Khóa luận Phân tích thành phần Stipuleanosid R2 có trong các bộ phận của cây Sâm Vũ Diệp

Nội dung text: Khóa luận Phân tích thành phần Stipuleanosid R2 có trong các bộ phận của cây Sâm Vũ Diệp

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ===  === TRẦN THỊ NGỌC HÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN STIPULEANOSID R2 TRONG CÁC BỘ PHẬN CỦA CÂY SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2019
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ===  === Người thực hiện: TRẦN THỊ NGỌC HÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN STIPULEANOSID R2 TRONG CÁC BỘ PHẬN CỦA CÂY SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH2014.Y Người hướng dẫn: GV.TS. NGUYỄN HỮU TÙNG Hà Nội - 2019
3. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN Danh mục ký hiệu và tên viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ và đồ thị ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về Sâm Vũ Diệp 2 1.1.1. Tên khoa học 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật 2 1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái 2 1.1.4. Thành phần hóa học 3 1.1.5. Tính vị, công năng 8 1.1.6. Tác dụng dược lý 8 1.1.7. Công dụng 8 1.2. Tổng quan về Saponin 9 1.3. Tổng quan về Stipuleanosid R2 10 1.4. Tổng quan về một số nghiên cứu phân tích định tính và định lượng về thành phần hóa học trong Sâm Vũ Diệp 11 2. CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 14 2.1.1. Nguyên liệu 14 2.1.2. Dung môi, hóa chất 14 2.1.3. Thiết bị 14 2.2. PHƯƠNG PHÁP 15 2.2.1. Phương pháp chiết xuất Sâm Vũ Diệp 15 `2.2.2. Phương pháp phân tích T @LC. School .of .Medicine .and 16 Pharmacy, VNU
4. 2.2.3. Phương pháp định lượng Stipuleanosid R2 bằng HPLC 17 3. CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ 25 3.1. Chiết xuất saponin từ các bộ phận lá, thân, rễ Sâm Vũ Diệp 25 3.2. Định tính bằng TLC thành phần Stipuleanosid R2 trong các bộ phận Sâm Vũ Diệp 25 3.3. Định tính thành phần Stipuleanosid R2 trong cao chiết từ các bộ phận Sâm Vũ Diệp bằng HPLC 26 3.4. Định lượng Stipuleanosid R2 trong các bộ phận Sâm Vũ Diệp bằng HPLC 27 4. CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN 29 4.1 Về chiết xuất và xác định thành phần saponin có trong các bộ phận của Sâm Vũ Diệp 29 4.2. Về định lượng sơ bộ thành phần Stipuleanosid R2 trong các bộ phận của Sâm Vũ Diệp bằng HPLC 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC 35 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
5. LỜI CẢM ƠN Trong thời gian tiến hành nghiên cứu và hoàn thiện đề tài cùng khóa luận, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, hỗ trợ và giúp đỡ tận tình và tâm huyết của các thầy cô, các anh chị đi trước tại Khoa Y Dược-ĐHQGHN cùng với sự ủng hộ của bạn bè và người thân gia đình. Qua đây, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành tới những người đã luôn bên cạnh, dìu dắt, chỉ dạy và ủng hộ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Dương Thị Ly Hương, T.S Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y Dược ĐHQGHN, thầy cô đã dành thời gian để trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm quý báu và động viên tôi trong suốt quá trình hoàn thiện khóa luận của mình. Tôi xin cảm ơn sâu sắc tới anh Nguyễn Hoàng Việt ; chị Đặng Thị Ngần - Khoa Y Dược ĐHQGHN, những người tiền bối đã luôn bên cạnh tôi trong suốt quá trình thực nghiệm tại labo, giúp tôi khắc phục những sai sót hay vượt qua những khó khăn thất bại trong qúa trình thí nghiệm. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong Khoa Y Dược, đặc biệt là bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn tạo điều kiện cho tôi thực hiện khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Dược học khóa QH.2014.Y, đặc biệt là các bạn Nông Mỹ Hoa, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Cao Thị Phương Thảo, Bùi Thị Thanh Vân đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian nghiên cứu. Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình thân yêu và bạn bè đã ở bên ủng hộ tôi trong cả quá trình học tập, phấn đấu để đạt được thành tích như ngày hôm nay. Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Trần Thị Ngọc Hà @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
6. Danh mục ký hiệu và tên viết tắt Ký hiệu Tên đầy đủ EtOH Ethanol HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-DAD Sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò mảng diod MeOH Methanol LOD Giới hạn phát hiện LOQ Giới hạn định lượng RDS Độ lệch chuẩn tương đối SVD Sâm vũ diệp TLC Sắc ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo TPHH Thành phân hóa học TT Thuốc thử UV Tử ngoại UV-DAD UV-detector aray diode @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
7. Danh mục các bảng Bảng 1.1. Các thành phần hóa học đã nghiên cứu trong Sâm Vũ Diệp 7 Bảng 1.2. Điều kiện sắc ký và kết quả phân tích định tính, định lượng acid oleanolic trong dược liệu Sâm Vũ Diệp 12 Bảng 1.3. Chương trình pha động chạy HPLC-DAD 13 Bảng 2.1. Chương trình dung môi chạy HPLC-DAD 18 Bảng 3.1. Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ thân rễ Sâm Vũ Diệp 25 Bảng 3.2. Hàm lượng cắn phân đoạn chiết xuất từ lá và thân Sâm Vũ Diệp 25 Bảng 3.3. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký 19 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2 20 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 21 Bảng 3.6. Khảo sát độ thu hồi 22 Bảng 3.7. Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD 27 Bảng 3.8. Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân và lá SVD 28 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
