Khóa luận Nghiên cứu tác dụng điều trị đái tháo đường typ 2 của cao chiết lá chè đắng (llex kaushue S. Y. Hu)

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu tác dụng điều trị đái tháo đường typ 2 của cao chiết lá chè đắng (llex kaushue S. Y. Hu)

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYP 2 CỦA CAO CHIẾT LÁ CHÈ ĐẮNG (Ilex kaushue S. Y. Hu) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYP 2 CỦA CAO CHIẾT LÁ CHÈ ĐẮNG (llex kaushue S. Y. Hu) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2016Y Người hướng dẫn 1: PGS.TS BÙI THANH TÙNG Người hướng dẫn 2: ThS. NGUYỄN THỊ HUYỀN Hà Nội – 2020
3. LỜI CẢM ƠN Trong quá trình xây dựng hoàn thành khóa luận, tôi luôn nhận được sự hướng dẫn tận tình PGS.TS Bùi Thanh Tùng và ThS. Nguyễn Thị Huyền. Bên cạnh đó là sự giảng dạy tâm huyết của các thầy cô giáo tại trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội và sự khích lệ, cổ vũ của gia đình đã luôn bên cạnh động viên, tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập, nghiên cứu cho việc hoàn thành khóa luận. Do đó tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và gửi lời cảm ơn trân trọng nhất tới hai thầy cô đã hướng dẫn tôi trong khóa luận này là PGS.TS. Bùi Thanh Tùng và ThS. Nguyễn Thị Huyền – Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng Trường Đại học Y Dược. Hai thày cô không chỉ tận tình chỉ bảo giúp tôi hoàn thành khóa luận và còn đưa ra những lời khuyên hữu ích cho tôi trên con đường sự nghiệp sau này. Đồng thời, tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới ban chủ nhiệm Trường Đại học Y Dược đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và làm khóa luận này. Ngoài ra, tôi cũng xin cảm ơn các thày cô tại các bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng, Bào chế, Dược liệu - Dược cổ truyền và Hóa dược – Kiểm nghiệm đã trang bị cũng như cho phép tôi sử dụng cơ sở vật chất, phòng thí nghiệm để hoàn thành khóa luận. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè của tôi đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này. Mặc dù bản thân đã nỗ lực, cố gắng song khó tránh khỏi những hạn chế, thiếu sót. Kính mong quý thầy, cô giáo đóng góp thêm ý kiến để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 6 năm 2021 Tác giả khóa luận Nguyễn Thị Nhung
4. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ĐTĐ Đái tháo đường IC50 Nồng độ ức chế 50% Liên đoàn Đái tháo đường thế giới (International IDF Diabetes Federation) HDL Lipoprotein tỉ trọng cao LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp STZ Streptozocin
5. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Hình ảnh cây chè đắng. Hình 1.2: Công thức một số hợp chất trong lá chè đắng. Hình 1.3: Lá cây chè đắng sau khi phơi khô. Hình 2.1: Lá cây chè đắng sau khi cắt nhỏ, sấy khô. Hình 2.2: Quy trình chiết xuất lá chè đắng. Hình 2.3: Quy trình nghiên cứu. Hình 3.1: Sắc kí đồ GC - MS / MS của chiết xuất etanol của lá cây chè đắng. Hình 3.2: Thể trọng chuột sau 28 ngày nuôi theo mô hình gây béo phì thực nghiệm. Hình 3.3: Trọng lượng của các nhóm chuột trước và sau khi điều trị 28 ngày. Hình 3.4: Chỉ số glucose huyết của các nhóm chuột trước và sau khi điều trị 28 ngày.
6. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Nguyên nhân gây ĐTĐ nguyên phát Bảng 1.2: Phân loại mức độ cân nặng theo BMI Bảng 3.1: Các chất chính được xác định trong chiết xuất etanol của lá cây chè đằng bởi GC – MS / MS Bảng 3.2: Tác động ức chế enzym α –glucosidase của cao chiết lá chè đắng Bảng 3.3: Thể trọng chuột sau 28 ngày nuôi theo mô hình béo phì thực nghiệm Bảng 3.4: Nồng độ glucose máu của các nhóm chuột tiêm STZ và tiêm đệm (đơn vị mmol/L) Bảng 3.5: Tác dụng của cao chiết lá chè đắng lên trọng lượng chuột Bảng 3.6: Ảnh hưởng của dịch chiết lá chè đắng lên nồng độ glucose huyết. Bảng 3.7: Tác dụng cao chiết chè đắng lên lipid máu (mg/ml) trên chuột bị tiểu đường do streptozotocin sau 28 ngày điều trị.
7. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1.ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 3 1.1.1. Khái niệm 3 1.1.2. Dịch tễ 3 1.1.3. Phân loại đái tháo đường 3 1.1.4. Cơ chế bệnh sinh và các biến chứng của đái tháo đường typ 2 4 1.1.5. Biến chứng bệnh đái tháo đường 4 1.1.6. Các thuốc điều trị 5 1.2. BỆNH BÉO PHÌ 5 1.2.1. Vài nét về béo phì 6 1.2.2. Nguyên nhân gây bệnh béo phì 6 1.2.3. Mối quan hệ giữa béo phì và kháng insulin trong ĐTĐ typ 2 7 1.3. TỔNG QUAN VỀ ENZYME -GLUCOSIDE 8 1.3.1. Danh pháp và phân loại 8 1.3.2. Các chất ức chế enzyme - glucosidase 8 1.4. MÔ HÌNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG THỰC NGHIỆM 9 1.5. CÂY CHÈ ĐẮNG 10 1.5.1. Tên gọi 10 1.5.2. Đặc điểm thực vật 10 1.5.3. Phân bố, sinh thái 11 1.5.4. Thành phần hóa học 11 1.5.5. Công dụng 13 1.5.6. Tính an toàn của lá chè đắng 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17 2.1.1. Mẫu thực vật 17 2.1.2. Động vật thí nghiệm 18 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 19 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.3.1. Phương pháp xác định một số hợp chất chính trong cao chiết bằng GC – MS / MS 19 2.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym - glucosidase 20 2.3.3. Phương pháp gây đái tháo đường trên chuột béo phì 21 2.3.4. Đánh giá tác dụng hạ glucose của dịch chiết lá chè đắng 22 2.3.5. Đánh giá tác dụng hạ lipid máu của dịch chiết lá chè đắng 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 25
8. 3.1. KẾT QUẢ CỦA CHIẾT CAO DƯỢC LIỆU 25 3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU CAO CHIẾT BẰNG GC- MS / MS 25 3.3. KẾT QUẢ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM -GLUCOSIDASE IN VITRO CỦA CAO CHIẾT CHÈ ĐẮNG 25 3.4. KẾT QUẢ GÂY ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TRÊN CHUỘT BÉO PHÌ 28 3.4.1. Kết quả gây béo phì 28 3.4.2. Kết quả gây ĐTĐ trên chuột béo phì 28 3.5. KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ BẰNG CAO CHIẾT 29 3.5.1. Kết quả của cao chiết lá chè đắng trên khối lượng chuột 29 3.5.2. Kết quả cao chiết lá chè đắng trên glucose máu 30 3.5.3. Kết quả cao chiết lá chè đắng trên lipid máu 31 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36
9. MỞ ĐẦU Trong xã hội hiện đại ngày nay, đái tháo đường đang là một trong những bệnh có tỷ lệ mắc ngày càng tăng. Đái tháo đường đã trở thành một trong những nguyên nhân tử vong hàng đầu tại các nước đang phát triển. Đái tháo đường gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng như suy thận, hôn mê, hạ đường huyết, nhiễm trùng, cắt cụt chi, và ảnh hưởng tới cuộc sống của con người. Ở Việt Nam số người mắc đái chiếm khoảng 1- 2.5% dân số và có tỷ lệ tử vong cao nhất trong các bệnh nội tiết. Con số này đang không ngừng tăng lên trong những năm gần đây. Bên cạnh đó cùng với sự phát triển của kinh tế là sự gia tăng việc sử dụng thực phẩm không thích hợp, chế độ dinh dưỡng chưa hợp lý. Cùng với sự chưa có chế độ luyện tập thường xuyên hay phổ biến hơn là không vận động khiến cho độ tuổi mắc đái tháo đường đặc biệt là đái tháo đường typ 2 đang ngày càng giảm xuống. Ngày nay, xu hướng chữa bệnh đó là quay về thiên nhiên. Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu phát triển thuốc tân dược nhưng quá trình tìm ra các hợp chất có chi phí cao và gây nhiều tác dụng phụ. Hầu hết các thuốc điều trị ĐTĐ hiện nay trên thị trường đều có những tác dụng phụ. Ví dụ như nhóm Sulfonylureas gây hạ đường huyết, run rẩy, đổ mồ hôi, chóng mặt. Nhóm Thiazolidinediones có thể gây tăng cân, hạ glucose huyết, tăng cholesterol xấu trong máu. Nhóm thuốc ức chế SGLT2 làm tăng nguy cơ mắc nhiễm trùng và nhiễm nấm đường tiết niệu, nhiễm toan. Do đó, xu hướng tìm tòi và phát triển các thuốc Đông y, thuốc Nam, kết hợp Y học cổ truyền và y học hiện tại đang ngày càng phổ biến. Hơn nữa, Việt Nam với khí hậu và địa hình đa dạng có một nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú. Các dược liệu đã được sử dụng hàng nghìn năm và có nhiều tác dụng điều trị cũng như các tác dụng tiềm năng. Hiện nay cũng có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng trên điều trị đái tháo đường của nhiều loại thảo dược và đạt được nhiều tác dụng khả quan. Điều đó cho thấy tiềm năng phát triển các loại dược liệu thành các thuốc hỗ trợ và điều trị bệnh đái tháo đường typ 2. Lá chè đắng (Ilex kaushue) là một loại trà phổ biến ở nhiều nước châu Á như Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản, Theo Y học cổ truyền, lá chè đắng có nhiều tác dụng như làm trí óc minh mẫn và mắt sáng, giải độc, giảm ho, đau họng; giúp lợi tiểu phiền khát; kích thích tiêu hóa; giảm huyết áp, hạ đường huyết; kháng khuẩn, kháng viêm. Lá chè đắng cũng được sử dụng để điều trị các chứng mất ngủ, mắt đỏ, nhức đầu, đau răng. Các nghiên cứu phân lập các thành phần hóa học của 1
10. lá chè đắng cho kết quả có nhiều nhóm chất quý từ tự nhiên như saponin, alkaloid, triterpenoid, phenolic, flavonoid, Một số nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy lá chè đắng có tác dụng hạ đường huyết và giảm nồng độ lipid trong máu. Nhưng qua tìm hiểu thì Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu chứng minh nhằm phát triển loại thảo dược này thành các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường. Vì vậy, đề tài nghiên cứu khoa học: “Nghiên cứu tác dụng điều trị đái tháo đường typ 2 của cao chiết lá chè đắng (llex kaushue S. Y. Hu)” được thực hiện nhằm mục tiêu sau: 1. Triển khai mô hình chuột nhắt béo phì bị ĐTĐ typ 2. 2. Đánh giá tác dụng điều trị ĐTĐ typ 2 của cao chiết lá chè đắng trên thực nghiệm. 2
11. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Đái tháo đường 1.1.1. Khái niệm Bệnh đái tháo đường là bệnh rối loạn chuyển hóa không đồng nhất, có đặc điểm tăng glucose huyết do khiếm khuyết về tiết insulin, về tác động của insulin, hoặc cả hai. Tăng glucose mạn tính trong thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa carbohydrate, protide, lipide, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim và mạch máu, thận, mắt, thần kinh [4]. 1.1.2. Dịch tễ Năm 2018, theo Liên đoàn đái tháo đường quốc tế (IDF) toàn thế giới có khoảng 463 triệu người lớn đang mắc đái tháo đường, báo cáo cũng cho biết tỷ lệ bệnh tiểu đường trên toàn cầu đã lên tới 9,3%, với hơn một nửa (50,1%) người trưởng thành không được chẩn đoán. Bệnh tiểu đường loại 2 chiếm khoảng 90% tổng số người mắc bệnh tiểu đường. IDF ước tính đến năm 2045 có khoảng 629 triệu người mắc đái tháo đường, điều đó có nghĩa là cứ 10 người thì có mổ người mắc bệnh đái tháo đường. Chi phí y tế liên quan đến đái tháo đường sẽ vượt quá 776 tỷ USD. Theo Hội Nội Tiết và Đái Tháo Đường Việt Nam, tỷ lệ ĐTĐ tại Việt Nam là 5,5% (năm 2017) [29]. 1.1.3. Phân loại đái tháo đường Đái tháo đường được phân loại theo nguyên nhân thành các loại chủ yếu sau:  Đái tháo đường nguyên phát Đái tháo đường typ 1: do tế bào beta bị phá hủy nên bệnh nhân không còn hoặc còn rất ít insulin, 95% do cơ chế tự miễn (typ 1A), 5% vô căn (typ 1B) Đái tháo đường typ 2: thiếu insulin tương đối cùng với đề kháng insulin Đái tháo đường thai kì: được chẩn đoán trong 3 tháng giữa hoặc 3 tháng cuối của thai kỳ và không có bằng chứng về ĐTĐ typ 1, typ 2 trước đó  Đái tháo đường thứ phát: khiếm khuyết trên nhiễm sắc thể, bệnh lý tuyến tụy, do thuốc, hóa chất, Bệnh cũng không có nguyên nhân chuyên biệt nào. Trong khi đái tháo đường typ 1 được cho là do các tế bào beta bị phá hủy hay do cơ chế tự miễn thì các yếu tố được cho là gia tăng nguy cơ ĐTĐ typ 2 là tuổi, béo phì, ít vận động. Chế độ ăn nhiều chất đường, chất béo, ít vận động cùng với tuổi cao gặp ở hầu hết các đối tượng mắc đái tháo đường. Yếu tố di truyền cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng tới bệnh ĐTĐ typ 2. Tỷ lệ hai người sinh đôi cùng trứng mắc ĐTĐ lên tới 90%. Hầu hết những người ĐTĐ typ 2 trong gia đình đều có người bị ĐTĐ [8]. 3
12. Bảng 1.1. Nguyên nhân gây ĐTĐ nguyên phát. Các nguyên nhân ĐTĐ typ 1 ĐTĐ typ 2 Tiền sử gia đình Kháng nguyên HLA- Đặc tính dân tộc Yếu tố nguy cơ DR3, HLA-DR4 Ăn nhiều, ít tập luyện thể lực Nhiễm virus Béo phì Yếu tố khởi phát Stress chuyển hóa/ yêu Stress chuyển hóa/ yêu cầu quá mức cầu quá mưucs Các tế bào tại đảo tụy Phá hủy theo cơ chế tự Yếu tố bệnh sinh thoái hóa/ suy yếu dần miễn Giảm receptor insulin 1.1.4. Cơ chế bệnh sinh và các biến chứng của đái tháo đường typ 2 Đái tháo đường typ 2 chủ yếu do hai cơ chế chính liên quan tới kháng insulin và rối loạn tiết insulin [4, 37]. Kháng insulin là tình trạng giảm hoặc mất tính nhạy cảm của cơ quan đích với insulin. Kháng insulin có thể do một số nguyên nhân như tế bào beta đảo tụy tiết insulin bất thường, có chất đối kháng insulin lưu thông trong máu như glucagon, cortisol, kháng thể kháng thụ thể insulin, resistin, TNF alpha (Tumor Necrosis factor alpha), IL-6 (Interleukin-6). Do tình trạng đề kháng insulin, nồng độ glucose trong máu tăng cao. Ở giai đoạn đầu tế bào beta bù trừ và tăng tiết insulin trong máu. Nếu tình trạng đề kháng insulin kéo dài và không giảm hoặc nặng dần, tế bào beta sẽ không tiết đủ insulin và ĐTĐ typ 2 lâm sàng sẽ xuất hiện. Tăng insulin máu bù trừ, tăng tiền chất không có hoạt tính proinsulin, mất tính chất tiết insulin theo từng đợt là các nguyên nhân gây rối loạn tiết insulin. 1.1.5. Biến chứng bệnh đái tháo đường Bệnh ĐTĐ gây nên nhiều biến chứng nguy hiểm gồm hai loại là: biến chứng cấp tính hôn mê tăng đường máu và biến chứng mạn tính. Biến chứng cấp tính như hôn mê nhiễm toan ceton và hôn mê tăng áp lực thẩm thấu, hạ đường huyết. Nhiễm toan ceton đến tới toan hóa máu, gây rối loạn điện giải trong và ngoài tế bào có thể dẫn tới hôn mê nếu không được điều trị tốt. Hạ đường 4
13. huyết cũng là một trong những tai biến thường gặp ở những bệnh nhân dùng quá liều thuốc hoặc bệnh nhân dùng thuốc lúc đói hoặc bỏ bữa. Các biến chứng mạn tính bao gồm các bệnh lý liên quan tới các mạch máu, tim mạch và thần kinh. Xơ vữa động mạch vành, tăng huyết áp là những bệnh thường xuất hiện sớm ở những người bị đái tháo đường. Đái tháo đường typ 2 cũng làm tăng nguy cơ rối loạn lipid máu bao gồm tăng triglycerid, cholesterol toàn phần, tăng LDL cholesterol, giảm HDL cholesterol. Cùng với đó là sự tổn thương các mạch máu nhỏ, tăng tính thấm mao mạch và mao mạch dễ vỡ gây nên bệnh ở các cơ quan như võng mạc, thận, thận kinh [15]. 1.1.6. Các thuốc điều trị Đối với bệnh nhân đái tháo đường typ 1, do tế bào beta đảo tụy đã bị phá hủy không còn chức năng tiết insulin. Do đó bệnh nhân cần điều trị bằng cách bổ sung insulin thường xuyên, suốt đời. Bệnh nhân đái tháo đường typ 2, ngoài một số thuốc điều trị thì cần kết hợp một số biện pháp như tuân thủ lối sống lành mạnh, dinh dưỡng hợp lý và tăng cường luyện tập thể lực. Do mỗi bệnh nhân đái tháo đường typ 2 thường mắc kèm thêm một hoặc một số bệnh lý khác nữa nên có thể phải kết hợp một số thuốc để đạt được mục tiêu điều trị [1, 4]. Hiện nay có các nhóm thuốc chính trong điều trị đái tháo đường đó là: Insulin: Insulin được sử dụng ở bệnh nhân ĐTĐ typ 1 và cả ĐTĐ typ 2 khi có triệu chứng thiếu insulin hoặc không kiểm soát được glucose huyết. Nhóm thuốc kích thích tụy bài tiết insulin: nhóm sulphonylurea (glicazid, glibenclamid, glimepirid, ) Nhóm thuốc làm tăng nhạy cảm insulin ở ngoại vi, giảm đề kháng insulin như nhóm biguanide (metformin) nhóm thiazolidinedion (pioglitazone) Thuốc ức chế hấp thu glucose thông qua ức chế enzym α-glucosidase như: acarbose, voglibose, miglitol, làm chất đường trong ruột được hấp thụ chậm vào cơ thể và đường ngay sau khi ăn sẽ không tăng cao trong máu. Thuốc có tác dụng incretin: thuốc ức chế enyme DPP-4, thuốc đồng vận thụ thể GLP-1 Thuốc ức chế kênh đồng vận chuyển SGLT2 1.2. Bệnh béo phì 5
14. 1.2.1. Vài nét về béo phì Tổ chức Y tế thế giới (WHO) định nghĩa thừa cân và béo phì là tình trạng tích lũy mỡ quá mức hoặc không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng tới sức khỏe [19]. Sự phát triển kinh tế - xã hội đã làm thay đổi chế độ dinh dưỡng, cung nhiều hơn cầu, kết hợp phong cách sống tĩnh tại nhiều hơn vận động, dẫn đến tình hình béo phì tǎng lên với tốc độ báo động, không những ở các quốc gia phát triển, mà còn ở các quốc gia đang phát triển. Ngày nay, Tổ chức Y tế thế giới thường dùng chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index - BMI) để nhận biết tình trạng gây béo của cơ thể giữa cân nặng và chiều cao. Công thức BMI BMI = W / (H) Trong đó: W cân nặng (kg) H chiều cao (m) Đối với người châu Á, từ nghiên cứu thức tế tiêu chuẩn phân loại béo phì như bảng 1.2 Bảng 1.2: Phân loại mức độ cân nặng theo BMI Loại BMI Gầy < 18,5 Bình thường 18,5 -22, 9 Nguy cơ 23 – 24,9 Tăng cân Béo phì độ 1 25 – 19,9 Béo phì độ 2 30 Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), thừa cân và béo phì là những yếu tố nguy cơ chính đối với các bệnh mãn tính như tiểu đường, tim mạch, ung thư. Thường gia tăng đáng kể ở các nước thu nhập cao nhưng ngày nay lại có chiều gia tăng ở nước thu nhập trung bình và thấp, nhất ở các thành thị. 1.2.2. Nguyên nhân gây bệnh béo phì Có nhiều nguyên nhân gây ra béo phì. Có thể chia làm ba nhóm nguyên nhân chính là môi trường, di truyền và nội tiết. 6
15. Yếu tố môi trường: Là những yếu tố liên quan tới việc mất cân bằng năng lượng do ăn quá nhiều calo hoặc hoạt động thể lực không đủ để tiêu tốt hết lượng calo dẫn tới tích lũy mỡ. Nguyên nhân nội tiết: thường là hậu quả gián tiếp của một số bệnh lý khác như hội chứng Cushing: phân bố mỡ nhiều ở mặt, cổ, bụng trong khi tứ chi gầy; u tiết insulin: tăng cảm giác ngon miệng và tăng tân sinh mô mỡ từ glucid; suy giáp: béo phì do chuyển hóa cơ bản giảm. Di truyền: có bằng chứng cho thấy di truyền có đóng vai trò trong bệnh béo phì, như gia đình có bố và mẹ béo phì thì con bị béo phì đến 80%, có bố hoặc mẹ béo phì thì con béo phì thấp hơn 40%, và bố mẹ không béo phì thì chỉ 7% số con bị béo phì. 1.2.3. Mối quan hệ giữa béo phì và kháng insulin trong ĐTĐ typ 2 Insulin là hormone protein có bản chất acid, tan trong nước, không qua được màng tế bào mà gắn vào các receptor (thụ thể) đặc hiệu ở màng (glocoprotein). Sau khi insulin kết hợp với thụ thể đặc hiệu có tác dụng như protein kinase, tự phosphoryl hóa và làm tăng tốc độ vận chuyển glucose qua màng tế bào. Các lipid và acid béo tự do thúc đẩy kháng insulin theo 3 con đường chính: Hoạt hóa con đường mTOR, tăng béo tự do và các adipikin (do các tế bào của mô mỡ tiết ra). Hoạt hóa con đường mTOR (mamnadia large of the rapamycin) thúc đẩy kháng insulin và ĐTĐ typ 2: mTOR làm phosphoryl hóa serine của các insulin receptor substrates (Các chất thụ thể insulin) bằng cách hoạt hóa S6 Kinase 1 (S6K1) làm IRS không có khả năng hoạt hóa P13K (phosphatidyl inositol 3 - kinase) và protein Akt (là mục tiêu của con đường chuyển hóa insulin). Các chất dinh dưỡng dư thừa làm thúc đẩy kháng insulin bằng cách hoạt hóa protein kinase của con đường mTOR. Con đường mTOR/S6K1 được hoạt hóa, ức chế gen PGC1 (proliferacer – activated receptor  coactivator- 1) biểu hiện, làm năng lượng ti thể giảm thụ dẫn đến béo phì. Tăng acid béo tự do gây kháng insulin: Nồng độ glucose trong mức bình thường thì acid béo tự do được vận chuyển trong ti thể qua enzym carnitine- paliaytoyl transfe-1 (CPT-1) và được oxy hóa một phần nhỏ. Nhưng với bệnh nhân béo phì khi nồng độ glucose và acid béo đểu tăng cao, tế bào sẽ sử dụng năng lượng của acid béo tự do, vì vậy tăng tạo thành LC-CoA (long chair-CoA) trong bào tương mà LC-CoA làm ức chế tế bào sử dụng glucose, gây kháng insulin và ức chế tổng hợp glycogen từ glucose, tăng tổng hợp triglyceride [10]. 7
