›

Khóa luận Nghiên cứu tác dụng điều trị đái tháo đường của cao chiết nước lá cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn)

pdf 46 trang thiennha21 18/04/2022 4680
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu tác dụng điều trị đái tháo đường của cao chiết nước lá cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_tac_dung_dieu_tri_dai_thao_duong_cua_ca.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu tác dụng điều trị đái tháo đường của cao chiết nước lá cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ===  === ĐỒNG THỊ NHÂM NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG CỦA CAO CHIẾT NƯỚC LÁ CÂY XẤU HỔ (MIMOSA PUDICA LINN.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ===  === ĐỒNG THỊ NHÂM NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG CỦA CAO CHIẾT NƯỚC LÁ CÂY XẤU HỔ (MIMOSA PUDICA LINN.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2014.Y Người hướng dẫn: PGS.TS. Bùi Thanh Tùng ThS. Nguyễn Thị Huyền Hà Nội - 2019 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU Hà Nội – 2019
  3. LỜI CẢM ƠN Trong quá trình hoàn thành khóa luận này, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ tận tình, những lời động viên, khích lệ của nhiều tập thể, quí thầy cô giáo, bạn bè và gia đình. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Bùi Thanh Tùng đã định hướng và hướng dẫn tận tình cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. Tiếp theo, tôi muốn gửi lời cảm ơn đến Bộ môn Dược lý- Dược lâm sàng – khoa Y Dược, ĐHQGHN đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất và trang thiết bị thí nghiệm để tiến hành thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ths. Nguyễn Thị Huyền đã tạo cơ hội cho tôi thực hiện đề tài này, đề tài được tài trợ bởi khoa Y Dược, ĐHQGHN, mã số đề tài CS.18.03, do cô làm chủ nghiệm. Cảm ơn cô đã luôn chia sẻ những kiến thức, kinh nghiệm và giúp đỡ trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, là lời tri ân sâu sắc nhất tôi xin được gửi tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên, khích lệ trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 03 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Đồng Thị Nhâm @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 2 1.1. Bệnh đái tháo đường 2 1.1.1. Khái niệm 2 1.1.2. Phân loại 2 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường týp 2 3 1.1.4. Dịch tễ học 3 1.1.5. Các biến chứng bệnh đái tháo đường 3 1.1.6. Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường 4 1.2. Bệnh béo phì 4 1.2.1. Vài nét về béo phì 4 1.2.2. Nguyên nhân gây bệnh béo phì 5 1.2.3. Mối quan hệ giữa béo phì và kháng insulin trong đái tháo đường týp 2 . 5 1.3. Mô hình gây đái tháo đường 6 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. 1.3.1. Streptozotocin 6 1.3.2. Mô hình gây đái tháo đường trên chuột 6 1.4. Enzym α-glucosidase và các chất ức chế enzym α-glucosidase 7 1.4.1. Enzym α-glucosidase 7 1.4.2. Các chất ức chế enzym α-glucosidase 7 1.5. Gốc tự do và phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 8 1.5.1. Gốc tự do 8 1.5.2. Cơ chế chống oxy hóa 9 1.5.3. Các chất chống oxy hóa 9 1.5.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro 9 1.6. Quan niệm về đái tháo đường (ĐTĐ) theo thuyết của Đông Y 10 1.7. Cây xấu hổ (Mimosa pudica Linn.) 11 1.7.1. Cây xấu hổ 11 1.7.2. Đặc điểm thực vật và phân bố 11 1.7.3. Thành phần hóa học 11 1.7.4. Tác dụng dược lý 13 CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.1. Mẫu nghiên cứu 16 2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 16 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. 2.2. Phương tiện nghiên cứu 17 2.2.1. Hóa chất và thuốc thử 17 2.2.2. Thiết bị và dụng cụ 17 2.3. Nội dung nghiên cứu 18 2.4. Phương pháp nghiên cứu 18 2.4.1. Xây dựng mô hình chuột ĐTĐ týp 2 19 2.4.2. Đánh giá tác dụng tác dụng hạ glucose của dịch chiết lá cây Xấu hổ . 19 2.4.3. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết lá cây Xấu hổ theo phương pháp DPPH 21 2.4.4. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α – glucosidase in vitro của dịch chiết lá cây Xấu hổ. 23 2.5. Phương pháp xử lí số liệu 24 CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1. Kết quả 25 3.1.1. Qui trình chiết, tách lá cây Xấu hổ bằng nước tinh khiết 25 3.1.2. Xây dựng mô hình ĐTĐ týp 2 thực nghiệm 25 3.1.3. Tác dụng của cao nước lá cây Xấu hổ lên chuột béo phì thực nghiệm. 26 3.1.3. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết lá cây Xấu hổ theo phương pháp DPPH 28 3.1.4. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α – glucosidase in vitro của dịch chiết lá cây Xấu hổ. 29 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. 3.2. Bàn luận 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32 KẾT LUẬN 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  8. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DDPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy ĐTĐ Đái tháo đường DMSO Dimethyl sulfoxid HPTLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao IC50 Nồng độ ức chế 50% mTOR Mammalian target of the rapamycin RNS Nitrogen hoạt tính ROS Oxy hoạt tính STZ Streptozotocin @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Nguyên nhân ĐTĐ nguyên phát 2 Bảng 3.1. . Khối lượng trung bình của các lô chuột ban đầu và sau 8 tuần nuôi theo mô hình gây béo phì thực nghiệm 25 Bảng 3.2.Nồng độ đường huyết của chuột béo phì sau khi tiêm STZ 26 Bảng 3.3. Tác dụng của dịch chiết cây Xấu hổ đối với trọng lượng chuột bị tiểu đường do STZ gây ra 27 Bảng 3.4. Chỉ số glucose ở chuột ĐTĐ do STZ gây ra trước và sau 22 ngày điều trị bằng lá cây Xấu hổ 27 Bảng 3.5. Khả năng quét gốc tự do của các mẫu thử 28 Bảng 3.6. Tác động ức chế alpha-glucosidase của cao nước lá cây Xấu hổ 30 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  10. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Công thức hóa học của STZ 6 Hình 2.1. Cây Xấu hổ 16 Hình 2. 2. Cao chiết nước của lá cây Xấu hổ 17 Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu 18 Hình 2.4. Sơ đồ qui trình thí nghiệm 22 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do DDPH của acid ascorbic và cao chiết nước lá cây Xấu hổ 29 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  11. MỞ ĐẦU Ngày nay, bệnh tiểu đường hay còn gọi là đái tháo đường ngày càng phổ biến, là một trong những nguyên nhân gây tử vong, gây ra các biến chứng bệnh trầm trọng ảnh hưởng đến sức khỏe cũng như chất lượng cuộc sống của người bệnh. Hơn nữa, việc điều trị bệnh bằng thuốc tân dược chi phí cao kèm theo nhiều tác dụng phụ gây khó khăn cho người bệnh. Ở Việt Nam, các bệnh nhân mắc bệnh mãn tính thường có xu hướng sử dụng thuốc Đông Y hoặc thuốc Y học cổ truyền do chúng độc tính thấp, rẻ tiền và sẵn có. Vì vậy, trong những năm gần đây có nhiều công trình nghiên cứu về sử dụng các hợp chất tự nhiên từ cây cỏ để chữa bệnh béo phì và đái tháo đường mà ít gây tác dụng phụ, đồng thời tác dụng của thuốc có hiệu quả trong thời gian kéo dài. Các nghiên cứu này đã cho thấy kết quả khá khả quan, có thể dần dần đưa vào sử dụng lâm sàng [6]. Cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn.) mọc ở nhiều nơi, đặc biệt là các vị trí ẩm ướt, mọc hoang nhiều ở khắp các tỉnh thành trên cả nước. Là một cây cỏ bình thường nhưng lại có nhiều tác dụng quí và điều trị về mặt y học. Một số nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy cây Xấu hổ có tác dụng hạ đường huyết, hạ lipid máu, chống viêm, kháng khuẩn. Nhưng qua tìm hiểu thì tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về tác dụng chống oxy hóa, hạ đường huyết của cây Xấu hổ để phát triển thành các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường. Chính vì vậy, đề tài nghiên cứu khoa học: “Nghiên cứu tác dụng điều trị đái tháo đường của cao chiết nước lá cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn)” với những mục tiêu sau: 1. Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của cao chiết nước lá cây Xấu hổ trên mô hình in vivo chuột béo phì bị gây đái tháo đường do Streptozotocin 2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro theo phương pháp DPPH 3. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
