định. Nếu không điều trị kháng vitamin K, nhóm ức chế trực tiếp thrombin (dabigatran) được khuyến cáo sử dụng điều trị cho bệnh nhân thuyên tắc phổi cấp có huyết động ổn định, sau 5 – 7 ngày điều trị heparin TLPT thấp .© Thuốc School chống ofđông Medicine thế hệ mới andkhông Pharmacy, được VNU chỉ định trong trường hợp suy thận. 11
  20. 1.2.2. Phòng và điều trị huyết khối động mạch Tiêu chuẩn chăm sóc hiện tại trong điều trị huyết khối động mạch bao gồm thuốc chống đông máu và ba nhóm thuốc chống kết tập tiểu cầu tiểu cầu: aspirin, nhóm thienopyridin và thuốc đối kháng glycoprotein IIb-IIIa [32]. Thuốc chống đông máu được sử dụng ít hơn trong việc ngăn ngừa sự hình thành huyết khối trong động mạch, do huyết khối động mạch được cấu tạo chủ yếu là tiểu cầu với ít fibrin [40]. Huyết khối động mạch gây ra nhiều bệnh khác nhau, tuy nhiên nghiên cứu này chỉ cung cấp một cái nhìn tổng quan về quản lý ban đầu và lâu dài của cơn thiếu máu cục bộ thoáng qua, đột quỵ thiếu máu cục bộ và xuất huyết nội sọ. a) Cơn thiếu máu cục bộ thoáng qua Bệnh nhân nghi ngờ có cơn thiếu máu cục bộ thoáng qua nên ngay lập tức sử dụng aspirin. Bệnh nhân quá mẫn với aspirin hoặc những người không dung nạp aspirin, mặc dù có sử dụng chất ức chế bơm proton, nên nhận clopidogrel (sử dụng không có giấy phép) sử dụng như một phương án thay thế. Sau khi chẩn đoán xác nhận, bệnh nhân nên được điều trị dự phòng thứ phát. Sau một cơn thiếu máu cục bộ thoáng qua, nên điều trị lâu dài bằng dipyridamole dạng bào chế giải phóng biến đổi kết hợp với aspirin. Nếu bệnh nhân không dung nạp aspirin hoặc aspirin không được chỉ định thì nên điều chỉnh lại dipyridamole. Nếu bệnh nhân không dung nạp dipyridamole hoặc chống chỉ định thì chỉ nên sử dụng aspirin. Những bệnh nhân không dung nạp cả aspirin và dipyridamole chỉ nên dùng clopidogrel một mình (không được cấp phép sử dụng). b) Đột quỵ thiếu máu cục bộ Quản lý ban đầu Alteplase được khuyến cáo trong điều trị đột quỵ thiếu máu cục bộ cấp tính nếu nó có thể được dùng trong vòng 4 - 5 giờ sau triệu chứng khởi phát. Điều trị bằng aspirin nên được bắt đầu 24 giờ sau khi tan huyết khối (hoặc càng sớm càng tốt trong vòng 48 giờ sau khi triệu chứng khởi phát ở bệnh nhân không bị tan huyết khối). Bệnh nhân quá mẫn aspirin, hoặc những người không dung nạp aspirin, nên sử dụng clopidogrel (sử dụng không có giấy phép) như một phương án thay thế. Thuốc chống đông không được © khuy Schoolến cáo thayof Medicinethế cho thuố cand kháng Pharmacy, tiểu VNU cầu trong đột quỵ thiếu máu cục bộ cấp tính ở những bệnh nhân có nhịp xoang. Tuy nhiên, thuốc chống đông đường tiêm có thể được chỉ định ở những bệnh nhân 12
  21. có triệu chứng hoặc có nguy cơ cao bị huyết khối tĩnh mạch sâu hoặc thuyên tắc phổi; warfarin natri không nên bắt đầu trong giai đoạn cấp tính của đột quỵ thiếu máu cục bộ. Thuốc chống đông được cân nhắc ở bệnh nhân rung nhĩ sau khi bị đột quỵ thiếu máu cục bộ, tuy nhiên bệnh nhân có rung nhĩ sau đột quỵ thiếu máu cục bộ nên dùng aspirin trước khi được xem xét điều trị chống đông máu. Bệnh nhân đã dùng thuốc chống đông khi thay van tim giả, có tiền sử đột quỵ thiếu máu cục bộ và có nguy cơ xuất huyết nên ngừng điều trị chống đông trong 7 ngày và thay bằng aspirin. Điều trị tăng huyết áp trong giai đoạn cấp tính của đột quỵ thiếu máu cục bộ có thể dẫn đến giảm tưới máu não, do đó chỉ nên điều trị tăng huyết áp trong trường hợp khẩn cấp. Quản lý lâu dài Bệnh nhân nên được điều trị lâu dài sau cơn thiếu máu cục bộ thoáng qua hoặc đột quỵ thiếu máu cục bộ để giảm nguy cơ các biến cố tim mạch. Sau một cơn đột quỵ thiếu máu cục bộ (không liên quan đến rung nhĩ), clopidogrel được khuyến cáo để điều trị lâu dài. Nếu clopidogrel không được chỉ định hoặc không dung nạp thì bệnh nhân nên dùng dipyridamole dạng giải phóng biến đổi kết hợp với aspirin. Nếu cả aspirin và clopidogrel đều không được chỉ định hoặc không dung nạp thì chỉ nên dùng dipyridamole dạng giải phóng biến đổi. Nếu cả dipyridamole và clopidogrel đều không được chỉ định hoặc không dung nạp thì chỉ nên sử dụng aspirin. Bệnh nhân bị đột quỵ liên quan đến rung tâm nhĩ nên được xem xét để điều trị lâu dài với warfarin natri hoặc thuốc chống đông thay thế. Thuốc chống đông thường không được khuyến cáo trong việc phòng ngừa lâu dài đột quỵ tái phát, ngoại trừ ở những bệnh nhân bị rung tâm nhĩ. c) Xuất huyết nội sọ Quản lý ban đầu Phẫu thuật can thiệp có thể được yêu cầu sau khi xuất huyết nội sọ để loại bỏ tụ máu và giảm áp lực nội sọ. Bệnh nhân © School dùng thu ốofc ch Medicineống đông máu and nên Pharmacy,được VNU dừng điều trị; điều trị chống đông máu chỉ được sử dụng ở những bệnh nhân xuất huyết nội sọ có triệu chứng huyết khối tĩnh mạch sâu hoặc thuyên tắc phổi. 13
  22. Quản lý lâu dài Chỉ nên dùng aspirin cho bệnh nhân có nguy cơ cao bị biến cố thiếu máu cục bộ. Điều trị chống đông máu không được khuyến khích sau xuất huyết nội sọ, ngay cả ở những bệnh nhân bị rung nhĩ, trừ khi bệnh nhân có nguy cơ rất cao của đột quỵ thiếu máu cục bộ hoặc thiếu máu cục bộ tim. 1.3. Tam thất hoang 1.3.1. Đặc điểm thực vật Tam thất hoang còn gọi là dã tam thất, là một trong số những dược liệu hiếm, có tên khoa học: Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng, thuộc họ Nhân sâm – Araliaceae [2, 8]. Tam thất hoang thuộc cây thảo, sống lâu năm, cao 25 – 75cm; thân rễ mập nằm ngang, có nhiều vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khóm thường có 1 thân mang lá, ít khi 2- 3 lá. Lá kép chân vịt, gồm 1 – 3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5 – 10 cm. Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5 – 13cm, rộng 2 – 4 cm, nhọn hai đầu, mép cuống hoa dài 1 – 1,5 cm. Hoa màu vàng xanh với 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô. Quả mọng, gần hình cầu dẹp, đường kính 0,6 – 1,2 cm, khi chín màu đỏ. Qủa gồm 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng. Ra hoa tháng 4 – 5, có quả tháng 5 – 9 [2]. Bộ phận dùng: Thân rễ cây tam thất hoang - Rhizoma Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng © School of Medicine and Pharmacy, VNU Hình 1.3 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) 14
