›

Khóa luận Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α-Glucosidae và enzym PTP1B in vitro của dịch chiết lá cây ổi (Psidium Guajava L.) trồng tại Việt Nam

pdf 49 trang thiennha21 18/04/2022 5560
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α-Glucosidae và enzym PTP1B in vitro của dịch chiết lá cây ổi (Psidium Guajava L.) trồng tại Việt Nam", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_tac_dung_uc_che_enzym_glucosidae_va_enz.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α-Glucosidae và enzym PTP1B in vitro của dịch chiết lá cây ổi (Psidium Guajava L.) trồng tại Việt Nam

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y – DƢỢC TRẦN TRỌNG NGHĨA NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE VÀ ENZYM PTP1B IN VITRO CỦA DỊCH CHIẾT LÁ CÂY ỔI (Psidium Guajava L.) TRỒNG TẠI VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC HÀ NỘI – 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y – DƢỢC Ngƣời thục hiện: TRẦN TRỌNG NGHĨA NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE VÀ ENZYM PTP1B IN VITRO CỦA DỊCH CHIẾT LÁ CÂY ỔI (Psidium Guajava L.) TRỒNG TẠI VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC KHÓA: QH.2014.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS.TS. BÙI THANH TÙNG ThS. ĐẶNG KIM THU HÀ NỘI – 2019 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Khi nhận được đề tài này, tôi đã cảm thấy mình vô cùng may mắn, vì đây là một đề tại rất thiết thực với cuộc sống. Sau khi hoàn thành khóa luận, tôi lại cảm thấy mình may mắn hơn nữa khi được đóng góp một phần nhỏ bé vào cuộc chiến chống lại căn bệnh đang ngày một gia tăng trên thế giới. Trong thời gian thực hiện khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ nhiệt tình từ thầy cô, người thân và bạn bè. Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến PGS. TS. Bùi Thanh Tùng – Phó trưởng phòng Quản lý khoa học và hợp tác phát triển - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Thầy đã giúp đỡ tôi kể từ những ngày đầu tiên bước chân vào nghiên cứu khoa học. Thầy là một giáo viên hướng dẫn tận tâm luôn sát sao với sinh viên, tận tình chu đáo và luôn sẵn sàng giải đáp mọi thắc mắc trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Tiếp theo, tôi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược, các thầy cô bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, cùng toàn thể thầy cô các bộ môn khác đã mang đến những kiến thức bổ ích nhất cho sinh viên chúng tôi trong suốt 5 năm học tập và thực hiện khóa luận tại khoa. Không có sự dạy dỗ 5 năm này, tôi chắc chắn sẽ không có được một khóa luận như ngày hôm nay. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những người đã luôn sát cánh, luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, ngày 27 tháng 4 năm 2019 Sinh viên Trần Trọng Nghĩa @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BMI Chỉ số khối cơ thể ĐTĐ Đái tháo đường ĐTĐ type 2 Đái tháo đường type 2 ER Lưới nội chất EtOAc Ethylacetat EtOH Ethanol FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ FFA Axit béo tự do IDF Liên đoàn Đái tháo đường Thế giưới IL-6 Interleukin-6 IR Thụ thể insulin IRS Cơ chất của thụ thể insulin n-BuOH n-Buthanol PDK1 PI3K-dependent kinase1 PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase PTP1B Protein tyrosine phosphatase 1B ROS Quá trình oxi hóa TNF alpha Tumor necrosis factor alpha TZD Thiazolidindion WHO Tổ chức Y tế Thế giới @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Các hợp chất tự nhiên ức chế enzym α-glucosidase 14 Bảng 3.1 Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cao chiết toàn 30 phần, các phân đoạn dịch chiết lá ổi và Acarbose Bảng 3.2 Tác dụng ức chế enzym PTP1B của cao chiết toàn phần, 31 các phân đoạn dịch chiết lá ổi Bảng 3.3 Tác dụng ức chế enzym PTP1B của axit ursolic 32 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc phân tử Acarbose 13 Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của Beta-sitosterol 23 Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của Quercetin 23 Hình 1.4 Cấu trúc phân tử của Guaijaverin 24 Hình 1.5 Cấu trúc phân tử của Avicularin 24 Hình 2.1 Phản ứng thủy phân PNP-G dưới tác dụng của enzym 26 α-glucosidase Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn lá ổi 29 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym 32 PTP1B của Hình3.3 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym 33 PTP1B của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết lá ổi @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Bệnh đái tháo đƣờng 3 1.1.1. Tổng quan về bệnh đái tháo đường 3 1.1.2. Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và tại Việt Nam 4 1.1.3. Các yếu tố nguy cơ của bệnh đái tháo đường type 2 5 1.1.4. Cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường type 2 7 1.1.5. Chẩn đoán bệnh đái tháo đường 8 1.1.6. Điều trị đái tháo đường 10 1.2. Tổng quan về enzym α-glucosidase và PTP1B 11 1.2.1. Tổng quan về enzym 11 1.2.2. Tổng quan về enzym α-glucosidase 11 1.2.3. Tổng quan về enzym PTP1B (protein tyrosine phosphatase 1B) 14 1.3. Đặc điểm thực vật, phân bố của cây ổi tại Việt Nam 20 1.3.1. Vị trí phân loại thực vật 20 1.3.2. Phân bố 20 1.3.3. Đặc điểm thực vật 21 1.3.4. Thành phần hóa học 21 1.3.5. Tác dụng và công dụng 22 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 24 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 24 2.1.2. Chuẩn bị mẫu 24 2.1.3. Hóa chất và thiết bị 24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 25 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  8. 2.2.1. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro 25 2.2.2. Đánh giá khả năng ức chế enzym PTP1B in vitro 26 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1. Kết quả chiết xuất và phân đoạn dịch chiết lá ổi 28 3.2. Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro 29 3.3. Tác dụng ức chế enzym PTP1B in vitro 30 Chƣơng 4: BÀN LUẬN 33 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong vòng 3 thập kỷ gần đây, số người mắc đái tháo đường trên thế giới đã tăng gấp đôi. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, năm 2012 trên thế giới có 346 triệu người mắc đái tháo đường, trong đó có hơn nửa sống ở vùng Tây Thái Bình Dương, Nam Á và Đông Địa Trung Hải [37]. Sự bùng phát của bệnh đái tháo đường type 2 hiện nay xảy ra ở những nước đang phát triển nhiều hơn những nước phát triển. Trong 10 nước được dự đoán có số người mắc đái tháo đường nhiều nhất trên thế giới vào năm 2030 thì có 5 nước ở châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Pa-kít-xtan, In-đô-nê-sia và Băng-la-đét) [3, 38]. Bệnh đái tháo đường là bệnh đặc trưng bằng mức đường trong máu cao, nguyên nhân là do thiếu insulin có kèm hoặc không kèm theo kháng insulin với các mức độ khác nhau [37]. Bên cạnh đó, bệnh đái tháo đường còn gây ra các biến chứng nguy hiểm về tim mạch, tai biến mạch máu não, suy thận, Bệnh đái tháo đường gồm có hai loại, trong đó loại 2 chiếm khoảng 90 % trong tổng số trường hợp bị bệnh [1]. Đái tháo đường type 2 đặc trưng bởi sự đề kháng insulin, dẫn đến tế bào không nhận được lượng glucose nên sẽ làm tăng glucose trong máu. Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã cho thấy vai trò của hai enzym α-glucosidase và protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) trong điều trị đái tháo đường type 2 [4]. Enzym α-glucosidase được biết đến như tác nhân thủy phân oligosaccharid thành glucose; PTP1B lại là tác nhân làm tăng quá trình khử phospho hóa Irβ, dẫn đến giảm tín hiệu insulin và kháng insulin [7, 19, 31]. Vì vậy, ức chế sự hoạt động của hai enzym này sẽ là phương pháp điều trị đái tháo đường type 2. Hiện nay, trên thị trường đã có nhiều loại thuốc được dùng để điều trị đái tháo đường type 2, nhưng vẫn còn nhiều tác dụng không mong muốn. Theo đó, sử dụng dược liệu hay các sản phẩm đến từ tự nhiên trong chẩn đoán và điều trị bệnh đang trở thành một xu hướng được nhiều người ưa chuộng, bởi tính an toàn và ít tác dụng phụ. Trên thế giới và ngay tại Việt Nam cũng đã có rất nhiều nghiên cứu chứng minh @ đư Schoolợc tác dụ ngof làm Medicine giảm glucose and máu Pharmacy, VNU 1