16. 1.3. Tổng quan về enzyme - glucoside Enzym là chất xúc tác sinh học có trong tất cả các tế bào sinh vật. Enzym có bản chất là protein, giúp thúc đẩy quá trình trao đổi chất cũng như thúc đẩy các phản ứng hóa học ở múc cao mặc dù điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH. Enzym có tính đặc hiệu và chọn lọc rất cao đối với các cơ chất [12]. 1.3.1. Danh pháp và phân loại Enzym 1-glucosidase (EC 3.2.1.20) còn có những tên gọi khác như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase glucoamylase, - glucopyranosidase, glucosidoinvertase, -D-glucosidase, - glucoside hydrolase, - 1,4-glucosidase, - D-glucoside glucohydrolase. Enzym phân bố chủ yếu trong màng bề mặt đường ruột, tham gia vào quá trình tiêu hóa [17]. Enzym - glucosidase là enzym một thành phần, có hoạt tính exohydrolysis. Carbohydrat sau khi vào cơ thể được phân cắt thành glucose. Enzym - glucosidase xúc tác phản ứng cắt đứt liên kết 1,4- -glycosid ở đầu tận của carbohydrate giải phóng các phân tử -D-glucose. Enzym -glucosidase là một trong những enzym thuộc lớp glycoside hydrolase. Glycoside hydrolase là một lớp các enzym thường tách liên kết glycoside giữa 2 phân tử carbohydrate. Các enzym này có khả năng bẻ gãy các liên kết glycoside nhanh hơn 1017 lần so với phản ứng không có enzym xúc tác [23]. 1.3.2. Các chất ức chế enzyme - glucosidase Các chất ức chế enzym là các chất làm thay đổi hoạt tính enzym có thể là ion kim loại, hợp chất hữu cơ phân tử nhỏ, protein, Chất ức chế theo hai cơ chế chính là ức chế cạnh tranh hoặc không cạnh tranh [12]. Có thể phân loại các chất ức chế thành hai nhóm chính là các chất ức chế tổng hợp và các hợp chất tự nhiên. Các chất tổng hợp Các thuốc làm giảm đường huyết sau ăn như: acarbose, miglitol, voglibose đang được sử dụng rộng rãi như thuốc điều trị đái tháo đường typ 2 [4]. Cơ chế hoạt động của các thuốc này là ức chế cạnh tranh với enzym - glucosidase ở ruột. Tuy nhiên thường có tác dụng phụ như đầy hơi, tiêu chảy, buồn nôn, Các chất tự nhiên Hiện nay, người ta đã tìm ra một số các hợp chất ức chế enzym - glucosidase như: flavonoid, anthocyanidin, isoflavone, phenolic, curcuminoids, terpinoid Các 8
17. hợp chất này có nhiều tiềm năng đồng thời có ít tác dụng không mong muốn. Việc tìm kiếm và nghiên cứu về các hợp chất này cũng đang rất được quan tâm trên toàn thế giới [40]. 1.4. Mô hình đái tháo đường thực nghiệm Thử nghiệm ĐTĐ trên mô hình động vật là điều cần thiết để nâng cao kiến thức và hiểu biết về các khía cạnh khác nhau của cơ chế bệnh sinh cũng như tìm ra các liệu pháp chữa trị mới và hiệu quả. Các nghiên cứu thực nghiệm trên động vật chủ yếu là loài gặm nhấm với nhiều ưu điểm như là: kích thước nhỏ, khoảng cách thế hệ ngắn, dễ nuôi, tính sẵn có, tiết kiệm. Các phương pháp đã được sử dụng để gây bệnh đái tháo đường ở động vật thí nghiệm là sử dụng tác nhân hóa học, phẫu thuật, di truyền. Trong đó sử dụng tác nhân hóa học mà cụ thể là alloxan và streptozoxin là được sử dụng phổ biến nhất [32].  Streptozotoxin Streptozocin (STZ) là một hợp chất hóa học thuộc nhóm glucosamine nitrosorea, có công thức hóa học là C8H15N3O7 tồn tại trong tự nhiên và có khả năng gây độc đặc hiệu với tế bào  đảo tụy sản xuất insulin ở động vật có vú. STZ gây ra ĐTĐ ở hầu hết các loài và được sử dụng phổ biến nhất để gây ra ĐTĐ ở chuột [24, 26, 33]. Cơ chế gây độc: STZ xâm nhập vào tế bào đảo tụy thông qua kênh vận chuyển glucose GLUT2, và gây ra sự alkyl hóa axit deoxyribonucleic (DNA). Ngoài ra STZ còn gây kích hoạt sự ribosyl hóa poly adenosin diphosphat và giải phóng nitric oxid. Kết quả là tế bào tụy bị phá hủy do hoại tử [32]. Tùy vào liều lượng STZ và cách thức tiến hành tiêm thuốc mà có thể gây mô hình động vật bị ĐTĐ typ 1 hoặc ĐTĐ typ 2. Liều trên chuột nhắt dao động từ 50 - 150 mg/kg, trên chuột cống dao động từ 40 -100 mg/kg [20, 27]. Một vấn đề khi sử dụng STZ là tác dụng độc hại của nó không giới hạn tuyến tụy vì nó có thể gây tổn thương thận, gây êm và rối loạn chức năng nội mô.  Alloxan Alloxan (2,4,5,6-tetraoxypyrimidine; 2,4,5,6-pyrimidinetetrone) là một pyrimidine được oxy hóa. Dẫn xuất có dạng hydrat alloxan trong dung dịch nước. Alloxan và các sản phẩm khử của nó (điển hình là dialuric axit) thiết lập một quá trình oxy hóa khử hình thành các gốc superoxide. Các gốc này chuyển hóa thành hydrogen peroxide. Tác động của các loại gốc tự do, phản ứng oxy hóa khử cùng với sự gia tăng đồng thời nồng độ canxi trong tế bào gây ra sự phá hủy nhanh chóng các tế bào β [32, 57]. 9
18. 1.5. Cây chè đắng 1.5.1. Tên gọi Tên khoa học: Ilex kaushue S. Y. Hu Tên gọi khác: Chè khôm, khổ định trà Họ: Trâm bùi (Aquifoliaceae) Chi Ilex gòm khoảng 400-600 loài, thuốc thể lưỡng bội phân bố chủ yếu ở châu Á, châu Âu, Bắc Phi, Bắc Mỹ [14]. 1.5.2. Đặc điểm thực vật Cây gỗ xanh quanh năm cao trung bình 6-20m cây cao có thể tới 35m. Đường kính thân khoảng 20-60 cm, những cây cổ thụ có đường kính có thể lên tới 120cm. Cành thô, không có lông, màu hơi nâu, nhánh non có nhiều gờ nhỏ. Lá đơn dài khoảng 11-17cm, rộng khoảng 4-6 cm, mọc so le. Lá có hình thuôn dài, mũi hơi nhọn, gốc lá hẹp dần, mép lá có răng cưa nhỏ tương đối đều nhau. Mặt trên lá màu lục sẫm, mặt dưới màu nhạt hơn, không có lông. Cuống lá dài từ 2 tới 2.5 cm [9]. Hình 1.1: Hình ảnh cây chè đắng ngoài tự nhiên Chè đắng ta hoa vào khoảng tháng 2 - 4, có quả chín tháng 6 tới tháng 2 năm sau. Hoa đơn tính. Cụm hoa đực có trục dài cỡ 1cm, dạng ngù, thường có 20-30 hoa 10
19. có cuống mảnh dài 4-5mm; dài hoa có đường kính cỡ 3mm; lá dài 4, hình trứng hoặc hình tròn dạng tam giác; cánh hoa dài 3,5-4mm; nhị ngắn hoặc dài bằng cánh hoa. Cụm hoa cái dạng chùm giả, gồm 3-9 hoa, có cuống thô, dài 4-6mm. Quả hạch gần hình cầu, đường kính cỡ 1cm, ở trên cuống ngắn 2-3mm, khi chín màu đỏ. Hạt hình thuôn, dài 7mm, rộng 4mm, mặt lưng và mặt trên có vân và rãnh dạng mắt lưới [2, 35]. Bộ phận dùng: chủ yếu là lá cây [5]. 1.5.3. Phân bố, sinh thái Phân bố: Trên thế giới chè đằng phân bố nhiều ở các tỉnh Trung Quốc như Hồ Nam, Hán Nam, Quảng Đông, Quảng Tây. Ở nước ta, cây chè đắng phân bố ở một số vùng thuộc tỉnh Cao Bằng, Lào Cai, Hòa Bình, Ninh Bình. Chè đắng thường mọc ở các vùng rừng thường xanh, rừng thưa, ven sông suối. Cây mọc chủ yếu ở độ cao từ 600-900m 1.5.4. Thành phần hóa học Đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu về thành phần hóa học của cây chè đắng. Các hợp chất có trong cây là saponin, alkaloid, triterpenoid, phenolic, flavonoid và axit hữu cơ đã được cô lập từ lá cây. Trong đó phải kể đến một số poly phenol có hoạt tính như là hydroxycasein, axit protocatechuic, rutin, axit neochlorogenic, axit chlorogenic, axit cryptochlorogenic, axit caffeic và axit isochlorogenic [7, 34, 41],  Triterpenoids và Glycoside của chúng Trong lá chè đắng triterpene kiểu ursane như aglycones được coi là thành phần đặc trưng nhất. Ngoài ra, lá chè đắng cũng chứa các triterpen loại oleanane và lupin và glycoside [35]. Trong các loài cùng chi, chè đắng có chứa hàm lượng saponin cao nhất [34]. Các kudinoside cũng đã được phân lập nhờ HPLC như kudinoside A, D và F [41, 47].  Polyphenol Thông qua các phân tích sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng phối phổ (LC-MS) và sắc kí khí khối phổ song song (GC- MS/MS) đã phát hiện axit chlorogenic, axit cryptochlorogenic và axit isochlorogenic A, B và C là các polyphenol chính trong lá chè đắng [51]. Ngoài ra, Các hợp phất polyphenol chiếm ưu thế nên tới > 75% là axit isochlorogenic A, B và C [51]. Các hợp chất này có nhiều tiềm năng để làm cơ sở đánh giá chất lượng của lá chè đắng. 11
20. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu về thành phần hóa học của lá chè đắng cũng đã được thực hiện Vũ Anh Thơ và Trần Lê Quan đã cô lập và xác định các hợp chất 1 uvaol Kudinoside A Kudinoside D axit isochlorogenic A Axit caffeic Quercetin 12
