Khóa luận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây thài lài trắng (Commelina diffusa Burm.F.)

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây thài lài trắng (Commelina diffusa Burm.F.)

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC  VŨ ĐÀI TRANG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY THÀI LÀI TRẮNG (Commelina diffusa Burm.F.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2021
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC  VŨ ĐÀI TRANG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY THÀI LÀI TRẮNG (Commelina diffusa Burm. F.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2016.Y Người hướng dẫn: PGS.TS. Vũ Đức Lợi Hà Nội - 2021
3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS Vũ Đức Lợi - Chủ nhiệm Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền. Em vô cùng biết ơn khi thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ dạy và tạo điều kiện tốt nhất để em có thể nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình. Em xin cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền của Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường. Cuối cùng, con xin cảm ơn gia đình, người thân cùng bạn bè đã luôn động viên, ủng hộ và giúp đỡ con trong suốt thời gian qua. Vì còn thiếu kinh nghiệm, nên báo cáo của em không thể tránh được những sai sót. Kính mong sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các thầy cô để khóa luận của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2021 Sinh viên Vũ Đài Trang
4. DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT STT Kí hiệu Ý nghĩa 1  (ppm) Độ dịch chuyển hóa học (ppm = part per million) 2 d Doublet 3 dd double doublet Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 4 13C-NMR (13C Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by 5 DEPT Polarization Transfer) Khối phổ đo bằng phương pháp ion hóa phun điện 6 ESI-MS tử (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) 7 EtOAc Ethyl acetate 8 EtOH Ethanol Sắc ký khí ghép khối phổ (Gas Chromatography- 9 GC-MS Mass Spectrometry) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H Nuclear 10 1H-NMR Magnetic Resonance Spectroscopy) Phổ tương tác di ̣ hạt nhânqua 1 liên kết 11 HSQC (Heteronuclear single quantum correlation) 12 IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) 13 J (Hz) Hằng số ghép (J coupling constant) 14 MeOH Methanol 15 s Singlet
5. DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Tên bảng Trang Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu 1 cơ bằng phương pháp hóa học của loài 29 Commelina diffusa Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của hợp chất TL1 2 33 và hợp chất tham khảo (CTK)
6. DANH MỤC HÌNH ẢNH STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1: Hình ảnh về loài Thài lài trắng 5 Hình 1.2: Cấu trúc hóa học một số chất được tìm thấy ở 2 8 loài C. diffusa 3 Hình 3.1: Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng 18 4 Hình 3.2: Đặc điểm cơ quan sinh sản 19 5 Hình 3.3: Đặc điểm vi phẫu thân 20 6 Hình 3.4: Đặc điểm vi phẫu lá 21 7 Hình 3.5: Đặc điểm bột dược liệu 23 Hình 3.6: Sơ đồ chiết xuất các hợp chất từ cây Thài lài 8 31 trắng 9 Hình 3.7: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cây Thài lài trắng 32 10 Hình 3.8: Cấu trúc hợp chất TL1 (acid pimaric) 33
7. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi Commelina 2 1.1.1. Vị trí phân loại 2 1.1.2. Đặc điểm phân bố 2 1.1.3. Đặc điểm thực vật 3 1.1.4. Công dụng 4 1.2. Tổng quan về cây Thài lài trắng 4 1.2.1. Đặc điểm phân bố 4 1.2.2. Đặc điểm loài 5 1.2.3. Thành phần hóa học 6 1.2.4. Tác dụng sinh học 8 1.2.5. Công dụng 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1. Đối tượng nghiên cứu 12 2.1.1. Nguyên liệu 12 2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị 12 2.2. Nội dung nghiên cứu 13 2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật 13 2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học 13 2.3. Phương pháp nghiên cứu 13
8. 2.3.1. Xử lí và bảo quản mẫu 13 2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái 14 2.3.3. Nghiên cứu đặc điểm vi học 14 2.3.4. Định tính các nhóm chất hữu cơ 14 2.3.5. Phương pháp chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc 15 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17 3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Thài lài trắng 17 3.1.1. Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu 17 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu thân 20 3.1.3. Đặc điểm vi phẫu lá 21 3.1.4. Đặc điểm bột dược liệu 22 3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học 23 3.2.1. Định tính thành phần hóa học 23 3.2.2. Chiết xuất và phân lập hợp chất 30 3.3. Bàn luận 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
9. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa nên chúng ta có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng. Nhiều loài cây tại nước ta có giá trị lớn trong ngành thực phẩm, hương liệu, mĩ phẩm và đặc biệt là dược liệu. Trong đó, loài Commelina diffusa Burm.F. hay còn gọi là Thài lài trắng, [9] mọc phổ biến tại Việt Nam, có tiềm năng trở thành một loại dược liệu hữu ích. Loài này thuộc chi Commelina L.- một chi lớn thuộc họ Commelinaceae. [15] Trên thế giới, một vài nghiên cứu đã được tiến hành để tìm hiểu sâu hơn về loài cây trên. Các nhà khoa học đã tìm thấy nhiều alcaloid, flavonoid, saponin, tanin, glycosid tim, anthraquinon, ở Commelina diffusa. [31, 37] Loài này cũng đã được chứng minh có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxi hóa. [13, 34] Ở Việt Nam, theo dân gian, Thài lài trắng có tác dụng rất tốt trong điều trị ho, cao huyết áp và bệnh lậu. [9,11] Tuy mang nhiều tác dụng nổi bật nhưng nhìn chung, loài này tại nước ta vẫn chưa được tìm hiểu kĩ càng. Vậy nên, việc nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của loài Commelina diffusa tại Việt Nam sẽ góp phần giúp tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học và nâng cao giá trị tiềm năng của loài này trong kho tàng cây thuốc nước ta. Để góp phần cung cấp những cơ sở tiền đề cho việc sử dụng, bảo tồn và phát triển loài Thài lài trắng làm thuốc ở Việt Nam, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Thài lài trắng (Commelina diffusa Burm.F.)” được thực hiện nhằm mục tiêu: 1. Nghiên cứu được các đặc điểm thực vật và xác định được tên khoa học của mẫu cây Thài lài trắng. 2. Định tính được các nhóm chất có trong cây Thài lài trắng. 3. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc một số chất phân lập từ cây Thài lài trắng. 1
10. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi Commelina 1.1.1. Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại Cronquist (hệ thống phân loại thực vật có hoa do Arthur Cronquist phát triển), [16] chi Commelina thuộc: Giới (Kingdom): Thực vật (Plantae) Phân giới (Subkingdom): Thực vật có mạch (Tracheobionta) Trên ngành (Superdivision): Thực vật có hạt (Spermatophyta) Ngành (Division): Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp (Class): Lớp hành (Liliopsida) Phân lớp (Subclass): Thài lài (Commelinidae) Bộ (Order): Thài lài (Commelinales) Họ (Family): Thài lài (Commelinaceae) Chi: Commelina L. 1.1.2. Đặc điểm phân bố Chi Commelina L. là chi lớn nhất trong họ Commelinaceae, có khoảng từ 205 đến 215 loài. [41] Đây cũng là một trong sáu chi có sự phân bố rộng khắp thế giới và phức tạp nhất trong việc phân loại ở họ Commelinaceae. [19] Chi Commelina L. chủ yếu phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. [30] Một số loài phổ biến của chi này là C. benghalensis được tìm thấy ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á và châu Phi, [33] Commelina erecta được thấy ở châu Mĩ (ôn đới và nhiệt đới), tiểu vùng Sahara ở châu Phi và phía Nam Arabian Peninsula. Trong số các loài của chi Commelina L. thì loài Commelina dielsii là loài duy nhất chỉ được tìm thấy ở đúng một nơi trên thế giới. Loài này được phát hiện đầu tiên vào năm 1940 và mới chỉ được tìm 2