8. Danh mục các hình vẽ và đồ thị Hình 1.1 . Đặc điểm hình thái Sâm Vũ Diệp 2 Hình 1.2 . Đặc điểm thực vật và vùng phân bố Sâm Vũ Diệp 3 Hình 1.3 . Cấu trúc hóa học của 10 saponin tách được từ rễ SVD 5 Hình 1.4 . Cấu trúc hóa học của β-sitosterol, oleanolic acid và daucosterol 5 Hình 1.5 . Cấu trúc hóa học của Stipuleanosid R2(a) và Aralosid A methyl(b) ester 6 Hình 1.6 . Thành phần saponin thuộc nhóm triterpenoid có trong Sâm Vũ Diệp.10 Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Stipuleanosid R2 11 Hình 2.1 . Mẫu dược liệu Sâm Vũ Diệp 14 Hình 2.2 . Sơ đồ quy trình chiết 16 Hình 2.3 . Dịch lọc rễ, thân, lá SVD 16 Hình 3.1 . Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử 19 Hình 3.2 . Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 21 Hình 3.3 . Kết quả TLC Stipuleanosid R2 của các bộ phận dược liệu Sâm Vũ Diệp 26 Hình 3.4 . Sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 (A) và các mẫu cao của thân rễ (B), thân và lá (C) Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 26 Hình 3.5 . Sắc ký đồ cao tổng lá và thân SVD 28 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
9. ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm - Araliaceae) là một trong những cây thuốc quý phân bố ở Trung Quốc và dãy núi Hoàng Liên Sơn Tây Bắc nước ta [9]. Gần đây Sâm Vũ Diệp (SVD) đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa phương ở Hà Giang, Lào Cai. Về mặt y học, SVD được sử dụng làm thuốc bổ và là thành phần trong một số bài thuốc truyền thống của các dân tộc vùng núi Tây Bắc. Theo các tài liệu cũng như các nghiên cứu trước [2,12] cho thấy dược liệu SVD đang được sử dụng là phần thân rễ, chứa hàm lượng lớn saponin-Stipuleanosid R2-thành phần hoạt chất chính mang lại tác dụng dược lý và giá trị sử dụng của dược liệu quý này trong y học. Tuy nhiên, chưa có công bố chính thức nào về thành phần saponin này trong bộ phận trên mặt đất của SVD. Do đó, việc tập trung nghiên cứu thành phần saponin trong các bộ phận SVD cũng như định lượng được thành phần đó có ý nghĩa rất quan trọng trong việc ứng dụng dược liệu SVD trong thực tiễn. Vậy liệu trong các bộ phận khác trên mặt đất của SVD (lá, thân, hoa) có chứa thành phần saponin như phần (dưới mặt đất) thân rễ hay không? Nếu có thì hàm lượng là bao nhiêu? Có thể sử dụng các bộ phận đó thay thế dược liệu SVD được không? Để trả lời những câu hỏi trên, đồng thời đóng góp vào việc nghiên cứu một cách có hệ thống về saponin và xây dựng các tiêu chí định tính, định lượng, cơ sở dữ liệu về hóa thực vật và tiêu chuẩn hóa dược liệu SVD; chúng tôi thực hiện đề tài “Phân tích thành phần Stipuleanosid R2 có trong các bộ phận của cây Sâm Vũ Diệp” tiếp nối nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học của thân rễ SVD và “Nghiên cứu thành phần saponin có trong thân rễ của SVD trồng ở Sa Pa”-luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Thu Thủy [12], với các mục tiêu định tính và bước đầu định lượng thành phần stipuleanosid R2 trong các bộ phận của cây Sâm Vũ Diệp gồm: thân (trên mặt đất), lá và thân rễ. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
10. CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Sâm Vũ Diệp 1.1.1. Tên khoa học Sâm Vũ Diệp có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem. [1], SVD thuộc chi Sâm (Panax. L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) [2]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật Sâm Vũ Diệp là cây thân thảo sống nhiều năm, ưa bóng và đặc biệt ưa ẩm. Thân rễ dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân rụng hàng năm để lại. Thân khí sinh mảnh, cao 20 - 30 cm, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi vào mùa đông, mọc chồi thân mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 dương lịch. Lá kép chân vịt, gồm 2 - 3 cái mọc vòng. Lá chét 5 - 7 (ít khi 3) thuôn, dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy không đều, mép có răng cưa, có lông [1]. Hình 1.1. Đặc điểm hình thái Sâm Vũ Diệp 1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái Trong tự nhiên, SVD phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ và Nepan (vùng cận Hymalaya) và dãy núi Hoàng Liên Sơn, Tây Bắc nước ta [1]. Sa Pa-Việt Nam cũng là điểm phân bố cuối cùng của SVD ở phía nam. Năm 1973, cây đã được phát hiện ở núi Hàm Rồng, sát thị trấn Sa Pa, ở độ cao 1600 m. Hiện nay vùng phân bố của SVD đã bị thu hẹp dần, từ độ cao khoảng 1800 m trở lên, cây được coi là cực hiếm [1]. Gần đây SVD đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa phương ở Hà Giang và Lào Cai [18]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
11. Hình 1.2. Đặc điểm thực vật và vùng phân bố Sâm Vũ Diệp. Sâm Vũ Diệp thường mọc rải rác hay tập trung (vài chục khóm) dưới tán rừng ẩm, gần như quanh năm có sương mù. Đất nơi có SVD mọc được xác định là feralit có mùn, có những chỗ SVD mọc lần với thảm rêu dày trên hốc đá hay ở gốc cây gỗ lớn. SVD còn là cây ưa khí ẩm mát. Các chỉ số về khí hậu ở Trạm quan trắc đèo Hoàng Liên Sơn, cho thấy SVD đã tồn tại và phát triển vững bền từ bao đời nay trong một điều kiện khí hậu có nền nhiệt độ khá thấp (nhiệt độ trung bình năm 12.8°C, lượng mưa: 3552 mm/năm; lượng bốc hơi là 494 mm/năm và độ ẩm không khí và độ ẩm không khí trung bình khoảng 90% ) Hàng năm vào cuối tháng 2 đầu tháng 3, từ phần đầu mầm thân rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ mọc lên một hoặc vài chồi thân (tùy thuộc vào số đầu mầm thân rễ phân nhánh). Chồi này sinh trưởng nhanh trong vòng một tháng đã ra lá và gần đạt được chiều cao cực đại. Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể cho ra một cụm hoa. Quả xanh quan sát được vào cuối tháng 4 – 6, đến tháng 7 quả đã chín và rụng xuống xung quanh gốc cây mẹ. Do quả chín đúng vào thời kì có lượng mưa lớn tháng 7 – 8 nên hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của SVD. Sau khi quả chín, từ tháng 9 – 10, toàn bộ phần thân mặt đất tàn lụi qua mùa đông, để lộ những vết sẹo thân rễ khá rõ. Đó là dấu hiệu giúp ta xác định tuổi của cây [1]. 1.1.4. Thành phần hóa học Hiện tại các nghiên cứu về Sâm Vũ Diệp chưa nhiều, song hầu hết các kết quả nghiên cứu đều cho thấy thành phần hóa học mang hoạt tính chính của SVD là Saponin. Trần Công Luận và cộng sự năm 2009, đã định lượng saponin tổng số của thân rễ và rễ củ của SVD theo phương @phá pSchooltrọng lượn gofcủ aMedicineNamba là 5,8 6and% [7] .Pharmacy, VNU 3