  23. 1.3.2. Phân bố Loài Panax stipuleanatus được hai nhà khoa học người Trung Quốc (Tao Hse Tsai và Kuo Mei Feng) công bố năm 1975 trên tạp chí Acta Phytotaxonomica Sinica. Loài này được tìm thấy đầu tiên tại khu rừng Maguan, Trung Quốc (gần Việt Nam) ở độ cao 1100-1700m so với mặt nước biển. Đây là một trong số những dược liệu hiếm, chỉ phân bố ở tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và và một vài điểm ở vườn Quốc Gia Hoàng Liên thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [4, 8]. Loài có phân bố hẹp ở Việt Nam. Xuất hiện ở huyện Sa Pa (núi Hàm Rồng - thị trấn Sa Pa và xã Tả Phìn) và huyện Bát Xát (xã Trung Lèng Hồ), tỉnh Lào Cai [14]. Sinh học và sinh thái: Cây đặc biệt ưa ẩm và ưa sáng, mọc ở độ cao từ 1600- 2300m rải rác trên đất có nhiều mùn, dưới tán rừng kín thường xanh ẩm. Mùa hoa tháng 4-5, quả tháng 5-9. Nhân giống tự nhiên chủ yếu bằng hạt. Quả chín thường bị chim ăn, hạt rơi xuống đất lại bị loại sóc nhỏ ăn nhân hạt. Cây có thể tái sinh tự nhiên bằng hạt, quả chín rụng ngay xuống đất, xung quanh gốc cây mẹ, nếu không bị tác động, hạt sẽ nảy mầm vào tháng 3 năm sau. Trong tự nhiên, quả chín tồn tại đến tháng 9 hoặc tháng 10. Phần thân mang lá lụi hàng năm vào mùa đông, chồi mới mọc lên từ đầu thân rễ, vào đầu mùa xuân năm sau. Khi thân rễ bị gãy, phần đầu mầm còn lại có khả năng tiếp tục tái sinh [13]. 1.3.3. Thành phần hóa học Các báo cáo về loài này còn rất hạn chế, các kết quả nghiên cứu phân tích và tách chiết thành phần hóa học trước đây của tam thất hoang chỉ ra rằng phần thân rễ của cây chứa nhiều saponin khung olean với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp. Ở Việt Nam nghiên cứu về thành phần hóa học của tam thất hoang mới chỉ mang tính chất thăm dò bước đầu. Năm 2002, Trần Công Luận đã phát hiện sự có mặt của hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo và acid amin, tanin bằng phương pháp thử định tính hóa học và phân tích sơ bộ TLC. Đồng thời bằng các thủy phân saponin rồi kết tinh sapogenin toàn phần thu được oleanolic [10]. Năm 1985, nhóm các nhà nghiên cứu ở Trung Quốc phân lập 2 saponin dẫn chất acid oleanolic là stipuleanosid R1 © và School R2 (16-17), of t ừMedicine dịch chiết methanol and Pharmacy, của VNU thân rễ tam thất hoang [47]. 15
  24. COOR2 R1O OR Hình 1.4 Saponin dẫn chất acid oleanolic Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đại học Toyama (Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng nhỏ từ dịch chiết ethanol của cây tam thất hoang được thu hái ở Trung Quốc [51]. Gần đây, năm 2010, đặc biệt từ rễ của cây tam thất hoang ở Việt Nam, 15 hợp chất saponin (1-15) khung oleanan đã được xác định bởi nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc; trong đó có một chất mới là spinasaponin A methyl ester (1), 3 hợp chất polyyn (16-18), một sesquitecpen (19) và một acid béo (20). Ở giá trị IC50 từ 0.13 đến 41.45 μM, các hợp chất saponin 1, saponin 2, polyyn 16 và polyyen 17 thể hiện tác dụng gây độc tế bào ung thư máu (HL-60) và ruột kết (HCT-116) theo cơ chế gây chết tự nhiên của tế bào (apoptosis) qua phân tích hình thái tế bào, phân mảnh DNA và biểu hiện trên protein kích thích quá trình apoptosis. Trong một công bố khác về hoạt tính sinh học, một số hợp chất saponin 6 -11 biểu hiện ức chế nhân tố sao chép NF-κB với giá trị IC50 từ 3.1 đến 18.9 μM trên dòng tế bào HepG2 liên quan đến khả năng chống ung thư và kháng viêm [43]. 1.3.4. Tác dụng dược lý Năm 2002, Trần Công Luận và cộng sự đã có một số nghiên cứu được công bố: Ở liều LD50 = 8,8 g/kg theo đường uống cao thân rễ và rễ củ tam thất hoang thể hiện độc tính cấp. Cao tam thất hoang có tác dụng phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress, đưa về trạng thái bình thường ở các liều thử nghiệm 44, 88, 176 mg/kg. Bên cạnh đó, ở nồng độ 25, 50, 100μg/ml cao saponin toàn phần của tam thất hoang thể hiện tác dụng chống oxy hóa và ức chế sự hình thành malonyl dialdehyd [10]. Năm 2009, nghiên cứu tác dụng dược lý của tam thất hoang thu hái ở Sapa, Lào Cai của Viện Dược liệu ch©ỉ raSchool rằng phân of đo Medicineạn saponin th andể hiệ nPharmacy, hoạt VNU 16
  25. tính chống oxy hóa-lipid peroxidation và dịch chiết tổng ethanol có tác dụng chống trầm cảm ở liều 44 - 176 mg/kg trên chuột [11]. Năm 2017, nghiên cứu của Lê Thị Tâm đã chứng minh tam thất hoang có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng ở các mức liều 1-2-5 mg/mL; phân đoạn n-butanol ở mức liều 5 mg/mL; phân đoạn n-hexan các mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL; phân đoạn diclomethan không có tác dụng [12]. Bên cạnh đó, Nguyễn Thị Tuyết Trinh cũng đã báo cáo rằng tam thất hoang thể hiện tác dụng chống đông máu in vitro ở các phân đoạn và nồng độ: phân đoạn cao chiết bằng dung môi n-butanol (2 - 5mg/ml), phân đoạn cao chiết bằng dung môi nước (5mg/ml). Gần đây, năm 2010, đặc biệt từ rễ của cây tam thất hoang ở Việt Nam, 15 hợp chất saponin (1-15) khung oleanan đã được xác định bởi nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc; trong đó có một chất mới là spinasaponin A methyl ester (1), 3 hợp chất polyyn (16-18), một sesquitecpen (19) và một acid béo (20). Ở giá trị IC50 từ 0.13 đến 41.45 μM, các hợp chất saponin 1, saponin 2, polyyn 16 và polyyen 17 thể hiện tác dụng gây độc tế bào ung thư máu (HL-60) và ruột kết (HCT-116) theo cơ chế gây chết tự nhiên của tế bào (apoptosis) qua phân tích hình thái tế bào, phân mảnh DNA và biểu hiện trên protein kích thích quá trình apoptosis. Trong một công bố khác về hoạt tính sinh học, một số hợp chất saponin 6 -11 biểu hiện ức chế nhân tố sao chép NF-κB với giá trị IC50 từ 3.1 đến 18.9 μM trên dòng tế bào HepG2 liên quan đến khả năng chống ung thư và kháng viêm [43]. Theo Đông y: tam thất hoang có vị ngọt, hơi đắng, tính ấm, có tác dụng tư bổ cường tráng, tiêu viêm giảm đau, khử ứ sinh tân và cầm máu. Theo kinh nghiệm dân gian, tất cả các bộ phân của cây đều có thể dùng làm thuốc; thân rễ của cây thường dùng làm thuốc bổ, tăng cường dinh dục, chống stress; lá và nụ hoa dùng làm trà uống kích thích tiêu hóa, an thần [2]. © School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
  26. CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Cao giàu saponin của tam thất hoang [5]: là sản phẩm của đề tài “ Xây dựng quy trình chiết cao giàu saponin từ tam thất hoang ( Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)” tiến hành tại khoa Hóa thực vật, viện Dược liệu, do PGS.TS. Đỗ Thị Hà cung cấp, quy trình chiết được thể hiện trong hình 2.1. Cao bán thành phẩm được thu trực tiếp từ dịch chiết tam thất hoang (sau khi loại tạp) bằng phương pháp sấy chân không với hiệu suất chiết cao giàu saponin được báo cáo là 20.59±0.27 %. Độ ẩm của cao giàu hoạt chất 3,07±0,03%, và hàm lượng saponin toàn phần trong cao giàu hoạt chất đạt 32.747±0.3147%. Cao giàu saponin tam thất hoang được pha trong DMSO 0,1%, cho chuột uống với thể tích 0,1 ml/10g. 2.2. Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng, khỏe mạnh, không dị tật, cân nặng 28±3(g), chiều dài đuôi từ 7 cm trở lên được cung cấp bởi Học Viện Quân Y. Chuột thí nghiệm được nuôi thích nghi với môi trường mới 5 ngày trước khi làm thí nghiệm, trong điều kiện phòng nuôi chuột sạch tại khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, nhiệt độ phòng được duy trì ở 20⁰C, độ ẩm khoảng 55±5%, ánh sáng theo chu kỳ 12 giờ sáng / 12 giờ tối. Chuột được cung cấp đầy đủ thức ăn tiêu chuẩn và nước uống sạch theo nhu cầu. Thức ăn của chuột là thức ăn tổng hợp của Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương. 2.3. Hóa chất - Nước cất 2 lần được sản xuất tại bộ môn Hóa Dược, Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội. - Dimethyl sulfoxit (DMSO): pha trong nước cất 2 lần để thu được DMSO 0,1%. - Kappa - carrageenan (κ-carrageenan) (Wako Pure Chem. Ind., Ltd., Osaka, Japan). - Aspirin (Aspergic của hãng SANOFI-AVENTIS Pháp). - Heparin dung dịch tiêm 5000 UI/ml (Heparin Belmed, The Belmedpreparaty RUE, Cộng hòa Belarus). © School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