11. thấy ở Concepción del Uruguay, tỉnh Entre Ríos, vùng đông bắc Argentina. [21] 1.1.3. Đặc điểm thực vật Các loài thuộc chi Commelina L. là cây sống lâu năm hoặc hàng năm. Rễ cây thường ở dạng sợi, hiếm khi có củ hoặc thân rễ. Lá cây thường mọc thành hai hàng hoặc mọc theo hình xoắn ốc, không có cuống hoặc có một cuống lá. [19, 20] Cụm hoa mọc ở ngọn thân, mọc tại nách lá, trên cùng một mấu với lá. [19, 20] Cụm hoa có chứa một hoặc hai xim hoa hình đuôi bọ cạp, tức là mỗi hoa mọc trên một trục hoa đơn lẻ, các trục hoa đơn lẻ sắp xếp so le tạo thành cụm giống như đuôi bọ cạp mọc dọc theo trục chính của chùy hoa. Xim hoa được bao trong một bao mo - một chiếc lá đã bị biến đổi và chứa đầy dịch nhầy. [19] Hoa mọc trên cuống hoa và đối xứng hai bên (zygomorphic). Các lá bắc đôi khi nằm dưới cuống lá nhưng thường thường sẽ không có lá bắc. Chi này có hoa lưỡng tính hoặc hoa đực. Ba lá đài không đồng đều, có thể mọc tự do hoặc hai lá đài có thể hợp nhất với nhau. Các cánh hoa mọc tự do và không đồng đều. Hai cánh hoa bên trên to hơn và quắp vào, nghĩa là chúng hẹp lại thành cuống ở gốc - nơi chúng gắn vào phần còn lại của hoa. Trong khi đó, cánh hoa bên dưới thường nhỏ hơn và có màu sắc khác với hai cánh hoa bên trên. Hoa thường có màu xanh lam nhưng đôi khi cũng có thể là màu tím nhạt, màu vàng, màu trắng, [19, 20] Hoa có ba nhị hữu thụ và ba nhị bất thụ. Chúng mọc tự do và có chỉ nhị nhẵn nhụi. Nhị bất thụ thường mọc phía sau với bao phấn, có bốn hoặc sáu thùy. Nhị hữu thụ mọc phía trước và dài hơn so với các nhị bất thụ. Nhị hoa ở giữa khác biệt về kích cỡ và hình dạng so với các nhị hoa còn lại. Bầu nhụy có hai hoặc ba ô với một hoặc hai noãn tại mỗi ô. [19, 20] Quả nang thường có hai hoặc ba ô, hiếm khi có một ô. Quả nang có hai hoặc ba mảnh vỏ. Mỗi ô chứa một hoặc hai hạt, cũng có thể không chứa hạt nào. Các hạt xếp thành một hàng, rốn hạt thẳng. [19] 3
12. 1.1.4. Công dụng Theo y học cổ truyền, nhiều loài thuộc chi Commelina L. được sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Các loài thuộc chi Commelina L. được sử dụng làm thuốc chữa viêm họng, cảm cúm, cảm lạnh, [38]. Loài C. benghalensis được sử dụng để trị đau, táo bón, nhức đầu và bệnh phong. Ở nhiều vùng nhiệt đới châu Á, nó được sử dụng để điều trị vô sinh ở phụ nữ. Ở Ấn Độ, nó được sử dụng để giảm béo, nhuận tràng, mềm da, chống viêm và chống trầm cảm. [33] C. coelestis được sử dụng để chữa tiêu chảy ở Mexico. [28] Tại Việt Nam, nhiều loài thuộc chi Commelina L. cũng được sử dụng làm thuốc chữa nhiều loại bệnh. C. benghalensis được sử dụng làm thuốc xổ, bảo vệ màng nhầy, hoạt nhuận và làm mát. C. communis L. dùng làm thuốc lợi tiểu, trị phù thũng do suy tim, trị huyết áp cao, sốt, đau mắt, lậu, [9] Các nghiên cứu hiện đại cũng đã chứng minh được tác dụng của một số loài thuộc chi Commelina L. Các chất chiết xuất ethanol từ rễ của loài C.benghalensi cho thấy tác dụng giảm đau rất tốt với cơ chế tương tự cơ chế hoạt động của các NSAID khác. Ngoài ra, loài này còn cho thấy khả năng chống viêm, kháng khuẩn, chống oxi hóa, [33] C. coelestis cho thấy hoạt tính chống tiêu chảy. [28] Còn loài C. appendiculata có tiềm năng giảm đau tốt. [32] 1.2. Tổng quan về cây Thài lài trắng Tên khoa học: Commelina diffusa Burm.F. Synonyms: Commelina agraria Kunth (1843), Commelina aquatica J.K.Morton, Commelina longicaulis Jacq, [42] Tên tiếng Việt thường gọi: Thài lài trắng, Rau trai [9] 1.2.1. Đặc điểm phân bố Commelina diffusa được mô tả lần đầu tiên vào năm 1768 bởi Burman.f. [15] C. diffusa được tìm thấy ở khắp các vùng nhiệt đới của châu Mĩ, châu Phi, châu Á và Thái Bình Dương, cũng như ở các vùng cận nhiệt đới phía nam của Hoa Kỳ, Nam Mĩ, Úc và các đảo Nam Á. 4
13. C. diffusa là một loài cỏ dại ở vùng nhiệt đới và cả cận nhiệt đới, xuất hiện chủ yếu ở các môi trường sống thoáng và ẩm như các cánh đồng lúa. Cây thường mọc ở các vùng đất canh tác, ven đồng ruộng, đồng cỏ ẩm ướt, ven đường và các khu vườn. C.diffusa có thể chống chịu được những đợt lũ lụt tạm thời. [22] Tại Việt Nam, loài này thường mọc ở nơi ẩm ướt như ven đồi, ven đường, đất ẩm ướt. [10] Loài này mọc tại nhiều tỉnh thành trên cả nước như Tam Đảo, Quảng Trị, Long An, [10, 4, 6] Hình 1.1: Hình ảnh về loài Thài lài trắng 1.2.2. Đặc điểm loài Commelina diffusa là loài cây hàng năm ở các vùng ôn đới nhưng lại là loài lâu năm khi mọc ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới. [22, 20] Cây bò lan rộng trên mặt đất, thân phân nhiều nhánh và mọc rễ ở các mắt cây. Thân cây mịn hoặc sần sùi, gần như không có lông. [9, 23] Thân cây có thể dài lên đến một mét. [9] Các phiến lá có hình dạng đa dạng, có thể là hình mác đến hình trứng, phần lá gần cuống thì thường thuôn hơn. Chúng có kích thước 3-12 cm x 0,8-3 cm. [23] Bề mặt lá có thể nhẵn hoặc có lông. [20] Lá không có cuống và bẹ lá có sọc màu đỏ, được bao phủ bởi các sợi lông tơ. [9, 20] Hoa thường mọc thành xim hoa hình đuôi bọ cạp, tức là mỗi hoa mọc trên một trục hoa đơn lẻ, các trục hoa đơn lẻ sắp xếp so le tạo thành cụm giống như đuôi bọ cạp mọc dọc theo trục chính của chùy hoa. Thông thường 5
14. sẽ có hai xim hoa, xim hoa thấp hơn có khoảng từ hai đến bốn bông hoa, trong khi đó, xim hoa ở bên trên có từ một bông hoa trở lên. [20] Xim hoa phía trên chỉ có một bông hoa đực và có cuống hoa dài hơn xim hoa phía dưới có hoa lưỡng tính. Mỗi cuống chỉ mọc một bông hoa. Quả có kích thước từ 3-5 mm. [23] Các lá đài ở dạng màng mỏng, khó nhìn thấy, chỉ có chiều dài từ 3-4 mm. [23] Cánh hoa màu xanh nhưng trong một số trường hợp hiếm hoi sẽ có màu tím nhạt. [20] Hai cánh hoa bên trên có kích thước từ 4,2 - 6 mm. [23] Phần liên kết hai nửa bao phấn của nhị hoa trung tâm có một có một dải ngang màu tím. Bao mo mọc đơn độc trên một cuống và thường có dạng chủ yếu là hình lưỡi liềm, hoặc hình trái tim cho đến hình có đáy tròn, đỉnh nhọn. Bao mo mịn hoặc có thể có vân, tức là có rãnh nhỏ trên đó. Chúng thường dài 0,8-2,5 cm, nhưng có thể ngắn đến 0,5-4 cm. Chúng thường rộng 0,4x1,2 cm, nhưng có thể rộng tới 1,4 cm. Cuống của chúng thường dài 0,5-2 cm và hiếm khi lên đến 2,9 cm. [20, 23] Ra hoa từ tháng 5 đến tháng 11. [23] Quả nang có 3 ô và hai mảnh vỏ, chứa 5 hạt đen, vỏ hạt có mạng. [9,23] Quả có kích thước dài 4-6,3 mm, rộng 3-4 mm, mặc dù nó có thể hẹp tới 2,1 mm. Hạt dài 2-2,8 mm, hiếm khi dài đến 3,2 mm, rộng 1,4-1,8 mm. [20, 23] 1.2.3. Thành phần hóa học Bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng và định lượng sơ bộ, người ta nhận thấy rằng thành phần hóa học của loài C. diffusa bao gồm alcaloid, flavonoid, saponin, tanin, glycosid tim, anthraquinon, steroid và terpenoid. [31, 37]. Ngoài ra, thài lài còn mang các hàm lượng chất dinh dưỡng cao, bao gồm vitamin C, vitamin B3, vitamin B2, [27] Năm 2014, Lê Xuân Đắc và các cộng sự đã tìm thấy khoảng 0,006% 20-hydroxyecdysone (1) trong toàn thân của loài C. diffusa. Mẫu được thu hái ở khu vực dân cư tại thị trấn Tam Đảo và một số xã vùng đệm vườn quốc gia Tam Đảo. Xác định hàm lượng 20-hydroxyecdysone có trong mẫu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trên hệ thống HPLC Agilent 1200 6