  12. CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1. Bệnh đái tháo đường 1.1.1. Khái niệm Bệnh đái tháo đường là bệnh rối loạn chuyển hóa không đồng nhất, có đặc điểm tăng glucose huyết do khiếm khuyết về tiết insulin, về tác động của insulin, hoặc cả hai. Tăng glucose mạn tính trong thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa carbohydrat, protid, lipid, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim và mạch máu, thận, mắt, thần kinh [5]. 1.1.2. Phân loại Đái tháo đường nguyên phát [5, 3, 2] Đái tháo đường týp 1: do phá hủy tế bào bêta tụy, dẫn đến thiếu insulin tuyệt đối. Đái tháo đường týp 2: do giảm chức năng của tế bào beta tụy tiến triển trên nền tảng đề kháng insulin. Bảng 1.1: Nguyên nhân ĐTĐ nguyên phát Các nguyên nhân ĐTĐ týp 1 ĐTĐ týp 2 Yếu tố nguy cơ Kháng nguyên HLA-DR3, Tiền sử gia đình HLA-DR4 Ăn nhiều, ít vận động thể lực. Yếu tố chủng tộc. Nhiễm độc. Yếu tố khởi phát Nhiễm virus Béo phì Stress chuyển hóa/ yêu cầu Stress chuyển hóa/ yêu cầu quá quá mức. mức. Yếu tố bệnh sinh Phá hủy đảo tụy theo cơ chế Các tế bào tụy thoái hóa/ suy yếu tự miễn. dần dần. Giảm receptor insulin Đái tháo đường thai kỳ: ĐTĐ được chẩn đoán trong 3 tháng giữa hoặc 3 tháng cuối của thai kỳ và không có bằng chứng về ĐTĐ týp1, týp 2 trước đó. Đái tháo đường thứ phát @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  13. Thể bệnh chuyên biệt của ĐTĐ do các nguyên nhân khác, như ĐTĐ sơ sinh hoặc ĐTĐ do sử dụng thuốc và hoá chất như sử dụng glucocorticoid, điều trị HIV/AIDS hoặc sau cấy ghép mô 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường týp 2 Hai yếu tố cơ bản trong cơ chế bệnh sinh là kháng insulin và rối loạn tiết insulin kết hợp với nhau. Kháng insulin: Giảm tác dụng của insulin trong việc sử dụng glucose do giảm số lượng receptor insulin ở tế bào hoặc giảm khả năng kết dính của insulin vào receptor (thụ thể). Rối loạn tiết insulin: Tăng insulin máu bù trừ, tăng tiền chất không có hoạt tính proinsulin, mất tính chất tiết insulin theo từng đợt. Ngoài ra béo phì và hoạt động thể lực có liên quan chặt chẽ với tình trạng kháng insulin [3]. 1.1.4. Dịch tễ học Bệnh đái tháo đường là căn bệnh rối loạn chuyển hóa hay gặp ở các nước phát triển và đang phát triển; đang trở thành gánh nặng về tài chính, y tế, xã hội nghiêm trọng. Bệnh gây ra các biến chứng nguy hiểm liên quan mật thiết với nhau, là nguyên nhân hàng đầu về các bệnh tim mạch, cụt chi, mù lòa, suy thận. Theo Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (IDF), năm 2015 toàn thế giới có 415 triệu người (trong độ tuổi 20-79) bị bệnh đái tháo đường (ĐTĐ), tương đương cứ 11 người có 1 người bị ĐTĐ, đến năm 2040 con số này sẽ là 642 triệu, tương đương cứ 10 người có 1 người bị ĐTĐ[5]. Theo công bố của WHO thì có khoảng hơn 215,6 triệu người mắc bệnh đái tháo đường năm 2010. Theo kết quả điều tra của Bộ Y tế, Hội Nội tiết – Đái tháo đường Việt Nam, nước ta hiện có hơn 3,16 triệu người mắc bệnh tiểu đường. Tỷ lệ này đang chiếm hơn 5% dân số trưởng thành trong độ tuổi 20-79. Và ngày càng tỷ lệ người mắc bệnh tiểu đường ngày càng trẻ hoá hơn. Nhưng một điều đáng khả quan, có tới 70% trường hợp ĐTĐ týp 2 có thể dự phòng hoặc làm chậm xuất hiện bệnh bằng tuân thủ lối sống lành mạnh, dinh dưỡng hợp lý và tăng cường luyện tập thể lực [5] 1.1.5. Các biến chứng bệnh đái tháo đường Bệnh đái tháo đường nếu không được điều trị tốt và quá trình điều trị không chặt chẽ sẽ gây ra các biến chứng nguy hiểm và các bệnh mạn tính, cấp tính kèm theo. Một số biến chứng cấp tính giai đoạn đầu của ĐTĐ như: Nhiễm toan ceton – thường xảy ra với ĐTĐ týp 2, hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu máu, hạ đường huyết – thường gặp bệnh nhân dùng thuốc hạ đường huyết quá liều hoặc dùng thuốc trong lúc đói bỏ bữa. Một số biến chứng mãn tính như: Biến chứng mạch máu lớn @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  14. (bệnh mạch vành, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, ), các bệnh lý mạch máu nhỏ (bệnh lý võng mạc, bệnh lý thận, bệnh lý thần kinh,.).[2,3] 1.1.6. Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường 1.1.6.1. Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường týp 1[2,4] Do tế bào β tuyến tụy bị phá hủy bởi chất trung gian miễn dịch nên cơ thể không có khả năng tạo ra hormon insulin, do đó, bệnh nhân phải tiêm insulin thường xuyên trong suốt cuộc đời. 1.1.6.2. Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường týp 2 [2,4] Thuốc điều trị đối với nhóm đối tượng này được chia làm 3 nhóm chính: - Nhóm thuốc kích thích tụy bài tiết insulin như nhóm sulphonylurea: gliclazid, glibenclamid, glimepirid, - Nhóm thuốc làm tăng nhạy cảm insulin ở ngoại vi, giảm đề kháng insulin như nhóm biguanide: metformin (thuốc duy nhất được sử dụng thuộc nhóm này); nhóm thiazolidinedion. - Thuốc ức chế enzym α-glucosidase như: acarbose, voglibose, miglitol làm hấp thu chậm đường glucose từ ruột vào máu. Đối với bệnh nhân đái tháo đường týp 2, ngoài uống thuốc điều trị cần phải kết hợp với chế độ ăn, vận động thể lực hợp lí để điều trị đạt hiệu quả tốt. Hơn nữa, mỗi đối tượng cụ thể sẽ có bệnh lí kèm theo cũng như thể trạng khác nhau nên kết hợp các thuốc trong nhóm với nhau nhằm giảm đường huyết hữu hiệu. 1.2. Bệnh béo phì 1.2.1. Vài nét về béo phì Theo vi.wipedia, béo phì là tình trạng tích lũy mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng tới sức khỏe. Ngày nay, Tổ chức Y tế thế giới thường dùng chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index – BMI) để nhận biết tình trạng gầy béo của cơ thể giữa cân nặng và chiều cao. Công thức BMI [49] BMI = W/(H)2 Trong đó: W cân nặng (kg) H chiều cao (m) Đối với người Châu Âu và Châu Mỹ, BMI từ 20 - 25 là bình thường; trên 25 là thừa cân và trên 30 là béo phì. Với người Châu Á, chỉ số bình thường của BMI là 18,5 đến 23 [35]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
  15. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), thừa cân và béo phì là những yếu tố nguy cơ chính đối với các bệnh mãn tính như tiểu đường, tim mạch, ung thư. Thường gia tăng đáng kể ở các nước thu nhập cao nhưng ngày nay lại có dấu hiệu gia tăng ở nước thu nhập trung bình và thấp, nhất ở các thành thị. 1.2.2. Nguyên nhân gây bệnh béo phì Theo WHO, thừa cân và béo phì là kết quả của việc mất cân bằng năng lượng do ăn quá nhiều calo hoặc hoạt động thể lực không đủ để tiêu tốn hết lượng calo. Béo phì chia làm hai loại [13] - Béo phì đơn thuần: Năng lượng hấp thụ vào cơ thể thừa nhiều so với mức tiêu thụ năng lượng dẫn tới tích lũy mỡ. - Béo phì bệnh lý: Do một số bệnh lý về nội tiết như hội chứng Cushing (do lượng corticosteroids trong cơ thể cao), suy tuyến giáp trạng, bệnh buồng trứng đa nang, 1.2.3. Mối quan hệ giữa béo phì và kháng insulin trong đái tháo đường týp 2 Insulin là hormone protein có bản chất acid, tan trong nước, không qua được màng tế bào mà gắn vào các receptor (thụ thể) đặc hiệu ở màng (glucoprotein). Sau khi thụ thể insulin kết hợp với insulin có tác dụng như protein kinase, tự phosphoryl hóa và làm tăng tốc độ vận chuyển glucose qua màng tế bào. Các lipid và acid béo tự do thúc đẩy kháng insulin theo 3 con đường chính: Hoạt hóa con đường mTOR, tăng acid béo tự do và các adipokin (do các tế bào của mô mỡ tiết ra). Hoạt hóa con đường mTOR (mammalian target of the rapamycin) thúc đẩy kháng insulin và ĐTĐ týp 2 [9]: mTOR làm phosphoryl hóa serine của các insulin receptor substrates (các chất thụ thể insulin) bằng cách hoạt hóa S6 Kinase 1 (S6K1) làm IRS không có khả năng hoạt hóa PI3K (phosphatidyl – inositol 3 - kinase) và protein Akt (là mục tiêu của con đường chuyển hóa insulin). Các chất dinh dưỡng dư thừa làm thúc đẩy kháng insulin bằng cách hoạt hóa protein kinase của con đường mTOR. Con đường mTOR/S6K1 được hoạt hóa, ức chế gen PGC1 (proliferator- activated receptor γ coactivator- 1) biểu hiện, làm năng lượng ti thể giảm tiêu thụ dẫn đến béo phì. Tăng acid béo tự do gây kháng insulin [9]: Nồng độ glucose trong mức bình thường thì acid béo tự do được vận chuyển trong ti thể qua enzym carnitine- palmytoyl transferase-1 (CPT-1) và được β oxy hóa một phần nhỏ. Nhưng với bệnh nhân béo phì khi nồng độ glucose và acid béo đều tăng cao, tế bào sẽ sử dụng năng lượng của acid béo tự do, vì vậy tăng tạ o@ thành School LC-CoA of(long Medicine chair-CoA) trong and bào Pharmacy, VNU 5