  27. Bột thô tam thất hoang Kiểm nghiệm dược liệu - Chiết EtOH 50 % - Dung môi/dược liệu (10/1) - To = 90oC - Chiết 1h/lần 3 lần / mẻ. Dịch chiết cồn 50% Cô dưới áp suất giảm Cao lỏng 1:20 Cột resin D101, EtOH 80% Kiểm tra TLC Dịch rửa giải - Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm - Sấy chân không tại 55-60oC, 24 h - Cao giàu hoạt chất Đóng gói Tiêu chuẩn kiểm nghiệm cơ sở Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất cao giàu hoạt chất từ tam thất hoang 2.4. Thiết bị và dụng cụ - Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR - Máy làm đá bào. - Đồng hồ bấm giờ. - Thước đo centimet. © School of Medicine and Pharmacy, VNU - Kim tiêm 1 ml, đầu kim tù để cho chuột uống thuốc. 19
  28. - Một số dụng cụ dùng trong chăn nuôi và pha chế của bộ môn Dược lý, khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.5.1. Xây dựng mô hình huyết khối đuôi chuột bằng κ-carrageenan 2.5.1.1. Xác định liều gây huyết khối tối ưu và thời gian quan sát huyết khối Để gây hiện tượng huyết khối và kiểm tra tác dụng phòng ngừa sự hình thành huyết khối của tam thất hoang trong cơ thể, mô hình huyết khối đuôi chuột được xây dựng dựa trên tham khảo của các nghiên cứu trên thế giới trước đó và có sửa đổi để phù hợp với điều kiện tại Việt Nam. Chuột sau khi nuôi ổn định trong môi trường mới 5 ngày, được chia thành 3 lô, tiêm phúc mạc dung dịch κ-carrageenan (pha trong NaCl 0,9%) cho chuột ở mỗi lô với các mức liều lần lượt là 15 mg/kg – 20 mg/kg – 25 mg/kg. Quan sát phần trăm huyết khối sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ để xác định liều gây huyết khối tối ưu và thời gian quan sát huyết khối phù hợp nhất sau khi tiêm. Phần trăm huyết khối được tính theo công thức: ( ) ( ) ( ) 2.5.1.2. Xác định điều kiện gây huyết khối tối ưu a) Xác định đường tiêm Các nghiên cứu cho thấy có thể dùng κ-carrageenan bằng 2 đường: tiêm phúc mạc và tiêm tĩnh mạch đuôi. Với đường tiêm phúc mạc, cần nhúng đuôi chuột trong nước đá 5 phút trước khi tiêm. Với đường tiêm tĩnh mạch đuôi, cần buộc đuôi chuột ở vị trí cách đầu tự do của đuôi 6cm trước khi tiêm, rồi nhúng đuôi đã buộc trong nước ấm khoảng 40⁰C trong 1 phút (để làm lộ rõ tĩnh mạch đuôi và dễ tiêm), sau khi tiêm κ-carrageenan 1 mg/kg vào tĩnh mạch đuôi chuột thì nhúng đuôi trong đá lạnh 2 phút, tháo dây buộc sau 10 phút kể từ khi tiêm κ- carrageenan vào tĩnh mạch đuôi. Chuột được chia ngẫu nhiên thành 2 lô thí nghiệm, lô 1 tiêm κ-carrageenan đường tiêm phúc mạc, lô 2 tiêm κ-carrageenan đường tiêm tĩnh mạch đuôi, quan sát © School of Medicine and Pharmacy, VNU huyết khối sau 24 giờ, so sánh phần trăm huyết khối giữa 2 lô và rút ra kết luận về đường dùng κ-carrageenan phù hợp. 20
  29. b) Thời gian nhúng đuôi trong nước đá Các nghiên cứu về mô hình gây huyết khối đuôi chuột đều nhấn mạnh vai trò của nhiệt độ phòng, và nhiệt độ đuôi tới sự hình thành huyết khối đuôi chuột. Trong quá trình nghiên cứu, sự thay đổi nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến tần suất và chiều dài huyết khối theo đường tiêm phúc mạc, nên chúng tôi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của thời gian nhúng đuôi chuột trong nước đá đến sự hình thành huyết khối. Trong nghiên cứu này, 3 cách gây lạnh cho đuôi chuột được áp dụng: 1) nhúng đuôi chuột vào nước đá 5 phút trước khi tiêm κ-carrageenan; 2) nhúng đuôi chuột vào nước đá 5 phút trước khi tiêm và 1 phút sau khi tiêm κ-carrageenan; và 3) không nhúng đuôi vào nước lạnh. Sử dụng κ-carrageenan với liều tối ưu, đường tối ưu trong các nghiên cứu kể trên, và thời gian quan sát huyết khối tối ưu để gây huyết khối. Ghi lại phần trăm huyết khối sau 24 giờ ở 3 cách gây lạnh cho chuột, so sánh và rút ra kết luận về ảnh hưởng của nhiệt độ đuôi chuột tới sự hình thành huyết khối. 2.5.1.2. Xác định thuốc chứng dương Các nghiên cứu cho thấy thuốc chứng dương trong mô hình này có thể là thuốc chống kết tập tiểu cầu aspirin [38], thuốc chống đông heparin [16], hoặc thuốc làm tan huyết khối streptokinase [31] Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá vai trò của thuốc chứng dương aspirin và heparin với các mức liều tham khảo từ tài liệu nghiên cứu, hoặc ngoại suy từ liều trên người. Trong đó aspirin được pha trong DMSO 0,1%, uống với thể tích uống là 0,1 ml/10g; heparin pha trong nước cất 2 lần với thể tích tiêm là 0,1 ml/10g. Chuột được chia ngẫu nhiên 4 lô: lô 1 uống DMSO 0,1%; lô 2,3 lần lượt uống aspirin liều 20 mg/kg, 25 mg/kg; lô 4 tiêm phúc mạc heparin 100 UI/kg. Cho chuột ở lô 1, lô 2, lô 3 uống thuốc trong vòng 7 ngày, ở ngày thứ 7 sau khi uống một tiếng thì tiến hành nhúng đuôi chuột vào nước đá 5 phút rồi tiêm phúc mạc bằng κ-carrageenan với liều đã được lựa chọn. Sau khi tiêm κ-carrageenan, lô 4 tiếp tục tiêm phúc mạc heparin 100 UI/kg. Sau đó đo chiều dài huyết khối ở thời điểm 24 giờ để so sánh. 2.5.2. Đánh giá tác dụng chống huyết khối của tam thất hoang Để thăm dò tác dụng chống huyết khối của tam thất hoang, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên các mức liều 30 mg/kg© School – 60 mg/kg of Medicine – 90 mg/kg – and 120 mg/kg Pharmacy,. VNU Chuột nhắt trắng đủ điều kiện nghiên cứu, được nuôi ổn định trong môi trường mới ít nhất 5 ngày để làm quen, sau đó được chia ngẫu nhiên thành 6 lô: lô 1 uống 21
  30. DMSO 0,1 %; lô 2 uống aspirin; lô 3,4,5,6 uống tam thất hoang với các liều lần lượt là 30 mg/kg, 60 mg/kg, 90 mg/kg, 120 mg/kg. Cho chuột ở các lô dùng thuốc (hoặc dung môi) trong 7 ngày. Ngày thứ 7, sau khi dùng thuốc 1 giờ thì tiến hành gây huyết khối bằng κ-carrageenan, với liều dùng, đường dùng tối ưu, và thời gian nhúng đuôi phù hợp. Quan sát và tính phần trăm huyết khối sau 24 giờ, rút ra kết luận về tác dụng của tam thất hoang. Ngày 1 Ngày 7 24h Sử dụng thuốc hoặc dung môi Đo chiều dài huyết khối Tiêm κ-carrageenan Hình 2.2 Sơ đồ tiến hành mô hình gây huyết khối đuôi chuột 2.6. Phƣơng pháp phân tích số liệu Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 20.0. Các phân tích thống kê phi tham số được sử dụng: sự khác biệt giữa nhiều hơn hai nhóm được xác định bằng kiểm định Kruskal-Wallis; sự khác biệt giữa hai nhóm độc lập được xác định bằng kiểm định Mann-Whitney U. Sự khác biệt giữa các lô được xem là có ý nghĩa với p <0,05. © School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
  31. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả Sau 24 giờ tiêm phúc mạc chúng tôi quan sát được đuôi chuột bị sưng và có màu đỏ, ranh giới rõ ràng, dễ nhận biết (Hình 3.1A), sau đó một phần đuôi trở nên hoại tử (Hình 3.1B), điều này chứng tỏ có sự hình thành huyết khối ở đuôi chuột. A B Hình 3.1 Huyết khối đuôi chuột gây bởi ĸ-carrageenan tiêm phúc mạc 3.1.1. Xây dựng mô hình huyết khối đuôi chuột bằng ĸ-carrageenan 3.1.1.1. Xác định liều gây huyết khối tối ưu và thời gian quan sát huyết khối Bảng 3.1 Mức độ gây huyết khối đuôi chuột sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ Thời gian Liều Trung vị Giá trị bé Giá trị lớn p quan sát ĸ-carrageenan (%) nhất (%) nhất(%) 15 mg/kg 25,50 0,00 50,00 24h 20 mg/kg 78,51 62,86 89,47 0,017 25 mg/kg 50,67 37,66 74,32 15 mg/kg 27,87 4,00 50,68 48h 20 mg/kg 81,40 65,71 91,18 0,017 25 mg/kg 52,00 40,26 75,68 15 mg/kg 25,11 12,67 43,84 72h 20 mg/kg 69,53 65,71 86,76 0,012 25 mg/kg 52,53 © School38,96 of Medicine72,97 and Pharmacy, VNU 23