15. (Mĩ), cột Zorbax Eclipse XDB-C18 (5 μm, 4,6x150 mm), thành phần pha động: nước/axetonitrin là 80/20, tốc độ dòng là 1 ml/phút, bước sóng l = 242 nm, nhiệt độ cột 30°C. [6] Năm 2018, với mẫu cây C. diffusa được thu thập từ vườn thực vật ở đại học Port Harcourt, Nigeria, Ekeke và các cộng sự đã tìm thấy 38 flavonoid, 38 alcaloid, 40 phenolic acid và 18 glycosid bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng hiệu suất cao. Flavonoid gồm chủ yếu là các flavanon và flavon, trong đó, chất rhoifolin chiếm hàm lượng cao nhất (4,44g/100g). Các chất thuộc nhóm isoquinoline có hàm lượng cao nhất trong các alcaloid, trong đó, chủ yếu là chất psychotrin (6,97g/100g). Trong số các phenolic acid thì chất có tỉ lệ cao nhất là astringin acid (8,023g/100g). Cuối cùng, với các glycosid, captopril acid (15,705/100g) là chất được tìm thấy nhiều nhất. [18] Năm 2019, Samir M. Hamad và các cộng sự lần đầu tiên tìm thấy 7-hydroxy-4´-methoxy-isoflavon (2) từ dịch chiết của lá cây loài C. diffusa. Dịch chiết flavonoid được xác định bởi phương pháp quang phổ Uv – vis, H NMR và các kĩ thuật C NMR. [35] Năm 2019, các nhà khoa học đã tìm thấy alcaloid, phenolic, tannin, steroid, flavonoid, protein và phyosteriod ở loài C. diffusa. Từ chồi cây, người ta đã tìm thấy 21 hợp chất từ loài C. diffusa. Trong đó, những hợp chất quan trọng có tác dụng sinh học là: - 2-Methoxy-4-vinylphenol (3): kháng khuẩn, chống oxy hóa và viêm - 3,7,11,15-Tetramethyl-2 hexadecen-1-ol (4): kháng khuẩn, chống viêm - Phytol (5): Chống viêm, chống oxi hóa, lợi tiểu - Methyl stearate (6): chống tiêu chảy, gây độc tế bào và chống tăng sinh - 9,12,15- Octadecatrienoic acid, methyl ester, (Z,Z,Z)- (7): Chống viêm, giảm cholesterol máu, hỗ trợ điều trị ung thư - Octadecanoic acid (8): Sử dụng trong mĩ phẩm, điều hương. [29] Năm 2019, để chứng minh về giá trị thực phẩm của loài C. diffusa, các nhà khoa học đã nghiên cứu về các thành phần dinh dưỡng có trong chiết xuất từ cây thài lài. Kết quả cho thấy C. diffusa chứa carbohydrat (6,32%), Vitamin C (44,80 mg/100g ), Vitamin B3 (63,18mg/100g) và Vitamin B2 7
16. (8,30 mg/100g). Hàm lượng chất khoáng từ chiết xuất lá gồm Na (69,32mg/100g), Ca (232,00mg/100g) và Mg (84,28mg/100g). [27] O O 7 Hình 1.2: Cấu trúc hóa học một số chất được tìm thấy ở loài C. diffusa 1.2.4. Tác dụng sinh học Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chiết xuất từ loài Commelina diffusa có tác dụng nổi bật trong việc kháng khuẩn và kháng nấm.[12, 13, 31] Ngoài ra, người ta còn chứng minh được khả năng chống oxi hóa, ức chế thần kinh, bảo vệ gan và ổn định đường huyết của Thài lài trắng. [34, 37, 3, 24] 1.2.4.1 Kháng khuẩn, kháng nấm Năm 2006, nghiên cứu của Abraham Y Mensah và các cộng sự cho thấy các chiết xuất methanol của Commelina diffusa có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm chọn lọc đối với các loài Trichophyton. Nồng độ ức chế tối thiểu với vi khuẩn B. subtilis là 500 μg/ml, với nấm T. interdigitale thì MIC = 500 μg/ml, T. tonsurans với MIC = 250 μg/ml. Các chất chiết xuất làm 8
17. giảm quá trình peroxy hóa của chiết xuất não bò với giá trị IC50 tương ứng là 1,39 mg/mL. Ngoài ra, các chất chiết xuất cũng thể hiện hoạt tính chống oxy hóa đáng kể bằng cách bảo vệ tế bào MRC-5 khỏi tổn thương oxy hóa do hydrogen peroxide gây ra ở nồng độ từ 1 μg/mL đến 10 μg/mL. Các chất chiết xuất cho thấy không có sự ức chế NF-kappaB ở 100 μg/mL. [13] Năm 2011, Ahad Ali Khan cũng đã nghiên cứu ra rằng C. diffusa có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm. Chiết xuất methanol của loài C. diffusa có khả năng ức chế bảy loại vi khuẩn bao gồm Aspergillus niger, Blastomyces dermatitidis, Pityrosporum ovale, Trichophyton spp, Microsporum spp, Cryptococcus neoformans với MIC từ 15,62 đến 62,5 μg/μl. Chiết xuất diethyl ether có thể ức chế được Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Shigella dysenteriae, Shigella sonnei, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Salmonella paratyphi với MIC từ 15,62 đến 125 μg/μl. [31] Cũng trong năm 2021, A. Frankova và các cộng sự đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của loài C. diffusa. Nghiên cứu được tiến hành để đánh giá hoạt động kháng khuẩn in vitro của dịch chiết ethanol của loài C. diffusa và khả năng ảnh hưởng đến sự gia tăng, di chuyển của nguyên bào sợi ở người. Kết quả cho thấy cây có thể ức chế sự phát triển của loài Staphylococcus aureus với MIC ≥ 4 μg/mL. Pseudomonas aeruginosa là loại vi khuẩn gây viêm nhiễm và làm trì hoãn sự chữa lành vết thương. Ngoài ra, nghiên cứu còn cho thấy dịch chiết không tạo ra độc tính đối với dòng nguyên bào sợi da người lớn bình thường (IC80 > 128 μg/mL). [12] 1.2.4.2 Chống gốc tự do Năm 2017, chiết xuất methanol từ lá cây C. diffusa đã được thử nghiệm về khả năng dọn dẹp các gốc tự do với các chất chuẩn là Ascorbic acid và tert-butyl-1-hydroxytoluene (BHT). Trong nghiên cứu này, chiết xuất từ lá cây thài lài đã cho thấy khả năng đáng chú ý trong việc chống lại các gốc tự do với giá trị IC50 là 401,57 μg/ml, khá cao so với chất chuẩn (IC50 của Ascorbic acid là 3,01 μg/ml, IC50 của tert-butyl-1-hydroxytoluene là 21,17 μg/ml). [34] 9
18. 1.2.4.3 Ức chế thần kinh trung ương Năm 2018, Tania Sultana và cộng sự đã tìm thấy mối liên hệ giữa chiết xuất methanol của C. diffusa và khả năng ức chế thần kinh trung ương của loài chuột. Người ta tiến hành thử nghiệm mô hình môi trường mở (Open field test), bơi lội, thí nghiệm treo đuôi chuột và kiểm tra thời gian ngủ gây ra bởi natri thiopental, . Kết quả cho thấy chiết xuất từ cây làm giảm hẳn hoạt động của chuột ở bài kiểm tra môi trường mở và bài kiểm tra lỗ xuyên (p < 0,05). Quan sát cũng cho thấy chiết xuất làm kéo dài khoảng thời gian bất động ở bài kiểm tra bơi cưỡng bức và treo đuôi. Ngoài ra, nó cũng kéo dài thời gian ngủ ở chuột. Vì vậy, nghiên cứu cho thấy chiết xuất của loài C.diffusa gây ức chế hệ thần kinh trung ương ở chuột. [37] 1.2.4.4 Tác dụng bảo vệ gan Năm 2019, nghiên cứu khảo sát tác dụng bảo vệ gan của các cao chiết từ C.diffusa trên mô hình chuột nhắt trắng bị tổn thương gan do quá trình sử dụng rượu mãn tính. Chuột được cho uống ethanol theo nồng độ tăng dần mỗi 7 ngày (10, 20, 30, 40%) liên tục sau 4 tuần và được điều trị dự phòng với các loại cao chiết từ C.diffusa và silymarin (100 mg/kg) tại thời điểm 1 giờ trước khi cho uống ethanol. Kết quả cho thấy việc cho uống cao chiết cồn 96% từ C.diffusa ở cả hai liều 0,21 và 0,42 g/kg làm giảm hoạt độ AST và ALT trong huyết tương. Đồng thời, việc cho uống cao chiết cồn 96% cũng làm giảm nồng độ MDA (malondialdehyd) và tăng nồng độ GSH (glutathion) trong gan chuột, tác dụng tương đương với thuốc đối chiếu silymarin. Cao chiết cồn 50% (0,49 và 0,98 g/kg) và cao chiết nước (0,36 và 0,72 g/kg) chưa thể hiện được tác dụng dược lý trên các chỉ tiêu khảo sát. [3] 1.2.4.5 Tác dụng ổn định đường huyết Năm 2003, Ji-Youn Youn và các cộng sự đã đánh giá khả năng ức chế alpha-glucosidase của chiết xuất của C. diffusa in vitro và in vivo. Dịch chiết cho thấy khả năng ức chế alpha-glucosidase phụ thuộc vào liều lượng của loài này. C. diffusa dường như cũng không gây ra bất kì tác dụng gây độc tế bào nào, ít nhất là với nguyên bào sợi CHO-K1 và tế bào mỡ 3T3-L1. C.diffusa cải thiện tình trạng tăng đường huyết do maltose hoặc tinh bột ở chuột mắc 10
19. bệnh tiểu đường (loại thông thường và loại do Streptozotocin gây ra). Ngoài ra, dùng C. diffusa kéo dài có xu hướng giúp ổn định đường huyết ở chuột mắc bệnh tiểu đường do Streptozotocin gây ra. Kết quả như vậy cho thấy rằng hoạt động ức chế của C. diffusa trên alpha-glucosidase có thể góp phần làm chậm quá trình tiêu hóa carbohydrate và hấp thụ glucose. Do đó, C. diffusa có tiềm năng sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường không phụ thuộc insulin. [24] 1.2.5. Công dụng Trên thế giới, Commelina diffusa được sử dụng để chữa bệnh ở rất nhiều nơi. Ở Nigeria, cây được sử dụng để trị táo bón. Nước sắc từ lá dùng để rửa mắt và trị các bệnh về mắt. Ở Mexico, cây được dùng chữa đau mắt đỏ, đau bụng kinh và viêm da dầu. Ở Hawaii, thài lài được sử dụng để làm lành vết thương. Ở Pêru, nước sắc được dùng làm trà chữa đau đầu. [34] Ở Trung Quốc, nước sắc toàn cây được dùng để hạ nhiệt độ cơ thể, giải độc, chữa bệnh phong thấp và nâng cao sức khỏe. [34, 23] Tại Việt Nam, cây Thài lài trắng được sắc thuốc, ngày dùng từ 30 - 60g để chữa cảm cúm, viêm nhiễm phần trên đường hô hấp; viêm hạnh nhân cấp, viêm hầu; phù thũng, nhiễm khuẩn đường niệu-sinh dục; viêm ruột thừa cấp và lỵ; cao huyết áp và bệnh lậu. [9, 11] Ngoài ra, cây còn được giã tươi để đắp vết thương và điều trị viêm mủ da. Ở dân tộc Mường, người dân sử dụng nước sắc toàn cây để trị bệnh sỏi thận. [2] Nhìn chung, trên thế giới, nghiên cứu hóa học về loài C. diffusa đã được tiến hành ở nhiều nơi và phát hiện được nhiều hợp chất quan trọng, có tác dụng sinh học. Các nhà khoa học cũng đã chứng minh được tác dụng nổi bật của loài C. diffusa trong việc kháng khuẩn, kháng nấm. [12, 13, 31] Tuy nhiên, ở Việt Nam, nghiên cứu về loài Thài lài trắng còn tương đối hiếm và không đầy đủ. Vì vậy, việc tiến hành nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm thực vật và hóa học loài C. diffusa tại Việt Nam là cần thiết. 11
20. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu Thài lài trắng được thu hái tại phường Tây Mỗ, quận Nam Từ Liêm, Hà Nội vào tháng 12 năm 2020. Mẫu cây tươi thu hái, làm tiêu bản (có đầy đủ bộ phận sinh sản), bảo quản, lưu mẫu tại: Trường Đại học Y Dược, Đại học quốc gia Hà Nội (số hiệu tiêu bản: UMP-092021). 2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị 2.1.2.1 Hóa chất - Hóa chất dùng trong tẩy nhuộm vi phẫu: javen, acid acetic, xanh methylen, glycerin, nước cất - Các dung môi dùng để chiết xuất và phân lập: ethanol (EtOH), ethyl acetat (EtOAc), aceton (Ac), cloroform (CHCl3), benzen, n-hexan, methanol (MeOH), dicloromethan (DCM), - Các hóa chất dùng để định tính: FeCl3, dung dịch NaOH, H2SO4, HCl, phenonphtalein, fehling - Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silicagel pha thường cỡ hạt 0,063 - 0,200 mm (Merck), (0,040 - 0,063 mm, Merck). Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) (silicagel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm)  Các hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích. 2.1.2.2 Trang thiết bị - Kính hiển vi có gắn camera tại Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. - Sắc ký cột: sắc ký cột sử dụng silicagel cỡ hạt 0,063 - 0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 12
21. - Phổ khối ESI-MS: đo trên máy AGILENT 1260 Series LC-MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ). - Nhiệt độ nóng chảy: đo trên máy SMP10 BioCote, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. - Góc quay cực riêng: đo trên máy PLR-4, MRC scientific instruments, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. - Dụng cụ thí nghiệm: Pipet, ống nghiệm, bình nón, bình chiết 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật - Mẫu cây Thài lài trắng sau khi thu hái xử lí sơ bộ, tiến hành phân tích, mô tả các đặc điểm hình thái đặc trưng của loài, giám định tên khoa học. - Nghiên cứu, mô tả đặc điểm bột và vi phẫu thân, lá của cây Thài lài trắng. 2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học - Định tính các nhóm chất trong cây Thài lài trắng bằng các phản ứng hóa học. - Chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc hợp chất có trong cây Thài lài trắng. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Xử lí và bảo quản mẫu Mẫu dược liệu gồm dược liệu tươi và dược liệu đã phơi khô sau khi thu hái. Dược liệu được bảo quản như sau: Mẫu dược liệu cắt làm vi phẫu là mẫu tươi, sau khi có mẫu tiến hành làm ngay. Trường hợp chưa thể làm kịp thì tiến hành bảo quản mẫu trong hỗn hợp cồn:nước (1:1). Mẫu dược liệu dùng để soi bột được sấy khô, nghiền thành bột, bảo quản trong lọ có nút kín, có ghi nhãn và để nơi khô ráo. Mẫu dược liệu dùng để định tính, chiết xuất, phân lập, nhận dạng cấu trúc hóa học được sấy ở nhiệt độ < 50oC trong tủ sấy, bảo quản trong túi ni lông kín, để nơi khô ráo, tránh ánh sáng mặt trời. 13
22. 2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái - Phân tích hình thái thực vật: mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp mô tả phân tích. - Làm tiêu bản mẫu khô theo phương pháp làm tiêu bản cây khô. Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu: đối chiếu đặc điểm mô tả được với đặc điểm thực vật đã được công bố trong các tài liệu [9, 20, 23] về loài Commelina diffusa Burm.F. 2.3.3. Nghiên cứu đặc điểm vi học Nghiên cứu đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu theo tài liệu, [5, 7, 8] cụ thể: mẫu sau thu hái được đem xử lí theo phương pháp thích hợp rồi tiến hành nghiên cứu. 2.3.3.1 Đặc điểm vi phẫu - Chọn mẫu có kích thước lá và thân thích hợp. - Cắt mẫu làm tiêu bản: tiêu bản vi phẫu thân được cắt ngang ở đoạn thân thứ tư tính từ đầu cành. Tiêu bản vi phẫu lá được cắt ngang ở vị trí khoảng 1/4-1/3 từ dưới gần gốc của lá trưởng thành. - Xử lý lát cắt: chọn những lát cắt mỏng đem nhuộm và làm tiêu bản vi phẫu theo quy trình chuẩn. [8] - Quan sát, mô tả và chụp ảnh: quan sát các đặc điểm vi phẫu, chụp ảnh bằng kính hiển vi có gắn camera tại Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, Đại học quốc gia Hà Nội. 2.3.3.2 Đặc điểm bột dược liệu - Mẫu nghiên cứu được sấy khô, nghiền thành bột. - Quan sát trực tiếp, nếm, ngửi, xác định màu, mùi, vị. - Làm tiêu bản bột dược liệu bằng phương pháp giọt ép, quan sát, mô tả và chụp ảnh những đặc điểm điển hình của bột trên nền kính hiển vi có gắn camera. Ảnh các đặc điểm bột được đưa vào máy tính. 2.3.4. Định tính các nhóm chất hữu cơ Chiết xuất lấy dịch chiết bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau (nước, ethanol, n-hexan ), sau đó định tính sơ bộ một số nhóm chất hữu cơ 14
23. trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học thích hợp, theo quy trình chuẩn ghi trong tài liệu. [1, 7] 2.3.5. Phương pháp chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc 2.3.5.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất Mẫu thân và lá cây C. diffusa phơi sấy khô (1,0 kg) được ngâm chiết bằng dung môi EtOH 70% (3 lần, mỗi lần 6 L), sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40oC trong vòng 30 phút. Lọc các dịch chiết EtOH thu được qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 80 g cao chiết tổng ethanol. Lấy 60 g cao chiết phân tán trong nước cất (400 mL) và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 mL). Các dịch chiết n-hexan, EtOAc được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng n-hexan (20,8 g) và ethyl acetat (24,9 g). Tiến hành xử lý và phân lập hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký cột. Các phân đoạn trong quá trình phân lập được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng. Sắc ký cột: thực hiện với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo, lựa chọn hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Silicagel pha thường cỡ hạt là 0,063 - 0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau. Sắc ký lớp mỏng: thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60G F254 (Merck), độ dày 0,2 mm và RP-18 F254, độ dày 0,25 mm (Merck). Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, sau đó được phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và đốt nóng trên bếp điện từ. 2.3.5.2. Phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập qua 2 bước chính: 15
24. Bước 1: Thực hiện đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), thiết lập bộ dữ liệu của chất phân lập được. Bước 2: So sánh dữ liệu các chất thiết lập đó với dữ liệu các chất đã công bố. 16
25. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Thài lài trắng 3.1.1. Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu Cây bò lan rộng trên mặt đất. Thân thảo sống lâu năm. Thân cây hình trụ, mịn, không có lông, màu xanh lá, vài chỗ có các sọc đỏ dọc theo thân. Thân chia đốt dài từ 2-10 cm. Rễ sợi dài, màu trắng ngà đến nâu nhạt, đường kính 0,2-0,4 cm. Lá đơn, mọc so le. Lá không có cuống. Bẹ lá dài 0,8-1,7 cm, có sọc màu đỏ, được bao phủ bởi các sợi lông tơ. Phiến lá nguyên, hình mác hoặc hình Elip, phần lá gần cuống thì thường tròn hơn. Chúng có kích thước 3-10 cm x 1-3 cm. Bề mặt lá hầu như không có lông, gân hình cung. Hoa nở vào buổi sáng và nhanh chóng tàn sau vài giờ đồng hồ. Hoa thường mọc thành từng xim hoa ở nách lá với cuống dài từ 0,5-2 cm, màu xanh nhạt, không có lông. Mỗi xim hoa có một lá bắc riêng, hình lưỡi liềm hoặc hình trái tim, ôm lấy xim hoa, rộng 0,9-2 cm, dài 1,2-1,8 cm, màu xanh nhạt hơn so với lá bình thường, không có lông. Hoa đực hoặc lưỡng tính. Cuống hoa hình trụ dài, màu trắng đến xanh lá nhạt, nhẵn. Đài 3, rời, hình lòng thuyền, rộng 0,2-0,3 cm, dài 0,3-0,5 cm, màu trắng nhạt hoặc phớt xanh lam, mỏng, nhẵn, có gân song song. Tràng 3, rời, hình hoa hồng dài 0,6-1 cm, rộng 0,2-0,4 cm, màu xanh lam. Nhị 6 xếp thành 2 vòng; 3 nhị vòng ngoài bất thụ, có chỉ nhị hình sợi, màu xanh lam, dài 0,2-0,3 cm, mang bao phấn bất thụ có hai thùy, màu vàng; 3 nhị hữu thụ có kích thước khác nhau, chỉ nhị dài 0,4-0,6 cm, màu xanh lam, bao phấn 2 ô, hình bầu dục, màu vàng; nhị hữu thụ ở giữa hơi lớn hơn so với hai nhị hữu thụ hai bên và có dải liên kết hai ô của bao phấn. Nhụy có bầu hình elip thuôn, dài 0,2-0,3 cm, đường kính 0,1-0,2 cm, màu xanh, vòi nhụy hình sợi dài 0,6-0,9 cm, màu xanh lam. Quả nang có 3 ô. Quả có kích thước dài từ 0,6-0,8 cm x 0,2-0,4 cm. 17
26. Hình 3.1: Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng Chú thích: 1.Toàn cây; 2. Bẹ lá; 3.Thân cây; 4. Mặt sau của lá; 5. Mặt trước của lá; 6. Rễ cây 18
27. Hình 3.2: Đặc điểm cơ quan sinh sản Chú thích: 1. Cụm hoa; 2. Hoa nguyên vẹn nhìn từ trên xuống; 3. Hoa nguyên vẹn nhìn từ dưới lên; 4. Đài; 5. Tràng; 6. Nhụy; 7. Quả; 8. Nhị bất thụ; 9. Nhị hữu thụ; 10. Bộ nhị 19
28. 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu thân Hình 3.3: Đặc điểm vi phẫu thân Chú thích: 1. Biểu bì; 2. Mô nâng đỡ; 3. Mô mềm vỏ; 4. Nội bì; 5. Trụ bì; 6. Libe sơ cấp; 7. Gỗ sơ cấp; 8. Mô mềm ruột Vi phẫu thân có tiết diện tròn, cấu tạo gồm có hai phần là vỏ và trụ giữa. Phần vỏ chiếm 1/6 tiết diện, từ ngoài vào trong gồm: Biểu bì (1) có cấu tạo gồm một hàng tế bào hình đa giác, xếp sát vào nhau, vách ngoài hóa cutin. Mô nâng đỡ (2) gồm 1-2 hàng tế bào nằm sát ngay biểu bì. Mô mềm (3) là các tế bào hình đa giác, sắp xếp lộn xộn, có kích thước lớn hơn mô nâng đỡ. Nội 20
29. bì (4) gồm một lớp tế bào hình đa giác, vách dày lên hình chữ U, phần vách dày lên bắt màu xanh. Phần trụ giữa từ ngoài vào trong gồm: Trụ bì (5) gồm 1-2 lớp tế bào hình đa giác, xếp sát nội bì và có kích thước nhỏ hơn các tế bào nội bì, vách dày bắt màu xanh. Các bó libe-gỗ nằm rải rác trong mô mềm ruột, thường tập trung nhiều nhất ở ngay sát trụ bì và phần trung tâm của vi phẫu thân. Các bó ở phía tâm có kích thước lớn hơn các bó phía ngoài. Mỗi bó gồm gỗ sơ cấp (7) xếp thành hai bó bên ngoài libe sơ cấp (6). Gỗ sơ cấp (7) là các tế bào hình tròn, vách dày hóa gỗ, bắt màu xanh, có kích thước giảm dần từ tâm ra vỏ. Libe sơ cấp (6) là những tế bào có kích thước nhỏ, bắt màu hồng nằm giữa 2 bó gỗ. Mô mềm ruột (8) gồm các tế bào hình đa giác, có kích thước rất lớn, sắp xếp lộn xộn và có nhiều khoảng gian bào. 3.1.3. Đặc điểm vi phẫu lá Hình 3.4: Đặc điểm vi phẫu lá Chú thích: 1. Biểu bì trên; 2. Mô mềm trên; 3. Gỗ; 4. Libe; 5. Mô mềm dưới; 6. Mô nâng đỡ; 7. Biểu bì dưới; 8. Lông che chở; 9. Khí khổng; 10. Tinh thể canxi oxalat 21
30. Vi phẫu lá có cấu tạo đối xứng hai bên, tiết diện có mặt trên lá lõm xuống ở gân giữa, cấu tạo gồm: Biểu bì trên (1) có cấu tạo gồm một hàng tế bào hình đa giác, kích thước không đều, xếp ngay sát nhau, vách ngoài hóa cutin. Trên biểu bì có lông che chở đa bào (8). Mô mềm trên (2) gồm 2-3 lớp tế bào hình đa giác, kích thước rất lớn, sắp xếp lộn xộn với nhau và có nhiều khoảng gian bào. Bó libe gỗ nằm gần giữa vi phẫu có libe (4) nằm ở phía ngoài, gồm các tế bào đa giác có kích thước bé, bắt màu hồng. Gỗ (3) gồm một vài tế bào hình tròn, vách dày hóa gỗ bắt màu xanh, nằm phía trong libe. Biểu bì dưới (7) gồm một hàng tế bào hình đa giác xếp sát vào nhau, vách ngoài hóa cutin. Ở phần phiến lá, còn có khí khổng (9). Mô nâng đỡ dưới (6) gồm một lớp tế bào nằm sát biểu bì, vách dày, bắt màu hồng chuẩn bị hóa mô cứng nâng đỡ cho cây. Mô mềm (5) là các tế bào hình đa giác, sắp xếp lộn xộn, nằm phía trong mô nâng đỡ, kích thước lớn. Tinh thể canxi oxalat (10) với kích thước không đều nhau, xuất hiện nhiều ở mô mềm. 3.1.4. Đặc điểm bột dược liệu Bột dược liệu có màu xanh, soi dưới kính hiển vi thấy có những đặc điểm sau: Mảnh mạch vạch (1), lông che chở (2), mảnh mô mềm (3), tinh bột (4), tinh thể canxi oxalat (5), khí khổng (6) 22
31. Hình 3.5: Đặc điểm bột dược liệu Chú thích: 1. Mảnh mạch vạch; 2. Lông che chở; 3. Mảnh mô mềm; 4. Tinh bột; 5. Tinh thể canxi oxalat; 6. Khí khổng 3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học 3.2.1. Định tính thành phần hóa học 3.2.1.1. Định tính saponin Phản ứng tạo bọt: Cho 5 ml nước cất và 0,1 g bột dược liệu vào ống nghiệm, lắc mạnh trong 5 phút, để yên trong 15 phút. Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút, thì dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính. Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có saponin. 3.2.1.2. Định tính glycosid tim Ngâm 10g bột dược liệu với 100ml nước, trong 24 giờ. Lọc lấy dịch chiết, loại tạp chất bằng chì acetat 30% vừa đủ (không còn tủa đục). Để lắng, lọc lấy dịch lọc vào bình gạn. Lắc kỹ 3 lần với 25ml cloroform (10ml, 10ml, 23
32. 5ml), để lắng, gạn lấy dịch chiết, lọc qua bông loại nước. Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm đã được sấy khô, đem cô cách thủy đến khô. Cắn thu được để làm phản ứng: - Phản ứng Liberman Cho 1ml anhydrid acetic vào ống nghiệm 1, lắc đều. Nghiêng ống 450, cho từ từ theo thành ống 1ml H2SO4 đặc. Quan sát nếu thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp xuất hiện vòng màu đỏ tím thì dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính. - Phản ứng Baljet Cho 0,5ml ethanol 90% vào ống nghiệm 2, lắc đều. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%), xuất hiện màu đỏ cam thì dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính (-). - Phản ứng Legal Thêm 0,5ml ethanol 90% vào ống nghiệm 3, lắc đều, cắn tan hết. Nhỏ 1 giọt dung dịch natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều, xuất hiện màu đỏ cam thì dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính(-). - Phản ứng Keller-Kiliani Hòa tan cắn còn lại bằng 0,5ml ethanol 90%. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic, lắc đều. Nghiêng ống 45o. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống nghiệm. Phản ứng dương tính khi giữa hai lớp chất lỏng có vòng màu đỏ. Kết quả: Phản ứng âm tính(-). Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có glycosid tim. 3.2.1.3. Định tính anthranoid Phản ứng Borntraeger: Đun sôi dược liệu trong 10ml H2SO4 1N. Để nguội, lọc qua giấy lọc, dịch lọc thu được cho vào bình gạn. Chiết bằng 10ml 24