  16. tương mà LC-CoA làm ức chế tế bào sử dụng glucose, gây kháng insulin và ức chế tổng hợp glycogen từ glucose, tăng tổng hợp triglyceride. 1.3. Mô hình gây đái tháo đường 1.3.1. Streptozotocin Streptozotocin (STZ) là chất hóa học thuộc nhóm hợp chất glucosamine nitrosorea, có công thức hóa học là C8H15N3O7, tồn tại trong tự nhiên, có khả năng gây độc đặc hiệu với tế bào β sản xuất insulin của tuyến tụy ở động vật có vú. STZ được phát hiện có trong một chủng vi khuẩn có tên là Streptomyces achromogenes vào những năm 50 của thế kỷ 20, hiện nay STZ đang được sử dụng trong y tế để điều trị một số ung thư trên đảo tụy Langerhan và là chất gây ĐTĐ hữu hiệu trên các mô hình động vật thực nghiệm, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu y học [48]. Cơ chế gây độc: STZ nhận biết và xâm nhập vào các tế bào β qua kênh vận chuyển glucose GLUT2, alkyl hóa và làm tổn thương ADN, cuối cùng dẫn đến hoại tử tế bào. Hoạt tính alkyl hóa được cho là do hoạt động của nhóm nitrosourea, đặc biệt là vị trí O6 của guanine. Tùy vào liều lượng STZ và cách thức tiến hành tiêm thuốc mà có thể gây mô hình động vật ĐTĐ type 1 hay ĐTĐ type 2. Liều trên chuột nhắt dao động từ 100- 150 mg/kg [29], trên chuột cống dao động từ 40-100 mg/kg [21]. Hình 1.1. Công th ức hóa học của STZ 1.3.2. Mô hình gây đái tháo đường trên chuột Chuột được nuôi béo phì trong khoảng thời gian nhất định, chọn lọc những con chuột đủ tiêu chuẩn để chia làm 2 nhóm và cho nhịn đói khoảng 8 giờ. Tiếp theo, chuột được tiêm màng bụng một liều duy nhất: nhóm 1 tiêm streptozotocin pha trong đệm citrat, nhóm 2 tiêm đệm @ citrat. School Sau khi oftiêm Medicine 1 giờ, chuột đư andợc b ổPharmacy, VNU 6
  17. sung thức ăn theo chế độ dinh dưỡng ban đầu và theo dõi đường huyết của chuột trong 10 ngày [13,21,24,27]. 1.4. Enzym α-glucosidase và các chất ức chế enzym α-glucosidase Enzym là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản là protein và có trong mọi tế bào sinh vật. Nhờ có enzym mà nhiều phản ứng hóa học xảy ra với hiệu suất cao mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH. Các phân tử tham gia vào ngay lúc đầu của quá trình phản ứng được gọi là chất nền và enzym biến đổi chất nền thành các phân tử khác. Enzym có tính đặc hiệu và chọn lọc rất cao đối với các chất nền của nó[14]. 1.4.1. Enzym α-glucosidase Enzym α-glucosidase có những tên gọi khác như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, α-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzym làm gẫy các liên kết bằng thủy phân). Nguồn gốc, phân bố: Enzym α-glucosidase được tìm thấy trong màng bề mặt đường ruột, tham gia vào bước cuối của quá trình tiêu hóa [17]. Cơ chế hoạt động của enzym α-glucosidase: Glucose được cung cấp bởi carbohydrat chứa trong thức ăn. Nguồn carbohydrat sau khi vào cơ thể được các enzym ở tụy (α-amylase) và ruột non (α-glucosidase) tiết ra, thủy phân thành những phân tử đường đơn rồi thẩm thấu vào máu. Enzym α-glucosidase có chức năng xúc tác việc cắt đứt liên kết 1,4-α-D-glucosid của cơ chất để giải phóng α-D-glucose. 1.4.2. Các chất ức chế enzym α-glucosidase Các chất ức chế enzym có thể là ion kim loại, hợp chất hữu cơ phân tử nhỏ hoặc protein; và làm hoạt tính enzym bị thay đổi. Chất ức chế enzym có 2 loại chính: chất ức chế cạnh tranh và chất ức chế không cạnh tranh. Đối với chất ức chế cạnh tranh: Chất kìm hãm có cấu trúc tương tự như cơ chất, gắn thuận nghịch vào trung tâm phản ứng của enzym, làm chức năng xúc tác của enzym chậm lại. Đối với chất ức chế không cạnh tranh: chất kìm hãm gắn thuận nghịch vào vị trí khác trên enzym (gọi là vị trí dị lập thể) chứ không gắn vào vị trí xúc tác và làm thay đổi cấu hình vị trí hoạt động của enzym khiến không phù hợp để cơ chất gắn vào. Dù theo hình thức ức chế nào thì khi chất kìm hãm được giải phóng, hoạt động xúc tác của enzym bình thường trở lại [14] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
  18. Thuốc tân dược ức chế enzym α-glucosidase làm giảm hấp thu glucose: Nhóm thuốc này làm giảm đường huyết sau ăn như: Acarbose, Voglibose, Miglitol [2]. Acarbose là một tetrasaccharid, ít hấp thu ở đường tiêu hóa và ức chế cạnh tranh với enzmy α-glucosidase ở ruột non [4] có tác dụng chống tăng đường huyết sau ăn và không làm tăng tiết insulin, không làm hạ đường huyết. Tuy nhiên, acarbose có tác dụng phụ thường gặp trên đường tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng, tiêu chảy, buồn nôn, nhất là khi ăn đường mía và thực phẩm có đường do cacbohydrat không được hấp thu và lên men ở đại tràng [4]. Vì vậy, việc nghiên cứu các dược liệu có các chất ức chế enzym α-glucosidase rất cần thiết và quá trình điều trị bệnh đái tháo đường typ 2 có nhiều lựa chọn hơn. 1.5. Gốc tự do và phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa Đái tháo đường là một trong những rối loạn chuyển hóa do sản xuất quá mức các loại oxy phản ứng (ROS) so với mức bình thường hoặc rối loạn chức năng trong cơ chế bảo vệ chống oxy hóa hoặc cả hai xảy ra đồng thời. ROS dư thừa được quét bởi các chất chống oxy hóa. Chất chống oxy hóa chống lại các gốc tự do thông qua một số cơ chế: suy thoái gốc tự do; nhặt các gốc tự do; Theo nghiên cứu, bệnh nhân bị tiểu đường mức độ chống oxy hóa giảm. Điều đó góp phần gây ra các biến chứng bệnh tiểu đường như chấn thương mô, tổn thương tế bào, dây thần kinh, [16,51] 1.5.1. Gốc tự do Là các hạt với một điện tử tự do (chưa tạo cặp) quay quanh hạt nhân (có thể là nguyên tử, ion hoặc phân tử) có xu hướng đạt cân bằng là lấy một electron từ một phân tử mà nó tiếp xúc. Phần lớn các phân tử sinh học không phải là các gốc. Gốc tự do trong cơ thể có hai nguồn gốc chính: nguồn gốc nội sinh và nguồn gốc ngoại sinh - Gốc tự do nội sinh: Các gốc tự do được chính cơ thể tạo ra trong những quá trình chuyển hóa tự nhiên như hô hấp tế bào (chủ yếu là superoxide sau đó H2O2), lưới nội chất (tạo thành superoxide – bởi cytochrome P450), quá trình trao đổi chất của tế bào, Trong cơ thể, ti thể là nguồn tạo ra nhiều gốc tự do nội bào. - Gốc tự do ngoại sinh: Do tác động bởi các yếu tố ngoại lai như tia tử ngoại của ánh sáng mặt trời, thuốc lá, ô nhiễm môi trường, Gốc tự do có chức năng sinh lý sau: - ROS (Oxy hoạt tính) và RNS (nitrogen @ School hoạt tính )of chố ngMedicine lại vi sinh vậ t.and Pharmacy, VNU 8
  19. - Tính miễn dịch và điều hòa: Sự sản xuất lượng lớn ROS là một công cụ của miễn dịch; sự cảm ứng thay đổi nồng độ ROS thấp có thể là một cơ chế điều hòa. Quá trình tạo ra và loại thải ROS, RNS mất cân bằng sẽ dẫn đến stress oxy hóa. Quá trình đó ảnh hưởng xấu đến cơ thể: - Tổn hại tới lipid do bị oxy hóa: làm mất các dây nội chưa bão hòa (hậu quả: thay đổi trong tính lưu chảy và tính thấm của màng), tạo ra các chất có hoạt tính mạnh (hậu quả: ảnh hưởng tới tính đồng nhất của enzym màng). - Tổn hại tới protein do bị oxy hóa: làm kết tập, phân mảnh, phân tách protein; phản ứng với ion sắt của hem; biến đổi nhóm chức năng. Hậu quả: thay đổi hoạt tính enzyms và phân giải protein. - Tổn hại tới DNA: bị oxy hóa làm đứt, gẫy chuỗi; tách vòng saccharide dẫn đến đột biến, lỗi di truyền hoặc ức chế tổng hợp protein. - Các bệnh lý rối loạn: già hóa, béo phì, viêm nhiễm, các bệnh nội tiết (như tiểu đường), viêm tụy cấp, các bệnh thoái hóa thần kinh: bệnh Parkinson và bệnh Alzheimers. 1.5.2. Cơ chế chống oxy hóa Phòng thủ chống oxy hóa gồm 3 cấp độ: - Ức chế sản xuất lượng lớn ROS, RNS (các nitrogen và oxygen hoạt tính). - Bắt giữ các gốc tự do như: khóa, bẫy, dập tắt lan truyền. - Sửa đổi: cơ chế của các phân tử sinh học bị phá hủy. 1.5.3. Các chất chống oxy hóa Chất chống oxy hóa là các chất khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng, vì vậy người ta hay dùng các chất khử để chống oxy hóa. Một số chất chống oxy hóa nội sinh phân tử nhỏ: vitamin C; vitamin E; β- caroten, vitamin A (loại bỏ các gốc khỏi lipids); coenzyme Q; glutathione; flavonoids; Một số sản phẩm chống oxy hóa như: súp lơ xanh, óc chó, quả việt quất, cà rốt, socala đen, lúa mạch, 1.5.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy (DDPH) có khả năng tạo các gốc tự do bền trong MeOH bão hòa. Các chất chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DDPH qua cho hydrogen, làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng (OD) của DDPH và màu dung dịch @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
  20. nhạt dần (màu tím chuyển dần màu vàng). Giá trị của OD càng nhỏ thì khả năng bắt gốc oxy hóa của chất chống oxy hóa càng cao [25] 1.6. Quan niệm về đái tháo đường (ĐTĐ) theo thuyết của Đông Y Bệnh ĐTĐ trong y học cổ truyền gọi là chứng tiêu khát mà nguyên nhân chủ yếu là do ăn uống không điều độ, ăn nhiều các chất cay nóng, béo, ngọt, do lao lực, do căng thẳng thần kinh tạo thành hỏa nhiệt, uất nhiết làm phần âm của các phủ tạng: phế, vị, thận bị hao tổn. Hải Thượng Lãn Ông trong cuốn Y Trung Quan Kiện có viết: chứng bệnh tiêu khát phần nhiều do hỏa làm tiêu hao chân âm 5 chất dịch bị khô cạn mà sinh ra [6]. Muốn chữa bệnh phải trị cả gốc và ngọn: trị ngọn là trị chứng khát nước, đói, tiểu nhiều. Bệnh ĐTĐ trong y học cổ truyền chia ra làm ba mức độ khác nhau: Nếu bệnh nhân thích uống nước nhiều thì bệnh chủ yếu ở thượng tiêu do phế âm hư; nếu thích ăn nhiều bệnh chủ yếu ở trung tiêu do vị âm hư gây đói và gầy; nếu bị đi tiểu nhiều thì bệnh chủ yếu ở phần hạ tiêu do thận âm hư không tàng trữ được tinh hoa của ngũ cốc, không làm chủ được thủy gây tiểu nhiều và nước tiểu có đường [6]. Muốn chữa bệnh phải trị cả gốc và ngọn: trị ngọn là trị chứng khát nước, đói, tiểu nhiều. Trị gốc là trị phế, tỳ, thận là những cơ quan có chức năng chuyển hóa và điều tiết trong cơ thể. Các thuốc Đông y sử dụng trong điều trị ĐTĐ: Sử dụng thuốc có nguồn gốc thực vật trong phòng và chữa bệnh là thói quen, kinh nghiệm và truyền thống của người dân Việt Nam và một số nước trên thế giới. Một nghiên cứu về vấn đề sử dụng thảo dược thường xuyên cho bệnh nhân ĐTĐ đã cho thấy liệu pháp thực vật là kinh tế nhất và hiệu quả hơn thuốc hiện đại [28]. Có rất nhiều loài cây đã được dùng theo kinh nghiệm dân gian để làm giảm nhẹ triệu chứng cũng như biến chứng của bệnh ĐTĐ: Cải xoong (Nasturium officinale Brassicaceae); Mướp đắng (Mormordica charantia Cucurbitaceae); Bồ công anh (Taraxacum officinale Asteraceae); Dứa (Ananas sativus); Ổi (Psidium guajava); Rau má (Celltela asiatica); Ngò tàu (Eryngium foetidum Apiaceae); Quỉ trâm thảo (Bidens pilosa Asteraceae); Củ cải trắng (Ravanus sativus); Bạch truật (Atractiloides macrocephala Asteraceae); Cam thảo nam (Scoparia ducis Scrophulariaceae); Dừa cạn (Catharanthus roseus Apocynaceae); Hoài sơn (Dioscorea persimilis Dioscoreaceae); Ngọc trúc (Polygotanum officinale Liliaceae), Chuối hột (Musra barjoo Sieb) [22]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  21. 1.7. Cây xấu hổ (Mimosa pudica Linn.) 1.7.1. Cây xấu hổ Cây xấu hổ hay được gọi là Trinh nữ, cây mắc cỡ, cây thẹn, Hàm thu thảo [15]và có tên khoa học là Mimosa pudica Linn., họ Trinh nữ (Mimosaceae). Vị trí phân loại trong giới thực vật như sau [7,18]: Ngành: Ngọc Lan (Magnoiophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Hoa hồng (Rosidae) Bộ: Đậu (Fabaceae) Họ: Đậu (Fabaceae) Phân họ: Trinh nữ (Mimosaceae) Chi: Trinh nữ (Mimosa) Loài: Mimosa pudica L. 1.7.2. Đặc điểm thực vật và phân bố Đặc điểm thực vật Cây nhỏ mọc hoang lòa xòa ở ven đường. Thân thảo, có gai hình móc dài tới 1,5 m. Lá kép lông chim chẵn, hai lần, cuống phụ xếp như hình chân vịt, khi chạm nhẹ hoặc và buổi tối, lá sẽ cụp xuống; lá chét nhỏ gồm 15 – 20 đôi, gần như không có cuống [15]. Hoa màu tím đỏ, tụ thành hình đầu trái xoan và nở khoảng tháng 6-8. Quả giáp dài khoảng 2 mm, nhỏ, rộng 2 -3 mm, hợp lại thành hình ngôi sao, có lông cứng; hạt nhỏ, dẹt, dài 2mm, rộng 1 – 1,5 mm [15] Phân bố Cây mọc hoang ở những nơi yên tĩnh, trên đất khô cằn do có khả năng cố định đạm, ít người qua lại và sinh sống. Cây thường mọc ở các ven đường cái, bờ đê, bãi hoang ở nhiều nơi trong nước ta, ở các nước khu vực nhiệt đới Châu Mỹ, Châu Phi, Châu Á. Bộ phận dùng: Cành, lá, rễ [15] Thu hái và chế biến Người ta đào rễ quanh năm, rửa sạch đất cát, thái mỏng, phơi khô hoặc sấy [15]. 1.7.3. Thành phần hóa học @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  22. Chất vô cơ Cây Xấu hổ có chứa hàm lượng Selen và hàm lượng của Selen trong cây khác nhau lớn theo mùa vụ, vùng thu hái: - Trong lá, hàm lượng Selen là 3000 γ/g vào tháng 8 và đến tháng 12 còn 300 γ/g. Trong quả, tháng 8, hàm lượng Selen là 290 γ/g, tháng 12 tăng là 1560 γ/g [15] - Các vùng đất chua (Hải Phòng, Vĩnh Phúc) hàm lượng Selen ít, các mẫu thu tại Đà Nẵng hàm lượng cao, còn tại Đồng Nai thì không thấy Selen. Như vậy, lá cây xấu hổ có hàm lượng rất cao vào mùa hè rồi giảm nhanh, trong khi hàm lượng Selen ở quả lại tăng [1] Chất hữu cơ Dựa trên các tài liệu nghiên cứu, có thể phân tích và sàng lọc sơ bộ thành phần hóa học trong dịch chiết từ lá và rễ cây M. pudica L., một số thành phần có hoạt tính là [30]: phytosterol, amino acid, alkaloid, flavonoid, tannins, glycosides và acid béo. - Alkaloid chính được phân lập là mimosin – là chất có độc tính với cơ thể, được tìm thấy trong rễ, lá và cành của cây. Tên gọi khác của mimosin là leucenon, là một amimo acid thực vật, có tính chất hóa học như Tyrosine, có 0 0 công thức C8H10O4N2, t nc= 231 C, αD= -210 (H2O), thường tồn tại dạng phức đồng C8H8O4N2Cu. Phương pháp HPTLC pha đảo – phương pháp có độ nhạy cao, đơn giản, dùng để định tính và định lượng mimosine trong bột M. pudica L. [33]. Ngoài ra, dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) để định tính, định lượng mimosin. - Các flavonoid có khả năng chống oxy hóa mạnh, giúp giảm quá trình oxy hóa liên quan đến ung thư, lão hóa, xơ vữa động mạch, chứng thiếu máu cục bộ, viêm và các bệnh thoái hóa thần kinh như Parkinson và Alzheimer’s. Các flavonoid phân lập từ M. pudica L. bằng phương pháp sắc ký và quang phổ [34] như: Quercetin – 7-rhamnoside, acacetin -7-rutinoside, có thể ức chế sự kích hoạt các chất tiền gây ung thư làm giảm tăng sinh các tế bào ung thư, sẽ chọn lọc các tế bào ung thư bằng apoptosis, đáp ứng miễn dịch kháng tế bào ung thư được kích hoạt, quá trình viêm và kháng thuốc được điều tiết [34] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
  23. - Steroids chiết suất M. pudica L. bao gồm: β –sitosterol, stigmastanol, D- galactosyl-β-sitosterol, stigmasterol có liên quan mật thiết đến các hormon chuyển hóa, bao gồm cả hormon giới tính [43] - Tanin có nhiều trong rể cây M. pudica L. được phân tách và tinh chế bằng sắc ký cột với nhựa hấp phụ macropor Diaion HP-20, Sephadex LH-20 và silicagel pha thường. Cấu trúc được xác định bởi quang phổ. Tannins giúp ức chế sự tổng hợp protein tế bào do khả năng hình thành phức hợp với các protein kích thước lớn [44] - Các chất khác: hoocmon turgotin được tách chiết - có vai trò như một yếu tố làm lá hoạt động đóng mở theo chu kỳ; β-tubulin và α- tubulin giúp điều hòa sự chuyển động của lá, 1.7.4. Tác dụng dược lý Theo y học cổ truyền Cây Xấu hổ có vị ngọt, tính hơi hàn, có ít độc. Qui kinh: kinh phế. Cây có tác dụng tốt trong việc điều trị các bệnh như giảm đau, chống ho, long đờm, tiêu viêm, hạ huyết áp, lợi tiểu, [11,7,18] - Cành và lá của cây Xấu hổ có vị ngọt đắng, tính bình, hơi độc, có tác dụng an thần, được điều trị mất ngủ, sưng tấy, mưng mủ [12,46] - Rễ của cây Xấu hổ có vị chát, hơi đắng, giúp thông kinh được dùng đề phòng và điều trị các bệnh về phong thấp, viêm dạ dày, hen suyễn [11,18,42,36,40] - Lá và hạt cây Xấu hổ có thể điều trị các bệnh về da liễu [19] Theo y học hiện đại Tác dụng chống oxi hóa: dịch chiết bằng ethanol của M.pudica L. cho thấy khả năng chống lại các gốc tự do như DDPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), Nitric Oxide (NO). Hoạt tính chống oxi hóa giữa các chất có thể khác nhau do liên quan đến cấu trúc hóa học và việc sử dụng các gốc tự do khác nhau. Tác dụng kháng nọc rắn: dịch chiết từ rễ khô cây Xấu hổ có khả năng ức chế nọc độc của rắn Naja kaouthia, ức chế hoạt động hyaluronidase và protease trong nọc độc của Naja naja, Vipera russelii và Echis carinatus [40] - Với LD50 = 0,6 ± 0,08 mg/kg trọng lượng cơ thể nọc độc của N.kaouthia gây chết cho chuột. Khoảng 200 μg dịch chiết từ nước thường và nước nóng của rễ có thể trung hoà lần lượt 35 μg và 20 μg nọc độc thô. Tuy nhiên, khi chiết @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
  24. cùng một lượng dược liệu bằng methanol/ethanol, không tìm thấy bất kỳ sự ức chế đáng kể nào. - Sự trung hòa enzym trong nọc độc của N. kaouthia được nghiên cứu bằng cách ủ dịch chiết pha loãng với một lượng protein có trong nọc độc (protease và phospholipase A2 (PL A2), acetylcholinesterase (AChE)) ở 37°C trong 30 phút. Kết quả, dịch chiết rễ với nước nóng có hiệu lực trung hòa protease cao nhất, đối với dịch chiết nước thường, ở liều 100 μg, nó làm trung hòa hoạt tính PL A2 của nọc độc lên đến 86%. Tác dụng trung hòa AChE cũng đã được nghiên cứu tương tự. Khả năng chữa lành vết thương [26]: Vết thương trên chuột được điều trị bằng thuốc mỡ chứa 2% (w/w) dịch chiết methanol và 2% (w/w) dịch chiết nước cho thấy tác dụng chữa lành vết thương đáng kể (P< 0,001). Mô hình được tiến hành như sau: gây tổn thương chuột bằng cách cắt một hình tròn trên da chuột (diện tích 500 mm2, sâu 2 mm), vết thương được điều trị thuốc mỡ tại chỗ đến khi lành hoàn toàn. Kết quả cho thấy, 4 ngày đầu vết thương chưa có sự phục hồi đáng kể; đến ngày thứ 8 vết thương được thu hẹp lại. Như vậy, dịch chiết Xấu hổ có khả năng tăng sinh tế bào. Khả năng kháng khuẩn: dịch chiết từ thân và lá cây Xấu hổ có tác dụng kháng khuẩn. Mô hình nghiên cứu bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch nuôi cấy Aspergillus fumigatus, Citrobacter divergens và Klebsiella pneumonia với các nồng độ khác nhau là 50, 100 và 200 μg/đĩa [30]. Kết quả cho thấy dịch chiết methanol của M.pudica L. có hoạt tính kháng khuẩn ở ba nồng độ 50, 100, 200 μg/đĩa. Một số tác dụng dược lý khác[18]: chống co giật (cao chiết toàn cây làm chậm xuất hiện các cơn co giật do pentetrazol gây ra so với lô chứng), kéo dài thời gian ngủ, tác dụng ức chế virus Vaccinia (đối với cao khô toàn cây chiết bằng cồn 80o), Một số nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của cây xấu hổ: Rajendiran. R cùng cộng sự đã nghiên cứu tiềm năng của lá M.pudica trên mô hình chuôt mắc bệnh tiểu đường typ 2 (chuột được cho chế độ ăn nhiều chất béo và tiêm màng bụng liều thấp 35 mg/kg trọng lương cơ thể). Lá của cây xấu hổ được sấy khô nghiền thành bột, được khử chất béo với với ether, sau đó chiết xuất với ethanol 95%. Bảy ngày sau khi tiêm STZ, chuột bị tiểu đường được bổ sung kể @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
  25. bằng cách thay đổi hoạt động của enzym chuyển hóa carbohydrat và bài tiết insulin [27] Bashir. R cùng cộng sự đã nghiên cứu hiệu quả của chống đái tháo đường trên thỏ Albino bằng rễ cây Xấu hổ. Rễ của M. pudica chế biến như sau: Rễ được rửa sạch, sấy khô, nghiền thành bột mịn. Gây mô hình đái tháo đường trên thỏ bằng tiêm tĩnh mạch alloxan (150 mg/ kg thể trọng) và thỏ bạch tạng trưởng thành có mức đường huyết khoảng 250 – 300 mg/ dl coi là bị tiểu đường. Kết quả nhận thấy rằng, bột rễ của cây Xấu hổ có hiệu quả điều trị đái tháo đường với liều 6mg/ kg thể trọng [24] tương đương với chứng dương Glimepride. Dịch chiết ethanol toàn thân cây Xấu hổ cho thấy tác dụng hạ lipid máu trên mô hình chuột cống. Nồng độ các cholesterols, triglycerides, LDL và VLDL giảm đáng kể, nồng độ HD tăng, được đối chứng dương với lovastatin [47] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
  26. CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Mẫu nghiên cứu Nguyên liệu là cây Xấu hổ được thu hái tại Nghĩa Sơn – Nam Định vào tháng 5 năm 2018, rửa sạch, sấy khô ở 500C đến khối lượng không đổi và bảo quản trong túi nilon. Mẫu nghiên cứu được Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược giám định tên khoa học là Mimosa pudica Linn., họ Trinh nữ (Mimosaceae). Mẫu tiêu bản được lưu trữ tại bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Hình 2.1. Cây Xấu hổ (Tại: Nghĩa Sơn-Nghĩa Hưng-Nam Định) 2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu Lá cây Xấu hổ (1 kg) sau khi rửa sạch, phơi khô được tiến hành sắc với dung môi nước tinh khiết bằng bếp từ. Gộp các dịch chiết nước sau đó lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không thu đươc cao chiết tổng nước dạng sệt (153,4 g). Hiệu suất thu được là 15,34%. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
  27. Hình 2. 2. Cao chiết nước của lá cây Xấu hổ 2.2. Phương tiện nghiên cứu 2.2.1. Hóa chất và thuốc thử - Acid ascorbic (99%, Sigma – Aldrich, Singapore) - 1,1 – diphenyl – 2 – picrylhydrazyl (DDPH, Sigma – Aldrich, Singapore) - Streptozotocin (250 mg, Aladdin, Trung Quốc) - Enzyme Yeast -glucosidase - P-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) - 4-Nitrophenol (Sigma) - Gliclazide (DiamicronRMR 60 mg) - Các loại hóa chất khác đều đạt độ tinh khiết cao 2.2.2. Thiết bị và dụng cụ - Máy đo quang UV Aligent technologies Cary 60 UV – VIS, Mỹ. - Máy đo pH HANNA HI8314, Mỹ - Cân phân tích AY 220 của hãng Shimadzu, Nhật Bản. - Máy cô quay của hãng Shimadzu, Nhật Bản. - Máy khuấy từ của hãng Shimadzu, Nhật Bản. - Máy li tâm của hãng Shimadzu, Nhật Bản. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
  28. - Micro pipet một đầu kênh 2-20 μL, 10-100 μL, 100-1000 μL. - Các dụng cụ khác sử dụng trong thực nghiệm: ống nghiệm, đầu côn, pipet, bình thủy tinh, đũa thủy tinh, bếp từ . 2.3. Nội dung nghiên cứu Đề tài nghiên cứu được thiết kế với các nội dung như sau: Nội dung 1: Xây dựng mô hình chuột ĐTĐ týp 2 Hoạt động 1: Tạo chuột béo phì bằng chế độ dinh dưỡng giàu chất béo. Hoạt động 2: Gây đái tháo đường týp 2 bằng STZ. Nội dung 2: Đánh giá tác dụng tác dụng hạ glucose của dịch chiết lá cây xấu hổ (Mimosa pudica Linn.). Hoạt động 1: Phân lô nghiên cứu Hoạt động 2: Định lượng glucose huyết của chuột trong các lô nghiên cứu Nội dung 3: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết lá cây xấu hổ theo phương pháp DPPH. Nội dung 4: Đánh giá tác dụng ức chế enzym α – glucosidase in vitro của dịch chiết lá cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn.). 2.4. Phương pháp nghiên cứu Hình 2.3. Sơ @ đồ Schoolnghiên cứu of Medicine and Pharmacy, VNU 18
  29. 2.4.1. Xây dựng mô hình chuột ĐTĐ týp 2 Gây béo phì Chuột được nuôi ở điều kiện bình thường. Chuột được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn trong 3-4 ngày để thích nghi với điều kiện môi trường mới. Sau đó được nuôi với chế độ ăn giàu chất dinh dưỡng (35% chất béo mỡ lợn) để gây béo phì. Chuột được nuôi trong vòng 8 tuần, sau đó tiến hành chọn lọc những con chuột đạt tiêu chuẩn để tiến hành thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Gây ĐTĐ type 2 thực nghiệm bằng Streptozotocin Phương pháp tạo mô hình ĐTĐ týp 2 thực nghiệm ở chuột được thực hiện theo phương pháp của Punit Bansal và cộng sự [24], sau khi nuôi 8 tuần, các con chuột được nhịn đói khoảng 8h, tiến hành tiêm màng bụng STZ – STZ được pha trong đệm citrat 0,01M, pH = 4,3 (pha 250 ml đệm citrate gồm: 0,2966g acid citric monohydrate và 0,2995g natri citrate dihydrat) một lần với liều 120 mg/kg thể trọng. Phân lô cụ thể như sau (mỗi lô 4 con): Lô 1: Béo phì + đệm Lô 2: Béo phì + STZ. Tiêm STZ xong, sau 1 giờ các con chuột được bổ sung thức ăn theo chế độ dinh dưỡng ban đầu trong 10 ngày và theo dõi nồng độ đường huyết của 2 lô. 2.4.2. Đánh giá tác dụng tác dụng hạ glucose của dịch chiết lá cây Xấu hổ Phân lô nghiên cứu Chuột bị ĐTĐ týp 2 được tiến hành phân lô để nghiên cứu khả năng hạ đường huyết khi xử lý với các mẫu nghiên cứu khác nhau. Mỗi nhóm chuột gồm 4 con được phân nhóm ngẫu nhiên. Nhóm 1: Nhóm chứng sinh lý, chuột bình thường, được cho uống nước cất. Nhóm 2: Nhóm chứng bệnh tiểu đường: Chuột bị tiểu đường do tiêm STZ Nhóm 3: Nhóm lô đối chiếu chứng dương: Chuột tiểu đường được cho uống 5 mg/kg gliclazide (nhóm thuốc đối chứng dương) Nhóm 4: Chuột tiểu đường được cho uống 150 mg/kg thể trọng cao nước của dịch chiết lá cây Xấu hổ. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
  30. Nhóm 5: Chuột tiểu đường được cho uống 300 mg/kg thể trọng cao nước của dịch chiết lá cây Xấu hổ. Các nhóm chuột được điều trị trong 22 ngày. Trọng lượng và đường huyết được xác định vào 8-9 giờ sáng vào các ngày thứ 0, ngày thứ 5, thứ 10, thứ 15 và thứ 22 (chuột cho nhịn ăn cả đêm trước khi đo). Sau khi đo các chỉ tiêu khoảng 60 phút chuột được cho ăn và uống nước bình thường. Sau 22 ngày, lấy máu chuột để phân tích chỉ số lipid máu. Cách pha mẫu: Cao chiết nước được hòa tan trong nước với nồng độ thích hợp (liều 1: 0,15 g/ 20 ml và liều 2: 0,3 g/ 20 ml) sau đó cho chuột uống dựa vào cân nặng của chuột (0,2 ml/10g) theo liều ở nhóm 4 và nhóm 5. Phương pháp định lượng glucose huyết Định lượng glucose huyết bằng kỹ thuật enzym. Glucose oxidase bị oxy hóa nhờ sự xúc tác của các enzym có trên bề mặt của vùng phản ứng giấy thử và đọc kết quả trên máy đo đường huyết On - Call Plus do hãng ACON Laboratories Inc, Mỹ sản xuất. Nguyên lý hoạt động Khi máu tiếp xúc với bề mặt của vùng phản ứng que thử, glucose (trong máu) sẽ phản ứng với oxy (trong không khí) nhờ xúc tác của enzyme glucooxydase (có ở trên bề mặt vùng phản ứng của giấy thử) tạo acid gluconic và hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide vừa tạo ra sẽ oxy hóa thuốc nhuộm trên bề mặt vùng phản ứng làm biến đổi màu của giấy thử vùng phản ứng (từ màu kem chuyển dần sang màu xanh). Độ đậm màu xanh tuỳ thuộc vào nồng độ glucose chứa trong mẫu máu. Tiến hành Máy On – Call Plus đo lượng đường glucose trong máu toàn phần. Máu được thấm vào đầu trên của que thử và tự động hút vào vùng đo nơi phản ứng xảy ra. Gắn một que thử để bật máy. Nhấn nút C để chọn mã số chính xác với mã ghi trên lọ que thử. Tạo vết cắt trên đuôi chuột, bỏ giọt máu đầu, lấy giọt máu thứ 2. Mẫu máu dùng cho việc đo là 1µl, phải là một máu tròn đầy. Thấm nhẹ giọt máu vào điểm nhận máu trên đầu que thử. Sau 5 giây kết quả sẽ hiện thị trên màn hình. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
  31. 2.4.3. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết lá cây Xấu hổ theo phương pháp DPPH Chuẩn bị hóa chất cần thiết - Dung môi MeOH đạt tiêu chuẩn phân tích. - Chất chuẩn dương acid ascorbic (Trung quốc) được hòa tan trong MeOH bão hòa với nồng độ 100 µg/ml; 50 µg/ml; 25 µg/ml; 12,5 µg/ml; 6,25 µg/ml; 3,125 µg/ml; 1,5625 µg/ml. - 1,1- diphenyl – 2 –picrylhydrazyl (DDPH, Sigma- Aldrich, Singapore) pha trong MeOH với nồng độ 0.08 mg/ml. - Mẫu thử: dược liệu được hòa tan trong MeOH bão hòa với các nồng độ 20 mg/ml; 15 mg/ml; 10 mg/ml; 5mg/ml; 4 mg/ml; 2,5 mg/ml; 1 mg/ml dùng cho thí nghiệm. Nguyên lý DDPH có khả năng tạo gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa. Cho các chất thử vào dung dịch này, nếu chất có khả năng quét gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của DDPH. Cách tiến hành Thử nghiệm đánh giá tác dụng chống oxy hóa của cây Xấu hổ được tiến hành tại Bộ môn Dược lý- Dược lâm sàng, khoa Y dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Hỗn hợp phản ứng gồm: 150μL dung dịch DDPH 3,3mM; 100 μL các mẫu với nồng độ khác nhau của dịch chiết; 2,9 ml MeOH. Hỗn hợp được ủ trong bóng tối ở 25oC trong 30 phút, sau đó đem đo độ hấp thụ bằng máy quang phổ ở bước sóng 517 nm. Mẫu chứng được tiến hành tương tự nhưng chất thử thay bằng vitamin C. Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
  32. 150 μL dung dịch DDPH 3,3 mM 100 μL chất thử (ở nồng độ 20; 15; 10; 5; 4; 2,5; 1)(mg/ml) 2,9 mL dung dịch MeOH Ủ ở 25oC trong 30 phút Đo quang ở 517 nm Hình 2.4. Sơ đồ qui trình thí nghiệm Cách đánh giá kết quả Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Đánh giá tác dụng chống oxi hóa thông qua mật độ quang học (OD), từ đó tính được phần trăm ức chế (I%) và xác định được IC50 bằng phần mềm Sigma Plot 10.0. Tính I% (phần trăm ức chế) theo công thức [16] − 푡 I% = 100 − 표 Trong đó: Ac: độ hấp thụ của mẫu chứng (150 μL DDPH 3,3mM + 3ml MeOH) At: độ hấp thụ của mẫu thử (150 μL DDPH 3,3mM+ 2,9 ml MeOH+100 μL mẫu thử) A0: độ hấp thụ của mẫu trắng (sử dụng methanol) Tác dụng chống oxi hóa của dịch chiết được so sánh với chất chuẩn dương là acid ascorbic. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
  33. 2.4.4. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α – glucosidase in vitro của dịch chiết lá cây Xấu hổ. Thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym α – glucosidase in vitro của dịch chiết lá cây Xấu hổ (Mimosa pudica Linn.) được tiến hành tại Viện công nghệ sinh học -Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. [37,39,31,32] Chuẩn bị hóa chất cần thiết Enzym Yeast -glucosidase; p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG), 4- Nitrophenol (Sigma). Nguyên lý Enzym α-glucosidase xúc tác quá trình chuyển chất nền p-nitrophenyl-α-D- glucopyranoside thành α-glucose và p-nitrophenol có màu vàng nhạt - hấp thụ cực đại tại 405 nm. Chất kìm hãm enzym làm cường độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm. Dựa vào độ hấp thụ của dung dịch khi có hoặc không có mặt chất thử, từ đó suy ra phần trăm ức chế enzym. Dựa vào phần mềm, xác định IC50 (nồng độ của mẫu tại đó ức chế 50% enzym). Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. Cách tiến hành Hoạt tính ức chế enzym α glucosidase của hoạt chất nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp của Moradi-Afrapoli F và cộng sự. Cụ thể như sau: - Chất thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng trong đệm phosphate 10 mM (pH 6,8) và 50 l được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 256 g/ml, 64 g/ml; 16 g/ml; 4 g/ml; - 20 µl α- glucosidase (0,5U/ml) và 130 µl đệm phosphate 100 mM (pH 6,8) được thêm vào mỗi giếng, trộn đều và ủ ở 37oC trong 15 phút. - Cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) được đưa tiếp vào từng giếng thí nghiệm rồi ủ tiếp ở 37oC trong 60 phút. - Đĩa thí nghiệm chỉ có mẫu thử, đệm phosphate và pNPG được sử dụng làm đối chứng trắng (blank). Giếng thí nghiệm chỉ có DMSO 10%, đệm phosphate, enzyme và pNPG được sử dụng làm đối chứng. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo sự chính xác. - Dừng thí nghiệm bằng cách thêm vào 80 µl Na2CO3 0,2M và đo OD ở bước sóng 405nm bằng máy đo ELISA Plate Reader (Bio-Rad). Cách đánh giá kết quả @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  34. Khả năng ức chế enzyme α - glucosidase của mẫu thử được xác định theo công thức sau: % ức chế = 100 - (Amẫu thử/ A đối chứng *100) Trong đó: A đối chứng = OD đối chứng - OD mẫu trắng đối chứng Amẫu thử = ODmẫu thử - OD mẫu trắng thử Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve2Dv4. 2.5. Phương pháp xử lí số liệu Các số liệu nghiên cứu được lưu trữ và xử lý thống kê sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2010, phần mềm SigmaPlot 10.0 (Systat Software Inc, Mỹ) và TableCurve2Dv4. Số liệu được biểu diễn dưới dạng X ± SD (X: Giá trị trung bình; SD: độ lệch chuẩn). TableCurve2Dv4. Giá trị IC50 được tính dựa vào đồ thị và phương trình biểu diễn nồng độ của dịch chiết nước từ cây Xấu hổ. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  35. CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả 3.1.1. Qui trình chiết, tách lá cây Xấu hổ bằng nước tinh khiết Tiến hành chiết tách 1 kg lá Xấu hổ khô, chúng tôi thu đượ 153,4 g cao,. Hiệu suất của qui trình chiết là 15,34 %. Kết quả chiết cho thấy lá cây Xấu hổ có chứa một lượng lớn các hợp chất tự nhiên. Phương pháp tách chiết với dung môi nước tinh khiết này thường thu được các chất có độ phân cực cao, các chất kém phân cực khó được tách ra hoàn toàn. 3.1.2. Xây dựng mô hình ĐTĐ týp 2 thực nghiệm 3.1.2.1. Tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm Chuột được chọn là chuột nhắt trắng chủng Swiss do Học Viện Quân Y Hà Nội cung cấp có khối lượng từ 25 – 28 g/con, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 3 con (tách riêng đực, cái). Những lô chuột được nuôi với chế độ ăn giàu chất dinh dưỡng do Viện vệ sinh dịch tễ trung tương cung cấp và nuôi trong chu kỳ 12 giờ sáng/ tối (12:00 AM – 12:00 PM) dưới nhiệt độ kiểm soát (25oC ± 3oC). Sau 8 tuần, tiến hành xác định khối lượng trung bình của các lô chuột thí nghiệm và thu được kết quả như sau: Bảng 3.1. . Khối lượng trung bình của các lô chuột ban đầu và sau 8 tuần nuôi theo mô hình gây béo phì thực nghiệm Khối lượng chuột Ngày bắt đầu Sau 4 tuần Sau 8 tuần Khối lượng tăng (%) (g) 28,2 ± 1,68 34,36 ± 3,26 38,12 ± 4,18 35,17 % Từ bảng 3.2 cho thấy chuột nuôi để béo phì theo chế độ ăn giàu chất dinh dưỡng trong 8 tuần có khối lượng tăng đáng kể so với ban đầu (tăng 35,17%) 3.1.2.2. Tạo mô hình chuột ĐTĐ thực nghiệm Chọn các con chuột béo phì có khối lượng từ 35g trở lên để làm tiếp thí nghiệm. Chuột được chia làm 2 lô, mỗi lô 4 con; kiểm tra đường huyết trước khi tiêm và sau khi tiêm 6 ngày và 10 ngày. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
  36. Bảng 3.2.Nồng độ đường huyết của chuột béo phì sau khi tiêm STZ (120mg/kg thể trọng) (đơn vị: mmol/l) Chuột Trước khi tiêm Sau khi tiêm 6 ngày 10 ngày Lô tiêm đệm 6,9 ± 1,13 6,3 ± 1,34 6,75 ± 1,2 Lô tiêm 6,43 ±0,55 8,43 ± 0,97 10,10 ± 1,73 STZ Từ bảng 3.3, ta thấy, lô đối chứng (lô tiêm đệm) nồng độ đường huyết tương đối ổn định theo từng ngày, xung quanh nồng độ 6 mmol/l. Nhưng với lô tiêm STZ, nồng độ trước khi tiêm là 6,43 ± 0,55 mmol/l; ngày thứ 6 sau khi tiêm tăng STZ nồng độ đường huyết của chuột đã tăng lên 31,10% so với nồng độ ban đầu của chuột; tới ngày thứ 10, nồng độ đường huyết chuột là 10,10 ± 1,73 mmol/l – tăng lên 57,07% so với nồng độ ban đầu. Kết quả cho thấy, việc gây mô hình chuột béo phì bị đái tháo đường do STZ liều thấp gây nên là hoàn toàn thành công. 3.1.3. Tác dụng của cao nước lá cây Xấu hổ lên chuột béo phì thực nghiệm. Với mô hình thí nghiệm được mô tả trong phần phương pháp nghiên cứu, kết quả khối lượng chuột được thể hiện trong bảng 3.4 dưới đây: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  37. Bảng 3.3. Tác dụng của dịch chiết cây Xấu hổ đối với trọng lượng chuột bị tiểu đường do STZ gây ra Đơn vị: g Trước điều Sau điều trị Sau điều trị % thay đổi trị 11 ngày 22 ngày Nhóm 1: Nhóm chứng 35,50± 0,86 36,73±0,83 37,66±1,70 Tăng sinh lý 6,08% Nhóm 2: STZ + không 37,00 ± 2,54 38,65±0,21 41,25±1,2 Tăng điều trị 11,49% Nhóm 3: STZ+ 41,8 ±2,82 38.91±1.76 34,96 ± 3,21 Giảm gliclazide 16,36% Nhóm 4:STZ+xấu hổ- 42,42±3,68 38,80±0,88 37,85± 1,44 Giảm 150mg/kg 10,77% Nhóm 5: STZ + xấu hổ- 42,93±1,91 38,3 ±0,60 35,16±2,15 Giảm 300mg/kg 18,10% Sự khác nhau về chỉ số đường huyết của chuột bình thường và béo phì được thể hiện qua bảng 3.5 như sau: Bảng 3.4. Chỉ số glucose ở chuột ĐTĐ do STZ gây ra trước và sau 22 ngày điều trị bằng lá cây Xấu hổ Nhóm Trước điều trị Sau điều trị 22 ngày Nhóm 1: Nhóm chứng sinh lý 6,3 ± 0,52 6,63 ± 1,27 Nhóm 2: STZ + nước cất 10,5 ± 1,13 12,75 ± 0,64# Nhóm 3: STZ+ gliclazide 10,53 ± 1,05 8,33 ± 0,32* Nhóm 4: STZ+ cao chiết -150mg/kg 10,22 ± 1,61 8,15 ± 0,95* Nhóm 5: STZ + cao chiết-300mg/kg 10,36 ± 1,30 8,1 ± 0,46* *Khác biệt có ý nghĩa so với nhóm 2; # Khác biệt có ý nghĩa so với nhóm 1. Kết quả tác dụng cao chiết nước lá cây Xấu hổ lên nồng độ glucose huyết và trọng lượng chuột được trình bày ở bảng 3.4 và 3.5. Nhìn vào bảng cho thấy, ở nhóm chứng sinh lý, nồng độ glucose và trọng @ lư ợSchoolng cơ thể đư ofợc duyMedicine trì ổn định. Nhómand Pharmacy, VNU 27
  38. chứng bệnh không điều trị có sự tăng cao về nồng độ glucose huyết (tăng 21,4 %) và trọng lượng cơ thể (tăng 11,49%) so với trước điều trị. Nhóm chứng được điều trị bằng gliclazide giảm nồng độ glucose huyết (giảm 20,89%) và trọng lượng cơ thể (giảm 16,36%) đáng kể. Nhóm chuột được cho uống cao chiết nước lá cây Xấu hổ ở cả hai liều 150mg/kg và 300mg/kg thể trọng đều làm giảm đáng kể nồng độ glucose huyết và trọng lượng cơ thể. Với liều 150 mg/kg, nồng độ glucose huyết giảm 20,25% và trọng lượng cơ thể giảm 10,77% so với trước điều trị. Với liều 300mg/kg, trọng lượng chuột giảm 18,10% và nồng độ đường huyết giảm 21,81% so với trước điều trị. Kết quả này cho thấy cao chiết nước lá cây Xấu hổ có tiềm năng trong việc phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường cho con người. 3.1.3. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết lá cây Xấu hổ theo phương pháp DPPH Hợp chất DDPH là chất có khả năng tạo gốc tự do bền vững, tạo dung dịch màu tím (hấp thụ ở bước sóng 517 nm). Các gốc tự do DPPH bị quét bởi các chất có khả năng chống oxy hóa, dung dịch DDPH sẽ tạo dung dịch màu vàng. Dựa vào phương pháp đó để đánh giá khả năng quét gốc tự do của cao chiết nước lá cây Xấu hổ. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.5 và hình 3.1 Bảng 3.5. Khả năng quét gốc tự do của các mẫu thử Mẫu LogIC50 IC50 Vitamin C (μg/ml) 0,650 4,46 Cao chiết (mg/ml) 0,8008 6,32 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  39. . Cao chiết Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do DDPH của acid ascorbic và cao chiết nước lá cây Xấu hổ Từ bảng 3.6 và hình 3.1, kết quả cho thấy cao chiết nước lá cây Xấu hổ khả năng quét gốc tự do tương đối tốt, có giá trị IC50 là 6,32 mg/ml. Tác dụng chống oxy hóa của chứng dương acid ascorbic có IC50 là 4,46 µg/ml. Như vậy, khả năng quét gốc tự do của cao chiết nước phụ thuộc vào nồng độ, tại các nồng độ khác nhau thể hiện khả năng quét gốc tự do rõ rệt. Ở nồng độ cao chiết càng cao, khả năng quét gốc tự do càng lớn: nồng độ cao chiết 1 mg/ml khả năng quét gốc tự do chỉ đạt 12,12 ± 1,3 % nhưng khi tăng nồng độ lên lần lượt 2,5 mg/ml; 4 mg/ml; 5 mg/ml; 10 mg/ml; 15 mg/ml khả năng quét gốc tự do cũng tăng lần lượt là 16,62 ± 1,2%; 23,62 ± 1,8%; 51,66 ± 1,8%; 68,31 ± 1,00%; 87,50 ± 1,5%. Tại nồng độ 20 mg/ml khả năng quét gốc tự do đạt 93,93 ± 2,1%. 3.1.4. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α – glucosidase in vitro của dịch chiết lá cây Xấu hổ. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
  40. Bảng 3.6. Tác động ức chế alpha-glucosidase của cao nước lá cây Xấu hổ Tên % ức chế tại các nồng độ (µg/ml) Giá trị IC50 STT mẫu 512 128 32 8 2 (g/ml) 1 Cao 97,14 96,23 95,41 78,26 35,10 3,09 ± 0,27 chiết Chất đối chứng 147,52 ± 4,71 Acarbose Kết quả từ bảng 3.6 cho thấy mẫu cao chiết nước lá cây Xấu hổ có khả năng ức chế enzym α-glucosidase rất tốt so với chất đối chứng acarbose qua IC50 thấp hơn nhiều so với acarbose. Giá trị IC50 = 3,09 ± 0,27µg/ml của cao chiết và chất đối chứng có IC50=147,52 ± 4,17μg/ml . Chất đối chứng dương acarbose hoạt động ổn định trong thí nghiệm. 3.2. Bàn luận Streptozotocin (STZ) thuộc nhóm hợp chất glucosamine nitrosorea có khả năng gây độc với tế bào β sản xuất insulin của tuyến tụy ở động vật có vú. Chế độ dinh dưỡng nhiều chất béo kết hợp tiêm STZ liều thấp ở động vật làm thí nghiệm thường được dùng làm mô hình để sàng lọc các thuốc hạ đường huyết. Đái tháo đường typ 2 có đặc trưng bởi tăng đường huyết, rối loạn lipid máu, rối loạn chuyển hóa carbohydrat. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy cao chiết nước lá Xấu hổ có tác dụng chống oxy hóa, ức chế enzym α-glucosidase và làm hạ glucose huyết và trọng lượng tương đương với thuốc đối chứng gliclazide trên chuột bị đái tháo đường do STZ. Cơ chế STZ gây độc với tế bào β là do STZ sinh ra các gốc tự do, tấn công vào các tế bào β. Trong quá trình tăng glucose huyết của cơ thể sản sinh ra nhiều gốc tự do làm suy yếu hệ thống phòng thủ chống oxy hóa nội sinh [38]. Như vậy, một trong những cách để phòng ngừa và giảm các triệu chứng của bệnh đái tháo đường là sử dụng các chất chống oxy hóa. Các chất oxy hóa trong dược liệu có đặc tính quét các gốc tự do là do sự góp mặt của nhóm hydroxyl trong công thức cấu tạo của chúng [17]. Để đánh giá khả năng chống oxy hóa, phương pháp DDPH được sử dụng rộng rãi. Kết quả nghiên cứu này cho thấy tác dụng của cao chiết nước lá cây Xấu hổ phụ thuộc vào nồng độ nghĩa là @khi nSchoolồng độ chấ oft tăng Medicine thì tác dụng quét and các Pharmacy, VNU 30
  41. gốc tự do cũng tăng theo. Cao chiết nước lá cây Xấu hổ có khả năng quét gốc tự do DPPH đáng kể với IC50 là 6,32 mg/ml. Jing Zhang và cộng sự đã nghiên cứu hoạt động quét gốc DDPH của chiết xuất ethanol của toàn bộ cây, thân, lá và hạt của Mimosa pudica Linn cho thấy các giá trị IC50 của chiết xuất ethanol như sau: lá > toàn bộ cây > hạt > thân [52]. Tuy nhiên, trong cao chiết với nước, các chất chống oxy hóa chứa hàm lượng thấp nên ta thấy hoạt động chống oxi hóa vừa phải. Vì vậy, cần thử khả năng chống oxy hóa ở các cao chiết với dung môi phân cực khác. α-glucosidase là một enzym nằm trong màng tế bào đường ruột, tham gia vào bước cuối cùng của quá trình tiêu hóa. Vì vậy, các chất ức chế enzym này sẽ làm giảm quá trình hấp thu đường từ đường tiêu hóa vào máu. Các chất ức chế enzym α-glucosidase đã được sử dụng làm thuốc điều trị bệnh đái tháo đường typ 2 như acarbose, miglitol, voglibose [17]. Acarbose là thuốc tân dược dược sử dụng rộng rãi hiện nay và cũng là một chất chứng dương trong các nghiên cứu về tác dụng ức chế enzym α – glucosidase. Trong nghiên cứu này acarbose được sử dụng làm chất chứng dương cho các thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế enzyme α- glucosidase. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy cao chiết nước có IC50 thấp rất nhiều so với chứng dương, mặc dù dược liệu được chiết bằng dung môi nước chứa nhiều hỗn hợp các chất với nồng độ rất nhỏ, đặc biệt với các chất ít phân cực, cao chiết nước của cây Xấu hổ có IC50 (3,09 ± 0,27 μg/ml) thấp hơn gần 47 lần so với IC50 của chất chuẩn (147,52 ± 4,71 μg/ml). Như vậy, cao chiết nước lá cây Xấu hổ rất tiềm năng trong việc tìm các hợp chất trong cao chiết có tiềm năng ức chế enzym α-glucosidase. Vì vậy, hướng nghiên cứu tiếp theo sẽ tiến hành tách chiết các hợp chất từ cao chiết nước của lá cây Xấu hổ để phân lập các hợp chất có khả năng ức chế enzym này với giá trị IC50 cao. Kết quả cao chiết nước lá cây Xấu hổ làm hạ glucose huyết của chúng tôi cũng tương đồng với các nghiên cứu trước đây. Deepa Rajendiran và cộng sự đã chứng minh tác dụng dịch chiết ethanol lá cây Xấu hổ có tác dụng làm tăng sinh insulin, giảm glucose huyết, giảm HbA1c tăng lượng enzym tổng hợp glucose và giảm phân hủy glucogen [27] . Piyapong Yupparach và cộng sự cũng nghiên cứu cao chiết cồn 80% toàn cây Xấu hổ lên khả năng hạ glucose huyết và lipid máu trên chuột cống. Kết quả cho thấy ở nồng độ 500 mg/kg thể trọng làm giảm đáng kể glucose huyết, nồng độ cholesterol toàn phần triglycerides, lipoprotein tỉ trọng thấp và tăng đáng kể lipoprotein tỉ trọng cao sau 8 tuần điều trị [50]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
  42. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN 1.Về xây dựng mô hình đái tháo đường typ 2 thực nghiệm Để xây dựng mô hình chuột bị đái tháo đường typ 2 thực nghiệm, chúng tôi đã tạo mô hình chuột béo phì với chế độ ăn nhiều chất dinh dưỡng và nuôi trong chu kỳ 12 giờ sáng/ tối dưới nhiệt độ kiểm soát 250C ± 30C. Sau 8 tuần chọn các con chuột béo phì có khối lượng từ 35 g trở lên để tiếp tục làm thí nghiệm. Chuột đủ tiêu chuẩn về khối lượng tiến hành chia lô để gây mô hình đái tháo đường bởi tiêm màng bụng chuột liều thấp streptozotocin (120 mg/kg thể trọng). Bằng phương pháp này, chúng tôi đã gây mô hình đái tháo đường thành công với nồng độ đường huyết của chuột 10,10 ±1,73 mmol/l được chọn làm các thí nghiệm tiếp theo. 2. Về tác dụng của cao chiết lá cây Xấu hổ trong hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường Chúng tôi đã xác định được tác dụng chống oxy hóa qua phương pháp DPPH của cao chiết nước của lá cây Xấu hổ có IC50 của là 6,32 mg/ml. Tác dụng ức chế enzym α – glucosidase của cao chiết là 3,09 ± 0,27 μg/ml . Kết quả nghiên cứu còn cho thấy cao chiết nước có tác dụng hỗ trợ điều trị đái tháo đường, có tác dụng hạ đường huyết và trọng lượng trên chuột béo phì bị gây đái tháo đường với liều từ 150 mg/kg thể trọng. ĐỀ XUẤT Từ những kết quả thu được trong nghiên cứu chứng minh lá cây Xấu hổ, nhóm nghiên cứu chúng tôi đề xuất: - Phân lập các hoạt chất chính từ lá cây Xấu hổ cần được tiến hành để làm rõ hơn về tác dụng và cơ chế của dược liệu này về tác dụng điều trị đái tháo đường. - Kết quả thu được đã chứng minh lá cây Xấu hổ có thể hỗ trợ trong điều trị bệnh đái tháo đường, vì vậy, tiến hành nghiên cứu bào chế các sản phẩm hỗ trợ điều trị tiểu đường từ lá cây Xấu hổ. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
  43. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Đàm Trung Bảo và cộng sự (1997), Hội nghị khoa học Trường Đại học dược khoa Hà Nội, tr:1974 – 1977. 2. Bệnh viện Bạch Mai (2017), “ Đái tháo đường”, Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh nội khoa, NXB Y học, tr: 411 -416. 3. Bộ Y tế (2009), “ Đái tháo đường”, Bệnh học, NXB Giáo Dục, tr: 179 – 191. 4. Bộ Y tế (2012), “Hormon và thuốc điều trị rối loạn nội tiết”, Dược lý học tập 2,NXB Y học, tr: 303-304. 5. Bộ Y Tế (2017), Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị đái tháo đường typ 2. 6. B.m.Y.h.C.t.d – Trường Đại học Y Hà Nội (1999), “Đái tháo đường”, Y học cổ truyền, NXB Y học, tr. 542 – 543. 7. Võ Văn Chi (1991), Cây thuốc An Giang, tr:358. 8. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, tập 2, tr: 587-588. 9. Nguyễn Thị Hương Giang (2015), “Bài tổng quan mối liên hệ giữa béo phì và kháng insulin trong đái tháo đường typ 2”, Nghiên cứu dược Thông tin thuốc, (5), pp: 31-34. 10. Nguyễn Thị Hằng, Nguyễn Thị Thanh Tâm, Mai Hữu Phương (2016), “Khả năng bắt gốc tự do DDPH và năng lực khử của Nam Sâm Bò ở Cần Giờ, TP.HCM”, Tạp chí khoa học ĐHSP TP.HCM, (12), pp: 112-122. 11. Phạm Hoàng Hộ (2006), Cây có vị thuốc ở Việt Nam, tập 1, tr:119 - 218. 12. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, tập 1, tr:819 . 13. Đinh Hải Linh (2012), Nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết và mỡ máu của dịch chiết cây trâm Syzygium spp , Đại học KH- TN. 14. Nguyễn Văn Mùi (2015), Enzym học, NXB ĐHQGHN, tập 1, tr:361. 15. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, tr:794-796. 16. Bùi Thanh Tùng, Thu NTK, Hải NT (2016), "Tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym acetylcholinesterase của curcuminoid", Tạp chí Dược học, 56(12), tr:08-12. 17. Bùi Thanh Tùng, Thu ĐK, Hải PT, Hải NT. (2018), "Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của các phân đoạn dịch chiết quả Lựu (Punica granatum Linn))", Tạp chí Y Dược cổ truyền Việt Nam, 5(18), tr:59-63. 18. Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II, tr: 1099-1101. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  44. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 19. A. RK (2015), "Diversity of ethnomedicinal plants in Boridand Forest of District Korea, Chhattisgarh, India", Am J Plant Sci, 6, pp:413–425. 20. Ahmad H, Sehgal S, Mishra A, Gupta R (2012), “Mimosa pudica L. (Laajvanti): An overview”, Pharmacogn Rev, 6 (12), pp:115-24. 21. Akbarzadeh, A., et al (2007), “Induction of diabetes by Streptozotocin in rats”, Indian Journal of Clinical Biochemistry, 22(2), pp:60-64. 22. Babu, P.A., et al (2016), “A database of 389 medicinal plants for diabetes”, Bioinformation, 1(4), pp: 130. 23. Bansal P, Paul P, Mudgal J, Nayak PG, Pannakal ST, Priyadarsini K, et al (2012), "Antidiabetic, antihyperlipidemic and antioxidant effects of the flavonoid rich fraction of Pilea microphylla (L.) in high fat diet/streptozotocin-induced diabetes in mice", Experimental and Toxicologic Pathology, 64(6), pp:651-658. 24. Bashir, R., et al (2013), “Antidiabetic Efficacy of Mimosa pudica (Lajwanti) Root in Albino Rabbits”, International Journal of Agriculture & Biology, 15(4), pp:782-786. 25. Brand Williams, W., Cuvelier, M. E. & Berset, C. (1995), “Use of free radical method to evaluate antioxidant activity”, LWT, 28, pp:25 – 30. 26. D. D. R. Y. M. M. B. K. M. N. N. P. C. M. C. H.Gadgoli (2009), "Evaluation of wound healing activity of root of Mimosa pudica", Journal of Ethnopharmacology, 124(2), pp. 311-315. 27. Deepa Rajendiran SK, Senthilkumar Sivanesan, Saravanan Radhakrishnan, Krishnamoorthy Gunasekaran (2017), "Potential Antidiabetic Effect of Mimosa pudica Leaves Extract in High Fat Diet and Low Dose Streptozotocin-Induced Type 2 Diabetic Rats", International Journal of Biology Research, 2(4), pp:55-62. 28. Diarra, M., et al (2016), “Medicinal Plants in Type 2 Diabetes: Therapeutic and Economical Aspect”, International Journal of Preventive Medicine, 7, pp:56. 29. Graham, M.L., et al (2011), “The Streptozotocin-Induced Diabetic Nude Mouse Model: Differences between Animals from Different Sources”, Comparative Medicine, 61(4), pp:356-360. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  45. 30. Gandhiraja, N., et al (2009), “Phytochemical screening and antimicrobial activity of the plant extracts of Mimosa pudica Linn. Against selected microbes”, Ethnobotanical leaflets, (5), pp:8 31. Haimin Chen, Xiaojun Yan, Wei Lin, Li Zheng, Weiwei Zhang (2004), “A New Method for Screening a-Glucosidase Inhibitors and Application to Marine Microorganisms”, Pharmaceutical Biology, 42 (6), pp:416–421. 32. Hakamata W, Kurihara M, Okuda H, Nishio T, Oku T. (2009), “Design and screening strategies for alpha-glucosidase inhibitors based on enzymological information”, Curr. Top. Med. Chem., 9 (1), pp:3-12. 33. J. C. P. N. Sanaye M. M (2015), "Mimosa- A brief overview", Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 4(2), pp. 182-187. 34. Joby Jose. A. D. K. R. H. T. S. K. S. J. E. J. V. S. S (2016), "Structural characterization of a novel derivative of myricetin from Mimosa pudica as an anti-proliferative agent for the treatment of cancer," Biomedicine & Pharmacotherapy, 84, p. 1067–1077. 35. John H.Karam (1998), “Pancreatic Hormones and Antidiabetes drugs”. Basic and Clincal Pharmarcology, Appleton and Lange, pp:.684 – 705. 36. K. K. a. C. C. Ramesh S (2017), "Photochemical screening and pharmacognostic studies", International Journal of Fauna and Biological Studies, 4(4), pp:170-175. 37. Kim Y. M., Wang M. H., Rhee H. I. (2004), “A novel a-glucosidase inhibitor from pine bark”, Carbohydr. Res., 339, pp:715–717. 38. Lenzen S. (2008), "The mechanisms of alloxan-and streptozotocin-induced diabetes", Diabetologia, 51(2), pp: 216-226. 39. Li T., Zhang X. D., Song Y. W., Liu J. W. (2005), “A Microplate-Based Screening Method for -Glucosidase Inhibitors”, Nat. Prod. Res. Dev., 10, pp:1128–1134. 40. Monimala Mahanta. A. K. M (2001), "Neutralisation of lethality, myotoxicity and toxic enzymes of Naja kaouthia venom by Mimosa pudica root extracts", Journal of Ethnopharmacology, 75(1), pp: 55-60. 41. Moradi-Afrapoli F, Asghari B, Saeidnia S, Ajani Y, Mirjani M, Malmir M, et al. (2012), "In vitro α-glucosidase inhibitory activity of phenolic constituents from aerial parts of Polygonum hyrcanicum", DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 20(1), pp:37. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  46. 42. P. A. Pande M (2010), "Preliminary pharmacognostic evaluations and phytochemical studies on roots of Mimosa pudica (Lajvanti)", Int J Pharm Sci Rev Res, vol. 1(1), 2010. 43. Ranjan R.K, et al (2013), "Phytochemical analysis of leaves and roots of Mimosa pudica collected from Kalingavaram, Tamil Nadu", Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 5(5), pp: 53-55. 44. S. S. M. A. G. R. Ahmad H (2012), "Mimosa pudica L. (Laajvanti): An overview," Pharmacogn Rev, 6 (12). 45. Sanaye M. M, Joglekar C.S, Pagare N.P (2015), “Mimosa- A brief overview”, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 4(2), pp:182-187. 46. Sharma PC. M. D. T (2001), "Database on medicinal plants”. Govt. of India, Janakpuri, Delhi, India, pp. 369-379. 47. Sowmya, A. and T. Ananthi (2011), “Hypolipidemic activity of Mimosa pudica Linn on butter induced hyperlipidemia in rats”, Asian J. Res. Pharm. Sci, 1(4), pp:123-126. 48. Swanston-Flatt, S., et al (1990), “Traditional plant treatments for diabetes. Studies in normal and streptozotocin diabetic mice”. Diabetologia, 33(8), pp:462-464. 49. WHO, Heath topics, obesity. 50. Yupparach P, Konsue A. (2017), "Hypoglycemic and Hypolipidemic Activities of Ethanolic Extract from Mimosa pudica L. in Normal and Streptozotocin-Induced Diabetic Rats", Pharmacognosy Journal, 9(6). 51. Zaidun NH, Thent Z.C, Latiff AA (2018), “ Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin”, Life sciences, 208(1), pp:111 – 122. 52. Zhang J, Yuan K, Zhou W-l, Zhou J, Yang P (2011), "Studies on the active components and antioxidant activities of the extracts of Mimosa pudica Linn. from southern China", Pharmacognosy magazine, 7(25), pp:35. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU