›

Khóa luận Nghiên cứu tác dụng của Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) trên mô hình ruồi giấm tự kỷ mang gen đột biến Rugose

pdf 48 trang thiennha21 18/04/2022 6700
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu tác dụng của Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) trên mô hình ruồi giấm tự kỷ mang gen đột biến Rugose", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_tac_dung_cua_thach_tung_rang_cua_huperz.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu tác dụng của Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) trên mô hình ruồi giấm tự kỷ mang gen đột biến Rugose

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS) TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM TỰ KỶ MANG GEN ĐỘT BIẾN RUGOSE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI-2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS) TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM TỰ KỶ MANG GEN ĐỘT BIẾN RUGOSE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2016.Y Người hướng dẫn: 1. PGS. TS. PHẠM THỊ NGUYỆT HẰNG 2. THS. ĐỖ THỊ QUỲNH HÀ NỘI-2021
  3. LỜI CẢM ƠN Em muốn được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng, trưởng khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu Trung ương, người thầy đã truyền cảm hứng, trực tiếp hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cũng như kinh phí để em thực hiện đề tài khóa luận này. Em muốn gửi lời cảm ơn tới ThS. Đỗ Thị Quỳnh, Bộ môn Y Dược học cơ sở, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội. Cô đã cho em cơ hội được nghiên cứu khoa học trong một môi trường chuyên nghiệp, luôn đưa ra những lời khuyên quý báu, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp. Em muốn gửi lời cảm ơn tới các thầy cô bộ môn Y Dược học cơ sở, cô chủ nhiệm và các thầy cô bộ môn khác của Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, trong suốt khoảng thời gian 5 năm qua, đã cung cấp cho bản thân em rất nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu, quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập. Em xin cảm ơn tập thể các anh chị, cán bộ khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu Trung ương đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình cho em trong quá trình thực nghiệm, cũng như chia sẻ những kinh nghiệm quý giá ứng dụng thực tế. Cuối cùng, em xin cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc khi em gặp khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sống. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Hà Nội, ngày 29 tháng 5 năm 2021 Sinh viên Trương Thị Hoài Phương
  4. MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về hội chứng tự kỷ 2 1.1.1. Khái niệm về hội chứng tự kỷ 2 1.1.2. Dịch tễ học về hội chứng tự kỷ 2 1.1.3. Các yếu tố nguy cơ của rối loạn phổ tự kỷ 3 1.1.3.1 Yếu tố di truyền học 3 1.1.3.2 Yếu tố nguy cơ từ môi trường 5 1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ 6 1.1.5. Các phương pháp điều trị rối loạn phổ tự kỷ 7 1.1.6. Một số mô hình nghiên cứu rối loạn phổ tự kỷ 7 1.2. Tổng quan về ruồi giấm 8 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu, hình thành và phát triển 8 1.2.2. Đặc điểm sinh học và phát triển của ruồi giấm 9 1.2.2.1. Đặc điểm bên ngoài của ruồi giấm 9 1.2.2.2. Hệ gen của ruồi giấm 9 1.2.2.3. Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm 9 1.2.3. Mô hình ruồi giấm đột biến gen Rugose mang hội chứng tự kỷ 10 1.3. Tổng quan về dược liệu nghiên cứu: Thạch tùng răng cưa 11 1.3.1. Tên gọi – vị trí phân loại 11 1.3.2. Đặc điểm thực vật, phân bố, giá trị sử dụng 12 1.3.3. Thành phần hoá học và tác dụng sinh học 13
  5. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Dược liệu nghiên cứu 15 2.2. Đối tượng nghiên cứu 15 2.3. Hoá chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 15 2.3.1. Hoá chất 15 2.3.2. Dụng cụ, thiết bị 16 2.4. Thiết kế thí nghiệm 16 2.4.1. Căn cứ để chọn mức liều 2 mg/ml và 4 mg/ml 16 2.4.2. Nhân dòng ruồi giấm tự kỷ và hoang dại phục vụ nghiên cứu 16 2.4.3. Thu ấu trùng và ruồi trưởng thành phục vụ nghiên cứu 18 2.4.4.Chia lô thí nghiệm 18 2.5. Phương pháp nghiên cứu 18 2.5.1. Đánh giá tác dụng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa trên mô hình ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ bằng thử nghiệm hành vi 18 2.5.1.1. Thử nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm 18 2.5.1.2. Thử nghiệm đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành 19 2.5.1.3. Thử nghiệm đánh giá hành vi tương tác cộng đồng của ruồi giấm trưởng thành 20 2.3.1.4. Thử nghiệm đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm trưởng thành 21 2.5.2. Thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa đối với khả năng sống sót của ruồi giấm Rugose trưởng thành 22 2.6. Phân tích kết quả 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1. Kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với ruồi giấm Rugose đột biến gen mang hội chứng tự kỷ bằng thử nghiệm hành vi 24
  6. 3.1.1. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ 24 3.1.2. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa ảnh đối với khả năng trèo của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ . 26 3.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa tới khả năng cải thiện mức độ tương tác cộng đồng của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ 28 3.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa ảnh tới sự thay đổi nhịp sinh học của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ 30 3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa tới khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 1. Kết luận 35 2. Đề xuất 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO
  7. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 1 ABA Applied Behavioral Analysis Phân tích hành vi ứng dụng Attention deficit hyperactivity 2 ADHD Rối loạn tăng động giảm chú ý disorder 3 ASD Autism Spectrum Disorder Hội chứng rối loạn phổ tự kỷ Diagnostic and statistical Cẩm nang thống kê và chẩn 4 DSM-5 manual of mental disorders đoán rối loạn tâm thần Gen Fragile X 5 FRM1 Fragile X Mental Retardation 1 Mental Retardation 1 6 NBEA Neurobeachin Gen Neurobeachin 7 TSC Tuberous Sclerosis Complex Hội chứng xơ cứng củ 8 TTRC Thạch tùng răng cưa
  8. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Các gen liên quan đến rối loạn phổ tự kỷ ở người (ASD) 5 Hình 1.2: Ruồi giấm đực và cái 9 Hình 1.3: Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm. 10 Hình 1.4: Cây Thạch tùng răng cưa. 12 Hình 2.1: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng 19 Hình 2.2: Thiết kế thí nghiệm đánh giá hành vi cộng đồng của ruồi giấm 21 Hình 2.3: Hệ thống quan sát DAM2 Drosophila Activity Monitor 22 Hình 2.4: Mô hình đánh giá mức độ cải thiện khả năng sống sót 23 Hình 3.1: Ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm tự kỷ. 24 Hình 3.2: Kết quả đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành bằng thử nghiệm leo trèo ở các thời điểm 3, 7, 10 ngày tuổi 26 Hình 3.3: Khả năng tương tác cộng đồng của ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ 28 Hình 3.4: Ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với khả năng hoạt động của ruồi giấm Rugose. 30 Hình 3.5: Kết quả phân tích mức độ vận động tại thời điểm buổi sáng của ruồi giấm trong 6 ngày. 31 Hình 3.6: Đồ thị phân tích khả năng sống sót 33
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn phổ tự kỷ (Autism spectrum disorder- ASD) là một rối loạn thần kinh phức tạp với những rối loạn về hành vi thường xuất hiện trong những năm đầu đời của trẻ, được đặc trưng bởi sự suy giảm khả năng giao tiếp, tương tác xã hội kết hợp với những hành vi, sở thích hoặc hoạt động hạn chế và lặp đi lặp lại [34]. Gần đây, có nhiều sự thay đổi về nhận thức cũng như tiêu chuẩn chẩn đoán kết hợp với các yếu tố sinh học và môi trường, tỷ lệ tự kỷ đang gia tăng một cách nhanh chóng ở tất cả các quốc gia [24]. Nguyên nhân của tự kỷ đến nay vẫn chưa được xác định chính xác cũng như chưa có phương pháp hay thuốc điều trị đặc hiệu [11]. Trong khi đó, các thuốc tân dược hiện đang sử dụng mới chỉ giúp cải thiện triệu chứng, tuy nhiên, lại gây ra nhiều tác dụng không mong muốn nguy hiểm [32]. Do đó, nhu cầu nghiên cứu phát triển các loại thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu không hoặc có ít tác dụng không mong muốn để hỗ trợ và điều trị hội chứng tự kỷ là rất cần thiết và đang được thế giới quan tâm. Thạch tùng răng cưa có tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb.) Trevis họ Thạch tùng (Thông đất) (Lycopodiaceae). Ở Việt Nam, cây mọc hoang dã tại một số vùng núi cao từ 1000 m trở lên, như là Lào Cai, Cao Bằng, Theo kinh nghiệm dân gian, toàn cây Thạch tùng răng cưa được sử dụng để điều trị suy nhược thần kinh, mất trương lực cơ, cầm máu [70] nhờ có các thành phần hoá học như alkaloid Huperzin A, Triterpen, Flavoles, và những acid Phenoliques [21] Tại Việt Nam, việc nghiên cứu thuốc từ dược liệu nói chung và Thạch tùng răng cưa nói riêng nhằm hỗ trợ điều trị hội chứng tự kỷ còn rất hạn chế. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) trên mô hình ruồi giấm tự kỷ mang gen đột biến Rugose” với hai mục tiêu cụ thể sau: 1. Đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) trên mô hình ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ. 2. Đánh giá tác dụng cải thiện khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis). 1
