Khóa luận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây mơ tam thể (Paederia lanuginosa Wall.)

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây mơ tam thể (Paederia lanuginosa Wall.)

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ===  === TRẦN QUANG HƯNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY MƠ TAM THỂ (Paederia lanuginosa Wall.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2021
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ===  === TRẦN QUANG HƯNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY MƠ TAM THỂ (Paederia lanuginosa Wall.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2016.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS.TS. ĐỖ THỊ HÀ PGS.TS. VŨ ĐỨC LỢI Hà Nội – 2021 HÀ NỘI – 2021
3. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đỗ Thị Hà – khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu Trung ương và PGS.TS. Vũ Đức Lợi – Chủ nhiệm Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Em xin cảm ơn Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Bộ môn Bào chế và Công nghệ dược phẩm, trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện và cung cấp đầy đủ trang thiết bị, dụng cụ, cho phép em thực hiện các nghiên cứu trong đề tài khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, các quý thầy cô trong trường Đại học Y Dược dạy đã dạy dỗ, trang bị kiến thức, kỹ năng và kinh nghiệm cuộc sống cho em trong suốt 5 năm theo học tại trường. Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này. Do kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế, nên khóa luận của em không thể tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được những lời nhận xét, chỉ bảo của quý thầy cô để khóa luận của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 08 tháng 06 năm 2021 Sinh viên Trần Quang Hưng
4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT STT Ký hiệu, viết tắt Ý nghĩa Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear 1 1H -NMR Magnetic Resonance Spectroscopy) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C (Carbon 13 Nuclear 2 13C -NMR Magnetic Resonance Spectroscopy) 3 br s Broad singlet 4 CD3OD Deuterated methanol 5 d Doublet 6 dd Doublet of doublets 7 DMSO Dimethyl sulfoxid Phổ khối ion hóa phun điện tử (Electrospray ionization 8 ESI-MS - mass spectrometry) 9 EtOAc Ethyl acetat 10 EtOH Ethanol 11 m Multiplet 12 m/z Khối lượng/điện tích (Mass to charge ratio) 13 MeOH Methanol Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal inhibitory 14 MIC concentration) 15 ppm 10-6 (parts per million) 16 s Singlet 17 v/v Thể tích/thể tích
5. DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng biểu Tên bảng biểu Trang Bảng 1.1 Phân bố các loài thuộc chi Paederia ở Việt Nam 4 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá cây Bảng 3.1 26 Mơ tam thể bằng phương pháp hóa học Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của LT1 và chất Bảng 3.2 30 tham khảo Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của LT2 và chất Bảng 3.3 31 tham khảo
6. DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Mơ tam thể (Paederia lanuginosa) 5 Hình 1.2 Một số iridoid glucosid 7 Hình 1.3 7 hợp chất anthraquinon từ rễ cây Mơ tam thể 8 Hình 1.4 Một số hợp chất phân lập từ lá Mơ tam thể, Nhật Bản (2011) 9 Hình 3.1 Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng cây Mơ tam thể 21 Hình 3.2 Đặc điểm cơ quan sinh sản cây Mơ tam thể 22 Hình 3.3 Đặc điểm vi phẫu thân cây Mơ tam thể 23 Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu lá cây Mơ tam thể 24 Hình 3.5 Đặc điểm vi phẫu bột lá cây Mơ tam thể 25 Hình 3.6 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Mơ tam thể 27 Sơ đồ phân lập 2 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của lá Hình 3.7 28 cây Mơ tam thể Hình 3.8 Cấu trúc hóa học của hợp chất LT1 29 Hình 3.9 Cấu trúc hóa học của hợp chất LT2 31
7. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về chi Paederia 3 1.1.1. Vị trí phân loại chi Paederia 3 1.1.2. Phân bố loài và đặc điểm thực vật của chi Paederia 3 1.2. Tổng quan về cây Mơ tam thể (Paederia lanuginosa) 4 1.2.1. Phân bố của cây Mơ tam thể 4 1.2.2. Đặc điểm thực vật cây Mơ tam thể 5 1.2.3. Thành phần hóa học 6 1.2.4. Tác dụng dược lí 9 1.2.5. Công dụng theo Y học cổ truyền 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. Đối tượng nghiên cứu 13 2.1.1. Nguyên liệu 13 2.1.2. Hóa chất, thiết bị 13 2.2. Phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu về đặc điểm thực vật 14 2.2.2. Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá cây Mơ tam thể 15 2.2.3. Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có trong lá cây Mơ tam thể 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1. Kết quả mô tả đặc điểm thực vật 21 3.1.1. Mô tả đặc điểm hình thái thực vật 21 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu của cây Mơ tam thể 23 3.1.3. Đặc điểm bột dược liệu 25
8. 3.2. Kết quả định tính các nhóm chất có trong lá cây Mơ tam thể 26 3.3. Kết quả chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất 27 3.3.1. Chiết các phân đoạn từ lá cây Mơ tam thể 27 3.3.2. Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột 28 3.3.3. Kết quả xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được 29 3.4. Bàn luận 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36
9. MỞ ĐẦU Nghiên cứu các bài thuốc cổ truyền và các hợp chất trong dược liệu là một trong những hướng phát minh thuốc mới. Đặc biệt trong thời đại khoa học kỹ thuật phát triển, con người lại ngày càng có xu hướng trở về với thiên nhiên. Tìm đến cây cỏ thân thuộc gần gũi để chăm sóc và bảo vệ sức khỏe. Tác dụng chữa bệnh thần kỳ của các loại dược liệu cũng là một trong những lý do thúc đẩy các nhà khoa học nghiên cứu, khám phá. Nằm tại vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa cùng với vị trí địa lý thuận lợi, Việt Nam được thiên nhiên ưu ái ban tặng rừng vàng, biển bạc. Trong đó nguồn tài nguyên thực vật đa dạng với khoảng gần 4000 loài đã được sử dụng làm thuốc. Bởi vậy, phát triển các sản phẩm từ dược liệu rất được nước ta quan tâm. Trên thế giới, chi Paederia (họ cà phê Rubiaceae) là một chi nhỏ với 31 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [13,32]. Ở nước ta có 5 loài thuộc chi Paederia đều là cây thân leo với những tên gọi quen thuộc như: mơ tam thể, mơ tròn, mơ leo, [1,3]. Chúng được sử dụng ở nhiều địa phương như một loại rau sống ăn kèm nhiều món, giúp hỗ trợ đường tiêu hóa, nhất là khi dùng các món có nhiều đạm hay tươi sống dễ gây đầy bụng, khó tiêu, mẩn ngứa hoặc tiêu chảy [4]. Tuy nhiên 5 loài cây này hơi khác nhau về đặc điểm thực vật và tác dụng trị liệu. Nghiên cứu về chúng là cần thiết để nhận biết loài và xác định tiềm năng cũng như nâng cao giá trị sử dụng. Cây Mơ tam thể (Paederia lanuginosa Wall.) hay còn gọi mơ lông được trồng ở nhiều địa phương trên nước ta từ đồng bằng cho tới miền núi [3]. Các bộ phận của cây đặc biệt là lá đã được sử dụng trong các bài thuốc dân gian giúp lợi tiểu, chữa nhiễm trùng, nhiễm giun sán. Nhưng thông dụng nhất vẫn là chữa các bệnh về đường tiêu hoá như kiết lỵ, tiêu chảy [2,3]. Theo các nghiên cứu đã công bố, các anthraquinon trong cây Mơ tam thể cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh [23]. Một số tác dụng khác như chống oxi hóa [11], kháng virus [18], bảo vệ gan [8,10] đã được xác nhận. Tuy nhiên số lượng các nghiên cứu về cây Mơ tam thể ở nước ta chưa có nhiều. Do vậy, để góp phần xây dựng cơ sở khoa học nhận biết loài, 1
10. về thành phần hóa học của loài, ứng dụng cây Mơ tam thể nhiều hơn nữa trong cuộc sống, chúng tôi đã lựa chọn và thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Mơ tam thể (Paederia lanuginosa Wall.)” với những mục tiêu sau: 1. Mô tả được đặc điểm thực vật và xác định được tên khoa học của mẫu cây Mơ tam thể. 2. Định tính được các nhóm chất có trong lá cây Mơ tam thể. 3. Chiết xuất, phân lập, xác định được cấu trúc của một số hợp chất từ lá cây Mơ tam thể. 2
11. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chi Paederia 1.1.1. Vị trí phân loại chi Paederia Theo hệ thống phân loại thực vật APG IV [27] và hệ thống phân loại thực vật có hoa của của Armen Takhtajan [28], vị trí của chi Paederia như sau: Giới Thực vật (Planta) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa Môi (Lamiidae) Bộ Cà Phê (Rubiales) Họ Cà Phê (Rubiaceae) Chi Paederia 1.1.2. Phân bố loài và đặc điểm thực vật của chi Paederia 1.1.2.1. Phân bố các loài trong chi Paederia Chi Paederia (Rubiaceae) là một chi nhỏ chỉ gồm 31 loài [13,32], thể hiện sự phân bố chủ yếu là cây nhiệt đới và cận nhiệt đới; với đa số các loài ở châu Á (16 loài), Madagascar – châu Phi và Nam Mỹ [4,13,32]. Các loài trong chi Paederia là một nhóm dây leo thân gỗ, một dạng sinh trưởng không đặc biệt phổ biến trong họ Rubiaceae. Hầu như tất cả các cây trong chi Paederia đều phát mùi khó chịu với các iridoid glucosid chứa lưu huỳnh khi làm dập thân hay lá [13]. Theo mô tả trong hai cuốn “Cây cỏ Việt Nam”, “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, chi Paederia tại Việt Nam gồm có 5 loài, với một số thông tin cơ bản trong bảng sau: 3
12. Bảng 1.1. Phân bố các loài thuộc chi Paederia ở Việt Nam [1,3] Loài Tên gọi khác Phân bố Phổ biến ở Việt Nam, còn có ở Ấn Paederia scandens Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Lào, Mơ leo (Lour.) Merr. Campuchia, Thái Lan, các nước nhiệt đới châu Á Paederia lanuginosa Mơ tam thể, trồng nhiều tại Việt Nam và Wall. mơ lông Myanmar Lâm Đồng, Đồng Nai, các tỉnh Paederia consimilis Mơ thon, rau đồng bằng sông Cửu Long. Còn có Pierre ex Pit. mơ ở Lào, Campuchia các tỉnh Hòa Bình, Hà Nội, Hà Mơ tròn, cây Nam, Ninh Thuận. Còn có ở Ấn Paederia foetida L. lá mơ Độ, Trung Quốc, Lào, Thái Lan, Campuchia Paederia microcephala Mơ đầu nhỏ, các tỉnh Biên Hòa, Bình Dương Pierre ex Pit. mơ rừng (Thủ Dầu Một) 1.1.2.2. Đặc điểm thực vật chi Paederia Các loài thuộc chi Paederia có thân cây mọc um tùm hoặc dạng dây leo thân gỗ. Lá mọc đối, có lông tơ, cuống lá dài, phiến lá thường hình elip hoặc hình mác, đôi khi hình tam giác hẹp, đỉnh thuôn nhọn. Cụm hoa mọc thành chùm, hình xim, trục dài, mảnh. Các đài hoa có các thùy hình tam giác hoặc hình trứng, tách biệt. Quả có màu trắng (hoặc hơi hồng, hoặc hơi xanh), bên ngoài có những sợi lông ngắn [12]. 1.2. Tổng quan về cây Mơ tam thể (Paederia lanuginosa) Tên khoa học: Paederia lanuginosa Wall., họ Cà phê (Rubiaceae). Tên tiếng Việt: Mơ tam thể, mơ lông [1,3]. Bộ phận dùng: Toàn cây [4], phần lá được dùng nhiều nhất [2,3]. 1.2.1. Phân bố của cây Mơ tam thể Cây mọc hoang ở các nước châu Á như Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản, Philippin và Myanmar. Ở Việt Nam, cây mọc hoang và cũng được trồng làm thuốc 4
13. hay gia vị từ đồng bằng cho đến miền núi. Cây thường được trồng vào mùa xuân, thu, ở các bờ rào, bờ ao có lùm bụi cho leo [2]. 1.2.2. Đặc điểm thực vật cây Mơ tam thể Cây Mơ tam thể thuộc dạng dây leo thân gỗ, sống lâu năm. Vỏ thân màu xanh hoặc hơi tím, bên ngoài được phủ nhiều lông tơ màu trắng [1,3]. Thân cây lâu năm có tiết diện tròn, với thân non thì hơi dẹp hình elip [1]. Lá đơn, mọc đối, cùng với thân cây có mùi đặc trưng khi bị làm dập. Phiến lá có gốc hình tim, đỉnh nhọn, dài 9-11 cm, rộng 4-6 cm, mặt trên lá màu xanh lục, mặt dưới ửng tím đỏ, có lông mịn ở cả hai mặt. Gân lá hình lông chim nổi phía mặt dưới, gồm 7-8 gân đôi [3]. Cuống lá có hình rãnh lòng máng nông hướng lên trên, màu xanh, dài 2-3 cm, cũng có nhiều lông trắng. Hai lá kèm ở giữa 2 cuống lá màu xanh, dạng vảy tam giác hoặc hình tim, dài 0,3-0,5 cm [1,3]. Hình 1.1. Mơ tam thể (Paederia lanuginosa) Cụm hoa xim hai ngả mọc từ nách lá hoặc ngọn cành, dài 10-50 cm [2]. Hoa nhỏ, không cuống, đều nhau, lưỡng tính; lá bắc dạng vẩy tam giác nhỏ. Đài hoa thường 5, rất ít 6, rời nhau, hình tam giác cao 1 mm, màu xanh có khi hơi tím, có 5
14. lông trắng. Tràng hoa có 5-6 cánh đều, mặt ngoài có màu tím, mặt trong có màu trắng. Tràng hoa liền với nhau ở 2/3 phía dưới tạo thành ống tràng dài 0,5 cm, phần còn lại phía trên xòe ra dài 0,2 cm, mép ngoài có 3-4 thùy cạn uốn lượn không đều. Mặt trong ống tràng có nhiều lông tiết màu tím nhạt, dài 0,2-0,3 cm; mặt ngoài có nhiều lông màu trắng. Cây ra hoa vào tháng 7 – tháng 10 hàng năm. Bộ nhị gồm 5-6 nhị rời, đều nhau, đính ở đáy ống tràng xen kẽ giữa các cánh hoa. Chỉ nhị dạng sợi mảnh, màu hồng hoặc tím nhạt dài 0,2-0,25 cm. Bao phấn có 2 ô, màu trắng, thuôn dài 0,3-0,35 cm, nứt dọc, hướng trong, đính lưng. Bộ nhụy có bầu dưới hình chuông gồm 2 ô, mỗi ô có 1 noãn. Vòi nhụy ngắn, màu hồng nhạt. Hai đầu nhụy dạng sợi uốn lượn, dài 0,4-0,7 cm, màu hồng nhạt, có nhiều lông mịn màu trắng. Đĩa mật hình khoen bao quanh gốc vòi nhụy. Quả hình cầu có đài màu vàng nâu, bóng [2,3]. 1.2.3. Thành phần hóa học Qua định tính sơ bộ, thành phần hóa học trong cây Mơ tam thể cho thấy có sự hiện diện của các hợp chất: steroid, flavonoid, saponin, tanin, coumarin, glycosid, alcaloid và tinh dầu [7,9]. Từ năm 1979 trở về trước, tại Nhật Bản, các iridoid glucosid đã được tìm thấy trong cây Mơ tam thể. Trong đó có cả các iridoid chứa lưu huỳnh như paederosid (1), asperulosid (2) và acid paederosidic (3) được tìm thấy trong thân và lá [21,24]. Các chất này cũng được công bố trong một nghiên cứu tại Trung Quốc [29]. Năm 2002, tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu của trường Đại học Sư phạm Hà Nội và các nhà khoa học Nhật Bản đã phân lập được bốn iridoid glucosid, ba trong số đó là dimeric từ dịch chiết methanol của rễ cây Mơ tam thể [25]. Cùng trong nghiên cứu này cũng phân lập được năm glucosid đã biết trước đó: paederosid, asperulosid, acid paederosidic, acid asperulosidic (4), geniposid (5) [25,30]; và bảy glucosid iridoid chứa lưu huỳnh [25]. 6
15. 1 2 3 4 5 Hình 1.2. Một số iridoid glucosid Năm 2009, PGS.TS. Đặng Ngọc Quang đã phân lập được 7 hợp chất anthraquinon (6-12) từ rễ cây Mơ tam thể. Các anthraquinon này đều cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh [23]. 7
16. 6 7 8 9 10 11 12 Hình 1.3. 7 hợp chất anthraquinon từ rễ cây Mơ tam thể Năm 2011, từ lá của cây Mơ tam thể, các nhà khoa học tại Đại học Saga, Nhật Bản đã phân lập được 9 hợp chất bao gồm: acid 4-O-caffeoylquinic (13), acid chlorogenic (14), rutin (15), kaempferol 3-O-β-rutinosid (16), acid paederosid-paederosidic (17), quercetin 3-O-β-glucosid (18), kaempferol 3-O-β- glucosid (19), quercetin (20) và kaempferol (21) [22]. 8
17. 13: R1= H, R2= caffeoyl 15: R1= OH, R2= rutinosyl 16: R1= H, R2= rutinosyl 14: R1= caffeoyl, R2= H 18: R1= OH, R2= glucosyl 19: R1= H, R2= glucosyl 20: R1= OH, R2= OH 21: R1= H, R2= OH Hình 1.4. Một số hợp chất phân lập từ lá Mơ tam thể, Nhật Bản (2011) Năm 2018, theo nhóm nghiên cứu của trường đại học Cần Thơ, từ cao ethyl acetat đã phân lập, tinh chế và định danh được năm hợp chất trong đó: 1-ethyl-O-β-D-glucopyranosid (22), kaempferol-7-O-α-L-rhamnopyranosid (23), 6-hydroxygeniposid (24) lần đầu tiên được phân lập từ cây Mơ tam thể; hai hợp chất còn lại là kaempferol (25) và 6-hydroxygeniposid (26) [9]. 1.2.4. Tác dụng dược lí 1.2.4.1. Tác dụng chống oxy hóa Nhóm nghiên cứu của trường đại học Nông Lâm, đại học Huế (2019) đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của lá mơ tam thể và so sánh với khả năng chống oxy hóa của mơ tròn (P. foetida, loài này đã có nhiều nghiên cứu công bố khả năng chống oxy hóa). Khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết lá mơ tam thể được xác định bằng phương pháp ferric thiocyanat (FTC) và được so sánh với các chất kháng oxy hóa khác. Kết quả phân tích cho thấy rằng khả năng kháng oxy hóa trong mẫu tươi cao hơn mẫu khô. Khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết lá mơ tam thể tương đương lá mơ tròn nhưng thấp hơn của vitamin C và E. Hai thành phần được cho là có khả năng kháng oxy hóa cao trong lá mơ tam thể là polyphenol và vitamin C đã được xác định với hàm lượng tương ứng là 32,91 và 30,13% [11]. Tác dụng kép ức chế alpha glucosidase và chống oxi hóa của lá mơ tam thể là do các hợp chất polyphenol [17]. Nghiên cứu invivo trên chuột mắc tiểu đường 9
18. đã chỉ ra rằng những hợp chất này làm giảm stress oxy hóa thông qua khả năng thu gom các gốc oxy tự do và ngăn ngừa phá hủy tế bào [15]. Các hợp chất polyphenol trong các loại rau ăn có thể là nguồn chất chống oxi hóa tự nhiên có lợi cho sức khỏe con người [16]. 1.2.4.2. Tác dụng hạ đường huyết Các hợp chất polyphenol chống lại enzym thủy phân carbohydrat góp phần làm giảm tăng đường huyết sau ăn trong điều trị bệnh tiểu đường cũng đã được xác nhận có trong lá mơ tam thể. Hoạt động ức chế alpha glucosidase của các chất này cho thấy tiềm năng giúp hạ đường huyết trong điều trị tiểu đường [17]. 1.2.4.3. Tác dụng kháng khuẩn, kháng virus Theo nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn Helicobacter pylori từ dịch chiết ethanol của mơ tam thể. Kết quả mơ tam thể có hoạt tính kháng khuẩn tốt với MIC trong khoảng 3,1 – 4,7 mg/mL. Cho thấy loài này cũng có tiềm năng trong phòng ngừa và điều trị H. pylori kháng thuốc [18]. Cũng trong một nghiên cứu khác kiểm tra và sàng lọc về hoạt động chống H. pylori của các chất chiết xuất từ 50 cây thuốc dân gian phổ biến ở Đài Loan. Kết quả cho thấy mơ tam thể có khả năng kháng H. pylori lớn nhất [26]. Các anthraquinon có trong mơ tam thể cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Bên cạnh đó là những hoạt tính sinh học quan trọng như tác dụng ức chế Epstein- Barr virus [14], tác dụng kháng virus khác và hoạt tính gây độc tế bào [23]. Dịch chiết của lá mơ tam thể ức chế vi khuẩn Bacillus pumilus, nước sắc và dịch chiết cồn theo phương pháp nóng, lạnh ức chế Escherichia coli; iridoids và tinh dầu đều ức chế tụ cầu vàng Staphylococcus aureus [7,29]. 1.2.4.4. Tác dụng bảo vệ gan Hiệu quả bảo vệ gan được khảo sát trên chuột tổn thương gan bằng carbon tetrachlorid (CCl4) pha trong dầu olive (tỉ lệ 1:4). Chuột được cho uống dịch chiết lá mơ tam thể liều 100, 200 và 400 mg/kg trọng lượng chuột/lần × 1 lần/ngày. Sau 4 tuần khảo sát, kết quả cho thấy dịch chiết lá mơ tam thể có hiệu quả bảo vệ gan 10
19. dựa trên sự giảm hàm lượng enzym chỉ thị chức năng gan ở các liều khảo sát so với nhóm chuột không được điều trị. Kết quả phân tích mô bệnh học gan chuột được điều trị bằng lá mơ tam thể cho thấy mô gan được cải thiện so với nhóm đối chứng bệnh, sự cải thiện này tương đương với nhóm điều trị bằng silymarin. Chứng minh được hiệu quả của mơ tam thể trong hoạt động chống oxy hóa và bảo vệ gan [10]. Trong một nghiên cứu khác (2018) trên dòng tế bào HepG2 được gây tổn thương bởi CCl4 (1%), cho thấy cao chiết lá mơ tam thể không gây độc tính cho tế bào HepG2 ở nồng độ 500 µg/mL. Bên cạnh đó, thí nghiệm còn chứng minh cao chiết methanol lá mơ tam thể có hiệu quả trong việc bảo vệ tế bào gan kháng lại độc tính gây ra bởi CCl4 trên dòng tế bào HepG2 [8]. 1.2.4.5. Tác dụng chống tiêu chảy Tác dụng chống tiêu chảy của mơ tam thể đã được chứng minh qua nghiên cứu trên mô hình chuột tiêu chảy do dầu thầu dầu và magnesi sulfat. Dịch chiết ethanol 90% của lá mơ tam thể được đánh giá làm giảm đáng kể nhu động của đường tiêu hóa [19,20]. 1.2.5. Công dụng theo Y học cổ truyền Tính vị, tác dụng: vị đắng, tính mát; có tác dụng thanh nhiệt, sát trùng [3]. Nhân dân ta quen dùng lá mơ tam thể để chữa kiết lỵ, đi ngoài ra máu hoặc có sốt, hay đại tiện thất thường, ỉa chảy phân lổn nhổn: người ta lấy lá mơ tam thể (30g) thái nhuyễn trộn với một quả trứng gà, thêm vài hạt muối, đánh đều, dàn mỏng trên lá chuối, gói lại rồi lót thêm một lần lá chuối, đặt trên chảo, rang hoặc nướng cho chín, đến khi thấy cháy lá chuối dưới sém vào lá gói thì lật trên xuống dưới như đúc chả trứng cho chín mà ăn (không dùng mỡ). Ăn ngày 2 lần, trong 3- 5 ngày liền là khỏi [2,3]. Ðể trục giun kim và giun đũa, cũng dùng lá mơ tam thể giã nhỏ, cho tí muối ăn sống hoặc vắt lấy nước uống, uống liền 3 buổi sáng vào lúc đói thì giun ra. Ðể trừ giun kim, ngoài cũng dùng lá mơ tam thể một nắm 30g, chế vào 50ml nước 11
20. chín, vắt lấy nước cốt bơm thụt vào hậu môn, giữ lại khoảng 20 phút vào lúc 8-9 giờ tối trước khi đi ngủ, giun sẽ bò ra [3]. Lá mơ tươi đem nướng rồi nhét lỗ tai trị viêm tai chảy máu mủ, chảy nước vàng [3]. Mơ tam thể còn có trong các bài thuốc chữa sôi bụng, ăn khó tiêu; chữa ho gà; chữa đau dạ dày và bí tiểu tiện [4]. Người dân Ấn Độ còn dùng cây này để uống trong và xoa bóp để chữa tê thấp; nước sắc cho thêm đường, gừng [2]. Tại Philipin, người dân uống nước sắc lá chữa bệnh sỏi thận, bí tiểu tiện [2]. Ở Bangladesh, lá mơ tam thể được giã nát dùng đắp chữa mụn nhọt [31]. Nhìn chung, các nghiên cứu về cây Mơ tam thể tại Việt Nam và trên thế giới đã công bố về một số hợp chất phân lập được từ các bộ phận cây: rễ, thân lá. Bên cạnh đó là một số tác dụng sinh học như chống oxi hóa, kháng khuẩn, kháng virus, bảo vệ gan, Tuy nhiên, số lượng các nghiên cứu chưa nhiều. Do vậy, cần có thêm nhiều nghiên cứu nữa về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của loài này để làm cơ sở khoa học cho các kinh nghiệm sử dụng đã có, ứng dụng cây Mơ tam thể nhiều hơn nữa trong cuộc sống. 12
21. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu Cây Mơ tam thể được thu hái vào ngày 20/12/2020 tại xã Vân Hòa, huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội. Mẫu lá được thu hái, phơi sấy, bảo quản trong túi nilon kín, làm nguyên liệu cho các phản ứng định tính thành phần hóa học và chiết xuất, phân lập hợp chất. Bảo quản, lưu mẫu tại Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội (số hiệu tiêu bản: UMP- 062021). 2.1.2. Hóa chất, thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất Hóa chất dùng trong tẩy nhuộm vi phẫu: nước javen, chloralhydrat, acid acetic, xanh metylen, đỏ carmin và nước cất. Các hóa chất dùng để định tính: H2SO4 1N, NH3, NaOH 10%, Mg, HCl, FeCl3 5%, Na2CO3, thuốc thử Liebermann, Baljet, Legal, Mayer, Bouchardat, Dragendorff, Fehling A, B, Các dung môi dùng để chiết xuất và phân lập: Ethanol (EtOH) 70%, n- hexan, ethyl acetat (EtOAc), chloroform (CHCl3), methanol (MeOH), aceton (Ac), nước (H2O) đạt tiêu chuẩn tinh khiết. 2.1.2.2. Thiết bị Thiết bị để nghiên cứu thực vật: kính hiển vi, lam kính, kính hiển vi soi nổi, kính hiển vi gắn camera Optika, tại trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Sắc ký lớp mỏng: dùng bản mỏng tráng sẵn Kieselgel 60 F254 (Merck, silicagel, dày 0,20 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, silicagel, dày 0,25 mm). 13
22. Sắc ký cột: Sử dụng các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau, hạt silicagel pha thường (Merck) cỡ hạt 0,063 – 0,200 mm và cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm, pha đảo RP-18 (Merck) cỡ hạt 0,03 – 0,05 mm tại trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Nhiệt độ nóng chảy: Đo trên máy SMP10 BioCote tại trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN. Phổ khối ESI-MS: Đo trên máy Agilent 1100 LC/MSD tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR): được ghi trên máy AVANCE AV 500 MHz (Bruker, Đức) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Dụng cụ thí nghiệm: cốc có mỏ, bình nón, bình chiết, pipet, ống đong, ống nghiệm, thuộc Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN. Các thiết bị khác: cân phân tích, máy cô quay chân không, máy siêu âm, tủ sấy, tủ hút, đèn soi UV, bể cách thủy tại Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Bộ môn Bào chế và Công nghệ Dược phẩm, trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu về đặc điểm thực vật Phân tích hình thái thực vật: mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp mô tả phân tích. Làm tiêu bản mẫu khô theo phương pháp làm tiêu bản cây khô. Nghiên cứu đặc điểm vi học: mẫu sau khi thu hái, được đem xử lý bằng phương pháp thích hợp rồi nghiên cứu theo tài liệu [5]. - Vi phẫu thân, lá: + Chọn mẫu thích hợp + Cắt tiêu bản bằng dụng cụ cắt vi phẫu 14
23. + Xử lý lát cắt: Lựa chọn những lát cắt mỏng, đủ tiêu chuẩn, tẩy bằng dung dịch javen, rửa sạch bằng nước cất, tẩy tiếp bằng chloralhydrat 75%, rửa lại bằng nước cất, ngâm trong acid acetic 5%, rửa bằng nước cất đến hết acid. Sau đó tiến hành nhuộm với xanh methylen và đỏ carmin. + Quan sát, mô tả và chụp ảnh: Lên tiêu bản rồi quan sát dưới kính hiển vi, mô tả đặc điểm giải phẫu, chụp ảnh qua kính hiển vi gắn máy ảnh. - Bột dược liệu: + Mẫu nghiên cứu được sấy khô, nghiền thành bột. + Quan sát trực tiếp, nếm, ngửi để biết được màu, mùi, vị. + Lên tiêu bản bột theo phương pháp giọt ép. Quan sát cấu tạo giải phẫu và đặc điểm bột dược liệu dưới kính hiển vi, mô tả và chụp ảnh những đặc điểm điển hình của bột qua kính hiển vi gắn máy ảnh. 2.2.2. Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá cây Mơ tam thể Nguyên liệu nghiên cứu là lá cây Mơ tam thể đã được phơi sấy khô. Các phương pháp định tính tham khảo trong tài liệu [6]. ➢ Định tính alcaloid Lấy 2 g dược liệu đã làm nhỏ, cho vào bình nón dung tích 50 mL. Thêm 15 mL dung dịch thấm ẩm H2SO4 1N. Đun đến sôi, để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 mL. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH 9- 10. Chiết alcaloid base bằng chloroform (3 lần, mỗi lần 5 mL). Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng natri sulfat khan, sau đó đem lắc với H2SO4 1N (2 lần, mỗi lần 5 mL). Gộp các dịch chiết nước chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 mL để làm các phản ứng: • Phản ứng với thuốc thử Mayer: Thêm 2 – 3 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy xuất hiện tủa trắng thì phản ứng dương tính. • Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: Thêm 2 – 3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dương tính. 15
24. • Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: Thêm 2 – 3 giọt thuốc thử Dragendorff, nếu thấy xuất hiện kết tủa cam thì phản ứng dương tính. ➢ Phương pháp định tính iridoid glycosid Lấy 2 g dược liệu đã làm nhỏ, cho vào bình nón dung tích 50 mL. Thêm 15 mL ethanol 90%, thỉnh thoảng lắc. Sau vài giờ gạn lấy dịch chiết. • Phản ứng với thuốc thử Trim-Hill Thuốc thử Trim-Hill: 10ml acid acetic + 1ml CuSO4 0,2% + 0,5ml HCl 1%. Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết ethanol, thêm 15 ml thuốc thử. Đun nóng sẽ xuất hiện màu xanh dương hoặc tím đỏ. Tuy nhiên, cũng có một số iridoid glycosid âm tính với thuốc thử trên. Chuẩn bị: Lấy dược liệu đã làm nhỏ, cho nước ngập dược liệu (cách bề mặt dược liệu khoảng 2 cm), đun sôi trong 30 phút. Sau 30 phút, lấy dịch chiết ra, lọc nóng thu được dịch lọc. Dịch lọc lại đem cô đến cắn (cắn toàn phần). ➢ Định tính saponin • Quan sát hiện tượng tạo bọt: Hòa tan một ít cắn vào khoảng 5 mL nước cất. Đun cách thủy 10 phút, lọc qua bông lấy dịch chiết vào ống nghiệm to. Thêm nước cất đến khoảng 10 mL, bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút. Để yên và quan sát cột bọt, thấy cột bọt bền sau 15 phút thì dương tính. ➢ Định tính flavonoid Hòa tan cắn vào EtOH 90%, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc để làm các phản ứng: • Phản ứng với hơi amoniac (NH3): Nhỏ vài giọt dịch lọc lên miếng giấy lọc, để khô rồi hơ lên miệng lọ amoniac đặc, quan sát nếu thấy vết chất chuyển sang màu vàng thì phản ứng dương tính. 16
25. • Phản ứng với dung dịch kiềm loãng: Cho dịch lọc vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch NaOH 10%, nếu thấy dịch vẩn đục màu vàng thì phản ứng dương tính. • Phản ứng Cyanidin: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống khoảng 1 mL dịch lọc, 1 ống thêm ít bột Mg kim loại rồi nhỏ từ từ vài giọt HCl đậm đặc, ống còn lại để đối chiếu. Khi phản ứng xong quan sát nếu thấy ống phản ứng xuất hiện màu đỏ cam đậm hơn ống đối chiếu thì phản ứng dương tính. • Phản ứng với dung dịch sắt (III) chlorid: Cho khoảng 1 mL dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Lắc đều, nếu thấy xuất hiện màu xanh đen thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính coumarin Chuẩn bị dịch lọc như phần định tính flavonoid để làm phản ứng mở đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 mL dịch lọc: + Ống 1: thêm 0,5 mL NaOH 10%. + Ống 2: để nguyên. Đun cả 2 ống trong 2 phút, để nguội, nếu thấy hiện tượng + Ống 1: có tủa đục màu vàng. + Ống 2: trong suốt. Thêm từ từ nước cất vào cả 2 ống đến 4 mL: + Ống 1: trong suốt. + Ống 2: có tủa đục. Thêm vài giọt HCl đặc vào ống 1, ống 1 trở lại đục như ống 2 thì phản ứng dương tính. 17
26. ➢ Phương pháp định tính tanin Hòa tan cắn trong nước nóng. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 2 mL dịch lọc. + Ống 1: Thêm vài giọt sắt (III) chlorid 5% nếu thấy xuất hiện tủa màu xanh đen thì phản ứng dương tính. + Ống 2: Thêm vài giọt chì acetat 10% nếu thấy xuất hiện tủa bông thì phản ứng dương tính. + Ống 3: Thêm vài giọt gelatin 1% nếu thấy xuất hiện tủa bông trắng thì phản ứng dương tính. ➢ Phương pháp định tính anthraquinon Các hợp chất anthraquinon khi tác dụng với kiềm (amoniac, natri hydroxyd hoặc kali hydroxyd) sẽ tạo các dẫn chất phenolat có màu đỏ sim tan trong nước. Dựa vào tính chất này, định tính anthraquinon dựa trên phản ứng Borntraeger. • Phản ứng Borntraeger: Hòa tan một ít cắn vào 10 mL H2SO4 1N. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc cho vào bình gạn. Chiết bằng 10 mL chloroform, gạn lấy lớp chloroform vào ống nghiệm, cô bớt dung môi còn khoảng 1 mL, thêm 1 mL NaOH 10% vào, lắc nhẹ, nếu xuất hiện màu đỏ sim thì phản ứng dương tính. ➢ Phương pháp định tính terpenoid Hòa tan cắn vào EtOH 90%, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc để làm phản ứng • Phản ứng Salkowski: pha hỗn hợp gồm 1 mL dung dịch mẫu thử, 1 mL chloroform, 1 mL H2SO4 đậm đặc; phản ứng dương tính khi dung dịch đổi thành màu đỏ đậm, xanh, xanh tím. ➢ Phương pháp định tính steroid Hòa tan cắn vào EtOH 90%, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc để làm phản ứng 18
27. • Phản ứng Liebermann-Burchard Cho vào ống nghiệm anhydrid acetic (1 mL), chloroform (1 mL), làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Cho mẫu thử vào ở dạng rắn hoặc pha trong chloroform. Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu xanh dương, lục, cam hoặc đỏ; màu này bền không đổi. • Phản ứng Rosenheim: Cho vào ống nghiệm dung dịch mẫu thử (1 mL), thêm acid trichloroacetic (2 giọt), lắc đều. Phản ứng dương tính là sau 20 phút dung dịch dung dịch đổi thành màu xanh dương. ➢ Định tính đường khử Hòa tan cắn vào 1 mL nước nóng, đem lọc thu được dịch lọc. Thêm vào đó 1 mL dung dịch thuốc thử Fehling A và 1 mL dung dịch thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy sôi vài phút nếu thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính acid hữu cơ Hòa tan cắn trong nước nóng, để nguội rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp. Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2 mL dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3 nếu thấy có bọt khí bay lên thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính tinh dầu Hòa tan cắn vào EtOH 90%, lọc qua giấy lọc gấp nếp, lấy 2 mL dịch lọc cho vào ống nghiệm. Thêm 0,1 mL dung dịch NaOH 5% và 3 giọt dung dịch HCl 5%. Xuất hiện kết tủa trắng chứng tỏ trong thành phần dược liệu có chứa tinh dầu. 2.2.3. Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có trong lá cây Mơ tam thể 2.2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất Mẫu lá cây Mơ tam thể được thu hái, rửa sạch, phơi khô, ngâm chiết 3 lần bằng dung môi EtOH 70% ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Lọc các dịch chiết 19
28. ethanol thu được qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao chiết tổng ethanol. Phân tán cao chiết này trong nước cất và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc (mỗi dung môi 3 lần). Các dịch chiết n-hexan, EtOAc được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng. 2.2.3.2. Phương pháp phân lập các hợp chất Sử dụng các phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng (dùng để khảo sát) và sắc ký cột để phân lập các hợp chất. - Sắc ký lớp mỏng: được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60G F254, độ dày 0,2 mm và RP-18 F254 (Merck), độ dày 0,25 mm. Sau khi triển khai sắc ký, phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, sau đó phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ đến khi hiện màu. - Sắc ký cột: thực hiện với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo, lựa chọn hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Silicagel pha thường cỡ hạt là 0,063 - 0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (Merck); pha đảo RP-18 cỡ hạt 0,03 – 0,05 mm (Merck). 2.2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C- NMR), thiết lập bộ dữ liệu của chất phân lập được. Sau đó so sánh dữ liệu thu được từ các chất đã phân lập với dữ liệu các chất đã công bố. 20
29. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả mô tả đặc điểm thực vật 3.1.1. Mô tả đặc điểm hình thái thực vật Cây thân leo thành bụi, sống lâu năm. Thân trưởng thành tiết diện tròn, thân non hơi dẹt. Thân non màu xanh nhạt, thân già màu nâu, dọc theo thân có nhiều lông tơ ngắn màu trắng bao phủ bên ngoài. Lá đơn, mọc đối, gắn với thân bởi cuống dài 2-4 cm. Phiến lá có hình trứng hoặc hình mác dài 9-11 cm, rộng 4-6 cm, một đầu nhọn, phần lá dưới cuống tạo thành hình trái tim; mép lá phẳng; mặt trên lá màu xanh và mặt dưới có màu tím tía; hệ gân lông chim với các gân nổi rõ ở mặt dưới lá, có 7-8 gân đôi màu xanh. Cuống lá có rãnh nông hướng lên trên. Hai lá kèm ở giữa 2 cuống lá màu xanh, dạng vảy tam giác dài 0,4 cm. Toàn bộ lá cũng có nhiều lông tơ mịn. Hình 3.1. Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng cây Mơ tam thể Chú thích: 1.Cành mang lá; 2. Hình thái lá; 3. Lá kèm; 4. Cuống lá; 5. Mép lá; 6. Mặt sau lá; 7. Mặt trước lá 21
30. Cụm hoa mơ tam thể mọc xen ở các kẽ lá hoặc đầu ngọn cành thành từng chùm, dài từ 10-40 cm. Mỗi cụm lại gồm nhiều bông nhỏ, lưỡng tính. Đài hoa có 5 hoặc 6 lá đài hình tam giác nhỏ tách rời, đều nhau cao khoảng 1 mm, màu xanh đậm ngả nâu. Lá bắc hình tam giác nhỏ dài khoảng 2 mm. Tràng hoa có 5 cánh đều nhau, ít khi 6 cánh; các cánh hoa dính liền với nhau ở phần dưới tạo thành hình chuông dài khoảng 0,5 cm, bên ngoài ống chuông có màu tím và nhiều lông trắng mịn, bên trong ống có nhiều lông tiết dài khoảng 0,3 cm màu tím nhạt; cánh hoa ở trên xòe ra khoảng 0,2 cm, màu trắng, mép cánh hoa uốn lượn 3-4 nếp. Bộ nhị gồm 5 nhị rời, gắn ở đáy ống chuông xen giữa các cánh hoa, chỉ nhị màu hồng dài khoảng 0,2 cm. Bao phấn có 2 ô màu ngả vàng, thuôn dài 0,3 cm, nứt dọc, đính lưng. Bộ nhụy có 2 ô, mỗi ô có 1 noãn; vòi nhụy ngắn màu hồng nhạt; 2 đầu nhụy hình sợi uốn lượn, dài khoảng 0,6 cm, màu trắng hơi hồng, có nhiều lông mịn. Hoa cây mơ tam thể thường ra vào tháng 7 đến tháng 10 hàng năm. Hình 3.2. Đặc điểm cơ quan sinh sản cây Mơ tam thể Chú thích: 1. Cụm hoa; 2. Hoa nguyên vẹn; 3. Tràng hoa; 4. Đài hoa; 5. Lá bắc; 6. Bộ nhị; 7. Bao phấn; 8. Bao phấn đính lưng; 9. Đầu nhụy; 10. Bầu cắt ngang 22
31. 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu của cây Mơ tam thể ➢ Vi phẫu thân Vi phẫu hình tròn hơi dẹt hai bên. Cấu tạo từ ngoài vào trong gồm: ngoài cùng là lớp biểu bì tạo thành từ một hàng tế bào xếp liền, các tế bào hình chữ nhật kích thước không đều nhau; bên ngoài có phủ một lớp cutin mỏng hình răng cưa, có lông che chở, đa bào (1). Tiếp theo là mô dày góc gồm 2-3 lớp tế bào đa giác không đều nhau (2). Mô mềm gồm 3-4 lớp tế bào hình bầu dục không đều nằm ngang (3). Tầng sinh bần có một lớp bần và các lớp lục bì xếp thành dãy. Trụ bì có 3-4 lớp tế bào đa giác, kích thước không đều xen lẫn nhau (4). Libe gỗ xếp thành vòng khép kín lượn sóng gồm libe ở phía bên ngoài (5) và gỗ ở bên trong (6). Libe gồm các tế bào đa giác, kích thước không đều, vách uốn lượn. Phần gỗ còn có các mạch gỗ hình đa giác tròn, kích thước lớn, phân bố thành từng cụm. Trong cùng là mô mềm tủy gồm các lớp tế bào có thành mỏng, hình đa giác hoặc tròn, kích thước không đều, xếp lộn xộn (7). Hình 3.3. Đặc điểm vi phẫu thân cây Mơ tam thể Chú thích: 1. Biểu bì 2. Mô dày 3. Mô mềm 4. Trụ bì 5. Libe 6. Gỗ 7. Mô mềm tủy 23
32. ➢ Vi phẫu lá Gân giữa: Vi phẫu lồi lên ở cả 2 mặt trên và dưới, mặt dưới lồi nhiều hơn. Biểu bì trên và dưới đều là một hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều nhau; có lớp cutin mỏng răng cưa và các lông che chở. Mô dày trên và mô dày dưới gồm 3-4 lớp tế bào đa giác, kích thước không đều. Mô mềm có các tế bào đa giác gần tròn, không đều nhau. Bó dẫn hình cung, bên dưới là libe, bên trên là gỗ. Libe tế bào hình đa giác xếp thành vòng cung. Mạch gỗ tròn hoặc gần tròn xếp thành dãy xen kẽ mô mềm. Phiến lá: Biểu bì trên và dưới là một hàng các tế bào hình chữ nhật không đều; tế bào biểu bì trên lớn gấp 2-3 lần tế bào biểu bì dưới, lớp cutin mỏng, và lông che chở hai mặt, biểu bì dưới có lỗ khí. Mô giậu dưới biểu bì trên gồm 1 lớp tế bào hình dấu phẩy xếp không khít nhau. Mô khuyết gồm 3-4 lớp tế bào đa giác hoặc tròn, kích thước không đều, xếp lộn xộn. Bó gân phụ nằm rải rác trong vùng mô mềm. Hình 3.4. Đặc điểm vi phẫu lá cây Mơ tam thể Chú thích: 1. Biểu bì trên; 2. Mô dày trên; 3. Gỗ; 4. Libe; 5. Mô mềm; 6. Mô dày dưới; 7. Biểu bì dưới; 8. Mô giậu; 9. Mô khuyết; 10. Lông che chở 24
33. 3.1.3. Đặc điểm bột dược liệu Quan sát đại thể: Bột lá có màu xanh đậm, thể chất xốp, mùi đặc trưng, vị chát. Soi dưới kính hiển vi có các đặc điểm sau: Nhiều lông che chở đa bào bị gãy hoặc dính với biểu bì, mặt ngoài lông có lấm tấm những vảy nhỏ như gai. Nhiều mảnh mạch mạng và các mảnh mạch vạch. Mảnh biểu bì trên tế bào hình chữ nhật kích thước đều, vách thẳng, có vân. Mảnh biểu bì dưới tế bào đa giác vách uốn lượn có vân mang nhiều lỗ khí kiểu song bào. Có thấy nhiều tinh thể calci oxalat hình kim. Hình 3.5. Đặc điểm vi phẫu bột lá cây Mơ tam thể Chú thích: 1. Lông che chở; 2. Mảnh mạch mạng; 3. Mảnh mạch vạch; 4. Mảnh biểu bì trên; 5. Mảnh biểu bì dưới; 6,7. Tinh thể calci oxalat 25
34. 3.2. Kết quả định tính các nhóm chất có trong lá cây Mơ tam thể Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá cây Mơ tam thể bằng phản ứng đặc trưng được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá cây Mơ tam thể bằng phương pháp hóa học STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Nhận xét 1 Saponin Hiện tượng tạo bọt - Không có Thuốc thử Mayer + 2 Alcaloid Thuốc thử Dragendorff + Có Thuốc thử Bouchardat + Iridoid 3 Thuốc thử Trim-hill ++ Có glycosid Phản ứng với hơi NH3 - Phản ứng với NaOH 10% + 4 Flavonoid Có Phản ứng Cyanidin + Phản ứng với FeCl3 ++ 5 Coumarin Phản ứng đóng mở vòng lacton - Không có Phản ứng với FeCl3 5% ++ 6 Tanin Phản ứng với gelatin 1% + Có Phản ứng với chì acetat 10% ++ 7 Anthraquinon Phản ứng Borntraeger + Có 8 Steroid Phản ứng Liebermann-Burchard - Không có 9 Terpenoid Phản ứng Salkowski ++ Có 10 Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling - Không có 11 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 - Không có 12 Tinh dầu Phản ứng với NaOH 5% + Có Ghi chú: (-) âm tính, (+) dương tính, (+++) dương tính rõ. Nhận xét: Bằng các phản ứng hóa học, sơ bộ nhận thấy dược liệu lá Mơ tam thể có các nhóm hợp chất: alcaloid, iridoid glycosid, flavonoid, tanin, anthraquinon, terpenoid, tinh dầu. 26
35. 3.3. Kết quả chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất 3.3.1. Chiết các phân đoạn từ lá cây Mơ tam thể Mẫu lá cây mơ tam thể được rửa sạch, phơi sấy khô, cắt nhỏ. Cân 1,4 kg lá cây đã làm nhỏ và đem ngâm chiết bằng dung môi EtOH 70% (3 lần, mỗi lần 8 L), sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40 oC trong vòng 30 phút. Lọc các dịch chiết EtOH thu được qua giấy lọc, gộp các dịch chiết lại và mang cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 110 g cao chiết tổng ethanol. Lấy 100 g cao chiết phân tán trong nước cất (600 mL) và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 600 mL). Các dịch chiết n- hexan, EtOAc được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng n-hexan (35,4 g) và ethyl acetat (56,3 g). Hình 3.6. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Mơ tam thể 27
36. 3.3.2. Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột Tiến hành phân tách phân đoạn dịch chiết EtOAc (50,0 g) trên cột sắc ký silicagel (Φ85 mm × 90 mm) với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần bao gồm n-hexan : EtOAc (5:1 → 1:1, v/v, mỗi phân đoạn 600 mL) và tiếp sau là CHCl3 : MeOH (10:1 → 1:1, v/v, mỗi phân đoạn 500 mL) thu được 4 phân đoạn ký hiệu là L1 ~ L4. Từ phân đoạn L1 (7,6 g), chạy sắc ký cột silicagel (Φ45 mm × 350 mm) với hệ pha động CHCl3 : MeOH (10:1; 6:1; 3:1, v/v, 2,0 L) thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn là L1.1 ~ L1.3. Phân tách phân đoạn nhỏ L1.1 (2,1 g) bằng sắc ký cột pha thường sử dụng hệ dung môi rửa giải CHCl3 : Aceton (10:1, v/v, 1,0 L) thu được 1 hợp chất ký hiệu là LT1 (19 mg). Phân tách phân đoạn nhỏ L1.2 (2,9 g) bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi MeOH: CHCl3 (5:1, v/v) thu được 1 hợp chất ký hiệu là LT2 (18 mg). Hình 3.7. Sơ đồ phân lập 2 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của lá cây Mơ tam thể 28
37. 3.3.3. Kết quả xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được 3.3.3.1. Hợp chất LT1: 5,7,3’-trihydroxy-5’-methoxy isoflavon Hợp chất LT1 được phân lập dưới dạng chất rắn, màu vàng. Nhiệt độ nóng chảy: 302-303 oC. + Phổ ESI-MS: m/z 301 [M+H] . Công thức phân tử: C16H12O6 (M = 300). Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của chất LT1 và chất tham khảo [33] được trình bày ở Bảng 3.2. 1 Phổ H-NMR của hợp chất LT1 xuất hiện tín hiệu singlet ở trường thấp δH 8,09 (H-2). Hai tín hiệu doublet ở δH 6,25 (d, J = 2,0 Hz, H-8); 6,37 (d, J = 2,0 Hz, H-6) của vòng A trong khung isoflavon. Vòng B đã có sự thay đổi tín hiệu của phenyl thế 1, 4 được thay thế bằng vòng phenyl thế 1, 3, 5 với tín hiệu ở δH 6,99 (2H, H-2', H-6' ) và 7,07 (1H, H-4'). Phổ 13C-NMR của hợp chất LT1 cho tín hiệu của 16 nguyên tử carbon bao gồm tín hiệu của nhóm carbonyl ở δC 180,1 (C-4), nhóm methoxy ở δC 56,5. Trên cơ sở các dữ liệu phổ cho thấy hợp chất LT1 là hợp chất isoflavon. Kết hợp so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất tham khảo [33], cho phép xác định hợp chất LT1 là 5,7,3’-trihydroxy-5’-methoxy isoflavon. Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất LT1 29
38. Bảng 3.2. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của LT1 và chất tham khảo a,c Qb,c a,d Qb,d Vị trí δC δC δH (ppm) δH (ppm) C (ppm) (ppm) (Mult, J = Hz) (Mult, J = Hz) 2 155,1 155,4 8,09 (s) 8,00 (s) 3 125,3 124,9 4 180,1 182,2 5 163,9 161,1 6 100,3 99,2 6,37 (d; J = 2,0) 6,36 (s) 7 166,1 162,0 8 94,9 107,2 6,25 (d; J = 2,0) 9 159,8 156,5 10 106,3 106,1 1ꞌ 124,6 124,1 2ꞌ 112,8 116,6 6,99 (br s) 3ꞌ 147,5 150,6 4ꞌ 117,4 126,9 7,07 (s) 5ꞌ 149,3 144,9 6ꞌ 121,7 109,2 6,99 (br s) 6,37 (s) 5’-OMe 56,5 56,0 3,91 (s) 3,77 (s) a) b) c) d) đo trong CD3OD đo trong Me2CO-d6 125 MHz 500 MHz Q) của chất tham khảo Isopiscerythramin [33] 3.3.3.2. Hợp chất LT2: Chrysoeriol Hợp chất LT2 được phân lập dưới dạng chất rắn, màu vàng. Nhiệt độ nóng chảy: 302-303 oC. - Phổ ESI-MS: m/z 299 [M-H] . Công thức phân tử: C16H12O6 (M = 300). Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của chất LT2 và chất tham khảo [34] được trình bày ở Bảng 3.3. 30
39. Hình 3.9. Cấu trúc hóa học của hợp chất LT2 Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của LT2 và chất tham khảo a,c Zb,c a,d Zb,d Vị trí δC δC δH (ppm) δH (ppm) C (ppm) (ppm) (Mult, J = Hz) (Mult, J = Hz) 2 163,6 163,7 3 103,2 103,2 6,87 (s) 6,88 (s) 4 181,8 181,8 5 161,4 161,5 6 98,8 98,9 6,18 (d; J = 2,0) 6,19 (d; J = 2,0) 7 164,2 164,2 8 94,0 94,1 6,50 (d; J = 2,0) 6,50 (d; J = 2,0) 9 157,3 157,4 10 103,6 103,7 1ꞌ 121,5 121,5 2ꞌ 110,2 110,2 7,54 (s) 7,55 (m) 3ꞌ 148,0 148,1 4ꞌ 150,7 150,8 5ꞌ 115,7 115,8 6,93 (d; J = 8,5) 6,93 (d; J = 8,9) 6ꞌ 120,3 120,4 7,56 (dd; J = 2,0; 8,5) 7,55 (dd; J = 2,0; 8,9) 3’-OMe 56,0 56,0 3,89 (s) 3,89 (s) a) b) c) d) đo trong CD3OD đo trong DMSO-d6 125 MHz 500 MHz Z) của chất tham khảo Chrysoeriol [34] 31
40. Phổ 1H-NMR của hợp chất LT2 xuất hiện tín hai tín hiệu proton thơm của vòng A ở δH 6,50 (d, J = 2,0 Hz, H-8) và 6,18 (d, J = 2,0 Hz, H-6). Proton H-3 cho tín hiệu singlet ở δH 6,87. Vòng B xuất hiện tín hiệu proton tương tác spin hệ ABX ở δH: 7,56 (dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-6'), 7,54 (s, H-2'), 6,93 (d, J = 8,5 Hz, H-5'). 1 Tuy nhiên trên phổ H-NMR xuất hiện thêm một nhóm methoxy ở δH 3,89. Phổ 13C-NMR của hợp chất LT2 cho tín hiệu của 16 nguyên tử carbon bao gồm tín hiệu của một nhóm carbonyl ở δC 181,8 (C-4) và nhóm methoxy ở δC 56,0. Trên cơ sở các dữ liệu phổ cho thấy hợp chất LT2 là hợp chất flavon. Kết hợp so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất đã công bố [34] cho phép xác định hợp chất LT2 là Chrysoeriol. 3.4. Bàn luận ➢ Về đặc điểm thực vật Trong quá trình thực nghiệm, đề tài đã sử dụng mẫu nghiên cứu là cây Mơ tam thể (Paederia lanuginosa Wall.) thu hái tại huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội. So với các công bố trước đây về chi Paederia, nghiên cứu cũng đã mô tả chi tiết hơn về đặc điểm hình thái thực vật, đặc biệt về thân, lá, hoa với những hình ảnh rõ nét; đặc điểm vi phẫu thân, lá, soi bột lá và xác định được tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Paederia lanuginosa Wall Kết quả nghiên cứu thực vật và đặc điểm vi học góp phần phân biệt loài P. lanuginosa với các loài khác trong chi Paederia, góp phần xây dựng và hoàn thiện tiêu chuẩn cho dược liệu Mơ tam thể. Về đặc điểm thực vật, có một số khác biệt của loài P. lanuginosa so với các loài khác có thể thấy như: lông che chở đa bào (với loài P. scandens thân và lá không có lông, loài P. foetida lá không có lông [3], trong khi loài P. lanuginosa có lông che phủ toàn cây); lá (với loài P. foetida phiến lá hình bầu dục hay thon, tròn ở gốc, hai mặt lá đều màu lục. Loài P. scandens phiến lá có gốc tròn hay tù, hai mặt lá cũng đều màu xanh [4], trong khi loài P. lanuginosa phiến lá có gốc hình tim, mặt trên lá màu lục, mặt dưới màu đỏ tía); hoa (với loài P. foetida phần chóp ống tràng nhỏ, mặt bên ngoài ống tràng màu tím nhạt pha trắng, trong khi 32
41. loài P. lanuginosa có ống tràng bên ngoài màu tím, có khi hồng, chóp ống tràng lớn hơn). Nghiên cứu đã tiến hành phân tích đặc điểm vi phẫu thân, lá, soi bột lá của cây. Kết quả nghiên cứu cho thấy, các đặc điểm vi học của cây mang các đặc điểm chung đặc trưng của thực vật chi Paederia. Vi phẫu thân và lá khá rõ ràng, có thể quan sát được các lớp tế bào trên kính hiển vi. Các hình ảnh về cấu tạo vi học của cây rất rõ nét, có những mức phóng đại khác nhau, có thể dùng làm tư liệu cho việc tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm xác định mẫu cây Mơ tam thể; đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân biệt và so sánh các mẫu Mơ tam thể có trên thị trường, tránh dược liệu bị làm giả. ➢ Về định tính các nhóm chất Về định tính đã sử dụng các phương pháp hóa học để định tính các nhóm chất hóa học có trong dược liệu. Kết quả định tính được một số nhóm chất hữu cơ có trong mẫu lá cây Mơ tam thể phù hợp với các nghiên cứu trước đó tại việt Nam và trên thế giới là: alcaloid, iridoid glycosid, flavonoid, tanin, anthraquinon, terpenoid, tinh dầu. ➢ Về chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất Đề tài đã phân lập được hai hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat bằng phương pháp ngâm chiết với dung môi EtOH 70%, đó là 5,7,3’-trihydroxy-5’-methoxy isoflavon và Chrysoeriol. Sau đó, tiến hành xác định cấu trúc thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân, so với dữ liệu phổ công bố của các chất liên quan. Đây là hai chất lần đầu tiên phân lập được từ lá cây Mơ tam thể. Hợp chất 5,7,3’-trihydroxy-5’-methoxy isoflavon phân lập được là một isoflavon với nhóm 5’-methoxy. Nhóm chất isoflavon được tìm thấy nhiều trong thực vật, trong đó có thể kể đến các chất nổi bật như phytoestrogen có hoạt tính estrogen mạnh; genistein, daidzein và glycitein là những isoflavon nhiều hoạt tính nhất được tìm thấy trong hạt đậu nành; các hợp chất này có thể coi là chất bảo vệ 33
42. hóa học được sử dụng như một liệu pháp thay thế cho một loạt các rối loạn nội tiết tố, bao gồm một số loại ung thư, cụ thể là ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt, các bệnh tim mạch và loãng xương, các triệu chứng sau mãn kinh và ngăn ngừa một số bệnh mạn tính khác [35]. Tính đến thời điểm hiện tại, trên thế giới chưa có ghi nhận các công bố về tác dụng của hợp chất 5,7,3’-trihydroxy-5’-methoxy isoflavon. Tuy nhiên, có thể kể đến hai isoflavon chứa Nitơ có nhóm 5’-methoxy được tìm thấy trong rễ của loài Piscidia erythrina gây độc cho cá và có dược tính là piscerythramin, isopiscerythramin [33]. Một isoflavon nữa có nhóm 4’-methoxy là pratensein (5,7,3'-trihydroxy-4'-methoxy isoflavon), đã được phân lập từ vỏ lạc và xác định có hoạt tính kháng khuẩn [36]. Trong chiết xuất của loài Cuscuta kotchiana, pratensein và pratensein glycosid hoạt động mạnh ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư [37]. Do vậy, cần có thêm các nghiên cứu để đánh giá tác dụng dược lí của hợp chất 5,7,3’-trihydroxy-5’-methoxy isoflavon. Chrysoeriol là một flavon với nhóm 3' -methoxy, về mặt hóa học là một dẫn xuất của luteolin, thuộc nhóm hợp chất flavon và có nhiều trong các loại thực vật, rau và trái cây, kể cả dược liệu [38]. Chất này đã được nghiên cứu về các tác dụng sinh học khác nhau như bảo vệ hệ thần kinh [39], bảo vệ tim mạch [40], hoạt tính chống oxi hóa mạnh, cho thấy sự ức chế đáng kể quá trình peroxy hóa lipid [41,42], chống viêm, chống ung thư [43] và tác dụng kháng khuẩn [44,45]. Chrysoeriol được biết đến với hoạt tính ức chế protein kinase CK2, ức chế các dạng phân tử khác nhau của CK2 ở nồng độ thấp hơn so với các flavonoid khác [46]. Chrysoeriol đã được phân lập tự nhiên từ chi Artemisia, đây là một chi lớn và có chứa một dẫn xuất artemisinin, hiện được sử dụng trên toàn thế giới để điều trị bệnh sốt rét do Plasmodium falciparum gây ra [47]. Chrysoeriol cũng được phát hiện có tác dụng chống vi khuẩn đối với các vi khuẩn khác nhau [45]. Cho thấy rằng các flavonoid và các dẫn xuất có tầm quan trọng trong dược phẩm và các ứng dụng trong công nghiệp. Bên cạnh Artemisia, chrysoeriol cũng được phân lập từ các nguồn thực vật khác với nhiều tác dụng khác nhau: Digitalis purpurea, cảm ứng tổng hợp acid nitric bằng cách ức chế protein kích hoạt yếu tố hạt nhân (κB AP-1) [48]; Artemisia copa, nghiên cứu tác 34
43. dụng làm giãn mạch và hạ huyết áp thông qua dòng ức chế Ca2+ [49]; Capsicum frutescens, nghiên cứu so sánh các hoạt động chống oxy hóa và kháng khuẩn của các hợp chất phenolic [45]; Tecoma stans, hoạt tính ức chế lipase đối với bệnh đái tháo đường týp 2 [50]. Một nghiên cứu về Rooibos Tea (Aspalathus Linearis) hay còn gọi là hồng trà Nam Phi đã chỉ ra chrysoeriol có trong trà này cho thấy tác dụng giãn phế quản có chọn lọc trong số các hợp chất tinh khiết được thử nghiệm của Aspalathus Linearis. Trong nghiên cứu này cũng giới thiệu chrysoeriol là một flavonoid có hoạt tính sinh học được biết đến với các hoạt động chống oxy hóa, chống viêm, kháng u, kháng khuẩn, kháng vi rút và các hoạt động thu dọn gốc tự do [51]. Sự xuất hiện của chrysoeriol bị hạn chế trong thực vật. Gần đây, sinh tổng hợp chrysoeriol sử dụng luteolin làm tiền chất ban đầu đang được nghiên cứu như một cách tiếp cận kinh tế, thân thiện với môi trường và bền vững hơn. Quá trình sinh tổng hợp chrysoeriol từ Escherichia coli sử dụng đường O-methyltransferase (SpnK) từ xạ khuẩn Saccharopolyspora spinose để xúc tác phản ứng O-methyl hóa trên luteolin. Chrysoeriol tạo ra được thử nghiệm kháng khuẩn chống lại mầm bệnh ở người, kết quả thể hiện hoạt tính chống vi khuẩn mạnh với 9 chủng Gram âm và Gram dương thử nghiệm [34]. Việc phân lập được chrysoeriol từ lá cây Mơ tam thể cho thấy tiềm năng ứng dụng của loài này và có thể tách chiết chrysoeriol từ thực vật. Vì vậy, cần thêm nữa những thử nghiệm về tác dụng dược lí của dịch chiết lá Mơ tam thể và chrysoeriol phân lập từ loài này. Nhằm cung cấp những kiến thức về nguyên liệu Mơ tam thể, góp phần ứng dụng trong việc nhận biết loài, tìm hiểu về thành phần hóa học và tác dụng. Đề tài nghiên cứu đã mô tả về đặc điểm thực vật, phân lập được 2 hợp chất là những chất lần đầu tiên phân lập từ lá cây Mơ tam thể. Cùng với những nghiên cứu đã công bố và kinh nghiệm sử dụng cây làm thuốc trong dân gian cho thấy đây là nguồn dược liệu hữu ích. Vì vậy cần nghiên cứu, phát triển hơn nữa để cây Mơ tam thể được ứng dụng phổ biến trong việc chăm sóc sức khỏe. 35
44. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ➢ Kết luận Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khóa luận đã thu được một số kết quả như sau: ● Đã mô tả được đặc điểm thực vật và xác định được tên khoa học của mẫu cây Mơ tam thể thu hái tại huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội là Paederia lanuginosa Wall., thuộc họ Cà phê (Rubiaceae). ● Đã định tính và xác định được một số nhóm chất có trong mẫu lá cây Mơ tam thể là: alcaloid, iridoid glycosid, flavonoid, tanin, anthraquinon, terpenoid, tinh dầu. ● Đã chiết xuất, phân lập, xác định được cấu trúc của 2 hợp chất là: 5,7,3’- trihydroxy-5’-methoxy isoflavon và Chrysoeriol. ➢ Kiến nghị ● Tiếp tục triển khai nghiên cứu, phân lập các hợp chất khác từ loài Paederia lanuginosa Wall. ● Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm, kháng khuẩn của cao chiết phân đoạn ethyl acetat để nâng cao giá trị sử dụng, ứng dụng nhiều hơn nữa cây Mơ tam thể trong cuộc sống. 36
45. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Quyển 3, Nhà xuất bản Trẻ, 212- 213. 2. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, 186-187. 3. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Tập 2, Nhà xuất bản Y học, 146-148. 4. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 2, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 301-304. 5. Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, Tập 1, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 13-21. 6. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, 80-148. 7. Phạm Xuân Sinh, Nguyễn Văn Khanh, Lê Thị Thủy Hương (1996), “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của lá mơ lông”, Tạp chí Dược học – Bộ Y tế, 11, tr. 14-16. 8. Trần Thanh Mến, Đái Thị Xuân Trang, Nguyễn Đình Hải Yến (2018), “Khảo sát độc tính và khả năng bảo vệ gan của cao chiết methanol lá một số thực vật trên dòng tế bào HepG2”, Tạp chí Khoa học Đại học Đồng Tháp, 33, tr. 86-89. 9. Võ Thành Chung (2018), “Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn ít phân cực của cao ethyl acetate cây mơ lông (Paederia lanuginosa Wall.) ở Thành phố Cần Thơ”, Trường Đại học Cần Thơ. 10. Phan Kim Định, Đái Thị Xuân Trang, Nguyễn Thị Thanh Lan (2019), “Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan của dịch chiết methanol
46. lá mơ lông (Paederia lanuginosa W.)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 17(1), tr. 157-166. 11. Nguyễn Thị Vân Anh, Lê Thị Quỳnh Như, Trần Thanh Quỳnh Anh (2019), “Nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết lá mơ lông (Paederia lanuginosa Wall.)”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ nông nghiệp, 3(2), tr. 1359-1370. Tài liệu tiếng Anh 12. George K. Rogers (2005), “The genera of rubiaceae in the southeastern United States, part II. subfamily Rubioideae, and subfamily Cinchonoideae revisited (chiococca, erithalis, and guettarda)”, Harvard Papers in Botany, 10(1), tr. 1-45. 13. Ze-Long Nie, Tao Deng, Ying Meng, Hang Sun, Jun Wen (2013), “Post- Boreotropical dispersals explain the pantropical disjunction in Paederia (Rubiaceae)”, Annals of Botany, 111(5), tr. 873-886. 14. J Koyama, I Morita, K Tagahara, M Ogata, T Mukainaka, H Tokuda, H Nishino (2001), “Inhibitory effects of anthraquinones and bianthraquinones on Epstein-Barr virus activation”, Cancer Letters, 170, tr. 15-18. 15. Fukuda T, Ito H, Yoshida T (2004), “Effect of the walnut polyphenol fraction on oxidative stress in type 2 diabetes mice”, Biofactor, 21, tr. 251- 253. 16. M C Sabu, K Smitha, Ramadasan Kuttan (2002), “Anti-diabetic activity of green tea polyphenols and their role in reducing oxidative stress in experimental diabetes”, Journal of Ethnopharmacology, 83, tr. 109-116. 17. Truong Tuyet Mai, Nghiem Nguyet Thu, Pham Gia Tien, Nguyen Van Chuyen (2007), “Alpha-Glucosidase Inhibitory and Antioxidant Activities of Vietnamese Edible Plants and Their Relationships with Polyphenol Contents”, Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 53, tr. 267- 276.
47. 18. Ngan L T M, Dung P P, Nhi N V T Y, Hoang N V M, Hieu T T (2017), “Antibacterial activity of ethanolic extracts of some Vietnamese medicinal plants against Helicobacter pylori”, AIP Conference Proceedings, 1878(1), tr. 020030-(1-8). 19. Rajesh Kumar Soni, Raghuveer Irchhaiya, Vihangesh Dixit, Shashi Alok (2013), “Paederia foetida Linn.: phytochemistry, pharmacological and traditional uses”, Interational Journal of Pharmaceutical sciences and Research, 4, tr. 4525-4530. 20. Kishor Mazumder, Ziku K Dey, Suparna Dey, MD Solayman Hossain (2018), “Phytochemical screening & evaluation of ant diarrheal mode of action of leaves extracts of Paederia foetida Linn.”, International Journal of Complementary & Alternative Medicine, 11(5), tr. 304-309. 21. Inouye H, Inouye S, Shimokawa N, Okigawa M (1969), “Studies on monoterpene glucosides”, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 17(9), tr. 1942-1948. 22. Miyanaga C, S Yoshitomi, H Nakayama, T Shiki, N Haraguchi (2011), “Secondary Metabolites in the Leaves of Paederia lanuginosa Wall.”, Journal of Natural Medicines (J NAT MED-TOKYO), 65(1), tr. 52-53. 23. Dang Ngoc Quang (2009), “Anthraquinones from the Roots of Paederia scandens”, Vietnam Journal of Chemistry, 47(1), tr. 95-98. 24. Kapadia G J, Shukla Y N, Bose A K, Fujiwara H (1979), “Revised structure of paederoside, a novel monoterpene S-methyl thiocarbonate”, Tetrahedron Letters, 22, tr. 1937-1938. 25. Dang Ngoc Quang, Toshihiro H, Masami T, Nguyen Xuan Dung, Yoshinori A (2002), “Iridoid glucosides from roots of Vietnamese Paederia scandens”, Phytochemistry, 60(5), tr. 505-514.
48. 26. Wang Y, Huang T (2005), “Screening of anti-Helicobacter pylori herbs deriving from Taiwanese folk medicinal plants”, FEMS Immunology and Medical Microbiology, 43(2), tr. 295-300. 27. The Angiosperm Phylogeny Group (2016), "An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG IV", Botanical Journal of the Linnean Society. 28. Armen Takhtajan (1997), Diversity and classification of flowering plants, Columbia University Press. 29. Hai-Qing Hu, He-Dong Han, Yan Lin, Lian-Hong Chen, Xiao-Ling Wang (2013), “Chemical constituents of Paederia pertomentosa”, China Journal of Chinese materia medica, 38(16), tr. 2657-2660. 30. Mingqiu Shan, Sheng Yu, Hui Yan, Sheng Guo, Wei Xiao (2017), “A Review on the Phytochemistry, Pharmacology, Pharmacokinetics and Toxicology of Geniposide, a Natural Product”, Molecules, 22(10), 1689. 31. M K Alam (1992), “Medical Ethnobotany of the Marma Tribe of Bangladesh”, Economic Botany, 46(3), tr. 330-335. 32. Piero Giuseppe Delprete, Jomar Gomes Jardim (2012), “Systematics, taxonomy and floristics of Brazilian Rubiaceae: an overview about the current status and future challenges”, Rodriguésia, 63(1), tr. 101-128. 33. Masaaki Moriyama, Satoshi Tahara, John L. Ingham, Junya Mizutani (1993), “Isoflavonoid alkaloids from Piscidia erythrina”, Phytochemistry, 32(5), tr. 1317-1325. 34. Younghee Park, Byoung-Ho Moon, Heejung Yang, Youngshim Lee, Eungjung Lee, Yoongho Lim (2007), “Complete assignments of NMR data of 13 hydroxymethoxyflavones”, Magnetic Resonance in Chemistry, 45, tr. 1072-1075. 35. Daniela Cristina Vitale, Cateno Piazza, Barbara Melilli, Filippo Drago, Salvatore Salomone (2013), “Isoflavones: estrogenic activity, biological
49. effect and bioavailability”, European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 38(1), tr. 15-25. 36. Wee Ji-Hyang, Moon Jae-Hak, Park Keun-Hyung (2004), “Isolation and Identification of Pratensein with Antimicrobial Activity from the Peanut Shells”, Korean Journal of Food Science and Technology, 36(4), tr. 643- 647. 37. Mandana Behbahani, A. Moghaddam (2020), “Study of Anticancer Activity of Pratensein and Pratensein Glycoside Isolated from Cuscuta kotchiana”, Journal of Molecular Biology Research, 10(1), tr. 73. 38. Yong Lin, Ranxin Shi, Xia Wang, Han-Ming Shen (2008), “Luteolin, a flavonoid with potential for cancer prevention and therapy”, Current Cancer Drug Targets, 8(7), tr. 634-646. 39. Seyed Fazel Nabavi, Nady Braidy, Olga Gortzi, Eduardo Sobarzo-Sanchez, Maria Daglia, Krystyna Skalicka-Wozniak, Seyed Mohammad Nabavi (2015), “Luteolin as an anti-inflammatory and neuroprotective agent: A brief review”, Brain Research Bulletin, 119(Pt A), tr. 1-11. 40. Yuanyuan Luo, Pingping Shang, Dongye Li (2017), “Luteolin: A Flavonoid that Has Multiple Cardio-Protective Effects and Its Molecular Mechanisms”, Frontiers in Pharmacology, 8, tr. 692. 41. Beena Mishra, K Indira Priyadarsini, M Sudheer Kumar, M K Unnikrishnan, Hari Mohan (2003), “Effect of O-glycosilation on the antioxidant activity and free radical reactions of a plant flavonoid, chrysoeriol”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 11(13), tr. 2677-2685. 42. Myung Hee Kim, So Yeon Kwon, So-Yeun Woo, Woo Duck Seo, Dae Yu Kim (2021), “Antioxidative Effects of Chrysoeriol via Activation of the Nrf2 Signaling Pathway and Modulation of Mitochondrial Function”, Molecules, 26(2), tr. 313.
50. 43. Muobarak J. Tuorkey (2016), “Molecular targets of luteolin in cancer”, European Journal of Cancer Prevention, 25(1), tr. 65–76. 44. Tao Zhang, Yunguang Qiu, Qichao Luo, Lifen Zhao, Xin Yan, Qiaoce Ding, Hualiang Jiang, Huaiyu Yang (2018), “The Mechanism by Which Luteolin Disrupts the Cytoplasmic Membrane of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus”, The Journal of Physical Chemistry B, 122(4), tr. 1427-1438. 45. Patrícia L A Nascimento, Talita C E S Nascimento, Natália S M Ramos, Girliane R Silva (2014), “Quantification, antioxidant and antimicrobial activity of phenolics isolated from different extracts of Capsicum frutescens (Pimenta Malagueta)”, Molecules, 19(4), tr. 5434-5447. 46. Andrea Baier, Jolanta Nazaruk, Anna Galicka, Ryszard Szyszka (2018), “Inhibitory influence of natural flavonoids on human protein kinase CK2 isoforms: effect of the regulatory subunit”, Molecular and Cellular Biochemistry, 444(1), tr. 35–42. 47. Dae-Kyun Ro, Eric M Paradise, Mario Ouellet, Karl J Fisher, Karyn L Newman, John M Ndungu (2006), “Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast”, Nature, 440(7086), tr. 940- 943. 48. Doo-Youn Choi, Jeong Yong Lee, Mi-Ran Kim, Eun-Rhan Woo, Yoon Gyoon Kim, Keon Wook Kang (2005), “Chrysoeriol potently inhibits the induction of nitric oxide synthase by blocking AP-1 activation”, Journal of Biomedical Science, 12(6), tr. 949-959. 49. Susana Gorzalczany, Valeria Moscatelli, Graciela Ferraro (2013), “Artemisia copa aqueous extract as vasorelaxant and hypotensive agent”, Journal of Ethnopharmacology, 148(1), tr. 56-61.
51. 50. Guillermo Ramirez, Alejandro Zamilpa, Miguel Zavala, Julia Perez, Dulce Morales, Jaime Tortoriello (2016), “Chrysoeriol and other polyphenols from Tecoma stans with lipase inhibitory activity”, Journal of Ethnopharmacology, 185, tr. 1-8. 51. Arif Khan, Anwar-ul Hassan Gilani (2007), “Selective Bronchodilatory Effect of Rooibos Tea (Aspalathus Linearis) and Its Flavonoid, Chrysoeriol”, European Journal of Nutrition, 45(8), tr. 463-469.