21. Hình 1.2: Công thức một số hợp chất trong lá chè đắng triterpen saponin: kudinoside A, kudinoside C, kudinoside D, kudinoside E, latifoloside G [16]. Nguyễn Văn Hậu và Lê Ngọc Thức đã cô lập và xác định hai hợp chất là quercetin và axit dihyfrocaffeic [7]. Trương Thị Huỳnh Hoa và các công sự đã phân lập được các uvaol, 3β, stigmast-5-en-yl-β-D-glucopyranoside và các kudinoside [28]. 1.5.5. Công dụng 1.5.5.1. Theo y học cổ truyền Theo Y học cổ truyền, chè đắng có vị đắng hơi ngọt, tính mát, có tác dụng phát tán phong nhiệt, trừ phiền khác. Y học dân gian thường dùng lá và búp chè làm thuốc. Lá non và búp non sao thành trà uống, lá già hái về loại bỏ cuống thô, phơi khô dùng nấu uống. So với chè xanh, nước lá chè đắng trong hơn, màu nhạt hơn [9]. Lá chè đắng được sử dụng trong Y học cổ truyền với nhiều tác dụng như làm trí óc minh mẫn và mắt sáng, giải độc, giảm ho, đau họng; giúp lợi tiểu phiền khát; kích thích tiêu hóa; giảm huyết áp, hạ đường huyết; kháng khuẩn, kháng viêm; trị các chứng mất ngủ, mắt đỏ, nhức đầu, đau răng. Liều dùng thông thường theo Y học dân gian là từ 3 -10g; thường sắc lấy nước uống hoặc dùng ngoài. Liều dùng ngoài có thể lơn hơn tầm 5-20g. 1.5.5.2. Theo y học hiện đại  Tác dụng chống oxy hóa Chè đắng có hoạt tính chống oxy hóa rất tốt. Các nghiên cứu cho thấy trong chè đắng có nhiều hợp chất của axit phenolic là hợp chất chịu trách nhiệm chính cho tác dụng chống oxy hóa. Phương Thiện Thương và các cộng sự đã phát hiện ra rằng chiết xuất etyl axetat có hoạt tính chống oxy hóa đáng kể. Chiết xuất có khả năng thu dọn các gốc tự do chống lại DPPH chống lại DPPH (IC 50 16,3 μg / ml), OH• (IC50 - 27,3 μg / ml), O2 • (IC50 1,3 μg / ml). Phân đoạn chiết etyl axetat cũng cho thấy tác dụng ức chế mạnh mẽ quá trình peroxy hóa ở ty thể gan chuột (IC 50 7,1 μg / ml) và bảo vệ đáng kể chống lại quá trình oxy hóa LDL qua trung gian của gốc tự do Cu2+ • (IC50 1,4 μg / ml) hoặc AAPH (IC50 4,8 μg / ml) [42, 55]. Liều 200 mg/kg polyphenol được chiết xuất từ lá chè đắng cho thấy tác dụng tăng các chất chống oxy hóa như superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) và glutathione (GSH) và giảm nồng độ các gốc tự do như NO, malonaldehyde (MDA) trên chuột [53]. 13
22. Cung cấp một chế độ ăn giàu chất béo hoặc nhiều fructose cho chuột có thể dẫn đến tăng cường quá trình peroxy hóa lipid và stress oxy hóa cao hơn ở gan. Việc sử dụng chiết xuất ethanol từ lá chè đắng đã được báo cáo là giảm tình trạng oxy hóa ở gan và tăng mức độ của các enzym chống oxy hóa nội sinh, bao gồm SOD và GSH- Px [22]. Hơn nữa, hoạt động chống oxy hóa của lá chè đắng cũng được báo cáo là có hiệu quả trong phòng ngừa viêm đại tràng ở chuột. Cũng trong nghiên cứu này, Xingyao Long và các cộng sự đã chỉ ra rằng polyphenol trong lá chè đắng làm giảm stress oxy hóa và tăng hoạt động của mARN của các gen mã hóa enzym chống oxy hóa trong mô ruột kết bao gồm Mn-SOD, Cu / Zn-SOD, GSH-Px và CAT. Điều này cho thấy một phương thức hoạt động của các polyphenol là gián tiếp thông qua việc điều chỉnh biểu hiện của các gen mã hóa các enzym chống oxy hóa [36].  Tác dụng điều trị đái tháo đường Đã có một sô nghiên cứu cho thấy lá chè đắng có tác dụng tốt trên chuột đái tháo đường. Ví dụ như nghiên cứu tại Trung Quốc của Chengwu Song và các cộng sự đã cho thấy sự làm giảm đáng kể mức độ tăng đường huyết và lipid máu, đồng thời điều hòa đáng kể các enzym 3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase và glucokinase trên chuột bị đái tháo đường typ 2 do alloxan gây ra [38]. Mặt khác, các dẫn xuất polyphenol và axit caffeoylquinic được điều chế từ lá chè đắng có tác dụng ức chế hoạt động của enzym α-glucosidase với giá trị IC50 là 0,16-0,39 mg / mL [46]. Nghiên cứu in vitro trên tế bào Caco 2, Zheng Wang và các cộng sự cũng cho thấy sự hấp thụ glucose của tế bào Caco 2 bị ức chế đáng kể bởi chiết xuất nước lá chè đắng [44].  Tác dụng hạ lipid máu Một số nghiên cứu cho thấy chè đắng chứa một số hoạt chất có thể giảm nồng độ lipid máu. Thử nghiệm lâm sàng, ngẫu nhiên có đối chứng của nhóm nghiên cứu Hà Thị Hồng Linh và các cộng sự cho thấy chế phẩm TMA gồm giảo cổ lam, chè đắng, hòe, ngưu tất, nghệ cho tác dụng giảm đáng kể các chỉ số LDL, triglycerit, cholesterol toàn phầm và tăng đáng kể HDL. Cao chiết toàn phần từ lá cây chè đắng cũng được Chengwu Song và các cộng sự cho thấy tác dụng hạ lipid máu trên chuột mắc hội chứng béo phì. Đồng thời nghiên cứu cũng cho thấy tác dụng tăng nồng độ HDL trong huyết thanh chuột và chỉ số sinh xơ vữa (AI) đã giảm đáng kể trên chuột sau khi dùng cao chiết lá chè đắng [39]. 14
23. Cao chiết lá chè đắng liều 50 mg/kg thể trọng đã được Shengjie Fan và các cộng sự chứng minh được là có tác dụng ngăn chặn sự tăng trọng của cơ thể, giảm kích thước của tế bào mỡ, giảm triglycerid huyết thanh, cholesterol, LDL-cholesterol, mức đường huyết lúc đói và dung nạp glucose ở chuột được cho ăn với chế độ ăn nhiều chất béo [25]. Chiết xuất ethanol của lá chè đắng cũng đã chứng minh là cải thiện các thông số cholestrol toàn phần, cũng như LDL- C ở những con chuột ăn một chế độ giàu chất béo [25]. Mặt khác, lysoglycerophospholipid là một dấu ấn sinh học tiềm năng đối với chứng tăng lipid máu. Chúng hoạt động mạnh nhất bắt nguồn từ việc thủy phân loại bỏ một trong các axit béo khỏi màng phospholipid. Shi và cộng sự đã thí nghiệm điều trị bằng saponin có nguồn gốc từ lá chè đắng đã làm tăng hàm lượng lysoglycerophospholipid so với những con chuột chỉ nhận chế độ ăn giàu chất béo. Ngoài ra, nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng những con chuột bị tăng lipid máu có mức độ giảm của lysoglycerophospholipid với mức độ không bão hòa cao hơn những con chuột sử dụng saponin từ lá chè đắng. Nghiên cứu của Yanyun Che và các cộng sự thì chỉ ra rằng kudinoside D đã điều hòa các yếu tố phiên mã tạo mỡ thông qua sự phosphoryl hóa của protein kinase hoạt hóa AMP và tăng biểu hiện phosphoryl hóa-acetyl CoA carboxylase đích [21].  Tác chống ung thư Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và chỉ ra rằng cao chiết lá chè đắng có nhiều đặc tính chống ung thư. Kai Zhu và các cộng sự đã chỉ ra tác dụng chống ung thư của lá chè đắng trên tế bào ung thư buổi mô lưỡi người TCA8113. Nghiên cứu cho thấy ở nồng độ 200 μg / ml, lá chè đắng có tác dụng ức chế đến 75% sự tăng sinh trong tế bào TCA8113, cao hơn so với nồng độ 100 μg / ml (đạt 41%). Chè đắng cũng có tác dụng chống di căn đối với các tế bào ung thư thông qua giảm biểu hiện của metalloprotease nền gia tăng biểu hiện của chất ức chế mô của metalloproteinase. Trên mô hình chuột ung thư niêm mạc, lá chè đắng cũng làm giảm thể tích khối u so với những con chuột không được lá chè đắng [56]. Ở nồng độ 200 μ g / ml, Kudecha ức chế 81% sự phát triển của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MCF-7 [54]. Một nghiên cứu khác cũng cho thấy tại các nồng độ 25, 50 và 100 μg / mL polyphenol chiết xuất lá chè đắng ức chế sự tăng sinh tế bào của dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào vảy ở người. Trong đó nồng độ 100 μg / mL cho thấy khả năng ức chế cao nhất là 72.3%. Bằng các thực nghiệm RT-PCR và Western blot, Xin Zhao và các cộng sự chỉ ra cơ chế hoạt động của các polyphenol này gây ra quá trình apoptosis 15
24. bằng cách điều chỉnh caspase-3, caspase-8, caspase-9, Fas / FasL, Bax, p53, p21, E2F1, p73 và điều chỉnh giảm Bcl-2, Bcl-xL, HIAP-1, và HIAP-2 mRNA và biểu hiện protein [52].  Tác dụng khác Tác dụng giải độc: Nghiên cứu của Lương Thị Hồng Vân và Nông Thanh Sơn cho thấy dịch chiết lá chè đắng có tác dụng đáng kể đối với nhiễm sắc thể trên chuột nhắn trắng bị nhiễm độc 2,4D [18]. Tác dụng chống viêm: Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng chống viêm của cao chiết lá chè đắng. Ví dụ như nghiên cứu của Xin Zhao và các cộng sự đã cho thấy nồng độ cao của cao chiết chè đắng có tác dụng giảm nồng độ cytokine tiền viêm trong huyết thanh, interleukin 6 và yếu tố hoại tử khối u, đồng thời ức chế tổn thương dạ dày do viêm trên chuột [50]. 1.5.6. Tính an toàn của lá chè đắng Chè đắng cung cấp một giải pháp tiềm năng an toàn. Các nghiên cứu ở chuột liều lên đến 10.000 mg / kg dùng đường uống trong 14 ngày, thì tỷ lệ tử vong đều không vượt quá 50%. Điều này cho thấy LD50 của chè đắng cao hơn 10.000 mg / kg [48]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của Svenja Wüppe và các cộng sự gần đây trên mô hình chuột ăn nhiều chất béo phát hiện ra rằng việc bổ sung cao chiết lá chè đằng và γ-cyclodextrin trong 6 tuần làm tăng khối lượng gan và tăng nồng độ cholesterol trong huyết tương so với nhóm chuột đối chứng [45]. Ngoài ra các nghiên cứu ở nồng độ cho tác dụng đều chưa ghi nhận các tác dụng không mong muốn đáng kể nào. 16
25. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Mẫu thực vật Nguyên liệu là lá cây chè đắng được thu hái tại Cao Bằng vào tháng 8 năm 2020. Lá được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 50 oC tới khối lượng không đổi và được bảo quản trong túi nilong. Hình 2.1: Lá cây chè đắng sau khi phơi khô Hình 2.2: Lá cây chè đắng sau khi cắt nhỏ, sấy khô Mẫu nghiên cứu được bộ môn Dược liệu và Dược cổ truyền, trường Đại học Y Dược giám định tên khoa học là Ilex kaushue S. Y. Hu thuộc họ Trâm bùi 17
26. (Aquifoliaceae). Mẫu tiêu bản được lưu trữ tại bộ môn Dược liệu và Dược cổ truyền, trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Dược liệu lá chè đắng khô (800 g) được cắt nhỏ, tiến hành chiết xuất bằng dung môi ethanol 30% (3 lần) sử dụng thiết bị siêu âm ở 50 oC trong vòng 1 giờ. Gộp các dịch chiết ethanol sau đó lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi đến khi thu được cao dược liệu (197g). Quy trình được chiết xuất được liệu được thể hiện ở hình 2.3 Hình 2.3: Quy trình chiết xuất lá chè đắng 2.1.2. Động vật thí nghiệm 18
27. Chuột nhắt trắng, giống đực, chủng Swiss, trọng lượng 20-22g được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương. Trước khi tiến hành thử nghiệm, chuột nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm trong 5 ngày. Điều kiện nuôi ở 22 - 26 độ. Chuột được nuôi bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp, nước sạch được cho uống tự do. 2.2. Hóa chất và thiết bị Hóa chất Enzym Yeast -glucosidase (Sigma, Singapore); Etanol 96% (EtOH) (Shouguang, Trung Quốc); p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG), 4- Nitrophenol (Sigma); Streptozocin (250mg, Alddin, Trung Quốc); Gliclazide (Diamicron PMR 60mg); Nước muối sinh lý NaCl 0,9%; Dung dịch đệm citrate pH = 4,3; Các loại hóa chất phòng thí nghiệm khác đạt độ tinh khiết cao. Máy móc thiết bị Máy khuấy từ của hàng Shimadzu, Nhật Bản Cân phân tích AY 220 của hãng Shimadzu, Nhật Bản Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC- 150H, MRC, Isareal Các dụng cụ khác sử dụng trong phòng thí nghiệm như: ống nghiệm, ống đong, cốc có mỏ, pipet, đũa thủy tinh, giấy lọc, bình tam giác, tủ hút, bếp điện, 2.3. Phương pháp nghiên cứu Hình 2.4: Quy trình nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp xác định một số hợp chất chính trong cao chiết bằng GC – MS / MS 19
28. Nguyên tắc GC – MS / MS là một hệ thống phân tích sắc kí khí kết hợp với khối phổ song song. Mẫu được làm bay hơi và đi qua một cột mao quản chứa pha tĩnh. Các hợp chất trong mẫu được khí trơ như argon, heli, đẩy ra một cách lần lượt theo thời gian. Khi ra khỏi cột phân tích, các chất phân tích đi vào khối phổ kế song song (MS / MS) bao gồm hai máy phân tích khối lượng được ngăn cách bằng một ô va chạm. Các mảnh được chọn trong máy phân tích đầu tiên được phản ứng với khí trơ trong ô va chạm, dẫn đến phân mảnh tiếp tục. Các ion sản phẩm con này sau đó được phân giải trong ba tứ cực để phân tích. Các ion được phân tích dựa trên tỷ lệ khối lượng và điện tích (m/z) khác nhau của chúng. Cách tiến hành Mẫu được chiết được pha trong dung môi methanol bằng sóng siêu âm, được lọc qua màng lọc PTFE 0,45um và đem phân tích định tính bằng phương pháp GC- MS/MS. Sử dụng hệ sắc ký khí khối phổ GC-MS/MS 7000D Triple Quad của hãng Agilent. Điều kiện chạy sắc ký khối phổ sử dụng cột DB-5ms: 30m x 250µm x 0.25µm. Nhiệt độ vòi phun khí là 230 oC. Chương trình nhiệt độ: 50 oC - 2 phút; tăng 10 oC/phút cho tới 250 oC. Tổng thời gian chạy là 30 phút. Nguồn ion hóa là EI, với năng lượng ion hóa là 70eV. Quét khối phổ với dải quét là 100-350. Cách đánh giá kết quả Kết quả sau chạy được định tính trên dữ liệu của thư viện NIST 14 để xác định chất. 2.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym - glucosidase Nguyên tắc phản ứng Enzym α-glucosidase xúc tác quá trình chuyển cơ chất p-nitrophenyl- α-D- glucopyranoside thành α-glucose và p-nitrophenol có màu vàng nhạt- hấp thụ cực đại tại 405 nm. Chất kìm hãm enzym làm cường độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm. Dựa vào độ hấp thụ của dung dịch khi có hoặc không có mặt chất thử. Từ đó suy ra phần trăm ức chế enym. Dựa vào phần mềm xác định IC50 (nồng độ của mẫu tại đó ức chế 50% enzym). Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. Cách tiến hành Hoạt động ức chế α-glucosidase của cao chiết lá chè đắng được thực hiện bằng phương pháp sau [43]: Chất thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng trong đệm phosphate 10 mM (pH 6,8) và 50 µl được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 256 µg/ml, 64 µg/ml; 16 µg/ml; 4 µg/ml; 20
29. 20 µl -glucosidase (0,2U/ml) và 130 µl đệm phosphate 100 mM (pH 6,8) được thêm cho mỗi giếng, trộn đều và ủ ở 37°C trong 15 phút. Cơ chất -nitrophenyl- -D-glucopyranoside (pNPG) được đưa tiếp vào từng giếng nghiệm rồi ủ tiếp ở 37°C trong 60 phút. Đĩa thí nghiệm chỉ có mẫu thử, đệm phosphate và pNPG được sử dụng làm đối chứng trắng (blank). Giếng thí nghiệm chỉ có DMSO 10%, đệm phosphate, enzyme và pNPG được sử dụng làm đối chứng. Thí nghiệm được y lặp lại 3 lần để đảm bảo sự chính xác. Dừng thí nghiệm bằng cách thêm vào 80 µl Na2CO3 0,2M. Độ hấp thụ của phản ứng được xác định trên BIOTEK với bước sóng 410 nm (A). Tính toán và xử lý số liệu Khả năng ức chế enzym a-glucosidase của mẫu được xác định theo công thức: Độ ức chế (%) = (A(đối chứng) – A(mẫu thử))  A(đối chứng) x 100% Giá trị IC50 được xác định bằng phần mềm TableCurve 2Dv4. 2.3.3. Phương pháp gây đái tháo đường trên chuột béo phì 2.3.3.1.Gây béo phì Chuột được nuôi ở điều kiện bình thường, và cho ăn thức ăn tiêu chuẩn trong 5 ngày để thích nghi với điều kiện môi trường mới. Sau đó được phân ngẫu nhiễn thành 2 nhóm. Nhóm 1: chế độ ăn bình thường (thức ăn tiêu chuẩn do Viện vệ sinh dịch tễ cung cấp) Nhóm 2: chế độ ăn với thức ăn giàu dinh dưỡng (35% chất béo mỡ lợn) để gây béo phì. Chuột của hai nhóm được nuôi trong 28 ngày liên tục. Sau 28 ngày nuôi, tiến hành cân trọng lượng để chọn những con chuột đạt trọng lượng trên 35g được coi là đạt tiêu chuẩn để tiến hành gây mô hình đái tháo đường. 2.3.3.2.Gây ĐTĐ typ 2 bằng Streptozocin Sau khi gây được mô hình chuột béo phì thành công, tiến hành gây ĐTĐ typ2. Phương pháp tạo mô hình ĐTĐ thực nghiệm ở chuột được thực hiện bằng cách tiêm STZ màng bụng. STZ được pha trong đêm citrat 0.01M, pH = 4.3 (pha 250ml đệm citrate gồm: 0,2966 g axit citric monohydrate và 0,2996 natri citrate dihydrat). Sau khi nuôi, chuột được nhịn đói khoảng 8h, tiến hành tiêm màng bụng STZ liều 50mg/kg trong 3 ngày liên tiếp. Sau một giờ kể từ khi tiêm STZ bổ sung thức ăn theo chế độ dinh dưỡng ban đầu trong 10 ngày và theo dõi nồng độ đường huyết. Tiến 21
30. hành đo đường huyết máu đuôi chuột vào ngày thứ 5. Chọn các chuột béo phì bị ĐTĐ (có nồng độ glucose huyết lúc đối trên 10 mmol/L được cọi là ĐTĐ) tham gia tiếp nghiên cứu [30]. 2.3.4. Đánh giá tác dụng hạ glucose của dịch chiết lá chè đắng Phân lô nghiên cứu Chuột bị ĐTĐ type 2 được tiến hành phân lô để nghiên cứu khả năng hạ đường huyết khi xử lý với các mẫu nghiên cứu khác nhau. Chuột được phân thành 5 nhóm ngẫu nhiên. Nhóm 1: Nhóm chứng sinh lý, chuột bình thường, cho uống nước cất Nhóm 2: Nhóm chứng bệnh tiểu đường: chuột bị tiểu đường do tiêm STZ và uống nước cất Nhóm 3: Nhóm chứng dương: chuột tiểu đường do tiêm STZ và cho uống glibenclamid liều 50mg/kg Nhóm 4: Chuột tiểu đường do tiêm STZ cho uống cao chiết lá chè đắng liều 100mg/kg (liều 1) Nhóm 5: Chuột tiểu đường do tiêm STZ và cho uống cao chiết lá chè đắng liều 200mg/kg (liều 2) Các nhóm chuột được điều trị trong 28 ngày. Trọng lượng của chuột được theo dõi mỗi ngày, và chuột được uống nước cất, uống thuốc và cao chiết cố định vào 8-9 giờ sáng hàng ngày. Đường huyết của chuột được theo dõi vào buổi sáng (sau khi nhịn ăn cả đêm trước khi đo) các ngày 0, thứ 10, thứ 20 và thứ 28. Sau khi đo đường huyết, chuột được cho ăn và uống nước bình thường. Cách pha mẫu Cao chiết lá chè đắng được hòa tan vào nước thành nồng độ 200mg/ml (liều 1) và 400mg/ml (liều 2) và cho chuột uống theo cân nặng của chuột (0.05ml/10g) ở nhóm 4 và nhóm 5 Định lượng glucose trong máu chuột Máu sử dụng để định lượng glucose huyết là máu toàn phần lấy từ đuôi chuột. Định lượng glucose máu bằng máy đó đường huyết tự động On Call Plus (Johnson & Johnson, USA) và có bộ que thử tương ứng. Nguyên tắc: Glucose trong máu phản ứng với oxy không khí dưới xúc tác đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong que thử tạo thành axit gluconic và H 2O2. H2O2 sau đó phân hủy giải phóng oxy, oxy hóa dianisidin tạo thành phức chất màu vàng. Độ đậm nhạt của màu phụ thuộc vào nồng độ glucose chứa trong mẫu máu. Quy trình đo đường huyết với máy On Call Plus 22
31. Máy On Call Plus là máy bán tự động đo được glucose trong máu toàn phần. Gắn một que thử để khởi động máy. Nhấn nút C để chọn mã số phù hợp với mã que thử. Tạo vết cắt trên đuôi chuột, bỏ giọt máu đầu, lấy giọt máu thứ 2. Mẫu máu dùng cho việc đo là khoảng 1 µl. Thấm nhẹ giọt máu vào một đầu que, máu sẽ tự thấm vào đầu que thử. Sau 7 giây kết quả hiện thị trên hình. 2.3.5. Đánh giá tác dụng hạ lipid máu của dịch chiết lá chè đắng Sau khi kết thúc thí nghiệm (28 ngày). Cho chuột nhịn ăn trước 24 giờ khi lấy mẫu. Chuột được gây mê bằng diethyl ether, dùng kim tiêm 1 mL để tiến hành lấy máu tim chuột. Sau 28 ngày điều trị, mẫu nhược thu thập vào các ống có chứa heparin. Huyết thanh được tách ra bằng cách ly tâm ở 3000 vòng/phút ở 25°C trong 15 phút và được gửi đến bệnh viện Đại học Y Hà Nội để phân tích các chỉ số hóa sinh: cholesterol tổng, cholesterol, HDL cholesterol, triglycerid. Nguyên tắc: Định lượng Cholesterol huyết thanh Thuỷ phân cholesterol este bằng enzym cholesterol esterase (CHE) và oxy hoá bằng cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quinonimin tạo nên từ phản ứng hydrogen peroxide với 4- aminophenazone và phenol nhờ xúc tác cà peroxidase. Tính kết quả: Đo mật độ quang của Quinonimin với ống chuẩn Nguyên tắc định lượng triglycerid huyết thanh Thuỷ nhân triglycerid bằng enzym lipase, định lượng glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quinonimin tạo thành từ 4 - aminoantipyryl và 4 - chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các như phản ứng sau: 23
32. Tính kết quả: Đo mật độ quang học quinonimin ở bước sóng 546 nm rồi so với chuẩn của bộ KIT của hãng thương mại. 24
33. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 3.1. Kết quả của chiết cao dược liệu Tiến hành chiết tách từ 800g lá chè đắng, thu được 197g cao. Hiệu suất của quy trình là 24, 62%. Đồng thời mẫu cao chiết cũng được xác định hàm ẩm đạt 6,4%. 3.2. Kết quả phân tích mẫu cao chiết bằng GC- MS / MS Phổ GC - MS / MS của cao chiết lá chè đắng thu được như hình 3.1. Bảng 3.1 liệt kê trong đó 17 hợp chất chính đã được xác định có trong mẫu chiết. So sánh khối phổ của các cấu tử và định tính trên dữ liệu của thư viện NIST 14 xác định được các chất. Các hợp chất được tìm thấy trong cao chiết gồm có alkaloid, các hợp chất của phenyl, benzyl như benzaldehyde 4-(dimethylamino)-2-hydroxy-; 2- Phenylindolizine; phenol, 2,5-bis(1-methylethyl)-, acetate; 4-(2- phenylvinyl)pyridine, trans-; 1,2-benzendiol, O,O'-di(trans-3- trifluoromethylcinnamoyl)-; anthranoid: anthracene, 9,10-dihydro-9-(1- methylpropyl)-; chất chống oxi hóa: Felbinac, 3.3. Kết quả tác dụng ức chế enzym -glucosidase in vitro của cao chiết chè đắng Hoạt tính ức chế của cao chiết lá chè đắng tại các nồng độ 256 µg/ml, 64 µg/ml; 16 µg/ml; 4 µg/ml được trình bày trong bảng 3.2. Kết quả cho thấy cao chiết lá chè đắng có hoạt tính ức chế α –glucosidase trung bình với giá trị IC 50 là 147,25 µg / ml. Acarbose được sử dụng làm đối chứng và có hoạt tính ức chế men α – glucosidase với giá trị IC50 là 156,08 µg / ml. Bảng 3.2: Tác động ức chế enzym α –glucosidase của cao chiết lá chè đắng 256 µg/ml 64 µg/ml 16 µg/ml 4 µg/ml IC50 (g/ml) Cao chiết (%) 81.6 30,9 9,7 5 147,25 Acarbose (%) 75.5 26.5 11 3 156,08 25
34. Hình 3.1: Sắc kí đồ GC - MS / MS của chiết xuất etanol của lá cây chè đắng 26
35. Bảng 3.1: Các chất chính được xác định trong chiết xuất etanol của lá cây chè đắng bởi GC – MS / MS Pic Thời Độ tin Phân tử Công thức sắc gian lưu Tên hợp chất cậy khối phân tử kí (tR) (%) (g/mol) benzaldehyde, 4- 1 4.575 75.67 C H NO 165.19 (dimethylamino)-2-hydroxy- 9 11 2 2 7.056 2-Phenylindolizine 63.33 C14H11N 193.24 3 7.058 Cyclotrisiloxane, hexamethyl- 64.82 C6H18O3Si3 222.46 7-Hydroxy-7,8,9,10-tetramethyl- 4 7.058 7,8-dihydrocyclohepta[d,e]s 70.04 C18H20O 252.3 naphthalene 7,8-Dimethoxy-2-methyl-1-(4'- 5 7.598 hydroxybenzyl)-1,2,3,4- 64.54 C19H23NO3 313.4 tetrahydroisoquinoline 1H-Inden-1-one, 5- 6 13.362 60.79 C H NO 175.23 (dimethylamino)-2,3-dihydro- 11 13 Anthracene, 9,10-dihydro-9-(1- 7 14.762 65.76 C H 236.35 methylpropyl)- 18 20 8 15.162 7-Methoxy-2,3-dimethylindole 74.77 C11H13NO 175.23 9 15.483 5-Methylpyrimido[3,4-a]indole 75.69 C12H10N2 182.22 l-Leucine, N-ethoxycarbonyl-N- 10 15.499 62.70 C H NO 427.7 methyl-, pentadecyl ester 25 49 4 11 16.417 9H-Fluoren-9-one 70.70 C13H8O 180.2 Phenol, 2,5-bis(1-methylethyl)-, 12 16.818 67.16 C H O 220.31 acetate 14 20 2 4-(2-Phenylvinyl)pyridine, 13 17.264 68.00 C H N 181.23 trans- 13 11 14 17.267 5H-Indeno[1,2-b]pyridin-5-one 64.25 C12H7NO 181.19 15 17.960 Felbinac 66.52 C14H12O2 212.24 1,2-Benzendiol, O,O'-di(trans-3- 16 18.724 60.18 C H F O 506.39 trifluoromethylcinnamoyl)- 26 16 6 4 Anthracene-9,10-biimine-11,12- 17 23.171 dicarboxylic acid, 9,10-dihydro-, 65.42 C20H20N2O4 352.4 diethyl ester 27
36. 3.4. Kết quả gây đái tháo đường trên chuột béo phì 3.4.1. Kết quả gây béo phì Sau 28 ngày được nuôi theo chế độ, chuột được gây béo phì đã tăng cân rõ rệt. Sự thay đổi về thể trọng chuột trung bình của các nhóm thí nghiệm sau 28 ngày được thể hiện trong bảng 3.3. Bảng 3.3: Thể trọng chuột sau 28 ngày nuôi theo mô hình béo phì thực nghiệm. Khối lượng (g) Nhóm Thay đổi (%) Ngày 0 Ngày 28 Nhóm nuôi 20,3 ± 1,21 34,2 ± 1,28  68,47% thường (n=10) Nhóm nuôi béo 21,1 ± 1,43 46,5 ± 1,32  120,38% (n=40) 50 46.5 45 40 34.2 35 30 25 20.3 21.1 20 Trọng lượng 15 10 5 0 Lô nuôi thường Lô nuôi béo Ngày 0 Ngày 28 Hình 3.2: Thể trọng chuột sau 28 ngày nuôi theo mô hình gây béo phì thực nghiệm. Nhận xét: Nhóm chuột ăn thức ăn bình thường sau 28 ngày nuôi thì khối lượng cơ thể tăng so với ngày bắt đầu thí nghiệm là 13,9 g (tăng 68,47 %), nhóm chuột nuôi với chế độ giàu chất béo thì khối lượng cơ thể tăng so với ngày đầu thí nghiệm là 25,4 g (tăng 120,38 %). Chuột nuôi với chế độ ăn giàu chất béo có khối lượng cơ thể lớn hơn chuột nuôi thường là 12,3 g tương đương tăng 35,96%. Như vậy có thể kết luận chuột nuôi bằng thức ăn giàu chất béo đã tăng cân rõ rệt về khối lượng so với chuột nuôi chế độ ăn thức ăn thường. 3.4.2. Kết quả gây ĐTĐ trên chuột béo phì 28
37. Chọn các con chuột béo phì có khối lượng từ 35 g trở lên để làm tiếp thí nghiệm. Chuột được chia làm hai lô, kiểm tra đường huyết trước khi tiêm STZ. Tiến hành tiêm STZ liều 50 mg/kg trong 3 ngày liên tục. Sau đó kiểm tra đường huyết vào ngày thứ 5 và thứ 10. Kết quả được thể hiện trong bảng. Bảng 3.4. Nồng độ glucose máu của các nhóm chuột tiêm STZ và tiêm đệm (đơn vị mmol/L) Sau khi tiêm Chuột Trước khi tiêm 5 ngày 10 ngày Lô tiêm điệm 5,9 ± 1,12 6,4 ± 2,21 6,9 ± 1,43 Lô tiêm STZ 6,1 ± 0,79 8,7 ± 0,98 11,5 ± 1,38 Nhận xét: Từ bảng 3.4 ta thấy lô đối chứng (lô tiêm đệm) nồng độ glucose máu tương đối ổn định theo thời gian, xung quanh nồng độ 6 mmol/L. Nhưng lô tiêm STZ nồng độ đường huyết trước khi tiêm là 6,1 ± 0,79 mmol/L, ngày thứ 5 sau khi tiêm STZ đã tăng lên 42,62 %; tới ngày thứ 10 nồng độ đường huyết chuột là 11,5 ± 1,38 (88,52%). Kết quả cho thấy, việc gây mô hình bệnh đái tháo đường trên chuột béo phì bằng STZ là thành công. 3.5. Kết quả điều trị bằng cao chiết 3.5.1. Kết quả của cao chiết lá chè đắng trên khối lượng chuột Bảng 3.5: Tác dụng của cao chiết lá chè đắng lên trọng lượng chuột Đơn vị: g Trước điều trị Sau điều trị Sau điều trị % thay đổi 15 ngày 28 ngày Nhóm 1 43,5 ± 0,92 45,2 ± 2,41 46,7 ± 3,21 Tăng 7,34% Nhóm 2 47,9 ± 1,12 50,2 ± 1,75 52,8 ± 2,93 Tăng 10,27% Nhóm 3 39,8 ± 2,22 35,1 ± 2,45 33,6 ± 1,72 Giảm 15,51% Nhóm 4 47,1 ± 1,51 44,7 ± 1,78 41,3 ± 2,44 Giảm 12,22% Nhóm 5 44,5 ± 1,32 39,1 ± 2,95 36,7 ± 1,12 Giảm 17,35% 29
38. 60 52.8 47.9 50 46.7 47.1 43.5 44.5 39.8 41.3 40 36.7 33.6 30 20 chuột Trọng lượng 10 0 Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3 Nhóm 4 Nhóm 5 Trước điều trị Sau điều trị 28 ngày Hình 3.3: Trọng lượng của các nhóm chuột trước và sau khi điều trị 28 ngày. Nhận xét: Từ bảng 3.5 và hình 3.3 cho thấy kết quả tác dụng của cao chiết lá chè đắng lên trọng lượng chuột. Từ bảng ta có thể thấy, trọng lượng chuột ở nhóm sinh lý (nhóm 1) và nhóm chứng bệnh (nhóm 2) có tăng nhẹ (7,34% và 10,27%). Nhóm được điều trị bằng glibenclamid (nhóm 3) trọng lượng chuột nhóm nhẹ (15,51%). Hai nhóm điều trị với cao chiết liều 100 mg/kg và 200mg/kg có trọng lượng chuột giảm tương tự với thuốc điều trị glibenclamid. Liều cao chiết lá chè đắng 200mg/kg (giảm 12,22%) cho thấy việc giảm trọng lượng cao hơn liều 100 mg/kg (giảm 17,35%). 3.5.2. Kết quả cao chiết lá chè đắng trên glucose máu Bảng 3.6: Ảnh hưởng của dịch chiết lá chè đắng lên nồng độ glucose huyết. Thay đổi Ngày 0 Ngày 10 Ngày 20 Ngày 28 (%) Nhóm 1 5,07 ± 0,66 5,58±1,04 5,79±1,01 5,14±0,91  1,38 Nhóm 2 14,58±3,21 15,02±2,24 16,09±2,51 16,23±2,31#  11,31 Nhóm 3 15,83±1,21 13,25±3,32 11,27±2,36 9,52±2,25*  39,86 Nhóm 4 15,07±1,45 13,87±1,89 12,69±1,35 10,52±1,34*  30,19 Nhóm 5 14,69±2,53 12,67±2,12 11,57±1,82 8,91±1,12*  39,35 Khác biệt có ý nghĩa thống kê, #p<0,05 so sánh với nhóm 1; *p<0,05 so sánh với nhóm 2. 30
39. 20 16.23 15.83 18 14.58 15.07 14.96 16 14 10.52 12 9.52 8.91 10 8 5.075.14 6 4 2 Nồng độ glucose huyết (mmol/L) 0 Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3 Nhóm 4 Nhóm 5 Ngày 0 Ngày 28 Hình 3.4: Chỉ số glucose huyết của các nhóm chuột trước và sau khi điều trị 28 ngày. Nhận xét: Từ bảng 3.6 và hình 3.4 cho thấy, nồng độ glucose huyết tăng đáng kể ở nhóm chứng bệnh (nhóm 2) khi so sánh với nhóm chứng sinh lý. Nhóm chuột đái tháo đường điều trị bằng glibenclamid và nhóm chuột được điều trị bằng cao chiết liều 100mg/kg và liều 200mg/kg đều giảm nồng độ glucose huyết so với trước khi điều trị và đặc biệt giảm đáng kể so với nhóm chứng bệnh đái tháo đường (p < 0,05). Tác dụng hạ glucose huyết của cao chiết liều 200mg/kg đạt 39,35% cho thấy hiệu quả hơn so với tác dụng hạ đường huyết của liều 100mg/kg (đạt 30,19%). 3.5.3. Kết quả cao chiết lá chè đắng trên lipid máu Bảng 3.7. Tác dụng cao chiết chè đắng lên lipid máu (mg/ml) trên chuột bị tiểu đường do streptozotocin sau 28 ngày điều trị. Nhóm Cholesterol toàn Triglycerit HDL LDL phần (mg/ml) (mg/ml) cholesterol cholesterol (mg/ml) (mg/ml) Nhóm 1 45,78±2,5 60,1±5,2 42,3±3,5 17,5±2,5 Nhóm 2 86,7 ± 4,6# 97,9±5,5# 16,1±3,3# 50,2±2,4# Nhóm 3 65,6 ±5,5* 73,7±5,4* 31,9±3,4* 29,6±2,9* 31
40. Nhóm 4 69,4±4,8* 76,7±5,3* 35,5±3,8* 35,4±3,5* Nhóm 5 66,7±3,9* 75,4±4,7* 32,5±4,5* 30,4±4,2* Khác biệt có ý nghĩa thống kê, #p<0,05 so sánh với nhóm I; *p<0,05 so sánh với nhóm II. Nhận xét: Bảng 3.7 trình bày tác dụng của cao chiết lá chè đắng lên nồng độ lipid máu của các nhóm chuột nghiên cứu sau 28 ngày sau khi uống cao chiết. Nhóm chuột được điều trị cao chiết liều 100mg/kg và 200mg/kg có khả năng làm hạ nồng độ cholesterol toàn phần, triglycerit và LDL-cholesterol đáng kể so với nhóm chứng bệnh (p<0,05). Hơn nữa, hai liều cao chiết 100mg/kg và 200mg/kg cũng cho thấy hiệu quả làm tăng đáng kể nồng độ HDL-cholesterol so với nhóm chứng bệnh (p<0,05). 32
41. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN STZ là một hợp chất glucosamine nitrosorea được định nghĩa về mặt hóa học là C8H15N3O7 có khả năng gây ra bệnh tiểu đường ở hầu hết các loài động vật có vú [32]. STZ có độc tính cụ thể đối với tế bào β sản xuất insulin của tuyến tụy ở động vật. STZ được tìm thấy trong một chủng Streptomyces achromogenes vào những năm 1950. Hiện nay, STZ đang được sử dụng trong y học để điều trị một số bệnh ung thư của đảo nhỏ tuyến tụy Langerhan và cũng được sử dụng làm tác nhân gây bệnh tiểu đường hiệu quả trên các mô hình động vật thực nghiệm. Cơ chế gây độc: STZ nhận biết và xâm nhập vào tế bào β thông qua chất vận chuyển glucose GLUT2, alkyl hóa và phá hủy DNA, cuối cùng dẫn đến hoại tử tế bào. Hoạt động alkyl hóa được cho là do hoạt động của nhóm nitrosourea, đặc biệt là vị trí O6 của guanin [33]. Ngoài ra, STZ cũng kích hoạt quá trình ribosyl hóa poly adenosine diphosphate và giải phóng oxit nitric. Kết quả là các tế bào tuyến tụy bị phá hủy do hoại tử. Có nhiều phương pháp gây đái tháo đường trên động vật kèm theo biến chứng. Qua tham khảo các tài liệu chúng tôi chọn phương pháp dùng STZ liều thấp kết hợp cho ăn chế độ nhiều chất béo để gây bệnh tiểu đường cho chuột thí nghiệm [3, 6, 20]. Chế độ ăn giàu chất béo vừa có tác dụng làm chuột bị béo phì, bị kháng insulin lại vừa có tác dụng gây nên nguy cơ bị bệnh tim mạch. Khi sức đề kháng của chuột bị suy yếu, tiêm STZ liều thấp sẽ phá hủy các tế bào tuyến tụy vừa đủ để làm tăng hàm lượng glucose trong máu, tạo ra một mô hình chuột bị tiểu đường type 2 giống như ở người. Mô hình được đảm bảo dựa trên cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 với chi phí thấp, dễ thực hiện và hữu ích trong các mô hình đánh giá tiền lâm sàng với các thuốc có tiềm năng điều trị ĐTĐ [33, 49]. -glucosidase là một enzym nằm trong màng tế bào đường ruột, tập trung nhiều ở ruột non, tham gia vào quá trình hấp thu đường từ hệ tiêu hóa [31]. Vì vậy, các chất chế enzym này sẽ làm giảm quá trình hấp thụ các hợp chất của glucose vào máu. Các chất ức chế enzym -glucosidase đã được sử dụng làm thuốc điều hành đái tháo đường typ 2 như acarbose, miglitol, voglibose [4]. Acarbose là thuốc tân dược được nghiên cứu tương đối rõ ràng và sử dụng rộng rãi hiện nay. Acarbose cũng là một chất được sử dụng làm chất chứng cho các thí nghiệm về tác dụng ức chế enzym - glucosidase của các hợp chất khác. Trong nghiên cứu này acarbose được sử dụng làm chất chứng dương cho thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế enzyme - glucosidase của cao chiết lá chè đắng. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy cao chiết lá chè đắng có IC50 là 147,25 µg/ml gần như tương tự acarbose (156,08 µg/ml). Cao 33
42. chiết lá chè đắng trong cồn 30o nên không chiết được nhiều hợp chất không phân cực. Tuy nhiên, giá trị IC50 trung bình cho thấy lá chè đắng có khả năng ức chế enzym α- glucosidase rất lớn. Theo nghiên cứu của Hà Thị Bích Ngọc và các cộng sự cho thấy hợp chất 24-methyl (3 -hydroxy-lup-20(29)-en-24-oic acid) ester gây ức chế 59,5% hoạt tính của enzym α-glucosidase tại nồng độ 4 μg/ml [13]. Trong tương lai việc nghiên cứu phân lập thêm các hợp chất có khả năng ức chế men α-glucosidase từ lá chè đắng cần thiết. Tong mô hình nghiên cứu này, ngoài việc so sánh với nhóm chúng sinh lý, nhóm chứng tiểu đường được cho uống nước cất, còn sử dụng gliclazide làm thuốc đối chứng dương. Gliclazid thuộc thế hệ thứ hai nhóm sulfonylure dược sử dụng để điều trị ĐTĐ, kích thích tế bào  sản xuất insulin do đó làm giảm nồng độ glucose trong máu, được sử dụng cho các bệnh nhân bị ĐTĐ không phụ thuộc insulin. Theo y học cổ truyền của Việt Nam, lá chè đắng đã được sử dụng để điều trị nhiều bệnh trong đó có đái tháo đường. Các nghiên cứu hiện nay cũng có thấy chiết xuất lá chè đắng có nhiều tác dụng như chống oxy hóa, hạ lipid máu, điều trị đái tháo đường. Nghiên cứu in vitro trên tế bào Caco 2 Zheng Wang và các cộng sự cũng cho thấy sự hấp thụ glucose của tế bào Caco 2 bị ức chế đáng kể bởi chiết xuất nước lá chè đắng [44]. Cao chiết toàn phần từ lá cây chè đắng cũng được Chengwu Song và các cộng sự cho thấy tác dụng hạ lipid máu trên chuột mắc hội chứng béo phì [39]. Đồng thời nghiên cứu cũng cho thấy tác dụng tăng nồng độ HDL trong huyết thanh chuột và chỉ số sinh xơ vữa (AI) đã giảm đáng kể trên chuột sau khi dùng cao chiết lá chè đắng. Cao chiết lá chè đắng liều 50 mg/kg thể trọng đã được Shengjie Fan và các cộng sự chứng minh được là có tác dụng ngăn chặn sự tăng trọng của cơ thể, giảm kích thước của tế bào mỡ, giảm triglycerid huyết thanh, cholesterol, LDL-cholesterol, mức đường huyết lúc đói và dung nạp glucose ở chuột được cho ăn với chế độ ăn nhiều chất béo [25]. Lá chè đắng cũng đã chứng minh là cải thiện các thông số cholestrol toàn phần, cũng như LDL- C ở những con chuột ăn một chế độ giàu chất bé. Nghiên cứu của Hà Thị Bích Ngọc (2012) và Hà Thị Hồng Linh (2016) cũng có thấy tác dụng trong đái tháo đường và rối loạn lipid máu [11, 13]. Kết quả của chúng tôi cho thấy: trên chuột nhắt trắng mắc bệnh đái tháo đường typ 2, sau 28 ngày điều trị bằng lá Ilex kaushue chiết xuất ethanol 30% ở liều 100 mg / kg và 200 mg / kg, mức đường huyết giảm tương ứng là 30,19%. 39,35% so với nhóm đường huyết ban đầu. Ở liều 200 mg / kg, nồng độ glucose trong máu giảm cao 34
43. hơn. Nó cũng đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc giảm triglycerid, cholesterol toàn phần, cholesterol LDL và tăng cholesterol HDL. 35
44. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Xuất phát từ 2 mục tiêu nghiên cứu ban đầu, nghiên cứu đã hoàn thành và kết quả thực nghiệm đưa đến các kết luận sau: Đã tạo được mô hình chuột ĐTĐ typ 2 trên nền chuột kéo phì thực nghiệm: sau 8 tuần nuôi trọng lượng cơ thể của chuột béo phì tăng lên so với chuột bình thường. Những con chuột đủ tiêu chuẩn có trọng lượng trên 40 mg được tiêm STZ liều 50 mg/kg trong 3 ngày liên tiếp. Sau 10 ngày tiêm STZ, đã tạo được mô hình gây ĐTĐ typ 2 đã thành công với nồng độ glucose máu lúc đói đạt trên 10mmol/L. Sau 28 ngày nuôi, chuột được điều trị bằng cao chiết lá chè đắng với hai mức liều 100 mg/kg và 200 mg/kg thể trọng đã có mức giảm glucose huyết đáng kể đạt 30,19% và 39, 35% so với nhóm chứng bệnh và mức giảm tương tự như điều trị bằng thuốc glibenclamid. Cao chiết ethanol 30% của lá cây chè đắng cũng tác dụng tốt trên thể trọng chuột béo phì bị đái tháo đường và các chỉ số hóa sinh máu. Cholesterol tổng, triglycerid, LDL-cholesterol trong máu giảm đáng kể. Đồng thời nồng độ HDL-cholesterol cũng tăng đáng kể so với nhóm chứng bệnh. Đề xuất Từ những kết quả nghiên cứu như trên, nhóm nghiên cứu đưa ra đề xuất như sau: Cẩn tiếp tục nghiên cứu, tìm hiểu sâu hơn về thành phần hóa học của các hợp chất thiên nhiên có trong lá chè đắng, đặc biệt là xác định cấu trúc và định lượng cá thành phần có trong lá chè đắng có hiệu quả trên glucose máu và lipid máu ở chuột ĐTĐ typ 2. Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết lá chè đắng. Cũng như các nồng độ ethanol tối ưu để chiết xuất các hợp chất từ lá chè đắng 36
45. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Kê Thị Lan Anh và Đỗ Thị Tính (2019), Quản lý và điều trị đái tháo đường tại y tế cơ sở, chủ biên. 2. Nguyễn Tiến Bân (2003), "Danh mục các loài thực vật Việt Nam (tập 2)". 3. Đoàn Việt Bình, Nguyễn Thị Kim Dung, Nguyễn Bích Nhi và các cộng sự., "Mô hình bệnh tiểu đường biến chứng ở chuột cống trắng bằng khẩu phần mỡ cao và tiêm streptozotocin liều thấp". 4. Bộ Y tế (2017), Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị đái tháo đường típ 2, chủ biên, BYT. 5. Võ Văn Chi (2018), Từ điển cây thuốc Việt Nam (Bộ mới). T. 1-Tái bản lần thứ nhất, chủ biên, Y học. 6. Quan Thế Dân (2014), Nghiên cứu tác dụng của bài thuốc Bổ dương hoàn ngũ điều trị đái tháo đường týp 2 có biến chứng thận trong thực nghiệm và trên lâm sàng, Đại học Y Hà Nội. 7. Nguyễn Văn Đậu và Lê Ngọc Thức (2006), "Đóng góp và việc nghiên cứu hóa thực phẩm cây chè đắng Ilex kaushue S.Y.Hu (Aquifliaceae)", 22(1). 8. Nguyễn Thị Hương Giang, Lê Thị Luyến và Trần Thị Thanh Huyền (2010), Bệnh học: Sách đào tạo dược sĩ đại học, chủ biên, Y học. 9. Trương Thị Huỳnh Hoa (2013), Tìm hiểu hoạt tính sinh học ở một số cao trích từ lá chè đắng cao bằng (Ilex kaushue), Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên - ĐHQGTPHCM. 10. Trần Thị Thanh Hóa, Nguyễn Thị Phi Nga, Nguyễn Tiến Sơn và các cộng sự. (2020), "Mối liên quan giữa rối loạn lipid máu và glucagon- like peptide-1 ở bệnh nhân đái tháo đường týp 2 chẩn đoán lần đầu có thừa cân béo phì", Tạp chí Nội tiết và Đái tháo đường, (38), tr. 53-59. 11. Hà Thị Hồng Linh (2016), "Tác dụng điều chỉnh lipid máu của chế phẩm TMA (gồm Giảo cổ lam, Chè đắng, Hòe, Ngưu tất, Nghệ) trên bệnh nhân rối loạn chuyển hóa lipid", Nghiên cứu Y học. 12. Nguyễn Văn Mùi (2012), Enzym học, NXB Giáo Dục Việt Nam. 13. Hà Thị Bích Ngọc, Nguyễn Văn Mùi và Phạm Thị Hồng Minh (2012), Điều tra, nghiên cứu một số thực vật Việt Nam có tác dụng hỗ trợ điều hòa lượng đường trong máu để ứng dụng cho bệnh nhân đái tháo đường type 2, Khoa Sinh học. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. 14. Nhiều tác giả (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Vol. 1, NXB Khoa học và Kỹ thuật. 15. Đỗ Trung Quân (2006), Biến chứng bệnh đái tháo đường và điều trị, chủ biên, Y học.