  10. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về hội chứng tự kỷ 1.1.1. Khái niệm về hội chứng tự kỷ Tự kỷ - “Autism” là tên gọi chứng rối loạn phát triển, đặc trưng bởi khiếm khuyết về mặt thiết lập các mối quan hệ, tương tác với xã hội, do nhà tâm lý học Leo Kanner đặt ra vào năm 1943 [49]. Chi tiết hành vi của nhóm trẻ mắc bệnh này được mô tả bao gồm: "Thiếu quan hệ tiếp xúc về mặt tình cảm với người khác; các thói quen thường ngày rất giống nhau về tính cách kỳ dị và tỉ mỉ; không có ngôn ngữ nói hoặc ngôn ngữ nói khác thường; rất thích xoay các đồ vật hình tròn; có kỹ năng mức cao về nhìn nhận không gian hoặc giỏi trí nhớ "vẹt", hình thức bên ngoài có vẻ hấp dẫn, nhanh nhẹn, thông minh" [34, 35, 40, 55, 59]. Năm 1979, Lorna Wing đã đưa ra thuật ngữ “Rối loạn phổ tự kỷ” (tên tiếng anh là “Autism Spectrum Disorder (ASD)”), do sự đa dạng triệu chứng biểu hiện [66]. Ngày nay, một thuật ngữ khác nữa được gọi để chỉ nhóm các rối loạn phức tạp này là “Hội chứng tự kỷ”. Người ta chia rối loạn phổ tự kỷ thành 5 phân loại bao gồm: rối loạn tự kỷ, rối loạn Asperger, rối loạn Rett, rối loạn Disintegrative và rối loạn phát triển lan toả không được chỉ định khác [8, 34]. Năm 2008, Liên hiệp quốc đưa ra khái niệm: “Tự kỷ là một dạng khuyết tật phát triển tồn tại suốt cuộc đời, thường xuất hiện trong 3 năm đầu đời. Tự kỷ là do rối loạn thần kinh, gây ảnh hưởng đến chức năng hoạt động của não bộ. Tự kỷ có thể xảy ra ở bất cứ cá nhân nào, không phân biệt giới tính, chủng tộc hoặc điều kiện kinh tế - xã hội. Đặc điểm của tự kỷ là những khiếm khuyết về tương tác xã hội, giao tiếp ngôn ngữ, phi ngôn ngữ và có hành vi, sở thích, hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại”. Đây được coi là khái niệm tương đối đầy đủ và được đưa vào sử dụng phổ biến nhất. Những khiếm khuyết liên quan đến ASD hiện diện trong suốt cuộc đời và được coi là có tác động đáng kể về mặt chức năng, xã hội và tài chính đối với các cá nhân bị ảnh hưởng, gia đình và xã hội [23]. 1.1.2. Dịch tễ học về hội chứng tự kỷ Theo thống kê mới nhất của Tổ chức Y tế Thế giới WHO (2021), người ta ước tính rằng trên toàn thế giới cứ 270 người thì có một người mắc ASD. Ước tính này đại diện cho một con số trung bình và tỷ lệ hiện mắc được báo cáo khác nhau đáng kể giữa các nghiên cứu. Tuy nhiên, một số nghiên cứu được kiểm soát tốt đã báo cáo những con số cao hơn đáng kể. Tỷ lệ mắc ASD ở nhiều quốc gia có thu nhập thấp và trung bình vẫn chưa được biết rõ [65]. 2
  11. Tỷ lệ trẻ em mắc ASD ngày càng tăng ở mọi quốc gia. Một công bố của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) vào năm 2014 đã cho biết tỷ lệ rối loạn phổ tự kỷ là 1/68, tức cứ 68 trẻ thì có 1 trẻ mắc ASD, tăng 30% so với năm 2012 [2]. Xét về giới tính, theo nhiều nghiên cứu ở nhiều quốc gia khác nhau bao gồm cả Việt Nam, ASD có tỷ lệ gặp ở trẻ em nam cao gấp 3 lần so với trẻ em gái [31, 37, 41, 46, 48, 63, 64]. Tại Việt Nam, theo thống kê sơ bộ của Bộ Lao Động - Thương Binh và Xã Hội, Việt Nam có khoảng 200000 người mắc chứng tự kỷ và số lượng trẻ được chẩn đoán và điều trị ngày càng tăng lên, nếu tính theo cách tính của Tổ chức Y tế Thế giới, con số này ước chừng 500000 người [1]. Nghiên cứu của Hoàng Văn Minh và cộng sự năm 2019 cho thấy: tỷ lệ mắc ASD ở trẻ 18-30 tháng tuổi ở miền Bắc Việt Nam là khoảng 75.2/10000 trẻ. Tỷ lệ mắc ASD ở trẻ em được tìm thấy trong nghiên cứu này khá tương đồng với tỷ lệ mắc ASD trung bình trên thế giới với tỷ lệ khoảng 0.76%. Cũng trong nghiên cứu này, kết quả cho thấy những trẻ em sống ở thành phố có tỷ lệ mắc rối loạn phổ tự kỷ cao hơn trẻ em sống ở nông thôn. Mức độ đô thị hóa ngày càng tăng, dẫn đến trẻ có nguy cơ mắc hội chứng càng cao hơn. Một điểm đáng lưu ý nữa là tỷ lệ mắc ASD cao hơn ở những trẻ có mẹ làm nông nghiệp. Phát hiện này cho thấy có thể có mối quan hệ giữa ASD và thực hành canh tác, đặc biệt là việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật phổ biến ở Việt Nam [31]. 1.1.3. Các yếu tố nguy cơ của rối loạn phổ tự kỷ Nguyên nhân gây ra rối loạn phổ tự kỷ hiện vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Vì rối loạn rất phức tạp và không có hai người mắc chứng tự kỷ giống hệt nhau nên có lẽ có nhiều nguyên nhân gây ra hội chứng này. Các bằng chứng khoa học hiện có cho thấy có thể có nhiều yếu tố khiến trẻ có nhiều khả năng mắc ASD, bao gồm các yếu tố về môi trường và di truyền. 1.1.3.1. Yếu tố di truyền học Theo một nghiên cứu về khả năng di truyền của các rối loạn phổ tự kỷ năm 2015, tiền sử gia đình là một trong những yếu tố đáng chú ý làm tăng khả năng mắc ASD. Ước tính có từ 64% đến 91% rủi ro là do tiền sử gia đình có người mắc hội chứng [8]. Mặc dù, đã chỉ ra rằng ASD có nguyên nhân đa yếu tố phức tạp, nhưng các nghiên cứu song sinh đã chứng minh được có sự đóng góp mạnh mẽ về mặt di truyền. Các nghiên cứu về sự liên hệ giữa tỷ lệ tự kỷ với các anh chị em trong gia đình có trẻ tự kỷ cho thấy, trong các trẻ sinh đôi cùng trứng, khi có một đứa trẻ bị tự kỷ thì nguy cơ mắc chứng tự kỷ của đứa trẻ còn lại có thể lên tới 70-90%. Tỷ lệ này ở trẻ sinh đôi khác trứng 3
  12. chỉ khoảng 30% và 3-19% ở anh chị em nói chung. Hơn nữa, tỷ lệ là gấp đôi giữa các anh chị em cùng huyết thống so với các anh chị em cùng mẹ khác cha. Những kết quả này đã cung cấp bằng chứng cho thấy yếu tố di truyền đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của ASD. Từ đó, mở ra những nỗ lực lớn trong nghiên cứu để cố gắng làm sáng tỏ các yếu tố di truyền gây ra hội chứng này [68]. Các rối loạn di truyền đơn gen liên quan đến ASD Trong nhiều nghiên cứu, các rối loạn đơn gen đã được phát hiện xuất hiện đồng thời với ASD. Một số được báo cáo phổ biến nhất là bệnh xơ cứng củ và hội chứng Fragile X, ít gặp hơn là bệnh Phenylketon niệu và hội chứng Smith-Lemli-Opitz. Tỷ lệ ASD gặp trong các rối loạn này cũng tăng lên nhưng không tìm thấy ở tất cả các cá thể mang đột biến [25]. Nguyên nhân dẫn đến hội chứng Fragile X là sự mở rộng của bộ ba nucleotid CGG lặp lại trong vùng 5’ chưa được dịch mã của gen Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1) [28]. Biết rằng hai trong bốn loại nucleotid là Adenin và Cytosin có thể bị methyl hóa, do đó, sự mở rộng này dẫn đến sự siêu methyl hoá promoter của FMR1 và đi kèm với đó là sự ức chế phiên mã [61]. Trong khi 1-3% trẻ em được chẩn đoán tự kỷ có hội chứng Fragile X thì khoảng 18-33% số trẻ mắc hội chứng Fragile X có hành vi tự kỷ [34]. Phức hợp xơ cứng củ - Tuberous Sclerosis Complex (TSC) là một chứng rối loạn di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng bởi các khối u lành tính trong não và nhiều mô, cơ quan khác, chứng động kinh và suy giảm nhận thức. TSC là do đột biến gen TSC1 hoặc TSC2 mã hóa hamartin và tuberin tương ứng. Tỷ lệ hiện mắc ASD ở TSC được ước tính nằm trong khoảng từ 36% đến 50% [61]. Nghiên cứu gen trong toàn bộ hệ gen Các nhà khoa học đã phát hiện được nhiều gen liên quan đến hội chứng tự kỷ khi nghiên cứu gen trong toàn bộ hệ gen và phân tích toàn bộ vùng mã hoá. Chúng có chức năng và đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình như phiên mã và tái cấu trúc sợi nhiễm sắc, tổng hợp và phân huỷ protein, cấu tạo và nâng đỡ bộ khung xương tế bào và hình thành các synap thần kinh (Hình 1.3) [14, 25, 61, 68]. 4
  13. Hình 1.1: Các gen liên quan đến rối loạn phổ tự kỷ ở người (ASD) với các chức năng sinh học khác nhau [61]. Các nghiên cứu di truyền gần đây đã xác định gen Neurobeachin (NBEA) là gen đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của ASD. Gen này bị phá vỡ ở bệnh nhân mắc chứng tự kỷ vô căn [67]. Báo cáo ban đầu cho thấy đột biến chuyển đoạn nhiễm sắc thể với điểm đứt gãy trên gen NBEA là nguyên nhân dẫn đến tự kỷ vô căn ở trẻ nam [13, 62]. Kết quả một nghiên cứu năm 2009 còn cho biết đột biến mất đoạn gen này cũng liên quan đến hội chứng tự kỷ [48]. NBEA mã hóa protein neo A-kinase (AKAP) liên kết với tiểu đơn vị điều hòa của protein kinase A (PKA), được xác định là protein đặc hiệu của tế bào thần kinh, có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển não. Các nghiên cứu trên mô hình động vật chỉ ra vai trò của NBEA trong nhiều quá trình của tế bào như cấu tạo võng mạc, trao đổi và giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh qua màng tế bào, tham gia duy trì trí nhớ ngắn hạn [61, 62]. 1.1.3.2. Yếu tố nguy cơ từ môi trường Các yếu tố môi trường có thể đóng vai trò nhất định trong cơ chế bệnh sinh ASD. Một số đánh giá hệ thống và phân tích tổng hợp đã mô tả các yếu tố nguy cơ trước khi sinh và chu sinh, cũng như các yếu tố chế độ ăn uống và lối sống của bà mẹ. Trong nhiều nghiên cứu, các nhà khoa học đã chỉ ra tuổi cha và tuổi mẹ cao có liên quan độc lập tới nguy cơ mắc ASD. Điều này cũng làm tăng nguy cơ mắc ASD ở đời con [19]. Các yếu tố trước khi sinh bao gồm tình trạng trao đổi chất của mẹ, tăng huyết áp, tiểu đường thai kỳ, chảy máu khi mang thai hoặc tiền sử gia đình mắc bệnh tự miễn cũng 5
  14. có liên quan đến nguy cơ mắc ASD và chậm phát triển kết hợp. Hơn nữa, nguy cơ gia tăng cũng được tìm thấy đối với trẻ sinh ra đầu tiên so với trẻ sinh ra thứ ba trở lên [26]. Nhiễm trùng tử cung có liên quan đến sự gia tăng đáng kể nguy cơ mắc bệnh tự kỷ. Mối liên hệ giữa nhiễm trùng của mẹ trong thời kỳ mang thai và sinh con với nguy cơ tự kỷ cũng được củng cố bởi các kết quả trên mô hình động vật. Nhiễm virus thai kỳ kích hoạt phản ứng miễn dịch của mẹ, có thể gây ảnh hưởng tới sự phát triển não bộ của thai nhi [30]. Một số phân tích gộp được đề cập gần đây cho thấy quá trình phơi nhiễm với thuốc trong thời kỳ mang thai có thể làm tăng nguy cơ tự kỷ với trẻ được sinh ra [26]. Phơi nhiễm trước khi sinh với Valproat đã được xác nhận là một trong những yếu tố nguy cơ đối với ASD, đặc biệt là trong ba tháng đầu của thai kỳ [16]. Thai nhi tiếp xúc với Valproat có nguy cơ mắc ASD cao gấp 8 lần [40]. Đối với thuốc chống trầm cảm, bao gồm các chất ức chế tái hấp thu serotonin có chọn lọc, các nghiên cứu được kiểm soát tốt cho thấy không có rủi ro không rõ ràng [40], mặc dù có ý kiến cho rằng việc tiếp xúc với thuốc chống trầm cảm khi mang thai làm tăng nhẹ nguy cơ mắc ASD, đặc biệt là trong 3 tháng đầu. 1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ ASD có thể ảnh hướng tới sự phát triển sớm của não và tái tổ chức thần kinh. Hiện nay, vẫn chưa có dấu ấn đặc hiệu để chẩn đoán ASD do vậy việc xác nhận chẩn đoán ASD vẫn phải dựa trên đánh giá rối loạn hành vi được ghi trong cẩm nang thống kê và chẩn đoán rối loạn tâm thần của Hiệp hội Tâm thần Hoa Kỳ (DSM-5), được xuất bản năm 2013 [10]. Trẻ mắc hội chứng này thường biểu hiện sự suy giảm và bất thường ở 3 khía cạnh hành vi chính là tương tác xã hội, khả năng giao tiếp và hành vi có tính lặp lại. Trong đó, tiêu chuẩn chẩn đoán bao gồm việc xuất hiện của ít nhất 3 dấu hiệu của sự giảm giao tiếp xã hội hoặc hai dấu hiệu của việc lặp đi lặp lại các hành vi có phản ứng quá mức. Dấu hiệu của sự giảm tương tác xã hội và khả năng giao tiếp bao gồm sự suy giảm rõ rệt các hành vi phi ngôn ngữ như ánh mắt, biểu cảm khuôn mặt hay ngôn ngữ cơ thể. Các hành vi của trẻ có tính lặp đi lặp lại và dập khuôn. Trẻ không hứng thú với việc giao tiếp và hoạt động xã hội. Trẻ tự kỷ cũng có những thiếu hụt trong khả năng học tập và nhận thức, thiếu hụt ngôn ngữ, động kinh, bất thường vận động, lo lắng và các vấn đề về đường tiêu hóa [45, 61] đi kèm với rối loạn giấc ngủ và thay đổi nhịp sinh học [51]. Ngoài ra, DSM-5 nhận định rằng ASD có thể đi kèm với các rối loạn khác, bao gồm các rối loạn di truyền (ví dụ, hội chứng Fragile X) và các vấn đề về sức khoẻ tâm thần (ví dụ, rối loạn tăng động giảm chú ý - Attention deficit hyperactivity disorder - ADHD) [40]. 6
  15. 1.1.5. Các phương pháp điều trị rối loạn phổ tự kỷ Hiện nay, bệnh nhân được chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ có thể tiếp cận với hai phương thức điều trị là: dùng thuốc hoặc không dùng thuốc: Với hướng điều trị không dùng thuốc, các phương pháp can thiệp đã được phát triển và nghiên cứu để điều chỉnh hành vi cho trẻ nhỏ. Những can thiệp này có thể làm giảm các triệu chứng, cải thiện khả năng nhận thức, kỹ năng sống hàng ngày và tối đa hóa khả năng hoạt động và tham gia vào cộng đồng của trẻ. Liệu pháp quản lý hành vi được sử dụng để cố gắng củng cố các hành vi mong muốn và giảm các hành vi không mong muốn. Trị liệu hành vi thường dựa trên phân tích hành vi ứng dụng (ABA) đã được chấp nhận rộng rãi giữa các chuyên gia chăm sóc sức khỏe và được sử dụng trong nhiều trường học và phòng khám điều trị. Sự tiến bộ của trẻ được theo dõi và đo lường theo thời gian trị liệu thông qua các bảng kiểm tra hành vi và ngôn ngữ [71]. Với hướng điều trị bằng thuốc, hiện tại, chưa có loại thuốc nào có thể điều trị triệt căn cho rối loạn phổ tự kỷ. Nhưng vẫn có một số loại thuốc đã được chứng minh là có thể hỗ trợ điều trị một số triệu chứng liên quan đến ASD, đặc biệt là một số hành vi nhất định. Risperidon và Aripiprazol thuộc nhóm thuốc chống loạn thần đã được xác nhận là có thể cải thiện các triệu chứng khó chịu hoặc kích động ở trẻ em và thanh thiếu niên mắc ASD. Phần lớn trẻ em sử dụng hai loại thuốc này được cải thiện về việc cáu kỉnh và kích động, bao gồm gây hấn, tự gây thương tích và các hành vi gây rối khác. Nhưng cả hai loại thuốc này cũng có thể gây ra tác dụng không mong muốn, bao gồm an thần và tăng cân, làm tăng nguy cơ mắc các vấn đề sức khỏe sau này. Một vài loại thuốc như Methylphenidat, Atomoxetin và Guanfacin thường được sử dụng để điều trị rối loạn tăng động giảm chú ý (ADHD), cũng cho thấy lợi ích đối với các triệu chứng ADHD ở khoảng 25% trẻ mắc ASD. Tuy nhiên, với mỗi loại thuốc này, khả năng gây ra nhiều tác dụng không mong muốn ở những người mắc ASD lại cao hơn so với những người mắc ADHD nói chung [40]. Các chuyên gia cũng khuyến cáo việc sử dụng thuốc điều trị cho bệnh nhân ASD cần thận trọng, nên ưu tiên cho các phương pháp điều trị có nguy cơ thấp hơn, bao gồm các can thiệp về hành vi hoặc tâm lý xã hội [33]. 1.1.6. Một số mô hình nghiên cứu rối loạn phổ tự kỷ Trong thập kỷ qua, các mô hình động vật bao gồm các loài linh trưởng, loài gặm nhấm (điển hình là chuột) và ruồi giấm đã góp phần không nhỏ trong việc nghiên cứu để tìm hiểu đặc tính, chức năng của các gen liên quan đến ASD. Tìm hiểu các mô hình loài gặm nhấm cho nghiên cứu ASD, nhìn chung có 2 loại mô hình chính là mô hình di truyền và mô hình không di truyền [61]. Các mô hình di 7
  16. truyền ASD gây ra ở chuột có thể được thiết lập bằng cách nhắm mục tiêu vào các gen tương đồng của chuột với các gen có liên quan tới ASD ở người như FMR1, NBEA, Cụ thể, chuột đực bị loại bỏ gen FMR1 có biểu hiện thiếu tương tác xã hội, sự hiếu động và suy giảm nhận thức. Những điều này là tương đồng với các triệu chứng tự kỷ ở người. NBEA đơn bội có thể gây ra rối loạn chức năng nhận thức và kiểu hình giống ASD, bao gồm những thiếu hụt trong hành vi xã hội, phản ứng sợ hãi có điều kiện, học tập không gian và trí nhớ ở chuột [61]. Mặt khác, các mô hình tự kỷ không di truyền trên chuột cũng được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu. Các mô hình này được gây ra do phơi nhiễm trước khi sinh với các tác nhân hóa học như Axit Valproic (VPA), Thalidomid và Ethanol trong khi mang thai, nhiễm virus hoặc viêm [61]. Trong số các yếu tố này, phơi nhiễm VPA, một loại thuốc chống động kinh và ổn định tâm trạng dùng cho bệnh nhân khi mang thai có thể làm tăng đáng kể tỷ lệ ASD ở con sinh ra [17, 44]. Nghiên cứu lâm sàng đã xác định các yếu tố nguy cơ liên quan đến việc sử dụng VPA, bao gồm dị tật bẩm sinh, chậm phát triển, giảm chức năng nhận thức và tự kỷ. Hội chứng tự kỷ do VPA gây ra có thể do khiếm khuyết trong sự phát triển tế bào thần kinh của tiểu não, hệ limbic và thân não gây ra sự gián đoạn trong kết nối synap giữa các tế bào thần kinh [61]. Bên cạnh đó, trong những năm gần đây, trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên cứu sử dụng ruồi giấm làm sinh vật mô hình để mô phỏng chứng rối loạn tự kỷ ở người với mục tiêu xác định được tác động của các yếu tố về gen, môi trường đến các hành vi, biểu hiện, khả năng vận động, các thay đổi về nhịp sinh học của ruồi giấm. Một số gen có liên quan và đã được sử dụng để gây mô hình ruồi giấm tự kỷ trên thế giới như: gen Rugose, dFMR [61]. Việc tổng hợp nhiều dữ liệu nghiên cứu sử dụng mô hình ruồi giấm biến đổi gen cho hội chứng tự kỷ cũng góp phần xác định được vai trò của các nhóm gen liên quan, làm sáng tỏ cơ chế phân tử của ASD. 1.2. Tổng quan về ruồi giấm 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu, hình thành và phát triển Ruồi giấm có tên khoa học Drosophila melanogaster thuộc họ Drosophilidae, là sinh vật được sử dụng trong lĩnh vực di truyền học từ đầu những năm 1900. Nó phân bố ở tất cả các châu lục, bao gồm cả hầu hết các đảo. Hiện nay, ruồi giấm là sinh vật mô hình được sử dụng rộng rãi không chỉ trong di truyền học cổ điển và phân tử, mà còn với nhiều kỹ thuật sinh hóa, sinh học tế bào và sinh lý học mới, để nghiên cứu các vấn đề đòi hỏi cách tiếp cận đa ngành, chẳng hạn như sinh học phát triển và sinh học thần kinh [22, 54]. 8
  17. 1.2.2. Đặc điểm sinh học và phát triển của ruồi giấm 1.2.2.1. Đặc điểm bên ngoài của ruồi giấm Ruồi giấm có màu vàng nâu với các vòng đen ngang bụng. Con cái trưởng thành có kích thước dài khoảng 2.5 mm, con đực nhỏ hơn với phần bụng sẫm màu. Dễ dàng phân biệt được con đực và con cái nhờ sự khác nhau về màu sắc với mảng đen rõ rệt ở bụng [42]. Hình 1.2: Ruồi giấm đực và cái [18]. 1.2.2.2. Hệ gen của ruồi giấm Hệ gen của ruồi giấm chứa khoảng 139.5 triệu cặp base gồm khoảng 17000 gen phân bố trên 4 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 3 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể giới tính trong khi ở người có tới 23 cặp nhiễm sắc thể. Sự đơn giản này là một trong những lý do tại sao chúng là một trong những sinh vật đầu tiên được sử dụng trong phân tích, sàng lọc di truyền [7, 50]. 1.2.2.3. Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm Vòng đời của ruồi giấm trải qua 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng và ruồi trưởng thành. Một con ruồi cái có thể đẻ tới 2000 trứng trong suốt cuộc đời của nó. Trứng sau khi thụ tinh sẽ phát triển thành phôi trong vòng 18-24h. Phôi này, sau đó, lột xác 2 lần qua ba giai đoạn ấu trùng khác nhau trước khi hoá nhộng và trải qua quá trình biến thái, cuối cùng, trở thành ruồi giấm trưởng thành. Ở 25°C, sự phát triển để thành một con ruồi trưởng thành chỉ mất khoảng 10 ngày kể từ khi xảy ra hiện tượng thụ tinh. Tuổi thọ trung bình của ruồi giấm trưởng thành khi là khoảng 60-70 ngày [22, 29, 50]. 9
  18. Hình 1.3: Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm [22]. 1.2.3. Mô hình ruồi giấm đột biến gen Rugose mang hội chứng tự kỷ Năm 2015, tác giả Wise và cộng sự đã nghiên cứu và xác định được mối liên quan giữa đột biến gen Rugose (một gen tương đồng với gen NBEA ở người) với biểu hiện của rối loạn tự kỷ trên mô hình ruồi giấm [67]. Nghiên cứu khác cũng cho thấy các đột biến mất chức năng của gen Rugose thể hiện cấu trúc synap bất thường ở ấu trùng và khiếm khuyết trong các tương tác xã hội và suy giảm vận động ở ruồi trưởng thành [67]. Những phát hiện này chỉ ra rằng đột biến gen Rugose biểu hiện các đặc điểm kiểu hình tương tự như ASD ở con người. Do đó, sử dụng ruồi giấm đột biến gen Rugose có thể là một mô hình phù hợp để nghiên cứu ASD, đồng thời qua đó, chúng ta có thể hiểu biết rõ ràng hơn về vai trò của gen NBEA trong rối loạn phổ tự kỷ ở người. Với những ưu điểm của mình, ruồi giấm (Drosophila melanogaster) đã được đưa vào sử dụng trong lĩnh vực di truyền học rất sớm từ những năm đầu thế kỉ XX: - Các nhà khoa học đã giải trình tự toàn bộ hệ gen của ruồi giấm và phát hiện có khoảng 60% gen tương đồng với bộ gen của người, khoảng 75% các gen bệnh ở người đã biết có sự trùng khớp dễ nhận biết trong bộ gen của ruồi giấm [7, 9]. - So với các thử nghiệm trên động vật khác như chuột, khỉ, , sử dụng ruồi giấm trong nghiên cứu ít vấp phải các vấn đề liên quan đến đạo đức trong nghiên cứu y sinh học hơn. - Ruồi giấm phát triển nhanh (khoảng 10 ngày để thành ruồi trưởng thành), đẻ trứng nhiều (có thể tới 100 trứng/ngày) nên cho phép có thể tạo ra lượng lớn ruồi trong một thời gian ngắn, nghiên cứu nhiều thế hệ trong vòng vài tuần [7, 29]. - Ruồi giấm có kích thước nhỏ nên tiết kiệm chi phí nguyên vật liệu và không gian khi làm thí nghiệm. - Điều kiện sống đơn giản giúp dễ dàng tạo quần thể lớn ruồi, là tiềm năng trong sàng lọc dược chất và thuốc. 10