12. Trong lá và thân rễ Sâm Vũ Diệp được các nhà nghiên cứu xác định có chứa thành phần chính là các Saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng với một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn [11,12]. Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc công bố phân lập 13 saponin khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [17].Thân rễ SVD chứa saponin thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [1]. Ở Việt Nam, nghiên cứu về TPHH của SVD còn khá mới mẻ. Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự năm 2002, kết quả định tính sơ bộ cho thấy trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin. Đồng thời bằng cách thủy phân saponin rồi kết tinh sapogenin toàn phần thu được acid oleanolic [7,8]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc đã phân lập và xác định được một nhóm gồm 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.2) là thành phần chính của rễ cây SVD được thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn (Việt Nam), trong đó có 3 chất mới bifinosid A-C (1-3) [3]. 1: Ara(p) H H Me H 2: H Xy (1→6) H Me H g c 3: Xy Ara(p) H Me G c 4: H H Ara(p) Me H 5: H H H Me Gc 6: Xy H @ SchoolH M ofe MedicineH and Pharmacy, VNU 4
13. 7: H G c Ara(f) H H 8: Xy H H Me G c 9: Xy Ara(p) H H G c 10: H G c Ara(f) Me G c Me: methyl Ara(f): α-L-arabinofuranosy Ara(p): α-L-arabinopyranosy G c: β-D-g ucopyranosy Xy: β-D-xy opyranosy Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của 10 saponin tách được từ rễ SVD Đỗ Văn Hào năm 2017, đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học 3 hợp chất β-sitosterol, oleanolic acid và daucosterol từ phân đoạn ethyl acetat thân rễ SVD [4]. β-sitosterol Oleanolic acid Daucostero Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của β-sitosterol, oleanolic acid và daucosterol. Năm 2018, Thạc sỹ Nguyễn Thu Thủy đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 2 hợp chất khác có trong thân rễ SVD là stipuleanosid R2 , aralosid methyl ester [12]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5
14. a) Stipuleanosid R2. b) Aralosid A methyl ester. Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Stipuleanosid R2(a) và Aralosid A methyl(b) ester. Như vậy, tổng cộng có 23 hợp chất saponin đã được xác định từ các phần của cây SVD có liên quan đến tác dụng sinh học. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
15. Bảng 1.1. Các thành phần hóa học đã nghiên cứu trong Sâm Vũ Diệp STT Hợp chất TLTK 1 24(S)-pseudoginsenosid F11 [15] 2 Bifinosid A [14] 3 Bifinosid B [14] 4 Bifinosid C [14] 5 Bipinnatifidusosid F1 [15] 6 Bipinnatifidusosid F2 [15] 7 Chikusetsusaponin IVa [13] 8 Ginsenosid F [15] 9 Ginsenosid F2 [15] 10 Ginsenosid F3 [15] 11 Ginsenosid Rb1 [15] 12 Ginsenosid Rb3 [15] 13 Ginsenosid Rd [15] 14 Ginsenosid Re [15] 15 Ginsenosid Rg1 [15] 16 Ginsenosid Rg2 [15] 17 Majorosid F1 [15] 18 Momordin IIe [13] 19 Narcissiflorin methyl este [13] 20 Panasenosid [13] 21 Pseudoginsenosid RT1 methyl este [13] 22 Stipuleanosid R1 [13] 23 Stipuleanosid R2 methyl este [13] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
16. Nhận xét: Các kết qủa nghiên cứu bước đầu chỉ ra rằng saponin Stipuleanosid R2 là thành phần chính trong dược liệu SVD (thân rễ) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn [1,7,12,14]. Song các nghiên cứu chỉ mới thực hiện chủ yếu trên đối tượng là thân rễ của SVD mà chưa có nhiều báo cáo về các thành phần có trong các bộ phận khác như lá, phần thân trên mặt đất của cây. Do đó từ tổng quan về TPHH của SVD đã trình bày, đề tài định hướng nghiên cứu phân tích TPHH của các bộ phận thân, lá, thân rễ SVD trồng ở Sa Pa, đặc biệt là thành phần Stipuleanosid R2 với mục đích so sánh về thành phần và hàm lượng thành phần này giữa các bộ phận. Từ đó cung cấp cơ sở khoa học cho dược liệu SVD trồng ở Việt Nam. 1.1.5. Tính vị, công năng Tính vị, công năng: SVD có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [1]. 1.1.6. Tác dụng dược lý Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của SVD cho thấy khi thử trên động vật thí nghiệm, SVD có độc tính cấp rất thấp, tăng cường chức năng sinh lý, ảnh hưởng tốt đến hệ thần kinh trung ương, tăng sức dẻo dai của cơ thể, tăng sức đề kháng, tác dụng tán huyết [1]. Bên cạnh đó một số Saponin có tác dụng dược lý như: chống viêm, chống oxi hóa, chống ung thư, bảo vệ tim mạch, chống tiểu đường, bảo vệ tế bào thần kinh, có thể phần nào giải thích cho lợi ích về mặt dược học trong việc sử dụng SVD trong y học truyền thống [16]. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã chỉ ra rằng SVD có tác dụng chống stress, chống trầm cảm, có tác dụng bảo vệ gan và kích thích tăng miễn dịch [5] 1.1.7. Công dụng Từ xa xưa, dân gian đã dùng SVD làm thuốc bổ huyết, chủ yếu cho phụ nữ sau sinh và người cao tuổi. SVD còn được dùng ngoài, bôi lên các vết thương để cầm máu, tán ứ, tiêu sưng, làm lành vết thương nhanh. Bên cạnh đó SVD còn được dân gian sử dụng như một thực phẩm tăng cường sinh lực, kích thích sinh dục bằng cách ngâm rễ SVD rồi chiết dưới dạng tinh sâm, rất tốt cho sức khỏe [1]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
17. Trong y học cổ truyền Việt Nam, thân rễ của SVD đã được sử dụng như một loại thuốc bồi bổ tinh thần và thể chất, cải thiện trí nhớ, giảm nguy cơ ung thư và làm giảm đường huyết ở bệnh nhân tiểu đường [3]. Ở Trung Quốc, SVD còn được dùng làm thuốc chữa lao, chảy máu cam, thổ huyết, đòn ngã tổn thương [1]. 1.2. Tổng quan về Saponin Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycoside với phần genin có cấu trúc triterpene hay steroid 27 Cacbon gặp nhiều trong thực vật; ở động vật tìm thấy nhiều trong Sao Biển, Hải Sâm. Theo truyền thống, saponin thường được định nghĩa dựa trên một số tính chất chung đặc trưng của nhóm hợp chất này bao gồm:  Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước.  Làm vỡ hồng cầu ngay cả khi ở nồng độ loãng.  Độc với cá, diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên  Kích thích niêm mạc mắt gây hắt hơi, đỏ mắt.  Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3β-hydroxysteroid. Tuy nhiên không phải tất cả steroid đều thể hiện tất cả tính chất trên. Cấu trúc của Saponin cũng như các glycosid khác, gồm có 2 phần là phần đường và phần aglycon (còn được gọi là sapogenin). Saponin có cấu trúc triterpen với khung cơ bản 30C hoặc steroid với khung cơ bản 27C dẫn xuất từ khung cholestan. Trên các khung cơ bản của sapogenin các sapogenin khác nhau bởi mức độ oxi hóa trên khung hay vị trí, số lượng của các nhóm thế. Nhóm thế trong sapogenin thường là hydroxyl, đôi khi gặp nhóm oxo hay sulfat. Nhóm OH có thể tự do hay glycosid hóa với đường. Một vài trường hợp nhóm có thể được acyl hóa với các acid hữu cơ. Số lượng và vị trí nhóm thế trên khung cũng không nhiều. Ở vị trí C3 của sapogenin gần như luôn có nhóm OH. Nhóm OH này trong đa số trường hợp có định hướng β. Đây cũng là vị trí gắn với đường của đa số saponin. Với số lượng không nhiều các sapogenin, sự đa dạng của saponin chủ yếu do thành phần, số lượng và vị trí của các đường trong phân tử. Ngoài ra, còn có thể gặp các dây nối trên khung. Đa số saponin có từ 1-2 mạch đường (được gọi là monodesmosid và bidesmosid). Ở các monodesmosid, phần đường gắn vào sapogenin hầu hết là ở vị @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
18. trí C-3 bằng dây nối glycosid. Saponin có thể có thêm mạch đường thứ hai. Tổng số đơn vị đường trong một saponin có thể tới 11 đơn vị, nhưng số đường trên một mạch được biết tới nay tối đa là 8. Số đơn vị đường trong saponin thường là 1-4 đường. Đường trong saponin là các đường thông thường như β-D-glucose, β-D- xylose, α-L-rhamnose và α-L-arabinose [11]. Dựa trên cấu trúc hóa học của phần genin người ta chia saponin thành 2 nhóm lớn là saponin triterpenoid và saponin steroid; mỗi nhóm lại được chia thành nhiều nhóm nhỏ [11]. Nhiều công trình nghiên cứu trước đây đã cho thấy thành phần chính của thân rễ và rễ củ của cây SVD là saponin thuộc nhóm triterpenoid khung oleanan với phần sapogenin đã được xác định là acid oleanolic [1]. Hình 1.6. Thành phần saponin thuộc nhóm triterpenoid có trong Sâm Vũ Diệp. 1.3. Tổng quan về Stipuleanosid R2 Stipuleanosid R2 là một hoạt chất saponin quan trọng, thành phần mang hoạt tính, đang tiếp tục được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học, hợp chất này được phân lập trong một số dược liệu như: Sâm Vũ Diệp, Tam Thất hoang, Aralia taibaiensis [14], Aralia elata [17] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
19. Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Stipuleanosid R2 Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: (2S,3S,4R,5R,6R)-6- [[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b-heptamethyl-8a- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxycarbonyl- 1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]-3[(2S,3R,4R,5S)- 3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2- carboxylic acid [16]. Công thức phân tử: C53H84O23 [19]. Phân tử lượng: 1089.232 g/mol [19]. Tính chất lý hóa: Chất bột màu trắng, độ tan: 0,57 g/L, điểm nóng chảy 210 - 215 0C [19]. 1.4. Tổng quan về một số nghiên cứu phân tích định tính và định lượng về thành phần hóa học trong Sâm Vũ Diệp Trần Công Luận và cộng sự năm 2009, đã định lượng saponin tổng số của thân rễ và rễ củ của Sâm vũ diệp theo phương pháp trọng lượng của Namba là 5,86% [7]. Năm 2017, Đỗ Văn Hào và Nguyễn Thị Huệ đã tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và xây dựng phương pháp định tính, định lượng acid oleanolic trong dược liệu SVD bằng phương pháp HPLC–DAD. Điều kiện sắc ký và kết quả phân tích định tính, định lượ n@g n hSchoolư bảng 1.2. of Medicine and Pharmacy, VNU 11
20. Bảng 1.2. Điều kiện sắc ký và kết quả phân tích định tính, định lượng acid oleanolic trong dược liệu Sâm Vũ Diệp - Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm) - Pha động: MeOH - Acid acetic 0,15%/H2O (85:15, v/v) - Detector UV-DAD phát hiện ở bước sóng: 203 nm - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Thể thích bơm mẫu: 20 µl - Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng - Dung môi pha mẫu: Methanol Định tính: Kết quả phân tích Định lượng: Kết quả cho thấy dung dịch thử (cao tổng ethanol) hàm lượng acid oleanolic trong cao có pic oleanolic acid xuất hiện ở SVD và dược liệu SVD lần lượt là: thời gian lưu tR=10,485 phút tương 0,034% và 0,0066% [12]. tự như thời gian lưu của pic oleanolic acid chuẩn (tR=10,690 phút) [4]. Năm 2018, Nguyễn Thị Thu Thủy đã xác định và định lượng thành phần chính stipuleanosid R2 trong mẫu thân rễ SVD nghiên cứu trong đề tài là 0,49% bằng phương pháp HPLC-DAD được thực hiện trong điều kiện như sau:  Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity.  Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm).  Detector DAD phát hiện ở bước sóng 203 nm.  Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.  Thể thích bơm mẫu: 20 µl.  Nhiệt độ: 25℃.  Dung môi pha mẫu: Methanol.  Pha động: Acetonitril (kênh A): 0,5% acid acetic/H2O (kênh B) với chương trình gradient như bảng 1.3. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
21. Bảng 1.3. Chương trình pha động chạy HPLC-DAD Thời gian Acetonitri Acid acetic 0,5% (phút) l (%) (%) 0-5 20 80 5-15 20→40 80→60 15-20 40 60 20-30 40→100 60→0 30-35 100 0 35-40 100→20 0→80 40-45 20 80 Với điều kiện sắc ký như trên, các thành phần saponin trong mẫu thử chuẩn bị từ dịch chiết n-butanol, ethanol thân rễ SVD đều được tách tương đối tốt, pic cân đối, thời gian lưu hợp lý [12]. Nhận xét: Đây là những kết quả bước đầu về các chỉ số định tính, định lượng thành phần Stipuleanosid R2 trong thân rễ của SVD. Cho đến thời điểm hiện tại, chưa có kết quả công bố phân tích các thành phần saponin cụ thể trong các bộ phận khác của cây SVD. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành phân tích định tính và định lượng thành phần Stipuleanosid R2-saponin chính trong các bộ phận SVD bằng phương pháp TLC và HPLC. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
22. 2. CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu Mẫu nghiên cứu thân rễ, thân (trên mặt dất), lá Sâm Vũ DIệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 3 năm tuổi được trồng ở Sa Pa, Lào Cai và thu hái vào tháng 3/2016 và được giám định tên khoa học bởi TS Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Mẫu tiêu 4 bản (PB-001/2016) được lưu giữ tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN. Hình 2.1. Mẫu dược liệu Sâm Vũ Diệp 2.1.2. Dung môi, hóa chất - Chất chuẩn liên kết Stipuleanosid R2 của Wako Chemicals, Nhật Bản (độ tinh khiết 98%, mã sản phẩm 155-01701) - Dung môi, hóa chất: Các hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA) và loại tinh khiết dùng trong HPLC. - Ethanol 70% được pha từ Ethanol PA. - Acid acetic 0.5%/H2O được pha từ acid acetic PA (Merk, Đức) - Methanol dùng cho HPLC (Merk Đức). - Nước cất hai lần đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV. - Dung môi chạy sắc ký HPLC (Metanol, acetonitril) của Merck, Đức. - Sắc ký lớp mỏng pha đảo bằng silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức). 2.1.3. Thiết bị @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
23. - Các dụng cụ dùng trong quá trình thực nghiệm như bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức, ống nghiệm, ống đong, pipet, kim tiêm - Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức). - Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (Precisa- Thụy Sĩ). - Máy siêu âm Power sonic 405(Powersonic - Hàn Quốc). - Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ). - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động. 2.2. PHƯƠNG PHÁP 2.2.1. Phương pháp chiết xuất Sâm Vũ Diệp Các nghiên cứu về Sâm Vũ Diệp đều cho thấy thành phần chính của dược liệu là saponin. Tham khảo tài liệu về chiết xuất saponin và saponinogen trong dược liệu [10] và đề tài “Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ SVD” - luận văn thạc sĩ của Nguyễn Thị Thu Thủy [12] để lựa chọn quy trình chiết xuất phù hợp nhất với từng bộ phận như sau:  Cân 500 g thân rễ SVD (độ ẩm được xác định là 7,81%), chiết bằng phương pháp chiết hồi lưu ở nhiệt độ 65-70℃ với dung môi ethanol 70% trong 3 giờ (chiết 3 lần, mỗi lần 1500 ml). Các dịch chiết ethanol thu được được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 95,9 g cao chiết tổng ethanol.  Mẫu thân và lá SVD được rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ. Tiến hành chiết kiệt 450g mẫu bằng dung môi ethanol 70%, chiết hồi lưu 3 lần (mỗi lần 1500 mL trong 3 giờ). Gộp dung môi, lọc loại bỏ bã nguyên liệu, sau đó cất quay áp suất giảm loại bỏ EtOH ở nhệt độ 65-70℃ cho 57,6 g cao chiết tổng ethanol. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
24. Hình 2.2. Sơ đồ quy trình chiết. Hình 2.3. Dịch lọc rễ, thân, lá SVD Cao chiết saponin thu được dùng làm mẫu để thực hiện các phương pháp phân tích tiếp theo. `2.2.2. Phương pháp phân tích TLC Pha tĩnh: bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức). Pha động: MeOH/H2O (2:1). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
25. Phương pháp phát hiện: Phun thuốc thử acid sulfuric (10%)/ EtOH 96%, hơ nóng bản sắc ký trên bếp điện. Triển khai sắc ký:  Tiến hành sắc ký đồng thời các dung dịch: dung dịch chất đối chiếu, dung dịch các cao chiết phân đoạn.  So sánh vị trí, màu sắc các vết trên sắc ký đồ. 2.2.3. Phương pháp định lượng Stipuleanosid R2 bằng HPLC Tham khảo phương pháp nghiên cứu trong đề tài “Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ SVD” - luận văn thạc sĩ của Nguyễn Thị Thu Thủy [12] và các nghiên cứu về định lượng Stipuleanosid R2 trước đó [8] chúng tôi tiến hành lựa chọn phương pháp HPLC như sau 2.2.3.1. Phương pháp HPLC  Chuẩn bị mẫu Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 1,0 mg hợp chất stipuleanosid R2, pha thành dung dịch gốc nồng độ 1000 µg/ml với MeOH, siêu âm 10 phút, ly tâm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc kích thước 0,45µm thu được dung dịch để triển khai sắc ký. Mẫu thử: cân chính xác khoảng 0,1g cao tổng thân rễ; 0,5g cao tổng thân và lá SVD (độ ẩm 7,8 %) cho vào bình định mức 10ml, thêm 7ml MeOH sau đó lắc siêu âm 10 phút để hòa tan. Các dung dịch được lọc qua màng lọc kích thước 0,45µm thu được dung dịch để triển khai sắc ký. Mẫu trắng: dung dịch MeOH.  Điều kiện sắc ký  Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity.  Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm).  Detector DAD phát hiện ở bước sóng 203nm.  Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.  Thể thích bơm mẫu: 20µl.  Nhiệt độ: 25℃. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
26.  Dung môi pha mẫu: Methanol.  Pha động: Acetonitril (kênh A) - 0,5% Acid acetic/H2O (kênh B) với chương trình gradient như Bảng 2.1. Bảng 2.1. Chương trình dung môi chạy HPLC-DAD Thời gian Acetonitril Acid acetic (phút) (%) 0,5% (%) 0-5 20 80 25-15 20→40 80→60 15-20 40 60 20-30 40→100 60→0 30-35 100 0 35-40 100→20 0→80 40-45 20 80 Mục tiêu: phương pháp phân tích được xây dựng nhằm mục đích định tính và định lượng thành phần Stipuleanosid R2 trong các bộ phận khác nhau của SVD. Nguyên tắc: sử dụng chất chuẩn liên kết Stipuleanosid R2 để xây dựng đường chuẩn. 2.2.3.2. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích a) Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng, mẫu chuẩn stipuleanosid R2 và mẫu thử theo quy trình phân tích ở trên. Ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu và phổ UV của pic stipuleanosid R2 trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn. Kết quả thu được được trình bày trong các hình sau. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
27. Hình 3.1. Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của stipuleanosid R2 trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Sắc ký đồ của dung dịch thử cho 1 pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của stipuleanosid R2 trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn. b) Tính thích hợp hệ thống Tiến hành phân tích 01 dung dịch chuẩn của stipuleanosid R2 lặp lại 06 lần. Tiến hành sắc ký, ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic, hệ số đối xứng. Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu, diện tích pic và hệ số bất đối lần lượt là 0,15%; 2,75% và 1,21% đều thấp hơn 3% (Bảng 3.3). Điều đó cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống sắc ký HPLC sử dụng là ổn định, phù hợp cho phép phân tích stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp. Bảng 3.3. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký Thời gian lưu Diện tích pic Hệ số bất STT (phút) (mAU*s) đối 1 15,707 424,728 0,90 2 15,698 421,771 0,89 3 15,674 449,195 0,92 4 15,658 419,380 0,90 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