33. cloroform, gạn lấy lớp cloroform vào ống nghiệm, cô bớt dung môi còn khoảng 1ml, thêm 1ml NaOH 10%, lắc nhẹ, xuất hiện màu đỏ sim thì dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính (-). Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có anthranoid. 3.2.1.4. Định tính flavonoid Đun cách thủy 0,5 g bột dược liệu trong 5 ml ethanol 90%, lọc nóng lấy dịch lọc đem làm phản ứng: - Phản ứng Cyanidin Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm một ít bột Mg (khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5) giọt. Để yên một vài phút, dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ, phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính. - Phản ứng với kiềm Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, hơ trên miệng lọ chứa amoniac đặc, màu vàng đậm lên so với tờ giấy lọc chỉ nhỏ giọt dịch chiết thì dương tính. Phản ứng với NaOH 10%: Cho dung dịch NaOH 10% vào ống nghiệm chứa 1ml dịch chiết, xuất hiện tủa vàng. Khi thêm 1ml nước cất, tủa tan, màu vàng của dung dịch tăng thêm thì dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính. - Phản ứng với FeCl3 Thêm vài giọt FeCl3 5% vào ống nghiệm chứa 1ml dịch chiết, dung dịch màu xanh đen - phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính. Kết luận: Mẫu nghiên cứu có flavonoid. 25
34. 3.2.1.5. Định tính coumarin Dịch lọc chuẩn bị như phần định tính flavonoid dùng làm các phản ứng: - Phản ứng mở đóng vòng lacton Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết: + Ống 1: thêm 0,5ml NaOH 10%. + Ống 2: để nguyên. Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội rồi quan sát: + Ống 1 không xuất hiện tủa vàng. + Ống 2 dung dịch vẫn trong. Thêm mỗi ống 1ml nước cất: + Ống 1: trong hơn. + Ống 2: có tủa đục. Thêm vài giọt HCl đặc, ống 1 trở về giống ống 2 thì dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính. - Phản ứng với thuốc thử diazo Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vào 2ml NaOH 10%. Đun cách thủy tới sôi, để nguội, thêm vài giọt thuốc thử diazo, thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch là dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính. Kết luận: Mẫu nghiên cứu có coumarin. 3.2.1.6. Định tính tanin Đun sôi 1 g bột dược liệu với 10 ml nước cất, để nguội, lọc. Cho vào mỗi ống 1 ml dịch lọc: - Ống 1: thêm 1 giọt FeCl3 5%, xuất hiện tủa màu xanh đen. - Ống 2: thêm 2 giọt đồng acetat 10%, xuất hiện tủa. 26
35. - Ống 3: thêm 2 giọt chì acetat 10%, xuất hiện tủa bông. - Ống 4: thêm 5 giọt gelatin 1%, xuất hiện tủa bông trắng. Kết quả: Phản ứng dương tính. Kết luận: Mẫu nghiên cứu có chứa tanin. 3.2.1.7. Định tính alcaloid Ngâm 1g dược liệu trong 15 ml dung dịch H2SO4 1N. Đun đến sôi, để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH 9-10. Chiết alcaloid base bằng cloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5 ml). Gộp các dịch chiết cloroform, loại nước bằng natrisulfat khan. Dịch chiết đem lắc với H2SO4 1N hai lần, mỗi lần 5 ml. Gộp các dịch chiết nước, chia đều mỗi ống 1 ml để làm các phản ứng: - Ống 1: nhỏ 2 -3 giọt TT Mayer, tủa màu trắng là dương tính. - Ống 2: nhỏ 2 - 3 giọt TT Bouchardat, tủa màu nâu là dương tính. - Ống 3: nhỏ 2 - 3 giọt TT Dragendorff, tủa màu da cam là dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính. Kết luận: Mẫu nghiên cứu có alcaloid. 3.2.1.8. Định tính đường khử, polysaccharid, acid hữu cơ Đun sôi 2g bột dược liệu với 20ml nước cất, trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch lọc dùng làm phản ứng sau: - Định tính đường khử: Thêm vào 5 giọt thuốc thử Fehling A và 5 giọt thuốc thử Fehling B vào ống nghiệm chứa 2 ml dịch lọc. Đun cách thủy 10 phút, nếu xuất hiện kết tủa đỏ gạch là dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính. - Định tính polysaccharid: + Ống 1: 4ml dịch chiết và 5 giọt TT Lugol. + Ống 2: 4ml nước cất và 5 giọt TT Lugol. 27
36. Quan sát: ống 1 màu xanh đậm hơn ống 2, phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính. - Định tính acid hữu cơ: Thêm một ít bột Na2CO3 vào ống nghiệm chứa 4ml dịch chiết, phản ứng dương tính khi có bọt khí bay lên. Kết quả: Phản ứng dương tính. Kết luận: Mẫu nghiên cứu có acid hữu cơ, không có đường khử, polysaccharid. 3.2.1.9. Định tính chất béo, sterol, caroten Ngâm 10 g bột dược liệu trong n-hexan để qua đêm. Lọc, thu lấy dịch lọc để làm phản ứng: - Định tính chất béo: nhỏ 2 giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ nóng bay hơi hết dung môi, nếu còn vết mờ trên giấy lọc thì dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính. - Định tính sterol: Cô cách thủy bốc hơi dung môi đến cắn. Thêm vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ; nghiêng ống 45 độ, nhỏ từ từ 3 giọt acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm, thấy mặt phân cách có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá thì dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính. - Định tính caroten: Cô cách thủy bốc hơi dung môi đến cắn. Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn. Dung dịch có màu xanh đậm thì dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính. Kết luận: Mẫu nghiên cứu có caroten, chất béo; không có sterol. Nhận xét: Kết quả thực nghiệm cho thấy: cây Thài lài trắng có các nhóm chất là flavonoid, tannin, alcaloid, coumarin, caroten, chất béo và acid hữu cơ. Kết quả định tính được trình bày ở bảng 3.1. 28
37. Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phương pháp hóa học của loài Commelina diffusa Thuốc thử và phản ứng TT Nhóm chất Kết quả Kết luận định tính 1 Saponin Phản ứng tạo bọt - Không có Phản ứng với thuốc thử + Mayer Phản ứng với thuốc thử 2 Alcaloid + Có Bouchardat Phản ứng với thuốc thử + Dragendorff 3 Anthranoid Phản ứng Borntrager - Không có Phản ứng với thuốc thử 4 Polysaccharid - Không có lugol Phản ứng Liebermann- - Burchardt 5 Glycosid tim Phản ứng Baljet - Không có Phản ứng Legal - Phản ứng Keller kiliani - Phản ứng với Cyanidin + Phản ứng với NH3 + 6 Flavonoid Có Phản ứng với NaOH 10% + Phản ứng với FeCl3 + Phản ứng đóng mở vòng 7 Coumarin +++ Có lacton 8 Tanin Phản ứng với FeCl3 5% + Có 29
38. Phản ứng với gelatin 1% + Phản ứng với chì acetat 10% +++ Phản ứng với đồng acetat +++ 10% 9 Caroten Phản ứng với H2SO4 +++ Có Phản ứng với thuốc thử 10 Đường khử - Không có Fehling 11 Chất béo Để lại vết mờ trên giấy lọc + Có Phản ứng với H2SO4/ 12 Sterol - Không có anhydrid acetic 13 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 + Có Chú thích: (-) âm tính, (+) dương tính (+++) dương tính rất rõ 3.2.2. Chiết xuất và phân lập hợp chất 3.2.2.1. Chiết xuất phân đoạn từ cây Thài lài trắng Mẫu thân và lá cây C. diffusa phơi sấy khô (1,0 kg) được ngâm chiết bằng dung môi EtOH 70% (3 lần, mỗi lần 6 L), sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40oC trong vòng 30 phút. Lọc các dịch chiết EtOH thu được qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 80 g cao chiết tổng ethanol. Lấy 60 g cao chiết phân tán trong nước cất (400 mL) và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 mL). Các dịch chiết n-hexan, EtOAc được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng n-hexan (20,8 g) và ethyl acetat (24,9 g). 30
39. Cây C.diffusa (1,0 kg) Chiết siêu âm ở 40oC Dung môi EtOH 70% trong 30 phút (6 L x 3 lần) Dịch chiết EtOH Lọc, cất thu hồi dung môi Cao chiết tổng EtOH (80 g) Lưu làm đối chiếu (20g) Dùng lắc các phân đoạn 1. Phân tán trong nước cất (400 mL) 2. Chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 mL) 3. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm Dịch chiết n-hexan (20,8 g) Dịch chiết ethyl acetat (24,9 g) Hình 3.6: Sơ đồ chiết xuất các hợp chất từ cây Thài lài trắng 3.2.2.2. Phân lập các hợp chất bằng sắc kí cột Tiến hành phân tách phân đoạn dịch chiết n-hexan (20,0 g) trên cột sắc ký silicagel (Φ85 mm × 90 mm) với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần bao gồm n-hexan : EtOAc (5:1 → 1:1, v/v, mỗi phân đoạn 500 mL) và tiếp sau là CHCl3 : MeOH (10:1 → 1:1, v/v, mỗi phân đoạn 500 mL) thu được 5 phân đoạn ký hiệu là T1 ~ T5. Từ phân đoạn T1 (5,4 g), chạy sắc ký cột silicagel (Φ45 mm × 350 mm) với hệ pha động CHCl3 : MeOH (10:1; 8:1; 6:1; 3:1, v/v, 2,5 L) thu được 4 phân đoạn nhỏ hơn là T1.1 ~ T1.4. Phân tách 31
40. phân đoạn nhỏ T1.1 (1,2g) bằng sắc ký cột pha thường sử dụng hệ dung môi rửa giải n-hexan : EtOAc (15:1, v/v, 1,2 L) thu được 1 hợp chất ký hiệu là TL1 (16 mg). Dịch chiết n-hexan (20,0 g) sắc ký silicagel (Φ85 mm × 90 mm) n- hexan : EtOAc (5:1 → 1:1, v/v, 500 mL) CHCl3 : MeOH (10:1 → 1:1, v/v, 500 mL) T1 (5.4g) T2 T3 T4 T5 Sắc ký cột silicagel (Φ45 mm × 350 mm) CHCl3 : MeOH (10:1; 8:1; 6:1; 3:1, v/v, 2,5 L) T1.1 (1.2 g) T1.2 T1.3 T1.4 Sắc ký cột pha thường n-hexan : EtOAc (15:1, v/v, 1,2 L) TL1 (16 mg) Hình 3.7: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cây Thài lài trắng 3.2.2.3. Kết quả xác định cấu trúc của hợp chất phân lập được Hợp chất TL1 (acid pimaric): Tinh thể hình kim 32
41. Rf = 0,5 (n-hexan : EtOAc = 4:1), Hiện màu xám với thuốc thử Vanilin/H2SO4 20 o o [α] D = + 87,3 (CHCl3, c 0,4) tnc = 217-219 C. ESI-MS m/z: 303,6 [M+H] + Công thức phân tử C20H30O2 (M=302) Hình 3.8: Cấu trúc hợp chất TL1 (acid pimaric) Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của hợp chất TL1 và hợp chất tham khảo (CTK) TL1 CTK TL1 CTK Vị trí DEPT δC δC δH[26] (ppm) δH[25,17] (ppm) C (ppm) (ppm) (Mult, J=Hz) (Mult,J=Hz) 1 CH2 38,3 38,4 2 CH2 18,2 18,3 3 CH2 37,1 37,1 4 C 47,3 47,2 5 CH 48,8 48,7 6 CH2 24,9 24,9 7 CH2 35,5 35,6 8 C 136,6 136,2 33
42. 9 CH 50,6 50,7 10 C 37,7 38,1 11 CH2 18,6 18,8 12 CH2 34,5 34,6 13 C 37,4 37,4 14 CH 129,1 129,3 5,23 (s) 5,22 (s) 15 CH 148,91 149,9 5,78 5,71 (dd, J=17,0; 10,5) (dd, J=17,0; 10) 16 CH2 110,2 110,5 4,91 4,91 (dd, J=17,0; 1,5) (dd, J=17,0; 1,7) 4,89 4,95 (dd, J=10,5; 1,5) (dd, J=10; 1,7) 17 CH3 26,0 26,2 1,05 (s) 1,04 (s) 18 C 184,9 185,3 19 CH3 16,8 16,8 1,22 (s) 1,21 (s) 20 CH3 15,2 15,3 0,85 (s) 0,84 (s) Chú thích: δH (Đo ở 500MHz trong CDCl3), δC (Đo ở 125MHz trong CDCl3), hợp chất tham khảo (CTK): acid pimaric Phổ 1H-NMR của hợp chất TL1 cho thấy một nhóm vinyl ở cuối mạch [δH 5,78 (1H, dd, J = 17,0, 10,5 Hz, H-15); 4,91 (1H, dd, J = 17,0, 1,5 Hz, H- 16a); 4,89 (1H, dd, J = 10,5, 1,5 Hz, H-16b); δC 148,9 (C-15); 110,2 (C-16), một proton của nhóm olefin bị thế ba lần ở δH 5,23 (1H, s, H-14); δC 136,6 (C-8); 129,1 (C-14)] và 3 nhóm methyl ở δH 0,85; 1,05; 1,22. Ngoài ra trên phổ 13C-NMR và HSQC cho thấy tín hiệu cộng hưởng của 20 carbon: 3 nhóm methyl (3×CH3), 8 nhóm methylene (7×CH2), 4 nhóm methine (3×CH) và 5 34
43. carbon bậc bốn (3×Cq), trong đó có 1 nhóm carboxyl ở δC 184,9. Bằng cách phân tích phổ và so sánh với các dữ liệu đã được công bố trước đó, đã khẳng định được hợp chất TL1 là một diterpenoid khung pimarane. Kết hợp dữ liệu phổ nêu trên với so sánh dữ liệu phổ của hợp chất acid pimaric đã công bố [26, 25, 17] có thể khẳng định hợp hợp chất TL1 chính là acid pimaric. 3.3. Bàn luận Trong quá trình thực nghiệm, đề tài đã sử dụng mẫu nghiên cứu là cây Thài lài trắng (Commelina diffusa Burm.F.) thu hái tại Tây Mỗ, quận Nam Từ Liêm, thành phố Hà Nội. Nghiên cứu này đã mô tả được tương đối đầy đủ và chi tiết đặc điểm thực vật của loài Commelina diffusa Burm.F. Các nét đặc trưng của thân, lá, hoa đã được chỉ ra, với những hình ảnh rõ ràng và dễ quan sát, trong khi các nghiên cứu trước đây mới chỉ được miêu tả bằng lời và hình vẽ. [9, 11] Ngoài ra, nghiên cứu cũng đã xác định được tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Commelina diffusa Burm.F. Kết quả đạt được trên đây sẽ giúp ích cho việc phân biệt loài Commelina diffusa Burm.F. với các loài khác trong chi Commelina L., là cơ sở cho mục đích nghiên cứu sâu hơn, góp phần xây dựng và hoàn thiện tiêu chuẩn của chuyên luận về dược liệu này trong Dược điển Việt Nam. Về đặc điểm thực vật, Commelina diffusa Burm.F. có những đặc điểm riêng biệt so với các loài khác như tràng hoa màu xanh khác với tràng hoa màu vàng của loài C. dielsii, lá màu xanh khác với lá có một đường màu tím chạy dọc theo mép của loài C. catharinensi hay rễ sợi khác với rễ củ ở loài C. tuberosa. [21] Nghiên cứu đã tiến hành phân tích đặc điểm vi phẫu, soi bột toàn cây. Kết quả cho thấy, các đặc điểm vi học của cây mang đặc điểm chung đặc trưng của thực vật Commelinaceae. Vi phẫu thân và lá đủ mỏng, bắt màu khá tốt để quan sát rõ các lớp tế bào trên kính hiển vi. Các hình ảnh về cấu tạo vi học của cây rất rõ nét, có những mức phóng đại khác nhau, có thể dùng làm tư liệu cho việc tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm xác định mẫu cây Thài lài trắng; 35
44. đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân biệt và so sánh các mẫu Thài lài trắng có trên thị trường, tránh dược liệu bị làm giả. Định tính các nhóm chất hữu cơ là một phương pháp có tính thuận tiện, nhanh chóng và giá thành hóa chất tương đối rẻ, giúp ích cho việc hiểu biết cơ bản về thành phần hóa học của cây. Kết quả định tính được một số nhóm chất có trong cây Thài lài trắng, thu hái từ thành phố Hà Nội phù hợp với các nghiên cứu trước đó tại Việt Nam và trên thế giới là: alcaloid, flavonoid, tannin, coumarin, caroten, chất béo và acid hữu cơ. Chiết xuất và phân lập: Phương pháp chiết xuất bằng EtOH và phân lập các chất bằng sắc ký cột được tham khảo từ các nghiên cứu trước đó. Ưu điểm là sử dụng dung môi rẻ tiền, dễ kiếm và ít độc. Kết quả phân lập được một chất là acid pimaric. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ cây Thài lài trắng. Acid pimaric một acid hữu cơ, thuộc nhóm acid nhựa. Kết quả phân lập phù hợp với kết quả định tính về sự có mặt của acid hữu cơ ở Thài lài trắng. Acid pimaric thường được tìm thấy nhiều trong nhựa thông. [39] Ngoài ra, nó còn xuất hiện trong một số loài cây khác như Aralia cordatac [36] và Dacrycarpus imbricatus. [17] Về tác dụng sinh học, acid pimaric ở loài Aralia cordatac đã được chứng minh là có khả năng ức chế sản xuất metalloproteinase-9 và ức chế sự di chuyển của tế bào cơ trơn động mạch chủ ở người (do yếu tố hoại tử khối u (TNF)-α gây ra). Từ đó, chất này cho thấy tiềm năng làm giảm nguy cơ xơ vữa động mạch ở người. [36] Vì vậy, chúng ta có thể nghiên cứu sâu hơn về tác dụng của acid pimaric ở C.diffusa. Tuy vậy, quá trình phân lập hiện chưa phát hiện thêm các thành phần điển hình khác được nhắc đến trong các nghiên cứu trước đó. Nguyên nhân có thể là thời điểm thu hái không phù hợp, điều kiện môi trường sống nhiều khác biệt hay do quá trình di thực nên làm cho hàm lượng hợp chất trong mẫu Thài lài trắng được nghiên cứu chỉ chiếm tỉ lệ thấp. Các nghiên cứu của đề tài chỉ mới là bước đầu, tạo tiền đề cho việc nghiên cứu sâu hơn về Thài lài trắng; bổ sung tư liệu cho việc sử dụng cây làm thuốc trong dân gian, cũng như phục vụ cho lĩnh vực kiểm nghiệm dược liệu sau này. 36
45. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau một thời gian thực hiện, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra và thu được một số kết quả như sau: - Đã mô tả được đặc điểm hình thái thực vật và xác định được tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Commelina diffusa Burm.F. - Đã mô tả được đặc điểm vi phẫu thân, lá và đặc điểm bột toàn cây của loài nghiên cứu, góp phần tiêu chuẩn hóa loài này. - Đã định tính và xác định được một số nhóm chất có trong mẫu cây Thài lài trắng (Commelina diffusa) là: alcaloid, flavonoid, tannin, coumarin, caroten, chất béo và acid hữu cơ. - Đã chiết xuất, phân lập bằng phương pháp sắc ký cột thu được 1 hợp chất có trong cây Thài lài trắng. - Đã xác định được cấu trúc hợp chất phân lập được: Thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ khối và phổ cộng hưởng hạt nhân, đã xác định được cấu trúc 1 hợp chất vừa phân lập được đó là: acid pimaric. Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu phân lập các chất để có thể xác định thêm các thành phần khác từ loài Commelina diffusa. - Thử đánh giá tác dụng sinh học của dịch chiết loài Commelina diffusa, cụ thể như tác dụng ổn định đường huyết, bảo vệ gan, kháng khuẩn, kháng nấm. 37
46. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bộ Y tế (2011), Dược liệu học I, Nxb. Y học, Hà Nội, tr. 111 - 494. 2. Đỗ Sĩ Hiến, Đỗ Thị Xuyến (2011), "Các loài thực vật được đồng bào dân tộc mường tại khu bảo tồn thiên nhiên hang kia - pà cò sử dụng làm thuốc trị bệnh thận", Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 4, tr. 1121 - 1125. 3. Hà Quang Thanh, Mai Thành Chung, Nguyễn Mai Trúc Tiên, Nguyễn Thị Thu Hương (2019), "Tác dụng bảo vệ gan của các cao chiết từ rau trai trên mô hình chuột tổn thương gan do ethanol", Tạp chí Dược liệu, 24(6), tr. 362 - 368. 4. Lê Bá Khoa (2014), "Thành phần loài và thảm thực vật ven sông vàm cỏ tây, tỉnh Long An", Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM, 61, tr. 60- 73 5. Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, Nxb. Y học Hà Nội, tr. 64 - 138. 6. Lê Xuân Đắc và cộng sự (2019), "Đánh giá hàm lượng 20- hydroxyecdysone các loài cây thuốc ở Vườn quốc gia Tam Đảo và vùng đệm Bản B", Tạp Chí Khoa học Và Công nghệ Việt Nam, 61(2), tr. 25-29. 7. Vũ Đức Lợi, Lê Thị Thu Hương (2017), Thực hành: Thực vật Dược liệu Dược học cổ truyền, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, tr. 24-32, 65-87. 8. Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr 13 - 20. 9. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam 3, NXB Trẻ, tr. 373. 10. Phạm Thị Kim Thoa, Nguyễn Thị Kim Yến (2014), "Đa dạng sinh học các loài rau rừng có giá trị tại khu dự trữ sinh quyển đảo cù lao chàm - thành phố Hội An", Khoa học Lâm nghiệp, 4, tr. 2968-2975. 11. Võ Văn Chi (1991), Cây thuốc An Giang, NXB. UBKH và KT, tr.455
47. Tiếng Anh 12. A. Frankova, L. Vistejnova, T. Merinas-Amo, Z. Leheckova, I. Doskocil, J. Wong Soon, T. Kudera, F. Laupua, A. Alonso-Moraga, L. Kokoska (2021), "In vitro antibacterial activity of extracts from Samoan medicinal plants and their effect on proliferation and migration of human fibroblasts", Journal of Ethnopharmacology, 264, tr.1-20. 13. Abraham Y Mensah, Peter J Houghton, Rita A Dickson, T C Fleischer, M Heinrich, P Bremner (2006), "In vitro evaluation of effects of two Ghanaian plants relevant to wound healing", Phytother Res, 20(11), tr. 941- 944. 14. Abraham Yeboah Mensah, Evelyn Afua Mireku, Aboagyewaa Oppong- Damoah and Isaac Kingsley Amponsah (2014), "Anti-inflammatory and antioxidant activities of Commelina diffusa (Commelinaceae)", World Journal of Pharmaceutical Sciences, 2(10), tr 1159-1165. 15. Burman, Nicolaas Laurens (1733-1793), Flora Indica: cui accedit series zoophytorum indicorum, nec non Prodromus Florae Capensis, 18, tr.303. 16. Cronquist, A (1981), Integrated System of Classification of Flowering Plants, Columbia University Press, New York, tr. 1101 - 1115. 17. Dang Viet Hau (2017), "Terpenoids from Dacrycarpus imbricatus", Vietnam Journal of Chemistry", Vietnamese International Edition, 55(6), tr. 734 - 737. 18. Ekeke Chimezie, Chinedum.A Ogazie (2018), "Phytochemical study on Commelina diffusa Burm", Nigerian Journal of life Science, 8(1), tr. 73-86. 19. Faden, Robert (1998) "Commelinaceae". The families and genera of vascular plants, 4, tr. 109–128. 20. Faden, Robert (2006), "Commelina", Flora of North America Editorial Committee, 22, tr. 5 - 25. 21. Gustavo Hassemer (2018), "Taxonomic and geographic notes on the neotropical Commelina (Commelinaceae)", Journal of Plant Taxonomy and Geography, 73(1), tr. 23-53.
48. 22. Holm LG, Plucknett DL, Pancho JV, Herberger JP (1977), The World's Worst Weeds. Distribution and Biology, University Press of Hawaii, USA. 23. Hong, Deyuan, DeFillipps, Robert A. (2000), "Commelina diffusa", Flora of China, 24, tr. 36. 24. Ji-Youn Youn, Hyo-Young Park, Kyung-Hea Cho (2003), " Anti- hyperglycemic activity of Commelina communis L.: inhibition of
    - glucosidase", Diabetes Research and Clinical Practice, tr.149–155. 25. José Graça, Sara Santos, Pedro Lamosa, José Rodrigues (2017), "A complex mixture of diterpenic acids and their 3 oxidation products from Pinus sylvestris resin 4 comparatively analyzed by GC-MS and NMR", Molecules, tr. 22. 26. Junichi Kitajima, Tetsuya Komori, Toshio Kawasaki (1982) "Studies on the constituents of the crude drug Fritillaria bulbus: III. On the diterpenoid constituents of fresh bulbs of Fritillaria thunbergii Miq.", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 30(11), tr. 3912-3921. 27. Kamble SA (2019), "Nutraceutical investigations of Commelina diffusa Burm f. leaves –A popular wild vegetable", Plantae Scientia, 2(3), tr. 34-39. 28. M.AZavalaa, S Péreza, C Péreza, R Vargasa R.MPérezb (1998), "Antidiarrhoeal activity of Waltheria americana, Commelina coelestis and Alternanthera repens", Journal of Ethnopharmacol, 61(1), tr. 41-47. 29. Malarvizhi D, Karthikeyan AVP, Sudan I and Satheeshkumar R (2019), "Phytochemical analysis of Commelina diffusa Burm. F. through GC-MS method", Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 8(1), tr. 376-379. 30. Marco Octávio de Oliveira Pellegrini, Rafaela Campostrini Forzza, (2017), "Synopsis of Commelina L. (Commelinaceae) in the state of Rio de Janeiro, reveals a new white-flowered species endemic to Brazil", PhytoKeys, 78, tr. 59-81. 31. Md. Ahad Ali Khan & Md. Torequl Islam & Samir Kumar Sadhu, (2011), "Evaluation of phytochemical and antimicrobial properties of Commelina diffusa Burm. f.", Oriental Pharmacy and Experimental Medicine, 11(4), tr. 235-241.
49. 32. Pritesh Ranjan Dash, Md Sohel Rana, Mohammad Shawkat Ali, (2015), "Investigation of analgesic and cytotoxic activities of ethanol extract of Commelina appendiculata", Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 4(3), tr. 53-59 33. Proma Roy Orni, Hosne Jahan Shetu, Tanzim Khan, Sadman Sakib Bin Rashed, Pritesh Ranjan Dash (2018), "A comprehensive review on Commelina benghalensis L. (commelinaceae)", International Journal of Pharmacognosy, 5(10), tr. 637-45. 34. Rubina Ahem Mou (2017), Phytochemical and Biological Investigation of Commelina diffusa, BRAC University, Dhaka, tr. 17- 32. 35. Samir M.HamadabSarbast A.MahmudcS. MohammadSajadiaZagros A.Omara (2019), "Biosynthesis of Cu/ZrO2 nanocomposite using 7-hydroxy- 4´-methoxy-isoflavon extracted from Commelina diffusa and evaluation of its catalytic activity", Surfaces and Interfaces, 15, tr. 125-134. 36. Seok-Jong Suh (2012), "Pimaric acid from Aralia cordata has an inhibitory effect on TNF-α-induced MMP-9 production and HASMC migration via down-regulated NF-κB and AP-1", Chemico-Biological Interaction, 199(2), tr. 112-119. 37. Tania Sultana, Md. Abdul Mannan (2018), "Evaluation of central nervous system (CNS) depressant activity of methanolic extract of Commelina diffusa Burm. in mice", Clinical Phytoscience, 4(5), tr 1-7. 38. Xiao PG (2003), New Edited Records of Traditional Chinese Medicine, Chemical Industry, Beijing, tr. 86 - 160 39. Xosé López-Goldar ,Lina Lundborg,Anna Karin Borg-Karlson,Rafael Zas,Luis Sampedro (2020), "Resin acids as inducible chemical defences of pine seedlings against chewing insects", Plos one, 15(5), tr. 1-18 40. ya zhi cao shu (2000), Flora of China , 24, tr. 35–38. Website 41. ngày truy cập: 9/11/2020 42. ngày truy cập: 10/11/2020
50. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phiếu giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu Phụ lục 2: Phổ 1H-NMR của hợp chất TL1: acid pimaric Phụ lục 3: Phổ 13C-NMR của chất TL1: acid pimaric Phụ lục 4: Phổ HSQC của hợp chất TL1: acid pimaric