  19. - Dễ dàng và an toàn khi gây mê ruồi giấm. Hơn nữa, hình thái ruồi cũng rất dễ nhận biết khi được gây mê. - Trong khi con người có tới 23 cặp nhiễm sắc thể, D.melanogaster chỉ có 4. Sự đơn giản này là một trong những lý do khiến ruồi giấm thuộc những sinh vật đầu tiên được sử dụng trong phân tích, sàng lọc di truyền [29]. Sử dụng ruồi giấm làm đối tượng nghiên cứu, T.H. Morgan – cha đẻ của mô hình này đã phát hiện ra quy luật di truyền liên kết gen và liên kết giới tính, từ đó, đặt nền móng cho di truyền học hiện đại. Đến ngày nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng ruồi giấm để xây dựng mô hình nghiên cứu bệnh trên người. Trong đó, có các bệnh thoái hóa thần kinh, ví dụ các mô hình ruồi giấm chuyển gen mã hóa các protein gây bệnh Alzhermer như β- amyloid, Tau, [60]. Với nhiều ưu điểm đã được ghi nhận, kết hợp yếu tố dễ quan sát và định lượng, chúng tôi quyết định sử dụng mô hình ruồi giấm chuyển gen Rugose để nghiên cứu tác dụng sinh học và đánh giá khả năng kéo dài tuổi thọ của cao chiết cồn TTRC. Mặc dù, có nhiều lợi thế cho việc sử dụng D. melanogaster để nghiên cứu các bệnh ở người, nhưng vẫn tồn tại một số nhược điểm : - Thiếu phương pháp để đo lường xu hướng hành vi. - Tác dụng thuốc có khác biệt đáng kể khi so sánh với các nghiên cứu ở người. Tóm lại, việc sử dụng D. melanogaster làm sinh vật mẫu rất tốt vì nhiều lý do, nhưng chúng cũng có những nhược điểm chưa thể khắc phục. Thế nhưng, mô hình sử dụng ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ này vẫn rất quan trọng khi cung cấp được những bằng chứng khoa học làm tiền đề tiếp tục đánh giá tác dụng điều trị tự kỷ của các dược liệu Việt Nam trên mô hình động vật thực nghiệm trong thời gian tới. 1.3. Tổng quan về dược liệu nghiên cứu: Thạch tùng răng cưa 1.3.1. Tên gọi – vị trí phân loại - Thạch tùng răng cưa (cây Thông đất) có tên khoa học: Huperzia serrata (Thunb.) Trevis. - Tên tương tự: Lycopodium Serrata (Thunb.) Trevis. - Vị trí phân loại của loài Huperzia serrata trong hệ thống phân loại thực vật: Ngành: Thạch tùng (Lycopodiophyta); Lớp: Thạch tùng (Lycopodiopsida); Bộ: Thạch tùng (Lycopodiales); 11
  20. Họ: Thông đất (Lycopodiaceae) [69] hoặc Huperziaceae [21]; Chi: Huperzia; Loài: H. Serrata. 1.3.2. Đặc điểm thực vật, phân bố, giá trị sử dụng Cây thân đứng, mọc ở đất cao từ 10-40 cm, thân đơn hay lưỡng phân 1-2 lần hình trụ, đường kính khoảng 2mm. Lá hình bầu dục đầu nhọn, dài 15 mm, rộng 3 mm; phiến lá tương đối mỏng, nổi rõ gân giữa, mép lá có răng cưa. Túi bào tử ở nách lá, hình thận, màu vàng tươi [5]. Hình 1.4: Cây Thạch tùng răng cưa [3]. 1: Ảnh chụp tại thực địa; 2: Phần ngọn của cây; 3: Lá; 4: Túi bào tử mọc ở nách lá; 5,6: Túi bào tử đã mở; 7: Túi bào tử hình thận. Cây Thạch tùng răng cưa thường bì sinh ở những cành cây, hốc cây hoặc bề mặt đá, đất mùn ở dưới tán rừng quanh năm ẩm ướt, độ mùn cao, ở độ cao 1000m so với mặt nước biển. Loài thực vật này được biết nhiều ở Trung Quốc dưới tên gọi là Qian Ceng Ta, trong các bài thuốc chữa bệnh như: cầm máu, lợi tiểu Còn ở các nước phương Tây, đặc biệt là Hoa Kỳ, Thạch tùng răng cưa được sử dụng như thức ăn bổ trợ, bán rộng rãi trên thị trường. Loại cây này hiện nay còn được nghiên cứu nhiều với tác dụng tăng cường trí nhớ và điều trị bệnh Alzheimer . Ở Việt Nam, cây Thạch tùng răng cưa được tìm thấy nhiều ở Sapa (Lào Cai) và Đà Lạt (Lâm Đồng) [6]. Bộ phận dùng là phần thân cây trên mặt đất, có thể dùng tươi hoặc sấy khô để bảo quản lâu dài [69]. 12
  21. 1.3.3. Thành phần hoá học và tác dụng sinh học Một số thành phần hoá học có tác dụng dược lý trong Thạch tùng răng cưa gồm alkaloid Huperzin A, Triterpen, Flavoles, và những acid Phenoliques. Trên thế giới có rất nhiều nhóm nghiên cứu đã tách chiết được các thành phần hoạt tính này. Nhóm nghiên cứu tại Trung Quốc phân lập được 2 alkaloid là Huperzin A và Huperzin B. Các nghiên cứu tiếp theo phân lập được các alkaloid: Huperzin E và F, Huperzin G, Huperzin I, Huperzin J, Huperzin K và Huperzin L, Huperzin R, Huperzin P, Huperzin Q và N-oxyhuperzin Q, Huperzin S, T và U, Huperzin O, Huperzin W, Huperzin B [21]. Chang-Heng Tan và cộng sự đã phân lập được 9 alkaloid: Huperzin P, Fawcettimin và Phlegmariunin B. Huperzin Q. N-oxyhuperzin Q serratadin, 6f- hydroxycerratadin, 4f-hydroxyserratadin và 4f,6f-dihydroxycerratidin, Phlegmariurin B, 2f- hydroxyphlegmariurin B, 2-oxyphlegmariuni B và 11-oxophlegmariurin [58]. Nhóm nghiên cứu tại Nhật Bản đã phân lập được 17 alkaloid: Lycoposerramin- C, -D, -E, -P, -Q, -S, -U. Lycoposerramin-G, -H, -I, -J, -K, -M, -N, -O [57]. Kazuaki Katakawa và cộng sự phân lập được 8 alkaloid: Lycothunin, Serratin, Serratanidin, 11alpha-hydrofawcettidin, 2alpha,11alpha-dihydroxy-fawcettidin, 8alpha- 11alpha-dihydroxyfawcettidin, 2beta-hydroxylycothunin, 8alpha-hydroxylycothunin. Sau đó nhóm tiếp tục phân lập được 7 alkaloid khác từ cây gồm Lycoposerramin-R, -T, dẫn chất N-methyl và N-formyl của Lycoposerramin-T, -N-dimethyl-beta-obscurin, lycodin và fawcettimin [36]. Trong nhóm các alkaloid, thành phần hoá học có tác dụng lên hoạt động của hệ thần kinh, tác dụng hướng thần hoặc chống lại chứng mất trí nhớ là Huperzin A [6]. Huperzin A có tên khoa học là (1R,9S,13E)-1-amino-13-ethylidene-11-methyl-6- azatricyclo[7.3.1.02,7]trideca-2(7),3,10-trien-5-one. Huperzin A được tìm thấy trong phần chiết ra của loài Thạch tùng răng cưa là một alkaloid có khả năng ức chế mạnh enzym Acetylcholinesterase (AChE) nên sự có mặt của Huperzin A làm giảm lượng enzym AChE có trong não. Nhờ đó, hàm lượng Acetylcholin tăng lên làm cải thiện trí nhớ cho bệnh nhân. Một số báo cáo lâm sàng cũng nhận định Huperzin A tạo điều kiện dẫn truyền thần kinh cholinergic bằng cách tăng nồng độ Acetylcholin trong hệ thần kinh trung ương có tác dụng bảo vệ hệ thần kinh [6, 21]. Bên cạnh đó, một vài nghiên cứu cũng cho thấy Huperzin A có vai trò như một chất bảo vệ thần kinh. Nó hoạt động như một chất chống oxy hóa và tăng cường hoạt động của các enzym chống oxy hóa não khác, ngăn ngừa tác hại của các gốc tự do trong tế bào não và tăng tuổi thọ của tế bào não. Điều này có liên quan đến khả năng điều 13
  22. chỉnh biểu hiện của apoptotic protein, hỗ trợ ty thể tế bào não – trung tâm năng lượng chính mỗi tế, bảo vệ não khỏi độc tính của glutamat bằng cách hoạt động như một chất đối kháng thụ thể NMDA và điều chỉnh chuyển hoá protein tiền thân beta-amyloid (beta- amyloid ảnh hưởng đến mức ATP trong ty thể và làm rối loạn các chức năng có thể dẫn đến các bệnh như Alzheimer) [21]. Ngoài ra, khả năng chống viêm của Huperzin A cũng được đề cập trong nhiều nghiên cứu. Nó được báo cáo là có hoạt tính chống viêm như các chất ức chế AchE khác, đồng thời, cũng có khả năng ngăn chặn một số phản ứng viêm như tăng sinh tế bào T và sản xuất cytokin [21]. Tuy nhiên, trên thế giới, Huperzin A chưa có nhiều nghiên cứu trên mô hình ruồi giấm, mà chủ yếu được nghiên cứu trên chuột. Và kết quả cho thấy Huperzin A còn có các tác dụng khác như chống ung thư, chống co giật [21]. Điều đó có nghĩa khi thử nghiệm trên ruồi giấm cũng có thể cho kết quả tương tự. 14
  23. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Dược liệu nghiên cứu Cao chiết cồn 90% từ toàn cây TTRC (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis .) với hiệu suất chiết 5.18%. Nguồn gốc: TTRC do khoa Tài Nguyên - Viện Dược liệu thu hái, sau đó được khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu tách chiết tổng hợp và cung cấp. Mẫu nghiên cứu được lưu và bảo quản tại Phòng Tiêu bản - Khoa Tài Nguyên, Viện Dược Liệu. 2.2. Đối tượng nghiên cứu Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) trong các giai đoạn của chu kỳ phát triển do giáo sư Masamitsu Yamaguchi, Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto, Nhật Bản cung cấp với 2 chủng: Canton-S (FBst0064349): chủng ruồi giấm hoang dại được sử dụng làm nhóm chứng sinh lý. Rugose (FBst0009801-CG44835): chủng ruồi giấm chuyển gen rugose mang hội chứng tự kỷ. Ruồi giấm được nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản với điều kiện phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 25±1oC, chu kỳ sáng tối 12/12 (sáng từ 7 giờ đến 19 giờ). Các thí nghiệm hành vi được thực hiện trong thời gian từ 9 giờ đến 18 giờ. 2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 2.3.1. Hóa chất STT Tên hóa chất Nguồn gốc 1 Acid propionic Trung Quốc 2 Agar Trung Quốc 3 Ether Trung Quốc 4 Nấm men Pháp 5 Natri benzoat Trung Quốc 6 Nước cất Việt Nam 7 Nước RO Việt Nam 8 Sữa bột nguyên kem Việt Nam 9 Sucrose Việt Nam Một số hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phòng 10 thí nghiệm 15
  24. 2.3.2. Dụng cụ, thiết bị STT Dụng cụ, thiết bị Nguồn gốc 1 Buồng tam giác và kính Việt Nam 2 Bút lông để thu ấu trùng Nhật Bản, Trung Quốc 3 Chai, ống, bô-can thủy tinh để đựng thức Việt Nam ăn, nuôi ấu trùng 4 Chày cối Việt Nam 5 Cân phân tích Mettler Toledo, Mỹ 6 Đĩa petri 9cm và 15cm, nắp đục lỗ Corning, Mỹ 7 Đồng hồ bấm giờ Nhật Bản 8 Kính hiển vi huỳnh quang Olympus IX73 Olympus, Nhật Bản 9 Lò vi sóng Electrolux, Thụy Điển 10 Máy quay phim Canon, Nhật Bản 11 Micropipet Mettler Toledo, Mỹ 12 Miếng lót mềm Việt Nam 13 Ống Eppendorf Đức 14 Hệ thống theo dõi nhịp sinh học trên ruồi Trikinetic, Mỹ giấm 15 Một số dụng cụ, thiết bị khác 2.4. Thiết kế thí nghiệm 2.4.1. Căn cứ để chọn lựa mức liều 2mg/ml và 4mg/ml Chúng tôi đã tiến hành dò liều trên một dải nồng độ từ 1 mg/ml đến 10 mg/ml. Dựa vào khả năng sống sót và mô hình tương tác cộng đồng của ruồi trưởng thành với từng nồng độ trên dải, chúng tôi nhận thấy nồng độ 2 mg/ml và 4 mg/ml là phù hợp để đưa vào nghiên cứu chính thức. 2.4.2. Nhân dòng ruồi giấm tự kỷ và hoang dại phục vụ nghiên cứu Tiến hành lai với tỷ lệ đực cái 1:1 các cặp bố mẹ chủng Rugose để tạo dòng ruồi tự kỷ và chủng Canton-S để tạo dòng ruồi đối chứng sinh lý. Chủng ruồi lai tạo được chia thành các nhóm như sau: Nhóm sinh lý: Ruồi bố mẹ chủng Canton-S được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản. Nhóm mang hội chứng tự kỷ: Ruồi bố mẹ chủng Rugose được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản. 16