28. 5 15,680 418,038 0,92 6 15,729 440,903 0,91 TB 15,691 429,003 0,913 RSD (%) 0,15 2,75 1,21 c) Độ tuyến tính Chuẩn bị các dung dịch chuẩn bằng cách pha loãng từ một dung dịch chuẩn gốc ban đầu với các hệ số pha loãng khác nhau. Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm 3 lần) ghi lại sắc ký đồ và xác định đáp ứng của pic. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn trong mẫu so và đáp ứng pic thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu. Kết quả cho thấy tương quan tuyến tính giữa diện tích pic trên sắc ký đồ và nồng độ stipuleanosid R2 trong dung dịch theo phương trình y = 2,6081x + 49,1185 với hệ số tương quan R2 = 0,9988 (Bảng 3.4. và Hình 3.4.). Trong khoảng nồng độ khảo sát 15,625 – 400 µg/ml có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ stipuleanosid R2 với hệ số tương quan rất cao. Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2 STT Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (mAU*s) 1 15,625 90,65283 2 37,5 154,6339 3 75 239,247 4 150 418,038 5 200 589,441 6 300 836,676 7 400 1087,77 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
29. Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 d) Giới hạn phát hiệu (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có giới hạn phát hiện là LOD = 1,953 µg/ml, giới hạn định lượng LOQ = 3,3 x LOD = 6,445 µg/ml. Kết quả cho thấy phương pháp đã xây dựng có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tương đối phù hợp để xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong Sâm Vũ Diệp. e) Độ lặp lại Tiến hành định lượng 6 mẫu thử độc lập, mỗi mẫu tiêm 3 lần. Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong mẫu các mẫu thử bằng cách sử dụng đường chuẩn ở phần xác định khoảng tuyến tính. Đô lặp lại của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%), kết quả định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 trong mẫu. Độ lệch chuẩn tương đối RSD < 3%. Như vậy, phương pháp có độ lặp lại tốt và có thể ứng dụng trong phân tích stipuleanoside R2 (PBF41) trong sâm vũ diệp (Bảng 3.5.). Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp Thí Khối Nồng độ cao Diện tích pic Hàm lượng nghiệm lượng (g) (mg/ml) (mAU*s) (%) 1 0,0968 100 6372,05 2,42 2 0,0921 100 6761,73 2,57 3 0,1308 100 6619,42 2,52 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
30. 4 0,2297 200 12960,5 2,48 5 0,2064 200 12671,5 2,42 6 0,2059 200 12837,4 2,45 Trung bình 2,477 RSD (%) 2,20 f) Độ đúng Khi thêm các lượng stipuleanosid R2 chuẩn khác nhau, phương pháp đều cho độ thu hồi nằm trong khoảng và độ lệch chuẩn tương đối RSD. Kết quả này chứng tỏ phương pháp xây dựng có độ thu hồi tốt, phù hợp với định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.6. Bảng 3.6. Khảo sát độ thu hồi Lượng có Lượng thêm Diện tích Lượng tìm Độ thu hồi vào pic STT sẵn lại (µg) (%) (µg) (mAU*s) (µg) 1 711,754 75 2094,160 72,358 96,48 2 711,754 75 2093,725 72,191 103,68 3 711,754 100 2167,998 100,668 100,67 4 711,754 100 2175,860 103,683 96,25 5 711,754 200 2416,990 196,137 98,07 6 711,754 200 2451,260 209,277 104,64 Trung bình 99,96 RSD (%) 3,31  Định lượng các mẫu dược liệu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
31. Tiêm riêng biệt các dung dịch mẫu thử, mỗi mẫu thử lặp lại 3 lần, ghi nhận sắc ký đồ và ghi lại đáp ứng của chất cần phân tích. Nồng độ của stipuleanosid R2 trong dung dịch thử được xác định dựa trên công thức: S-b H C (µg/ml) = x a 100 Với S là diện tích pic stipuleanosid R2; a,b là các hệ số của phương trình đường chuẩn y = ax+b, H là độ tinh khiết của chất đối chiếu (%). Hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu được xác định dựa trên công thức: Trong đó: C x 10 x 100 100 x H X (%) = x m x 1000000 100-a M: khối lượng dược liệu (g). X: hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu (%). C: Nồng độ stipuleanosid R2 trong dung dịch thử, xác định được bằng đường chuẩn (µg/ml). a: độ ẩm của dược liệu (%). H: hiệu suất chiết (%).  Xử lý số liệu + Tập hợp kết quả và loại bỏ giá trị thô theo test Dixon. + Tính giá trị trung bình: + Tính độ lệch chuẩn: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
32. + Tính độ lệch chuẩn tương đối: Trong đó: X : giá trị trung bình của hàm lượng hợp chất chính. xi : giá trị của hàm lượng hợp chất chính của mẫu thứ i. n : số thử nghiệm được sử dụng để tính giá trị trung bình về hàm lượng của hợp chất chính. SD: độ lệch chuẩn. RSD: độ lệch chuẩn tương đối @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
33. 3. CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ 3.1. Chiết xuất saponin từ các bộ phận lá, thân, rễ Sâm Vũ Diệp Hiệu suất của cắn 3 phân đoạn so với cắn toàn phần và so với nguyên liệu khô được trình bày trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Hàm ẩm nguyên liệu thu được từ các bộ phận Lần đo Hàm ẩm thân lá (%) Hàm ẩm thân rễ (%) 1 7,52 7,72 2 7,81 7,93 3 7,92 7,78 Trung bình 7,75 7,81 RSD 2,6 1,3 Bảng 3.2. Hiệu suất chiết các bộ phận Bộ phận Khối lượng Khối lượng cao Hiệu suất nguyên liệu (g) tổng EtOH (g) chiết(%) Thân lá 450 57 12,67 Thân rễ 500 95,9 19,18 3.2. Định tính bằng TLC thành phần Stipuleanosid R2 trong các bộ phận Sâm Vũ Diệp Tiến hành chạy sắc ký TLC để định tính chất Stipuleanosid R2 trong cao chiết từ các bộ phân SVD bằng hệ dung môi triển khai. Sau khi phun thuốc thử dung dịch H2SO4 10% (TT) trong EtOH, sấy ở 120°C đến khi hiện vết. Quan sát các vết xuất hiện ở ánh sáng thường, so sánh giá trị hệ số di chuyển Rf so với chất đối chiếu Stipuleanosid R2 [20], thu được kết quả sau: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
34. Hình 3.3. Kết quả TLC Stipuleanosid R2 của các bộ phận dược liệu Sâm Vũ Diệp 1: mẫu cao tổng của thân và lá. 2: mẫu cao tổng của thân rễ. 3: chất chuẩn Stipuleanosid R2 . Nhận xét: kết quả TLC cho thấy vết sắc ký của Stipuleanosid R2 xuất hiện ở cả cao chiết của phần thân lá và thân rễ SVD. 3.3. Định tính thành phần Stipuleanosid R2 trong cao chiết từ các bộ phận Sâm Vũ Diệp bằng HPLC Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 (A) và các mẫu cao của thân rễ (B), thân và lá (C) Sâm Vũ D i@ệp ( PSchoolanax bipin nofati fMedicineidus Seem.). and Pharmacy, VNU 26
35. Nhận xét: Sử dụng chương trình phân tích HPLC như trong phần 2.2.3.a. lần lượt cho thấy chất tinh khiết stipuleanosid R2 và các mẫu cao toàn phần của thân rễ, lá và thân của SVD. Kết quả phân tích HPLC minh họa trên Hình 3.2 cho thấy sắc ký đồ của bộ phận thân rễ, thân và lá đều xuất hiện pic có thông số thời gian lưu nằm trong khoảng thời gian lưu tương ứng của chất chuẩn stipuleanosid R2 (tR = 15,565-15,85 phút) cùng với thông số độ tinh khiết pic và chồng phổ UV trên cơ sở chế độ quét phổ của đầu dò DAD. Bên cạnh đó các tín hiệu chính khác cũng khá tương đồng bao gồm tín hiệu tại tR = 16,616 ở thân rễ và tR=16,166 phút cho thấy khá tương đồng về thành phần saponin chưa xác định này trong bộ phận rễ, thân và lá. 3.4. Định lượng Stipuleanosid R2 trong các bộ phận Sâm Vũ Diệp bằng HPLC Qua kết quả định tính bằng TLC và HPLC cùng kết quả từ các nghiên cứu trước đó [6,8,12] cho thấy thành phần chính trong SVD là saponin khung oleanan, trong đó có hợp chất chính quan trọng stipuleanosid R2. Do đó chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng stipuleanosid R2 để góp phần đánh giá SVD theo kế hoạch nghiên cứu đề ra. Kết quả thu được sẽ được trình bày sau đây. Bảng 3.7. Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD STT Khối lượng Nồng độ Diện tích Hàm lượng Stipuleanosid nguyên liệu cao pic R2 trong nguyên liệu khô (g) (mg/ml) (mAU*s) (%) 1 500 10 721,829 0,559 2 500 10 748,681 0,581 3 500 10 735,082 0,570 Trung bình 0,57 ± 0,01% RSD (%) 2,0 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
36. b) Định lượng stipuleanosid R2 trong thân và lá SVD Bảng 3.8. Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân và lá SVD STT Khối lượng Nồng độ Diện tích Hàm lượng nguyên liệu cao pic Stipuleanosid R2 trong (g) (mg/ml) (mAU*s) nguyên liệu khô (%) 1 450 50 1451,157 0,259 2 450 50 1502,325 0,265 3 450 50 1441,055 0,257 Trung bình 0,26 ± 0,006% RSD 2,3 Hình 3.5. Sắc ký đồ cao tổng lá và thân SVD @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
37. 4. CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN 4.1 Về chiết xuất và xác định thành phần saponin có trong các bộ phận của Sâm Vũ Diệp Với qui trình chiết xuất SVD bằng phương pháp chiết hồi lưu đơn giản, nhiệt độ 70o dung môi ethanol thu cắn toàn phần, phương pháp chiết hồi lưu có ưu điểm làm tăng tốc độ chiết, chiết kiệt được hoạt chất trong nguyên liệu. Kết quả thu được 95,9 g cao tổng EtOH thân rễ (H=19,18%) và 57,6 g cao tổng EtOH thân lá (H=12,67%). Tiến hành phương pháp TLC cho thấy cắn thu được sau quá trình chiết được xuất hiện các vết màu hồng sau đó chuyển sang màu tím ở cao chiết EtOH của lá, thân (trên mặt đất) và thân rễ rõ rệt, đây là đặc trưng của dẫn xuất triterpen. Trong đó, vết sắc ký của hợp chất Stipuleanosid R2 hiện lên rất rõ rệt ở cả trong cao tổng của phần thân, lá và thân rễ của SVD. Kết quả phân tích TLC sơ bộ cho thấy bộ phận thân và lá SVD có chứa các thành phần saponin tương tự với phần thân rễ cây này; đặc biệt là thành phần Stipuleanosid R2. Thành phần hóa học của các cây thuốc-saponin/ginsenosid của các loài Panax thường phức tạp gồm nhiều thành phần và việc xác định chính xác từng thành phần đòi hỏi phân lập sắc ký và xác cấu trúc hóa học bằng các phương pháp phổ. Từ đó chúng tôi tiến hành sử dụng HPLC để nhằm xác định chính xác sự có mặt của các thành phần saponin khác nhau cũng như Stipuleanosid R2 trong cao chiết của các bộ phận SVD. Kết quả HPLC cho thấy sắc ký đồ của bộ phận thân rễ, thân và lá đều xuất hiện pic có thông số thời gian lưu tương ứng của stipuleanosid R2 (tR = 15,565- 15,85 phút) cùng với thông số độ tinh khiết pic và chồng phổ UV trên cơ sở chế độ quét phổ của đầu dò DAD. Đây là kết quả sơ bộ ban đầu cho thấy sự có mặt của Stipuleanosid R2 đều xuất hiện trong bộ phận rễ, thân và lá [6]. 4.2. Về định lượng sơ bộ thành phần Stipuleanosid R2 trong các bộ phận của Sâm Vũ Diệp bằng HPLC Sau khi tiến hành phân tích xác định hàm lượng Stipuleanosid R2 bằng HPLC, kết quả sơ bộ cho thấy hàm lượng Stipuleanosid R2 trong thân rễ là 0,57 %; trong thân và lá là 0,26 % với hàm ẩm nguyên liệu là 7,8 %; hàm lượng stipuleanosid R2 ở trong cao chiết từ thân rễ SVD cao hơn hàm lượng trong cao chiết từ lá và thân. Dựa trên kết quả này, sơ bộ nhận định các bộ phận khác của cây Sâm Vũ Diệp bao gồm thân và lá đều @già uSchoolhoạt chất sofapo nMedicinein và có thể đ ưandợctiến Pharmacy, VNU 29
38. hành nghiên cứu thêm về thành phần hóa học để ứng dụng như dược liệu thay thế phần thân rễ SVD trong y học cổ truyền. Việc tận dụng thêm phần trên mặt đất của Sâm Vũ Diệp và sử dụng được triệt để giá trị các bộ phận của cây thuốc này giống như các loài Panax nổi tiếng khác: Nhân Sâm (P.ginseng), Tam Thất (P.notoginseng) làm tăng thêm nguồn khai thác dược liệu; giúp tiết kiệm chi phí nghiên cứu và bảo tồn nguồn dược liệu quý hiếm thuộc chi Panax này. Trên đây là các kết quả định tính và định lượng sơ bộ đầu tiên về thành phần Stipuleanosid R2 trong các bộ phận của cây SVD. Kết quả mang tính chất tham khảo và chưa có tính chính xác cao do nghiên cứu còn nhiều sai sót và hạn chế. Cần tiến hành xây dựng và thẩm định lại phương pháp nghiên cứu HPLC trên mẫu thân, lá và rễ tại điều kiện phù hợp với phòng thí nghiệm để có kết quả ổn định và chính xác hơn. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
39. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Với các kết quả thực nghiệm thu được, đề tài đã đạt được các mục tiêu đề ra là: định tính và định lượng sơ bộ thành phần stipuleanosid R2 trong các bộ phận thân, lá và thân rễ của cây Sâm Vũ Diệp. Kết quả này có ý nghĩa thực tiễn trong công tác kiểm nghiệm thuốc nói chung và kiểm nghiệm dược liệu nói riêng, góp phần vào công tác thiết lập cơ sở dữ liệu về hóa thực vật cũng như làm cơ sở định hướng cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học của đối tượng tiềm năng thuộc chi Panax này. Bên cạnh đó, đề tài còn góp phần định hướng mới trong sử dụng, khai thác dược liệu, cụ thể là SVD bằng cách sử dụng các bộ phận khác ngoài phần thân rễ (dưới mặt đất) để phân lập, tinh chế thành phần saponin. Nhằm mục tiêu tiết kiệm thời gian nghiên cứu và chi phí cho người dân trong nhu cầu sử dụng Sâm để chăm sóc sức khỏe hiện nay. Tuy nhiên với những hạn chế của nghiên cứu, kết quả trên chỉ là kết quả sơ bộ ban đầu, mang tính chất tham khảo và cần tiến hành nghiên thẩm định và nghiên cứu kỹ hơn để đưa ra nhận định khách quan và chính xác về định tính và định lượng về thành phần Stipuleanosid R2 . KIẾN NGHỊ Đề tài này là một phần nghiên cứu bước đầu trong đề tài cấp Nhà nước thuộc chương trình Tây Bắc “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây thuốc Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam Thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)” của Khoa Y Dược-ĐHQGHN [6], đặt ra mục tiêu đó là xác lập được cơ sở khoa học của giải pháp công nghệ sinh học, hóa học và dược học để phát triển sản phẩm từ hai loài Sâm Vũ Diệp và Tam Thất hoang. Luận văn này là một trong những kết quả nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học của Sâm Vũ Diệp. Với những kết quả đã thu được và những sai sót và hạn chế gặp phải khi tiến hành thực hiện đề tài, nhóm nghiên cứu xin được kiến nghị thực hiện thêm các phép thực nghiệm sau:  Tiến hành thẩm định lại phương pháp HPLC trên cao chiết EtOH bộ phận thân và lá cây Sâm Vũ Diệp. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
40.  Triển khai phân lập và tinh chế thêm các hợp chất Stipuleanosid R2 trong thân và lá cây Sâm Vũ Diệp.  Tiến hành các nghiên cứu thêm về thành phần hóa học trong thân và lá SVD.  Thiết lập thêm điều kiện cho chất đối chiếu Stipuleanosid R2 để có thể cho kết quả chính xác định lượng hàm lượng chất này trong các bộ phận SVD được chính xác và ổn định hơn.  Xây dựng chất chuẩn stipuleanosid R2 từ Sâm Vũ Diệp.  Tiến hành khảo sát động thái tích lũy, sự thay đổi thành phần hóa học theo độ tuổi.  Dựa trên kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học, cần tiếp tục nghiên cứu tác dụng sinh học của loài này. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
41. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2003), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam Vol. 2, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật. 2. Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học tập 1, NXBYHHN. 3. Đỗ Văn Hào (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học của cây sâm vũ diệp thu hái ở Tây Bắc, Khoa Y Dược-ĐHQGHN. 4. Nguyễn Thị Huệ (2017), Phân tích acid oleanolic và thành phần saponin trong rễ cây sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái ở Sa Pa, Khoa Y Dược-ĐHQGHN. 5. Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích, Đoàn Thị Ngọc Hạnh (2005), "Nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam và đinh lăng trên trí nhớ", Tạp chí Dược liệu,, 10(6), pp. 196-200. 6. PGS.TS. Dương Thị Ly Hương (2018), Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ 2 loại cây thuốc Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus) và Tam Thất Hoang (Panax stipuleantanus) vùng Tây Bắc, Khoa Y Dược-ĐHQGHN. 7. Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên, Nguyễn Tập (2009), "Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)", Tạp chí dược liệu, 14(1), pp. 17-23. 8. Dương Thị Phượng (2018), Định lượng Stripuleanosid R2 trong thân rễ Sâm vũ diệp, Khoa Y Dược-ĐHQGHN. 9. Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn ( 2006), "Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh thái sâm vũ diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam", Tạp chí dược liệu 11(5), pp. 177-180. 10. Ngô Vân Thu (1990), Hóa học Saponin, Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh. 11. Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu học tập 1, NXB Y học – Bộ Y tế. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
42. 12. Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Hữu Tùng, Nguyễn Thế Tùng (2018), Nghiên cứu thành phần Saponin của thân rễ Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem) trồng ở Sa Pa, Đại học Dược Hà Nội. 19. Nguyễn Văn Tập (2005), "Các loài thuộc chi Panax L. ở Việt Nam", Tạp chí dược liệu, 10(3), pp. 71-76. Tiếng Anh 13. Hu M, Ogawa K et Al (1995), "Triterpenoid glucuronide saponins from root bark of Aralia armata", Phytochemistry, 39, pp. 179-184. 14. H. T. Nguyen, et al. (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus", Chem Pharm Bull (Tokyo), 59(11), pp. 1417-1420. 15. Wang Dq, et al. (1989), "Studies on saponins from the leaves of Panax japonicasvar. bipinnatifidus (Seem.) Wu etFeng", Yao XueXueBao, 24(8), pp. 593-599. 16. Who (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP)requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization Geneva. 17. Zhang Y, Shi C et Al. (2016), "Saponins from Panax bipinnatifidus Seem.: New strategy of extraction, isolation, and evaluation of tyrosinase inhibitory activity based on mathematical calculations", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,, 1039, pp. 79-87. 18. Zhitao Liang, et al. (2009), "Determination of acid oleanolic and ursolic acid in Oldenlandia diffusa and its substitute using high performance liquid chromatography", Journal of food and drug analysis, 17(2), pp. 69-77. 20. Stipuleanosid R2, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
43. PHỤ LỤC Phụ lục 1 - Phiếu kết quả giám định mẫu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
44. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
45. Phụ lục 2 - Sắc ký đồ cao EtOH của lá và thân Sâm Vũ Diệp @ School of Medicine and Pharmacy, VNU