›

Khóa luận Nghiên cứu tạo nguyên liệu chứa Bacillus clausii dạng bào tử

pdf 50 trang yendo 12101
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu tạo nguyên liệu chứa Bacillus clausii dạng bào tử", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_tao_nguyen_lieu_chua_bacillus_clausii_d.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu tạo nguyên liệu chứa Bacillus clausii dạng bào tử

  1. BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG THỊ NGỌC HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO NGUYÊN LIỆU CHỨA Bacillus clausii DẠNG BÀO TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015
  2. BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG THỊ NGỌC HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO NGUYÊN LIỆU CHỨA Bacillus clausii DẠNG BÀO TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Đàm Thanh Xuân DS. Nguyễn Thị Thu Phương Nơi thực hiện: Bộ môn Công Nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2015
  3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được khóa luận này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của gia đình, thầy cô, bạn bè. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Đàm Thanh Xuân và DS. Nguyễn Thị Thu Phương là những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ những ngày đầu đến khi em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô và các anh chị kĩ thuật viên của bộ môn Công Nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm thực nghiệm. Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô cùng cán bộ Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, quan tâm em trong suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn động viên khích lệ em trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên Phùng Thị Ngọc Huyền
  4. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC 2 1.1.1. Định nghĩa 2 1.1.2. Vai trò 3 1.1.3. Probiotic từ bào tử 4 1.2. KHÁI QUÁT VỀ Bacillus clausii 5 1.2.1. Đặc điểm hình thái 6 1.2.2. Cấu trúc bộ gen 6 1.2.3. Đặc điểm sinh hóa 7 1.2.4. Đặc điểm sinh thái 7 1.2.5. Điều kiện nuôi cấy 7 1.2.6. Ứng dụng của B. clausii 7 1.2.7. Một số nghiên cứu lên quan tới B. clausii 8 1.3. BÀO TỬ VI KHUẨN 8 1.3.1. Quá trình hình thành bào tử 11 1.3.2. Tính chất của bào tử vi khuẩn và ứng dụng 11 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 13 2.1.1. Nguyên vật liệu 13 2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 14 2.1.3. Thiết bị 14 2.2. Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu lượng bào tử lớn nhất 15
  5. 2.2.2. Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản và theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu trong quá trình bảo quản 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1. Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina 15 2.3.2. Phương pháp nhân giống trong môi trường lỏng 15 2.3.3. Phương pháp đo quang đánh giá sự sinh trưởng của vi sinh vật 15 2.3.4. Phương pháp thu sinh khối 16 2.3.5. Phương pháp xử lý sinh khối bằng lysozym thu bào tử 16 2.3.6. Phương pháp đông khô 17 2.3.7. Phương pháp nhuộm màu bào tử: theo Ogietska 17 2.3.8. Xác định số lượng VSV sống sót theo phương pháp pha loãng liên tục 18 2.3.9. Định lượng đường dư theo phương pháp Schoorl – Regenbogen 19 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu được lượng bào tử lớn nhất 21 3.1.1. Xác định thời điểm lượng sinh khối và bào tử hình thành nhiều nhất 21 3.1.2. Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn khi bổ sung glucose vào môi trường nuôi cấy 23 3.2. Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản và theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu trong quá trình bảo quản 26 3.2.1. Xác định phương pháp xử lý mẫu nuôi cấy 26 3.2.2. Lựa chọn phương pháp bảo quản B. clausii 30 3.2.3. Theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu bảo quản trong NaCl 0,9% 33 3.2.4. Xác định lượng bào tử từ sinh khối thu được, tính toán số lượng ống sản phẩm tạo thành 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38
  6. DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid Ribonucleic ATCC : American Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Hoa Kì) B. cereus : Bacillus cereus B. clausii : Bacillus clausii B. subtilis : Bacillus subtilis Cfu : Colony - Forming Units (số đơn vị khuẩn lạc) DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen Gmbh (Kí hiệu chủng giống thuộc bộ sưu tập vi sinh vật và tế bào của Đức) FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lâm thế giới) MT1 : Môi trường canh thang OD : Optical Density (mật độ quang) TB : Tế bào V /P : Vòng/phút VSV : Vi sinh vật WHO : World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới)
  7. DANH MỤC CÁC BẢNG STT TÊN BẢNG Trang 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 13 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 14 3.1 Khả năng sinh trưởng của B. clausii thể hiện qua giá trị mật độ 22 quang và hình ảnh sau nhuộm Ogietska 3.2 Giá trị mật độ quang và lượng đường tiêu thụ của B. clausii 24 trong 100ml môi trường nuôi cấy khi bổ sung các nồng độ glucose khác nhau 3.3 Mật độ quang và số lượng VSV sống sót trong các mẫu sau khi 27 xử lý 3.4 Hình thái B. clausii trên tiêu bản nhuộm Ogietska 28 3.5 Tình trạng B. clausii trong mẫu nguyên liệu khi nhuộm Ogietska 31 sau các khoảng thời gian bảo quản 3.6 Giá trị mật độ quang của các mẫu nguyên liệu chứa bào tử sau 1 32 tháng bảo quản 3.7 Số lượng B. clausii sống sót tại các thời điểm trong quá trình bảo 34 quản 3.8 Mật độ quang và số lượng bào tử B. clausii trong ống chuẩn ở các 36 nồng độ pha loãng
  8. DANH MỤC CÁC HÌNH STT TÊN HÌNH Trang 1.1 Sản phẩm chứa B. clausii 5 1.2 Vi khuẩn B. clausii 6 1.3 Cấu tạo bào tử vi khuẩn 10 1.4 Sự hình thành bào tử 11 2.1 Xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục 16 3.1 Đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang và lượng glucose tiêu 24 thụ của B. clausii theo nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy 3.2 Đồ thị biểu diễn số lượng VSV sống sót và mật độ quang của các 28 mẫu sau khi xử lý bằng các phương pháp khác nhau 3.3 Hình ảnh B. clausii nhuộm Ogietska dưới kính hiển vi vật kính 32 100 (mẫu bảo quản trong NaCl sau 3 tháng) 3.4 Biểu đồ biểu diễn sự biến thiên số lượng VSV sau các khoảng 34 thời gian bảo quản 3.5 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn xác định số lượng bào tử B. clausii 36
  9. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay trên thế giới xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên phục vụ cuộc sống đang phát triển mạnh mẽ, đặc biệt là các sản phẩm men vi sinh (probiotic). Các chủng probiotic được sử dụng rất đa dạng. Các loài được nghiên cứu rộng rãi nhất là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans và Bacillus licheniformis bởi các ưu điểm riêng biệt của nó. Đó là khả năng sinh bào tử, bào tử vi khuẩn được sinh ra trong tự nhiên để chúng có thể tồn tại lâu dài trong các điều kiện khắc nghiệt, mà ở điều kiện đó vi khuẩn trưởng thành sẽ bị giết chết [28]. Chế phẩm Enterogermina là một chế phẩm chứa Bacillus clausii dưới dạng bào tử đang được sử dụng rộng rãi trên thị trường. Nhiều nghiên cứu lâm sàng cho thấy, khi ở dạng bào tử, lợi khuẩn B. clausii có thể an toàn vượt qua môi trường acid khắc nghiệt của dịch dạ dày và đến được ruột với tỷ lệ sống cao hơn hẳn các loại lợi khuẩn thông thường khác. Men vi sinh dạng bào tử lợi khuẩn B. clausii sẽ giúp bổ sung các vi khuẩn có lợi lập lại sự cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột, giúp phòng ngừa và điều trị hiệu quả các rối loạn tiêu hóa. Trên thực tế, việc sản xuất ra nguyên liệu chứa bào tử gặp rất nhiều vấn đề. Đó là phải thu được lượng bào tử tối đa và tinh khiết không còn lẫn tế bào chất hay xác tế bào từ sinh khối thu được sau khi nuôi cấy. Do đó, đề tài “Nghiên cứu tạo nguyên liệu chứa Bacillus clausii dạng bào tử” được thực hiện để giải quyết vấn đề trên với 2 mục tiêu sau: 1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu được lượng bào tử lớn nhất. 2. Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản và theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu trong quá trình bảo quản.
  10. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC 1.1.1. Định nghĩa Theo ngôn ngữ Hy Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Theo nghĩa gốc, "biotic" hay "biosis" từ chữ "life" là đời sống, và "pro" là thân thiện, nên probiotic có thể hiểu theo nghĩa cái gì thân thiện với đời sống con người. Hiểu sát nghĩa hơn, đó là chất bổ sung dinh dưỡng chứa những vi khuẩn hay vi nấm có ích [27], [40]. Năm 1907, Elie Metchnikoff – người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dắc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908). Có thể nói Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic. Định nghĩa về probiotic phát triển theo thời gian. Lily và Stillwell đã mô tả probiotic như hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác [41]. Phạm vi của định nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm 70 bao gồm dịch chiết tế bào thúc đẩy phát triển vi sinh vật. Probiotic là những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột của sinh vật chủ [41]. Vì vậy, khái niệm “Probiotic” được ứng dụng để mô tả “cơ quan và chất mà góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật ruột”. Định nghĩa chung này sau đó được làm chính xác hơn bởi Fuller vào năm 1989, theo ông “Probiotic là thực phẩm bổ sung các VSV sống đem lại các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột” [35]. Theo định nghĩa của FAO và WHO năm 2002 “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức
  11. 3 khỏe vật chủ” [32], [41]. Nhưng không phải tất cả các vi sinh vật đều có thể đến được vị trí tác dụng tạo ra hiệu quả. Trong quá trình sử dụng vi khuẩn probiotic phải đối mặt với các điều kiện bất lợi của đường tiêu hóa nên để đem lại tác dụng, các sản phẩm probiotic phải chứa ít nhất 106 cfu/ml tế bào VSV sống cho đến hết ngày hết hạn sử dụng để đảm bảo tác dụng điều trị [22], [32]. 1.1.2. Vai trò  Điều trị một số bệnh tiêu hóa ở người - Ngăn chặn bệnh tiêu chảy: Probiotic được chứng minh là có tác dụng trong 5 loại tiêu chảy: tiêu chảy liên quan đến kháng sinh, do nhiễm khuẩn, do nhiễm virus, tiêu chảy ở người du lịch và tiêu chảy do không dung nạp lactose. Hai tác nhân có hiệu quả với những bằng chứng rõ ràng trong việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy do kháng sinh là vi khuẩn Lactobacillus rhammosus GG và nấm men Saccharomyces boulardii [33]. Các tác nhân khác đang được nghiên cứu là Bacillus clausii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum [12], [33]. - Tác dụng lên Helicobacter pylori: Helicobacter pylori là vi khuẩn Gram âm rất phổ biến trong dạ dày. Khoảng 50% dân số thế giới bị nhiễm vi khuẩn này. Sự tồn tại lâu dài của vi khuẩn này trong dạ dày có thể là yếu tố tiềm tàng gây ung thư dạ dày [6]. Đã có nhiều phương pháp dung để loại bỏ sự nhiễm H. pylori, trong đó có việc sử dụng các chế phẩm có hoạt tính probiotic. Liệu pháp sinh học này thường được sử dụng như một chất bổ sung cho các liệu pháp sử dụng kháng sinh truyền thống trong việc điều trị bệnh. Các thử nghiệm y khoa đã xác nhận tỷ lệ chết của vi khuẩn H. pylori tăng lên khi điều trị bằng phương pháp kháng sinh kết hợp với probiotic. Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột. Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzym của sinh vật đường ruột. Đồng thời tăng sự dung nạp đường lactose: giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu
  12. 4 những loại thức ăn có chứa nhiều lactose, làm tăng vi khuẩn có lợi và giảm vi khuẩn gây hại [26].  Hạ cholesterol máu: Các bệnh về van tim thường liên quan đến lượng cholesterol cao trong huyết thanh. Các nghiên cứu của Hepner và cộng sự (1979) khi nghiên cứu những người khỏe mạnh không có tiền sử mắc bệnh tim mạch ăn bổ sung yogurt có chứa Lactobacillus acidophilus kết quả cho thấy nồng độ cholesterol trong huyết thanh giảm rõ rệt.  Chống lại tác nhân gây ung thư: Tác dụng chống khối u của probiotic có thể do một số cơ chế sau: gắn với tác nhân đột biến, sản xuất các chất chống đột biến, ức chế enzym tiền ung thư như nitroreductase và β-glucuronidase, tăng cường sản xuất β-glucosidase, chất giải phóng flavonoid, sản xuất các chất chống oxi hóa [38].  Một số tác dụng khác + Chống dị ứng: thực phẩm probiotic góp phần chống lại một số dị ứng của cơ thể, cung cấp nhiều chất quan trọng của cơ thể như (acid folic, niacin, riboflavin, vitamin B6 và B12). + Giảm nguy cơ sỏi thận do ảnh hưởng đến sự bài tiết oxalat trong nước tiểu, do đó giảm sự hình thành sỏi [24]. + Tăng cường miễn dịch: vi khuẩn lactic làm tăng cả 2 loại đáp ứng miễn dịch: miễn dịch đặc hiệu (tăng sản xuất kháng thể, cytokinase, tăng sinh tế bào lympho) và miễn dịch không đặc hiệu – miễn dịch tự nhiên (tăng cường chức năng của đại thực bào, tăng số lượng và tăng hoạt động của tế bào diệt tự nhiên) [27], [32]. 1.1.3. Probiotic từ bào tử Probiotic từ bào tử đang ngày càng được dùng rộng rãi dưới dạng thực phẩm bổ sung cho người và động vật dưới dạng các chất thúc đẩy sinh trưởng và cạnh tranh với vi khuẩn có hại; trong thủy sản để thúc đẩy sự tăng trưởng của tôm, cá; và dùng để phòng ngừa bệnh tật. Hiện nay không chỉ ở nước ngoài mà ở tại Việt Nam,
  13. 5 nhiều sản phẩm probiotic Bacillus đã được cấp phép làm thực phẩm chức năng. Các loài được nghiên cứu rộng rãi nhất là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans và Bacillus licheniformis. Sản phẩm đầu tiên chứa bào tử của vi khuẩn B. clausii là Enterogermina được sản xuất tại Ý (năm 1958) [21]. Các ưu điểm của probiotic từ bào tử: + Sản phẩm probiotic dạng bào tử có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng ở điều kiện khô mà không bị ảnh hưởng đến độ sống. + Bào tử có thể sống sót khi di chuyển qua môi trường pH acid của dịch vị dạ dày [14], [36], trong khi phần lớn các Lactobacillus ở dạng vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt [39]. Chính vì vậy một liều lượng nhất định của bào tử có thể được bảo quản vô thời hạn không cần để trong tủ lạnh và toàn bộ bào tử trong liều dùng đó sẽ được đi vào ruột để phát triển thành vi khuẩn sống và phát huy tác dụng. + Kháng đa kháng sinh (đặc biệt là Bacillus clausii trong chế phẩm Enterogermina) [30], [37]. + Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm probiotic từ bào tử vi khuẩn, các loại vi khuẩn hay được sử dụng là: B. clausii, B. subtilis, B. cereus, B. licheniformis với nhiều dạng bào chế và số lượng bào tử khác nhau. Hình 1.1. Sản phẩm chứa B. clausii 1.2. KHÁI QUÁT VỀ Bacillus clausii Theo khóa phân loại của Bergey (1994) B. clausii thuộc:
  14. 6 Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Loài: Bacillus clausii Bacillus clausii cũng như các loài trong chi Bacillus có thể hình thành bào tử, có nghĩa là tạo ra một vách dày bao quanh ADN và các cấu trúc nội tế bào của chúng. Do đó chúng rất khỏe mạnh và không bị phá hủy bởi nhiệt độ khắc nghiệt, hóa chất, các yếu tố môi trường, thậm chí một số loại bức xạ. Đây là đặc tính rất tốt để sử dụng trong công nghiệp và bào chế dược phẩm. 1.2.1. Đặc điểm hình thái Tế bào Bacillus clausii hình que đứng đơn lẻ hoặc kết lại thành chuỗi, là vi khuẩn Gram dương, có khả năng di động, hình thành bào tử hình bầu dục. Bacillus clausii có kích thước 1-2 µm × 5 µm [9]. Hình 1.2. Vi khuẩn B. clausii 1.2.2. Cấu trúc bộ gen B. clausii có cấu trúc bộ gen là một vòng tròn nhiễm sắc thể, nhiễm sắc thể này gồm 4.303.871 nucleotid, gen này chứa 4.204 gen, trong đó 4.096 là protein mã hóa và mã hóa cho 96 ARN. Các nucleotid loại cytosin và guanin trong ADN của B. clausii chiếm tỷ lệ cao nhất so với Bacillus khác: chiếm 44% với chủng KSM-K16 và chiếm khoảng 42,8 - 45,5% với chủng DSM 8716 [9], [29].
  15. 7 1.2.3. Đặc điểm sinh hóa Vi khuẩn B. clausii có khả năng thủy phân được casein, gelatin và tinh bột nhưng không thủy phân được pullulan, Tween 20, 40 hoặc 60. Cho phản ứng oxidase, catalase dương tính, khử nitrat thành nitrit [29]. 1.2.4. Đặc điểm sinh thái B. clausii phân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất vườn hoặc đất sét (B. clausii ATCC 31084, B. clausii DSM 8716 ) [29]. Ngoài ra có thể tìm thấy B. clausii ở trong nước, trong bùn (B. clausii MB9 được phân lập từ mẫu nước vùng ven biển phía đông Ấn Độ) [13]. 1.2.5. Điều kiện nuôi cấy B. clausii là vi khuẩn hiếu khí do đó trong quá trình nuôi cấy cần cấp khí. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là từ 15-50ºC [29]. Mỗi chủng sẽ có nhiệt độ thích hợp khác nhau, ví dụ: chủng B. clausii DSM 8716 có nhiệt độ thích hợp là 30ºC, chủng B. clausii KSM-K16 có nhiệt độ tối ưu là 40ºC Khoảng pH nuôi cấy thích hợp từ 7-10. Chủng B. clausii KSM-K16 có pH thích hợp là 9,0. Bacillus clausii có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon bao gồm: L-aribose, xylitol, galactose, dulcitol, sorbitol, methyl AD-mannoside, mannose, N- acetylglucosamine, D-tagose, 2-ketogluconate [29]. 1.2.6. Ứng dụng của B. clausii Bacillus clausii là vi khuẩn an toàn, có ứng dụng chủ yếu trong chế phẩm probiotic và sản xuất enzym đặc biệt là protease.  Chế phẩm probiotic Nghiên cứu của Marseglia và đồng sự năm 2007 chỉ ra rằng Bacillus clausii không gây nên tác dụng phụ và độc tính đối với trẻ em trong quá trình điều trị [25]. Bacillus clausii là loài vi khuẩn hiếu khí, có khả năng tạo bào tử và bền vững trong môi trường acid của dịch vị dạ dày, vì thế sẽ đi qua dạ dày một cách an toàn;
  16. 8 tới ruột nảy mầm thành vi khuẩn có lợi cho hệ tiêu hóa ngay cả khi có mặt các kháng sinh như ampicillin, cephalosporin, erythromycin, lincomycin và chloramphenicol [15], [19]. Việc uống đủ một lượng nhất định bào tử sống sẽ giúp tạo ra hệ vi khuẩn có lợi cho hệ tiêu hóa, cung cấp thêm chất dinh dưỡng. Bacillus clausii là lợi khuẩn không sản sinh bất cứ độc tố hay chất nào gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người sử dụng. Vì vậy Bacillus clausii thường được dùng làm thực phẩm chức năng để bổ sung hệ vi khuẩn có lợi cho đường ruột, giúp phòng ngừa và phối hợp điều trị rối loạn tiêu hóa cấp và mãn tính ở trẻ em, đặc biệt là sau khi dùng kháng sinh kéo dài [20]. Một số chế phẩm probiotic chứa B. clausii như: Enterogermina, Erceflora, Bazivic, Enterobio, Spobio CL giúp hỗ trợ đắc lực cho đường tiêu hóa.  Sản xuất enzym + Một số chủng B. clausii ví dụ: B. clausii KSM-K16 được sử dụng trong sản xuất protease đặc biệt hữu ích, đó là M, H và N-protease. Protease là một enzym quan trọng chiếm trên 65% thị trường các enzym công nghiệp. Protease có ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như chất tẩy rửa, công nghiệp thuộc da [31]. Cũng giống như các sinh vật Bacillus khác, B. clausii KSM-K16 tiết ra protease trực tiếp vào môi trường, đặc biệt là trong thời kỳ dinh dưỡng thấp, cùng với quá trình hình thành bào tử. Hoạt tính enzym M-protease đạt được ở 55ºC và pH là 12,3 [34]. 1.2.7. Một số nghiên cứu lên quan tới B. clausii Trên thế giới: + Gabriella Casuala and Simon M. Cutting tiến hành nghiên cứu tác dụng của Enterogermina tới thành ruột của chuột cho thấy chế phẩm Enterogermina chỉ trong thời gian ngắn đã gây đáp ứng miễn dịch ở chuột và loại bỏ vi khuẩn gây bệnh trong thành ruột của chuột [15].
  17. 9 + Bacillus clausii còn được chứng minh có tác dụng tích cực, giúp điều hòa miễn dịch với trẻ em bị dị ứng và nhiễm trùng đường hô hấp tái phát [16], [17]. + Nghiên cứu của Kobayashi cho kết quả enzym M-protease sinh ra từ B. clausii KSM-K16 có khả năng chịu nhiệt và tồn tại được ở pH cao [23]. Tại Việt Nam: + Trong tạp chí khoa học của đại học Huế năm 2010 đã đưa ra B. clausii B2/2 có khả năng bám dính đồng thời với vi khuẩn B. cereus và B. clausii B1 không bám dính với B. cereus nhưng lại bám dính với Escherichia coli [3]. + Tác giả Nguyễn Thị Bích Ngọc đã tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy vi khuẩn B. clausii [9]. + Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hiền cho kết quả 4 ngày là thời điểm Bacillus clausii hình thành bào tử nhiều nhất [5]. + Nghiên cứu của tác giả Vũ Thị Ngọc Bích cho thấy xử lý sinh khối B. clausii bằng lysozyme thu được lượng bào tử tinh khiết và lớn [1]. 1.3. BÀO TỬ VI KHUẨN Bào tử (nha bào – spore – endospore): một số vi khuẩn vào cuối thời kì sinh trưởng khi điều kiện phát triển không thuận lợi sẽ sinh ra bên trong tế bào một thể nghỉ có dạng hình cầu hay elipsoic, có bề mặt tích điện âm và hơi kỵ nước, được gọi là bào tử. Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một bào tử. Khi điều kiện thuận lợi bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào sinh dưỡng [4], [11], [18].Vi khuẩn có khả năng tạo bào tử thông thường thuộc hai chi là Bacillus và chi Clostridia kỵ khí bắt buộc, mặc dù nhiều chi khác ít được biết đến hơn cũng có những vi khuẩn tạo bào tử.
  18. 10 Hình 1.3. Cấu tạo bào tử vi khuẩn [11] Cấu trúc của bào tử là hệ thống nhiều lớp vỏ bền vững bao quanh vùng lõi chứa ADN, ADN nằm trong thể bào tử chất trong cùng, màng bào tử bao ngoài bào tử chất, tiếp đến là thành bào tử, tiếp theo là vỏ bào tử, rồi đến áo bào tử hai lớp và áo ngoài. Các lớp bao bọc chiếm 50% thể tích của nha bào, bao bọc bào tử chất và nhân [11]. Màng bào tử rất mỏng nhưng không thấm nước, cấu tạo chủ yếu là lipoprotein. Vỏ bào tử có nhiều lớp, bề mặt các lớp này xù xì, thành phần hóa học của các lớp vỏ bao là protein, hydratcacbon, lipid, peptidoglycan và calci dipicolinat (Ca – DPA), không chứa acid teichoic và có sự tham gia của keratin. Đây là những lớp có khả năng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hòa tan trong nước, chúng có tác dụng tăng cường khả năng bảo vệ bào tử trước các điều kiện bất lợi [7], [18]. Bào tử chất và vùng nhân bào tử tạo thành một khối tế bào đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất vì vậy có thể giữ trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm [7]. Lõi của bào tử chứa một lượng nước rất thấp cùng với Ca – DPA [4], [11].
  19. 11 1.3.1. Quá trình hình thành bào tử Hình 1.4. Sự hình thành bào tử Pha 1: Trong tế bào sinh dưỡng, ADN được phân chia thành chromosome riêng biệt. Pha 2: Màng tế bào chất lấn sâu vào phân chia tế bào để hình thành 2 phần không đều nhau. Pha 3: Phần nhân bào tử mang ADN lún sâu vào tế bào chất. Pha 4: Vỏ bào tử được hình thành. Pha 5: Áo bào tử được hình thành. Pha 6: Tế bào mẹ ly giải để giải phóng bào tử. Quá trình hình thành bào tử mất khoảng 6 – 8 tiếng, là quá trình tương đối phức tạp để tạo ra được cấu trúc vững bền, chịu được các điều kiện khắc nghiệt [11]. 1.3.2. Tính chất của bào tử vi khuẩn và ứng dụng Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu. Bào tử của vi khuẩn gây ngộ độc thịt Clostridium botulinum đun sôi ở 100ºC trong 5,0 – 9,5 giờ mới chết, hấp ở 121ºC sau 10 phút mới chết [11].
  20. 12 Bào tử có thể giữ sức sống từ vài năm đến vài chục năm. Đã có những thông báo tìm thấy được những bào tử trong các tiêu bản khảo cổ cách đây 3000 năm mà vẫn duy trì sự sống. Bào tử có khả năng đề kháng mạnh với điều kiện khắc nghiệt của môi trường nhờ: - Phức hợp acid dipicolinic-calcium có thể ổn định thành phần acid nucleic của bào tử. - Nước trong bào tử ở trạng thái liên kết nên không thể làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ môi trường. - Các enzym và chất hoạt động sinh học trong bào tử đều tồn tại ở trạng thái không hoạt động nên hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với môi trường ngoài. - Với cấu trúc có nhiều lớp màng bọc và tính ít thấm của các lớp màng, làm cho các hóa chất độc, chất sát trùng khó có thể xâm nhập vào và gây tác động cho bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi và được hoạt hóa bởi một số yếu tố làm tổn thương các lớp bao như nhiệt độ cao, hóa chất (acid, các chất chứa nhóm –SH tự do) thì vỏ bào tử bị phân hủy, bào tử hấp thụ nước, phục hồi hoạt động trở thành tế bào sinh dưỡng [11]. Do những đặc điểm nổi trội đó mà ngày nay rất nhiều sản phẩm probiotic được sản xuất từ bào tử vi khuẩn như: Progemila, Probacin, Bazivic, Anabio
  21. 13 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1. Nguyên vật liệu Chủng vi sinh vật: Bacillus clausii Nguồn gốc: Chế phẩm Enterogermina của công ty Sanofi-Aventis Nguyên liệu: Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu Hóa chất pha môi trường Hóa chất sử dụng thu bào tử Hóa chất Xuất xứ Hóa chất Xuất xứ Pepton Ấn Độ Lysozym Viện kiểm nghiệm Cao thịt Merck – Đức KH2PO4 Trung Quốc NaCl Trung Quốc NaOH Trung Quốc Thạch bột Việt Nam KCl Trung Quốc Glucose Trung Quốc NaCl Trung Quốc Các dung dịch sử dụng trong đề tài: Pha theo DĐVN IV [2]. - Dung dịch đệm phosphat pH 7,6: Pha dung dịch KH2PO4 0,2M (100ml): 0,2 × 0,1 × 136 = 2,72 g Pha dung dịch NaOH 0,2M (100ml): 0,2 × 0,1 × 40 = 8,0 g Trộn 50,0ml dung dịch KH2PO4 0,2M với 42,8ml dung dịch NaOH 0,2M rồi thêm nước vừa đủ 200ml. - Dung dịch KCl 1M: Hòa tan 7,45g KCl trong vừa đủ 100ml nước. - Dung dịch NaCl 1M: Hòa tan 5,84g NaCl trong vừa đủ 100ml nước. - Dung dịch lysozym 1mg/ml: Hòa tan 0,100g lysozym trong vừa đủ 100ml nước cất tiệt trùng. - Dung dịch NaCl 0,9%: Hòa tan 9,0g NaCl trong vừa đủ 100ml nước. - Ngoài ra còn 1 số dung dịch: Na2S2O3 0,1M, dung dịch đỏ Fuchsin, dung dịch Xanhmethylen, dung dịch HCl 0,5%, dung dịch H2SO4 1%.
  22. 14 2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu  Môi trường canh thang (MT1) Pepton 1,0g Cao thịt 0,5g NaCl 0,5g Nước máy vđ 100ml  Môi trường thạch thường (MT2) = MT1 + 1,8g thạch 2.1.3. Thiết bị Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu Tên thiết bị Nguồn gốc Tủ cấy vô trùng Bioair (Italy) Tủ ấm Memmert (Đức) Tủ lạnh sâu Đức Tủ lạnh Toshiba (Nhật) Tủ sấy Memmert (Đức) Tủ lắc Bioshake (Đức) Máy ly tâm Rotofix (Đức) Nồi hấp tiệt khuẩn ALP – Nhật Máy vortex IKA (Đức) Lò vi sóng Daewoo (Hàn Quốc) Cân kĩ thuật Đức Bình nón, đĩa petri, ống nghiệm, đầu côn, pipet, cốc có mỏ, ống ly tâm, giấy lọc
  23. 15 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu lượng bào tử lớn nhất  Xác định thời điểm hình thành lượng sinh khối và bào tử nhiều nhất  Khảo sát sự sinh trưởng của VSV khi bổ sung glucose vào môi trường nuôi cấy 2.2.2. Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản và theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu trong quá trình bảo quản  Xác định phương pháp xử lý mẫu nuôi cấy  Lựa chọn điều kiện bảo quản B. clausii  Theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu bảo quản trong NaCl 0,9%  Xác định lượng bào tử từ sinh khối thu được, tính toán số lượng ống sản phẩm tạo thành 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina Pha 100ml môi trường canh thang (MT1) (theo mục 2.1.2) trong bình nón dung tích 250ml, đậy bằng nút bông không thấm nước, hấp tiệt trùng ở 121ºC trong 20 phút, để nguội. Tiến hành cấy giống B. clausii từ chế phẩm vào bình nón trong tủ v cấy vô trùng. Nuôi cấy trong máy lắc ở 37ºC, với tốc độ 110 /p trong 24 giờ. Sau 24 giờ, vi khuẩn phát triển làm đục môi trường. 2.3.2. Phương pháp nhân giống trong môi trường lỏng Chuẩn bị 100ml môi trường canh thang trong bình nón dung tích 250ml. Hấp tiệt trùng ở 121ºC trong 20 phút. Cấy 10ml dung dịch giống đã được hoạt hóa vào. v Ủ trong máy lắc 37ºC với tốc độ 110 /p trong các thời gian xác định. Sau đó tiến hành xử lý mẫu sau thời gian thích hợp. 2.3.3. Phương pháp đo quang đánh giá sự sinh trưởng của vi sinh vật Nguyên tắc: Độ đục của huyền phù tỷ lệ thuận với số lượng tế bào vi sinh vật có trong môi trường. Trong một thời gian nhất định, mối quan hệ giữa vi sinh vật trong nước tỷ lệ tuyến tính với độ đục của môi trường. Định lượng vi sinh vật trong môi trường bằng máy đo độ đục hay máy so màu ở bước sóng 550 – 610nm [4].
  24. 16 Hình 2.1. Xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục [4] Tiến hành: Vi khuẩn được nuôi cấy trong dung dịch môi trường sẽ phát triển, tăng sinh v khối. Hỗn dịch tế bào vi khuẩn trong các bình nón được ly tâm với tốc độ 4000 /p trong 15 phút. Pha loãng hỗn dịch chứa vi sinh vật bằng NaCl 0,9% đến nồng độ thích hợp sao cho khi đo trên máy so màu ở bước sóng thích hợp được các trị số OD nhỏ hơn 1. Lấy mẫu tiến hành đo quang với bước sóng 600nm. Mẫu trắng là NaCl 0,9% chuẩn bị song song cùng mẫu thử. 2.3.4. Phương pháp thu sinh khối Hỗn dịch tế bào vi khuẩn trong các bình nón sau khi nuôi cấy theo phương v pháp đã nêu trong mục 2.3.2 được ly tâm với tốc độ 4000 /p trong 15 phút. Thu và hòa cắn trong NaCl 0,9% để rửa sạch môi trường nuôi cấy, ly tâm lặp lại 3 lần. 2.3.5. Phương pháp xử lý sinh khối bằng lysozym thu bào tử Tiến hành xử lý nhiệt dịch nuôi cấy VSV bằng cách đun cách thủy ở 100ºC/1h. Phá vỡ màng tế bào bằng lysozym [1]: v + Ly tâm dịch sau khi xử lý nhiệt, thu cắn (4000 /p trong 15 phút). + Cắn được hòa trong 10ml dung dịch đệm phosphat pH 7,6, thêm khoảng 15- 20ml dung dịch lysozym (1mg/ml), ủ 37ºC trong 120 phút để phá vỡ vỏ bọc tế bào, giải phóng bào tử. v + Ly tâm dịch thu cắn ( 4000 /p trong 15 phút).
  25. 17 + Hòa cắn trong 30ml dung dịch KCl 1M để loại vỏ tế bào, ly tâm dịch thu cắn v (4000 /p trong 15 phút). + Tiếp tục hòa cắn trong 30ml dung dịch NaCl 1M để loại hoàn toàn vỏ tế bào, v ly tâm dịch thu cắn (4000 /p trong 15 phút). + Thu cắn và rửa bằng nước cất 3 lần thu được bào tử. 2.3.6. Phương pháp đông khô a. Chuẩn bị mẫu Nuôi cấy VSV (như phương pháp nêu ở mục 2.3.2). Ly tâm thu sinh khối (4000 vòng/phút), rửa sinh khối nhiều lần bằng nước cất đã hấp tiệt trùng. Sinh khối thu được hòa vào khoảng 10-15ml nước cất tiệt trùng. Đổ hỗn dịch này ra các đĩa petri đã được làm sạch và hấp tiệt trùng từ trước, đậy kín bằng giấy nhôm [6]. b. Tiền đông Cho mẫu vào trong tủ lạnh sâu -80ºC cho tới khi mẫu đông rắn hoàn toàn [6]. c. Làm khô Các mẫu được làm khô trong không gian lạnh của máy đông khô nhiệt độ khoảng -50ºC, 0,055 mbar. Kết thúc quá trình làm khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị chuyển vào bao polymer, lấy mẫu xác định số vi sinh vật sống sót hoặc đậy kín rồi bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-6ºC [6]. 2.3.7. Phương pháp nhuộm màu bào tử: theo Ogietska Nguyên tắc: Màng bào tử: dày, chắc, chứa nhiều lipid khó bắt màu nên phải xử lý để tế bào chất của bào tử dễ bắt màu với nhiệt và acid. Nhuộm màu cả tế bào chất của tế bào và bào tử bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào đi nhuộm bằng thuốc nhuộm màu. Nhờ đó tế bào chất bào tử và tế bào chất tế bào có màu phân biệt [5].
  26. 18 Tiến hành:  Làm tiêu bản vết bôi và để vết bôi khô tự nhiên.  Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn cho bốc hơi, giữ 2 phút rồi rửa nước cất.  Đặt lên vết bôi miếng giấy lọc, rồi nhỏ dung dịch fuchsin Ziehl, hơ nóng cho đến khi bốc hơi, nếu thuốc nhuộm cạn phải bổ sung ngay và giữ trong 5 phút.  Bỏ giấy ra và rửa vết bôi lại bằng nước cất.  Tẩy màu bằng cách nhúng phiến kính vào dung dịch H2SO4 1% trong 2 phút.  Bỏ giấy ra và rửa vết bôi lại bằng nước cất.  Nhuộm vết bôi bằng xanh methylene Loeffler trong 5-15 phút.  Rửa nước cất, để khô tự nhiên vết bôi.  Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu: bào tử màu đỏ, tế bào màu xanh. 2.3.8. Xác định số lượng VSV sống sót theo phương pháp pha loãng liên tục Chuẩn bị bình nón dung tích 250ml chứa chính xác 100ml nước muối sinh lí. Các ống nghiệm mỗi ống chứa chính xác 9ml nước muối sinh lí. Các bình nón chứa môi trường thạch thường (MT2). Hấp tiệt trùng ở 121ºC trong 20 phút.  Xác định số lượng VSV trong 1ml dịch nuôi cấy: Hút chính xác 1ml hỗn dịch sinh khối pha loãng vào ống nghiệm thứ nhất, lắc đều, sau đó từ ống nghiệm thứ nhất lại hút chính xác 1ml cho vào ống nghiệm thứ 2 Làm như vậy cho tới ống nghiệm cuối cùng cần pha loãng [2]. Nhỏ 1ml dịch chứa vi khuẩn vào bình nón chứa MT2, lắc đều, đổ thạch ra đĩa petri (làm trên 3 nồng độ cuối), nuôi cấy trong tủ ấm 37ºC trong 24 giờ. Công thức tính số lượng vi khuẩn: A = (1) Trong đó: A: là số lượng tế bào trong 1ml dịch ban đầu n: hệ số pha loãng An: số lượng tế bào tại nồng độ pha loãng
  27. 19  Xác định số lượng VSV trong mẫu đông khô Sau đông khô thu được m gam sản phẩm. Lấy lượng x gam sản phẩm pha loãng trong bình nón 250ml chứa 100ml nước muối sinh lí đã hấp tiệt trùng ở 121˚C trong 20 phút. Hút chính xác 1ml dịch trong bình nón pha loãng trong ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lí, rồi tiếp tục pha loãng, cấy và ủ như trên. Công thức tính: - Số lượng B. clausii sau đông khô (tương ứng có trong 1ml dịch trước đông khô): A = (2) s As: Số lượng B. clausii có trong lượng mẫu sau đông khô tương ứng với 1ml dịch trước đông khô An: số lượng vi khuẩn mọc trên đĩa petri tại nồng độ pha loãng n n: số lần pha loãng m: khối lượng mẫu đông khô thu được x: khối lượng mẫu đông khô lấy tiến hành đếm số lượng VSV 2.3.9. Định lượng đường dư theo phương pháp Schoorl – Regenbogen Nguyên lý: Thuốc thử Schoorl A (CuSO4) và thuốc thử Schoorl B (Kali natri tactrat) cho phức hợp màu xanh của Cu2+ bị nhóm chức ceton hay aldehyd khử thành Cu trong môi trường kiềm, lượng Cu2+ dư trong dung dịch tác dụng với 1 lượng KI trong môi trường acid sẽ giải phóng I2. Định lượng I2 giải phóng bằng Na2S2O3 0,1N. Tiến hành song song với mẫu trắng. Hiệu số dung dịch Na2S2O3 0,1N tiêu thụ trong mẫu trắng (V0) và mẫu thử (Vt) cho ta số chênh lệch ml Na2S2O3 0,1N. Tra bảng tính được lượng đường có trong mẫu thử [8]. Tiến hành: Định lượng đường trong môi trường canh thang với 2 mẫu là: mẫu khởi điểm (mẫu chưa có vi sinh vật) và mẫu kết thúc (mẫu sau khi nuôi cấy vi sinh vật) [8]. Dịch khởi điểm và kết thúc được tiến hành như sau:
  28. 20 + Thêm chính xác 10,0ml Schoorl A, 10,0ml Schoorl B. + Thêm nước cất vừa đủ 50ml, đun sôi cách bếp 2 phút. + Làm nguội về nhiệt độ phòng, thêm 3,0g KI, lắc tan hoàn toàn. + Thêm 10ml H2SO4 25%. + Định lượng I2 giải phóng ra bằng Na2S2O3 0,1N. Mẫu trắng: 30ml nước cất + 10,0ml Schoorl A + 10,0ml Schoorl B. Kết quả thu được: + Thể tích Na2S2O3 cần thiết để định lượng mẫu trắng là: Vt + Thể tích Na2S2O3 cần thiết để định lượng mẫu khởi điểm là: Vkđ + Thể tích Na2S2O3 cần thiết để định lượng mẫu kết thúc là: Vkt Lượng đường được tính như sau: Nồng độ đường ở dịch khởi điểm (KĐ): ∆ Vkđ = Vt - Vkđ = a ml, tra bảng được p mg. → Nồng độ đường ở dịch khởi điểm là p mg/ml. Nồng độ đường ở dịch kết thúc (KT): ∆ Vkt = Vt - Vkt = b ml, tra bảng được q mg. → Nồng độ đường ở dịch kết thúc là q mg/ml. Lượng đường đã tiêu thụ: X (mg/ml) = p – q.
  29. 21 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu được lượng bào tử lớn nhất Nhờ sức đề kháng cao với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường nên các chế phẩm probiotic chứa bào tử ít chịu ảnh hưởng do điều kiện môi trường trong quá trình lưu hành và bảo quản. Do đó, chế phẩm có độ ổn định cao, hơn nữa bào tử vi khuẩn probiotic có thể tới được dạ dày và ruột đạt mức nguyên vẹn ở ruột non. Vì vậy, tìm ra điều kiện nuôi cấy để thu được lượng bào tử lớn nhất có ý nghĩa quan trọng trong việc tạo ra nguyên liệu dưới dạng bào tử. Các thí nghiệm dưới đây nhằm giải quyết vấn đề trên. 3.1.1. Xác định thời điểm lượng sinh khối và bào tử hình thành nhiều nhất Mục tiêu: Xác định và lựa chọn thời điểm thích hợp thu lấy sinh khối B. clausii từ môi trường nuôi cấy. Tiến hành: Nuôi cấy B. clausii trong môi trường canh thang theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2. Sau các thời gian nuôi cấy 1, 4, 7 ngày (dựa trên kết quả công bố của Ds. Nguyễn Thị Hiền) [5], tiến hành ly tâm thu sinh khối các bình nuôi cấy theo phương pháp đã nêu trong mục 2.3.4. Pha loãng sinh khối trong vừa đủ 100ml NaCl 0,9%. Sau đó: + Lấy mẫu từ hỗn dịch pha loãng trên tiếp tục pha loãng 10 lần và tiến hành đo quang xác định sự sinh trưởng của VSV với bước sóng 600nm. Mẫu trắng là NaCl 0,9% chuẩn bị song song cùng mẫu thử. + Tiến hành nhuộm Ogietska xác định lượng bào tử hình thành theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.7. Kết quả:
  30. 22 Bảng 3.1. Khả năng sinh trưởng của B. clausii thể hiện qua giá trị mật độ quang và hình ảnh sau nhuộm Ogietska Thời gian 1 ngày 4 ngày 7 ngày Mật độ 0,203 0,554 0,498 quang (10-1) Tế bào màu xanh đôi Tế bào màu xanh, Toàn tế bào màu khi nối với nhau nhiều bào tử đỏ và xanh, không thấy Hình ảnh thành sợi dài, chưa tế bào chứa bào tử bào tử B. clausii thấy sự xuất hiện của bên trong sau nhuộm bào tử Ogietska dưới kính hiển vi vật kính 100 Nhận xét: Các số liệu và hình ảnh ở bảng 3.1 cho thấy: + Lượng sinh khối đạt cực đại sau 4 ngày nuôi cấy (giá trị mật độ quang sau khi pha loãng đạt mức 0,554), sau đó giảm nhẹ còn 0,498 vào ngày thứ 7. + Ngày thứ 1, bào tử chưa xuất hiện, đến ngày thứ 4 bào tử xuất hiện với lượng lớn và ngày thứ 7 hầu như không thấy sự có mặt của bào tử. Bàn luận: Các kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hiền khi khảo sát thời điểm nuôi cấy B. clausii từ 1 đến 7 ngày cũng cho kết quả là ngày thứ 4 lượng bào tử hình thành lớn nhất [5]. Điều này có thể được giải thích: + Về lượng sinh khối: ngày đầu tiên vi khuẩn đang ở pha tiềm phát. Trong pha này vi khuẩn từ dạng bào tử phải thích ứng với môi trường mới, chúng bắt đầu sinh sản,
  31. 23 phát triển thành tế bào, do đó lượng sinh khối còn ít, giá trị mật độ quang thấp nhất. Đến ngày thứ 4 theo chu kì sinh trưởng, vi khuẩn đang ở pha cân bằng nên số lượng tế bào lớn. Ngày thứ 7 lượng sinh khối giảm đi có thể giải thích do vi sinh vật chuyển sang giai đoạn suy vong, tế bào VSV tự phân giải do các enzym nội bào [4]. + Về lượng bào tử: ngày đầu tiên, môi trường giàu chất dinh dưỡng, vi khuẩn chủ yếu tăng sinh và phân chia nên trên vi trường chỉ thấy toàn tế bào. Sang đến ngày thứ 4, chất dinh dưỡng trong môi trường lên men đã giảm nhiều; ở điều kiện thiếu chất dinh dưỡng, tế bào chuyển dần thành bào tử. Vào ngày thứ 7, môi trường vẫn còn nguồn dinh dưỡng, có thể do tạo thành từ xác tế bào chết phân giải, đã giúp bào tử nảy mầm trở lại dạng tế bào. Từ các kết quả trên, nhận thấy 4 ngày là thời điểm ngắn nhất để thu được lượng bào tử nhiều nhất. Do đó, các thí nghiệm tiếp theo sử dụng thời gian nuôi cấy vi sinh vật là 4 ngày. 3.1.2. Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn khi bổ sung glucose vào môi trường nuôi cấy Mục tiêu: Lựa chọn nồng độ glucose bổ sung vào môi trường canh thang để thu được bào tử nhiều nhất. Tiến hành: Nuôi cấy vi khuẩn trong các bình nón chứa môi trường canh thang bổ sung glucose với các nồng độ 0,5%, 1%, 2%, 4% theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2, môi trường nuôi cấy được hấp tiệt trùng ở 115ºC trong 20 phút. Sau 4 ngày, thu sinh khối theo phương pháp 2.3.4, pha loãng sinh khối trong vừa đủ 100ml NaCl 0,9%. Tiến hành lấy mẫu từ hỗn dịch đã pha loãng tiếp tục pha loãng 10 lần và đo quang ở bước sóng 600nm. Mẫu trắng là NaCl 0,9% chuẩn bị song song cùng mẫu thử. Đồng thời lấy mẫu xác định nồng độ glucose còn lại trong dịch lên men theo phương pháp 2.3.9 và so sánh với nồng độ glucose ban đầu.
  32. 24 Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.1. Kết quả: Bảng 3.2. Giá trị mật độ quang và lượng đường tiêu thụ của B. clausii trong 100ml môi trường nuôi cấy khi bổ sung các nồng độ glucose khác nhau Nồng độ glucose 0 % 0,5% 1,0% 2,0% 4,0% OD (10-1) 0,491 0,616 0,748 1,160 0,744 Nồng độ đường ở dịch KĐ (%) 0 0,44 0,99 1,87 3,87 Nồng độ đường ở dịch KT (%) 0 0,39 0,43 0,69 1,58 Lượng đường đã tiêu thụ (%) 0 0,05 0,56 1,18 2,29 1.4 2.5 1.2 2 ) 1 - 1 1.5 0.8 0.6 glucose tiêu thụ (%) thụ tiêu glucose 1 độ quang ( 10 ( quangđộ 0.4 Mật 0.5 Lượng 0.2 0 0 0 0,5 1,0 2,0 4,0 Nồng độ Glucose (%) Mật độ quang Lượng đường tiêu thụ Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang và lượng glucose tiêu thụ của B. clausii theo nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy Nhận xét:
  33. 25 Từ bảng 3.2 và đồ thị hình 3.1 có thể thấy lượng sinh khối vi sinh vật tăng dần theo nồng độ glucose bổ sung vào môi trường canh thang, đạt giá trị cao nhất tại nồng độ glucose 2% (mật độ quang sau pha loãng là 1,160), ở nồng độ glucose 4% mật độ quang giảm còn 0,744. Lượng glucose mà vi sinh vật tiêu thụ tăng dần theo lượng glucose bổ sung vào môi trường nuôi cấy, đạt giá trị cao nhất khi thêm 4% glucose vào môi trường, lúc này lượng glucose B. clausii tiêu thụ đạt 2,29%. Bàn luận: Thành phần của môi trường canh thang chủ yếu chỉ có nitơ mà không có hydratcacbon. Do đó, bổ sung glucose làm tăng nguồn hydratcarbon, là nhân tố ảnh hưởng trực tiếp tới việc tái tạo tế bào vi sinh vật nên số lượng tế bào vi sinh vật tăng [4]. Ở nồng độ glucose 2% sinh khối B. clausii tăng nhiều nhất, vì vậy 2% glucose là nồng độ thích hợp cho sự phát triển của B. clausii. Với các nồng độ 0,5% và 1%, lượng hydratcarbon bổ sung còn thấp, vi khuẩn chưa đủ năng lượng cho sự phát triển sinh khối, giá trị mật độ quang đo được thấp hơn. Mặt khác, ở nồng độ 4%, có thể do nồng độ đường lớn, dẫn đến sự thay đổi áp suất thẩm thấu, gây ra điều kiện ưu trương, ảnh hưởng tới cấu tạo tế bào vi khuẩn, gây hạn chế cho sự phát triển của vi khuẩn [9], [10]. Theo một nghiên cứu trước đây, khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose từ 1% đến 6% tới sự phát triển của B. clausii trong 1 ngày kết luận bổ sung 2% glucose vào môi trường nuôi cấy, vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất [9]. Kết hợp với kết quả thu được ở bảng 3.2, môi trường nuôi cấy B. clausii tối ưu là môi trường canh thang (MT1) + 2% glucose. Từ lượng đường mà vi sinh vật tiêu thụ sau 4 ngày nuôi cấy nhận thấy B. clausii đã đồng hóa glucose để phát triển. Lượng đường mà B. clausii tiêu thụ trong môi trường MT1 + 4% glucose cao hơn trong môi trường MT1 + 2% glucose nhưng trong môi trường MT1 + 2% glucose vi sinh vật lại phát triển mạnh hơn, thể hiện ở giá trị mật độ quang cao hơn. Cần các nghiên cứu tiếp theo tìm hiểu sự ảnh hưởng của glucose đến sự phát triển của vi sinh vật.
  34. 26 Kết luận sơ bộ: Từ các kết quả thu được cho thấy với thời gian nuôi cấy 4 ngày và môi trường canh thang bổ sung 2% glucose, sinh khối vi sinh vật đạt lượng cao nhất. Tuy nhiên, do sau 4 ngày nuôi cấy trong dịch lên men vẫn còn một lượng nhỏ glucose chưa được VSV tiêu thụ hết (0,69g/ml). Vì vậy, để thuận tiện cho quá trình xử lý tế bào, khóa luận lựa chọn môi trường canh thang không bổ sung glucose với thời gian nuôi cấy 4 ngày cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2. Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản và theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu trong quá trình bảo quản Theo số liệu thu được từ phần 3.1 cho thấy sau 4 ngày nuôi cấy trong môi trường canh thang có thể thu được nhiều bào tử nhưng vẫn lẫn tế bào sinh dưỡng. Tuy nhiên, các mẫu nguyên liệu không chỉ cần đạt được số lượng vi sinh vật mà cần phải tinh khiết theo tiêu chuẩn và giữ được chất lượng ổn định khi bảo quản trong thời gian dài. Do đó, cần có phương pháp xử lý và bảo quản thích hợp để nhằm loại bỏ hết môi trường dinh dưỡng và chuyển hết tế bào B. clausii sang dạng bào tử. Các thí nghiệm sau nhằm giải quyết vấn đề trên và đánh giá chất lượng của các mẫu nguyên liệu trong quá trình bảo quản. 3.2.1. Xác định phương pháp xử lý mẫu nuôi cấy Mục tiêu: Xác định phương pháp xử lý thích hợp nhằm thu được bào tử tinh khiết với lượng lớn nhất. Tiến hành: Chuẩn bị 8 bình nón 250ml, mỗi bình chứa 150ml môi trường canh thang đã hấp tiệt trùng để nuôi cấy B. clausii (theo mục 2.3.2). Sau 4 ngày nuôi cấy, thu sinh khối theo phương pháp trong mục 2.3.4. Sau đó tiến hành: a. Pha loãng trong nước cất Sinh khối thu được từ bình 1 và 2 được trộn lẫn và pha loãng trong vừa đủ 300ml nước cất đã hấp tiệt trùng.
  35. 27 b. Pha loãng trong nước muối sinh lí Sinh khối thu được từ bình 3 và 4 được trộn lẫn và pha loãng trong vừa đủ 300ml NaCl 0,9%. c. Đông khô Sinh khối thu được từ bình 5 và 6 được xử lý và tiến hành đông khô theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.6. d. Xử lý lysozym rồi pha loãng trong NaCl 0,9% Sinh khối thu được từ bình 7 và 8 được pha loãng trong 300ml nước cất đã hấp tiệt trùng. Tiến hành xử lý bằng lysozym theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.5. Sinh khối sau khi xử lý pha loãng với vừa đủ 300ml NaCl 0,9%.  Lấy mẫu sau khi xử lý ở tất cả bình, pha loãng bằng NaCl 0,9%, tiến hành đo quang ở bước sóng 600nm, mẫu trắng là NaCl 0,9% chuẩn bị song song cùng mẫu thử. Đồng thời đếm số lượng VSV theo phương pháp pha loãng liên tục đã nêu trong mục 2.3.8.  Nhuộm Ogietska theo dõi hình thái các mẫu sau xử lý. Kết quả: Bảng 3.3. Mật độ quang và số lượng VSV sống sót trong các mẫu sau khi xử lý Số lượng VSV OD (10-1) OD (10-1) Tình trạng mẫu (Tính theo lượng Trước xử lý Sau xử lý tương đương với 1ml dịch ban đầu) Pha loãng trong nước cất 0,477 0,477 100.108 cfu/ml Pha loãng trong 0,483 0,483 93.108 cfu/ml NaCl 0,9% Đông khô 0,486 0,342 19.108 cfu/ml Xử lý bằng lysozym 0,491 0,197 28.108 cfu/ml
  36. 28 120 0.6 0.477 0.483 100 0.5 cfu/ml) 8 80 0.4 0.342 60 0.3 100 93 0.197 độ quang độ 40 0.2 lượng VSV 10 x ( Mật Số 20 0.1 28 19 0 0 Mẫu nước Mẫu NaCl Mẫu Mẫu đông cất 0,9% Lysozyme khô Số lượng VSV (x 10^8 cfu/ml) OD (10^-1) Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn số lượng VSV sống sót và mật độ quang của các mẫu sau khi xử lý bằng các phương pháp khác nhau Bảng 3.4. Hình thái B. clausii trên tiêu bản nhuộm Ogietska Hình ảnh sau nhuộm Tình trạng mẫu Tế bào Bào tử Pha loãng trong nước cất + + Pha loãng trong NaCl 0,9% + + Đông khô + + Xử lý bằng lysozym _ + Chú thích: (+) Có (-) Không Nhận xét: Các kết quả thu được từ bảng 3.3 và hình 3.2 cho thấy:
  37. 29 + Lượng sinh khối thu được nhiều nhất khi pha loãng trong nước cất và nước muối sinh lí, thể hiện ở giá trị mật độ quang cao (0,477 và 0,483). Trong khi đó giá trị mật độ quang sau khi đông khô là 0,342 và xử lý bằng lysozym chỉ còn 0,197. + Sau khi pha loãng sinh khối bằng nước cất và nước muối sinh lí, thu được số lượng vi sinh vật sống sót nhiều hơn phương pháp xử lý bằng lysozym và đông khô (100.108 cfu/ml và 93.108 cfu/ml). Xử lý bằng lysozym số lượng VSV giảm còn 28.108 cfu/ml, sau đông khô số lượng VSV sống sót thấp nhất (19.108 cfu/ml). Từ bảng 3.4 nhận thấy: khi pha loãng sinh khối bằng nước cất và nước muối sinh lí thu được bào tử nhưng vẫn lẫn tế bào sinh dưỡng; đông khô ngay sinh khối VSV từ môi trường nuôi cấy thu được bào tử lẫn cả tế bào sinh dưỡng và xác tế bào; xử lý bằng lysozym thu được hoàn toàn dạng bào tử. Bàn luận: Các kết quả trên có thể được giải thích như sau: + Sinh khối thu được sau 4 ngày nuôi cấy, không qua xử lý, pha loãng ngay trong nước cất hoặc dung dịch NaCl 0,9% thì số lượng vi sinh vật gần như không thay đổi nhưng tại thời điểm đó, tế bào VSV vẫn chưa chuyển hết thành dạng bào tử, do vậy cần thêm thời gian để tế bào vi khuẩn chuyển hết thành dạng bào tử. + Đông khô ngay sinh khối thu được từ môi trường nuôi cấy, số lượng VSV vẫn đạt ở nồng độ cao (ở mức 108 cfu/ml) tuy nhiên số lượng VSV sống sót ít hơn khi pha loãng ngay sinh khối trong nước cất hoặc NaCl 0,9% và phương pháp xử lý bằng lysozym. Mặt khác khi xử lý theo phương pháp này, sinh khối thu được vẫn còn lẫn rất nhiều tế bào B. clausii. Do đó, đông khô không tối ưu để sử dụng cho mục đích thu được bào tử tinh khiết với lượng lớn nhất. + Xử lý bằng lysozym có ưu điểm hơn các phương pháp trên: chỉ trong thời gian ngắn đã loại hết tế bào và thu toàn bào tử, kết quả này phù hợp với nghiên cứu của dược sĩ Vũ Thị Ngọc Bích [1]. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là trải qua nhiều giai đoạn (phá vỡ vỏ tế bào, loại bỏ vỏ tế bào, rửa) sau mỗi lần lượng sinh khối bị rửa trôi rất nhiều và lượng tế bào vi khuẩn chưa chuyển sang bào tử cũng bị loại đi nên số lượng vi sinh vật giảm đáng kể (trước khi xử lý giá trị mật độ quang
  38. 30 đo được là 0,491 và sau khi xử lý chỉ còn 0,197). Hơn nữa, phương pháp này sử dụng nhiều loại hóa chất khác nhau, cách tiến hành phức tạp và giá thành lysozym rất cao dẫn đến chi phí tăng cao. Sinh khối thu được có thể vẫn còn chứa lượng nhỏ lysozym sẽ ảnh hưởng đến chất lượng nguyên liệu trong thời gian bảo quản và sử dụng. Từ các nhận định trên, lựa chọn phương pháp pha loãng sinh khối VSV trong nước cất, NaCl 0,9% và phương pháp xử lý bằng lysozym để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2. Lựa chọn phương pháp bảo quản B. clausii Mục tiêu: Xác định được phương pháp nhằm bảo quản nguồn bào tử trong thời gian dài mà không bị mất đi hoạt tính. Tiến hành: Sinh khối sau khi thu được ở mục 3.2.1.a, 3.2.1.b và 3.2.1.d tiến hành bảo quản trong nước cất và nước muối sinh lí. Theo dõi khả năng chuyển dạng bào tử của các mẫu trong các khoảng thời gian khác nhau theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.7. Kết quả:
  39. 31 Bảng 3.5. Tình trạng B. clausii trong mẫu nguyên liệu khi nhuộm Ogietska sau các khoảng thời gian bảo quản Xử lý lysozym, bảo Bảo quản trong NaCl Bảo quản trong nước Mẫu quản trong NaCl 0,9 % cất 0,9 % 1 tuần TB xanh + bào tử đỏ TB xanh + bào tử đỏ Bào tử đỏ 2 tuần TB xanh + bào tử đỏ TB xanh + bào tử đỏ Bào tử đỏ TB xanh ít đi, lượng bào TB xanh ít đi, bào tử 3 tuần Bào tử đỏ tử đỏ chiếm chủ yếu chiếm chủ yếu Chủ yếu bào tử đỏ, thỉnh 4 tuần Bào tử đỏ Bào tử đỏ thoảng có TB xanh 5 tuần Bào tử đỏ Bào tử đỏ Bào tử đỏ 2 tháng Bào tử đỏ Bào tử đỏ Bào tử đỏ 3 tháng Bào tử đỏ Bào tử đỏ Bào tử đỏ Nhận xét: Sau 4 tuần, mẫu nguyên liệu bảo quản trong NaCl chuyển hết thành bào tử, còn mẫu bảo quản trong nước cất vẫn còn lẫn tế bào. Đến tuần thứ 5, mẫu bảo quản trong nước cất đã chuyển hết sang dạng bào tử. Sau 3 tháng, tất cả 3 mẫu bảo quản vẫn giữ được dạng bào tử.
  40. 32 Hình 3.3. Hình ảnh B. clausii nhuộm Ogietska dưới kính hiển vi vật kính 100 (mẫu bảo quản trong NaCl sau 3 tháng) Bảng 3.6. Giá trị mật độ quang của các mẫu nguyên liệu chứa bào tử sau 1 tháng bảo quản Bảo quản trong Bảo quản trong Xử lý bằng Mẫu nước cất NaCl 0,9% lysozym OD (10-1) 0,431 0,440 0,158 % so với bảo quản 97,8% 100% 36% trong NaCl 0,9% Nhận xét: Khi bảo quản trong nước muối sinh lí và nước cất (không qua bước xử lý lysozym), lượng sinh khối không bị mất đi nhiều. So với sinh khối khi bảo quản trong nước muối, lượng sinh khối bảo quản trong nước cất đạt 97,8% và sinh khối sau khi xử lý bằng lysozym chỉ đạt 36%. Bàn luận: + Phương pháp bảo quản sinh khối ngay trong nước muối sinh lí và nước cất đơn giản, dễ làm, chi phí thấp và bào tử thu được với lượng lớn, tinh khiết hơn so với
  41. 33 phương pháp xử lý bằng lysozym. Tuy nhiên phương pháp này cần một khoảng thời gian (1 tháng) để tế bào sinh dưỡng chuyển hết thành dạng bào tử. + Khi bảo quản sinh khối trong nước muối sinh lí cho thấy có ưu điểm hơn so với nước cất. Có thể giải thích do nước muối sinh lí là môi trường đẳng trương so với tế bào vi khuẩn, tạo điều kiện thuận lợi hơn cho tế bào vi khuẩn. Nước cất có môi trường nhược trương so với tế bào vi khuẩn, nên nước tự động khuếch tán từ bên ngoài vào bên trong tế bào vi khuẩn theo cơ chế thẩm thấu, dẫn tới hiện tượng trương nước của tế bào [10]. Trong môi trường nhược trương, tế bào vi khuẩn có thể bị phá vỡ, làm giảm lượng bào tử hình thành sau này. + Mẫu được xử lý bằng lysozym sau khi bảo quản bằng nước muối sinh lí vẫn giữ nguyên dạng bào tử cho thấy tính ưu việt khi sử dụng nước muối sinh lí để bảo quản. Từ các nhận định trên có thể thấy, để thu được bào tử tinh khiết với lượng lớn nhất thì phương pháp bảo quản ngay sinh khối VSV trong NaCl 0,9% mà không qua các bước xử lý là phương pháp tối ưu nhất. Mẫu sinh khối bảo quản ngay trong NaCl 0,9% được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.3. Theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu bảo quản trong NaCl 0,9% Sinh khối vi sinh vật trong suốt quá trình bảo quản chịu nhiều tác động của ngoại cảnh khác nhau dẫn tới bị biến chất như thay đổi màu sắc, vẩn đục hay có mùi khó chịu và số lượng vi sinh vật có thể giảm sút đi. Do đó, cần phải theo dõi liên tục mẫu bảo quản và tiến hành khảo sát định kì tỷ lệ sống sót của bào tử thu được nhằm tạo ra nguồn nguyên liệu tối ưu nhất. Mục tiêu: Theo dõi thể chất và xác định tỷ lệ sống sót của bào tử sau các khoảng thời gian khác nhau. Tiến hành: Sau thời gian bảo quản bào tử bằng nước muối sinh lí, theo dõi màu sắc, mùi của mẫu lưu, lấy mẫu làm tiêu bản Ogietska quan sát sự nảy mầm của bào tử, đồng
  42. 34 thời tiến hành xác định số lượng bào tử sống sót theo phương pháp pha loãng liên tục đã nêu ở mục 2.3.8. Kết quả: Bảng 3.7. Số lượng B. clausii sống sót tại các thời điểm trong quá trình bảo quản Thời gian Ban đầu 1 tháng 2 tháng 3 tháng 93.108 85.108 79.108 106.108 Số lượng VSV cfu/ml cfu/ml cfu/ml cfu/ml 120 106 8 100 93 10 85 × 79 80 Số lượng 60 VSV cfu/ml) 40 20 Số lượng VSV ( VSV lượng Số 0 0 tháng 1 tháng 2 tháng 3 tháng Thời gian Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn sự biến thiên số lượng VSV sau các khoảng thời gian bảo quản Nhận xét: Trong suốt thời gian 3 tháng, nguyên liệu bào tử được tạo ra và bảo quản trong nước muối sinh lí vẫn giữ nguyên được thể chất và số lượng bào tử sống sót gần như không thay đổi (số lượng VSV vẫn đạt mức 108 cfu/ml). Sau 3 tháng bảo quản, bào tử thu được có màu trắng ngà, lắng ở đáy lọ, phần nước ở trên trong suốt, không màu, không mùi. Trên tiêu bản nhuộm Ogietska thấy xuất hiện toàn bào tử bắt màu đỏ. Bàn luận:
  43. 35 Bảo quản trong nước muối sinh lí có ưu điểm là bào tử vẫn giữ nguyên được thể chất và số lượng. Có thể giải thích do trong môi trường nước muối sinh lí không còn nguồn dinh dưỡng, không còn điều kiện thuận lợi cho bào tử có thể nảy mầm trở lại. Tóm lại, để tạo ra nguyên liệu chứa Bacillus clausii dạng bào tử tinh khiết với lượng lớn nhất có thể, cần tiến hành nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường canh thang với thời gian 4 ngày, sau đó ly tâm thu sinh khối, rửa sạch sinh khối và bảo quản trong nước muối sinh lí. 3.2.4. Xác định lượng bào tử từ sinh khối thu được, tính toán số lượng ống sản phẩm tạo thành Mục tiêu: Xác định lượng ống sản phẩm tạo được. Tiến hành:  Lập đường chuẩn : + Từ ống nguyên liệu trên thị trường pha loãng 2, 4, 6, 8, 10 lần bằng nước muối sinh lí trong các ống nghiệm khác nhau. Tiến hành đo quang với bước sóng 600nm, mẫu trắng là nước muối sinh lí được chuẩn bị song song cùng mẫu thử. + Đồng thời ở các mức pha loãng trên lại tiếp tục tiến hành pha loãng theo nguyên tắc pha loãng liên tục theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.8. Cấy 3ml dịch chứa vi khuẩn cần khảo sát vào bình nón có chứa môi trường thạch thường đã được hấp tiệt trùng, lắc đều sau đó đổ ra 3 đĩa petri. Nuôi cấy trong tủ ấm 37ºC trong 24 giờ.  Từ số liệu đo quang và số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa petri vẽ được đường chuẩn.  Xác định lượng ống sản phẩm có thể tạo ra từ 100ml môi trường nuôi cấy. + Tiến hành lấy mẫu nguyên liệu bảo quản trong nước muối sinh lí thu được ở mục 3.2.2 (bảng 3.5 và 3.6), pha loãng 10 lần, sau đó tiến hành đo quang với bước sóng 600nm, mẫu trắng là nước muối sinh lí được chuẩn bị song song cùng mẫu thử.
  44. 36  Số liệu đo quang được đưa vào đường chuẩn để suy ra số lượng vi sinh vật. Kết quả: Bảng 3.8. Mật độ quang và số lượng bào tử B. clausii trong ống chuẩn ở các nồng độ pha loãng Độ pha 2 lần 4 lần 6 lần 8 lần 10 lần loãng OD 0,506 0,251 0,170 0,125 0,104 7 7 7 7 Số lượng 124.10 46.107 39.10 27.10 13.10 VSV cfu/ml cfu/ml cfu/ml cfu/ml cfu/ml OD 0.6 y = 0.0037x + 0.045 0.5 R² = 0.98 0.4 0.3 OD Mật độ quang 0.2 Linear (OD) 0.1 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Số VSV (10^7) Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn đường chuẩn xác định số lượng bào tử B. clausii Mật độ quang của mẫu nguyên liệu chứa toàn dạng bào tử được nuôi cấy từ môi trường canh thang sau khi pha loãng 10 lần là 0,440 (bảng 3.6). Dựa vào đường chuẩn tính được số lượng bào tử B. clausii có trong 1ml môi trường nuôi cấy là 106,8.108 cfu.
  45. 37 Do đó, trong 100ml môi trường nuôi cấy tạo ra: 106,8.1010 cfu. 1 ống sản phẩm trên thị trường 5ml có chứa 2.109 bào tử. Do đó số lượng ống sản phẩm thu được sau khi nuôi cấy B. clausii trong 100ml môi trường là: 106,8.1010 : 2.109 = 533,7 ống. Kết luận sơ bộ: Tóm lại, sau 4 ngày nuôi cấy B. clausii, tiến hành ly tâm thu sinh khối và bảo quản sinh khối trong NaCl 0,9% thì sau 1 tháng tế bào sinh dưỡng chuyển hoàn toàn sang dạng bào tử. Sau 1 tháng số lượng VSV sống sót đạt mức 85.108 cfu/ml. Sau 3 tháng thì số lượng VSV vẫn giữ được 106.108 cfu/ml, không giảm so với lượng VSV ban đầu 93.108 cfu/ml. Do đó thấy được tính ưu việt của mẫu nguyên liệu chứa bào tử. Trong quá trình bảo quản, bào tử không nảy mầm trở lại, ở điều kiện bảo quản bào tử vẫn giữ được màu trắng ngà lắng dưới đáy ống nghiệm, dung dịch bảo quản trong không màu. Đã tính toán được lượng bào tử tạo ra được từ môi trường nuôi cấy: với 100ml môi trường nuôi cấy có thể thu được 533 ống sản phẩm với số lượng bào tử theo yêu cầu.
  46. 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I. KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, đề tài đã thu được một số kết quả như sau: 1. Lựa chọn được điều kiện nuôi cấy thích hợp thu lượng bào tử Bacillus clausii lớn nhất: Nuôi cấy B. clausii trong môi trường canh thang với thời gian 4 ngày. 2. Xác định được phương pháp xử lý và bảo quản để tạo ra nguồn nguyên liệu chứa toàn dạng bào tử với lượng lớn nhất và theo dõi được độ ổn định của mẫu nguyên liệu: xử lý và bảo quản trong nước muối sinh lí. Sau 1 tháng bảo quản trong NaCl 0,9% sinh khối B. clausii chuyển hết thành bào tử. Lượng bào tử thu được tinh khiết và cao hơn khi bảo quản trong nước cất, khi xử lý bằng lysozym và bằng đông khô. Sau 3 tháng nồng độ VSV sống sót vẫn giữ ở mức 108 cfu/ml. Với 100ml môi trường nuôi cấy có thể thu được 533 ống sản phẩm với số lượng bào tử theo yêu cầu. II. KIẾN NGHỊ Vì thời gian có hạn nên khóa luận chưa thể đề cập được hết những vấn đề liên quan. Dưới đây là một vài đề xuất để đề tài có thể hoàn thiện hơn: 1. Tiếp tục theo dõi sự hình thành bào tử của B. clausii khi nuôi cấy trong môi trường canh thang bổ sung glucose từ 2% - 6%. 2. Nuôi cấy và bảo quản bào tử B. clausii trong NaCl 0,9% thu bào tử, tiếp tục nghiên cứu theo hướng tạo nguyên liệu dưới dạng khô để phát triển với quy mô lớn hơn.
  47. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Vũ Thị Ngọc Bích (2013), Nghiên cứu xử lý sinh khối Bacillus clausii để thu bào tử, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội. 2. Bộ y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản y học. 3. Hồ Lê Quỳnh Châu và cộng sự (2010), “Đánh giá khả năng bám dính và kháng khuẩn ở mức độ invitro của một số chủng vi sinh vật có tiềm năng sử dụng làm probiotic”, Tạp chí khoa học, Đại học Huế, số 57. 4. Nguyễn Lân Dũng (2011), Vi sinh vật học, NXB giáo dục. 5. Nguyễn Thị Hiền (2012), Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus clausii, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội. 6. Hà Thị Thanh Huyền (2014), Nghiên cứu sử dụng Alginat làm chất bảo vệ trong quá trình đông khô Lactobacillus acidophilus, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội. 7. Nguyễn Duy Khánh (2006), Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis, Luận văn kĩ sư chuyên ngành công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Đình Luyện (2009), Thực tập kĩ thuật sản xuất dược phẩm, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.74 – 75. 9. Nguyễn Thị Bích Ngọc (2011), Khảo sát điều kiện nuôi cấy vi khuẩn B. clausii, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội. 10. Cao Văn Thu (2005), Sinh học đại cương, Trường đại học Dược Hà Nội, tr 33. 11. Cao Văn Thu (2008), Vi sinh vật học, NXB giáo dục, tr. 33 – 34. 12. Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2006), “Công nghệ sinh học”, NXB giáo dục, tập 4, tr. 129 – 154. Tiếng Anh 13. Asha Devil N. K., Balakrishnan K., Gopal R. and Padmavathyl S. (2008), “Bacillus clausii MB9 from the east coast regions of India: Isolation,
  48. biochemical characterization and antimicrobial potentials”, Current science, 95, pp. 627 – 635. 14. Barbosa T. M., Serra C. R., La Ragione R. M., Woodward M. J. and Henriques A. O. (2005), “Screening for Bacillus isolated in the broler gastrointestinal tract”, Applied and Environmental Microbiology, 71, pp. 968 – 978. 15. Casuala G., Cutting S. M. (2002), “Bacillus probiotics: spore germination in the gastrointestinal tract”, Appl. Environ Microbiol, 68, pp. 2344 – 2352. 16. Ciprandi G., Tosca M. A., Milanese M., Caligo G. and Ricca V. (2004), “Cytokines evaluation in nasal lavage of allergic children after Bacillus clausii administration: A pilot study”, Pediatr Allergy Immunol, 15, pp. 148 – 151. 17. Ciprandi G., Vizzaccaro A., Cirrillo I. and Tosca M. A. (2005), “Bacillus clausii effects in children with allergic rhinitis”, Allergy, 60(5), pp. 702 – 703. 18. Driks A. (2004), “The Bacillus Spore coat”, Phytopathology, 94, pp. 1249 – 1251. 19. Duc Le H, Hong H. A., Barbosa T. M., et al. (2004) “Charac – terization of Bacillus probiotics available for human use”, Appl Environ Microbiol, 70, pp. 2161 – 2171. 20. Green D. H., Wakeley P. R., Page A., Barnes A., Baccigalupi L., Ricca E., and Cutting S. M. (1999), “Charac – terization of two Bacillus probiotics”, Appl. Environ Microbiol, 65, pp. 4288 - 4291 21. Hong H. A., Le Hong Duc, Simon M. C. (2005), “The use of bacterial spore formers as probiotics”, FEMS Microbiology Reviews, 29, pp. 813 – 835. 22. Ivanovska T. P., Petrusevska-Tozi L., Kostoska M. D., Geskovski G., Grozdanov A., Stain C., Stafilov T., Mladenovska K. (2012), “Microencapsulation of Lactobacillus casei in Chitosan-Ca-Alginate microparticles using spray-dying method”, Macedonian Journal of Chemistry and Chemical Engineering, 31, pp.115 – 123. 23. Kobayashi T., Kageyama Y., Sumitomo N., Saeki K., Shirai T. and Ito S. (2005), “Contribution of a salt bridge triad to the thermostability of a highly alkaline protease from an alkaliphilic Bacillus strain”, World J. Microbiol Biotechnol, 21, pp. 961 -967.
  49. 24. Lieske J. C., Goldfarb D. S., De Simone C., Regnier C. (2005), “Use of a Probiotic to Decrease Enteric Hyperoxaluria”, Kidney International, 68(3), pp. 1244 – 1249. 25. Marseglia G. L., Tosca M., Cirillo I., Licari A, Leone M., Marseglia A., et al. (2007), “Efficacy of Bacillus clausii spores in the prevention of recurrent respiratory infections in children: a pilot study”, The Clin Risk manag, 3(1), pp. 13 – 17. 26. Martini M. C., Bollweg G. L., Levitt M. D. and Savarano D. A. (1987), “Lactose digestion by yogurt ẞ-galactosidase: influence of pH and microbial cell integrity”, The American Journal of clinical nutrition, 45, pp. 432 - 436. 27. Mcfarlane G Cummings JH (1999), “Probiotics and prebiotics can regulating the activities of intestinal bacteria benefit health”, pp. 999 – 1003. 28. Nicholson W. J., Munakata N., Horneck G., Melosh H. J. and Setlow P. (2000), “Resistance of Bacillusendospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64, pp. 548 – 572. 29. Nielsen P., Fritze D. and Priest F. G. (1995), “Phenetic diversity of alkaliphilic bacillus strains: proposal for nine new species”, Microbiology, 141, pp. 1745 – 1761. 30. Nista E. C., Candelli M., Cremonini F., Cazzato I. A. and et al. (2004), “Bacillus clausii therapy to reduce side-effects of anti-Helicobacter pylori treatment: randomized, double-blind, placebo controlled trial”, Alimentary Pharmacology and Therapeutics, 20(10), pp. 1181 – 1188. 31. Oskouie S. F. G., Tabandeh F., Yakhchali B., Eftekhar F. (2008), “Response surface optimization of medium composition for alkaline protease production by Bacillus clausii”, Biochemical Engineering Journal, 39, pp. 37 – 42. 32. Saad N., Delattre C., Urdaci M., Schmitter J. M., Bressollier P. (2013), “An overview of the last advances in probiotic and prebiotic field”, LWT – Food Science and Technology, 50(1), pp. 1 – 16. 33. Sazawal S., Hiremath G., Dhingra U., Malik P., Deb S., E Black R. (2006), “Efficacy of probiotics in prevention of acute diarrhea: a meta-analysis of
  50. masked, randomized, placebo-controlled trials”, Lancet Infect Dis, 6, pp. 374 – 382. 34. Shirai T., Suzuki A.,Yamane T., Ashida T., Kobayashi T., Hitomi J. and Ito S. (1997), “High-resolution crystal structure of M-protease: phylogeny aided analysis of the high-alkaline a daptation mechanism”, Protein Engineering, 10(6), pp. 627 - 634. 35. Singh P. K., Deol P. K., Kaur I. P. (2012), “Entrapment of Lactobacillus acidophilus into alginate beads for the effective treatment of cold restraint stress induced gastric ulcer”, Food Funct, 3, pp. 83 -90. 36. Spinosa M. R., Braccini T., Ricca E., De Felice M., Morelli L., Pozzi G. and Oggioni M. R. (2000), “On the fate of ingested Bacillus spores”, Research in Microbiology, 151, pp. 361 – 368. 37. Spinosa M. R., Wallet F., Courcol J. R. and Oggioni M. R. (2000), “The trouble in tracing opportunistic pathogens: cholangitis due to Bacillus in a French hospital caused by a train related to an Italian probiotics”, Microbial ercology in health and disease, 12, pp. 99 – 101. 38. Soccol C. R., De Souza L. P. and et al. (2010), “The potential of Probiotics”, Food Technol. Biotechnol, 48(4), pp. 413 – 434. 39. Tuohy K. M., et al. (2007), “Survivability of a probiotic Lactobacillus casei in the gastrointestinal tract of healthy human volunteers and its impact on the faecal microflora”, J Appl Microbiol, 102, pp. 1026 – 1032. 40. Vivek K. B. (2013), “Use of encapsulated Probiotics in dairy based foods”, International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences ISSN: 2277 – 209X, 3(1), pp. 188 – 199. 41. World Gastroenterology Organization Food and Agriculture Organization of The United Nations (2006), “Probiotics in Food: Health and nutritional properties and guidelines for evaluation”.