  25. Thức ăn cho ruồi được thay 3 ngày một lần, đảm bảo cung cấp nguồn dinh dưỡng đầy đủ cho ruồi đến khi làm thí nghiệm. Tất cả ruồi mang gen nghiên cứu đều được nuôi ở điều kiện nhiệt độ 25±1oC, chu kỳ sáng tối 12/12 (sáng từ 7 giờ đến 19 giờ). Các thí nghiệm hành vi được thực hiện trong thời gian từ 9 giờ đến 18 giờ. Các chủng ruồi sau khi lai tạo được kiểm tra ngẫu nhiên kiểu gen và đột biến gen tại Bộ môn Y Sinh học di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội để đảm bảo chủng ruồi dùng triển khai mô hình là chính xác. Thành phần thức ăn (cho 500 ml) Thành phần Hàm lượng Đường 25 g (5% w/v) Nấm men 25 g (5% w/v) Sữa bột 15 g (3% w/v) Agar 5 g (1% w/v) Acid Propionic 2.5 ml (0.5% v/v) Acid Benzoic 20% 2 gam Natri Benzoat trong hoặc Natri Benzoate 10 ml H2O (0.4% w/v) 20% Quy trình chuẩn bị thức ăn - Cân Natri Benzoate vào ống falcon, thêm nước, dùng máy vortex hoà tan đến khi dung dịch đồng nhất. - Cân sữa bột vào cốc thuỷ tinh, hoà thêm một ít nước nguội và đánh đều, tạo dạng kem. - Cân Agar vào trong bát sắt, bổ sung ~200 ml H2O, đun nóng đến khi dung dịch trong. - Bổ sung đường và nấm men vào trong bát sắt, thêm ~100 ml H2O, đun sủi lăn tăn trong 10 phút. - Đổ dung dịch ra cốc dung tích 1 lít, để nguội về 60 oC, phối hợp sữa vào, khuấy đều. Bổ sung thêm nước nóng đủ 500 ml, khuấy đều. - Bổ sung Acid Propionic và Natri Benzoate, tiếp tục khuấy đều. - Chia vào ống nuôi ~5 ml. Bảo quản ở 4oC đến khi sử dụng (dùng tối đa trong 1 tháng). 17
  26. 2.4.3. Thu ấu trùng và ruồi trưởng thành phục vụ nghiên cứu Thu ấu trùng Ruồi bố mẹ được chuyển sang ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu. Để ruồi đẻ trứng (2-3 ngày) trong ống thức ăn chứa mẫu, sau đó chuyển toàn bộ ruồi bố mẹ ra khỏi ống thức ăn sang ống mới. Tiến hành thu ấu trùng giai đoạn thích hợp cho thí nghiệm. Lưu ý: Với ruồi bố mẹ đã ăn thức ăn chứa mẫu nghiên cứu này thì không sử dụng cho các mẫu nghiên cứu khác. Ruồi bố mẹ đã ăn thức ăn chứa mẫu thì có thể sử dụng lặp lại trong 4-6 ngày (tức 1-2 lần chuyển). Thu ruồi trưởng thành Ruồi bố mẹ được chuyển sang ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu. Để ruồi đẻ trứng (2-3 ngày) trong ống thức ăn chứa mẫu, sau đó chuyển toàn bộ ruồi bố mẹ ra khỏi ống thức ăn sang ống mới để tiếp tục nhân dòng hoặc tiến hành loại bỏ. Ấu trùng nở và đóng kén trong 6-8 ngày, theo dõi ngày nở của kén, thu ruồi nở trong ngày xác định (sai khác 1 ngày). Ruồi nở được chuyển sang ống chứa thức ăn có mẫu nghiên cứu mới. Để ruồi ăn thức ăn chứa mẫu 3 ngày. Sau đó tiến hành thí nghiệm. Lưu ý: Với ruồi bố mẹ đã ăn thức ăn chứa mẫu nghiên cứu này thì không sử dụng cho các mẫu nghiên cứu khác. Ruồi bố mẹ đã ăn thức ăn chứa mẫu thì có thể sử dụng lặp lại trong 4-6 ngày (tức 1-2 lần chuyển). 2.4.4. Chia lô thí nghiệm Chia ruồi thu được ở trên làm 4 lô nghiên cứu: Lô 1: Nhóm chứng sinh lý: sử dụng chủng CantonS + nuôi trong ống thức ăn chuẩn. Lô 2: Nhóm chứng bệnh lý: sử dụng chủng Rugose + nuôi trong ống thức ăn chuẩn. Lô 3: Nhóm điều trị: sử dụng chủng ruồi Rugose + nuôi trong ống thức ăn chuẩn có bổ sung TTRC ở nồng độ 2 mg/ml. Lô 4: Nhóm điều trị: sử dụng chủng ruồi Rugose + nuôi trong ống thức ăn chuẩn có bổ sung TTRC ở nồng độ 4 mg/ml. 2.5. Phương pháp nghiên cứu 2.5.1. Đánh giá tác dụng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa trên mô hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ bằng thử nghiệm hành vi 2.5.1.1 Thử nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm Thí nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm được thực hiện với mục tiêu đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn TTRC đối với khả năng vận động 18
  27. của ấu trùng ruồi giấm Rugose. Thí nghiệm được tiến hành dựa trên nghiên cứu của tác giả Nichols và cộng sự năm 2012 [47]. Quy trình thí nghiệm Chuẩn bị đĩa petri đường kính 15 cm, làm sạch. Đổ thạch nóng Agar 1.2 % lên đĩa sao cho bề mặt láng đều, để mặt thạch khô trước khi tiến hành thí nghiệm. Thu ấu trùng bậc 3 (khoảng 4 ngày tuổi), ấu trùng đực, nằm trên bề mặt thức ăn, các ấu trùng đang bò ổn định, kích thước lớn đều nhau. Lưu ý: Không tiến hành thu ấu trùng yếu do mật độ ấu trùng quá đông, môi trường quá cứng không phù hợp cho phát triển và tránh tổn thương đến ấu trùng trong quá trình bắt. Sau khi thu ấu trùng, giữ trên khăn giấy ẩm. Chuẩn bị máy quay, đặt song song camera với bề mặt đĩa, tránh rung lắc trong suốt quá trình quay. Chuẩn bị thước đo, giấy tối màu, ít phản quang, đặt cạnh đĩa. Chuẩn bị miếng lót đen mềm, đặt bên dưới đĩa Agar (Hình 2.1). Chuyển ấu trùng lên đĩa Agar, 4-6 cá thể ấu trùng/lần quay, quay với khung hình 640*480, 15 frames/s. Bắt đầu quay khi ấu trùng bắt đầu di chuyển để hạn chế việc di chuyển ra rìa đĩa. Dừng quay sau khoảng 1 phút. Hình 2.1. Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm 2.5.1.2. Thử nghiệm đánh khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành Với mục tiêu đánh giá tác dụng của cao chiết cồn TTRC lên ruồi đột biến gen Rugose mang hội chứng tự kỷ, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng leo trèo của ruồi giấm trưởng thành. Thí nghiệm này được thực hiện dựa trên nghiên cứu của tác giả Nichols và cộng sự (2012), Liu Quan Feng (2015), Gargano (2005) [27, 39, 47]. Thời gian thích hợp để đánh giá hành vi leo trèo là vào buổi sáng (hoặc trễ nhất là 14 giờ). Vì vào buổi sáng và buổi trưa, khả năng leo trèo của ruồi là tốt nhất và ổn định nhất. Ngoài ra, cần tuân thủ nghiêm ngặt về không gian và thời gian, nghĩa là toàn 19
  28. bộ quá trình thí nghiệm chỉ diễn ra ở một địa điểm xác định vào khoảng thời gian nhất định (vì đây là thí nghiệm bò ngược chiều trọng lực, mà trọng lực tại các địa điểm và khoảng thời gian khác nhau là khác nhau dẫn đến sai số). Quy trình thí nghiệm Ruồi đực sau khi nở 3, 7 và 10 ngày được tiến hành đánh giá hành vi, chia thành 4 lô, mỗi lô 10 ống (đường kính 2 cm, dài 20 cm được chia vạch cách đáy ống: 2cm; 4cm; 6cm; 8cm; 10cm), mỗi ống chứa 8-12 con. Để thẳng đứng ống nghiệm trong 15- 20 phút cho ruồi tỉnh, ổn định, làm quen môi trường. Sau đó, xếp các ống vào khay, gõ khay chứa ống nghiệm xuống bàn thí nghiệm 3 lần, đảm bảo toàn bộ ruồi ở cùng một vị trí xuất phát. Tiếp theo, để cho ruồi tự do leo trong ống nghiệm trong 30 giây. Lặp lại quá trình này thêm 4 lần (tổng số 5 lần). Ghi lại toàn bộ quá trình bằng camera. Tiêu chí đánh giá: Chiều cao của ống tương ứng với điểm số như sau: 0 (< 2 cm), 1 (2.0 – 3.9 cm), 2 (4.0 – 5.9 cm), 3 (6.0 – 7.9 cm), 4 (8.0 – 8.9 cm) và 5 (≥ 9 cm). Tính số điểm của từng con ruồi sau 4 giây đầu tiên của mỗi lần lặp thí nghiệm. Số điểm trung bình của ống thí nghiệm được tính bằng công thức: ∑& ∑# (� ∗ � ) � = !$% "$% !" !" 5 Trong đó: S: số điểm trung bình của một ống thí nghiệm x: số con trong một ống thí nghiệm nik: số con ruồi trong một mức điểm sik: điểm số tương ứng của ruồi trong từng mức điểm 2.5.1.3. Thử nghiệm đánh giá hành vi tương tác cộng đồng của ruồi giấm trưởng thành Khả năng tương tác cộng đồng và tập trung là yếu tố quan trọng giúp đánh giá kết quả điều trị hội chứng tự kỷ của dược liệu. Do đó, chúng tôi đã tiến hành đánh giá khả năng cải thiện tính tập trung cộng đồng của ruồi giấm mang hội chứng tự kỷ sử dụng cao chiết cồn TTRC. Thí nghiệm này dựa trên mô hình đánh giá được tiến hành theo mô tả trước đây của tác giả Simon (2012) và Ueoka (2019) [56, 61]. Quy trình thí nghiệm Buồng đánh giá có dạng hình tam giác bằng nhựa (độ dài đường cao và cạnh đáy là 15.3 cm, dày 0.5 cm) được đậy chặt bởi 2 tấm kính (có kích thước 18cm x 18cm) cho phép ruồi hoạt động trong không gian hai chiều (Hình 2.2). 20
  29. Hình 2.2: Thiết kế thí nghiệm đánh giá hành vi cộng đồng của ruồi giấm. Ruồi mới nở được phân đực, cái riêng, sau đó, chuyển vào các ống chứa thức ăn chuẩn/mẫu nghiên cứu với số lượng ~ 40 con/ống và được nuôi trong 3-4 ngày. Tới ngày thí nghiệm, ruồi được gây mê để chuyển vào buồng tam giác, đóng lại bằng 2 phiến kính (thời gian thí nghiệm là sau 3-4 tiếng bắt đầu chu kì sáng). Dựng đứng buồng đếm chờ ruồi tỉnh. Đập nhẹ buồng thí nghiệm để đảm bảo toàn bộ ruồi ở cùng 1 thời điểm xuất phát là đáy buồng. Đợi 20 phút cho ruồi tự do vận động, giao tiếp với nhau. Sau đó, dùng máy ảnh chụp, lưu trữ lại hình ảnh và tiến hành phân tích kết quả. 2.5.1.4. Thử nghiệm đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm trưởng thành Chúng tôi tiến hành thí nghiệm này để đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm đột biến gen Rugose mang hội chứng tự kỷ được sử dụng cao chiết cồn TTRC. Thực hiện dựa trên mô tả theo nghiên cứu của Wise và cộng sự (2015) [67]. Quy trình thí nghiệm Thức ăn chuẩn/mẫu dược liệu được đun chảy ở nhiệt độ khoảng 65oC và đổ vào các bô-can thích hợp. Cho thức ăn vào các ống theo dõi (đường kính 5 mm, dài 8 cm) bằng cách để các ống dựng đứng trong các bô-can sao cho lượng thức ăn cao khoảng 0.5 cm. Đợi thức ăn đông lại ở điều kiện nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ 4oC, lấy ra, đậy hai đầu bằng nút cao su và bông. Lưu ý: Không để cho các ống bị đọng hơi ảnh hưởng tới ruồi trong quá trình chuyển ruồi vào ống. Tiến hành chia ruồi đực trưởng thành bắt trong ngày thành 4 lô, mỗi lô 8 con. Ruồi được chuyển vào ống tương ứng với từng lô bằng cách gây mê với ether, mỗi ống chứa một con ruồi đực trưởng thành. Cắm các ống vào hệ thống quan sát DAM2 21
  30. Drosophila Activity Monitor (5mm). Tiến hành buộc bằng dây chun hoặc dây cao su như hình vẽ để đảm bảo các ống không di chuyển (Hình 2.3). Theo dõi trong vòng 7 ngày, chu kì sáng/tối 12 giờ/12 giờ ở điều kiện 25oC. Hệ thống máy quan sát phát một chùm tia hồng ngoại cắt ngang và vuông góc chính giữa ống theo dõi, số lần ruồi di chuyển qua chùm tia này được ghi lại 30 phút/lần. Hình 2.3: Hệ thống quan sát DAM2 Drosophila Activity Monitor (Nguồn: Khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu) 2.5.2. Thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa đối với khả năng sống sót của ruồi giấm Rugose trưởng thành Quy trình thí nghiệm Thử nghiệm này được thực hiện nhằm mục đích đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa đối với khả năng sống sót của ruồi giấm Rugose trưởng thành. Thí nghiệm được thực hiện dựa trên mô tả theo nghiên cứu của tác giả Matthew DW Piper và Linda Partridge [52]. Ruồi trưởng thành được bắt trong ngày, phân đực cái riêng, sau đó, chuyển vào các ống thức ăn chuẩn/mẫu đã chuẩn bị (~30 con/ống, ~100 con/lô). Đưa các ống chứa ruồi vào trong máy theo dõi hoạt động của Trikinetics để đảm bảo ổn định các điều kiện nuôi. Tiến hành thay thức ăn 2-3 ngày/lần. Đếm số lượng ruồi chết sau mỗi lần thay, qua đó, tính toán được số ruồi còn sống sót. 22