  32. A B C Hình 3.2. Phần trăm huyết khối đuôi chuột sau 24 giờ gây huyết khối (A), 48 giờ gây huyết khối (B), 72 giờ gây huyết khối (C) Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.2 cho thấy ở cả 3 thời điểm sau khi gây huyết khối 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, phần trăm huyết khối lên rõ nhất ở lô dùng κ-carrageenan liều 20 mg/kg, sau đó là liều 25 mg/kg. Lô dùng κ-carrageenan liều 15 mg/kg cho huyết khối thấp nhất, tối đa chỉ khoảng 50% sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ. Sự khác biệt về liều dùng này có ý nghĩa thống kê ở cả 3 thời điểm quan sát. Do đó, chúng tôi chọn liều κ-carrageenan 20 mg/kg là liều tối ưu để gây huyết khối đuôi chuột. Đánh giá thời điểm quan sát huyết khối tối ưu của lô dùng κ-carrageenan liều 20 mg/kg, kết quả được thể hiện ở hình 3.3© School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  33. Hình 3.3 Phần trăm huyết khối 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ sau khi tiêm κ-carrageenan 20mg/kg Nhận xét: Hình 3.3 là phần trăm lên huyết khối sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ tiêm κ-carrageenan 20 mg/kg, kết quả cho thấy không có sự khác biệt về phần trăm huyết khối đuôi chuột theo thời gian. Như vậy, trong các thí nghiệm sau, chúng tôi áp dụng mô hình gây huyết khối đuôi chuột nhắt bằng κ-carrageenan 20 mg/kg tiêm phúc mạc, theo dõi sự hình thành huyết khối đuôi chuột sau 24 giờ để đảm bảo tất cả các nhóm động vật được xử lý bằng κ-carrageenan đều xuất hiện huyết khối và chiều dài huyết khối là phù hợp nhất. 3.1.1.2. Xác định điều kiện gây huyết khối tối ưu Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã báo cáo sử dụng κ-carrageenan bằng đường tiêm tĩnh mạch đuôi và tăng thời gian nhúng đuôi trong nước đá giúp nâng cao tần suất xuất hiện huyết khối. Bên cạnh đó, trong quá trình làm, chúng tôi cũng nhận thấy nhiệt độ phòng nuôi và nhiệt độ đuôi chuột có vẻ ảnh hưởng đến quá trình hình thành huyết khối, vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát 2 điều kiện trên để © School of Medicine and Pharmacy, VNU đánh giá mức độ ảnh hưởng của chúng đến sự hình thành huyết khối 25
  34. a) Xác định đường tiêm κ-carrageenan Chuột được chia ngẫu nhiên thành 2 lô: lô 1 tiêm phúc mạc κ-carrageenan liều 20 mg/kg, lô 2 tiêm tĩnh mạch đuôi liều 1 mg/kg; quan sát phần trăm huyết khối sau 24 giờ tiêm κ-carrageenan ở 2 lô, kết quả được thể hiện ở hình 3.4. Hình 3.4 Ảnh hưởng của đường tiêm κ-carrageenan đến sự hình thành huyết khối Nhận xét: Đường tiêm tĩnh mạch đuôi cho đoạn huyết khối dài hơn, độ dao động lớn hơn so với đường tiêm phúc mạc (hình 3.4). Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p=0,274 <0,05. Như vậy, không có sự ảnh hưởng của đường dùng thuốc đến sự hình thành huyết khối, do đó để dễ thao tác thì chúng tôi quyết định lựa chọn đường tiêm phúc mạc trong nghiên cứu này. b) Thời gian nhúng đuôi nước đá Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian nhúng đuôi nước đá đến phần trăm huyết khối Lô Thời gian nhúng n Trung vị Giá trị nhỏ Giá trị lớn p đuôi nƣớc đá (%) nhất (%) nhất (%) 1 5 phút trước tiêm 13 44,19 0,00 89,36 2 5 phút trước tiêm và 10 43,89 16,67 89,66 0,594 1 phút sau tiêm © School of Medicine and Pharmacy, VNU 3 Không nhúng 11 33,33 11,43 86,59 26
  35. Hình 3.5 Ảnh hưởng của sự nhúng đuôi nước đá đến sự hình thành huyết khối Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.5 cho thấy mặc dù phần trăm huyết khối rất dao động, tuy nhiên sự khác biệt giữa các lô không có sự khác biệt có ý nghĩa do p = 0,594 >0,05. Điều này cho thấy, sự hình thành huyết khối không phụ thuộc vào thời gian nhúng đuôi trong nước đá. Tuy nhiên, thực tế chúng tôi quan sát cho thấy huyết khối khi đuôi trong nước đá 5 phút trước tiêm thì có đến 66,67% chuột có độ dài huyết khối trên 50%. Do đó, chúng tôi lựa chọn phương án nhúng đuôi 5 phút trước tiêm để đảm bảo huyết khối lên tối ưu nhất. Sau khi tiến hành thử nghiệm, chúng tôi lựa chọn điều kiện chuẩn của mô hình huyết khối đuôi chuột là: dung dịch κ-carrageenan 20 mg/kg tiêm phúc mạc và quan sát sự hình thành huyết khối sau 24 giờ. Nhiệt độ phòng nuôi duy trì ở 20⁰C và cần nhúng đuôi chuột trong nước đá 5 phút trước khi tiêm κ-carrageenan. 3.1.2. Xác định thuốc chứng dương Aspirin là một thuốc chống kết t©ập tiSchoolểu cầu đi ểofn hình Medicine và là thuố cand đượ cPharmacy, dùng VNU để dự phòng huyết khối thứ phát trong các bệnh lý tim mạch, tai biến mạch máu 27
  36. não, sau can thiệp mạch vành Heparin là một thuốc được dùng phổ biến trong dự phòng và điều trị huyết khối tĩnh mạch. Để chứng minh tác dụng của aspirin và heparin trên mô hình gây huyết khối đuôi chuột bằng κ-carrageenan, chúng tôi tiến hành các thử nghiệm thăm dò liều có tác dụng của aspirin và heparin. Bảng 3.3 Ảnh hưởng của aspirin và heparin đến sự hình thành huyết khối Lô Thuốc dùng n Trung vị Giá trị nhỏ Giá trị lớn p (%) nhất (%) nhất (%) 1 DMSO 0,1% 10 100,00 82,6 100,00 2 Aspirin 20mg/kg 9 21,10 0,00 56,20 0,000 3 Aspirin 25mg/kg 10 36,65 5,30 100,00 4 Heparin 100 UI/kg 9 33,00 0,00 89,40 Nhận xét: Từ bảng 3.3 ta thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các lô dùng thuốc khác nhau. Để so sánh khả năng chống huyết khối của aspirin và heparin ta sử dụng kiểm định Mann-Whitney U so sánh với lô chứng bệnh DMSO 0,1%. Kết quả thể hiện ở hình 3.6. Hình 3.6 Ảnh hưởng của aspirin và heparin đến sự hình thành huyết khối © School of Medicine and Pharmacy, VNU (*:p<0,05; : p<0,001 so với nhóm chứng DMSO 0,1%) 28
  37. Nhận xét: Hình 3.6 cho ta thấy các lô aspirin và heparin đều ức chế sự hình thành huyết khối do κ-carrageenan gây ra so với nhóm chứng bệnh DMSO 0,1% với p <0,05. Vì lô dùng aspirin 20 mg/kg có phần trăm huyết khối thấp nhất và độ dao động ít nhất, nên chúng tôi đã quyết định lựa chọn aspirin 20 mg/kg là thuốc chứng dương cho các nghiên cứu tiếp theo. Như vậy, từ nghiên cứu sơ bộ, chúng tôi xây dựng được mô hình gây huyết khối đuôi chuột với điều kiện là: tác nhân gây huyết khối là dung dịch κ- carrageenan 20 mg/kg, sử dụng đường tiêm phúc mạc, cần nhúng đuôi chuột trong nước đá 5 phút trước tiêm, sử dụng thuốc chứng dương là aspirin 20 mg/kg, huyết khối quan sát ở thời điểm 24 giờ sau tiêm. 3.1.3. Tác dụng chống huyết khối của tam thất hoang Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tam thất hoang đến sự hình thành huyết khối Trung vị Giá trị nhỏ Giá trị lớn p Lô Thuốc dùng n (%) nhất (%) nhất (%) 1 DMSO 0.1% 10 44,80 22,99 73,00 2 Aspirin 20 mg/kg 10 4,66 0,00 26,36 3 Tam thất hoang 9 27,33 2,47 32,32 30 mg/kg 4 Tam thất hoang 0,000 8 38,26 13,28 54,65 60 mg/kg 5 Tam thất hoang 8 31,47 6,41 58,54 90 mg/kg 6 Tam thất hoang 8 37,00 31,00 77,55 120 mg/kg Nhận xét: Từ bảng 3.4 ta thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các lô dùng thuốc khác nhau. Để so sánh khả năng chống huyết khối của aspirin và tam thất hoang so với lô chứng bệnh DMSO 0,1% ta sử dụng kiểm định Mann-Whitney U. Kết quả thể hiện ở hình 3.7. © School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