  10. từ các loại thảo dược hay thực vật nói chung. Trong đó, nghiên cứu tác dụng ức chế hai enzym α-glucosidase và PTP1B từ các loại lá, vỏ cây hay các loại quả đang được quan tâm rất lớn. Ổi hay còn gọi là ủi, phan thạch lựu. Tên khoa học là Psidium guajava L., thuộc họ Sim Myrtaceae. Cây ổi nguồn gốc miền nhiệt đới châu Mỹ, sau được phổ biến và trồng khắp ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi [2]. Các hợp chất trong lá ổi gồm có: morin flavonoid, morin-3-O-lyxosyde, morin-3-O- arabinoside, quercetin, quercetin-3-O-arabinoside, glycosides, alkaloids, saponins và tritecpenoid [33]. Theo y học cổ truyền, lá ổi có vị đắng sáp, tính ấm, có công dụng tiêu thũng giải độc, thu sáp chỉ huyết. Quả ổi vị hơi chua sáp, tính ấm, có công dụng thu liễm, kiện vị cố tràng [2]. Các nghiên cứu cho thấy, dịch chiết từ các bộ phận của cây ổi đều có tác dụng kháng khuẩn, làm săn se niêm mạc và cầm đi lỏng [28]. Ngoài ra, hiện nay một số quốc gia như Nhật Bản đã sử dụng lá ổi để làm trà, trà lá ổi được biết đến như một loại đồ uống giúp kiểm soát lượng đường trong máu, giảm cholesteron, hỗ trợ giảm béo và một số tác dụng khác Để tìm hiểu rõ hơn, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α-glucosidae và enzym PTP1B in vitro của dịch chiết lá cây ổi (Psidium Guajava L.) trồng tại Việt Nam” với mục tiêu: 1. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidae in vitro của các phân đoạn dịch chiết lá cây ổi (Psidium Guajava L.). 2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym PTP1B in vitro của các phân đoạn dịch chiết lá cây ổi (Psidium Guajava L.). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  11. Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. Bệnh đái tháo đƣờng 1.1.1. Tổng quan về bệnh đái tháo đường Theo Tổ chức Y tế Thế giới ( WHO), đái tháo đường là một rối loạn chuyển hóa do rất nhiều nguyên nhân, được mô tả là sự tăng đường huyết mạn tính cùng với rối loạn chuyển hóa carbohydrat, chất béo và protein, nó là hậu quả của sự suy giảm tiết insulin và giảm hoạt tính insulin [37]. Bệnh đái tháo đường đã được biết đến từ lâu trong lịch sử y học. Từ những năm 1.500 trước công nguyên trong các tài liệu của người Ai Cập cổ đại đã mô tả bệnh có triệu chứng liên quan đến bệnh đái tháo đường ngày nay [41]. Các tài liệu cổ của người Ấn Độ cổ cũng ghi lại những nệnh nhân có triệu chứng uống nước nhiều, hiện tượng “ruồi bâu, kiến bậu” vào nước tiểu. Y học cổ xưa cũng đã có một số phương pháp điều trị như: dùng thuốc lợi tiểu, tắm bồn nước nóng, rạch tĩnh mạch, tẩy giun và dùng các loại thảo mộc [37]. Năm 1674 sau công nguyên, Thomas Willis là người đầu tiên so sánh vị ngọt của đường trong nước tiểu giống như mật, từ đó thuật ngữ “diabetes mellitus” bắt đầu xuất hiện và được sử dụng cho tới nay [3]. Năm 1869, Paul Langerhans đã phát hiện ra tụy có hại loại tế bào. Năm 1872, Bouchardart nhận thấy đường trong nước tiểu giảm khi các bệnh nhân nhịn đói lâu ngày hoặc ăn chế độ ăn khắc khổ [41]. Từ đó, chế độ ăn được quan tâm trong việc điều trị bệnh đái tháo đường. Từ những năm 1875 – 1901, các nghiên cứu về các tế bào đảo tụy tiếp tục được thực hiện. Năm 1901, Eugen Opie phát hiện người bệnh đái tháo đường có tổn thương đảo tụy Langerhans. Ông cho rằng các tế bào của đảo tụy đã tiết ra chất mà khi thiếu các chất này thì gây ra bệnh đái tháo đường [38]. Năm 1906, Geoge Zuelezer đã thử nghiệm điều trị cho người mắc đái tháo đường bằng cách tiêm chất chiết xuất của tụy, tuy nhiên thử nghiêm này thất bại do người bệnh co giật. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  12. Năm 1920, Frederick Banting và các đồng nghiệp đã thành công khi dùng chất chiết xuất của tụy để nuôi sống những con chó đã bị cắt tuyến tụy. Họ đã đặt tên cho chất này là “isletin”. Tiếp sau đó năm 1921 , người ta đã thử nghiệm lần đàu tiên chất isletin cho một bệnh nhân 14 tuổi và tháy mức glucose máu của người bệnh đã hạ xuống nhanh chóng từ 440 mg/dL xuống 320 mg/dL. Cùng thời gian này, giáo sư Macleod tại trường đại học Toronto đã sử dụng huyết thanh này để điều trị cho người bệnh và ông đổi tên “isletin” thành “insulin” [37]. Từ những năm 1922 cho tới nay insulin đã được nghiên cứu, sản xuất và bán trên thị trường. Việc sử dụng insulin trở nên dễ dàng thuận tiện hơn nhiều, tuy nhiên giá thành vẫn còn rất đắt đỏ. Năm 1979, người ta đã tạo ra được insulin bằng công nghệ AND tái tổ hợp và tới năm 1982, insulin tái tổ hợp đã được sản xuất thành công làm giảm giá thành của insulin giúp cho hàng triệu bệnh nhân đái tháo đường trên thế giới. Năm 1998, nước Anh công bố nghiên cứu chúng minh vai trò của liệu pháp điều trị tích cực đối với người mắc bệnh đái tháo đường type 2 và làm giảm mức độ các biến chứng mạn tính của bệnh [3]. 1.1.2. Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và tại Việt Nam Theo Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (IDF), năm 2015 trên toàn thế giới có 415 triệu người lớn (độ tuổi 20-79) đang sống với bệnh đái tháo đường và dự đoán đến năm 2040, con số này sẽ tăng đến khoảng 642 triệu người. Bên cạnh đó, cùng với việc tăng sử dụng thực phẩm không thích hợp, ít hoặc không hoạt động thể lực ở trẻ em, bệnh đái tháo đường type 2 đang có xu hướng tăng ở cả trẻ em, trở thành vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng [38]. Bệnh đái tháo đường gây nên nhiều biến chứng nguy hiểm, là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tim mạch, mù lòa, suy thận, và cắt cụt chi. Nhưng một điều đáng khả quan, có tới 70% trường hợp đái tháo đường type 2 có thể dự phòng hoặc làm chậm xuất hiện bệnh bằng tuân thủ lối sống lành mạnh, dinh dưỡng hợp lý và tăng cường luyện tập thể lực [38]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
  13. Tại Việt Nam, năm 1990 của thế kỷ trước, tỷ lệ bệnh ĐTĐ chỉ là 1,1 % (ở thành phố Hà Nội), 2,25% (ở thành phố Hồ Chí Minh), 0,96% (thành phố Huế), nghiên cứu năm 2012 của Bệnh viện Nội tiết trung ương cho thấy: tỷ lệ hiện mắc đái tháo đường trên toàn quốc ở người trưởng thành là 5.42%, tỷ lệ đái tháo đường chưa được chẩn đoán trong cộng đồng là 63.6%. Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose toàn quốc 7,3%, rối loạn glucose máu lúc đói toàn quốc 1,9% (năm 2003). Theo kết quả điều tra STEPwise về các yếu tố nguy cơ của bệnh không lây nhiễm do Bộ Y tế thực hiện năm 2015, ở nhóm tuổi từ 18-69, cho thấy tỷ lệ đái tháo đường toàn quốc là 4,1%, tiền đái tháo đường là 3,6% [3]. 1.1.3. Các yếu tố nguy cơ của bệnh đái tháo đường type 2 Bệnh đái tháo đường type 2 hay còn gọi là đái tháo đường không phụ thuộc insulin thường thấy ở người sau tuổi 40 và có thể trạng béo. Bệnh đái tháo đường type 2 là một rối loạn mạn tính mà nguyên nhân được cho là do có sự tương tác giữa yếu tố gen và yếu tố môi trường [4]. 1.1.3.1. Thừa cân và béo phì Tỷ lệ người trưởng thành bị thừa cân (BMI từ 25 – 30 kg/m2) và béo phì (BMI > 30 kg/m2) trên thế giới được dự đoán sẽ tăng lên 57,8% vào năm 2030. Thừa cân và béo phì dẫn tới viêm, tăng tiết từ mô mỡ các hoạt chất nhóm adipocytokine. Tất cả nững hiện tượng này đều có vai trò gây kháng insulin ở gan, mô cơ và tăng nguy cơ dẫn tới mắc bệnh đái tháo đường [41]. Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, đối với người châu Á, BMI từ 23-25 kg/m2 là thừa cân và trên 25 kg/m2 là béo phì [4]. Đặc điểm của đa số bệnh nhân đái tháo đường ở Việt Nam thường có BMI bình thường nhưng mỡ bụng, phần trăm mỡ cơ thể và mỡ bụng cao, đặc biệt là ở phụ nữ [23]. Nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy những người có BMI > 23 kg/m2 thì có nguy cơ mắc đái tháo đường type 2 cao gấp 2,89 lần so với người bình thường [3]. 1.1.3.2. Tuồi Nguy cơ đái tháo đường tăng cùng với tuổi do tăng tính kháng insulin liên quan tới béo phì và tinhg trạng ít @vận Schoolđộng. Cùng of vớ Medicinei thời gian, các andtế bào Pharmacy, VNU 5
  14. beta suy yếu do phải tăng tiết insulin để bù đắp cho sự tăng mức độ kháng insulin của cơ thể. Ở Châu Á, tỷ này cao ở người trẻ tuổi và trung niên, đây chính là độ tuổi lao động sản xuất chính của xã hội. Điều này gây nên gánh nặng lớn cho các nước Châu Á mà trong đó chủ yếu là những nước đang phát triển và kém phát triển [38]. Tại Việt Nam, nghiên cứu dịch tễ bệnh đái tháo đường tại 4 thành phố lớn năm 2003 cho kết quả tỉ lệ mắc đái tháo đường ở nhóm người dưới 35 tuổi là 0,9% còn ở nhóm 45-54 tuổi là 6,5% và ở nhóm 55-64 tuổi là 10,3%. Nghiên cứu này cũng chứng minh tuổi cao là một yếu tố nguy cơ đặc biệt, có liên quan chặt chẽ đến bệnh đái tháo đường [3]. 1.1.3.3. Tiền sử gia đình Tiền sử gia đình là một yếu tố quan trọng liên quan tới bệnh đái tháo đường, điều này một phần thể hiện cho vai trò của yếu tố di truyền đối với nguy cơ mắc bệnh. Những đối tượng có nguy cơ mắc bệnh cao nếu có ít nhất 1 người trong gia đình bị bệnh. Theo Tạ Văn Bình và cộng sự, tiền sử gia đình có bố mẹ hoặc con ruột, anh, chị, em ruột bị mắc đái tháo đường thì có nguy cơ mắc bệnh cao gấp 3,28 lần so với nhóm bình thường không có người thân trong gia đình mắc đái tháo đường [23]. 1.1.3.4. Yếu tố gen Nghiên cứu ở các cặp sinh đôi đã cung cấp những bằng chứng thuyết phục về ảnh hưởng của yếu tố di truyền đối với bệnh đái tháo đường. Các cặp sinh đôi cùng trứng có tỷ lệ tương đồng cao hơn so với các cặp sinh đôi khác trứng. Sự tương đồng về nguy cơ mắc đái tháo đường type 2 ở người sinh đôi cùng trứng từ 34-83% và ở người sinh đôi khác trứng là 16-40% [37]. 1.1.3.5. Chế độ dinh dưỡng và hoạt động thể lực Chế độ dinh dưỡng phù hợp và luyện tập là chìa khóa để chống lại béo phì và cao huyết áp, tăng hoạt động của insulin và giảm sự tạo glucose ở gan. Hoạt động thể lực có vai trò đặc biệt quan trọng đối với bệnh đái tháo đường type 2. Nhóm đối tượng ít vận động (< 30 phút/ngày) có nguy cơ mắc đái tháo đường cao gấp 2,4 lần so với nhóm hoạt động nhiều. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy việc hoạt động thể lực thường @ xuyên School có tác of dụng Medicine làm giảm n ồandng đ ộPharmacy, VNU 6
