Khóa luận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Qua lâu trứng (Trichosanthes ovigera Blume)

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Qua lâu trứng (Trichosanthes ovigera Blume)

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC –––––––––––––––––––––– NGUYỄN NGỌC ANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY QUA LÂU TRỨNG (Trichosanthes ovigera Blume) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2021
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC –––––––––––––––––––––– NGUYỄN NGỌC ANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY QUA LÂU TRỨNG (Trichosanthes ovigera Blume) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH. 2016.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS.TS. VŨ ĐỨC LỢI HÀ NỘI – 2021
3. LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn PGS .TS. Vũ Đức Lợi – Chủ nhiệm Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khoá luận này. Bên cạnh đó, thầy còn truyền dạy cho em những kỹ năng, kiến thức và bài học kinh nghiệm quý giá trong cuộc sống. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các giảng viên thuộc Bộ môn Dược liệu và Dược cổ truyền của Trường đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội; các cán bộ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, giúp em rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận. Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, các thầy cô ở Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền nói riêng, các thầy cô giảng dạy tại Trường đại học Y Dược nói chung đã dạy dỗ, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại đây. Nghiên cứu này đã được hỗ trợ kinh phí thực hiện từ đề tài cấp ĐHQGHN, mã số: QG.20.81 do PGS.TS. Vũ Đức Lợi là chủ trì đề tài. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè những người đã luôn theo sát động viên, quan tâm và tạo điều kiện giúp con có thể hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Ngọc Anh
4. DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT STT Ký hiệu Ý nghĩa 1  (ppm) Độ dịch chuyển hóa học 2 d Doublet 3 dd Doublet of doublets 4 ddd Doublet of doublet of doublets 5 s Singlet 6 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 7 1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton . 8 DEPT Phổ DEPT 9 ESI-MS Phổ khối ion hóa phun mù điện tử 10 EtOAc Ethyl acetate 11 EtOH Ethanol 12 NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 IC50 Nồng độ ức chế 50% (Half maximal inhibitory concentration). 14 DPPH Phương pháp xác định khả năng quét gốc tự do 15 ABTS+ Phương pháp xác định khả năng quét gốc tự do 16 FRAP Xét nghiệm tác động chống oxy hóa khử sắt
5. DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Phân bố các loài thuộc chi Trichosanthes ở Việt 4 Nam Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng 30 phương pháp hóa học của loài Trichosanthes ovigera Blume Bảng 3.2 Số NMR của hợp chất QL1 và chất tham khảo [37] 34
6. DANH MỤC HÌNH ẢNH STT Tên hình vẽ Trang Hình 1.1 Đặc điểm thực vật một số loài thuộc chi Trichosanthes ở 5 Việt Nam Hình 1.2 Hình ảnh vi phẫu hạt của loài 7 Trichosanthes ovigera Blume Hình 1.3 Hình vẽ mô tả cây Qua lâu trứng 8 Hình 1.4 Công thức cấu tạo các hợp chất phân lập từ cây 10 Trichosanthes ovigera Blume Hình 3.1 Hình ảnh các đặc điểm chi tiết của cây Qua lâu trứng 20 Hình 3.2 Đặc điểm cấu tạo vi phẫu thân của loài Trichosanthes 21 ovigera Blume Hình 3.2 Đặc điểm vi phẫu lá của loài Trichosanthes ovigera Blume 22 Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu bột thân 23 Hình 3.5 Đặc điểm vi phẫu bột lá 23 Hình 3.6 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Qua lâu trứng 32 Hình 3.7 Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat 33 Hình 3.8 Cấu trúc hóa học hợp chất QL1 36
7. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi Trichosanthes 3 1.1.1. Vị trí phân loại chi Trichosanthes 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Trichosanthes 3 1.1.3. Thành phần hóa học của chi Trichosanthes 6 1.2. Tổng quan về loài Qua lâu trứng 6 1.2.1. Đặc điểm thực vật 6 1.2.2. Đặc điểm phân bố 8 1.2.3. Thành phần hóa học 8 1.2.4. Tác dụng sinh học 12 1.2.5. Công dụng theo y học cổ truyền 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.1. Nguyên liệu 14 2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật 15 2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu về đặc điểm thực vật 16 2.3.2. Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ 17
8. 2.3.3. Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất 17 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1. Kết quả mô tả đặc điểm thực vật của cây Qua lâu trứng 19 3.1.1. Mô tả đặc điểm hình thái của Qua lâu trứng 19 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu thân 20 3.1.3. Đặc điểm vi phẫu lá 21 3.1.4. Đặc điểm bột dược liệu 22 3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học trong lá cây Qua lâu trứng 24 3.3. Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất 31 3.3.1. Chiết các phân đoạn từ lá cây Qua lâu trứng 31 3.3.2. Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột 32 3.3.3. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 33 3.4. Bàn luận 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
9. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, cùng với sự đa dạng về địa hình đã tạo nên cảnh quan thiên nhiên và thảm thực vật vô cùng phong phú. Nó giúp mang lại tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc nói riêng cùng với tài nguyên dược liệu nói chung. Theo thống kê được công bố có khoảng 12.000 loài thực vật, trong đó đã điều tra được 3.850 loài được sử dụng làm thuốc thuộc 309 họ [12]. Đa phần các cây mọc tự nhiên và chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, có hệ thống về mặt khoa học, cũng như hoạt tính sinh học. Từ xa xưa, nhân dân ta sớm phát hiện ra những vị thuốc có nguồn gốc khác nhau có thể từ thực vật, động vật hay khoáng vật và tích lũy riêng cho mình hệ thống các tri thức quý báu, đặc biệt là kinh nghiệm sử dụng cây cỏ để làm thuốc. Trên thế giới, chi Trichosanthes (họ Cucurbitaceae) bao gồm hơn 90 loài [2] chủ yếu sống ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chi này phân bố trải dài từ Ấn Độ khắp châu Á đến Đài Loan, tại các khu vực cụ thể Pakistan, Ấn Độ, Srilanca, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Malaysia, Australia, [6, 20]. Ở Việt Nam chi Trichosanthes được thống kê với 12 loài [8] có nhiều ở địa phương: Cao Bằng, Lào Cai, Hòa Bình, Ba Vì, Ninh Thuận, và một số tỉnh khác. Cây Qua lâu trứng (Trichosanthes ovigera Blume) thuộc chi Trichosanthes của họ Cucurbitaceae [9]. Ở Việt Nam, cây thường mọc chủ yếu trên đất rừng, ở vùng núi cao: từ Lào Cai đến Di Linh [2, 9]. Một số nghiên cứu trên thế giới ghi nhận loài này có tác dụng: gây độc tế bào ung thư [17, 26], chống oxy hóa [32], chống viêm [15, 36]. Trong y học cổ truyền một số nước, T. ovigera được dùng để chữa ho, vàng da, tiêu sưng, thanh nhiệt, nhuận táo [2, 22]. Tuy nhiên, những nghiên cứu về loài này ở cả Việt Nam và thế giới còn khá ít, mới chỉ có những mô tả sơ lược về hình thái thực vật, chưa có tài liệu nào nghiên cứu chi tiết về đặc điểm hình thái, thành phần hóa học và tác dụng 1
10. sinh học của cây. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Qua lâu trứng (Trichosanthes ovigera Blume)” được thực hiện với mục tiêu: 1. Nghiên cứu được đặc điểm thực vật và xác định được tên khoa học của mẫu cây Qua lâu trứng. 2. Định tính được các nhóm chất có trong lá cây Qua lâu trứng. 3. Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của một số hợp chất từ lá cây Qua lâu trứng. 2
11. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi Trichosanthes 1.1.1. Vị trí phân loại chi Trichosanthes Dựa theo hệ thống phân loại thực vật APG IV (2016) [35], vị trí phân loại chi Trichosanthes được tóm tắt như sau: Giới Thực vật: Plantae Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta Lớp Ngọc Lan: Magnoliopsida Phân lớp Hoa Hồng: Rosidae Bộ Bầu bí: Cucurbitales Họ Bầu bí: Cucurbitaceae Chi: Trichosanthes 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Trichosanthes Trichosanthes là chi lớn nhất trong họ Cucurbitaceae, với hơn 90 loài [20]. Chúng sống chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, được biết đến với nhiều loài có công dụng chữa bệnh, đặc biệt là các bệnh hiểm nghèo như bệnh tiểu đường và ung thư [5]. Trên thế giới chi Qua lâu hầu hết là dạng cây leo thân cỏ hay hoá gỗ, sinh trưởng lâu năm hoặc hàng năm với trung tâm đa dạng ở Đông Nam Á nhưng trải dài từ Ấn Độ khắp châu Á đến Đài Loan, tại các khu vực cụ thể: Pakistan, Ấn Độ, Srilanca, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Malaysia, Australia [6, 20]. Trong hệ thực vật Việt Nam, theo Nguyễn Hữu Hiến (Danh mục các loài thực vật Việt Nam, 2005) chi Qua lâu hiện đã thống kê được 12 loài [8]. 3
12. Bảng 1.1: Phân bố các loài thuộc chi Trichosanthes ở Việt Nam Tên thường gọi Tên khoa học Phân bố Mướp tây Trichosanthes anguina L Hà Giang, Khánh Hoà, Đồng Nai, Hồ Chí Minh Qua lâu Ba Vì Trichosanthes baviensis Ba Vì (Hà Nội) Gagnep. Dưa núi Trichosanthes cucumerina L Đồng Nai đến An Giang Qua lâu nhiều lá T.fissibracteata C.Y.Wu ex Các tỉnh phía Bắc bắc Cheng&Yueh Qua lâu nhân Trichosanthes kirilowii Maxim Bắc Bộ, Ninh Thuận, Bình Thuận Qua lâu lá bắc Trichosanthes laceribractea Các tỉnh phía Bắc đều Hayata Qua lâu trứng Trichosanthes ovigera Blume Cao Bằng, Lào Cai, Hòa Bình, Ninh Thuận, Qua lâu chân vịt Trichosanthes pedata Merr. & Quảng Ninh Chun Qua lâu pierre Trichosanthes pierrei Gagnep Bà Rịa - Vũng Tàu Qua lâu hoa đỏ Trichosanthes rubriflos Thorel Khắp nơi & Cayla Lâu xác Trichosanthes tricuspidata Khắp nơi Lour Dây đỏ mỏ Trichosanthes villosa Blume Lào Cai, Ninh Bình, Kon Tum, Lâm Đồng, Bình Phước Các loài thuộc chi Qua lâu thường là cây hàng năm, thân leo cỏ hoặc thân leo gỗ, leo nhờ tua cuốn đính ở gốc lá. Tua cuốn đơn hoặc phân nhánh. Lá mọc cách, xếp xoắn, có cuống lá, không có lá kèm. Lá có thể là lá đơn hoặc lá kép hình chân vịt (3-7 lá chét). Bề mặt lá thường có lông hoặc nhẵn. Hoa đơn tính mọc ở nách lá. Hoa đực thường tập trung thành chùm. Hoa cái thường đơn độc, bộ nhị cái 3 lá noãn hợp, bầu dưới 3 ô. Thụ phấn nhờ côn trùng. Quả mọng, nạc, hình cầu đến hình thoi dài. Hạt thường dẹt và dài [5]. 4
13. Dưới đây là hình ảnh một số loài Trichosanthes tìm thấy ở Việt Nam: Trichosanthes anguina L. Trichosanthes baviensis G Trichosanthes rubriflos Trichosanthes kirilowii Maxim Trichosanthes pedata Merr. & Chun Trichosanthes ovigera Blume Hình 1.1. Đặc điểm thực vật một số loài thuộc chi Trichosanthes ở Việt Nam 5
14. 1.1.3. Thành phần hóa học của chi Trichosanthes Theo những công trình đã được công bố về thành phần hóa học các loài thuộc chi Trichosanthes cho thấy thành phần hóa học rất đa dạng với hơn 130 hợp chất. Bên cạnh các chất quen thuộc như: hợp chất steroid, flavonoid, lignan, các hợp chất có nitơ, còn xuất hiện chất có tính đặc trưng cho chi Trichosanthes như triterpenoid, các hợp chất khung cucurbitane [3]. Hợp chất phân lập từ các loài thuộc chi Trichosanthes có một số hoạt tính đáng quan tâm như gây độc tế bào ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hoá, Trong đó, nổi bật là hoạt tính gây độc tế bào ung thư với khả năng ức chế mạnh trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau. Hầu hết các loài trong chi Trichosanthes đều được sử dụng trong y học cổ truyền để chữa nhiều bệnh và nhóm bệnh khác nhau như bệnh về đường tiêu hóa, ung nhọt, nóng trong người, các bệnh ngoài da Hạt (qua lâu nhân), vỏ quả (qua lâu bì), rễ củ (thiên hoa phấn hay qua lâu căn) của loài này đều là những vị thuốc trong Y học cổ truyền [10]. Ở Việt Nam, chi này có 1 loài có tên khoa học là Trichosanthes ovigera Blume hay Trichosanthes cucumeroides (Ser.) Maxim, được gọi là cây Qua lâu trứng hay Hoa bát. Cây mọc chủ yếu trên đất rừng, ở vùng núi cao 2000m: từ Lào Cai đến Di Linh [2, 9]. 1.2. Tổng quan về loài Qua lâu trứng 1.2.1. Đặc điểm thực vật Tên khoa học: Trichosanthes ovigera Blume hay Trichosanthes cucumeroides (Ser.) Maxim [19]. Tên Việt Nam: Qua lâu trứng hay Hoa bát [2]. Họ Bầu bí: Cucurbitaceae [9]. Cây thân cỏ leo, mảnh, có rãnh, có lông. Cuống lá 4-12 cm, có khía, lông tơ dày; phiến lá đa dạng, dài: 7-19 × rộng: 7-8 cm, mỏng , không có lông hoặc 6
15. rất ngắn, 3 thùy hoặc 3-5 thùy đến giữa hoặc đến gốc; thùy trung bình hình trứng, thuôn dài, hoặc dạng trứng ngược (đầu nhỏ ở phía cuống lá). Mặt dưới lá có lông sát dày, lông tơ rất ngắn; ở mặt trên, mép lá có răng cưa thưa, đỉnh nhọn [9, 14]. Hoa đực mọc thành chùm, có chiều dài 10-26 cm, có vân, lông ngắn. Lá bắc có hình cây thương hoặc dạng mác ngược, kích thước 1,6 × 0,5-0,6 cm, thon dần về phía gốc, mép lá dạng tam giác, có răng cưa, đỉnh nhọn. Đài hoa ống hình trụ, hơi giãn ở đỉnh, chiều dài khoảng 5 cm, phân đoạn hình tam giác hình trứng, 7-10 × 2-3 mm, tất cả các cạnh. Hoa cái mọc đơn độc, cọng dài 2-3cm, có vân, có lông tơ dày, ống hình trụ, 2-5 × 0,2-0,3 cm, nhẵn hoặc có lông tơ; bầu (nhụy hoa) 1-1,5 × 0,3-0,5 cm. Mùa hoa là từ tháng năm đến tháng chín [9, 14]. Quả hình trứng hoặc thuôn dài, 5-7 × 2,5-4 cm, nhẵn, gốc tròn, đỉnh nhọn. Hạt (T. ovigera) màu nâu sẫm, gần giống tứ giác với các góc tròn, kích thước hạt 6-8 x 5-9 x 3-5 mm, được bao quanh bởi hai đường vân dày theo chiều dọc, dày gần tâm, 3 buồng, 2 buồng bên trống. Mùa trái cây là tháng chín đến tháng mười hai [13, 14]. Hình 1.2. Hình ảnh vi phẫu hạt của loài Trichosanthes ovigera Blume [16] Chú thích: G. Hạt, eps. Biểu bì hạt, epl. Tế bào lớn của biểu bì, hs. Lớp dưới da của hạt, iz. Khu vực bên trong, emb. Phôi. 7
16. Hình 1.3. Hình vẽ mô tả cây Qua lâu trứng Chú thích: A. Cây Qua lâu trứng, B. Hoa, C. Hạt, D. Quả. 1.2.2. Đặc điểm phân bố Trên thế giới, cây Qua lâu trứng mọc dọc theo thung lũng, trên sườn núi: 700-2500 m (Quảng Đông, Quảng Tây, Quý Châu, Vân Nam) Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản, Nepal, Thái Lan, Việt Nam. Ở Việt Nam, cây mọc trên đất rừng, bên khe hay mé đường vùng núi từ Lào Cai đến Di Linh và cũng mọc trên đất cát hoang ở Ninh Thuận, Bình Thuận [2, 9, 14]. 1.2.3. Thành phần hóa học Qua các tài liệu thu thập được, thành phần hóa học của loài Qua lâu trứng ở các bộ phận khác nhau chứa một số nhóm chất được nghiên cứu như: triterpenoid, steroid, flavonoid, lignan, chất béo, protein, các hợp chất có nitơ và một số hợp chất khác [2, 18, 21, 23, 38]. 8
17. Năm 2002, từ phần trên mặt đất của cây Qua lâu trứng thu hái tại thành phố Hachioji ở Nhật Bản, Zhimao Chao và các cộng sự đã phân lập và xác định được 4 hợp chất steroid bao gồm [38]: - stigmastanol (1) - stigmast-7-en-3β-ol (2) - stigmasta-7,22-dien-3β-ol (3) - stigmastane-3β,6α-diol (4). Kết quả nghiên cứu của Du Jing và các cộng sự (2017) cho thấy các thành phần chính của quả, hạt và rễ trong cây T.ovigera được phân tích tương ứng bằng phương pháp micro-kjeldahl, chuẩn độ acid-base, phương pháp chiết xuất soxhlet, đo màu anthrone, v.v. Kết quả cho thấy chất béo và protein trong hạt có thể đạt lần lượt là 29,93 g/100 g và 31,75 g/100 g. Protein trong quả có thể đạt 40,21 g/100 g. Hàm lượng flavonoid và polyphenol của rễ có thể lên đến 156,58 mg/100 g và 113,035 mg/100 g [18]. Từ rễ tươi của T.ovigera nhà khoa học ở Nhật đã tìm ra ba glycosid triterpenoid mới có vị đắng thu được cùng với metyl palmitat, acid palmitic, α-spinasterol, stigmast-7-en-3β-ol, α-spinasterol-3-O-β-D-glucopyranosid, stigmast-7-en-3β-ol 3-O-β-D-glucopyranosid và acid vanillic [23]. Năm 2020 Jing Chen và các cộng sự đã nghiên cứu phân lập thành công một tritepenoid mới và chín hợp chất đã biết từ T.ovigera được thu hái từ tỉnh Hồ Bắc, Trung Quốc bao gồm [21]: - β-[(E)-Caffeoyloxy]-D:C-Friedooleana-7,9(11)-dienAxit 29-oic (5) - Cucurbitacin B (6) - 23,24-Dihydrocucurbitancin B (7) - 23,24-Dihydrocu-curbitacin D (8) - Cucurbitacin D (9) 9