  38. Hình 3.7 Ảnh hưởng của tam thất hoang đến sự hình thành huyết khối đuôi chuột (*:p<0,05; :p<0,001 so với nhóm chứng DMSO 0,1%) Nhận xét: từ bảng 3.4 và hình 3.7 ta thấy tam thất hoang liều uống 30 mg/kg ức chế đáng kể sự hình thành huyết khối gây ra bởi κ-carrageenan với p = 0,027<0,05, tuy nhiên tác dụng vẫn chưa bằng nhóm chứng dương aspirin 20mg/kg theo phương pháp kiểm định Mann - Whitney U. Ở các mức liều cao hơn tam thất hoang 60 mg/kg, 90 mg/kg và 120 mg/kg chưa thể hiện khả năng chống huyết khối, tuy nhiên ở những mức liều này có gây chết chuột. 3.2. Bàn luận 3.2.1. Mô hình gây huyết khối bằng κ-carrageenan 3.2.1.1. Tác nhân gây huyết khối Carrageenans là những polysaccharides cực nhỏ có chứa lưu huỳnh gồm các đơn vị lặp lại của D-galactose và 3,6-anhydro-D-galactose. Chúng được chiết xuất từ tảo biển đỏ, được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm và các ngành công nghiệp khác. Trên cơ sở các vị trí liên kết sulfate khác nhau và carbohydrate, carrageenans được phân © thành School 3 loạ i:of Kappa Medicine-carrageenan, and lamPharmacy,da- VNU carrageenan và iota-carrageenan. Kappa-carrageenan (κ-carrageenan) chỉ có một 30
  39. nhóm sulfat trên mỗi disaccharid. Iota-carrageenan có hai nhóm sulfat trên mỗi disaccharid; Lambda - carrageenan có ba nhóm sulfat trên mỗi disaccharid. Carrageenan được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm với các tính chất như tạo gel, làm dày, ổn định Tuy nhiên, H.Bekemeier và đồng nghiệp đã báo các rằng carrageenan có thể gây ra huyết khối ở đuôi chuột, trong đó thì κ- carrageenan có khả năng gây huyết khối tốt nhất [20]. Đặc điểm hình thành rõ ràng của huyết khối đuôi chuột là sưng và đỏ từ phần đầu tự do của đuôi đã được quan sát thấy từ thí nghiệm. Sau đó, mô hình này đã được sử dụng để kiểm tra nhiều thuốc trên lâm sàng có tác dụng chống huyết khối và tan huyết khối (heparin, UK, aspirin, .). Carrageenans có thể được sử dụng để gây viêm mô và gây huyết khối đuôi trong các mô hình động vật (chuột nhắt, chuột cống, và lợn). Có một số bằng chứng cho thấy có mối liên hệ hai chiều giữa đông máu và viêm. Viêm có thể dẫn đến kích hoạt hệ thống đông máu do yếu tố mô (TF) và yếu tố XII (yếu tố Hageman) tạo ra thrombin trung gian, từ đó làm giảm thiểu cơ chế chống đông máu và ức chế tiêu sợi huyết, mặt khác kích hoạt hệ thống đông máu có thể ảnh hưởng đến hoạt động viêm thông qua các cơ chế trực tiếp và gián tiếp. Vì vậy, quá trình đông máu và viêm được xem là làm thúc đẩy quá trình bệnh sinh của bệnh tim mạch. Cơ chế của κ-carrageenan gây huyết khối được biết đến là tăng cường sản xuất interleukin-1β và yếu tố hoại tử khối u dẫn đến sự gia tăng biểu hiện yếu tố XII [19, 20, 37] từ đó dẫn đến sự khởi đầu và kích hoạt dòng thác đông máu. Sự điều chỉnh tăng cường này kích thích sự kích hoạt tiểu cầu và thúc đẩy sự hình thành cục máu đông. Do đó, ức chế hoạt hóa tiểu cầu là điều quan trọng để phòng ngừa và điều trị huyết khối. Trên thế giới, một vài mô hình thí nghiệm huyết khối cũng đã được tiến hành trước đó như các phương pháp vật lý (thắt tĩnh mạch chủ [21], huyết khối gây ra bởi điện [24] ) và các phương pháp sử dụng chất hóa học (FeCl3 [24, 26], trypsin) hoặc dùng nọc rắn [50] đã được sử dụng để phá huỷ mạch máu nội mô, kích thích sự kết dính và tập hợp tiểu cầu, làm chậm và chặn dòng máu để bắt đầu quá trình đông máu nội sinh. Tuy nhiên, gần như tất cả các mô hình này cần phẫu thuật phức tạp để tiếp xúc với mạch máu, ngoại trừ mô hình huyết khối ở đuôi của động vật gây ra bởi κ-carrageenan. Ưu điểm của mô hình huyết khối này là dễ dàng thao tác, dễ quan sát, đo chính xác và liên tục phạm vi huyết khối mà không giết chết động vật với chi © School of Medicine and Pharmacy, VNU phí thấp. Tuy nhiên, sự hình thành huyết khối của κ-carrageenan phụ thuộc vào nhiều yếu tố nên tần suất và chiều dài huyết khối khác nhau nhiều ở các đợt nghiên 31
  40. cứu khác nhau. Sau khi mô hình được chứng minh bằng thuốc có hiệu quả trên lâm sàng như heparin, urokinase và aspirin, thì mô hình đã được áp ứng dụng rất nhiều để kiểm tra và chọn ra những thuốc thử có tiềm năng chống huyết khối. Ngoài mô hình gây huyết khối đuôi chuột bằng κ-carrageenan thì có nhiều nghiên cứu cũng đã sử dụng carrageenan (một dạng đồng phân của κ-carrageenan) [36, 37] – đây là một chất rẻ tiền, dễ kiếm. Với hy vọng lựa chọn được tác nhân gây huyết khối phù hợp, chúng tôi cũng đã thực hiện nghiên cứu để so sánh khả năng gây huyết khối của hai chất này. Kết quả cho thấy khi sử dụng carrageenan, huyết khối xuất hiện với tần số thấp và độ dài huyết khối dao động lớn – điều này phù hợp với báo cáo trước đó của Bekemeier và cộng sự (1985) rằng κ-carrageenan có khả năng gây huyết khối tốt nhất [20]. Do đó chúng tôi đã lựa chọn κ-carrageenan để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Các thí nghiệm ban đầu của chúng tôi đã thành công trong việc xây dựng mô hình huyết khối của chuột. Sau 24 giờ tiêm phúc mạc κ-carrageenan, đuôi chuột xuất hiện sưng tấy và có màu đỏ từ đầu tự do, điều này chứng tỏ huyết khối đã được hình thành. Từ các nghiên cứu đã thực hiện cho thấy κ-carrageenan liều 20 mg/kg gây huyết khối tối ưu trên đuôi chuột, kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đó đã sử dụng [29, 30]. 3.2.1.2. Xác định đường tiêm Khi bắt đầu nghiên cứu, κ-carrageenan được sử dụng với đường tiêm phúc mạc, song kết quả thu được tần suất huyết khối không đạt 100%. Trước đó, Bekemeier và cộng sự đã báo cáo rằng tần suất xuất hiện huyết khối ở chuột nhắt tiêm tĩnh mạch κ-carrageenan là 40 - 65% (0,88-2 mg/kg) cao hơn so với tiêm phúc mạc là 30-50% (5 mg/kg), và độ dài huyết khối trung bình tương ứng là 44 mm và 16 mm [20]. Ngoài ra, Masayori Hagimori và cộng sự (2009) đã báo cáo rằng, bằng cách tiêm tĩnh mạch đuôi κ-carrageenan 1mg/kg, thắt đuôi đuôi chuột và nhúng đuôi vào nước đá lạnh giúp tăng tần suất huyết khối đạt 100% [25]. Được biết tần suất huyết khối phụ thuộc vào liều lượng và đường dùng của κ-carrageenan, do đó, bên cạnh nghiên cứu sử dụng đường tiêm phúc mạc thì chúng tôi có sử dụng đường tiêm tĩnh mạch đuôi. Để nâng cao tần suất xuất hiện huyết khối, Masayori Hagimori và cộng sự (2009) đã dựa vào ba yếu tố gây nên huy© ếSchoolt khối tắc ofmạ chMedicine của Virchow and bao Pharmacy,gồm: VNU tăng đông máu, tổn thương nội mô và thay đổi lưu lượng máu (ứ trệ hay rối loạn). Tương tự như vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã giữ κ-carrageenan tại vùng 32
  41. đuôi chuột trong một thời gian bằng cách thắt đuôi ở vị trí 6 cm trong vòng 10 phút kể từ khi tiêm κ-carrageenan như là một phương pháp làm thay đổi lưu lượng máu, đồng thời thao tác này kết hợp với nhúng đuôi chuột trong nước ấm 40⁰C cũng đã làm lộ rõ tĩnh mạch đuôi giúp việc tiêm tĩnh mạch đuôi chuột nhắt dễ dàng hơn. Thực tế kết quả cho thấy, mặc dù đã tối ưu hóa điều kiện như trên thì cả hai đường tiêm đều cho tần suất xuất hiện huyết khối là như nhau, tuy nhiên, đường tiêm tĩnh mạch đuôi đòi hỏi kỹ thuật khó hơn và độ dao động chiều dài huyết khối lớn nên chúng tôi quyết định lựa chọn đường tiêm phúc mạc κ-carrageenan để có thể thao tác dễ dàng và đem lại hiệu quả tối ưu. 3.2.1.3. Thời gian nhúng đuôi Ba yếu tố chính góp phần trong cơ chế hình thành huyết khối của Virchow (thế kỷ 19) bao gồm: tăng đông máu, tổn thương nội mô và thay đổi lưu lượng máu (ứ trệ hay rối loạn) đã được chấp nhận rộng rãi. Đối với sự ứ đọng và bất ổn trong lưu lượng máu, các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng tần suất huyết khối đuôi chuột tăng lên khi đuôi được nhúng trong nước đá [18]. Bên cạnh đó, trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi cũng nhận thấy dường như nhiệt độ phòng và thời gian nhúng đuôi trong nước đá ảnh hưởng đến chiều dài và tần suất huyết khối nên chúng tôi tiến hành thử đánh giá ảnh hưởng của thời gian nhúng đuôi đến sự hình thành huyết khối. Tuy nhiên, sau khi phân tích số liệu thì không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các lô khác nhau, chứng tỏ thời gian nhúng đuôi trong nước đá không ảnh hưởng đến sự hình thành huyết khối. 3.2.2 Thuốc chứng dương Các nghiên cứu thực nghiệm trước đó có sử dụng nhiều loại chứng dương khác nhau như heparin [16, 39], streptokinase [31], aspirin Trong đó thì heparin là thuốc chống đông được sử dụng trong việc phòng và điều trị huyết khối tĩnh mạch, còn aspirin là thuốc chống kết tập tiểu cầu được sử dụng trong việc phòng và điều trị huyết khối động mạch [40]. Việc áp dụng các thuốc chống đông máu trong điều trị bệnh huyết khối là khái niệm hấp dẫn và tầm quan trọng dược lý của nó đã được đánh giá dựa trên cơ chế ngăn ngừa hình thành huyết khối của các thuốc này. Khả năng chống huyết khối của heparin dựa trên cơ chế tạo phức với antithrombin III, phức này tăng cường tác dụng của antithrombin III lên 1000 lần, từ đó ức chế protease serine, bao gồm một số yếu t©ố đôngSchool máu -of quan Medicine trọng nhất andlà thrombin Pharmacy, VNU (yếu tố IIa) và Stuart Factor (yếu tố Xa) dẫn đến máu không đông được. Bên cạnh đó, aspirin là thuốc chống kết tập tiểu cầu dựa trên cơ chế ức chế enzym 33
  42. thromboxan synthetase hoặc acetyl hóa phần có hoạt tính của cyclooxygenase, từ đó làm giảm tổng hợp thromboxan A2 (chất gây kết tập tiểu cầu) làm cho tiểu cầu không kết tập được. Aspirin là thuốc đầu tiên và đang tiếp tục được sử dụng rộng rãi nhất trong điều trị huyết khối động mạch [32]. Xu hướng sử dụng rộng rãi thuốc này trong việc ngăn chặn huyết khối động mạch đầu tiên được chỉ ra bởi những phát hiện của thử nghiệm ISIS-2 (2012) chứng minh rằng aspirin làm giảm tử vong ở những bệnh nhân bị nhồi máu cơ tim cấp tính với tỷ lệ tương tự như thuốc tan huyết khối (streptokinase) [33]. Các dữ liệu từ nhiều thử nghiệm được tổng hợp bởi Antiplatelets Trialist's Collaboration cho thấy sử dụng aspirin làm giảm 25% nguy cơ tử vong, nhồi máu cơ tim hoặc đột quỵ, so với giả dược [23] dẫn đến việc sử dụng aspirin như là liệu pháp chuẩn cho phòng ngừa tiên phát và thứ phát của thiếu máu cục bộ động mạch. Theo dược điển Anh, aspirin được sử dụng lâu dài với liều 75 mg/ngày ở các bệnh nhân bị đau thắt ngực ổn định, đau thắt ngực không ổn định hoặc nhồi máu cơ tim có ST không chênh [40], điều này chứng tỏ aspirin có thể sử dụng trong việc phòng ngừa các biến cố tim mạch, tuy nhiên aspirin không được sử dụng trong việc dự phòng và điều trị huyết khối tĩnh mạch, do đó chúng tôi đặt ra nghi vấn: “Liệu aspirin với cơ chế chống kết tập tiểu cầu có tác dụng ức chế sự hình thành huyết khối trên mô hình đã xây dựng?”. Chúng tôi đã sử dụng cả heparin và aspirin để đánh giá khả năng chống huyết khối trên mô hình gây huyết khối đuôi chuột bằng κ-carrageenan. Trong nghiên cứu, chúng tôi lần lượt thử aspirin ở các mức liều 20 mg/kg – 25 mg/kg (tương ứng với các mức liều khoảng 80 mg - 100 mg trên người 50 kg - là liều có tác dụng chống kết tập tiểu cầu của aspirin, sử dụng phương pháp ngoại suy liều có hiệu quả tương đương giữa người và động vật thí nghiệm [3, 34]) thì nhận thấy với mức liều 20 mg/kg (tương đương liều 80 mg ở người) aspirin cho tác dụng chống huyết khối rõ rệt so với nhóm chứng bệnh DMSO 0,1% và có tác dụng giảm huyết khối tốt hơn so với liều 25 mg/kg. Nhiều nghiên cứu trên mô hình huyết khối đã sử dụng thuốc chứng dương aspirin như Zhang và cộng sự (2013) nghiên cứu trên mô hình huyết khối gây ra bởi carrageenan cho thấy aspirin 50 mg/kg làm giảm đáng kể chiều dài huyết khối [38]. Ning Ma (2015) cũng báo cáo rằng aspirin 20 mg/kg có xu hướng làm giảm chiều dài huyết khối trung bình trên mô hình huyết khối đuôi chuột gây ra bởi κ-carrageenan [30]. Bên cạnh đó, aspirin 20 mg/kg còn làm giảm đáng kể trọng lượng huyết kh ©ối trongSchool mô hình of huyMedicineết khối độ ngand mạ cPharmacy,h gây VNU ra bởi một sợi tơ đặt giữa động mạch cảnh phải và tĩnh mạch cảnh bên trái [38]. Bên 34
  43. cạnh đó, liều heparin có tác dụng là 100 UI/kg phù hợp với nghiên cứu của Rana Arslan và cộng sự [39]. Như vậy, cả hai thuốc aspirin và heparin đều có tác dụng trên mô hình đã huyết khối đã xây dựng. Tuy nhiên, để đánh giá khả năng chống huyết khối của cao giàu saponin tam thất hoang dựa trên cơ chế chống kết tập tiểu cầu thì chúng tôi đã lựa chọn aspirin 20 mg/kg là chứng dương trong nghiên cứu này. 3.2.3. Tác dụng chống huyết khối của tam thất hoang Từ lâu, chi Panax L. được biết đến là một chi thuốc quý với nhiều loài cây thuốc được khẳng định giá trị sử dụng như Nhân sâm (Panax ginseng), Tây dương sâm (Panax quinquefolium), Tam thất (Panax notoginseng), Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) Ngoài ra đã có nhiều nghiên cứu chứng minh saponin các loài Panax có tác dụng ức chế sự hình thành huyết khối và chống ngưng tập tiểu cầu [27, 28]. Trong nghiên cứu của Qin Shen và cộng sự (2017) đã báo cáo rằng Panax notoginseng saponins (PNS) - thành phần chính được lấy từ Panax notoginseng làm giảm các yếu tố nguy cơ cao về huyết khối [35], ở nồng độ 100 µl/ml thể hiện tác dụng chống kết tập tiểu cầu. Ngoài ra, Aik-Jiang Lau và cộng sự (2009) đã đánh giá tác dụng chống kết tập tiểu cầu của P. notoginseng, P. ginseng và P. quinquefolium, kết quả thu được cho thấy cao chiết methanol chứa nhiều saponin của P. ginseng và P. quinquefolium cho tác dụng chống kết tập tiểu cầu ở nồng độ 3 mg/mL, P. notoginseng cho tác dụng ở nồng độ 1,5 mg/ml. Mặt khác thành phần chính của tam thất hoang là saponin oleanolic, ngoài ra còn có polyacetylen, acid béo và acid amin [10]. Một số cấu trúc saponin oleanolic đã được phân lập từ tam thất hoang [4, 45, 47]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu trong nước của Lê Thị Tâm và Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2017) cũng chỉ ra rằng phân đoạn n-butanol của tam thất hoang chứa nhiều saponin thể hiện tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu [12] ở liều 5 mg/ml và kéo dài thời gian đông máu trên in vitro ở liều 2- 5 mg/ml [15]. Điều này gợi ý về tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của tam thất hoang có thể do saponin gây ra. Do phân đoạn n-butanol (hoạt chất chính trong phân đoạn này là saponin) vừa thể hiện tác dụng chống kết tập tiểu cầu, vừa thể hiện tác dụng chống đông máu in vitro, mà sự hình thành huyết khối lại phụ thuộc vào quá trình đông máu và sự hoạt hóa tiểu cầu, vì vậy trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cao giàu saponin tam thất hoang © Schoolđể đánh giá of tác Medicine dụng chống and huyế tPharmacy, khối VNU trên thực nghiệm. 35
  44. Hiện nay, các nghiên cứu về tác dụng của tam thất hoang chỉ ở mức in vitro vì vậy việc đánh giá tác dụng của tam thất hoang trên chuột thực nghiệm là việc rất cần thiết. Trong một nghiên cứu của Lê Thị Thanh Hoa (2018) đã chỉ ra rằng liều có tác dụng chống kết tập tiểu cầu trên in vitro của aspirin và tam thất hoang lần lượt là 1 mg/ml và 1,6 mg/ml [6], như vậy tương ứng với dải liều có tác dụng chống kết tập tiểu cầu của aspirin là từ 75 – 300 mg/ngày [40] thì ở tam thất hoang chúng tôi thử ở các dải liều 30 mg/kg – 60 mg/kg – 90 mg/kg – 120 mg/kg. Kết quả chỉ ra rằng tam thất hoang 30 mg/kg thể hiện tác dụng ức chế hình thành huyết khối trên mô hình đã xây dựng, mà báo cáo của Wang và cộng sự (1997) chỉ ra rằng sự kết tập của tiểu cầu và hồng cầu thường được tăng lên trong một mô hình huyết khối do carrageenan gây ra. Điều này cho thấy hoạt động chống huyết khối của cao giàu saponin tam thất hoang có thể liên quan đến sự ức chế kết tập tiểu cầu thông qua việc tác động vào cơ chế gây huyết khối của κ-carrageenan theo con đường kích hoạt yếu tố XII gây đông máu nội mạch (nghiên cứu mô học cho thấy sự tập hợp tiểu cầu và bạch cầu tham gia đông máu nội mạch rải rác [19, 20]). Điều này gợi ý rằng, tam thất hoang có thể là ứng cử viên tốt trong dự phòng và điều trị huyết khối. Tuy nhiên, tác dụng này chỉ thể hiện ở liều thấp và mất hiệu quả khi liều tăng lên, do đó cần xây dựng các mô hình khác để đánh giá tác dụng chống huyết khối của tam thất hoang. Tam thất hoang được hòa tan trong DMSO - đã được báo cáo là có tác dụng chống huyết khối bằng cách ngăn ngừa sự biểu hiện và hoạt động của yếu tố mô cũng như sự giảm kết tập tiểu cầu do arachidonate gây ra bằng cách ức chế COX-1 [17, 22]. Tuy nhiên, tác dụng này của DMSO đã được loại bỏ bằng cách sử dụng DMSO ở nồng độ thấp là 0,1%. Do đó, hiệu ứng chống huyết khối của tam thất hoang không liên quan đến DMSO. Trước đó, Trần Công Luận đã báo cáo rằng cao thân rễ và rễ củ tam thất hoang thể hiện độc tính cấp ở liều LD50 = 8,8 g/kg theo đường uống, mà trong nghiên cứu này, tam thất hoang ở các mức liều cao 60 mg/kg – 90 mg/kg – 120 mg/kg có gây chết chuột, điều này chứng tỏ có thể cao giàu saponin tam thất hoang cũng có thể gây độc tính. Do đó, cần có thêm các nghiên cứu đánh giá độc tính của cao giàu saponin của cây này. © School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
  45. 3.2.4 Hạn chế nghiên cứu - Nghiên cứu thực hiện trên động vật thực nghiệm, do đáp ứng của chuột khác nhau nên chiều dài huyết khối thu được dao động lớn trong cùng một đợt nghiên cứu và các đợt nghiên cứu khác nhau. - Nghiên cứu này mới chỉ sử dụng một chỉ số đánh giá, cần có các nghiên cứu chuyên sâu sử dụng thêm các chỉ số đánh giá khác để khẳng định tác dụng và hiệu quả của tam thất hoang. Tuy đã tối ưu hóa điều kiện môi trường và điều kiện gây huyết khối nhưng tần suất huyết khối vẫn không đạt được 100% như các báo cáo trước đó của Masayori Hagimori đã công bố [25]. © School of Medicine and Pharmacy, VNU 37
  46. KẾT LUẬN Xuất phát từ hai mục tiêu nghiên cứu ban đầu, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu và đưa đến kết luận: 1. Đã xây dựng được mô hình gây huyết khối đuôi chuột với tác nhân là κ- carrageenan 20mg/kg hòa tan trong NaCl 0,9% tiêm phúc mạc, nhúng đuôi chuột 5 phút trong nước đá trước khi tiêm, quan sát huyết khối tại thời điểm 24 giờ sau, sử dụng aspirin 20 mg/kg, hoặc heparin 100 UI/kg làm chứng dương. 2. Đã đánh giá được tác dụng chống huyết khối của cao giàu saponin tam thất hoang thông qua phần trăm huyết khối đo được ở thời điểm 24 giờ sau khi gây huyết khối bằng κ-carrageenan. Cao giàu saponin tam thất hoang thể hiện tác dụng chống huyết khối ở liều 30 mg/kg (tương đương sử dụng dược liệu khô liều 0,64 (g)/người/ngày). ĐỀ XUẤT Sau quá trình nghiên cứu chúng tôi có một số đề xuất sau: 1. Cần sử dụng thêm các chỉ tiêu đánh giá khác để đánh giá tác dụng chống huyết khối, cũng như đánh giá tác dụng không mong muốn của tam thất hoang trên quá trình đông máu như: Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa (APTT), thời gian prothrombin (PT), fibrinogen, chỉ số INR 2. Ở liều cao, tam thất hoang tuy không thể hiện tác dụng chống huyết khối nhưng lại gây chết chuột, cần tiến hành kiểm tra độc tính cấp, độc tính bán trường diễn, độc tính trường diễn. 3. Nghiên cứu mới thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm, cỡ mẫu nhỏ nên cần triển khai với quy mô lớn hơn và tiến hành các đề tài nghiên cứu cơ chế tác dụng của tam thất hoang để đảm bảo tính đúng đắn của kết quả nghiên cứu. 4. Xây dựng mô hình gây huyết khối động mạch ở động vật thí nghiệm để đánh giá khả năng phòng/chống huyết khối của cao giàu saponin tam thất hoang trên huyết khối động mạch. © School of Medicine and Pharmacy, VNU 38
  47. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bộ môn dược lý (2012), Dược lý, Tập 2, Trường đại học Dược Hà Nội. 2. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam,vol 1, NXB Y học, Hà Nội. 3. Đỗ Trung Đàm (2001), "Phương pháp ngoại suy liều có hiệu quả tương đương giữa người và động vật thí nghiệm", Tạp chí Dược học. 4. Nguyễn Thị Duyên và các cộng sự (2017), "Xác định hợp chất oleanolic từ phân đoạn n - butanol thân rễ Tam thất hoang ( Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng), họ Nhân sâm ( Araliaceae)", Tập 8, 13 - 17. 5. TS.Đỗ Thị Hà (2017), "Quy trình chiết cao giàu saponin từ tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K. M. Feng)", Báo cáo tiến độ. 6. Lê Thị Thanh Hoa (2018), "Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của dịch chiết phân đoạn giàu saponin của Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng).", Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành dược học. 7. Lê Thị Hương (2006), "Tổng quan về thuốc chống đông máu và tiêu fibrin", Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành dược học. 8. Mạc Thị Thanh Huyền (2016), "Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học của thân rễ Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng)", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ. 9. GS.TS. Phạm Gia Khải và các cộng sự (2016), "Khuyến cáo về chẩn đoán, điều trị và dự phòng thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch của Hội Tim mạch học quốc gia Việt Nam". 10. Trần Công Luận (2002), "Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của 2 loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)", 93 - 94. 11. Trần Công Luận (2008), "Nghiên cứu một số tác dụng dược lí của tam thất hoang – Panax stipuleanatus Tsai © School et Feng, h ofọ Araliaceae Medicine", T ạandp chí Pharmacy, Dược VNU liệu, 99 - 102.
  48. 12. Lê Thị Tâm (2017), "Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) trên in vitro", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ. 13. Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền và Lê Thanh Sơn (2006), "Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh thái sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam", Tạp chí dược học. 14. Đỗ Minh Thành (2013), Nghiên cứu đặc điểm di truyền của loài sâm mới Panax sp. Thu ở Phong Thổ Lai Châu, Luận văn thạc sĩ. 15. Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2017), "Nghiên cứu tác dụng chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên in vitro", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 16. R. Arslan et al (2015), "Evaluation of the antithrombotic effects of Crataegus monogyna and Crataegus davisii in the carrageenan-induced tail thrombosis model", Pharm Biol, 53(2), 275-9. 17. L. Asmis et al (2010), "DMSO inhibits human platelet activation through cyclooxygenase-1 inhibition. A novel agent for drug eluting stents?", Biochem Biophys Res Commun, 391(4), 1629-33. 18. H. Bekemeier và R. Hirschelmann (1986), "Influence of serotonin, serotonin antagonists, some vasoactive substances and temperature on carrageenin- induced tail thrombosis in rats and mice", Agents Actions, 18(5-6), 581-5. 19. H. Bekemeier, R. Hirschelmann và A. J. Giessler (1984), "Carrageenin- induced thrombosis in the rat and mouse as a test model of substances influencing thrombosis", Biomed Biochim Acta, 43(8-9), S347-50. 20. H. Bekemeier, R. Hirschelmann và A. J. Giessler (1985), "Carrageenin- induced thrombosis in rats and mice: a model for testing antithrombotic substances?", Agents Actions, 16(5), © School 446-51. of Medicine and Pharmacy, VNU
  49. 21. M. V. Brito et al (2014), "The Kallikrein Inhibitor from Bauhinia bauhinioides (BbKI) shows antithrombotic properties in venous and arterial thrombosis models", Thromb Res, 133(5), 945-51. 22. G. G. Camici et al (2006), "Dimethyl sulfoxide inhibits tissue factor expression, thrombus formation, and vascular smooth muscle cell activation: a potential treatment strategy for drug-eluting stents", Circulation, 114(14), 1512-21. 23. "Collaborative overview of randomised trials of antiplatelet therapy I: Prevention of death, myocardial infarction, and stroke by prolonged antiplatelet therapy in various categories of patients. Antiplatelet Trialists' Collaboration" (1994), Bmj, 308(6921), 81-106. 24. J. A. Diaz et al (2012), "Critical review of mouse models of venous thrombosis", Arterioscler Thromb Vasc Biol, 32(3), 556-62. 25. M. Hagimori et al (2009), "Improving frequency of thrombosis by altering blood flow in the carrageenan-induced rat tail thrombosis model", Pharmacol Res, 60(4), 320-3. 26. L. M. Hiebert, T. Ping và S. M. Wice (2012), "Repeated doses of oral and subcutaneous heparins have similar antithrombotic effects in a rat carotid arterial model of thrombosis", J Cardiovasc Pharmacol Ther, 17(1), 110-6. 27. Y. R. Jin et al (2007), "Antithrombotic and antiplatelet activities of Korean red ginseng extract", Basic Clin Pharmacol Toxicol, 100(3), 170-5. 28. Lau et al (2009), "Antiplatelet and anticoagulant effects of Panax notoginseng: comparison of raw and steamed Panax notoginseng with Panax ginseng and Panax quinquefolium", J Ethnopharmacol, 125(3), 380-6. 29. N. Ma et al (2015), "Preventive Effect of Aspirin Eugenol Ester on Thrombosis in kappa-Carrageenan-Induced Rat Tail Thrombosis Model", PLoS One, 10(7), e0133125. 30. N. Ma et al (2016), "Evaluation on antithrombotic effect of aspirin eugenol ester from the view of platelet aggregation, hemorheology, TXB2/6-keto- PGF1alpha and blood biochemistry in rat model", BMC Vet Res, 12(1), 108. © School of Medicine and Pharmacy, VNU 31. S. Majumdar, P. Chattopadhyay và A. K. Mukherjee (2016), "In Vivo Anticoagulant and Thrombolytic Activities of a Fibrinolytic Serine Protease
  50. (Brevithrombolase) With the k-Carrageenan-Induced Rat Tail Thrombosis Model", Clin Appl Thromb Hemost, 22(6), 594-8. 32. D. R. Phillips et al (2005), "Therapeutic approaches in arterial thrombosis", J Thromb Haemost, 3(8), 1577-89. 33. "Randomised trial of intravenous streptokinase, oral aspirin, both, or neither among 17,187 cases of suspected acute myocardial infarction: ISIS-2. ISIS-2 (Second International Study of Infarct Survival) Collaborative Group" (1988), Lancet, 2(8607), 349-60. 34. S. Reagan-Shaw, M. Nihal và N. Ahmad (2008), "Dose translation from animal to human studies revisited", FASEB J, 22(3), 659-61. 35. Q. Shen et al (2017), "Panax notoginseng saponins reduce high-risk factors for thrombosis through peroxisome proliferator-activated receptor -gamma pathway", Biomed Pharmacother, 96, 1163-1169. 36. J. R. Simkhada et al (2012), "Purification, biochemical properties and antithrombotic effect of a novel Streptomyces enzyme on carrageenan- induced mice tail thrombosis model", Thromb Res, 129(2), 176-82. 37. F. Yan et al (2009), "Thrombolytic effect of subtilisin QK on carrageenan induced thrombosis model in mice", J Thromb Thrombolysis, 28(4), 444-8. 38. Zhang et al (2013), "Antithrombotic activities of aqueous extract from Gardenia jasminoides and its main constituent", Pharm Biol, 51(2), 221-5. 39. R. Arslan et al (2011), "Antithrombotic effects of ethanol extract of Crataegus orientalis in the carrageenan-induced mice tail thrombosis model", Thromb Res, 127(3), 210-3. 40. British medical association và Royal Pharmaceutical Society (2017), British National Formulary (BNF), 73. 41. M.D. Bruce Furie, and Barbara C. Furie, Ph.D, (2008), "Mechanisms of Thrombus Formation", Mechanisms of Disease, 938 - 949. 42. M.D. Christopher J.L. Murray, D.Phil., and Alan D. Lopez, Ph.D., (2013), "Measuring the Global Burden of Disease", The New England Journal of Medicine © School of Medicine and Pharmacy, VNU
  51. 43. Yan D Chun L, Kim JA, Yang SY, Boo HJ, Kang HK, Cuong NM, Kim YH., (2011), "Polyacetylenes from Panax stipuleanatus and their cytotoxic effects on human cancer cells", Bull. Korean Chem, 3513-3518. 44. Brian K.Alldredge et al. Applied theurapeutics Tập 10. 45. Ding Y. Liang C., Nguyen H. T., et al (2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 7110 - 7115. 46. C. J. Murray và A. D. Lopez (1997), "Mortality by cause for eight regions of the world: Global Burden of Disease Study", Lancet, 349(9061), 1269-76. 47. Dong J. Z. Ren Y. C., Jun Z., et al (1985), "Two new oleanolic acidtype saponins from Panax stipuleanatus", Acta Botanica Yunnanica, 103 - 108. 48. C. E. Seculini Patino và A. H. Tabares (2016), "[Heparin-induced thrombocytopenia. New therapeutical options]", Medicina (B Aires), 76(4), 230-4. 49. Y. Suzuki et al (2015), "Analysis of the Interaction between Clopidogrel, Aspirin, and Proton Pump Inhibitors Using the FDA Adverse Event Reporting System Database", Biol Pharm Bull, 38(5), 680-6. 50. Ren-Chieh Wu, Ping-Tse Chou và Li-Kuang Chen (2016), "Aspirin plus tirofiban inhibit the thrombosis induced by Russell’s viper venom", Thrombosis Journal, BioMed Central. 51. Kun Z., Shu Z. và Komatsu K (2002), "Analysis of saponins of Panax stipuleanatus by using HPLC and APIMS/MS techniques", Journal of University of Hydraulic and Electric Engineering, 355 - 358. © School of Medicine and Pharmacy, VNU