  15. glucose máu đồng thời duy trì sự ổn định của lipid máu, huyết áp và giúp cải thiện tâm lý. Sự phối hợp hoạt động thể lực thường xuyên và điều chỉnh chế độ ăn có thể giúp giảm 58% tỷ lệ mắc mới đái tháo đường type 2 [41]. 1.1.4. Cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường type 2 1.1.4.1. Cơ chế liên quan đến rối loạn tiết insulin Khi mới bị đái tháo đường type 2, insulin có thể bình thường hoặc tăng lên nhưng tốc độ tăng chậm không tương ứng với mức tăng của glucose máu. Khi glucose máu > 13,8mmol/l thì các rối loạn chức năng tế bào beta về bài tiết insulin sẽ rõ rệt. Khi nghiên cứu nồng độ insulin lúc đói sau nghiệm pháp dung nạp đường huyết giờ thứ hai của người mắc đái tháo đường type 2, Defronzo và cộng sự thấy mỗi tương quan giữa nồng độ glucose máu lúc đói và nồng độ insulin lúc đói có sự thay đổi đặc biệt [23]: - Khi glucose máu tăng đến 120mg/dL lượng insulin sẽ tăng gấp đôi. - Khi glucose máu từ 150-160 mg/dL lượng insulin tiết giống như người bình thường. - Khi glucose máu trên 160 mg/dL xuất hiện hiện tượng giảm đáp ứng. - Khi glucosse máu 200-220 mg/dL thì đáp ứng giảm rõ rệt. 1.1.4.2. Cơ chế bệnh liên quan đến kháng insulin Kháng insulin là tình trạng giảm hoặc mất tính nhạy cảm của cơ quan đích với insulin. Kháng insulin do nhiều nguyên nhân: tế bào beta tiết insulin bất thường, có chất đối kháng insulin lưu thông trong máu như: glucagon, catecholamine, cortisol, hormon GH, axit béo tự do (FFA), kháng thể kháng insulin, kháng thể kháng thụ thể insulin, resistin, TNF alpha (Tumor Necrosis factor alpha), IL-6 (Interleukin-6) [4]. Insulin kiểm soát cân bằng đường huyết qua 3 cơ chế, mỗi cơ chế rối loạn có thể dẫn đến kháng insulin [1]: - Insulin ức chế sản xuất glucose từ gan. - Insulin kích thích dự trữ glucose ở tổ chức cơ. - Insulin kích thích dự trữ glucose ở các cơ quan. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
  16. 1.1.4.3. Triệu chứng của đái tháo đường Bệnh đái tháo đường thường không có triệu chứng rõ rệt ở giai đoạn sớm, nhưng gây ra cảm giác như ốm: cảm sốt, đau bụng, đau đầu, ho. Sau một thời gian dài, các triệu chứng lâm sàng gồm [4]: - Háo nước, uống nhiều nước, luôn thấy khát. - Đi tiểu nhiều lần trong ngày, kể cả đêm. - Thường xuyên cảm thấy đói và ăn nhiều. - Cơ thể mệt mỏi, khó tập trung vào học hành, công việc, dễ nổi cáu. - Nhìn sự vật mờ đi. - Giảm cân nhiều trong một thời gian ngắn. 1.1.4.4. Biến chứng của đái tháo đường Biến chứng là vấn đề đe dọa sức khỏ lớn nhất đối với người mắc đái tháo đường. Các biến chứng thường thấy như: biến chứng thận, tim mạch, mắt, chân, tổn thương ở da, miệng, loãng xương, Khi xuất hiện biến chứng ở các cơ quan, người bệnh sẽ thấy nhiều triệu chứng như suy thận, đục thủy tinh thể, cao huyết áp, nhiễm trùng dai dẳng. Hậu quả để lại nặng nề, gây ra gánh nặng cho bệnh nhân và gia đình [3]. 1.1.5. Chẩn đoán bệnh đái tháo đường Theo khuyến cáo của Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ và Tổ chức Y tế Thế giới, đái tháo đường được chẩn đoán dựa vào 1 trong 4 tiêu chuẩn sau [37]: - Đường huyết lúc đói ≥ 126mg/dL hoặc ≥ 7,0 mmol/l (đo ở thời điểm nhịn đói ít nhất 8h) - Đường huyết 2 giờ ≥ 200 mg/dL hoặc ≥ 11,1 mmol/l khi làm xét nghiệm dung nạp glucose - HbA1c ≥ 6,5% - Bệnh nhân có triệu chứng của tăng đường huyết hay tăng đường huyết trầm trọng (gồm: uống nhiều nước, tiểu nhiều, sụt cân không giải thích được) kèm theo xét nghiệm đường huyết ngẫu nhiên ≥ 200 mg/dL hoặc ≥ 11,1 mmol/l. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
  17. Việc phát hiện rối loạn glucose máu lúc đói bằng xét nghiệm dung nạp glucose máu tĩnh mạch có độ nhạy cao hơn so với phương phá xét nghiệm dung nạp glucose bằng máu mao mạch [38].  Nghiệm pháp dung nạp đƣờng huyết Phương pháp xét nghiệm bằng dung nạp đường uống (OGTT) đánh giá hiệu quả chuyển hóa glucose của cơ thể được dùng làm “tiêu chuẩn vàng” để chẩn đoán đái tháo đường trong nhiều năm nay. Tăng nồng độ glucose máu sau bữa ăn thường xảy ra trước khi tăng glucose lúc đói. Do đó glucose máu sau bữa ăn là một chỉ báo nhạy của nguy cơ phát hiện bệnh tiểu đường. Tuy nhiên để thực hiện OGTT, bệnh nhân cần các điều kiện quan trọng gồm có: khẩu phần ăn ít nhất phải có 150g carbohydrat/ngày trong 3 ngày trước khi làm nghiệm pháp, nhịn đói từ 10 đến 16 giờ và bắt đầu làm nghiệm pháp trong khoảng 7 đến 9 giờ sáng [23]. Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) nên sử dụng tiêu chuẩn OGTT bởi nếu chỉ xét nghiệm glucose máu lúc đói thì sẽ có 30% trường hợp không phát hiện ra đái tháo đường. Ngoài ra các trường hợp rối loạn đường huyết chỉ được phát hiện bằng xét nghiệm OGTT [41].  Tiêu chuẩn HbA1c trong chẩn đoán đái tháo đƣờng type 2 HbA1c là nồng độ glucose máu hoặc huyết tương trung bình trong 8 – 12 tuần. Chỉ số HbA1c đã được sử dụng để chẩn đoán đái tháo đường type 2 và để dùng đánh giá ca mới mắc và hiện mắc đái tháo đường type 2. Chỉ số HbA1c có nhiều thuận lợi cho người bệnh: máu được lấy ở bất kỳ chỗ nào, không cần nhịn ăn hoặc ngay cả khi bệnh nhân có dung nạp glucose trước đó. Khác với tiêu chuẩn xét nghiệm đường huyết lúc đói hoặc dung nạp glucose thì HbA1c không bị ảnh hưởng bởi stress, lượng carbohydrat trong chế độ ăn uống hoặc hoạt động thể lực và rất ổn định trong mẫu máu bảo quản ở 37°C [38]. Tuy nhiên tiêu chuẩn này vẫn còn những hạn chế như yêu cầu phải thực hiện trong phòng thí nghiệm đạt chuẩn, tin cậy, chi phí xét nghiệm cai hơn so với phương pháp xét nghiệm đường huyết lúc đói và dung nạp glucose. Khi bệnh nhân có những vấn đề về máu: @thiế Schoolu máu, mang of thái, Medicine suy thận, b andệnh lý Pharmacy, VNU 9
  18. làm giảm thời gian sống hồng cầu, tăng ure máu, các bệnh lý có liên quan thới hemoglobin thì không thể đánh giá bằng HbA1c [38]. 1.1.6. Điều trị đái tháo đường 1.1.6.1. Điều trị sử dụng thuốc Hiện nay, cách điều trị đái tháo đường chủ yếu vẫn là sử dụng kết hợp các loại thuốc cùng với đó là lối sống lành mạnh nhằm duy trì sự ổn định và hạn chế các biến chứng nặng nề . Thuốc sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường type 2 chủ yếu chia 3 nhóm [3]: - Nhóm thuốc kích thích tụy tiết insulin như nhóm sufonylurea: Tolbutamide, Chlorpropamide, Glibenclamid, Gliclazid, Glimepirid, Glipizide, Glinide; nhóm meglitinide: Prandin, Starlix; nhóm sitagliptin: Januvia, Onglyza. - Nhóm thuốc giúp tăng độ nhạy của insulin như nhóm biguanide: metformin (Glucophage, Glucophge XR, Metformin XR); nhóm thiazolidinedione (TZD) hay glitazone, (Rosiglitazone, pioglitazone ). - Thuốc ức chế men α-glucosidase (làm chậm hấp thu đường glucose từ ruột vào máu): Acarbose (Precose, Glucobay), miglitol (Glyset). 1.1.6.2. Điều trị không sử dụng thuốc Bên cạnh việc sử dụng thuốc, xây dựng một lối sống lành mạnh là điều không thể thiếu để giúp người bệnh đái tháo đường type 2 có một cuộc sống ổn định hơn. Chế độ lành mạnh là một yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới bệnh đái tháo đường. Lựa chọn thực phẩm có nhiều chất xơ, ăn nhiều đạm có nguồn gốc thực vật, ít chất béo, đặc biệt chất béo bão hoà. Chế biến thực phẩm chú trọng luộc, hấp, áp chảo, hạn chế đồ rán, xào, sử dụng các loại gia vị và nước sốt ít béo, ít muối và đường. Ăn trái cây nguyên quả, không ép nước. Tập luyện thường xuyên sẽ cải thiện sức khoẻ nói chung và giúp chống lại bệnh tật, nhất là bệnh tim mạch, xương khớp. Tập luyện làm tăng cường sinh lực, giảm cân và giảm đường huyết nên được coi là một biện pháp quan trọng trong điều trị bệnh nhân đái tháo đường [41]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  19. 1.2. Tổng quan về enzym α-glucosidase và PTP1B 1.2.1. Tổng quan về enzym 1.2.1.1. Khái niệm Enzym là chất xúc tác sinh học được hình thành trong tế bào dưới dạng hợp chất protein có cấu trúc hóa học đặc thù. Trong tế bào sinh vật luôn xảy ra quá trình trao đổi chất, enzym đã góp phần thúc đấy các phản ứng hóa học này ở điều kiện bình thường với tốc độ cực nhanh mà không cần sự hỗ trợ đặc biệt của các yếu tố nhiệt độ, áp suất Enzym có thể được thu nhận từ các cơ thể sống khác nhau của động vật, thực vật, vi sinh vật [32]. Enzym trong cơ thể sinh vật với chức năng là xúc tác chọn lọc, đóng vai trò định hướng tất cả mọi phản ứng xảy ra trong tế bào. Khi ở ngoài tế bào nhiều enzym vẫn có khả năng hoạt động tương tự [34]. 1.2.1.2. Chất ức chế enzym Chất ức chế enzym là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzym. Các chất ức chế có bản chất hóa học rất khác nhau, có thể là các ion hóa kim loại, các anion, các hợp chất hữu cơ phân tử nhỏ hoặc là protein. Chất ức chế có thể có phản ứng thuận nghịch hoặc không thuận nghịch với enzym. Thường phân biệt hai loại ức chế thuận nghịch, ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh [35]. 