18. - Cucurbalsaminol A (10) - 3-epi-Isocucurbitacin D (11) - Curbitacin G (12) - Cucurbitacin J (13) - Cucurbitacin I (14) Một số công thức hóa học của các hợp chất có trong các bộ phận của cây Qua lâu trứng được trình bày ở hình 1.4. (1) (2) (3) (4) (5) (6) 10
19. (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) Hình 1.4. Công thức cấu tạo các hợp chất phân lập từ cây Trichosanthes ovigera 11
20. 1.2.4. Tác dụng sinh học 1.2.4.1. Tác dụng gây độc tế bào ung thư Năm 1995, Liang Rongneng và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bằng cách tinh chế và xác định hóa học, một thành phần hoạt động chính trong T. ovigera có hoạt tính chống ung thư mạnh mẽ. Nó thuộc về một họ hợp chất được gọi chung là cucurbitacin. Kết quả cho thấy cucurbitacin từ T.ovigera đặc biệt hiệu quả chống lại các tế bào ung thư biểu mô vòm họng (NPC) trong ống nghiệm. Khi nồng độ cucurbitacin là 20 g/ml, tỷ lệ gây độc tế bào là 82,6%. Nếu nồng độ đã được nâng lên đến 80 g/ml tỷ lệ gây độc tế bào là 94,1% [26]. Năm 1990, Khoa sinh học của Đại học Tế Nam, Trung Quốc đã tiến hành nghiên cứu với hai loại glycoprotein từ rễ củ của cây Qua lâu trứng được phân lập bằng cách kết tủa phân đoạn với axeton. Glycoprotein acid cho thấy 58% tác dụng tiêu diệt tế bào ung thư phổi. Kết quả nghiên cứu chỉ ra với liều lượng 105μg/ml có hiệu quả tiêu diệt ung thư phổi lên đến 74,2% [17]. 1.2.4.2. Tác dụng chống oxy hóa Để nghiên cứu hoạt động chống oxy hóa của polysaccharid và các phân đoạn hóa học phân cực khác nhau của chiết xuất từ cây T.ovigera. Năm 2015, các nghiên cứu của Trường cao đẳng y tế quốc gia Youjiang, Baise, Quảng Tây đã đánh giá bằng xét nghiệm quét gốc tự do DPPH, và xét nghiệm gốc tự do hydroxyl (OH-), gốc muối diammonium (ABTS+) và xét nghiệm tác động chống oxy hóa khử sắt (FRAP). Kết quả nghiên cứu chứng minh polysaccharides và các phân đoạn hóa học phân cực khác nhau được chiết xuất từ T.ovigera có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn polyphenol trong lá trà [31, 32]. 12
21. 1.2.4.3. Tác dụng chống viêm Tại hội nghị Y học cổ truyền Quốc tế lần thứ 3, Chao Zhimao đã công bố nghiên cứu chứng minh Triterpenes và mười hợp chất đã biết từ hạt của T.ovigera có tác dụng chống viêm và long đờm [15]. Năm 2003, Tang Chunfeng đã có nghiên cứu về các thành phần triterpenoids và sterol trong hạt Qua lâu trứng và chứng minh tác dụng chống viêm của nó được đăng trên tạp chí Quốc tế về Y học cổ truyền Trung Quốc [36]. 1.2.5. Công dụng theo y học cổ truyền • Tính vị: vị đắng, tính hàn [2]. • Quy kinh: quy vào kinh phế, vị, đại tràng • Tác dụng và công dụng: Theo y học cổ truyền T.ovigera được dùng làm thuốc, rễ củ có tác dụng thanh nhiệt giáng hỏa, lợi tiểu tiêu sưng, tán ứ huyết giảm đau, dùng chữa nhiệt độc, di mộng tinh, nhuận táo, tiểu tiện khó, viêm amidan cấp tính, viêm họng hạt và các chứng khác. Hạt có tác dụng thanh nhiệt, bồi bổ cơ thể, tiêu trừ huyết ứ, thông sữa, chữa bệnh thủng phổi, nôn mửa, kiết lỵ, ruột gió ra máu. Ở Trung Quốc quả của cây Qua lâu trứng còn có công dụng chữa ho, tiểu đường, vàng da, [2, 22]. 13
22. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu Cây Qua lâu trứng có hoa được thu hái tại xã Phú Vinh, huyện Tân Lạc, tỉnh Hòa Bình tháng 12 năm 2020. Mẫu thực vật đã được ThS. Nguyễn Thúc Thu Hương, giảng viên Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Trường đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội giám định tên khoa học là Trichosanthes ovigera Blume họ Cucurbitaceae (Phiếu giám định số UMP - 112021). Mẫu tươi gồm cả cây lá và hoa. 2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất - Hóa chất dùng trong tẩy nhuộm vi phẫu: nước javen, cloranhydrat, acid acetic, xanh metylen, đỏ carmin và nước cất. - Các hóa chất dùng để định tính: H2SO4 1N, NH3, NaOH 10%, Mg, HCl, FeCl3 5%, Na2CO3, thuốc thử Liebermann, Baljet, Legal, Mayer, Bouchardat, Dragendorff, Fehling A, B, - Các dung môi dùng để chiết xuất và phân lập: ethanol (EtOH) 70%, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), chloroform (CHCl3), methanol (MeOH), nước cất đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết. - Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột: silica gel pha thường (Merck) cỡ hạt 0,063–0,200 mm và cỡ hạt 0,040–0,063 mm. 2.1.2.2. Trang thiết bị - Kính hiển vi có gắn camera tại Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Trường đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. - Sắc ký cột: sử dụng silicagel cỡ hạt 0,063-0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040-0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký kích cỡ khác nhau. - Độ quay cực: đo trên máy PLR-4, MRC scientific instruments, Trường 14
23. đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. - Nhiệt độ nóng chảy: Đo trên máy SMP10 BioCote tại Trường đại học Y Dược, ĐHQGHN. - Phổ khối ESI-MS: Đo trên máy Agilent 1100 LC/MSD tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR: Được ghi trên máy Bruker AVANCE 500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Dụng cụ thí nghiệm: cốc có mỏ, bình nón, bình chiết, pipet, ống đong, ống nghiệm, thuộc Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Trường đại học Y Dược, ĐHQGHN. - Các thiết bị khác: cân phân tích, máy cô quay chân không, tủ sấy, tủ hút, tại Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Bộ môn Bào chế và Công nghệ Dược phẩm, Trường đại học Y Dược, ĐHQGHN. 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật - Mẫu cây Qua lâu trứng sau khi thu hái xử lý sơ bộ, tiến hành phân tích, mô tả các đặc điểm hình thái đặc trưng của loài, giám định tên khoa học. - Nghiên cứu, mô tả đặc điểm bột và vi phẫu thân, lá của cây Qua lâu trứng. 2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học - Định tính các nhóm chất trong lá cây Qua lâu trứng bằng các phản ứng hóa học. - Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của một số hợp chất có trong lá cây Qua lâu trứng. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 15
24. Mẫu dược liệu gồm dược liệu tươi và dược liệu đã phơi khô sau khi thu hái. Dược liệu được bảo quản như sau: Mẫu dược liệu cắt làm vi phẫu là mẫu tươi, sau khi có mẫu tiến hành làm ngay. Trường hợp chưa thể làm kịp thì tiến hành bảo quản mẫu trong hỗn hợp cồn : nước (1:1). Mẫu dược liệu dùng để soi bột được sấy khô, nghiền thành bột, bảo quản trong lọ có nút kín, có ghi nhãn và để nơi khô ráo. Mẫu dược liệu dùng để định tính, chiết xuất, phân lập, nhận dạng cấu trúc hóa học được sấy ở nhiệt độ <50oC trong tủ sấy, bảo quản trong túi ni lông kín, để nơi khô ráo, tránh ánh sáng mặt trời. 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu về đặc điểm thực vật 2.3.1.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái - Phân tích hình thái thực vật: mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp mô tả phân tích. - Làm tiêu bản mẫu khô theo phương pháp làm tiêu bản cây khô. - Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu: đối chiếu đặc điểm mô tả được với đặc điểm thực vật đã được công bố trong các tài liệu [8, 13, 14, 16] về loài T.ovigera. 2.3.1.2. Nghiên cứu đặc điểm vi học Nghiên cứu đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu theo tài liệu [4, 7, 11] cụ thể: mẫu sau thu hái được đem xử lý theo phương pháp thích hợp rồi tiến hành nghiên cứu. - Đặc điểm vi phẫu: + Chọn mẫu có kích thước lá và thân thích hợp. 16
25. + Cắt mẫu làm tiêu bản: tiêu bản vi phẫu thân được cắt ngang ở đoạn thân thứ 4 tính từ đầu cành. Tiêu bản vi phẫu lá được cắt ngang ở vị trí khoảng 1/4-1/3 từ dưới gần gốc của lá trưởng thành. + Xử lý lát cắt: chọn những lát cắt mỏng đem nhuộm và làm tiêu bản vi phẫu theo quy trình chuẩn [11]. + Quan sát, mô tả và chụp ảnh: quan sát các đặc điểm vi phẫu, chụp ảnh bằng kính hiển vi có gắn camera tại Bộ môn Dược liệu và Dược cổ truyền, Trường đại học Y Dược, Đại học quốc gia Hà Nội. - Đặc điểm bột dược liệu: + Mẫu nghiên cứu được sấy khô, nghiền thành bột. + Quan sát trực tiếp, nếm, gửi, xác định màu, mùi, vị. + Làm tiêu bản bột dược liệu bằng phương pháp giọt ép, quan sát, mô tả và chụp ảnh những đặc điểm điển hình của bột trên nền kính hiển vi có gắn camera. Ảnh các đặc điểm bột được đưa vào máy tính sau đó ghép thành ảnh hoàn chỉnh. 2.3.2. Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ Nguyên liệu nghiên cứu là lá cây Qua lâu trứng đã được phơi sấy khô và bảo quản. Chiết xuất lấy dịch chiết bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau (nước, ethanol, n-hexan ), sau đó xác định sơ bộ một số nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học thích hợp, theo quy trình chuẩn ghi trong tài liệu [1, 11]. 2.3.3. Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất 2.3.3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất Lá cây Qua lâu trứng được thu hái, rửa sạch, phơi khô, ngâm chiết 3 lần, mỗi lần 4L bằng dung môi EtOH 70%, sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40oC 17
26. trong vòng 30 phút. Lọc các dịch chiết EtOH qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu cao chiết tổng ethanol. Phân tán cao chiết này trong nước cất và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc (mỗi dung môi 3 lần). Các dịch chiết n-hexan, EtOAc được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng. Sử dụng các phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng (dùng để khảo sát) và sắc ký cột để phân lập các hợp chất. Sắc ký lớp mỏng: được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254, độ dày 0,2 mm và RP-18 F254s (Merck), độ dày 0,25 mm; hoạt hóa ở 1100℃ trong 1h. Sau khi triển khai sắc ký, phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ đến khi hiện màu. Sắc ký cột: được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường cỡ hạt 0,063–0,200 mm và 0,040–0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau. 2.3.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được Sử dụng các loại phổ hiện đại: ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR; xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được bằng cách giải phổ thông qua các tín hiệu, thông số: ✓ Độ quay cực. ✓ Nhiệt độ nóng chảy. ✓ Phổ khối ESI-MS. ✓ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). 18
27. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả mô tả đặc điểm thực vật của cây Qua lâu trứng 3.1.1. Mô tả đặc điểm hình thái của Qua lâu trứng Cây leo thân thảo, sống lâu năm. Thân cây mảnh, có lông và tua cuốn. Rễ củ hình trụ tròn, hoặc nửa hình trụ trong không nhất định, phần nhiều uốn cong, một đầu tương đối nhỏ, vỏ thô màu trắng vàng. Lá mọc so le, cuống lá 4-12 cm, có khía, lông tơ dày. Mặt trên lá màu xanh đậm, phiến lá đa dạng, dài: 7-19 × rộng: 7-8 cm, mỏng, có lông rất ngắn, 3-5 thùy đến giữa hoặc đến gốc, thùy có hình tam giác (đầu nhỏ ở phía cuống lá). Mặt dưới màu xanh lục nhạt có lông sát dày, lông tơ rất ngắn ở mặt trên, mép lá có răng cưa thưa, đỉnh nhọn. Các tua cuốn phân nhánh, bề mặt có lông tơ. Hoa đực, mọc thành chùm, có chiều dài 10-26 cm, có vân, lông ngắn. Cánh hoa trắng, có rìa dài, cuống hoa ngắn, dài khoảng 5 mm. Lá bắc có hình cây thương hoặc dạng mác ngược, kích thước 1,6 × 0,5-0,6 cm, thon dần về phía gốc, mép lá dạng tam giác, có răng cưa, đỉnh nhọn. Đài hoa ống hình trụ, hơi giãn ở đỉnh, chiều dài khoảng 5 cm, đường kính gốc khoảng 2 mm, đường kính đỉnh khoảng 7 mm, thùy hình mũi mác. Bao phấn dài 3 mm, vách ngăn có lông, các sợi ngắn, rời nhau. Hoa cái mọc đơn độc, cuống dài 0.5-1 cm, có vân, có lông tơ dày, đài hoa giống hoa đực, bầu (nhụy hoa) 1-1,5 × 0,3-0,5 cm. Mùa hoa là từ tháng năm đến tháng chín. Quả hình trứng hoặc thuôn dài, 5-7 × 2,5-4 cm, nhẵn, gốc tròn, đỉnh nhọn, khi chín có màu đỏ cam. Hạt (T.ovigera) màu nâu sẫm, thuôn dài theo chiều ngang, kích thước hạt 6-8 x 5-9 x 3-5 mm, được bao quanh bởi hai đường vân dày theo chiều dọc, dày gần tâm, 3 buồng, 2 buồng bên trống. Mùa trái cây là tháng chín đến tháng mười hai. 19
28. Hình 3.1: Hình ảnh các đặc điểm chi tiết của cây Qua lâu trứng Chú thích: 1. Cây Qua lâu trứng; 2. Mặt trước lá; 3. Mặt sau lá; 4. Quả ; 5. Hạt; 6. Ngọn cây; 7-8. Hoa. 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu thân Thân non vi phẫu hình tròn. Biểu bì (2) có cấu tạo một lớp tế bào hình đa giác xếp sít nhau, to nhỏ kích thước không đều, vách ngoài hóa cutin trên biểu bì, có nhiều lỗ khí để thông hơi. Ngoài ra, biểu bì của thân còn mang nhiều lông che chở đa bào (1). Tiếp theo là mô mềm vỏ (3) gồm 2 hàng tế bào, nằm sát biểu bì, xếp thành hình tròn khép kín các tế bào có góc tròn, tại góc tròn có những khoảng gian bào nhỏ. Hệ thống dẫn gồm các bó libe-gỗ (4), sắp xếp theo lối đồng tâm rải rác trong mô mềm ruột, phần gỗ ở phía trong và phần libe ở phía ngoài; bao ngoài chúng là lớp trụ bì khuyết (5). Trụ bì khuyết gồm 2-3 lớp tế bào đa giác đã hóa thành mô cứng tạo hình vòng cung trên bó libe-gỗ. Mạch gỗ hình đa giác tròn xếp xen kẽ với libe. Mô mềm ruột (8) gồm nhiều tế bào hình đa giác, các tế bào có thành mỏng, to, số lượng lớn, kích thước không 20
29. đồng đều, các góc có khoảng gian bào nhỏ. Hình ảnh vi phẫu thân cây Qua lâu trứng được trình bày ở hình 3.2. Chú thích: 1. Lông đa bào; 2. Biểu bì; 3. Mô mềm vỏ; 4. Bó libe-gỗ; 5. Trụ bì khuyết; 6. Mạch gỗ; 7. Libe; 8. Mô mềm ruột Hình 3.2: Đặc điểm cấu tạo vi phẫu thân của loài Trichosanthes ovigera Blume 3.1.3. Đặc điểm vi phẫu lá Quan sát ở vật kính nhỏ thấy vi phẫu lá gồm 2 phần: phần phồng to ở giữa là gân chính của lá, phần hẹp hai bên là phiến lá. Phần gân lá: vi phẫu có cấu tạo đối xứng 2 bên, mặt dưới lồi, mặt trên hơi lồi nhẹ. Bên trên biểu bì có lông che chở đa bào (1). Biểu bì trên (2) và biểu bì dưới (7) gồm 1 lớp tế bào đa giác sắp xếp đều đặn nhau, có màng cutin. Mô dày trên (3) ngay dưới biểu bì trên phần lồi lên cấu tạo bởi nhiều hàng tế bào hình trụ, thành dày lên ở các góc. Mô mềm (4) gồm lớp tế bào đa giác lớn hơi ở mô dày, các góc có khoảng gian bào nhỏ, bên trong có chứa các tinh thể canxi oxalat và các hạt tinh bột, rải rác. Bó libe-gỗ (5) ở chính giữa gân gồm libe ở phía ngoài và gỗ ở phía trong. Libe là các tế bào nhiều cạnh, gần tròn, kích thước khá nhỏ bao quanh gỗ. Mạch gỗ hình đa giác tròn, kích thước lớn hơn libe. Mô dày dưới (6) nằm sát biểu bì dưới gồm 1 hàng tế bào đa giác đều đặn xếp sát nhau. 21
30. Phần phiến lá: Gồm biểu bì trên và biểu bì dưới cấu tạo bởi 1 hàng tế bào đa giác sắp xếp đều đặn nhau. Mô giậu (8) ngay dưới biểu bì trên cấu tạo bởi 2 hàng tế bào hình chữ nhật sắp xếp đều đặn nhau. Bên dưới là mô mềm khuyết (9) cấu tạo bởi các tế bào gần tròn xếp sát nhau. Hình 3.3: Đặc điểm vi phẫu lá của loài Trichosanthes ovigera Blume Chú thích: 1. Lông đa bào; 2. Biểu bì trên; 3. Mô dày trên; 4.Mô mềm; 5. Bó libe-gỗ; 6. Mô dày dưới; 7. Biểu bì dưới; 8. Mô giậu; 9. Mô mềm khuyết. 3.1.4. Đặc điểm bột dược liệu 3.1.4.1. Đặc điểm bột dược liệu thân Đặc điểm bột thân của loài T.ovigera được thể hiện ở hình 3.4. Bột dược liệu là bột thân cây khô có màu xanh lá hơi vàng, vị đắng, không có mùi. Soi dưới kính hiển vi thấy có các đặc điểm sau: bó sợi (1) dài gồm các sợi có vách mỏng xếp thành bó, mảnh biểu bì (2), tinh thể calci oxalat hình kim lớn (3), hạt tinh bột (4), lông che chở (5) đa bào, mảnh mô mềm (6), mảnh bần (7). 22
31. Hình 3.4 : Đặc điểm vi phẫu bột thân 3.1.4.2. Đặc điểm bột dược liệu lá Bột lá có màu xanh đậm, vị hơi đắng, soi dưới kính hiển vi thấy có các đặc điểm: mảnh biểu bì (1), lông che chở (2), mạch xoắn (3), sợi có vách dày (4), tinh thể calci oxalat (5), mảnh biểu bì mang lỗ khí (6), tinh thể calci oxalat hình kim lớn (7), mảnh mô mềm (8). Hình 3.5: Đặc điểm vi phẫu bột lá ➢ Qua phân tích các đặc điểm hình thái và vi phẫu của loài nghiên cứu, có sự so sánh, đối chiếu với các tài liệu, nhất là đặc điểm thực vật trong cuốn 23
32. “Cây cỏ Việt Nam” của Phạm Hoàng Hộ [9] và tham khảo các chuyên gia, mẫu nghiên cứu thu hái tại xã Phú Vinh, huyện Tân Lạc, tỉnh Hòa Bình mang số hiệu: UMP-112021 được giám định tên khoa học là Trichosanthes ovigera Blume, họ Cucurbitaceae (Phiếu giám định ngày 22/02/2021). 3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học trong lá cây Qua lâu trứng ➢ Định tính glycosid tim Ngâm 10g bột dược liệu với 100ml cồn 25o, trong 24 giờ. Lọc lấy dịch chiết, loại tạp chất bằng chì acetat 30% vừa đủ (không còn tủa đục). Để lắng, lọc lấy dịch lọc vào bình gạn. Lắc kỹ 3 lần với 25ml cloroform (10ml, 10ml, 5ml), để lắng, gạn lấy dịch chiết, lọc qua bông loại nước. Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm đã được sấy khô, đem cô cách thủy đến khô. Cắn thu được để làm phản ứng: a, Phản ứng Liberman Cho 1ml anhydrid acetic vào ống nghiệm 1, lắc đều. Nghiêng ống 450, cho từ từ theo thành ống 1ml H2SO4 đặc. Quan sát nếu thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp xuất hiện vòng màu đỏ tím thì dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính (-). b, Phản ứng Baljet Cho 0,5ml etanol 90% vào ống nghiệm 2, lắc đều. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%), xuất hiện màu đỏ cam thì dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính (-). c, Phản ứng Legal 24
33. Thêm 0,5ml ethanol 90% vào ống nghiệm 3, lắc đều, cắn tan hết. Nhỏ 1 giọt dung dịch natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều, xuất hiện màu đỏ cam thì dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính(-). d, Phản ứng Keller-Kiliani Hòa tan cắn còn lại bằng 0,5ml ethanol 90%. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic, lắc đều. Nghiêng ống 45o. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống nghiệm. Phản ứng dương tính khi giữa hai lớp chất lỏng có vòng màu đỏ. Kết quả: Phản ứng âm tính(-). Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có glycosid tim. ➢ Định tính alcaloid. Lấy 2 g dược liệu đã làm nhỏ, cho vào bình nón dung tích 50 mL. Thêm 15 mL dung dịch thấm ẩm H2SO4 1N. Đun đến sôi, để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 mL. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH 9–10. Chiết alcaloid base bằng chloroform (3 lần, mỗi lần 5 mL). Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng natri sulfat khan, sau đó đem lắc với H2SO4 1N (2 lần, mỗi lần 5 mL). Gộp các dịch chiết nước chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 mL để làm các phản ứng: - Phản ứng với thuốc thử Mayer: Thêm 2–3 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy xuất hiện tủa trắng thì phản ứng dương tính. - Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: Thêm 2–3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dương tính. - Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: Thêm 2–3 giọt thuốc thử Dragendorff, nếu thấy xuất hiện kết tủa cam thì phản ứng dương tính. 25
34. Kết quả: Các phản ứng âm tính (-). Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có alcaloid ➢ Định tính saponin Cho 5g dược liệu vào bình nón 100ml, chiết bằng 30ml cồn 90o, lọc dịch chiết bằng giấy lọc gấp nếp. Dịch chiết cồn để làm phản ứng : - Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vài giọt dịch chiết công vào ống nghiệm có 5ml nước, lắc mạnh trong 1 phút, có cột bọt cao bền vững trong 15 phút. - Phản ứng với H2SO4 đậm đặc: Nhỏ 1 giọt H2SO4 đậm đặc vào cốc chứa cắn của dịch chiết cồn, không thấy xuất hiện màu tím hồng . Kết quả: Các phản ứng dương tính (+). Kết luận: Mẫu nghiên cứu có chứa saponin. Chuẩn bị: Lấy dược liệu đã làm nhỏ, cho nước ngập dược liệu (cách bề mặt dược liệu khoảng 2cm), đun sôi trong 30 phút. Sau 30 phút, lấy dịch chiết ra, lọc nóng thu được dịch lọc. Dịch lọc lại đem cô đến cắn (cắn toàn phần). ➢ Định tính flavonoid Hòa tan cắn vào EtOH 90%, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc để làm các phản ứng: - Phản ứng với hơi amoniac (NH3): Nhỏ vài giọt dịch lọc lên miếng giấy lọc, để khô rồi hơ lên miệng lọ amoniac đặc, quan sát nếu thấy vết chất chuyển sang màu vàng thì phản ứng dương tính. - Phản ứng với dung dịch kiềm loãng: Cho dịch lọc vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch NaOH 10%, nếu thấy dịch vẩn đục màu vàng thì phản ứng dương tính. - Phản ứng Cyanidin: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống khoảng 1 mL dịch lọc, 1 ống thêm ít bột Mg kim loại rồi nhỏ từ từ vài giọt HCl đậm đặc, ống còn 26
35. lại để đối chiếu. Khi phản ứng xong quan sát nếu thấy ống phản ứng xuất hiện màu đỏ cam đậm hơn ống đối chiếu thì phản ứng dương tính. - Phản ứng với dung dịch sắt (III) chlorid: Cho khoảng 1mL dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Lắc đều, nếu thấy xuất hiện màu xanh đen thì phản ứng dương tính. Kết quả: Các phản ứng dương tính (+). Kết luận: Mẫu nghiên cứu có chứa flavonoid. ➢ Định tính coumarin Chuẩn bị dịch lọc như phần định tính flavonoid để làm phản ứng mở đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 mL dịch lọc: + Ống 1: thêm 0,5 mL NaOH 10%. + Ống 2: để nguyên. Đun cả 2 ống trong 2 phút, để nguội, nếu thấy hiện tượng: + Ống 1: có tủa đục màu vàng. + Ống 2: trong suốt. Thêm từ từ nước cất vào cả 2 ống đến 4 mL: + Ống 1: trong suốt. + Ống 2: có tủa đục. Thêm vài giọt HCl đặc vào ống 1, ống 1 trở lại đục như ống 2 thì phản ứng dương tính. Kết quả: Các phản ứng dương tính (+). Kết luận: Mẫu nghiên cứu có chứa coumarin. ➢ Định tính anthranoid Phản ứng Borntraeger: Hòa tan một ít cắn vào 10 mL H2SO4 1N. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc cho vào bình gạn. Chiết bằng 27
36. 10mL chloroform, gạn lấy lớp chloroform vào ống nghiệm, cô bớt dung môi còn khoảng 1 mL, thêm 1 mL NaOH 10% vào, lắc nhẹ, nếu xuất hiện màu đỏ sim thì phản ứng dương tính. Kết quả: phản ứng âm tính (-) Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có anthranoid. ➢ Định tính acid hữu cơ Hòa tan cắn trong nước nóng, để nguội rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp. Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2 mL dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3 nếu thấy có bọt khí bay lên thì phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính (+). Kết luận: Mẫu nghiên cứu có chứa aicd hữu cơ. ➢ Định tính tanin Hòa tan cắn trong nước nóng. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 2 mL dịch lọc. + Ống 1: Thêm vài giọt sắt (III) chlorid 5% nếu thấy xuất hiện tủa màu xanh đen thì phản ứng dương tính. + Ống 2: Thêm vài giọt chì acetat 10% nếu thấy xuất hiện tủa bông thì phản ứng dương tính. + Ống 3: Thêm vài giọt gelatin 1% nếu thấy xuất hiện tủa bông trắng thì phản ứng dương tính. Kết quả: Các phản ứng dương tính (+). Kết luận: Mẫu nghiên cứu có chứa tanin. ➢ Định tính đường khử Hòa tan cắn vào 1 mL nước nóng, đem lọc thu được dịch lọc. Thêm vào đó 1 mL dung dịch thuốc thử Fehling A và 1 mL dung dịch thuốc thử Fehling 28
37. B. Đun cách thủy sôi vài phút nếu thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì phản ứng dương tính. Kết quả: phản ứng âm tính (-) Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có đường khử. ➢ Định tính chất béo Hòa tan cắn vào 2 mL nước nóng, lọc nóng. Nhỏ 1 giọt dịch chiết trên lên miếng giấy lọc, hơ nóng cho bay hết hơi dung môi, nếu để lại vết mờ trên giấy lọc thì phản ứng dương tính. Kết quả: phản ứng âm tính (-) Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có chất béo. ➢ Định tính caroten Cho vào ống nghiệm nhỏ một ít cắn khô, nhỏ vài giọt H2SO4 đặc vào cắn nếu thấy xuất hiện màu xanh lá thì phản ứng dương tính. Kết quả: phản ứng âm tính (-) Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có caroten. ➢ Định tính sterol Cho vào ống nghiệm một ít cắn khô, hòa tan trong 2 mL chloroform và 0 1mL anhydrid acetic. Để ống nghiệm nghiêng 45 , thêm từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm, nếu thấy mặt phân cách có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá thì phản ứng dương tính. Kết quả: phản ứng âm tính (-) Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có sterol. Nhận xét: Kết quả thực nghiệm cho thấy: lá cây Qua lâu trứng có 6 nhóm chất là saponin, flavonoid, polysaccharid, coumarin, tanin, acid hữu cơ. Kết quả định tính được trình bày ở bảng 3.1. 29
38. Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phương pháp hóa học của loài Trichosanthes ovigera Blume Thuốc thử và phản ứng định TT Nhóm chất Kết quả Kết luận tính Phản ứng tạo bọt + 1 Saponin Có Phản ứng với H2SO4 đậm đặc + Phản ứng với thuốc thử - Mayer Phản ứng với thuốc thử 2 Alcaloid - Không có Bouchardat Phản ứng với thuốc thử - Dragendorff 3 Anthranoid Phản ứng Borntrager - Không có 4 Polysaccharid Phản ứng với thuốc thử lugol +++ Có Phản ứng Liebermann- - Burchardt 5 Glycosid tim Phản ứng Baljet - Không có Phản ứng Legal - Phản ứng Keller kiliani - Phản ứng với Cyanidin + Phản ứng với NH3 + 6 Flavonoid Có Phản ứng với NaOH 10% + Phản ứng với FeCl3 + 7 Coumarin Phản ứng đóng mở vòng + Có 30
39. lacton Phản ứng với FeCl3 5% +++ Phản ứng với gelatin 1% +++ 8 Tanin Có Phản ứng với chì acetat 10% +++ Phản ứng với đồng acetat 10% +++ 9 Caroten Phản ứng với H2SO4 - Không có Phản ứng với thuốc thử 10 Đường khử - Không có Fehling 11 Chất béo Để lại vết mờ trên giấy lọc - Không có Phản ứng với H2SO4/ anhydrid 12 Sterol - Không có acetic 13 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 +++ Có Chú thích: (-) âm tính, (+) dương tính, (+++) dương tính rất rõ. 3.3. Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất 3.3.1. Chiết các phân đoạn từ lá cây Qua lâu trứng Mẫu lá Qua lâu trứng được rửa sạch, phơi khô, làm nhỏ. Cân 500 g lá cây đã cắt nhỏ và ngâm chiết bằng dung môi EtOH 70% (3 lần, mỗi lần 4 L), sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40oC trong vòng 30 phút. Lọc các dịch chiết EtOH thu được qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 40 g cao chiết tổng ethanol. Lấy 40 g cao chiết phân tán trong nước cất (400 mL) và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 400 mL). Các dịch chiết n-hexan, EtOAc được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng n-hexan (14,1 g) và ethyl acetat (20,6 g). 31
40. Sơ đồ chiết xuất lá cây Qua lâu trứng được trình bày theo hình 3.6. Lá T.ovigera (500g) Chiết ethanol 70% (4 lít x 3 lần) Dịch chiết ethanol Lọc, thu hồi dung môi Cao chiết tổng Ethanol (40g) Phân tán 40g cao vào nước Dịch nước Dịch chiết phân đoạn bằng n-hexan Cất loại dung môi Phân đoạn n-hexan Phân đoạn nước 14,1g Chiết bằng ethyl acetat Cất loại dung môi Phân đoạn ethyl acetat Phân đoạn nước 20,6g Hình 3.6. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Qua lâu trứng 3.3.2. Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột Tiến hành phân tách phân đoạn dịch chiết EtOAc (20,0 g) trên cột sắc ký silicagel (Φ85 mm × 90 mm) với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần bao 32
41. gồm n-hexan : EtOAc (5:1 → 1:1, v/v, mỗi phân đoạn 400 mL) thu được 3 phân đoạn ký hiệu là Q1 ~ Q3. Từ phân đoạn Q1 (5,2 g), chạy sắc ký cột silicagel (Φ45 mm × 350 mm) với hệ pha động CHCl3 : MeOH (10:1; 6:1; 3:1, v/v, 2,5 L) thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn là Q1.1 ~ Q1.3. Phân tách phân đoạn nhỏ Q1.1 (1,6g) bằng sắc ký cột pha thường với hệ dung môi CHCl3 : MeOH (5:1) thu được 1 hợp chất ký hiệu là QL1 (9 mg). Sơ đồ phân lập 1 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat được trình bày như hình 3.7. Cắn ethyl acetat 20g Hệ dung môi n-hexan: EtOAc (5:1 →1:1,v.v) Q1 Q2 Q3 5.2g CHCl : MeOH (10:1; 6:1; 3:1, v/v) 3 Q1.1 Q1.2 Q1.3 1.6g CHCl3 : MeOH (5:1) QL1 9mg Hình 3.7. Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat 3.3.3. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được Hợp chất QL1: (7''R, 8''R) Hydnocarpin Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất QL1: 33
42. - Chất rắn màu vàng nhạt. - Nhiệt độ nóng chảy: 256-258 oC. 25 o - Độ quay cực [α] D: +35 (c=0,15; MeOH) - - ESI-MS: m/z 463,1 [M-H] → Công thức phân tử :C25H20O9 (M = 464) 1 13 - Dữ liệu phổ H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) của chất QL1 và chất tham khảo [37] được trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2: Số NMR của hợp chất QL1 và chất tham khảo [37] QL1 Xa,b QL1 Xa,c Vị trí DEPT δH (ppm) δH (ppm) δC δC C (Mult, J=Hz) (Mult, J=Hz) ppm ppm 2 C - - 162,8 162,9 3 CH 6,87 s 6,86 s 103,8 103,9 4 C - - 181,6 181,8 5 C - - 161,3 161,4 6 CH 6,21 d (1,5) 6,20 d (2,0) 98,8 98,9 7 C - - 164,3 164,3 8 CH 6,52 d (2,0) 6,51 d (2,0) 94,0 94,1 9 C - - 157,2 157,4 10 C - - 103,7 103,8 1′ C - - 123,6 123,7 2′ CH 7,67 d (2,5) 7,65 d (2,1) 114,7 114,9 3′ C - - 143,5 143,7 4′ C - - 147,0 146,9 5′ CH 7,08 d (8,5) 7,07 d (8,5) 117,4 117,5 6′ CH 7,61 dd ( 2,5;8,5) 7.59 dd (2.1; 8.5) 119,8 119,9 1′′ C 126,8 127,0 2′′ CH 7,04 d (1,5) 7.03 d (1,7) 111,7 111,9 34
43. 3′' C - - 147,5 147,7 4′′ C - - 147,0 147,2 5′′ CH 6,82 d (8,5) 6,81 d (8,1) 115,2 115,4 6′′ CH 6,89 dd (2,0; 8,5) 6.88 dd (1,7;8,1) 120,5 120,6 7′′ CH 5,03 d (8,0) 5,02 d (7,8) 76,2 76,4 CH 4,28 ddd (2,5; 4,5; 4,26 ddd (2,5; 4,6; 78,0 78,0 8′′ 7,5) 7,8) CH2 3,59 d (10,5) 3,58 ddd (2,5; 4,9; 60,0 60,1 9′′ 12,3) 3,38 ddd (4,6; 5,6; 12,3) 5′′- 3,79 s 3,78 s 55,6 55,8 OMe a ) b) c ) Chú thích : X: hydnocarpin D [37], đo trong DMSO-d6, 700 MHz, 176 MHz. Hợp chất QL1 thu được dưới dạng chất rắn, màu vàng nhạt. Phổ khối lượng ESI-MS cho pic ion giả phân tử m/z 463 [M-H]-, tương ứng với khối lượng phân tử M = 464, phù hợp với công thức phân tử là C25H20O9. Phổ 1H-NMR của hợp chất QL1 xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của hợp chất 5,7-dihydroxy flavone với tín hiệu singlet ở δH 12,89 (s, OH-5), 2 tín hiệu doublet ở δH 6,52 (d, J=2 Hz, H-8), 6,21 (d, J=1,5 Hz, H-6). Proton H-3 cho tín hiệu singlet tại δH 6,87 (s, H-3). Tín hiệu của vòng thơm tại δH 7,61 (dd, J=2,5, 8,5 Hz, H-6'), 7,67 (d, J=2,5Hz, H-2'); 7,07 (d, J=8,5 Hz, H-5'). Tín hiệu của nhóm phenyl xuất hiện với 3 proton vòng thơm tại δH 7,04 (d, J=1,5 Hz, H-2''), 6,82 (d, J=8,5 Hz, H-5''), 6,89 (dd, J=2,0, 8,5 Hz, H-6'') và 1 nhóm methoxy tại 3,79 (s, OMe-3''). Ngoài ra 4 proton δH 5,03 (d, J=8 Hz, H-7''), 4,28 (ddd, J= 2,5, 4,5, 7,5 Hz, H-8''), 3,59 (d, J =10,5 Hz, H-9''a), 3,5 (s, H-9''b) là tín hiệu của một propanol nối với một vòng 1,4-dioxane. Trên phổ 1 ’’ H-NMR của hợp chất QL1 vị trí H-3 (δH 6,87) cạnh vị trí của H-6 (δH 6,89). Trên phổ 13C-NMR của QL1 có tín hiệu cộng hưởng của 25 tín hiệu 35
44. carbon bao gồm một nhóm methoxy tại δC 55,7. Nhóm carbonyl tại δC 181,6, nhóm methylen liên kết với oxy tại δC 60,0, hai nhóm oxymethine tại δC 78,0 (C-8''), 76,2 (C-7''). Tín hiệu carbon của vòng benzene gồm có 8 tín hiệu carbon gắn với oxy tại δC 164,3 (C-7), 162,8 (C-2), 161,3 (C-5), 157,2 (C-9), 147,5 (C-3''), 147,0 (C-4''), 147,0 (C-4'), 143,5 (C-3'), 3 tín hiệu carbon bậc bốn tại δC 103,7 (C-10), 123,6 (C-1'), 126,8 (C-1''), 9 tín hiệu nhóm methine δC 103,8 (C-3), 98,8 (C-6), 94,0 (C-8), 119,8 (C-6′), 117,4 (C-5'), 114,7 (C- 2'), 120,5 (C-6''), 115,2 (C-5''), 111,7 (C-2''). Sau khi so sánh dữ kiện phổ với tài liệu [37], ta có thể dự đoán cấu trúc QL1 tương tự với chất tham khảo, chỉ thay đổi vị trí nhóm thế ở vị trí C-7'' và C-8''. Từ đó cho phép ta xác định hợp chất QL1 là (7''R, 8''R) Hydnocarpin, có CTPT là: C25H20O9. Hình 3.8: Cấu trúc hóa học hợp chất QL1 3.4. Bàn luận Trong quá trình thực nghiệm, đề tài đã sử dụng mẫu nghiên cứu là lá cây Qua lâu trứng (Trichosanthes ovigera Blume) được thu hái tại tỉnh Hòa Bình. Nghiên cứu này đã đi sâu, mô tả chi tiết hơn về đặc điểm hình thái thực vật với những hình ảnh rõ nét, trong khi các công bố trước đây đặc điểm còn mơ hồ, chỉ được trình bày bằng bản vẽ [8, 13, 14, 16, 25]. Đồng thời xác định được tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Trichosanthes ovigera Blume. Kết quả đạt được trên đây góp phần phân biệt loài T.ovigera với các loài khác trong chi 36
45. Trichosanthes, là nghiên cứu bước đầu làm tiền đề cho mục đích nghiên cứu sâu hơn, góp phần xây dựng và hoàn thiện tiêu chuẩn của chuyên luận về dược liệu này trong Dược điển Việt Nam. Về đặc điểm thực vật, có một số khác biệt của loài T.ovigera so với các loài khác tiêu biểu như: lá (với loài T.rubriflos, T.tricuspidata, T.pedata phiến lá có nhiều điểm trắng nhỏ [3], trong khi phiến lá của loài T.ovigera không có). Hoa (với loài T.cucumerina lá bắc rất nhỏ hoặc tiêu biến [3], còn T.ovigera lá bắc hình cây thương hoặc dạng mác ngược, kích thước 1,6 × 0,5-0,6 cm). Nghiên cứu đã tiến hành phân tích đặc điểm vi phẫu, soi bột dược liệu thân và lá. Kết quả nghiên cứu cho thấy, đặc điểm vi học của cây mang các đặc điểm chung đặc trưng của thực vật họ Cucurbitaceae (Bầu bí). Các hình ảnh về cấu tạo vi học của thân và lá cây Qua lâu trứng có thể dùng làm tư liệu cho việc tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng phương pháp hóa học là một trong các phương pháp hiện đang được áp dụng chủ yếu ở Việt Nam, bởi tính thuận tiện, kinh tế và hiệu quả cao. Kết quả định tính được một số nhóm chất có trong lá cây Qua lâu trứng, thu hái từ tỉnh Hòa Bình phù hợp với các nghiên cứu trước đó về thành phần hóa học của chi và loài tại Việt Nam, cung như trên thế giới là: flavonoid, triterpenoid, acid hữu cơ [2, 18, 21, 23, 38]. Ngoài ra, trong lá cây Qua lâu trứng thu hái từ Hòa Bình còn có chứa một số thành phần khác như coumarin, tanin, polysaccharid. Đề tài sử dụng phương pháp chiết bằng dung môi EtOH 70% với thiết bị chiết siêu âm và phân lập các chất bằng sắc ký cột. Kết quả nghiên cứu thu được hợp chất QL1, cấu trúc hợp chất này được xác định thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ khối, phổ cộng hưởng hạt nhân và so sánh với các dữ liệu công bố của các hợp chất liên quan. Hợp chất được xác định là (7''R, 8''R) Hydnocarpin thuộc nhóm Flavonolignans. 37
46. (7''R, 8''R) Hydnocarpin: Đây là chất đầu tiên được phân lập từ lá cây Qua lâu trứng nói riêng và chi Trichosanthes nói chung. Trong tự nhiên, Hydnocarpin còn được được tìm thấy chủ yếu trong các cây thuộc chi Hydnocarpus [24, 33, 34]; cây Silybum marianum [37]; cây Lonicera japonica [29]; lá cây Verbascum thapsus [30]; cành, lá và cụm hoa của cây Brucea javanica [28]. Hợp chất này có nhiều tác dụng sinh học được biết đến như: chống viêm [37], chống oxy hóa [30], gây độc trên tế bào, ức chế sự hình thành khối u đối với các loại ung thư biểu mô tuyến ruột kết [29, 27], u xương, u thần kinh đệm [33], tế bào ung thư vú [28]. Một số nghiên cứu gần đây được công bố có ý nghĩa lớn trong việc phát triển hoạt chất chống tế bào ung thư cụ thể: Năm 2013 Min-Ai Lee và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt động chống tăng sinh của hydnocarpin tổng hợp từ cây Lonicera japonica, có liên quan đến việc ức chế con đường truyền tín hiệu Wnt / β-catenin trong tế bào ung thư ruột kết [29, 27]. Bên cạnh đó, một nghiên cứu ở Việt Nam chỉ ra trong cây Brucea javanica chứa hydnocarpin có hiệu lực gây độc dòng tế bào ung thư vú ở người MCF-7 [28]. Các nghiên cứu của đề tài chỉ mới là bước đầu, tạo cơ sở cho việc nghiên cứu sâu hơn về Qua lâu trứng, bổ sung tư liệu cho việc sử dụng cây làm thuốc trong dân gian, cũng như phục vụ cho lĩnh vực kiểm nghiệm dược liệu sau này. 38
47. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau một thời gian thực hiện, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra và thu được một số kết quả như sau: - Đã mô tả được đặc điểm thực vật và xác định được tên khoa học của cây Qua lâu trứng là Trichosanthes ovigera Blume, thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae). - Đã định tính và xác định được một số nhóm chất có trong lá cây Qua lâu trứng là: saponin, flavonoid, polysaccharid, coumarin, tannin, acid hữu cơ . - Đã chiết xuất, phân lập bằng phương pháp sắc ký cột thu được 1 hợp chất có trong lá cây Qua lâu trứng, đó là (7''R, 8''R) Hydnocarpin. Sau đó, tiến hành xác định cấu trúc thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ khối và phổ cộng hưởng hạt nhân, so với dữ liệu phổ công bố của các chất liên quan. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ lá cây Qua lâu trứng. Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu phân lập các chất để có thể xác định thêm các thành phần khác từ loài Qua lâu trứng. - Nghiên cứu đánh giá thêm về tác dụng sinh học của dịch chiết cây Qua lâu trứng, đặc biệt là chống viêm, ức chế tế bào ung thư và chống oxy hóa. 39
48. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bộ Y tế (2011), Dược liệu học I & II, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 2. Đại học Y học cổ truyền Nam Kinh Trung Quốc (2006), Từ điển Y học Cổ truyền Trung Quốc, Nhà xuất bản Khoa học và Công nghệ Thượng Hải, Thượng Hải, tr.1474 3. Hoàng Thị Yến (2019), “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Trichosanthes baviensis Gagnep (Qua lâu Ba Vì), Trichosanthes anguina L. (Dưa núi) và Trichosanthes kirilowii Maxim. (Qua lâu nhân”, Luận án tiến sĩ hóa học, Học viện khoa học công nghệ, tr.3-8. 4. Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2005), Thực vật dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.61-76. 5. Nguyễn Hoài An, Nguyễn Thế Cường (2009), "Đặc điểm bộ nhị cái chi Qua lâu (Trichosanthes L.), họ Bầu bí (Cucurbitaceae) ở Việt Nam", Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 25 (03), tr.139-144. 6. Ninh Khắc Bản, Lã Đình Mời, Trần Minh Hợi, Nguyễn Thị Hiền, Phan Văn Chi, Lê Mai Hương (2005), "Kết quả nghiên cứu về chi Qua lâu (Trichosanthes L.) ở Việt Nam", Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr.380-384. 7. Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, Tập 1, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr.13-20. 8. Nguyễn Hữu Hiến (2005), Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Tập II, Nhà xuất bản Nông nghiệp. 9. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Quyển 1, Nhà xuất bản Trẻ, tr.573.
49. 10. Phan Văn Trưởng, Phạm Thanh Huyền, Nguyễn Quỳnh Nga, Hoàng Văn Toán, Nguyễn Xuân Nam (2015), "Nghiên cứu đặc điểm hình thái và xây dựng khóa luận phân loại các loài thuộc chi Qua lâu (Trichosanthes)", Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 6, tr.378-382. 11. Vũ Đức Lợi, Lê Thị Thu Hường (2017), Thực hành: Thực vật – Dược liệu – Dược học cổ truyền, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, tr.11-87. 12. Vũ Đức Lợi, Nguyễn Tiến Vững và Lê Thị Thu Hường (2016), Tài nguyên cây thuốc, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, tr.71-74. TIẾNG ANH 13. Brigitta E.E. Duyfjes, Kanchana Pruesapan (2004), "The genus Trichosanthes L. (Cucurbitaceae) in Thailand", Thai forest bulletin, 32, tr.76-109. 14. Charles Jeffrey, Huang Luqi, Lu Anmin (2011), "Trichosanthes Linnaeus", The flora of China, 19, tr.36–45. 15. Chao Zhimao (2004), "Two Novel Pentacyclic Triterpenes and Ten Known Compounds from the Seeds of Trichosanthes Cucumeroides", The 3rd International Traditional Medicine Conference, tr.685-686. 16. Dalbir Singh and A.S.R. Dathan (1990), “Seed coat anatomy of the Cucurbitaceae”, Biology and Utilization of the Cucurbitaceae, tr.225-238. 17. Dept.of Biology, Center for Reproductive Immunology Research (1990), "Preliminary studies on physical and chemical properties of Trichoanthes Cucumeroides Maxim (Wanggua) glycoproteins and its killing effect on lung cancer", Journal of Jinan University, 11(1), tr.79-87. 18. Du Jing, Shu Nan, Yan Yuanyuan (2017), "Analysis of nutritional components in different part of Trichosanthes cucumeroides", Farm Products Processing, tr.41-47.
50. 19. Ex Franch, Et Sav (1875), "Enumeratio Plantarum in Japonia Sponte Crescentium", Paris, 01, tr.170-172 20. Hugo J. de Boer (2012), "Synopsis of Trichosanthes (Cucurbitaceae) based on recent molecular phylogenetic data", Department of Systematic Biology, 12, tr.23-33. 21. Jing Chen, Li Cheng, Fuqian Wang, Xuanbin Wang, Yonghui Zhang, Xincai Hao (2020), "Chemical constituents from Trichosanthes cucumeroides", Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 29(6), tr.431-438. 22. James A. Duke, Edward S. Ayensu (1985), Medicinal Plants of China, Reference Pubns, tr.302-320. 23. Junichi Kitajima, Yasuko Tanaka (1989), "Study on the components of herbal medicines (2nd report) ingredients of Trichosanthes cucumeroides", Yakugaku Zasshi, 109 (4), tr.256-264 24. Kishan KG, Shekshavali.T, Kuppast I.J, Kishan Kumar Ma, Jeevanagouda Patil (2016), "A review on Hydnocarpus wightiana", Pharmacology & Pharmacodynamics, India, 8 (4), tr.168-170. 25. Kyeonghee Kim, Jung-Hyun Kim, Yang-Hoon Choi, Seok-Soon Kim and Jin-Seok Kim (2020), "A new distribution record of Trichosanthes cucumeroides (Ser.) Maxim. ex Franch. & Sav. (Cucurbitaceae) in Korea", Korean Journal of Plant Taxonomy, Korean, 50 (3), tr.356-360. 26. Liang Rongneng, Wu Boliang, Mo Zhixian (1995), "Studies on the anticancer effect of active compounds from Trichosanthes Cucumeroides", Pharmacology and clinics of chinese materia medica, 04, tr.18-20. 27. Lee Min-ae (2012), "Antitumor effects of 2-Hydroxycinnamaldehyde and Hydnocarpin on colon cancer cells", Seoul National University Graduate School, Korean, tr.44-49.
51. 28. Li Pan, Young-Won Chin, Hee-Byung Chai, Tran Ngoc Ninh, Djaja Djendoel Soejarto, A. Douglas Kinghorn (2009), “Bioactivity-guided isolation of cytotoxic constituents of Brucea javanica collected in Vietnam”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 17 (6), tr.2219-2224. 29. Min-Ai Lee, Won Kyung Kim, Hyen Joo Park, Sam Sik Kang, Sang Kook Lee (2013), "Anti-proliferative activity of hydnocarpin, a natural lignan, is associated with the suppression of Wnt/β-catenin signaling pathway in colon cancer cells", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 23 (20), tr.5511-5514. 30. Minpei Kuroda, Katsura Iwabuchi, Saori Usui, Nanami Akiyama, Yoshihiro Mimaki (2017), "Chemical compounds from the leaves of Verbascum thapsus and their xanthine oxidase inhibitory activity", Shoyakugaku Zasshi, 71 (1), tr.49-50. 31. Pan Qiao-dan， Tang Hai-yan， Huang Yuan-he，Wei Xian， Li Ju-bao，LI Xiong-fu (2015), "Antioxidant activity of polysaccharides and different polarity chemical fractions of extract from Trichosanthes ovigera Bl", Food Research And Development, 36 (10), tr.1-4. 32. Pan Qiao-dan, Huang Yuan-he, Dong Mei-ling (2013), "Optimization of ultrasonic-microwave synergistic extraction technology of Trichosanthes cucumeroides and investigation of its antioxidant activity", Chinese Journal of Experimental Traditional Medical, 19 (18), tr.30-32. 33. Sharma, DK & Hall (1991), "Hypolipidemic, anti-inflammatory, and antineoplastic activity and cytotoxicity of Flavonolignans isolated from Hydnocarpus wightiana seeds", Journal of Natural Products, 54 (5), tr.1298-1302. 34. Sleumer. H (1938), "Monographie der Gattung Hydnocarpus Gaertner'', Monograph of the genus Hydnocarpus Gaertner, 69, tr.1-94.
52. 35. The Angiosperm Phylogeny Group (2016), "An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG IV", Botanical Journal of the Linnean Society, 181(1), tr.1-20. 36. Tang Chunfeng (2003), "Study on the components of triterpenoids and sterols in Wanggua seeds", International Journal of Traditional Chinese Medicine, 06, tr.41-41. 37. Vladimir Vimberg, Marek Kuzma, Eva Stodulkova, Petr Novak, Lucie Bednarova, Miroslav Sulc và Radek Gazak (2015), "Hydnocarpin-Type Flavonolignans: semisynthesis and inhibitory effects on Staphylococcus aureus biofilm formation", Journal of Natural Products, 78(8), tr.2095-2103. 38. Z.Chao, Y. Shibusawa, A. Yanagida, S. Tashiro, H. Shindo (2002), "Triterpenes and steroids from Trichosanthes cucumeroides (Ser.) Maxim", Natural Medicines, 56, tr.158.