46. 16. Vũ Anh Thơ (2008), Khảo sát thành phần hóa học lá cây chè đắng Ilex kaushue S. Y. Hu họ Trâm bùi (Aquifoliaceae), Trường ĐH Khoa học Tự nhiên TPHCM. 17. Thu NTK Bùi Thanh Tùng, Hải NT (2016), "Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym acetylcholinesterase của curcuminoid", Tạp chí Dược học, 86(12), tr. 08-12. 18. Nông Thanh Sơn Lương Thị Hồng Vân (2005), "Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết lá cây chè đắng đối với thể nhiễm sắc của chuột nhắt trắng bị nhiễm độc 2,4D", Tạp chí Sinh Học, 27(1), tr. 64-70. 19. Nguyễn Thị Xuyên (2015), Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh nội tiết-chuyển hoá, chủ biên, Y học. Tiếng Anh 20. A. Akbarzadeh, D. Norouzian, M. R. Mehrabi và các cộng sự. (2007), "Induction of diabetes by Streptozotocin in rats", Indian J Clin Biochem, 22(2), tr. 60-4. 21. Y. Che, Q. Wang, R. Xiao và các cộng sự. (2018), "Kudinoside-D, a triterpenoid saponin derived from Ilex kudingcha suppresses adipogenesis through modulation of the AMPK pathway in 3T3-L1 adipocytes", Fitoterapia, 125, tr. 208-216. 22. G. Chen, M. Xie, Z. Dai và các cộng sự. (2018), "Kudingcha and Fuzhuan Brick Tea Prevent Obesity and Modulate Gut Microbiota in High-Fat Diet Fed Mice", Mol Nutr Food Res, 62(6), tr. e1700485. 23. Chun Whan Choi, Yeon Hee Choi, Mi-Ran Cha và các cộng sự. (2010), "Yeast α-glucosidase inhibition by isoflavones from plants of Leguminosae as an in vitro alternative to acarbose", 58(18), tr. 9988- 9993. 24. M. C. Deeds, J. M. Anderson, A. S. Armstrong và các cộng sự. (2011), "Single dose streptozotocin-induced diabetes: considerations for study design in islet transplantation models", Laboratory Animals, 45(3), tr. 131-140. 25. S. Fan, Y. Zhang, N. Hu và các cộng sự. (2012), "Extract of Kuding tea prevents high-fat diet-induced metabolic disorders in C57BL/6 mice via liver X receptor (LXR) beta antagonism", PLoS One, 7(12), tr. e51007. 26. Sameer N. Goyal, Navya M. Reddy, Kalpesh R. Patil và các cộng sự. (2016), "Challenges and issues with streptozotocin-induced diabetes – A clinically relevant animal model to understand the diabetes pathogenesis and evaluate therapeutics", Chemico-Biological Interactions, 244, tr. 49-63. 27. Melanie L Graham, Jody L Janecek, Jessica A Kittredge và các cộng sự. (2011), "The streptozotocin-induced diabetic nude mouse model:
47. differences between animals from different sources", 61(4), tr. 356- 360. 28. Truong Thi Huynh Hoa, Nguyen Duc Hoan, Hoang Thi An và các cộng sự. (2019), "Isolation and Biological Testing of Constituents from Ilex kaushue SY Hu (Aquifoliaceae) Vietnam", 7, tr. 366. 29. Y Huang, S Karuranga, B Malanda và các cộng sự. (2018), Call for data contribution to the IDF Diabetes Atlas 9th Edition 2019, chủ biên. 30. Hai‐Rong Jin, Woo Jean Kim, Jae Sook Song và các cộng sự. (2009), "Functional and morphologic characterizations of the diabetic mouse corpus cavernosum: Comparison of a multiple low‐dose and a single high‐dose streptozotocin protocols", 6(12), tr. 3289-3304. 31. Hyun Ah Jung, Md Yousof Ali và Jae Sue %J Molecules Choi (2017), "Promising inhibitory effects of anthraquinones, naphthopyrone, and naphthalene glycosides, from Cassia obtusifolia on α-glucosidase and human protein tyrosine phosphatases 1B", 22(1), tr. 28. 32. S. Kumar, R. Singh, N. Vasudeva và các cộng sự. (2012), "Acute and chronic animal models for the evaluation of anti-diabetic agents", Cardiovasc Diabetol, 11(1), tr. 9. 33. S. Lenzen (2008), "The mechanisms of alloxan- and streptozotocin- induced diabetes", Diabetologia, 51(2), tr. 216-26. 34. L. Li, Y. Peng, G. Ma và các cộng sự. (2012), "Quantitative analysis of five kudinosides in the large-leaved Kudingcha and related species from the genus Ilex by UPLC-ELSD", Phytochem Anal, 23(6), tr. 677- 83. 35. L. Li, L. J. Xu, G. Z. Ma và các cộng sự. (2013), "The large-leaved Kudingcha (Ilex latifolia Thunb and Ilex kudingcha C.J. Tseng): a traditional Chinese tea with plentiful secondary metabolites and potential biological activities", J Nat Med, 67(3), tr. 425-37. 36. Xingyao Long, Yanni Pan và Xin Zhao (2018), "Prophylactic effect of Kudingcha polyphenols on oxazolone induced colitis through its antioxidant capacities", Food Science and Human Wellness, 7(3), tr. 209-214. 37. Ebenezer A Nyenwe, Terri W Jerkins, Guillermo E Umpierrez và các cộng sự. (2011), "Management of type 2 diabetes: evolving strategies for the treatment of patients with type 2 diabetes", 60(1), tr. 1-23. 38. Chengwu Song, Chao Xie, Zhiwen Zhou và các cộng sự. (2012), "Antidiabetic Effect of an Active Components Group from Ilex kudingcha and Its Chemical Composition", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2012, tr. 423690. 39. C. Song, Q. Yu, X. Li và các cộng sự. (2016), "The Hypolipidemic Effect of Total Saponins from Kuding Tea in High-Fat Diet-Induced
48. Hyperlipidemic Mice and Its Composition Characterized by UPLC- QTOF-MS/MS", J Food Sci, 81(5), tr. H1313-9. 40. Kenjiro Tadera, Yuji Minami, Kouta Takamatsu và các cộng sự. (2006), "Inhibition of α-glucosidase and α-amylase by flavonoids", 52(2), tr. 149-153. 41. L. Tang, Y. Jiang, H. T. Chang và các cộng sự. (2005), "Triterpene saponins from the leaves of Ilex kudingcha", J Nat Prod, 68(8), tr. 1169-74. 42. Phuong Thien Thuong, Nguyen Duy Su, Tran Minh Ngoc và các cộng sự. (2009), "Antioxidant activity and principles of Vietnam bitter tea Ilex kudingcha", Food Chemistry, 113(1), tr. 139-145. 43. Li Ting, Xiaodong Zhang, Yuwen Song và các cộng sự. (2005), "A microplate-based screening method for alpha-glucosidase inhibitors", 10(10), tr. 1128-1134. 44. Zheng Wang, Michael N. Clifford và Paul Sharp (2008), "Analysis of chlorogenic acids in beverages prepared from Chinese health foods and investigation, in vitro, of effects on glucose absorption in cultured Caco-2 cells", Food Chemistry, 108(1), tr. 369-373. 45. S. Wüpper, A. Fischer, K. Lüersen và các cộng sự. (2019), "High Dietary Kuding Tea Extract Supplementation Induces Hepatic Xenobiotic-Metabolizing Enzymes-A 6-Week Feeding Study in Mice", Nutrients, 12(1). 46. D. Xu, Q. Wang, W. Zhang và các cộng sự. (2015), "Inhibitory activities of caffeoylquinic acid derivatives from Ilex kudingcha C.J. Tseng on α-glucosidase from Saccharomyces cerevisiae", J Agric Food Chem, 63(14), tr. 3694-703. 47. H. Yi, J. Zhou, X. Shang và các cộng sự. (2018), "Multi-Component Analysis of Ilex Kudingcha C. J. Tseng by a Single Marker Quantification Method and Chemometric Discrimination of HPLC Fingerprints", Molecules, 23(4), tr. 854. 48. H. Zhang, X. Zou, Q. Huang và các cộng sự. (2018), "Effects of Kudingcha Nanoparticles in Hyperlipidaemic Rats Induced by a High Fat Diet", Cell Physiol Biochem, 45(6), tr. 2257-2267. 49. M. Zhang, X. Y. Lv, J. Li và các cộng sự. (2008), "The characterization of high-fat diet and multiple low-dose streptozotocin induced type 2 diabetes rat model", Exp Diabetes Res, 2008, tr. 704045. 50. Xin Zhao, Qiang Wang, Yu Qian và các cộng sự. (2013), "Ilex kudingcha C.J. Tseng (Kudingcha) prevents HCl/ethanol‐induced gastric injury in Sprague‐Dawley rats", Mol Med Rep, 7(5), tr. 1613- 1616.
49. 51. Xin Zhao, Peng Sun, Guijie Li và các cộng sự. (2018), "Polyphenols in Kuding tea help prevent HCl/ethanol-induced gastric injury in mice", 9(3), tr. 1713-1725. 52. X. Zhao, L. Pang, J. Li và các cộng sự. (2014), "Apoptosis inducing effects of Kuding tea polyphenols in human buccal squamous cell carcinoma cell line BcaCD885", Nutrients, 6(8), tr. 3084-100. 53. X. Zhao, J. L. Song, R. Yi và các cộng sự. (2018), "Comparison of Antioxidative Effects of Insect Tea and Its Raw Tea (Kuding Tea) Polyphenols in Kunming Mice", Molecules, 23(1). 54. X. Zhao, Q. Wang, Y. Qian và các cộng sự. (2013), "Ilex kudingcha C.J. Tseng (Kudingcha) has in vitro anticancer activities in MCF-7 human breast adenocarcinoma cells and exerts anti-metastatic effects in vivo", Oncol Lett, 5(5), tr. 1744-1748. 55. F. Zhu, Y. Z. Cai, M. Sun và các cộng sự. (2009), "Comparison of major phenolic constituents and in vitro antioxidant activity of diverse Kudingcha genotypes from Ilex kudingcha, Ilex cornuta, and Ligustrum robustum", J Agric Food Chem, 57(14), tr. 6082-9. 56. K. Zhu, G. Li, P. Sun và các cộng sự. (2014), "In vitro and in vivo anti- cancer activities of Kuding tea (Ilex kudingcha C.J. Tseng) against oral cancer", Exp Ther Med, 7(3), tr. 709-715. 57. Ankur Rohilla, Shahjad %J International journal of research in pharmaceutical Ali và biomedical sciences (2012), "Alloxan induced diabetes: mechanisms and effects", 3(2), tr. 819-823.