  31. Hình 2.4: Mô hình đánh giá mức độ cải thiện khả năng sống sót 2.6. Phân tích kết quả Chúng tôi sử dụng phần mềm phân tích hình ảnh ImageJ phiên bản 1.53 để xử lý kết quả thí nghiệm đánh giá hành vi cộng đồng của ruồi giấm và thí nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm. Sau đó, phân tích thống kê bằng phần mềm SPSSv25, hai thí nghiệm trên lần lượt tương ứng sử dụng test Kruskal-Wallis 1-Way ANOVA và test One-Way ANOVA. Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng leo trèo và đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm trưởng thành được tổng hợp bằng Microsoft Excel, phân tích bằng SPSSv25, sử dụng test One-Way ANOVA. Khả năng sống sót của ruồi giấm được phân tích SPSSv25, sử dụng test Kruskal-Wallis 1-Way ANOVA. Các kết quả có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. 23
  32. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với ruồi giấm Rugose đột biến gen mang hội chứng tự kỷ bằng thử nghiệm hành vi 3.1.1. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ Rối loạn phổ tự kỷ (ASD) được biểu hiện đặc trưng bằng sự suy giảm trong tương tác xã hội, phát triển ngôn ngữ và lời nói và sự xuất hiện của các hành vi lặp đi lặp lại với các sở thích bị hạn chế. Bên cạnh đó, suy giảm khả năng vận động ở những người mắc ASD đã được phân loại là "các triệu chứng liên quan" [43]. Như vậy, sự cải thiện khả năng vận động được công nhận là một tiêu chí giúp đánh giá tác dụng của thuốc tới rối loạn phổ tự kỷ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đo quãng đường di chuyển của ấu trùng ruồi giấm trong 60 giây, qua đó, tính được tốc độ trung bình của ấu trùng ruồi giấm. Với các dữ liệu thu được, chúng tôi đã so sánh tốc độ di chuyển của ấu trùng giữa 4 lô thí nghiệm. Kết quả được thể hiện trong Hình 3.1. (A) 24
  33. (B) Hình 3.1: Ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm tự kỷ. Ghi chú: (A): Hình ảnh đường đi của ấu trùng ruồi giấm trong 1 phút sau phi phân tích qua phần mềm ImageJ; (B): Kết quả phân tích tốc độ di chuyển của ấu trùng ruồi giấm giữa các lô. Canton-S (lô chứng sinh lý): lô ruồi giấm chủng hoang dại; Rugose (lô chứng bệnh lý): lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ; TTRC2, TTRC4: các lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ được điều trị cao chiết cồn TTRC ở các nồng độ tương ứng 2 mg/ml và 4 mg/ml; * p < 0,05 khi so sánh với lô chứng bệnh lý. Kết quả ở Hình 3.1 cho thấy ấu trùng ruồi giấm chủng hoang dại (Canton-S) có tốc độ di chuyển nhanh hơn lô chứng bệnh lý (Rugose) khoảng 25%, đạt ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Kết quả này cũng tương đồng với kết quả trong nghiên cứu của tác giả Nichols và cộng sự (2012). Như vậy, triển khai mô hình đánh giá khả năng vận động trên ấu trùng ruồi giấm tự kỷ là thành công và phù hợp để đánh giá tác dụng của cao chiết cồn TTRC. Ngoài theo dõi tốc độ di chuyển của ấu trùng ruồi giấm, nhóm nghiên cứu của Nichols còn phát hiện thấy ấu trùng ruồi giấm Rugose thường xuyên trong tư thế di chuyển cuộn tròn, trong khi đó, lô chứng sinh lý (Canton-S) lại có xu hướng di chuyển theo đường thẳng hơn [47]. 25
  34. Ấu trùng ruồi giấm đột biến gen Rugose sau khi sử dụng cao chiết cồn TTRC với liều 4 mg/ml (TTRC4) có tốc độ di chuyển cao hơn gần 20% so với lô chứng bệnh lý, sự khác biệt này đạt ý nghĩa thống kê với p 0,05. Như vậy, cao chiết cồn TTRC có tác dụng cải thiện suy giảm vận động của ấu trùng ruồi giấm mang đột biến gen tự kỷ. Liên hệ với một số nghiên cứu trước đây dựa trên phân tích cấu trúc thần kinh cơ (Neuromuscular junction-NMJ) tại nhóm cơ số 4 của ấu trùng ruồi giấm bậc 3 bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang, chúng tôi nhận thấy có mối liên quan [4]. Trong các nghiên cứu này, khi ruồi giấm chủng Rugose được điều trị bằng các cao chiết, đã có sự thay đổi trong cấu trúc thần kinh cơ, cụ thể là số lượng, diện tích các nút thần kinh, chiều dài sợi thần kinh. Nhờ đó, có sự thay đổi trong khả năng vận động. Do đó, đây cũng có thể là đích tác dụng của cao chiết cồn TTRC trên ấu trùng ruồi giấm bậc 3. 3.1.2. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa ảnh đối với khả năng trèo của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ Hành vi leo trèo là một tiêu chí đánh giá tác dụng tăng khả năng vận động trên ruồi giấm trưởng thành. Thí nghiệm được tiến hành khi ruồi đạt 3, 7 và 10 ngày tuổi. Thực hiện bằng cách cho ruồi đực trưởng thành leo tự do trong ống có chia vạch trong vòng 30 giây. Lặp lại quá trình 4 lần (tổng là 5 lần). Đếm số con mỗi vạch, qua đó, tính điểm số trung bình mỗi ống qua cả 5 lần và tiến hành so sánh giữa 4 lô. Kết quả được thể hiện trong Hình 3.2. Hình 3.2: Kết quả đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành bằng thử nghiệm leo trèo ở các thời điểm 3, 7, 10 ngày tuổi. 26
  35. Ghi chú: Canton-S (lô chứng sinh lý): lô ruồi giấm chủng hoang dại; Rugose (lô chứng bệnh lý): lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ; TTRC2, TTRC4: các lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ được điều trị cao chiết cồn TTRC ở các nồng độ tương ứng 2 mg/ml và 4 mg/ml; * p 0,05). Rugose là chủng rồi giấm đột biến có chứa trình tự tương đồng gen Neurobeachin(NBEA) ở người, đóng vai trò quan trọng trong đóng gói tạo bóng xuất bào liên quan tới dẫn truyền thần kinh/truyền dẫn trong tế bào ở synap thần kinh. Nghiên cứu trên chuột nhắt cho thấy, khi mất chức năng protein NBEA, con đường dẫn truyền thần kinh ở thần kinh cơ bị khoá hoàn toàn trong khi sợi thần kinh, cấu trúc thần kinh và yếu tố dẫn truyền thần vẫn bình thường [67]. Điều này cũng dẫn tới những hành vi khác thường trên ấu trùng ruồi giấm. Kết quả thu được trong nghiên cứu cũng góp phần cho thấy trên ruồi giấm trưởng thành cũng có ảnh hưởng bởi đột biến ở ruồi giấm Rugose. Mô hình đánh giá khả năng leo trèo của ruồi giấm là một trong những mô hình quan trọng giúp đánh giá sự thay đổi hành vi liên quan tới từng giai đoạn tuổi. Cao chiết TTRC cho thấy mức liều 2 mg/ml hoặc 4 mg/ml đều thể hiện khả năng cải thiện hành vi leo trèo ruồi giấm đột biết Rugose, tuy nhiên, sự cải thiện lại phụ thuộc vào từng giai đoạn của ruồi giấm. Điều này cho thấy hiệu quả tác dụng trên thử nghiệm hành vi phụ thuộc vào liều dùng và liên quan tới thời điểm, thời gian sử dụng của cao trên đối tượng ruồi giấm trưởng thành, thời gian hiệu quả tác dụng. Có nhiều đột biến cấu trúc gen được tạo ra trên ruồi giấm Drosophila được nghiên cứu để giúp kéo dài tuổi thọ của ruồi giấm cũng như làm chậm quá trình suy giảm chức năng do lão hoá. Ví dụ, một đột biến làm tăng cường biểu hiện của enzyme peptide methionine sulfoxide reductase A giúp kéo dài tuổi thọ làm chậm quá trình lão hoá các vận động thể chất và sinh sản trên ruồi giấm [53]. Ở một nghiên cứu khác trên đột biến gen Methuselah [38] giúp kéo dài tuổi thọ ruồi giấm trong khi lại không cho thấy thay đổi quá trình lão hoá trong vận động và 27
  36. cảm nhận khứu giác [20]. Vì vậy cần có những nghiên cứu sâu hơn để làm sáng tỏ hơn tác dụng của mẫu cao chiết TTRC trên cải thiện triệu chứng liên quan tới rối loạn phổ tự kỷ. 3.1.3. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa tới khả năng cải thiện mức độ tương tác cộng đồng của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ Suy giảm khả năng hoạt động cộng đồng là yếu tố đặc trưng nhận biết hội chứng tự kỷ. Do đó, chúng tôi sử dụng mô hình tương tác cộng đồng trên ruồi giấm tự kỷ để đánh giá tác dụng điều trị của cao chiết cồn TTRC. Xem xét các nghiên cứu về tỷ lệ mắc ASD trước đây, nhận thấy tỷ lệ mắc bệnh tự kỷ ở trẻ em nam cao hơn so với nữ [48]. Bởi vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm này trên cả ruồi đực và ruồi cái. Tiến hành thí nghiệm, ruồi được phân đực cái riêng và chuyển vào các buồng tam giác để cho ruồi tự do vận động trong 30 phút. Sau đó, chụp lại và xác định khoảng cách của mỗi con đến con gần nó nhất. Kết quả được thể hiện trong Hình 3.3. (A) 28
  37. (B) Hình 3.3: Khả năng tương tác cộng đồng của ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ. Ghi chú: (A): Hình ảnh phân bố trong không gian của quần thể ruồi giấm giữa các lô; (B): Kết quả phân tích khoảng cách tương tác không gian của ruồi giấm giữa các lô. Canton-S (lô chứng sinh lý): lô ruồi giấm chủng hoang dại; Rugose (lô chứng bệnh lý): lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ; TTRC 2 mg/ml, TTRC 4 mg/ml: các lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ được sử diều trị cao chiết cồn TTRC ở các nồng độ tương ứng 2 mg/ml và 4 mg/ml; p < 0,01, p < 0,001 khi so sánh với lô chứng bệnh lý. Kết quả ở Hình 3.3 cho thấy ruồi giấm chủng Rugose (chứng bệnh lý) đã gây nên một loạt những thay đổi trong tương tác cộng đồng so với ruồi giấm chủng hoang dại (chứng sinh lý). Các cá thể ở nhóm này đứng riêng lẻ và rải rác trong không gian, không có xu hướng giao tiếp hay ít di chuyển thành từng đám. Bằng chứng là khoảng cách tới con gần nhất trong quần thể ruồi giấm chủng Rugose tăng lên một cách rõ rệt (p < 0,001) và sự phân bố của chúng là ngẫu nhiên, ruồi giấm biểu hiện hành vi như thể không có con ruồi nào khác trong buồng thí nghiệm. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của tác giả Simon và cộng sự (2012). Như vậy, triển khai mô hình đánh giá tương tác cộng đồng trên ruồi giấm trưởng thành phù hợp để đánh giá tác dụng của cao chiết cồn TTRC. 29
  38. Các lô ruồi giấm được điều trị bằng cao chiết cồn TTRC đều cho thấy có tác dụng cải thiện khả năng tương tác công đồng so với lô chứng bệnh lý. Trong đó, nhóm ruồi đột biến gen Rugose sử dụng cao chiết cồn TTRC ở nồng độ 2 mg/ml cho thấy sự cải thiện rõ rệt có ý nghĩa thống kê (p 0,05). 3.1.4. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa ảnh tới sự thay đổi nhịp sinh học của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ Rối loạn giấc ngủ và thay đổi nhịp sinh học thường được báo cáo ở các trẻ mắc ASD [45]. Do đó, chúng tôi tiến hành theo dõi hoạt động thức ngủ của ruồi giấm trưởng thành để đánh giá tác dụng của cao chiết cồn TTRC đối với triệu chứng của bệnh tự kỷ. Tuy nhiên, thử nghiệm này được tiến hành trên ruồi đực thay vì ruồi cái bởi các hoạt động đẻ trứng được báo cáo có ảnh hưởng đến việc đo lường hoạt động vận động thực sự của chúng [15]. Ruồi đực trưởng thành được chia thành 4 lô, sau đó, được theo dõi nhịp sinh học trong 6 ngày bằng máy theo dõi hoạt động thức ngủ Trikinetics có gắn cảm biến kết nối với máy tính, thu được số lần ruồi di chuyển qua đèn laze cảm biến mỗi 30 phút. Kết quả được thể hiện trong Hình 3.4 và Hình 3.5. Hình 3.4: Ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với khả năng hoạt động của ruồi giấm Rugose, N=8/lô thí nghiệm. Ghi chú: Canton-S (lô chứng sinh lý): lô ruồi giấm chủng hoang dại; Rugose (lô chứng bệnh lý): lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ; TTRC2, TTRC4: các lô ruồi giấm đột biến 30
  39. gen mang hội chứng tự kỷ được điều trị cao chiết cồn TTRC ở các nồng độ tương ứng 2 mg/ml và 4 mg/ml; * p 0,05). Với lô ruồi giấm sử dụng TTRC ở nồng độ 4 mg/ml, trung bình tổng số lần hoạt động thấp hơn lô chứng bệnh lý, đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Hình 3.5: Kết quả phân tích mức độ vận động tại thời điểm buổi sáng của ruồi giấm trong 6 ngày, N=8/lô thí nghiệm. Ghi chú: Canton-S (lô chứng sinh lý): lô ruồi giấm chủng hoang dại; Rugose (lô chứng bệnh lý): lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ; TTRC2, TTRC4: các lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ được điều trị cao chiết cồn TTRC ở các nồng độ tương ứng 2 mg/ml và 4 mg/ml. Ngoài ra, kết quả phân tích mức độ vận động tại thời điểm buổi sáng (từ 8h đến 10h) của ruồi giấm trong 6 ngày ở Hình 3.5 cho thấy lô chứng sinh lý (Canton-S) và lô TTRC2 luôn cao hơn lô chứng bệnh lý (Rugose) trong tất cả các ngày, tuy nhiên không 31
  40. đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Lô ruồi giấm đột biến gen Rugose sử dụng cao chiết cồn TTRC nồng độ 4 mg/ml làm tăng mức độ vận động tại thời điểm buổi sáng so với lô bệnh lý vào ngày 1 và 2, sau đó giảm và không vượt quá lô bệnh lý. Sự khác biệt này cũng không đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Như vậy, từ những kết quả ở Hình 3.4 và Hình 3.5 có thể thấy đột biến gen Rugose đã gây ra sự thay đổi trong cường độ hoạt động của ruồi giấm. Ruồi tự kỷ có xu hướng giảm hoạt động trong ngày, đồng thời tần suất hoạt động buổi sáng giảm nhiều so với ruồi giấm ở lô chứng sinh lý Canton-S. Xét trên trẻ tự kỷ cũng cho thấy kết quả tương đồng khi mà tổng thời gian ngủ của trẻ tự kỷ nhiều hơn so với trẻ bình thường trong các nghiên cứu trước đó [51]. Với ruồi giấm đột biến gen Rugose được sử dụng cao chiết cồn TTRC nồng độ 2 mg/ml, nhịp sinh học ruồi giấm được cải thiện hơn so với lô bệnh lý, đặc biệt là vào thời gian buổi sáng. Tuy nhiên, sự khác biệt này chưa đạt ý nghĩa thống kê có thể do số liệu mới chỉ được nghiên cứu trên cỡ mẫu nhỏ (n=8/lô thí nghiệm), cần thiết phải tăng cỡ mẫu nghiên cứu để có thể khẳng định chính xác kết quả này. Mặc dù vậy, các kết quả thu được trong nghiên cứu này cho thấy tiềm năng trong việc sử dụng cao chiết cồn TTRC để cải thiện triệu chứng của rối loạn tự kỷ ở trẻ em. 3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa tới khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ Hiện nay, tỷ lệ mắc rối loạn phổ tự kỷ ngày càng tăng ở nhiều quốc gia và người mắc hội chứng này có tuổi thọ giảm so với tuổi thọ dân số chung [12]. Do đó, trên thế giới, các nhà khoa học đang nỗ lực nghiên cứu để tìm ra các phương pháp cải thiện tình trạng này. Trong nghiên cứu này, mô hình ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ được chúng tôi lựa chọn thử nghiệm để đánh giá tác dụng kéo dài khả năng sống sót của cao chiết cồn TTRC. Thử nghiệm được thực hiện trên cả ruồi đực và cái. Kết quả được thử hiện trong Hình 3.6. 32
  41. Hình 3.6: Đồ thị phân tích khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ Ghi chú: Canton-S (lô chứng sinh lý): lô ruồi giấm chủng hoang dại; Rugose (lô chứng bệnh lý): lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ; TTRC2, TTRC4: các lô ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ được sử dụng cao chiết cồn TTRC ở các nồng độ tương ứng 2 mg/ml và 4 mg/ml; p 0,05. Như vậy, có thể thấy, ảnh hưởng của hội chứng tự kỷ trên mô hình ruồi giấm đột biến gen này có xu hướng tương đồng với ảnh hưởng trên người. Tuổi thọ ở ruồi giấm mang hội chứng tự kỷ là có giảm so với ruồi giấm khoẻ mạnh chủng Canton-S. Bên cạnh đó, lô ruồi giấm TTRC2 được điều trị với cao chiết cồn TTRC ở nồng độ 2 mg/ml cũng cho thấy tỷ lệ sống sót luôn cao hơn tỷ lệ sống sót của ruồi giấm ở nhóm bệnh lý kể từ ngày 2. Đồng thời, tỷ lệ này luôn duy trì ổn định trong suốt 22 ngày quan sát. Sự khác biệt này đạt ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Mặt khác, ruồi giấm ở lô TTRC4 lại cho thấy tỷ lệ sống sót cao hơn ruồi giấm chủng Rugose liên tiếp từ ngày 2 33
  42. cho đến ngày cuối thu kết quả. Tuy nhiên, có sự suy giảm tỷ lệ ở ngày 6 và ngày 16, cho đến ngày 22 thì suy giảm rõ rệt. Sự khác biệt này đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,001). Nhìn chung, với 22 ngày quan sát, chúng tôi nhận thấy có xu hướng cải thiện khả năng sống sót ở nhóm ruồi giấm đột biến gen được sử dụng dược liệu Thạch tùng răng cửa với nồng độ 2 mg/ml. Trong khi đó, nồng độ 4 mg/ml thể hiện xu hướng có độc tính. Đây là tiền đề quan trọng để chúng tôi tiếp tục theo dõi, đánh giá cũng như nghiên cứu thêm về tác dụng của TTRC trên khía cạnh cải thiện khả năng kéo dài tuổi thọ cho những người mắc rối loạn phổ tự kỷ. 34
  43. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 1. Kết luận Từ những kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi kết luận như sau: - Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) có tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ trên mô hình ruồi giấm đột biến gen Rugose, được đánh giá thông qua các mô hình hành vi vận động, tương tác cộng đồng và nhịp sinh học. Khả năng cải thiện của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa phụ thuộc vào nồng độ. + Ruồi giấm đột biến gen được sử dụng cao chiết cồn TTRC nồng độ 4 mg/ml có tác dụng cải thiện khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm so với lô chứng bệnh lý với p < 0,05. + Khả năng trèo của ruồi giấm trưởng thành được điều trị với cao chiết cồn TTRC nồng độ 2 mg/ml cải thiện hơn dựa vào chỉ số vận động so với lô chứng bệnh lý với p < 0,05. + Khả năng tương tác cộng đồng của ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ được sử dụng cao chiết cồn TTRC nồng độ 2 mg/ml được cải thiện so với lô chứng bệnh lý với p < 0,01. + Có xu hướng tăng tần suất hoạt động tại thời điểm buổi sáng của lô ruồi giấm sử dụng cao chiết cồn TTRC nồng độ 2 mg/ml hơn so với lô bệnh lý. - Thạch tùng răng cưa với mức liều 2 mg/ml sau 22 ngày điều trị có tác dụng cải thiện khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen Rugose mang hội chứng tự kỷ. 2. Đề xuất - Thực hiện đánh giá thêm các thông số liên quan đến cấu trúc thần kinh cơ của ấu trùng ruồi giấm tự kỷ (chiều dài nhánh, số lượng nhánh, ). - Tiến hành nghiên cứu và sử dụng cao chiết cồn phân đoạn với thành phần hóa học cụ thể trong Thạch tùng răng cưa để nâng cao hiệu quả cải thiện hội chứng tự kỷ với mức liều thấp hơn. - Triển khai đánh giá tác dụng điều trị hội chứng tự kỷ của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa trên mô hình chuột thực nghiệm. - Đánh giá độ an toàn của Thạch tùng răng cưa trên động vật thực nghiệm. 35
  44. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Bộ Lao động - Thương binh và Xã hội (2018), Tọa đàm "Vấn đề trẻ em tự kỷ ở Việt Nam". 2. Trần Thị Minh Huế (2014), Giáo dục hòa nhập trẻ tự kỷ. 3. Nguyễn Thanh Tùng Nguyễn Quang Hiệu, Vũ Thu Thuỷ, Nguyễn Viết Thân (2017), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật của hai loài huperzia, họ thông đất (Lycopodiaceae)”. 4. Phạm Thị Bích Phượng (2020), Nghiên cứu tác dụng sinh học và bước đầu tìm hiểu cơ chế hóa sinh của Ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilisstylus w.w. smith). 5. Đỗ Huy Bích và Đặng Quang Trung và cộng sự (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, vol 1. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 6. Phạm Thị Hạnh Vũ Thị Ngọc, Lê Thị Lan Anh, Nguyễn Tiến Đạt, Lê Thị Bích Thủy (2016), “Định tính và định lượng Huperzine A trong cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) ở Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 14(3), 473-478. Tài liệu Tiếng Anh 7. Rajawat et al (2021), “Cinderella of genetics (Drosophila melanogaster): Population genetics to genomics”. 8. B. Tick, et al. (2016), “Heritability of autism spectrum disorders: a meta-analysis of twin studies”, J Child Psychol Psychiatry, 57(5), 585-595. 9. M. D. Adams, et al. (2000), “The genome sequence of Drosophila melanogaster”, Science, 287(5461), 2185-2195. 10. American Psychiatric Association (2013), Diagnostic and statistical manual of mental disorders (DSM-5®). American Psychiatric. 11. D. Q. Beversdorf and Consortium Missouri Autism Summit (2016), “Phenotyping, Etiological Factors, and Biomarkers: Toward Precision Medicine in Autism Spectrum Disorders”, J Dev Behav Pediatr, 37(8), 659-673. 12. L. Bishop-Fitzpatrick and A. J. H. Kind (2017), “A Scoping Review of Health Disparities in Autism Spectrum Disorder”, J Autism Dev Disord, 47(11), 3380-3391. 13. D. Castermans, et al. (2003), “The neurobeachin gene is disrupted by a translocation in a patient with idiopathic autism”, J Med Genet, 40(5), 352-356. 14. P. Chaste, & Leboyer, M. (2012), “Autism risk factors: genes, environment, and gene-environment interactions”, Dialogues in Clinical Neuroscience, 14(3), 281- 292.
  45. 15. J. C. Chiu, et al. (2010), “Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila”, J Vis Exp, (43). 16. J. Christensen, et al. (2013), “Prenatal valproate exposure and risk of autism spectrum disorders and childhood autism”, JAMA, 309(16), 1696-1703. 17. A. L. Christianson, N. Chesler, and J. G. Kromberg (1994), “Fetal valproate syndrome: clinical and neuro-developmental features in two sibling pairs”, Dev Med Child Neurol, 36(4), 361-369. 18. S. Chyb, & Gompel, N. (2013). D. melanogaster subgroup species. Atlas of Drosophila Morphology, 209–220. 19. M. S. Durkin, et al. (2008), “Advanced parental age and the risk of autism spectrum disorder”, Am J Epidemiol, 168(11), 1268-1276. 20. Michael S Grotewiel Eric Cook-Wiens (2002), “Dissociation between functional senescence and oxidative stress resistance in Drosophila”, Experimental Gerontology, 37(12), 1347-1357. 21. Ana Ferreira, et al. (2014), “Huperzine A from Huperzia serrata: a review of its sources, chemistry, pharmacology and toxicology”, Phytochemistry Reviews, 15(1), 51-85. 22. T. Flatt (2020), “Life-History Evolution and the Genetics of Fitness Components in Drosophila melanogaster”, Genetics, 214(1), 3-48. 23. E. Fombonne (2009), “Epidemiology of pervasive developmental disorders”, Pediatr Res, 65(6), 591-598. 24. E. Fombonne (2018), “Editorial: The rising prevalence of autism”, J Child Psychol Psychiatry, 59(7), 717-720. 25. C. M. Freitag, et al. (2010), “Genetics of autistic disorders: review and clinical implications”, Eur Child Adolesc Psychiatry, 19(3), 169-178. 26. H. Gardener, D. Spiegelman, and S. L. Buka (2009), “Prenatal risk factors for autism: comprehensive meta-analysis”, Br J Psychiatry, 195(1), 7-14. 27. J. W. Gargano, et al. (2005), “Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila”, Exp Gerontol, 40(5), 386-395. 28. J. Gerhardt, et al. (2014), “The DNA replication program is altered at the FMR1 locus in fragile X embryonic stem cells”, Mol Cell, 53(1), 19-31. 29. Jame H.Sang, Drosophila melanogaster: The fruit fly, in Bách khoa toàn thư về Di truyền học, E.C.R. Reeve, Editor. 2009, Fitzroy Dearborn. 30. I. Hadjkacem, et al. (2016), “Prenatal, perinatal and postnatal factors associated with autism spectrum disorder”, J Pediatr (Rio J), 92(6), 595-601.
  46. 31. V. M. Hoang, et al. (2019), “Prevalence of autism spectrum disorders and their relation to selected socio-demographic factors among children aged 18-30 months in northern Vietnam, 2017”, Int J Ment Health Syst, 13, 29. 32. J. Hofer, et al. (2019), “Complementary and alternative medicine use in adults with autism spectrum disorder in Germany: results from a multi-center survey”, BMC Psychiatry, 19(1), 53. 33. O. D. Howes, et al. (2018), “Autism spectrum disorder: Consensus guidelines on assessment, treatment and research from the British Association for Psychopharmacology”, J Psychopharmacol, 32(1), 3-29. 34. H. Y. Ivanov, et al. (2015), “Autism Spectrum Disorder - A Complex Genetic Disorder”, Folia Med (Plovdiv), 57(1), 19-28. 35. L. (1943) Kanner “Autistic disturbances of affective contact”, Nervous child, (2(3)), 217-250. 36. K. Katakawa, et al. (2007), “Fawcettimine-related alkaloids from Lycopodium serratum”, J Nat Prod, 70(6), 1024-1028. 37. M. C. Lai, et al. (2015), “Sex/gender differences and autism: setting the scene for future research”, J Am Acad Child Adolesc Psychiatry, 54(1), 11-24. 38. Y. J. Lin, L. Seroude, and S. Benzer (1998), “Extended life-span and stress resistance in the Drosophila mutant methuselah”, Science, 282(5390), 943-946. 39. Q. F. Liu, et al. (2015), “In Vivo Screening of Traditional Medicinal Plants for Neuroprotective Activity against Abeta42 Cytotoxicity by Using Drosophila Models of Alzheimer's Disease”, Biol Pharm Bull, 38(12), 1891-1901. 40. Catherine Lord, et al. (2018), “Autism spectrum disorder”, The Lancet, 392(10146), 508-520. 41. S. E. Manning, et al. (2011), “Early diagnoses of autism spectrum disorders in Massachusetts birth cohorts, 2001-2005”, Pediatrics, 127(6), 1043-1051. 42. T. A. Markow (2015), “The secret lives of Drosophila flies”, Elife, 4. 43. X. Ming, M. Brimacombe, and G. C. Wagner (2007), “Prevalence of motor impairment in autism spectrum disorders”, Brain Dev, 29(9), 565-570. 44. S. J. Moore, et al. (2000), “A clinical study of 57 children with fetal anticonvulsant syndromes”, J Med Genet, 37(7), 489-497. 45. S. H. Mostofsky, et al. (2000), “Evidence for a deficit in procedural learning in children and adolescents with autism: implications for cerebellar contribution”, J Int Neuropsychol Soc, 6(7), 752-759. 46. C. J. Newschaffer, et al. (2007), “The epidemiology of autism spectrum disorders”, Annu Rev Public Health, 28, 235-258. 47. C. D. Nichols, J. Becnel, and U. B. Pandey (2012), “Methods to assay Drosophila behavior”, J Vis Exp, (61).
  47. 48. J. O'Neal, et al. (2009), “Neurobeachin (NBEA) is a target of recurrent interstitial deletions at 13q13 in patients with MGUS and multiple myeloma”, Exp Hematol, 37(2), 234-244. 49. Mark Osteen (2007), Autism and Representation. New York :Routledge. 50. Farzana Khan Perveen (2018), “Introduction to Drosophila, Drosophila melanogaster - Model for Recent Advances in Genetics and Therapeutics”, IntechOpen. 51. L. Pinato, et al. (2019), “Dysregulation of Circadian Rhythms in Autism Spectrum Disorders”, Curr Pharm Des, 25(41), 4379-4393. 52. M. D. Piper and L. Partridge (2016), “Protocols to Study Aging in Drosophila”, Methods Mol Biol, 1478, 291-302. 53. H. Ruan, et al. (2002), “High-quality life extension by the enzyme peptide methionine sulfoxide reductase”, Proc Natl Acad Sci U S A, 99(5), 2748-2753. 54. G. M. Rubin (1988), “Drosophila melanogaster as an experimental organism”, Science, 240(4858), 1453-1459. 55. T. Schneider and R. Przewlocki (2005), “Behavioral alterations in rats prenatally exposed to valproic acid: animal model of autism”, Neuropsychopharmacology, 30(1), 80-89. 56. A. F. Simon, et al. (2012), “A simple assay to study social behavior in Drosophila: measurement of social space within a group”, Genes Brain Behav, 11(2), 243-252. 57. Hiromitsu Takayama, et al. (2002), “Seven new Lycopodium alkaloids, lycoposerramines-C, -D, -E, -P, -Q, -S, and -U, from Lycopodium serratum Thunb”, Tetrahedron Letters, 43(46), 8307-8311. 58. Chang-Heng Tan, Shan-Hao Jiang, and Da-Yuan Zhu (2000), “Huperzine P, a novel Lycopodium alkaloid from Huperzia serrata”, Tetrahedron Letters, 41(30), 5733- 5736. 59. K. E. Towbin, et al. (2005), “Autism spectrum traits in children with mood and anxiety disorders”, J Child Adolesc Psychopharmacol, 15(3), 452-464. 60. L. Tsuda and Y. M. Lim (2018), “Alzheimer's Disease Model System Using Drosophila”, Adv Exp Med Biol, 1076, 25-40. 61. I. Ueoka, et al. (2019), “Autism Spectrum Disorder-Related Syndromes: Modeling with Drosophila and Rodents”, Int J Mol Sci, 20(17). 62. K. Volders, K. Nuytens, and J. W. Creemers (2011), “The autism candidate gene Neurobeachin encodes a scaffolding protein implicated in membrane trafficking and signaling”, Curr Mol Med, 11(3), 204-217. 63. F. Volkmar, et al. (2014), “Practice parameter for the assessment and treatment of children and adolescents with autism spectrum disorder”, J Am Acad Child Adolesc Psychiatry, 53(2), 237-257.
  48. 64. C. Wang, et al. (2017), “Prenatal, perinatal, and postnatal factors associated with autism: A meta-analysis”, Medicine (Baltimore), 96(18), e6696. 65. WHO (2021), Autism spectrum disorders. 66. L. Wing and J. Gould (1979), “Severe impairments of social interaction and associated abnormalities in children: epidemiology and classification”, J Autism Dev Disord, 9(1), 11-29. 67. A. Wise, et al. (2015), “Drosophila mutants of the autism candidate gene neurobeachin (rugose) exhibit neuro-developmental disorders, aberrant synaptic properties, altered locomotion, and impaired adult social behavior and activity patterns”, J Neurogenet, 29(2-3), 135-143. 68. B. Wisniowiecka-Kowalnik and B. A. Nowakowska (2019), “Genetics and epigenetics of autism spectrum disorder-current evidence in the field”, J Appl Genet, 60(1), 37-47. Website 69. Cơ sở dữ liệu Thực vật Việt Nam: truy cập ngày 27/05/2021. 70. Trung tâm dữ liệu Thực vật Việt Nam: truy cập ngày 27/05/2021. 71. truy cập ngày 27/05/2021.