1.2.2. Tổng quan về enzym α-glucosidase 1.2.2.1. Danh pháp và phân loại Enzym α-glucosidase (EC 3.2.1.20) còn có những tên gọi khác như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase glucoamylase, α- glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucoside hydrolase, α-1,4-glucosidase, α-D-glucoside glucohydrolase [7]. Enzym α-glucosidase là một enzym một thành phần, có hoạt tính exohydrolysis, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α-1,4-glycoside ở đầu tận cùng không khử của carbohydrate giải phóng các phân tử α-D-glucose. Chất nền đặc trưng của enzym α-glucosidase là các disaccharide, oligosaccharide, các aryl- và akyl-α-glucopyranoside khác [30]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  20. Enzym α-glucosidase là một trong những enzym thuộc lớp glycoside hydrolase. Glycoside hydrolase là một lớp các enzym thường tách liên kết glycoside giữa 2 phân tử carbohydrate, một trong những liên kết mạnh nhất được tìm thấy ở các polymer tự nhiên. Các enzym này có khả năng bẻ gãy các liên kết glycoside nhanh hơn 1017 lần so với phản ứng không có enzym xúc tác [12]. 1.2.2.2. Cơ chế xúc tác Chúng ta biết rằng carbohydrat chứa trong thức ăn là nguồn cung cấp chất đường cho cơ thể. Sau khi vào cơ thể, những carbohydrat được thủy phân thành những phân tử đường đơn bởi những enzym trong ruột non và các phân tử đường này được tỏa ra nuôi các tế bào cơ thể [21]. Tiến trình phân hóa này đòi hỏi tụy phải tiết ra α-amylase dùng để phá vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành oligosaccharid, màng tế bào ruột non lại tiết ra α-glucosidase để tiếp tục phân hóa các oligosaccharide thành các phân tử đường đơn rồi mới thẩm thấu vào máu. Chức năng chính của enzym này là xúc tác cho việc cắt đứt liên kết 1,4-α-D-glucosid của cơ chất để giải phóng ra α-D-glucose [21]. Bằng cách kiềm chế sự hoạt động của enzym α-glucosidase, có thể làm giảm sự thủy phân của carbohydrat và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào máu [12]. 1.2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym α-glucosidase a. Các chất tổng hợp Acarbose và miglitol đang được sử dụng rộng rãi như thuốc điều trị đái tháo đường type 2. Cơ chế hoạt động của các thuốc này là ức chế enzym α- glucosidase ở ruột. Cụ thể chất ức chế α-glucosidase là các saccharide hoạt động như chất ức chế sự cạnh tranh của các enzym cần thiết để tiêu hóa carbohydrate, đặc biệt là enzym α-glucosidase. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
  21. Hình 1.1. Cấu trúc phân tử Acarbose b. Các chất tự nhiên Hiện nay, người ta đã tìm ra một số các hợp chất ức chế enzym α- glucosidase như: flavonoid, anthocyanidin, isoflavone, phenolic, curcuminoids, terpinoid Việc tìm kiếm các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên đang rất được quan tâm trên toàn thế giới, khi mà các hợp chất hóa học đang có một nhược điểm là để lại nhiều tác dụng phụ [21]. Bảng 1.1. Các hợp chất tự nhiên ức chế enzym α-glucosidase [22] STT Nhóm hợp chất Tên hoạt chất Quercetin 3-O-β -d-xylopyranosyl (1′′′→2″)- β – dgalactopyranoside Luteolin, Apigennin Hesperetin 1 Flavonoid (+)-catechin Cyanidin-3-galactoside Cyanidin-3- galactoside 2R,3R,4R,5R)2,5-bis(hydroxymethyl)-3,4- dihydroxypyrrolidine 1-deoxynojirimycin @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
  22. 3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic axit Axit 28-O-α-larabinopyranosyl-(1→4)-α-l- 2 Alcaloid arabinopyranosyl-(1→3)- β -d- xylopyranosyl-(1→4)-α-lrhamnopyranosyl- (1→2)-β -d-fucopyranosyl ester, 3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic axit Axit 28-O-α-larabinopyranosyl-(1→4)-α-l- 3 Saponin-triterpenoid arabinopyranosyl-(1→3)- β -d- xylopyranosyl-(1→4)-α-lrhamnopyranosyl- (1→2)-β -d-fucopyranosyl ester, Curcumin 4 Curcuminoid Demethoxycurcumin Bisdemethoxycurcumin Bromophenols 5 Miscellaneous 2,4,6-tribromophenol 2,4- dibromophenol Chebulanin Chebulagic axit 6 Phenolic Chebulinic axit (-)-3- O-galloylepicatechin (-)-3-O-galloylcatechin 1.2.3. Tổng quan về enzym PTP1B (protein tyrosine phosphatase 1B) 1.2.3.1. Danh pháp và phân loại PTP1B (EC 3.1.3.48) là tên viết tắt của protein tyrosin phosphatase 1B. Đây là một enzym thuộc phân họ pTyr PTP cổ điển - một trong bốn phân họ của siêu họ enzym Protein Tyrosin Phosphatase [18]. 1.2.3.2. Cấu trúc PTP1B là protein chứa 435 axit amin, trong đó vùng xúc tác từ axit amin 30 đến axit amin 278. Đầu tận C kị nước chính là vị trí để enzym gắn vào bề mặt lưới nội chất. Đặc điểm cấu trúc đặc trưng của PTP1B là vòng xúc tác gồm đơn phân xúc tác Cys215, vòng WPD (tryptophan, prolin, axit aspartic) và vị trí liên kết aryl-phosphat thứ cấp [24]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
  23. Trung tâm hoạt động của PTP1B có cấu trúc phổ biến như của các PTP nói chung. Vị trí xúc tác cơ bản được xác định từ axit amin 214-221 (His- CysSer-Ala-Gly-Ile-Gly-Arg) - đây là vòng của 8 axit amin có cấu trúc bền vững, giúp phối hợp với gốc aryl-phosphat của cơ chất. Vòng này cũng chứa vị trí ái nhân Cys215. Bốn vòng khác tạo thành các cạnh của khe xúc tác góp phần vào quá trình xúc tác và nhận diện cơ chất (Asp181, Phe182, Tyr46, Val49, Lys120 và Gln262). Chiều sâu của khe xúc tác là 8-9Å cho cơ chất đặc hiệu [29]. Vòng WPD, sự thay đổi hình dạng của PTP1B liên quan đến hoạt động xúc tác của enzym khi liên kết với cơ chất. Vòng WPD (axit amin 79-187) di chuyển tới 12Å để đóng vòng phenyl của cơ chất, làm tăng tương tác kị nước. Asp181 di chuyển tới vị trí mà nó có thể hoạt động giống một axit phổ biến để chuyển proton cho nhóm tyrosyl rời đi. Arg221 cũng thay đổi vị trí để tối ưu hóa tương tác “cầu muối” với cơ chất phosphat. Trong quá trình chuyển dạng này, Cys215 là vị trí liên kết ái nhân vào nguyên từ phospho của cơ chất. Vì vậy tác nhân ức chế PTP1B có thể tác động vào cả quá trình chuyển dạng “mở” và “đóng” của PTP1B [29]. Vị trí liên kết aryl-phosphat thứ cấp: đây là vị trí xúc tác không hoạt động, tạo ra liên kết yếu hơn so với vị trí hoạt động cơ bản do tiếp xúc với môi trường nhiều hơn. Tuy nhiên vị trí này quan trọng trong thiết kế tác nhân ức chế PTP1B [29]. 1.2.3.3. Cơ chế xúc tác Vùng xúc tác có chứa 3 tiểu phân (cystein, aspatat và glycin) – là 3 axit amin cần thiết cho quá trình xúc tác. Giai đoạn 1: Đoạn peptid có chứa phosphotyrosin đi vào vị trí. Tiểu phân aspatat có vai trò cho proton (gốc phenolat là nơi nhận và nó cũng là nhóm rời khỏi cấu trúc cơ chất). Giai đoạn 2: Khi gốc phosphat đã được chuyển đến gốc cystein, cơ chất rời khỏi enzym và bước cuối cùng là sự thủy phân gốc phosphat. Sự liên hợp của một phân tử nước và glycin giúp sự thủy phân gốc phosphat xảy ra dễ dàng hơn. Khi gốc phosphat rời khỏi, vị trí hoạt động sẵn sàng để tiếp tục xúc @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
  24. tác cho phản ứng tiếp theo. Trong quá trình đó, gốc phosphat ở cơ chất đầu tiên được chuyển đến tiểu phân cystein ở vị trí xúc tác trước khi bị thủy phân bởi nước để giải phóng anion phosphat [31]. 1.2.3.4. Vai trò của enzym PTP1B trong điều trị đái tháo đường Insulin là hormon do tế bào beta đảo tụy tiết ra, có vai trò quan trọng trong việc duy trì nồng độ glucose máu và điều hòa quá trình chuyển hóa carbohydrat, lipid và protein. Insulin tạo ra được tác dụng sinh học khi gắn vào thụ thể của nó ở các mô đích (mô cơ, mô gan, mô mỡ) và dẫn đến một loạt các tín hiệu tế bào [36]. Thụ thể insulin (IR) (KLPT 340.000), được cấu tạo bởi hai tiểu đơn vị (α và β) có bản chất glycoprotein. Tiểu đơn vị β có hoạt tính tyrosin kinase. Khi insulin liên kết với IR làm thay đổi hình dạng của IR, hoạt hóa hoạt tính kinase, gây ra sự tự phosphoryl hóa tiểu đơn vị β. Sự hoạt hóa IR làm phosphoryl hóa một số cơ chất protein phía dưới bao gồm cơ chất của insulin receptor (IRS) và một số protein khác, gây ra tác dụng sinh học của insulin [39]. Một trong những chìa khóa của tín hiệu insulin là phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K). Hoạt hóa PI3K giúp hoạt hóa PI3K-dependent kinase 1 (PDK1), tiếp theo là hoạt hóa protein kinase (Akt). Akt rất cần thiết cho vận chuyển glucose vào tế bào và tổng hợp glycogen. Nồng độ glucose máu ổn định là kết quả của sự cân bằng giữa quá trình phosphoryl hóa tyrosin bởi protein tyrosin kinase và quá trình khử phosphoryl tyrosin bởi các protein tyrosin phosphatase (PTP) [40]. Một trong những cơ chế của đái tháo đường type 2 là tình trạng kháng insulin, ảnh hưởng đến sự vận chuyển và chuyển hóa glucose ở gan, cơ và mô mỡ [43]. Ở cấp độ tế bào, kháng insulin biểu hiện ở sự giảm đáp ứng với một số lượng cực đại của insulin hoặc giảm tính nhạy cảm với sự kích thích vận chuyển glucose và chuyển hóa. Mặc dù khiếm khuyết ở phân tử gây nên sự kháng insulin chưa được biết rõ tuy nhiên hầu hết các bằng chứng cho thấy có thể nó liên quan đến sự truyền tín hiệu ở IR. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
  25. Xuất phát từ cơ chế kết thúc con đường truyền tín hiệu của insulin bằng phản ứng khử phosphoryl của IR, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các PTP có liên quan đến tình trạng kháng insulin thông qua tăng hoạt tính hoặc tăng biểu hiện [39]. Trong các PTP, PTP1B được nghiên cứu nhiều hơn cả, nó có vai trò điều hòa âm đối với hoạt động của insulin ở mô đích. PTP1B phân bố khá rộng, bao gồm cả các mô đích chủ yếu của insulin như gan, cơ và mô mỡ. Sự biểu hiện quá mức của PTP1B dẫn đến ức chế IR. PTP1B có khả năng tương tác và di chuyển tyrosin phosphat từ IR. PTP1B cũng có thể khử phosphoryl của protein IRS qua đó làm giảm và gián đoạn quá trình truyền tín hiệu của insulin [18]. Nghiên cứu trên chuột cho thấy rằng, khi bị giảm hoạt tính của PTP1B sẽ làm tăng sự phosphoryl hóa ở IR và IRS-1 ở mô cơ và gan. Kết quả là chuột đột biến mất gen PTP1B tăng nhạy cảm với insulin ở mô cơ và gan cũng như giảm được glucose máu [3]. 1.2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym PTP1B Bên cạnh các yếu tố ảnh hưởng chung đến hoạt tính các enzym, các quá trình ảnh hưởng đặc trưng đến hoạt tính enzym PTP1B gồm quá trình oxy hóa, nitrosyl hóa, sulfurhydro hóa, sumoyl hóa, phosphoryl hóa và quá trình phân giải protein [8]. Quá trình oxy hóa (ROS): tương tự như các enzym khác của phân họ PTP cổ điển, PTP1B dễ bị oxy hóa bởi các nhóm oxy hoạt động có trong môi trường hóa học ở khe xúc tác của nó. Quá trình oxy hóa vị trí hoạt động cystein làm mất tính chất ái nhân và ức chế hoạt động của PTP1B. ROS có chức năng như một đường truyền tín hiệu thứ hai trong tế bào, hoạt hóa RTKs dẫn tới tạo ra H2O2 cần cho sự hoạt hóa receptor và bất hoạt PTP1B. Yếu tố phát triển biểu bì và sự kích thích insulin gây ra sự oxy hóa thuận nghịch PTP1B và làm giảm hoạt tính của nó [8]. Quá trình nitrosyl hóa: giống như ROS, các nhóm nitrogen hoạt động làm bất hoạt PTP1B. Đặc biệt, S-nitrosyl hóa ngăn chặn sự oxy hóa vị trí hoạt động cystein do stress oxy hóa và do đó có tác dụng bảo vệ chống lại sự oxy hóa không thuận nghịch [8]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
  26. Quá trình sulfurhydro hóa: PTP1B bị bất hoạt thuận nghịch bởi hydrogen sulphid nội sinh do đáp ứng với quá trình stress lưới nội chất (ER) thông qua sulfurhydro hóa vị trí hoạt động cystein. Quá trình sulfurhydro hóa PTP1B làm một cơ chế hữu hiệu để điều hòa đáp ứng stress của ER [8]. Quá trình sumoyl hóa: PTP1B bị sumoyl hóa ở hai đơn phân lysin (Lys335 và 347). Đáng chú ý, insulin gây ra sự sumoyl hóa PTP1B, làm giảm hoạt tính của enzym và ức chế tác dụng điều hòa âm của PTP1B trong quá trình truyền tín hiệu của insulin. Hơn nữa sự thay đổi này cũng ảnh hưởng gián tiếp đến sự khử phosphoryl của emerin- một protein phía trong màng nhân điều hòa sự cấu tạo nhân tế bào [8]. Quá trình phosphoryl hóa: PTP1B bị phosphoryl hóa ở đơn phân tyrosin và serin, có thể làm tăng hoặc giảm hoạt tính enzym. Insulin gây ra sự phosphoryl hóa PTP1B tyrosin làm giảm hoạt tính của nó ở cơ xương và mô mỡ của chuột. Thêm vào đó PTP1B cũng bị phosphoryl hóa ở các đơn phân serin trong quá trình phân bào và stress. Hơn nữa sự phosphoryl hóa PTP1B (Ser50) bởi Akt cũng làm giảm hoạt tính xúc tác của enzym và khả năng khử phosphoryl IR, đó có thể là một cơ chế điều hòa dương tính của tín hiệu insulin [8]. Quá trình phân giải protein: trong quá trình hoạt hóa tiểu cầu xảy ra quá trình phân giải gián tiếp PTP1B từ ER, giải phóng enzym hòa tan vào tế bào chất. Sự oxy hóa thuận nghịch PTP1B có thể ảnh hưởng đến sự phân giải protein [8]. 1.2.3.6. Các nghiên cứu về chất ức chế PTP1B a. Các chất tổng hợp: Thiazolidindion (TZD) là 1 thuốc điều trịđái tháo đường type 2 đang được dùng phổ biến trên thế giới với cơ chế làm giảm kháng insulin ở các mô ngoại vi và gan. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh TZD ức chế PTP1B thông qua làm giảm biểu hiện enzym này ở gan và cơ [1]. Một trong những nhóm chất ức chế PTP1B được nghiên cứu đầu tiên và nhiều nhất là các hợp chất diflorophosphonat. Các hợp chất tương tự có phospho như phosphonat, monofluromethyl @ School phosphonat, of Medicine hydroxymethyl and Pharmacy, VNU 18
  27. phosphonat cũng được thử nghiệm khá nhiều. Cơ chế ức chế PTP1B của các hợp chất dạng này được cho là ức chế cạnh tranh với enzym [24]. Các hợp chất của vanadi từ lâu được coi là có triển vọng trong điều trị đái tháo đường ở người. Vanadat và pervanadat là 2 chất ức chế PTP1B được nghiên cứu lâm sàng rộng rãi [3]. Một vấn đề quan trọng trong nghiên cứu tìm kiếm các chất ức chế PTP1B để điều trị đái tháo đường là khả năng ức chế chọn lọc, bởi PTP là 1 họ enzym lớn với nhiều vai trò quan trọng trong cơ thể. Một nhóm chất ức chế PTP1B chọn lọc đã được tìm ra là các dẫn chất bidentat. Đây là những hợp chất phân tử nhỏ, có thể gắn với cả trung tâm hoạt động và vị trí liên kết phosphat thứ cấp đặc trưng của enzym [24]. b. Các hợp chất tự nhiên Bên cạnh việc thiết kế tổng hợp các chất ức chế PTP1B, một hướng đi song song đang được chú ý là tìm kiếm các thảo dược và hợp chất tự nhiên có tác dụng ức chế PTP1B để điều trị đái tháo đường type 2. Nhiều thảo dược sau khi được chứng minh hiệu quả làm giảm glucose máu, cải thiện dung nạp glucose đã được phát hiện cơ chế tác dụng thông qua ức chế PTP1B như : rễ cây dâu, cây nhàu, ngũ vị tử [5] Không chỉ dừng ở việc đánh giá tác dụng của các dịch chiết thảo dược lên hoạt tính PTP1B, nhiều hợp chất phân lập từ thảo dược đã được chứng minh tác dụng ức chế PTP1B in vitro và cả in vivo [9]. Năm 2002, 5 flavonoid bao gồm 8-(1,1-dimethylallyl)-5’-(3-methylbut- 2enyl)-3’,4’,5,7-tetrahydroxyflanvonol; 3’-(3-methylbut-2-enyl)-3’,4’,7- trihydroxyflavan; quercetin; uralenol; broussochalcone A được phân lập từ cây Broussonetia papyrifera được chứng minh tác dụng ức chế PTP1B với IC50 trong khoảng 4,3 - 36,8 μmol/L [5]. Tất cả các hợp chất phân lập được từ thân cây Angelica keiskei đều có tác dụng ức chế PTP1B, trong đó 6 chalcon thể hiện tác dụng ức chế PTP1B mạnh với giá trị IC50 trong khoảng 0,82-2,53 μg/mL [5, 10]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
  28. Dịch chiết từ cây ngũ vị tử (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.) có tác dụng ức chế PTP1B, dịch chiết ether (IC50 = 1,77 ± 0,20 μg/mL) và dịch chiết EtOAc (IC50 = 1,04 ± 0,20 µg/mL) [5]. Các hợp chất phenolic phân lập từ lá cây Cyclocarya paliurus (Batal.) có tác dụng ức chế PTP1B mạnh với IC50 trong khoảng 1,992 ± 0,480 tới 10,50 ± 2,67 µg/mL) [14]. Dịch chiết EtOAc của cây Acanthopanax senticosus (Rupr. & Maxim.) Harms phân lập được hai diphenyl ethers mới và 8 hợp chất đã biết. Tất cả các hợp chất phân lập được đều có tác dụng ức chế PTP1B. Trong đó 2 hợp chất mới ức chế PTP1B với IC50 trong khoảng từ 9,2 ± 1,4 đến 12,6 ± 1,2 µM [11]. Tại Việt Nam, một số thảo dược đã được chứng minh tác dụng ức chế PTP1B và song song là tác dụng điều trị đái tháo đường type 2 như rễ cây chóc máu, giảo cổ lam [5] 1.3. Đặc điểm thực vật, phân bố của cây ổi tại Việt Nam 1.3.1. Vị trí phân loại thực vật Cây ổi thuộc loài Psidium guajava L., chi Psidium L., họ Sim (Myrtaceae), bộ Sim (Myrtales), phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [42]. 1.3.2. Phân bố Cây ổi thuộc Họ Sim (Myrtaceae) có khoảng 3.000 loài, phân bổ trong 130-150 chi. Chúng phân bổ rộng khắp ở vùng nhiệt đới, ôn đới ấm áp trên thế giới. Chi Ổi (Psidium) có nguồn gốc ở Trung và Nam Mỹ với khoảng 100 loài cây bụi. Hiện nay cây ổi được trồng nhiều ở các nước thuộc Châu Phi, Nam Á, Đông Nam Á, vùng Caribbean, cận nhiệt đới của Bắc Mỹ, và Úc [2]. Ở Việt Nam cây ổi thường (Psidium guajava L.) được phát triển trên khắp cả nước từ đồng bằng ven biển cho đến vùng núi có độ cao khoảng 1500 m trở xuống [2]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
  29. 1.3.3. Đặc điểm thực vật Ổi hay còn gọi là ủi, phan thạch lựu là cây thân gỗ sống lâu năm, thân phân cành nhiều, cao 4-6 m, cao nhất 10 m, đường kính thân tối đa 30 cm. Thân cây chắc, khỏe, ngắn. Thân nhẵn nhụi, vỏ già có thể tróc ra từng mảng, vỏ mới nhẵn, màu xám, hơi xanh [33]. Cành non 4 cạnh, khi già mới tròn dần. Rễ ổi là rễ cọc, bộ rễ chính ăn sâu xuống đất tận 3 - 4 m và hơn. Lá đơn, mọc đối, không có lá kèm. Phiến lá hình bầu dục, gốc thuôn tròn, đầu có lông gai hoặc lõm, dài 11-16 cm, rộng 5-7 m, mặt trên màu xanh đậm hơn mặt dưới. Lá non có đường viền màu hồng tía kéo dài đến tận cuống lá, phủ lông trắng nhạt, vị chát [25]. Gân lá hình lông chim, gân giữa nổi rõ ở mặt dưới. Cuống lá màu xanh, hình trụ dài 1-1,3 cm, có rãnh cạn ở mặt trên. Hoa trắng to, lưỡng tính, mọc từng chùm 2, 3 chiếc, ít khi ở đầu cành mà thường ở nách lá, 4 – 5 lá đài, 4 – 5 cánh hoa, rất nhiều nhị, bầu dưới 5 ô [17]. Quả hình tròn, hình trứng hay hình quả lê, dài 3-10cm. Vỏ quả còn non màu xanh, khi chín chuyển sang vàng, thịt vỏ quả màu trắng, vàng hay ửng đỏ. Ruột trắng, vàng hay đỏ. Quả chín có vị chua ngọt hay ngọt và có mùi thơm đặc trưng. Hạt nhiều, màu vàng nâu hình đa giác, có vỏ cứng và nằm trong khối thịt quả màu trắng, hồng, đỏ vàng [45]. Cây ổi có thể phát triển trong giới hạn nhiệt độ từ 15,5°C đến 32°C. Ổi là cây ưa sáng, thích khí hậu ẩm. Ổi trồng được ở nhiều loại đất, pH thích hợp từ 4,5 đến 8,2 [42]. 1.3.4. Thành phần hóa học Theo nghiên cứu của đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh cho biết, trong lá ổi có chứa [5]: - Tanin (7-10%) gồm gallotanins, axit ellagic. - Tinh dầu (0,31%) trong đó có aromadendrene, beta-bisabolene, caryophyllene, nerolidiol, selinene, dl limonene, các ancol thơm - Các axit hữu cơ gồm axit mastinic, axit aleanolic, axit oxalic, axit guaijavolic, axit guajanoic, axit crategolic, axit psidiolic, axit ursolic. - Sterols có beta-sitosterol. - Flavonoid gồm quercetin, leucocyanidin, avicularin, guaijaverin. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
  30. - Lá non và búp non có khoảng 7-10% tanin loại pyrogallic và 3% nhựa. 1.3.5. Tác dụng và công dụng Theo Y học cổ truyền, lá ổi có vị đắng, tính ấm, có tác dụng tiêu thũng giải độc, thu sáp chỉ huyết; quả ổi vị ngọt hơi chua sáp, tính ấm, có công dụng thu liễm, kiện vị cố tràng; các bộ phận của cây ổi thường được dùng để chữa các chứng bệnh như tả (đi lỏng), cửu lỵ (lỵ mạn tính), viêm dạ dày ruột cấp tính và mạn tính, thấp độc, thấp chẩn, sang thương xuất huyết, tiêu khát (tiểu đường), băng huyết [5] Beta-sitosterol trong lá ổi đã được sử dụng làm thuốc để điều trị cholesteron cao và các bệnh tim mạch. Theo FDA, các thực phẩm có chứa các este sterol thực vật như beta-sitosterol có tác dụng giảm nguy cơ mắc các bệnh mạch vành [42]. Quercetin được biết đến như một chất chống oxi hóa mạnh, chống viêm hay giúp làm giảm cholesteron[25]. Avicularin, guaijaverin có tác dụng ức chế tụ cầu [44]. Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của Beta-sitosterol @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
  31. Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của Quercetin [25] Hình 1.4. Cấu trúc phân tử của Guaijaverin [45] Hình 1.5. Cấu trúc phân tử của Avicularin [45] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  32. Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Lá ổi tươi được thu hái vào tháng 10 năm 2018 ở Long Biên, Hà Nội. Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật học bởi Bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.1.2. Chuẩn bị mẫu Lá ổi tươi được rửa sạch, sấy khô ở 75-80°C, nghiền nhỏ. Lá khô (1,04kg) chiết với Ethanol 96% (3,24L x 3 lần) bằng phương pháp ngấm kiệt. Dịch chiết được lọc và gộp lại, cô dịch chiết bằng máy cô quay chân không thu được cao Ethanol toàn phần (350g). Lấy 30g cao toàn phần phân tán trong 350 mL nước cất rồi chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan, EtOAc, BuOH (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 350mL). 2.1.3. Hóa chất và thiết bị 2.1.3.1. Hóa chất Enzym Yeast α-glucosidase (Sigma, Singapore); p-Nitrophenyl-α-D- glucopyranoside (pNPG) (Sigma, Singapore); 4-Nitrophenol (Sigma, Singapore); p-Nitrophenyl phosphate (pNPP) (Sigma, Singapore); enzym PTP1B (Sigma, Singapore); 1, 1-Diphenyl –2-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma, Singapore); Axit ursolic (Himedia, Ấn độ). Dung môi: n – Hexan, Ethyl acetat (EtOAc), n – Buthanol (n-BuOH), Ethanol 96% (EtOH) (Shouguang, Trung Quốc) và nước cất. 2.1.3.2. Thiết bị Cân phân tích AY 129 (Shimadzu, Nhật Bản). Máy cô quay chân không Rovapor R- 210 (Buchi- Đức). Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal. Pipet, bình định mức, cối xứ, giấy lọc (đường kính 11 cm), phễu lọc. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  33. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro Dưới tác dụng của enzym α-glucosidase, cơ chất p-nitrophenyl-α-D- glucopyranosid (PNP-G) bị thủy phân tạo ra α-D-glucose và p-nitrophenol (PNP). Nồng độ p-nitrophenol sẽ thỉ lệ thuận với hoạt độ của enzym α- glucosidase. Nồng độ p-nitrophenol tạo thành trong dung dịch được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 405nm. Dựa vào độ hấp thụ màu của mẫu thử và mẫu chứng ở 405nm để đánh giá hoạt tính của enzym α-glucosidase. OH O OH OH HO α-glucosidase HO O OH HO O HO OH OH NO2 O2N p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid p-nitrophenol α-D-glucose (PNP-G) Hình 2.1. Phản ứng thủy phân PNP-G dưới tác dụng của enzym α- glucosidase [7] 2.2.1.1. Phương pháp tiến hành Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của hoạt chất nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp của Moradi-Afrapoli F và cộng sự [21]. Cụ thể như sau: - Chất thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng trong đệm phosphate 10 mM (pH 6.8) và 50 l được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 256 g/ml, 64 g/ml; 16 g/ml; 4 g/ml. - 20 µl α- glucosidase (0,5U/ml) và 130 µl đệm phosphate 100 mM (pH 6.8) được thêm vào mỗi giếng, trộn đều và ủ ở 37oC trong 15 phút. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
  34. - Cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) được đưa tiếp vào từng giếng thí nghiệm rồi ủ tiếp ở 37oC trong 60 phút. - Đĩa thí nghiệm chỉ có mẫu thử, đệm phosphate và pNPG được sử dụng làm đối chứng trắng (blank). Giếng thí nghiệm chỉ có DMSO 10%, đệm phosphate, enzym và pNPG được sử dụng làm đối chứng. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo sự chính xác. - Dừng thí nghiệm bằng cách thêm vào 80 µl Na2CO3 0,2M và đo OD ở bước sóng 405nm bằng máy đo ELISA Plate Reader (Bio-Rad). - Khả năng ức chế enzym α- glucosidase của mẫu thử được xác định theo công thức sau: % ức chế = 100 - (Amẫu thử/ A đối chứng *100) Trong đó: A đối chứng = OD đối chứng - OD blank Amẫu thử = ODmẫu thử - OD blank mauthu 2.2.1.2. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thực nghiệm được tổng hợp và phân tích xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4. 2.2.2. Đánh giá khả năng ức chế enzym PTP1B in vitro Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym PTP1B được tiến hành ở 30°C. Dưới tác dụng của PTP1B, cơ chất p-nitrophenyl phosphate (pNPP) bị phosphoryl hóa tạo ra p-nitrophenol (PNP). Nồng độ p-nitrophenol tạo thành trong dung dịch được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 405nm. Khi có mặt chất ức chế, nồng độ PNP sẽ giảm, dựa vào sự chênh lệch nồng độ giữa mẫu thử và mẫu chứng, có thể xác định được nồng độ enzym PTP1B [5]. 2.2.2.1. Phương pháp tiến hành Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym PTP1B được tiến hành theo phương pháp được mô tả bởi Hung và cộng sự, có thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [6]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  35. Cơ chất là p-nitrophenyl phosphate (pNPP) được sử dụng trong thí nghiệm. Dung dịch đệm gồm có 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic axit), và 50 mM citrate (pH 6.0). Thí nghiệm được tiến hành bằng cách thêm 10 L dung dịch mẫu thử vào 20 L dung dịch enzym PTP1B (1 g/ml), và trộn đều với 40 L pNPP 4 mM trong 130 L dung dịch đệm trong đĩa 96 giếng. Ủ ở 37oC trong vòng 30 phút, sau đó thêm 10 L NaOH 1M để dừng phản ứng. Đo lượng p-nitrophenol sinh ra bằng cách đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 405 nm. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Axit ursolic được sử dụng làm chứng dương. Phần trăm ức chế hoạt độ enzym PTP1B (% I) được tính theo công thức: Trong đó: I% phần trăm hoạt tính PTP1B bị ức chế Ac : độ hấp thu của mẫu chứng (không chứa 10 µL dung dịch thử) At : độ hấp thu của mẫu thử Ao : độ hấp thu của mẫu trắng 2.2.2.2. Xử lý số liệu Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê sử dụng phần mềm SigmaPlot 10 (Systat Software Inc, Mỹ). Số liệu được biểu diễn dưới dạng X ± SD. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
  36. Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả chiết xuất và phân đoạn dịch chiết lá ổi Lá ổi (1kg) sau khi được sấy khô, nghiền nhỏ, và chiết với Ethanol 96% thu được 350g cao toàn phần. Lấy 30g cao toàn phần thu được đem chiết phân đoạn với n-Hexan, EtOAc, n-Buthanol thu được ba loại cao phân đoạn gồm: 8,31g cao n-Hexan; 2,43g cao EtOAc; 18,12g cao n-Buthanol. Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn lá ổi @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  37. 3.2. Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ lá ổi được thử nghiệm tại các nồng độ 128; 32; 8; 2 µg/mL. Để tăng tính chính xác, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Acarbose được sử dụng như chất đối chứng dương. Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng ức chế enzym của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ, được thể hiện trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cao chiết toàn phần, các phân đoạn dịch chiết lá ổi và Acarbose ức chế tại các nồng đ Giá trị STT Mẫu (µg/ml) IC50 128 32 8 2 (g/ml) Cao chiết tổng 1 98,73 97,56 96,69 45,13 2,20 EtOH Phân đoạn n- 2 90,84 90,11 81,58 42,09 2,53 Hexan 3 Phân đoạn EtOAc 96,08 95,19 94,40 44,21 2,24 4 Phân đoạn BuOH 99,86 98,05 97,42 46,17 2,16 Chất đối chứng Acarbose 139,52 Bảng 3.1 tóm tắt giá trị IC50 của cao chiết toàn phần, các phân đoạn dịch chiết và Acarbose. Tác dụng ức chế α-glucosidase của các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ. Kết quả nghiên cứu cho thấy cao toàn phần EtOH, phân đoạn n-Hexan, phân đoạn EtOAc và phân đoạn BuOH đều có tác dụng ức chế α-glucosidase cao với giá trị IC50 lần lượt là 2,20; 2,53; 2,24 và 2,16 µg/mL; so với chứng dương Acarbose có IC50 là 139,52 µg/mL. Đặc biệt, phân đoạn BuOH cho thấy khả năng ức chế khá tốt tại nồng độ 128 µg/ml (99,86%) và 32 µg/ml (98,05%). Cao chiết toàn phần cho thấy tác dụng ức chế khả quan tại 128 µg/ml (98,73%). Hai phân đoạn EtOAc và n-Hexan @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
  38. có tác dụng ức chế yếu hơn tại nồng độ 128 µg/ml. (96,08% và 90,84%). Chất đối chứng dương acarbose hoạt động ổn định trong thí nghiệm. 3.3. Tác dụng ức chế enzym PTP1B in vitro Tác dụng ức chế enzym PTP1B của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ lá ổi được thử nghiệm tại các nồng độ 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25 µg/mL. Để tăng tính chính xác, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Axit usolic được sử dụng như chất đối chứng dương (bảng 3.3). Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng ức chế enzym của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ, được thể hiện trong bảng 3.2. Bảng 3.2. Tác dụng ức chế enzym PTP1B của cao chiết toàn phần, các phân đoạn dịch chiết lá ổi Nồng đ Phần trăm ức chế (I%) (µg/mL) EtOH n-hexan EtOAc n-BuOH 1000 96,68 87.58 98.21 99.67 500 83.36 76.38 85.48 89.24 250 66.29 56.12 72,35 76,97 125 46,54 33,74 52,68 56,13 62,5 29,67 14,36 30,67 35,61 31,25 15,34 7,75 18,36 20,64 LogIC50 2,13 2,31 2,08 1,99 IC50 134,89 204,17 120,22 97,72 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
  39. Bảng 3.3. Tác dụng ức chế enzym PTP1B của axit ursolic. Nồng đ Phần trăm ức chế (I%) (µg/mL) Axit ursolic 100 98,4 50 89,6 25 56,39 12,5 39,57 6,25 26,3 3,125 18,69 IC 19,7 50 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym PTP1B của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết lá ổi 120 100 ế 80 c ch c 60 EtOH Ứ n-Hexane 40 EtOAc BuOH 20 0 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 Log (Nồng đ ) (μg/mL) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
  40. Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym PTP1B của axit ursolic 120 100 80 ế c ch c 60 Ứ 40 Axit ursolic 20 0 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 Log (Nồng đ ) (μg/mL) Bảng 3.2 và bảng 3.3 tóm tắt giá trị IC50 của dịch chiết toàn phần, các phân đoạn dịch chiết và axit ursolic. Tác dụng ức chế PTP1B của các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ. Phân đoạn dịch chiết EtOAc và BuOH cho thấy có khả năng ức chế cao nhất với IC50 là 120,23 và 97,72 µg/mL so với chứng dương axit ursolic là 19,7 µg/mL. Phân đoạn n-Hexan có tác dụng ức chế enzym PTP1B thấp nhất với IC50 là 204,17 µg/mL. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
  41. Chƣơng 4: BÀN LUẬN Hiện nay, đái tháo đường type 2 đang trở thành một bệnh lý phổ biến nhất trên toàn thế giới, chiếm 90% tổng số tất cả các các ca mắc tiểu đường và có tỷ lệ tử vong cao. Bệnh đái tháo đường type 2 là bệnh lý chuyển hóa mạn tính với nhiều biến chứng nguy hiểm trên hầu hết các cơ quan như tim, thận, mạch máu, [41] Các biến chứng của bệnh tiểu đường có thể để lại nhiều di chứng như mù mắt hay phải cát cụt chi. Bệnh đái tháo đường type 2 và các biến chứng của nó gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến cuộc sống của người bệnh và giờ đây càng nguy hiểm hơn khi độ tuổi mắc bệnh đang dần trẻ hóa [16]. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đang nỗ lực để tìm ra những loại thuốc mới để điều trị hiệu quả bệnh đái tháo đường type 2, nhằm hạn chế các biến chứng và nâng cao chất lượng cuộc sống cho người bệnh. Các nhà khoa học hiện nay đang dần chuyển sang nghiên cứu các loại thuốc có nguồn gốc thảo dược vì chúng an toàn và ít tác dụng phụ, một trong số đó là những thuốc có khả năng ức chế enzym α-glucosidase và PTP1B [13, 15]. Ổi là một loại cây đã xuất hiện từ rất lâu và phổ biến trên toàn thế giới. Các bộ phận của cây ổi đều có tác dụng nhất định trong đó lá và quả ổi được sử dụng nhiều nhất. Từ xa xưa lá và quả ổi đã được sử dụng với nhiều mục địch khác nhau tại nhiều vùng miền trên thế giới cho tới nay. Quả ổi làm thực phẩm vừa có thể làm thuốc chữa bệnh. Lá ổi theo y học cổ truyền có vị đắng, tính ấm, có tác dụng tiêu thũng giải độc, thu sáp chỉ huyết [5]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các hợp chất trong lá ổi có khả năng kháng khuẩn, chống oxi hóa, giảm cholesteron [17]. Lá ổi có tiềm năng sẽ trở thành một nguyên liệu mới trong sản xuất các thuốc có nguồn gốc tự nhiên dùng để điều trị nhiều bệnh trong đó có đái tháo đường type 2. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh được tác dụng ức chế enzym α-glucosidase và PTP1B của các phân đoạn dịch chiết từ lá ổi, làm tiền đề cho sự nghiên cứu sâu hơn về loại lá đầy triển vọng này. Enzym α-glusidase là enzym nằm trong màng đường ruột, tham gia vào bước cuối của quá trình tiêu hóa, enzym này xúc tác cho quá trình phân hủy các đường disaccaride như sucrose hay maltose thành nomosaccharide như glucose [20]. Do đó, các chất ức ch @ế α School-glusidase sofẽ cóMedicine vai trò quan and trọng Pharmacy, VNU 33
  42. trong điều trị bệnh tiểu đường. Acarbose, voglibose, miglitol là chất ức chế α- glusidase đã được sử dụng làm thuốc điều trị đái tháo đường type 2 nhưng các chất này để lại nhiều tác dụng không mong muốn như đau bụng , tiêu chảy, [22]. Trong nghiên cứu này, kết quả cho thấy tác dụng ức chế enzym của các phân đoạn dịch chiết lá ổi khá khả quan, đặc biệt là phân đoạn BuOH với IC50 là 2,16. Các phân đoạn còn lại cũng cho thấy khả năng ức chế khá tốt mặc dù còn nhiều tạp chất. Đái tháo đường type 2 có liên quan tới đề kháng insulin và được dự đoán là do suy giảm các tín hiệu từ các thụ thể insulin [26]. Các nghiên cứu cho thấy PTP1B là enzym điều hòa ngược tín hiệu insulin quan trọng Để kết thúc tín hiệu, insulin cần khử phospho của phân tử IRβ và các phân tử sau đó. Enzym PTP1B tăng hoạt động hoặc được biểu hiện sẽ làm tăng quá trình khử phospho hóa IRβ và làm giảm tín hiệu insulin, và kháng insulin [27]. Vì vậy, về lý thuyết, PTP1B giảm hoạt động sẽ làm tăng độ nhạy insulin. Các hợp chất ức chế PTP1B có tiềm năng trong điều trị bệnh đái tháo đường type 2 và béo phì. Các hợp chất trong lá ổi gồm có: morin flavonoid, morin-3-O- lyxosyde, morin-3-O-arabinoside, quercetin, quercetin-3-O-arabinoside, glycosides, alkaloids, saponins và tritecpenoid [32]. Nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của cây ổi trên thế giới đã được công bố. Nghiên cứu của Haseena Banu và cộng sự cho thấy dùng theo đường uống cao chiết lá ổi với liều 300 mg/kg thể trọng có tác dụng hạ đường huyết trên chuột bị gây tiểu đường do streptozotocin. Kết quả cụ thể của nhóm nghiên cứu này cho thấy cao chiết lá ổi có tác dụng hạ glucose máu, nồng độ HbA1c và làm tăng đáng kể lượng insulin trong huyết tương, cải thiện hoạt tính của các enzym chuyển hóa carbohydrate như hexokinase, pyruvate kinase. Một nghiên cứu khác cũng cho thấy cao chiết nước của lá ổi (250 mg/kg) cho thấy tác dụng hạ đường huyết đáng kể trên mô hình chuột bị tiểu đường do hợp chất alloxan gây ra. Nếu tiêm màng bụng dịch chiết lá ổi (10 mg/kg) thì có khả năng ức chế tác dụng của protein tyrosine phosphatase 1B ở chuột bị tiểu đường do bị loại gen Lepr(db)/Lepr(db). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
  43. Nghiên cứu long-term trên chuột được cho uống cao chiết nước hoặc ethanol lá ổi làm tăng nồng độ insulin huyết tương và vận chuyển glucose vào cơ quan dự trữ như gan, cơ và làm tăng hoạt tính của các enzym hexokinase, phosphofructokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase trên chuột bị tiểu đường. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy cơ chế tác dụng trong hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường của lá ổi thông qua tác dụng ức chế enzym glucosidase và enzym Protein Tyrosin Phosphatase 1B. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
  44. Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Nghiên cứu đã đánh giá được tác dụng ức chế enzym α-glucosidase và PTP1B của các phân đoạn dịch chiết lá ổi. Các cao chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết lá ổi có tác dụng ức chế α-glucosidase cao. Đặc biệt, phân đoạn cao BuOH cho thấy tác dụng ức chế enzym α-glucosidase hiệu quả với IC50 là 2,16 g/mL. Ngoài ra, hai phân đoạn EtOAc và BuOH cũng thể hiện tác dụng ức chế enzym protein tyrosine phosphatase 1B với IC50 lần lượt là 120,22 g/mL và 97,72 g/mL. KIẾN NGHỊ Kết quả này có ý nghĩa trong việc định hướng nghiên cứu sâu hơn về các thành phần hóa học có trong dịch chiết lá ổi đặc biệt là phân đoạn EtOAc, BuOH nhằm phát hiện các hợp chất có tác dụng trong điều trị đái tháo đường type 2. Nghiên cứu tách chiết, phân lập, tinh chế các hợp chất trong các phân đoạn dịch chiết lá ổi để nghiên cứu sâu hơn về tác dụng điều trị đái tháo đường type 2 và một số rối loạn khác trong cơ thể. Lá ổi là một loại lá cây phổ biến hầu khắp trên thế giới, việc tận dụng được nguồn tài nguyên tiềm năng này không những cải thiện chất lượng cuộc sống của những người bệnh mà còn giúp giảm đi gánh nặng chi phí điều trị cho người bệnh. Theo đó, gánh nặng về kinh tế cho xã hội cũng sẽ được giảm nhẹ, đem lại một cuộc sống tốt đẹp hơn. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
  45. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Đông Thị Hoài An and e. al., Hóa sinh Y học. ĐH Y Dược tp.HCM: Nhà xuất bản y học, 2010. [2] Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam: Nhà xuất bản Y học, 1999. [3] Hà Thị Liên, "Nghiên cứu tính đa hình đơn nucleotide tại intron 1 và sự liên quan của gen FTO với bệnh đái tháo đường týp 2 ở người từ 40 đến 64 tuổi," Luận văn Thạc sỹ Khoa học 2013. [4] D. T. T. B., NguyễnT. K., Đặng T. B. T.,Lại T. P. Q.,Trần Q. K., Nội tiết học. Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh: nhà xuất bản Y Học, 2006. [5] Nguyễn Thị Huyền, "Nghiên cứu tác dụng ức chế PTP1B in vitro của cao và một số chất phân lập từ dịch ép thân cây chuối tiêu (musa paradisiaca L.)," Khóa luận Dược sĩ 2016. TIẾNG ANH [6] C. O. Arregui, A. Gonzalez, J. E. Burdisso, and A. E. Gonzalez Wusener, "Protein tyrosine phosphatase PTP1B in cell adhesion and migration," Cell Adh Migr, vol. 7, pp. 418-23, Sep-Oct 2013. [7] I. S. Arsiningtyas, M. D. Gunawan-Puteri, E. Kato, and J. Kawabata, "Identification of alpha-glucosidase inhibitors from the leaves of Pluchea indica (L.) Less., a traditional Indonesian herb: promotion of natural product use," Nat Prod Res, vol. 28, pp. 1350-3, 2014. [8] V. M. Balaramnavar, R. Srivastava, N. Rahuja, S. Gupta, A. K. Rawat, S. Varshney, et al., "Identification of novel PTP1B inhibitors by pharmacophore based virtual screening, scaffold hopping and docking," Eur J Med Chem, vol. 87, pp. 578-94, Nov 24 2014. [9] S. Begum, S. I. Hassan, and B. S. Siddiqui, "Two new triterpenoids from the fresh leaves of Psidium guajava," Planta Med, vol. 68, pp. 1149-52, Dec 2002. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  46. [10] S. Begum, S. I. Hassan, B. S. Siddiqui, F. Shaheen, M. N. Ghayur, and A. H. Gilani, "Triterpenoids from the leaves of Psidium guajava," Phytochemistry, vol. 61, pp. 399-403, Oct 2002. [11] S. Begum, B. S. Siddiqui, and S. I. Hassan, "Triterpenoids from Psidium guajava leaves," Nat Prod Lett, vol. 16, pp. 173-7, Jun 2002. [12] C. C.W., "Yeast α-glucosidase inhibition by isoflavones from plants of Leguminosae as an in vitro alternative to acarbose," Journal of agricultural and food chemistry, vol. 58, pp. 9988-9991, 2010. [13] Y. Cheng, M. Zhou, C. H. Tung, M. Ji, and F. Zhang, "Studies on two types of PTP1B inhibitors for the treatment of type 2 diabetes: Hologram QSAR for OBA and BBB analogues," Bioorg Med Chem Lett, vol. 20, pp. 3329-37, Jun 1 2010. [14] E. Diaz-de-Cerio, V. Verardo, A. M. Gomez-Caravaca, A. Fernandez- Gutierrez, and A. Segura-Carretero, "Health Effects of Psidium guajava L. Leaves: An Overview of the Last Decade," Int J Mol Sci, vol. 18, Apr 24 2017. [15] T. Eidenberger, M. Selg, and K. Krennhuber, "Inhibition of dipeptidyl peptidase activity by flavonol glycosides of guava (Psidium guajava L.): a key to the beneficial effects of guava in type II diabetes mellitus," Fitoterapia, vol. 89, pp. 74-9, Sep 2013. [16] X. Ferhati, C. Matassini, M. G. Fabbrini, A. Goti, A. Morrone, F. Cardona, et al., "Dual targeting of PTP1B and glucosidases with new bifunctional iminosugar inhibitors to address type 2 diabetes," Bioorg Chem, vol. 87, pp. 534-549, Mar 22 2019. [17] C. M. Furlan, R. M. Moraes, P. Bulbovas, M. Domingos, A. Salatino, and M. J. Sanz, "Psidium guajava 'Paluma' (the guava plant) as a new bio-indicator of ozone in the tropics," Environ Pollut, vol. 147, pp. 691- 5, Jun 2007. [18] Goldstein, B.J, and Bittner, "yrosine dephosphorylation and deactivation of insulin receptor substrate-1 by protein-tyrosine phosphatase 1B. Possible facilitation by the formation of a ternary complex with the Grb2 adaptor protein.," Journal of Biological Chemistry, vol. 275, pp. 4283- 4289,@ School 2000. of Medicine and Pharmacy, VNU
  47. [19] B. J. Goldstein, "Protein-tyrosine phosphatase 1B (PTP1B): a novel therapeutic target for type 2 diabetes mellitus, obesity and related states of insulin resistance," Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord, vol. 1, pp. 265-75, Nov 2001. [20] H. A. Jung, M. Y. Ali, and J. S. Choi, "Promising Inhibitory Effects of Anthraquinones, Naphthopyrone, and Naphthalene Glycosides, from Cassia obtusifolia on α-Glucosidase and Human Protein Tyrosine Phosphatases 1B," Molecules, vol. 1, p. 28, 2017. [21] T. K, M. Y, T. K, and M. T, "Inhibition of alpha-glucosidase and alpha- amylase by flavonoids," J. Nutr. Sci. Vitaminol, vol. 52, pp. 149-53, April 2006. [22] S. Kumar, S. Narwal, V. Kumar, and e. al, "Alpha-glucosidase inhibitors from plants: A natural approach to treat diabetes.," Pharmacognosy Review, vol. 9, pp. 19-29, 2011. [23] D. S. Le, K. Kusama, and S. Yamamoto, "Acommunity based picture of type 2 diabetes mellitus in Vietnam," J Atheroscler Thromb, vol. 13, pp. 16-20, 2006. [24] Y. S. Lee, I. J. Kang, M. H. Won, J. Y. Lee, J. K. Kim, and S. S. Lim, "Inhibition of protein tyrosine phosphatase 1beta by hispidin derivatives isolated from the fruiting body of Phellinus linteus," Nat Prod Commun, vol. 5, pp. 1927-30, Dec 2010. [25] C. F. Lin, Y. T. Kuo, T. Y. Chen, and C. T. Chien, "Quercetin-Rich Guava (Psidium guajava) Juice in Combination with Trehalose Reduces Autophagy, Apoptosis and Pyroptosis Formation in the Kidney and Pancreas of Type II Diabetic Rats," Molecules, vol. 21, p. 334, Mar 10 2016. [26] G. Liu and J. M. Trevillyan, "Protein tyrosine phosphatase 1B as a target for the treatment of impaired glucose tolerance and type II diabetes," Curr Opin Investig Drugs, vol. 3, pp. 1608-16, Nov 2002. [27] N. MohammadTaghvaei, R. Meshkani, M. Taghikhani, B. Larijani, and K. Adeli, "Palmitate enhances protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) gene expression at transcriptional level in C2C12 skeletal muscle cells," Inflammation, vol. @ 34, School pp. 43-8, of Feb Medicine 2011. and Pharmacy, VNU
  48. [28] H. M. Mukhtar, S. H. Ansari, M. Ali, T. Naved, and Z. A. Bhat, "Effect of water extract of Psidium guajava leaves on alloxan-induced diabetic rats," Pharmazie, vol. 59, pp. 734-5, Sep 2004. [29] T. NK, "Protein tyrosine phosphatases from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction.," FEBS, vol. 2, pp. 346-378, 2013. [30] S. Okada, K. Ishii, H. Hamada, S. Tanokuchi, K. Ichiki, and Z. Ota, "The effect of an alpha-glucosidase inhibitor and insulin on glucose metabolism and lipid profiles in non-insulin-dependent diabetes mellitus," J Int Med Res, vol. 24, pp. 438-47, Sep-Oct 1996. [31] N. P.H, Y. J.L, U. M.N, P. S.L, L. S.I, J. D.W, et al., "Protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) inhibitors from Morinda citrifolia (Noni) and their insulin mimetic activity.," Journal of natural products, vol. 76, pp. 2080-2087, 2013. [32] A. I. Pinho, C. S. Oliveira, F. L. Lovato, E. P. Waczuk, B. C. Piccoli, A. A. Boligon, et al., "Antioxidant and mercury chelating activity of Psidium guajava var. pomifera L. leaves hydroalcoholic extract," J Toxicol Environ Health A, vol. 80, pp. 1301-1313, 2017. [33] G. R.M, M. S., and S. R.V, "Psidium guajava: A review of its traditional uses, phytochemistry and pharmacology," Journal of Ethnopharmacology, vol. 117, pp. 1–27, 2008. [34] P. K. Rai, S. Mehta, and G. Watal, "Hypolipidaemic & hepatoprotective effects of Psidium guajava raw fruit peel in experimental diabetes," Indian J Med Res, vol. 131, pp. 820-4, Jun 2010. [35] P. Rattanachaikunsopon and P. Phumkhachorn, "Bacteriostatic effect of flavonoids isolated from leaves of Psidium guajava on fish pathogens," Fitoterapia, vol. 78, pp. 434-6, Sep 2007. [36] C. M. Rondinone, J. M. Trevillyan, J. Clampit, R. J. Gum, C. Berg, P. Kroeger, et al., "Protein tyrosine phosphatase 1B reduction regulates adiposity and expression of genes involved in lipogenesis," Diabetes, vol. 51, pp. 2405-11, Aug 2002. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  49. [37] T. Scully, "Diabetes in numbers," Nature, vol. 485, pp. S2-3, May 17 2012. [38] J. E. Shaw, R. A. Sicree, and P. Z. Zimmet, "Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030," Diabetes Res Clin Pract, vol. 87, pp. 4-14, Jan 2010. [39] A. K. Tamrakar, C. K. Maurya, and A. K. Rai, "PTP1B inhibitors for type 2 diabetes treatment: a patent review (2011 - 2014)," Expert Opin Ther Pat, vol. 24, pp. 1101-15, Oct 2014. [40] J. F. Tobin and S. Tam, "Recent advances in the development of small molecule inhibitors of PTP1B for the treatment of insulin resistance and type 2 diabetes," Curr Opin Drug Discov Devel, vol. 5, pp. 500-12, Jul 2002. [41] M. Uusitupa, "Lifestyles matter in the prevention of type 2 diabetes," Diabetes Care, vol. 25, pp. 1650-1, Sep 2002. [42] X. L. Yang, K. L. Hsieh, and J. K. Liu, "Guajadial: an unusual meroterpenoid from guava leaves Psidium guajava," Org Lett, vol. 9, pp. 5135-8, Nov 22 2007. [43] Z. Y. Zhang and S. Y. Lee, "PTP1B inhibitors as potential therapeutics in the treatment of type 2 diabetes and obesity," Expert Opin Investig Drugs, vol. 12, pp. 223-33, Feb 2003. [44] Y. J. Zhao, J. K. Li, X. Zhang, and J. P. Gao, "[Study on antioxidant activity of flavonoids from leaves of Psidium guajava]," Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, vol. 43, pp. 760-765, Feb 2018. [45] Zhen and e. al, "Synthesis of novel flavonoid alkaloids as α - glucosidase inhibitors," Bioorganic & Medicinal Chemistry, vol. 25, pp. 5355-64, November 2017. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU