›

Khóa luận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây dứa thơm (Pandanus amaryllifolius Roxb.)

pdf 57 trang thiennha21 18/04/2022 4200
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây dứa thơm (Pandanus amaryllifolius Roxb.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_dac_diem_thuc_vat_va_thanh_phan_hoa_hoc.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây dứa thơm (Pandanus amaryllifolius Roxb.)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC  VŨ THỊ HỒI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CÂY DỨA THƠM (Pandanus amaryllifolius Roxb.) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC  VŨ THỊ HỒI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CÂY DỨA THƠM (Pandanus amaryllifolius Roxb.) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khĩa: QH.2016.Y Người hướng dẫn: PGS. TS. VŨ ĐỨC LỢI HÀ NỘI – 2021
  3. LỜI CẢM ƠN Em là Vũ Thị Hồi – sinh viên lớp K5 Dược học, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Đây là đề tài em đã chọn để nghiên cứu và làm khĩa luận tốt nghiệp sau 5 năm theo học chuyên ngành Dược học tại Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Nghiên cứu này được hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp ĐHQGHN mã số: QG20.81 do PGS. TS Vũ Đức Lợi làm chủ trì đề tài. Để hồn thành tốt khĩa luận này, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lịng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Vũ Đức Lợi, Chủ nhiệm Bộ mơn Dược liệu -Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội; người thầy đã tận tâm hướng dẫn, hết lịng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hồn thành khố luận này. Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các giảng viên thuộc Bộ mơn Dược liệu - Dược học cổ truyền Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tơi rất nhiều trong quá trình thực hiện khĩa luận. Tơi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến tập thể quý thầy cơ giáo trong Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hết sức tận tình dạy dỗ, trang bị kiến thức cho tơi trong suốt 5 năm theo học tại trường. Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường. Và cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luơn theo sát động viên, quan tâm và tạo mọi điều kiện giúp tơi cĩ thể hồn thành khĩa luận này. Một lần nữa tơi xin chân thành cảm ơn những giúp đỡ quý báu đĩ! Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2021 Sinh viên Vũ Thị Hồi
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt  (ppm)  (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hĩa học BHT hydroxytoluene butylated d Doublet dd Doublet doublet 13C Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR Resonance Spectroscopy cacbon-13 Distortionless Enhancement DEPT Phổ DEPT by Polarization Transfer 2,2-diphenyl-1 DPPH Picrylhydrazyl Electrospray Ionization Mass Khối phổ đo bằng phương pháp ESI-MS Spectrometry ion hĩa phun điện tử EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol Ferric ion Reducing Thử nghiệm đánh giá khả năng FRAP Antioxidant Power khử ion sắt III
  5. 1H Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR Resonance Spectroscopy proton High Performance Liquid HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại J (Hz) J coupling constant Hằng số ghép MeOH Methanol Minimun Inhibitory Nồng độ ức chế tối thiểu của MIC Concentration chất cĩ hoạt tính kháng sinh 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) MTT -2,5-diphenyltetrazolium bromide RBD Required Beginning Date Ngày bắt đầu bắt buộc Reversed-Phase-High RP – HPLC Performance Liquid Sắc ký hấp phụ pha đảo Chromatography S Singlet SI Selective Index Hệ số chọn lọc PRODUCTION PART Quá trình phê duyệt phần sản PPAP APPROVAL PROCESS xuất
  6. DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Tên bảng Trang Kết quả định tính các nhĩm chất hữu cơ bằng phương Bảng 3.1 30 pháp hĩa học Số liệu phổ NMR của hợp chất DT1 và hợp chất tham Bảng 3.2. 33 khảo Số liệu phổ NMR của hợp chất DT2 và hợp chất tham Bảng 3.3. 35 khảo
  7. DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1. Cây Dứa sợi 4 Hình 1.2. Cây và quả dứa gỗ 5 Hình 1.3. Cây Dứa nhiếm 5 Hình 1.4. Cây Dứa thơm 7 Hình 1.5. Lá dứa sau khi thu hái 8 Cơng thức cấu tạo một số hợp chất phân lập từ lá cây Hình 1.6. 11 Dứa thơm Hình 3.1 Mặt trước và mặt sau của lá Dứa thơm 20 Hình 3.2 Đặc điểm vi phẫu lá Dứa thơm (10X) 21 Hình 3.3 Đặc điểm vi phẫu lá Dứa thơm (40X) 22 Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu bột dược liệu 22 Hình 3.5 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Dứa thơm 31 Hình 3.6 Sơ đồ phân lập 2 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat 32 Hình 3.7 Cấu trúc hĩa học chất DT1 34 Hình 3.8 Cấu trúc hĩa học chất DT2 35
  8. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Pandanus 3 1.1.1. Vị trí phân loại chi Pandanus 3 1.1.2. Phân bố và đặc điểm thực vật chi Pandanus 3 1.1.3. Cơng dụng, tác dụng chi Pandanus 6 1.2. Tổng quan về cây Dứa thơm 6 1.2.1. Đặc điểm hình thái 6 1.2.2. Đặc điểm phân bố và thu hái 7 1.2.3. Thành phần hĩa học 8 1.2.4. Cơng dụng 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.1. Nguyên liệu 15 2.1.2. Hĩa chất, trang thiết bị 15 2.2. Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật 16 2.2.2. Phương pháp định tính các nhĩm chất hữu cơ cĩ trong lá cây 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Xử lí và bảo quản mẫu 17 2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái 17 2.3.3. Nghiên cứu đặc điểm vi học 17 2.3.4. Định tính các nhĩm chất hữu cơ cĩ trong lá cây 18 2.3.5. Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất cĩ trong lá cây 18 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Dứa thơm 20
  9. 3.1.1. Mơ tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu 20 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu lá 21 3.1.3. Đặc điểm vi phẫu bột lá dược liệu 22 3.2. Kết quả nghiên cứu về hĩa học 23 3.2.1. Định tính thành phần hĩa học trong lá cây 23 3.2.2. Kết quả chiết xuất, phân lập một số hợp chất trong lá cây 31 3.3. Bàn luận 36 3.3.1. Về đặc điểm thực vật và định tính các nhĩm chất 36 3.3.2 Về chiết xuất và phân lập 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40
  10. MỞ ĐẦU Nhờ cĩ vị trí địa lý thuận lợi, khí hậu nhiệt đới cùng độ ẩm cao, Việt Nam sở hữu một hệ sinh thái vơ cùng phong phú và đa dạng. Cây cối sinh trưởng, phát triển mạnh, là nguồn tài nguyên quan trọng cho tiềm năng về dược liệu. Theo ước tính nước ta cĩ trên 12000 lồi thực vật bậc cao, trong số đĩ cĩ khoảng 4000 lồi được sử dụng làm thuốc. Ngày nay, khi nhu cầu về thuốc cĩ nguồn gốc dược liệu ngày càng tăng, việc đi sâu vào nghiên cứu, xác minh các kinh nghiệm của y học cổ truyền và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên cĩ hoạt tính sinh học cao đang rất được thế giới quan tâm [1]. Đặc biệt đối với Việt Nam, một đất nước giàu tài nguyên dược liệu, thì xu hướng phát triển các sản phẩm từ tự nhiên là một hướng đi đúng đắn. Thảo dược là đối tượng lý tưởng để các nhà khoa học sàng lọc và tìm ra các hoạt chất mới cho tác dụng mạnh, độc tính thấp, giảm thiểu chi phí nghiên cứu phát triển so với tổng hợp hĩa học. Mỗi cây thuốc cĩ chứa một hỗn hợp các hợp chất khác nhau, tuy nhiên trong mọi trường hợp hầu hết chưa xác định rõ hợp chất nào cho tác dụng điều trị. Chính vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hĩa học của các lồi cây đem lại ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn cao. Những tiến bộ trong định tính và định lượng các phân tử thuốc từ thực vật giúp chúng ta hiểu rõ hơn về mối quan hệ giữa các thành phần và tác dụng của chúng. Nước ta nằm trong vùng nhiệt đới ẩm nên hệ thực vật rất phong phú và đa dạng, nhiều loại cây quý, cĩ giá trị trong ngành thực phẩm, hương liệu, mỹ phẩm và dược liệu. Trong số đĩ cĩ lồi lá dứa thơm mà miền Trung và miền Nam thường gọi, còn miền Bắc gọi lá cơm nếp.Lá dứa cĩ tên khoa học là Pandanus amaryllifolius, thuộc họ dứa dại (pandanceae), một loại cây được trồng và mọc hoang phổ biến ở nước ta [2]. Theo dân gian, lá dứa là một loại dược liệu, hương liệu cĩ mặt chính trong nhiều bài thuốc hỗ trợ và điều trị đái tháo đường, huyết áp, giảm căng thẳng, Đây là một gợi ý cho nền y học hiện đại tiếp tục đi sâu và nghiên cứu. Đặc 1
  11. biệt, tiềm năng hỗ trợ điều trị căn bệnh tiểu đường nên được lưu tâm nhiều hơn. Để tìm hiểu nhiều tiềm năng của cây Dứa thơm để ứng dụng thực tiễn trong cuộc sống, gĩp phần chăm sĩc sức khỏe cho người dân, chúng tơi đã lựa chọn và tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hĩa học cây Dứa thơm (Pandanus amaryllifolius Roxb.)” với những mục tiêu sau: 1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật của cây Dứa thơm. 2. Định tính được sơ bộ thành phần hĩa học của lá cây Dứa thơm. 3. Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của 02 hợp chất từ lá cây Dứa thơm. 2
  12. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Pandanus 1.1.1. Vị trí phân loại chi Pandanus Theo hệ thống phân loại thực vật APG IV (2016) [14], chi Pandanus cĩ vị trí phân loại như sau: Giới Thực vật: Plantae Thực vật hạt kín: Angiospermae Thực vật một lá mầm: Monocots Bộ Dứa dại: Pandanales Họ Dứa dại: Pandanaceae Chi: Pandanus 1.1.2. Phân bố và đặc điểm thực vật chi Pandanus Chi dứa dại (Pandanus) thuộc họ Pandanaceae cĩ khoảng 750 lồi. Các lồi đa dạng, khác nhau về kích thước, từ cây bụi nhỏ cao dưới 1m đến cây cỡ trung bình cao 20 m, thường cĩ tán rộng, quả gai và tốc độ tăng trưởng vừa phải. Thân cây mập, tuỳ và từng lồi cĩ thể nhẵn hoặc sần, hình kim tự tháp , chúng thường cĩ nhiều rễ gần gốc [3]. Lá cây dài, hẹp hình lưỡi gươm, xếp thành hình xoắn ốc ở ngọn, cĩ thể cĩ gai, cĩ nhiều gai ở mép hơn là trên sống giữa. Lá của nhiều loại cho sợi cĩ thể dùng để đan lát và lợp nhà. Hoa màu trắng thành chùm cĩ mùi thơm. Hoa khác gốc, xếp thành bơng mo, các hoa đực đơn độc hay thành cụm hoa kép, các hoa cái thường thịng xuống khi chín. Quả hình cầu hoặc hình lăng trụ cĩ thể ở trên cây đến 12 tháng [3]. Gồm cĩ tới 60 lồi ở nhiệt đới cựu lục địa [3]. Ở nước ta cĩ khoảng 16 lồi và nhiều lồi được sử dụng như: 3
  13. • Pandanus odoratissimus: dứa sợi Hình 1.1. Cây dứa sợi Những năm 1990, cây dứa sợi được trồng nhiều ở Nơng trường Bến Nghè (Nghệ An), Bắc Cạn, Thái Nguyên, Thanh Hĩa, Hà Tĩnh, Quảng Trị dùng để cung cấp sợi dệt bao tải chịu mặn, chịu phân hĩa học và chiết xuất hecogenin dùng làm thuốc . Các nhà khoa học Việt Nam gần đây đã phát hiện trong cây dứa cĩ chứa chất Saponin chứa một lượng lớn, chất này khi gặp lửa sẽ tạo thành bột khí CO2 tự động dập tắt lửa, nhờ đặc tính đĩ mà người ta trồng hàng rào cây dứa sợi để chống cháy rừng. Cây dứa sợi cĩ đời sống rất dài (15 năm) và trong chu kỳ sống chỉ ra hoa một lần. Hoa của nĩ phát triển với tố độ rất nhanh, mỗi ngày cĩ thể cao thêm 15-20 cm, trong một tháng cĩ thể cao đến 5-7 m. Sau khi hoa tàn, cây dứa sợi sẽ chết [3]. • Pandanus kaida Kurz: cịn gọi là dứa gai, dứa gỗ thường mọc hoang hoặc được trồng để làm hàng rào. 4
  14. Hình 1.2. Cây và quả dứa gỗ Là loại cây nhỏ phân nhánh ở ngọn ,cao khoảng 2-4m, với rất nhiều rể phụ trong khơng khí thịng xuống đất. Lá ở ngọn, các nhánh hình dải, dài 1-2m, trên gân chính và hai bên mép cĩ gai nhọn. Bơng mo đực ở ngọn cây, thịng xuống với những mo màu trắng, rời nhau. Hoa rất thơm, bơng mo rất đơn độc, gồm rất nhiều lá nỗn [3]. Cụm quả tạo thành một khối hình trứng dài khoảng 16-22cm, cĩ cuống, màu da cam, gồm những quả hạch cĩ gĩc, xẻ thành nhiều ơ. Ra hoa quả vào mùa hè [4]. • Pandanus capusii Mart : dứa nhiếm Cây thường mọc hoang cao khoảng 2-3 m, mọc nhiều ở ven sơng Sài Gịn, cĩ trái giống như trái Mít đỏ [3]. Hình 1.3. Cây dứa nhiếm 5
  15. 1.1.3. Cơng dụng, tác dụng chi Pandanus Ở chi này bao gồm rất nhiều lồi cĩ thể kể đến như: Pandanus amaryllifolius, Pandanus tectorius, Pandanus boninensis, Pandanus fascicularis, Pandanus odorus, Pandanus veitchii, Pandanus dubius, Pandanus simplex . Trong đĩ cĩ một số lồi đã được tìm hiểu và cĩ nhiều nghiên cứu chứng minh cĩ tác dụng tốt trong việc hỗ trợ điều trị bệnh như: P. amaryllifolius: được quan tâm nhiều nhất đĩ chính là tác dụng chữa bệnh tiểu đường và bên cạnh đĩ cũng cĩ nhiều tác dụng khác kể đến như điều trị phong hàn, chữa thấp khớp Pandanus tectorius (dứa gai hay dứa dại): đã được nghiên cứu in vivo cho thấy tiềm năng chống nhiễm trùng. Chiết xuất của lồi này cũng cĩ hoạt động chống viêm và đang được phát triển để kiểm tra tính an tồn trên thực vật [44]. Thường dùng chữa sán khí (thốt vị bẹn hoặc thốt vị bìu, đau từ bìu lan lên bụng dưới), viêm đường tiết niệu, tiểu đường, chữa kiết lỵ. Ở Micronesia (quần đảo thuộc Mỹ) quả dứa dại chín cĩ màu cam được dung trị bệnh trĩ và phòng bệnh ung thư [7]. Pandanus odorus: trong rễ cây cĩ chứa acid 4-hydroxybenzoic cĩ tác dụng tốt trong hạ đường huyết [33]. 1.2. Tổng quan về cây Dứa thơm 1.2.1. Đặc điểm hình thái Cây dứa thơm cĩ tên khoa học: Pandanus amaryllifolius Roxb., thuộc chi dứa dại (Pandanus), họ Dứa dại (Pandanaceae). Hay còn cĩ tên gọi khác: lá dứa thơm, cây cơm nếp, cây lá nếp. Là thực vật thân thảo, sinh sơi và phát triển ở miền nhiệt đới. Cây lá dứa thân dài khoảng 30 – 40 cm, hẹp khoảng 3 – 4 cm, thẳng giống như một lưỡi gươm. Ở giữa lá chụm lại theo một đường gân dọc theo thân lá. Mép lá nếp thơm khơng cĩ 6
  16. gai, mặt trên màu xanh sẫm, bĩng. Mặt dưới màu xanh hơn, đơi khi cĩ thể phủ một lớp lơng mịn bên ngồi [2]. Lá nếp thơm mọc thành bụi lùm cao đến 1m, thân rộng 1-3cm, chia nhánh trên một thân và rễ. Cây khơng cĩ hoa. Lá cĩ mùi thơm đặc trưng tương tự như mùi cơm nếp, để càng khơ lá càng thơm [2]. Hình 1.4: Cây Dứa thơm 1.2.2. Đặc điểm phân bố và thu hái Lá dứa phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới, nĩng ẩm, dưới bĩng râm. Tại Đơng Nam Á, lá dứa thường được tìm thấy ở Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Việt Nam, Philippin [2] Ở Việt Nam, trước đây, lá dứa mọc hoang và được trồng ở khắp 3 miền. Nhưng hiện nay cây gần như khơng mọc hoang nữa mà phần lớn được trồng để thu hoạch lá. Lá dứa thơm thường phổ biến ở các tỉnh phía Nam để cho vào thức ăn như bánh, kẹo hoặc pha trà [2]. Cây lá dứa cĩ thể thu hái quanh năm. Cả thân lá sau khi phơi khơ hoặc tươi được sử dụng làm nguyên dược liệu. Cây cĩ mùi thơm đặc trưng [2]. 7
  17. Hình 1.5: Lá dứa sau khi thu hái 1.2.3. Thành phần hĩa học Trong các tài liệu của Việt Nam, tình hình nghiên cứu thành phần hĩa học của cây dứa thơm là rất ít và chưa đề cập đến nhiều. Theo tài liệu nước ngồi thì thành phần chính của chất gây mùi thơm trong lá dứa thơm đĩ là: 2-Acetyl-1-pyrroline (2) ( khoảng 3%), 3-methyl-2(5H)-furanone (1) (trên 70%), ethylnol, propanol, 3- hexanol, 4-methylpentanol, 3- hexanone, 2-hexanone, 2,4,4-trimethylbut-2- enolide [24]. Bộ phận cho hương nếp là các lá bánh tẻ, lá để càng héo, càng thơm mùi cơm nếp, mùi bền ở nhiệt độ cao. Trên thế giới đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu tách chiết chất gây mùi hương nếp, người ta đã khẳng định chất mùi hương nếp chính là 2- acetyl-1-pyrroline [24]. Người ta nghiên cứu sự phụ thuộc của nồng độ của 2- acetyl-1- pyrroline với mùi thơm nếp của gạo tẻ thơm và các phương pháp điều chế cơng nghiệp của nĩ. Nồng độ của nĩ rất nhỏ (chỉ tính phần triệu). Trong gạo thơm với 7 phần tỷ của 2- acetyl-1-pyrroline thì gạo đã ĩ mùi hương nếp. Trong lá dứa thơm cĩ hàm lượng 2- acetyl-1-pyrroline cao gấp hàng trăm và hàng ngàn lần so với gạo tám thơm. Trong lá dứa thơm ngồi chất thơm chính là 2- acetyl-1-pyrroline còn cĩ một số chất khác gĩp phần tạo hương nếp [24]. Mặt khác người ta cũng xác định một số acid amin cĩ trong lá dứa thơm khá cao, kém khoảng 3 lần so với hàm lượng acid amin của động vật. 8
  18. Thành phần hĩa học chủ yếu trong lá dứa là: Nước, chất xơ, 3-metyl-2(5H)- furanon, 2-axetyl-1-pyrrolin, flavonoid, Alkaloid, pectin và tinh dầu. Flavanoid và phenolic Năm 2013, Ali Ghasemzadeh và Hawa Z. E. Jaafar đã xác định được năm flavonoid và ba acid phenolic trong chiết xuất P. amaryllifolius từ ba địa điểm khác nhau của Malaysia bằng RP-HPLC [21]. 5 loại Flavonoid được tìm thấy là Rinin, Epicatechin (3), Catechin (4), Kaempferol (5), Naringin. Với acid phenolic, người ta cũng xác định tổng hàm lượng bằng phương pháp quang phổ rồi phân tích HPLC. Ba loại acid phenolic được xác định là acid galic (6), acid cinnamic (7), acid ferulic (8). Alkaloid Năm 1992, Byrne đã tìm thấy một loại alkaloid cĩ chứa vòng lactam, (+)- Pandamarine, từ lá P.amaryllifolius ở Isabela, Philippines, bằng phương pháp nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction) [15]. Năm 1993, bằng cách sử dụng các kỹ thuật NMR, Nonato và các cộng sự đã xác định ba loại alcaloid piperidine trong lá P.amaryllifolius ở Manila, Philippines: pandamarilactone-l (11), pandamarilactone-32 (12), pandamarilactone-31 (13). Tất cả các alcaloid piperidine này đều cĩ bộ khung C9-N-C9 và cĩ thể cĩ nguồn gốc sinh học từ acid 4-hydroxy-4-methylglutamic [15]. Năm 1996, Sjaifullah và Garson đã xác định được Pandamarilactam-3x (14) và Pandamarilactam -3y (14) được tìm thấy ở Jambi, Indonesia [41]. Năm 2002, Takayama đã tách được hai loại Alkaloid norpandamarilactonine- A và -B (9), cĩ một nhĩm chức pyrrolidinyl-α,β-chưa bão hòa-g-lactone, trong nhĩm chất pandamarilactonine alkaloids đã biết đến. [46]. 9
  19. Năm 2004, Salim và các cộng sự đã phân lập được 3 alkaloid mới [47] (hai loại alkaloid pyrrolidine và 6E pandanamine), cùng 5 alkaloid đã biết (6Z- Pandanamine, 6Z-Pandamarilactonine-A, 6Z-Pandamarilactonine-B, 6E- Pandamarilactonine-C, 6E-Pandamarilactonine-D) từ lá P.amaryllifolius thu thập ở West Java, Indonesia [11]. Pectin: Năm 2004, Ooi và các cộng sự đã tìm được một Pectin, được đặt là Pandanin, trong nước muối sinh lí chiết xuất từ lá P. amaryllifolius. Pandanin là một protein khơng bị glycosyl hĩa với khối lượng phân tử là 8.0 kDal [29]. Năm 2006, Ooi và các cộng sự tiếp tục phân lập được hai protein khác từ dịch chiết nước muối sinh lí của lá Dứa thơm đã già, bằng phương pháp sắc kí ái lực, sắc kí trao đổi ion và sắc kí gel. Hai loại protein này là nonglycoprotein, với khối lượng phân tử là 18 và 13 kDa, lần lượt cĩ các tiểu đơn từ 6.5 đến 9 kDa ở dạng heterodimer và homodimer [30]. (1) (2) (3) (4) (5) (6) 10
  20. (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo một số hợp chất phân lập từ lá cây Dứa thơm 1.2.4. Cơng dụng Theo dân gian lá dứa thơm được sử dụng làm hương nếp của gạo tám xoan. Lá dứa cho mùi hương nếp dễ chịu khi bỏ vào cơm, chè, trà, sữa đậu nành, bánh đúc, được dùng trong cơng nghiệp thực phẩm. Ngồi ra còn dùng nhuộm hồ do cĩ màu xanh chlorophyl cho các lọai bánh thường dùng trong dân gian [2]. Lá dứa nổi bật với tác dụng hỗ trợ điều trị tiểu đường và ngồi ra cũng cĩ thêm một vài các tác dụng cĩ vai trò khơng kém quan trọng. a. Tác dụng dược lý đã được nghiên cứu Tác dụng hạ đường huyết của chiết xuất nước PA Roxb (Trà lá dứa) ở người được thực hiện ở 30 người tham gia khỏe mạnh, sử dụng xét nghiệm OGTT tiêu 11
  21. chuẩn. Những người tham gia tiêu thụ trà lá dứa (0,1 g / ml), 15 phút sau khi nạp glucose. Glucose huyết tương được xác định bằng phương pháp glucose-oxyase. Kết quả cho thấy các đỉnh nồng độ glucose huyết tương sau bữa ăn trung bình ở nhĩm được điều trị thấp hơn đáng kể so với nhĩm đối chứng . Cho thấy trà PA cĩ hiệu quả cĩ thể làm giảm lượng đường trong máu sau ăn [30]. P. amaryllifolius chiết xuất cĩ chứa một số hợp chất hoạt động như một chất chống oxy hĩa và chống đái tháo đường tự nhiên như: tinh dầu, tocopherols, tocotrienols, acid béo alkaloid, protein chuyển lipid khơng đặc hiệu của este, và carotinoids và flavonoid [28, 47] Flavonoid chính là quercetin, thuộc nhĩm flavonol cĩ vai trò trong việc giảm đường huyết và giảm hấp thu đường huyết vào máu. Chiết xuất lá dứa cũng được chứng minh là làm giảm đường huyết sau ăn, kích thích tiết insulin từ dòng tế bào beta tuyến tụy chuột và ức chế hoạt động của enzyme alpha glycosidase. Điều này cho thấy tiềm năng chiết xuất lá dứa cĩ khả năng trở thành một nguồn tự nhiên của các thuốc chống tăng huyết áp. Các ứng dụng tiềm năng của chiết xuất lá dứa như một chất chống oxy hĩa tự nhiên được đánh giá trong olein cọ tinh chế, tẩy trắng và khử mùi (RBD), sử dụng quá trình oxy hĩa tăng tốc và nghiên cứu chuyên sâu ở 180 ° C từ 0 đến 40h. Các chất chiết xuất (nồng độ tối ưu 0,2%) làm chậm đáng kể quá trình oxy hĩa và suy giảm dầu, tương đương với 0,02% BHT trong các thử nghiệm như giá trị peroxide, giá trị anisidine, giá trị iốt, acid béo tự do, chỉ số ổn định oxy hĩa (OSI), cực và nội dung hợp chất polymer. Chiết xuất lá, cĩ hàm lượng polyphenol 102mg /g, thể hiện một đặc tính chống oxy hĩa ổn định nhiệt tuyệt vời và cĩ thể là một thay thế tự nhiên tốt cho các chất chống oxy hĩa tổng hợp hiện cĩ trong ngành cơng nghiệp thực phẩm [28]. 12
  22. Nghiên cứu trên lá của P. amaryllifolius đã phân lập được các loại alkaloid piperidine và pyrrolidine cĩ hoạt tính kháng khuẩn MIC và MBC trên 3 sinh vật: Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa [22]. Hoạt tính chống virus khi tinh chế từ dịch chiết lá dứa phát hiện một loại protein chống vi-rút mới. Đây cũng là một hướng tìm hiểu và nghiên cứu đang được phát triển và tìm hiểu sâu hơn [29]. b. Cơng dụng theo y học cổ truyền Trong y học, lá dùng phối hợp với một số vị thuốc khác nấu nước xơng giúp cho các bà mẹ mới sinh thêm sức khỏe, da dẻ hồng hào. Mặt khác, nĩ còn là cây hương liệu cổ truyền của Malaixia và Indonexia. Mặt khác lá dứa còn nhiều cơng dụng như trị gián, chữa bệnh thấp khớp, trị gàu, chữa bệnh yếu dây thần kinh. Trong đĩ, trị gián là một đặc điểm rất hay của lá dứa. Nếu khơng muốn dùng các sản phẩm diệt gián thương mại cĩ nhiều hĩa chất độc hại, chúng ta dùng lá dứa bằng cách cắt lá dứa thành từng đoạn 5 cm bỏ vào rổ rồi đặt ở nhà bếp hoặc những nơi gián thường lai vãng. Khi lá dứa hết mùi thơm thì thay lá dứa khác [2]. Bài thuốc điều trị tiểu đường, ổn định đường huyết dân gian dùng lá dứa cắt thành khúc phơi khơ pha nước nĩng uống như nước trà, ngồi ra lá dứa khơ và cây cỏ sữa đất khơ nấu chung làm nước uống để ổn định đường huyết của người bị bệnh tiểu đường loại 2 rất hiệu quả. Sử dụng lá nếp thơm với liều lượng vừa đủ, rửa sạch, phơi nắng cho khơ. Sau đĩ thái nhuyễn, nấu nước dùng uống như nước trà mỗi ngày để hỗ trợ điều trị và phòng chống tiểu đường [2]. Chữa thấp khớp: Sử dụng 3 chiếc lá nếp thơm và một bát nhỏ dầu dừa. Lá nếp thơm rửa sạch, thái nhuyễn, để ráo nước. Dầu dừa đun nhỏ lửa đến khi nĩng thì tắt lửa, cho lá nếp thơm đã thái nhuyễn vào, khuấy đều. Đợi hỗn hợp nguội thì dùng thoa vào vùng khu vực sưng đau [2]. 13
  23. Thanh nhiệt cơ thể, hỗ trợ lợi tiểu: Lá nếp thơm rửa sạch, thái nhỏ, chia thành 2 phần bằng nhau. Một phần cho vào máy xay để xay nhuyễn với một lượng nước vừa đủ, sau đĩ lọc lấy phần nước cốt. Phần lá còn lại cho vào nồi đun nhỏ lửa, đến khi sơi thì cho thêm đường phèn, khuấy tan. Tắt lửa, chờ đến khi nước ấm thì cho phần nước cốt lá vào, tiếp tục đun nhỏ lửa cho đến khi sơi thì tắt bếp. Chờ đến khi lá nguội hẳn thì dùng uống [2]. c. Sản phẩm Cách sử dụng: Pha nước sơi uống hằng ngày Thành phần: 100% Trà búp xanh, lá dứa, hoa lài Tác dụng: ✓ Giảm choleaterool trong máu, tim mạch, chống oxy hĩa, béo phì. ✓ Hỗ trợ điều trị đau đầu, mất ngủ ✓ Mát gan, giải nhiệt, làm đẹp da Tĩm lại, tới nay các nghiên cứu đã cơng bố sơ bộ đặc điểm thực vật, thành phần và tác dụng dược lý cĩ liên quan của cây Dứa thơm. Tuy nhiên cần tiếp tục nghiên cứu đặc điểm vi phẫu lá và bột dược liệu cùng với các hợp chất cĩ tác dụng chống oxi hĩa và bệnh tiểu đường của lá Dứa thơm. 14
  24. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu Cây dứa thơm hay còn gọi là cây cơm nếp ở xã Thái Đơ, Thái Bình đã được nhân dân trồng trong vườn và cĩ một số nơi nĩ cũng mọc hoang. Nguyên liệu chỉ lấy từ những lá cĩ màu xanh đậm ở các cây trưởng thành. Mẫu thực vật đã được giám định tên khoa học là Pandanus amaryllifolius Roxb. (Tiêu bản số hiệu: UMP- 052021: chi tiết ở Phụ lục 1). Mẫu lá được thu hái, phơi sấy, bảo quản trong túi nilon kín, làm nguyên liệu cho các phản ứng định tính thành phần hĩa học và chiết xuất, phân lập hợp chất. 2.1.2. Hĩa chất, trang thiết bị 2.1.2.1. Hĩa chất - Hĩa chất dùng trong tẩy nhuộm vi phẫu: nước javen, cloranhydrat, acid acetic, xanh metylen, đỏ carmin và nước cất. - Các hĩa chất dùng để định tính: H2SO4 1N, NH3, NaOH 10%, Mg, HCl, FeCl3 5%, Na2CO3, thuốc thử Liebermann, Baljet, Legal, Mayer, Bouchardat, Dragendorff, Fehling A, B, - Các dung mơi dùng để chiết xuất và phân lập: ethanol (EtOH) 70%, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), chloroform (CHCl3), methanol (MeOH), nước cất đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết. - Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột: silica gel pha thường (Merck) cỡ hạt 0,063– 0,200 mm và cỡ hạt 0,040–0,063 mm. 2.1.2.2. Trang thiết bị - Kính hiển vi cĩ gắn camera tại Bộ mơn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Trường đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. - Sắc ký cột: sử dụng silicagel cỡ hạt 0,063-0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040- 15
  25. 0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký kích cỡ khác nhau. - Độ quay cực: đo trên máy PLR-4, MRC scientific instruments, Trường đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. - Nhiệt độ nĩng chảy: Đo trên máy SMP10 BioCote tại Trường đại học Y Dược, ĐHQGHN. - Phổ khối ESI-MS: Đo trên máy Agilent 1100 LC/MSD tại Viện Hĩa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR: Được ghi trên máy Bruker AVANCE 500 MHz tại Viện Hĩa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam. - Dụng cụ thí nghiệm: cốc cĩ mỏ, bình nĩn, bình chiết, pipet, ống đong, ống nghiệm, thuộc Bộ mơn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Trường đại học Y Dược, ĐHQGHN. - Các thiết bị khác: cân phân tích, máy cơ quay chân khơng, tủ sấy, tủ hút, tại Bộ mơn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Bộ mơn Bào chế và Cơng nghệ Dược phẩm, Trường đại học Y Dược, ĐHQGHN. 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật - Mẫu cây Dứa thơm sau khi thu hái xử lí sơ bộ, tiến hành phân tích, mơ tả các đặc điểm hình thái đặc trưng của lồi, giám định tên khoa học. - Nghiên cứu, mơ tả đặc điểm bột và vi phẫu lá của cây Dứa thơm. 2.2.2. Phương pháp định tính các nhĩm chất hữu cơ cĩ trong lá cây - Định tính các nhĩm chất trong lá cây Dứa thơm bằng các phản ứng hĩa học. - Chiết xuất và phân lập lập và nhận dạng cấu trúc hợp chất cĩ trong lá cây Dứa thơm 16
  26. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Xử lí và bảo quản mẫu Mẫu dược liệu gồm dược liệu tươi và dược liệu đã phơi khơ sau khi thu hái. Dược liệu được bảo quản như sau: Mẫu dược liệu cắt làm vi phẫu là mẫu tươi, sau khi cĩ mẫu tiến hành làm ngay. Trường hợp chưa thể làm kịp thì tiến hành bảo quản mẫu trong hỗn hợp cồn:nước (1:1). Mẫu dược liệu dùng để soi bột được sấy khơ, nghiền thành bột, bảo quản trong lọ cĩ nút kín, cĩ ghi nhãn và để nơi khơ ráo. Mẫu dược liệu dùng để định tính, chiết xuất, phân lập, nhận dạng cấu trúc hĩa học được sấy ở nhiệt độ <50oC trong tủ sấy, bảo quản trong túi ni lơng kín, để nơi khơ ráo, tránh ánh sáng mặt trời 2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái Phân tích hình thái thực vật: mơ tả đặc điểm hình thái theo phương pháp mơ tả phân tích. Làm tiêu bản mẫu khơ theo phương pháp làm tiêu bản cây khơ. Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu: đối chiếu đặc điểm mơ tả được với đặc điểm thực vật đã được cơng bố trong các tài liệu [2] về lồi P.A 2.3.3. Nghiên cứu đặc điểm vi học Nghiên cứu đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu theo tài liệu [5], cụ thể: mẫu sau thu hái được đem xử lí theo phương pháp thích hợp rồi tiến hành nghiên cứu. 2.3.3.1. Đặc điểm vi phẫu + Chọn mẫu cĩ kích thước lá thích hợp. + Cắt mẫu làm tiêu bản: Tiêu bản vi phẫu lá được cắt ngang ở vị trí khoảng 1/4-1/3 từ dưới gần gốc của lá trưởng thành. 17
  27. + Xử lý lát cắt: chọn những lát cắt mỏng đem nhuộm và làm tiêu bản vi phẫu theo quy trình chuẩn [6]. + Quan sát, mơ tả và chụp ảnh: quan sát các đặc điểm vi phẫu, chụp ảnh bằng kính hiển vi cĩ gắn camera tại Bộ mơn Dược liệu và Dược cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, Đại học quốc gia Hà Nội. 2.3.3.2. Đặc điểm bột dược liệu - Mẫu nghiên cứu được sấy khơ, nghiền thành bột. - Quan sát trực tiếp, nếm, gửi, xác định màu, mùi, vị. - Làm tiêu bản bột dược liệu bằng phương pháp giọt ép, quan sát, mơ tả và chụp ảnh những đặc điểm điển hình của bột trên nền kính hiển vi cĩ gắn camera. Ảnh các đặc điểm bột được đưa vào máy tính sau đĩ ghép thành ảnh hồn chỉnh. 2.3.4. Định tính các nhĩm chất hữu cơ cĩ trong lá cây Nguyên liệu nghiên cứu là lá cây Dứa thơm đã được phơi sấy khơ và bảo quản. Chiết xuất lấy dịch chiết bằng các dung mơi cĩ độ phân cực khác nhau (nước, etanol, n-hexan ), sau đĩ xác định sơ bộ một số nhĩm chất hữu cơ trong dược liệu bằng các phản ứng hĩa học thích hợp, theo quy trình chuẩn ghi trong tài liệu [5, 6]. 2.3.5. Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất cĩ trong lá cây 2.3.5.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất Lá cây được thu hái, rửa sạch, phơi khơ, ngâm chiết 3 lần bằng dung mơi EtOH 70%, mỗi lần 4L sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40oC trong vịng 30 phút. Lọc các dịch chiết EtOH qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung mơi dưới áp suất giảm thu cao chiết tổng ethanol. 18
  28. Phân tán cao chiết này trong nước cất và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc (mỗi dung mơi 3 lần). Các dịch chiết n-hexan, EtOAc được cất loại dung mơi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng. 2.3.5.2. Phương pháp phân lập các hợp chất Sử dụng các phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng (dùng để khảo sát) và sắc ký cột để phân lập các hợp chất. - Sắc ký lớp mỏng: được thực hiện trên bản mỏng đế nhơm tráng sẵn silica gel 60 F254, độ dày 0,2 mm và RP-18 F254s (Merck), độ dày 0,25 mm; hoạt hĩa ở 1100C trong 1h. Sau khi triển khai sắc ký, phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại ở bước sĩng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol, sấy khơ rồi hơ nĩng trên bếp điện từ đến khi hiện màu. - Sắc ký cột: được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường cỡ hạt 0,063 – 0,200 mm và 0,040 – 0,063 mm (Merck) và pha đảo RP-18 cỡ hạt 0,03 – 0,05 mm (Merck). 2.3.5.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được Sử dụng các loại phổ hiện đại: ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR; xác định cấu trúc hĩa học của các hợp chất đã phân lập được bằng cách giải phổ thơng qua các tín hiệu, thơng số: ✓ Độ quay cực. ✓ Nhiệt độ nĩng chảy. ✓ Phổ khối ESI-MS. ✓ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). 19
  29. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Dứa thơm 3.1.1. Mơ tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu Cây bụi cao khoảng 1m, thân rộng 1-3cm, chia nhánh. Đặc biệt là lá cĩ mùi thơm dịu rất đặc trưng mà các lồi Pandanus khác khơng cĩ. Lá khơng cĩ lơng, xấp thành hình máng xối, dài 40-50 cm, rộng 3-4cm, mép khơng gai, mặt dưới lá màu xanh nhạt hơn mặt trên của lá, lá cĩ nhiều gân cách nhau cỡ 1mm, khơng thấy ra hoa. Hình 3.1: Mặt trước và mặt sau lá Dứa thơm 20
  30. 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu lá Quan sát vi phấu phiến lá nhận thấy: Ngồi cùng là lớp biểu bì trên và dưới mỏng. Mặt trên lõm, mặt dưới lồi, thuơn dài hai bên. Biểu bì tế bào đa giác xếp sít nhau, vách hĩa cutin, kích thước nhỏ. Mơ nâng đỡ 4 – 5 lớp xếp vịng liên tục, bắt màu hồng. Mơ mềm là các tế bào hình trịn lớn xếp phía trong mơ nâng đỡ. Gỗ gồm 1 vài tế bào hình trịn, vách dày hĩa gỗ, bắt màu xanh, nằm bên trong libe. Libe gồm các tế bào đa giác cĩ kích thước bé, bắt màu hồng. Trong vi phẫu thấy cĩ những tinh thể canxi oxalate nằm rải rác. Hình 3.2. Đặc điểm vi phẫu lá Dứa thơm (10X) Chú thích: 1. Biểu bì trên; 2. Mơ nâng đỡ; 3. Mơ mềm; 4. Bĩ libe gỗ; 5. Biểu bì dưới 21
  31. Hình 3.3. Đặc điểm vi phẫu lá Dứa thơm (40X) Chú thích:1. Gỗ; 2. Bao mơ cứng; 3. Biểu bì trên; 4. Mơ mềm; 5. Mơ nâng đỡ; 6. Cụm mơ cứng; 7. Libe 3.1.3. Đặc điểm vi phẫu bột lá dược liệu Hình 3.4: Đặc điểm vi phẫu bột lá dược liệu Chú thích: 1,5. Mảnh lá cĩ gân lá; 2. Bĩ sợi; 3.Mảnh lá cĩ nhiều tinh bột và tinh thể canci oxalate hình khối; 4. Mơ mềm mang tinh bột ; 6. Lơng tơ; 7. Tinh bột; 8. Tinh thể canci oxalate. 22
  32. Mùi cơm nếp thơm, màu xanh, vị hơi ngọt. Soi dưới kính hiển vi thấy: mảnh mơ mềm lá cĩ tế bào hình đa giác thành mỏng chứa tinh bột và tinh thể canci oxalat, sợi đứng riêng lẻ hay tụ thành bĩ. Tinh thể canxi oxalat hình khối. Nhiều hạt tinh bột đơn hoặc kép đơi, kép ba, nằm riêng lẻ hoặc kết thành khối, đường kính 5 mm đến 25 mm, rốn hình sao hay phân nhánh. 3.2. Kết quả nghiên cứu về hĩa học 3.2.1. Định tính thành phần hĩa học trong lá cây Dứa thơm ➢ Định tính glycosid tim Ngâm 10g bột dược liệu với 100ml cồn 25o, trong 24 giờ. Lọc lấy dịch chiết, loại tạp chất bằng chì acetat 30% vừa đủ (khơng cịn tủa đục). Để lắng, lọc lấy dịch lọc vào bình gạn. Lắc kỹ 3 lần với 25ml cloroform (10ml, 10ml, 5ml), để lắng, gạn lấy dịch chiết, lọc qua bơng loại nước. Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm đã được sấy khơ, đem cơ cách thủy đến khơ. Cắn thu được để làm phản ứng: a, Phản ứng Liberman Cho 1ml anhydrid acetic vào ống nghiệm 1, lắc đều. Nghiêng ống 450, cho từ từ theo thành ống 1ml H2SO4 đặc. Quan sát nếu thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp xuất hiện vòng màu ỏđ tím thì dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính (-). b, Phản ứng Baljet Cho 0,5ml etanol 90% vào ống nghiệm 2, lắc đều. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%), xuất hiện màu đỏ cam thì dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính (-). c, Phản ứng Legal 23
  33. Thêm 0,5ml etanol 90% vào ống nghiệm 3, lắc đều, cắn tan hết. Nhỏ 1 giọt dung dịch natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều, xuất hiện màu đỏ cam thì dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính (-). d, Phản ứng Keller-Kiliani Hịa tan cắn cịn lại bằng 0,5ml etanol 90%. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic, lắc đều. Nghiêng ống 45o. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống nghiệm. Phản ứng dương tính khi giữa hai lớp chất lỏng cĩ vòng màu đỏ. Kết quả: Phản ứng âm tính (-). Kết luận: Mẫu nghiên cứu khơng cĩ glycosid tim. ➢ Định tính alcaloid. Lấy 2 g dược liệu đã làm nhỏ, cho vào bình nĩn dung tích 50 mL. Thêm 15 mL dung dịch thấm ẩm H2SO4 1N. Đun đến sơi, để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 mL. Kiềm hĩa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH 9–10. Chiết alcaloid base bằng chloroform (3 lần, mỗi lần 5 mL). Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng natri sulfat khan, sau đĩ đem lắc với H2SO4 1N (2 lần, mỗi lần 5 mL). Gộp các dịch chiết nước chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 mL để làm các phản ứng: - Phản ứng với thuốc thử Mayer: Thêm 2–3 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy xuất hiện tủa trắng thì phản ứng dương tính. - Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: Thêm 2–3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dương tính. 24
  34. - Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: Thêm 2–3 giọt thuốc thử Dragendorff, nếu thấy xuất hiện kết tủa cam thì phản ứng dương tính. Kết quả: Các phản ứng dương tính (+). Kết luận: Mẫu nghiên cứu cĩ alcaloid ➢ Định tính saponin Cho 5g dược liệu vào bình nĩn 100ml, chiết bằng 30ml cồn 90o, lọc dịch chiết bằng giấy lọc gấp nếp. Dịch chiết cồn để làm phản ứng : - Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vài giọt dịch chiết cơng vào ống nghiệm cĩ 5ml nước, lắc mạnh trong 1 phút, cĩ cột bọt cao bền vững trong 15 phút. - Phản ứng với H2SO4 đậm đặc: Nhỏ 1 giọt H2SO4 đậm đặc vào cốc chứa cắn của dịch chiết cồn, khơng thấy xuất hiện màu tím hồng . Kết quả: Các phản ứng dương tính (+). Kết luận: Mẫu nghiên cứu cĩ chứa saponin. Chuẩn bị: Lấy dược liệu đã làm nhỏ, cho nước ngập dược liệu (cách bề mặt dược liệu khoảng 2cm), đun sơi trong 30 phút. Sau 30 phút, lấy dịch chiết ra, lọc nĩng thu được dịch lọc. Dịch lọc lại đem cơ đến cắn (cắn tồn phần). ➢ Định tính flavonoid Hịa tan cắn vào EtOH 90%, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc để làm các phản ứng: - Phản ứng với hơi amoniac (NH3): Nhỏ vài giọt dịch lọc lên miếng giấy lọc, để khơ rồi hơ lên miệng lọ amoniac đặc, quan sát nếu thấy vết chất chuyển sang màu vàng thì phản ứng dương tính. 25
  35. - Phản ứng với dung dịch kiềm lỗng: Cho dịch lọc vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch NaOH 10%, nếu thấy dịch vẩn đục màu vàng thì phản ứng dương tính. - Phản ứng Cyanidin: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống khoảng 1 mL dịch lọc, 1 ống thêm ít bột Mg kim loại rồi nhỏ từ từ vài giọt HCl đậm đặc, ống cịn lại để đối chiếu. Khi phản ứng xong quan sát nếu thấy ống phản ứng xuất hiện màu đỏ cam đậm hơn ống đối chiếu thì phản ứng dương tính. - Phản ứng với dung dịch sắt (III) chlorid: Cho khoảng 1mL dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Lắc đều, nếu thấy xuất hiện màu xanh đen thì phản ứng dương tính. Kết quả: Các phản ứng dương tính (+). Kết luận: Mẫu nghiên cứu cĩ chứa flavonoid. ➢ Định tính coumarin Chuẩn bị dịch lọc như phần định tính flavonoid để làm phản ứng mở đĩng vịng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 mL dịch lọc: + Ống 1: thêm 0,5 mL NaOH 10%. + Ống 2: để nguyên. Đun cả 2 ống trong 2 phút, để nguội, nếu thấy hiện tượng: + Ống 1: cĩ tủa đục màu vàng. + Ống 2: trong suốt. Thêm từ từ nước cất vào cả 2 ống đến 4 mL: + Ống 1: trong suốt. + Ống 2: cĩ tủa đục. 26
  36. Thêm vài giọt HCl đặc vào ống 1, ống 1 trở lại đục như ống 2 thì phản ứng dương tính. Kết quả: Các phản ứng dương tính (+). Kết luận: Mẫu nghiên cứu cĩ chứa coumarin. ➢ Định tính anthranoid Phản ứng Borntraeger: Hịa tan một ít cắn vào 10 mL H2SO4 1N. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc cho vào bình gạn. Chiết bằng 10mL chloroform, gạn lấy lớp chloroform vào ống nghiệm, cơ bớt dung mơi cịn khoảng 1 mL, thêm 1 mL NaOH 10% vào, lắc nhẹ, nếu xuất hiện màu đỏ sim thì phản ứng dương tính. Kết quả: phản ứng âm tính (-) Kết luận: Mẫu nghiên cứu khơng cĩ anthranoid. ➢ Định tính acid hữu cơ Hịa tan cắn trong nước nĩng, để nguội rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp. Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2 mL dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3 nếu thấy cĩ bọt khí bay lên thì phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính (+). Kết luận: Mẫu nghiên cứu cĩ chứa acid hữu cơ. ➢ Định tính tanin Hịa tan cắn trong nước nĩng. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 2 mL dịch lọc. + Ống 1: Thêm vài giọt sắt (III) chlorid 5% nếu thấy xuất hiện tủa màu xanh đen thì phản ứng dương tính. + Ống 2: Thêm vài giọt chì acetat 10% nếu thấy xuất hiện tủa bơng thì phản ứng dương tính. 27
  37. + Ống 3: Thêm vài giọt gelatin 1% nếu thấy xuất hiện tủa bơng trắng thì phản ứng dương tính. Kết quả: Các phản ứng dương tính (+). Kết luận: Mẫu nghiên cứu cĩ chứa tanin. ➢ Định tính đường khử Hịa tan cắn vào 1 mL nước nĩng, đem lọc thu được dịch lọc. Thêm vào đĩ 1 mL dung dịch thuốc thử Fehling A và 1 mL dung dịch thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy sơi vài phút nếu thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì phản ứng dương tính. Kết quả: phản ứng dương tính (+) Kết luận: Mẫu nghiên cứu cĩ đường khử. ➢ Định tính chất béo Hịa tan cắn vào 2 mL nước nĩng, lọc nĩng. Nhỏ 1 giọt dịch chiết trên lên miếng giấy lọc, hơ nĩng cho bay hết hơi dung mơi, nếu để lại vết mờ trên giấy lọc thì phản ứng dương tính. Kết quả: phản ứng dương tính (+) Kết luận: Mẫu nghiên cứu cĩ chất béo. ➢ Định tính acid amin: Hịa tan cắn vào 2 mL nước nĩng, lọc nĩng. Thêm 5 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thủy 2 phút, nếu thấy xuất hiện màu tím thì phản ứng dương tính. Kết quả: phản ứng âm tính (-) Kết luận: Mẫu nghiên cứu khơng cĩ acid amin. ➢ Định tính caroten 28
  38. Cho vào ống nghiệm nhỏ một ít cắn khơ, nhỏ vài giọt H2SO4 đặc vào cắn nếu thấy xuất hiện màu xanh lá thì phản ứng dương tính. Kết quả: phản ứng dương tính (+) Kết luận: Mẫu nghiên cứu cĩ caroten. ➢ Định tính sterol Cho vào ống nghiệm một ít cắn khơ, hịa tan trong 2 mL chloroform và 1mL 0 anhydrid acetic. Để ống nghiệm nghiêng 45 , thêm từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm, nếu thấy mặt phân cách cĩ vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên cĩ màu xanh lá thì phản ứng dương tính. Kết quả: phản ứng âm tính (-) Kết luận: Mẫu nghiên cứu khơng cĩ sterol. ➢ Định tính polysaccharide: Đun sơi 2g dược liệu với 20ml nước cất, trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch lọc dùng làm phản ứng sau: + Ống 1: 4ml dịch chiết và 5 giọt TT Lugol + Ống 2: 4ml nước cất và 5 giọt TT Lugol Quan sát ống 1 màu xanh đậm hơn ống 2 thì phản ứng dương tính. Kết quả: phản ứng dương tính (+) Kết luận: Mẫu nghiên cứu cĩ polysaccharide Nhận xét: Bằng các phản ứng hĩa học sơ bộ nhận thấy dược liệu lá dứa thơm thu hái ở tỉnh Thái Bình cĩ 10 nhĩm hợp chất: flavonoid, saponin, tanin, coumarin, acid hữu cơ, alcaloid, đường khử, chất béo, polysaccharid và caroten. Kết quả định tính các nhĩm chất hữu cơ trong lá cây Dứa thơm bằng phản ứng đặc trưng được trình bày ở Bảng 3.1. 29
  39. Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhĩm chất hữu cơ bằng phương pháp hĩa học STT Nhĩm chất Phản ứng định tính Kết quả Nhận xét 1 Glycosid tim Liberman - Khơng Bajiet - Khơng Legal - Khơng 2 Saponin Hiện tượng tạo bọt + Cĩ 3 Alcaloid Thuốc thử Mayer ++ Cĩ Thuốc thử Wagner ++ Cĩ Thuốc thử Dragendorff ++ Cĩ 4 Anthranoid Phản ứng Borntrager - Khơng 5 Flavonoid Phản ứng với Cyanidin + Cĩ Phản ứng với NH3 + Cĩ Phản ứng với NaOH 10% + Cĩ Phản ứng với FeCl3 + Cĩ 6 Coumarin Phản ứng đĩng mở vịng lacton + Cĩ 7 Tanin Phản ứng với FeCl3 5% + Cĩ Phản ứng với gelatin 1% + Cĩ Phản ứng với chì acetat 10% + Cĩ Phản ứng với đồng acetat 10% + Cĩ 8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 ++ Cĩ 9 Acid amin Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin - Khơng 10 Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling ++ Cĩ 11 Chất béo Phát hiện vết trên giấy lọc ++ Cĩ 12 Sterol Phản ứng với H2SO4/anhydride - Khơng 13 Caroten Phaceticản ứ ng với H2SO4 + Cĩ 14 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol + Cĩ Ghi chú: (-) âm tính, (+) dương tính, (++) dương tính rõ, (+++) dương tính rất rõ. 30
  40. 3.2.2. Kết quả chiết xuất, phân lập một số hợp chất trong lá cây Dứa thơm 3.2.2.1. Chiết các phân đoạn từ lá cây Dứa thơm Mẫu lá cây dứa thơm, phơi sấy khơ (1,6 kg) được ngâm chiết bằng dung mơi EtOH 70% (3 lần, mỗi lần 8 L), sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40oC trong vịng 30 phút. Lọc các dịch chiết EtOH thu được qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung mơi dưới áp suất giảm, thu được 114 g cao chiết tổng ethanol. Lấy 100 g cao chiết phân tán trong nước cất (600 mL) và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc (mỗi dung mơi 3 lần, mỗi lần 600 mL). Các dịch chiết n-hexan, EtOAc được cất loại dung mơi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng n-hexan (32,8 g) và ethyl acetat (51,9 g). Sơ đồ chiết xuất lá cây Dứa thơm được trình bày theo Hình 3.5 Dược liệu 1,6 kg Chiết bằng ethanol 70% Dịch chiết ethanol Cất loại dung mơi Cao tổng ethanol 114g Phân tán 100g cao vào nước Dịch nước Chiết phân đoạn bằng n-hexan Cất loại dung mơi Phân đoạn n-hexan Phân đoạn nước 32.8g Chiết bằng ethyl acetat Cất loại dung mơi Phân đoạn ethyl acetat 51,9g Phân đoạn nước Hình 3.5. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Dứa thơm 31
  41. 3.2.2.2. Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột Tiến hành phân tách phân đoạn dịch chiết EtOAc (40,0 g) trên cột sắc ký silicagel (Φ85 mm × 90 mm) với hệ dung mơi cĩ độ phân cực tăng dần bao gồm n- hexan : EtOAc (5:1 → 1:1, v/v, mỗi phân đoạn 600 mL) và tiếp sau là CHCl3 : MeOH (10:1 → 1:1, v/v, mỗi phân đoạn 500 mL) thu được 4 phân đoạn ký hiệu là D1 ~ D4 Từ phân đoạn D1 (8,1 g), chạy sắc ký cột silicagel (Φ45 mm × 350 mm) với hệ pha động CHCl3 : MeOH (9:1; 6:1; 3:1, v/v, 2,0 L) thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn là D1.1 ~ D1.3. Phân tách phân đoạn nhỏ D1.1 (1,9g) bằng sắc ký cột pha thường sử dụng hệ dung mơi rửa giải CHCl3 : Aceton (8:1, v/v, 800m L) thu được 1 hợp chất ký hiệu là DT1 (31 mg). Phân tách phân đoạn nhỏ D1.2 (2,2g) bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung mơi MeOH: CHCl3 (6:1) thu được 1 hợp chất ký hiệu là DT2 (28 mg). Sơ đồ phân lập 2 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat được trình bày như Hình 3.7. Cắn ethyl acetat 40,0 Hệ dung mơi n-hexan : EtOAc (5:1 → 1:1, v/v) CHCl3 : MeOH (10:1 → 1:1, v/v) D1 8,1 g D2 D3 D4 CHCl3 : MeOH (9:1; 6:1; 3:1, v/v) D1.1 1,9 g D1.2 2,2 g D1.3 CHCl3 : Aceton MeOH : CHCl3 (6:1, v/v ) (8:1, v/v) DT1 DT2 31 mg 28 mg Hình 3.6. Sơ đồ phân lập 2 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat 32
  42. 3.2.2.3. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được A. Hợp chất DT1: Blumenol A Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất DT1: Chất bột, màu trắng. 31 Độ quay cực [α ] D : +25 (c = 0,3, CHCl3) Nhiệt độ nĩng chảy: 112-113 oC. Cơng thức phân tử C13H20O3, M = 224. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất DT1 và chất tham khảo [8, 18] được trình bày ở Bảng 3.2. Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT1 và hợp chất tham khảo a,b Aa,b Aa,c δC δC δH (ppm) δH a,c (ppm) ppm ppm (Mult, J=Hz) Vị trí C DEPT (Mult, J=Hz) 1 C 41,2 42,4 2 CH2 49,6 50,7 2,23(d, J = 17); 2,18 (d, J = 17) 3 C 198,1 201167.4,2 2,42(d, J = 17,0 ) 2,53 (d,J=17 ) 4 CH 126,9 127,1 5,92(br s) 5,90 (br s) 5 C 162,5 167,4 6 C 79,0 79,9 7 CH 135,7 130,1 5,78(d, J = 16,0 ) 5,79 (d, J = 15,5) 8 CH 129,0 137,0 5,85(dd, J = 5,0; 16) 5,81 (dd, J = 6,0; 15,5) 9 CH 68,1 68,7 4,42 (m) 4,34 (dq, J = 6,0; 6,5) 10 CH3 23,7 23,8 1,31 (d, J = 6,5 ) 1,26 (d,J = 6,6 ) 11 CH3 22,9 24,5 1,01(s) 1,03 (s) 12 CH3 24,1 23,5 1,09 (s) 1,06 (s) 13 CH3 18,9 19,6 1,91 (s) 1,94 (d, J = 1.5) a ) đo trong CDCl3 , b) 125 MHz, c )500 MHz, A) của chất tham khảo blumenol A [8, 18] 33
  43. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT1 xuất hiện tín hiệu 3 nhĩm methyl bậc 3 tại δH 1,01 (3H, s), 1,09 (3H, s) và 1,91 (3H, s), 1 nhĩm methyl bậc 2 tại δH 1,31 (3H, d, J = 6,6 Hz), một nhĩm oxymethine tại δH 4,42, 3 proton olefin tại δH 5,78 (1H, d, J = 16,0 Hz), 5,85 (1H, dd, J = 5,0, 16,0 Hz), 5,92 (1H, br s), những tín hiệu này gợi ý sự cĩ mặt cấu trúc khung megastigmane. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất DT1 xuất hiện tín hiệu của 13 cacbon bao gồm: 1 cacbonyl, 3 cacbon bậc 4, 4 nhĩm methine, 1 nhĩm methylene và 4 nhĩm methyl. Trên phổ 13C-NMR cĩ sự xuất hiện tín hiệu của nhĩm methyl bậc 2 [δC 23,7/ δH 1,31 (3H, d, J = 6,5 Hz)]. Sau khi so sánh số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất DT1 với hợp chất blumenol A [8, 18] thấy hồn tồn phù hợp, do đĩ́ cho phép khẳng định hợp chất DT1 chính là blumenol A cĩ CTPT là: C13H20O3. Hình 3.7. Cấu trúc hĩa học chất DT1 B. Hợp chất DT2: 3,4-Dihydroxybenzoic acid Chất bột, màu trắng. Nhiệt độ nĩng chảy: 190-191oC. Cơng thức phân tử C7H6O4, M = 154. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất DT2 và chất tham khảo [27] được trình bày ở bảng 3.3. 34
  44. Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT2 và hợp chất tham khảo a,c Qb,c a,d Qb,d δC δC δH (ppm) δH (ppm) Vị trí C DEPT ppm ppm (Mult, J=Hz) (Mult, J=Hz) 1 C 123,9 123,28 2 CH 117,8 117,85 7,46 (s) 7,44 (d, J = 2) 3 C 146,0 146,18 4 C 151,3 151,66 5 CH 115,8 115,89 6,83 (d, J = 8,0) 6,79 (d, J = 6,0) 6 CH 123,9 124,03 7,45 (d, J = 8,0) 7,42 ( d, J = 6,0) COOH C 170,5 167,4 a) đo trong CD3OD, b) đo trong DMSO, c) 125 MHz, d) 500 MHz, Q) của chất tham khảo 3,4-Dihydroxybenzoic acid [27] 1 Trên phổ H-NMR của DT2 xuất hiện 3 tín hiệu proton tại δH 6,83 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,0 Hz) và 7,46 (1H, s) đặc trưng của một vòng thơm cĩ hệ proton dạng ABX. Trên phổ 13C-NMR và DEPT của DT2 xuất hiện tín hiệu của 7 cacbon, bao gồm 3 nhĩm methine tại δC 115,8; 117,8 và 123,9; 3 cacbon bậc 4 tại δC 123,9; 146,0, 151,3 đặc trưng của vòng thơm và một nhĩm cacboxylic tại δC 170,5. Sau khi so sánh số liệu phổ của DT2 với số liệu phổ của hợp chất 3,4- dihydroxybenzoic acid [27] thấy số liệu hồn tồn phù hợp điều này cho phép khẳng định hợp chất DT2 là 3,4-dihydroxybenzoic acid, cĩ CTPT là C7H6O4. Hình 3.8. Cấu trúc hĩa học của hợp chất DT2 35
  45. 3.3. Bàn luận 3.3.1. Về đặc điểm thực vật và định tính các nhĩm chất Trong quá trình thực nghiệm, đề tài đã sử dụng mẫu nghiên cứu là lá cây Dứa thơm được thu hái tại tỉnh Thái Bình. Nghiên cứu này đã đi sâu, mơ tả chi tiết hơn về đặc điểm hình thái thực vật, đặc biệt về đặc điểm vi phẫu lá và bột dược liệu lá với những hình ảnh rõ nét, trong khi các cơng bố trước đây chưa được miêu tả. Đồng thời xác định được tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Pandanus amaryllifolius Roxb. Kết quả đạt được trên đây gĩp phần phân biệt lồi P. amaryllifolius với các lồi khác trong chi Pandanus, là nghiên cứu bước đầu làm tiền đề cho mục đích nghiên cứu sâu hơn, gĩp phần xây dựng và hồn thiện tiêu chuẩn của chuyên luận về dược liệu này trong Dược điển Việt Nam. Về đặc điểm thực vật, cĩ một số khác biệt của lồi P. amaryllifolius so với các lồi khác tiêu biểu như: lá (với lồi P. tectorius, P. Odoratissimus, P. kaida Kurz mép lá cĩ răng cưa nhọn trong khi lồi P. amaryllifolius mép lá khơng cĩ và lá P. amaryllifolius cĩ mùi thơm nếp đặc trưng). Nghiên cứu đã tiến hành phân tích đặc điểm vi phẫu, soi bột dược liệu thân và lá. Kết quả nghiên cứu cho thấy, đặc điểm vi học của cây mang các đặc điểm chung đặc trưng của thực vật họ Pandanaceae . Vi phẫu lá cĩ thể quan sát rõ các lớp tế bào trên kính hiển vi. Các hình ảnh về cấu tạo vi học của lá rất rõ nét, cĩ những mức phĩng đại khác nhau, cĩ thể dùng làm tư liệu cho việc tiêu chuẩn hĩa và kiểm nghiệm xác định mẫu cây Dứa thơm. Để khảo sát thành phần hĩa học của P. amaryllifolius, đề tài đã sử dụng phương pháp định tính bằng các phản ứng hĩa học đặc trưng, là phương pháp hiện đang được áp dụng chủ yếu ở Việt Nam bởi tính thuận tiện, kinh tế và hiệu quả cao. Kết quả định tính được một số nhĩm chất cĩ trong lá cây Dứa thơm là flavonoid, saponin, tanin, coumarin, acid hữu cơ, alcaloid, đường khử, chất béo, polysaccharid và caroten, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về thành phần hĩa học của chi và 36
  46. lồi như: flavonoid, benzenoid và các alkaloid. Điều này cho thấy các lồi thuộc chi Pandanus cĩ chứa các nhĩm chất khá giống nhau. Vì vậy, khi nghiên cứu thành phần hĩa học của một lồi nào đĩ thuộc chi Pandanus cĩ thể định hướng nghiên cứu dựa trên kết quả nghiên cứu của lồi đã cĩ cơng bố. 3.3.2 Về chiết xuất và phân lập Đề tài đã phân lập được hai hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat bằng phương pháp ngâm chiết với dung mơi EtOH, đĩ là Blumenol A và Acid 3,4- dihydroxybenzoic. Sau đĩ, tiến hành xác định cấu trúc thơng qua kết quả đo nhiệt độ nĩng chảy, phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân, so với dữ liệu phổ cơng bố của các chất liên quan. Đây là hai chất lần đầu tiên phân lập được từ lá cây Dứa thơm. A, Hợp chất 1: Blumenol A Blumenols là apocarotenoid cĩ nguồn gốc từ một nhánh phụ của con đường carotenoid. Blumenol A được tìm thấy trong một số lồi thực vật như: lá cây Heliotropium angiospermum (Gilda Erosa-Rejĩn phân lập được vào năm 2009) [18]; lá cây Bridelia glauca f. balansae (Etsuko Sueyoshi phân lập được vào năm 2006) [51]; lá cây Euphorbia heteradena (do Sevil Oksuz phân lập được vào năm 2001) [50]; cây khổ sâm mềm Brucea mollis Wall. ex Kurz thu hái tại Hịa Bình (Mai Hùng Thanh Tùng phân lập được vào năm 2018) [8]; thân và lá của cây Lawsonia alba (Bina Shaheen Siddiqui phân lập được vào năm 2012) [40]. Nghiên cứu đã được tiến hành và phát hiện dịch chiết MeOH từ lá cây Brucea mollis (trong đĩ cĩ chứa blumenol A) cĩ tác dụng ức chế rất mạnh dịng tế bào ung thư phổi người A549 (96%) ở nồng độ 100 µg/mL [51]. Một nghiên cứu cũng đã đánh giá tích cực về hoạt động chống tăng sinh của blumenol A đối với dịng tế bào ung thư phổi A549 và NCI-H727 bằng thử nghiệm MTT khi so sánh với cisplatin, một chất chống ung thư phổ rộng [25]. Điều này đã chỉ ra rằng blumenol A cĩ tác dụng chống ung thư phổi đặc biệt với dịng tế bào A549. Ngồi ra, nghiên cứu về hoạt động chống bệnh lao của các hợp chất trong cây Lawsonia alba Lam đã chỉ ra 37
  47. rằng blumenol A cĩ khả năng ức chế vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis 11% ở nồng độ 6,25 (mg/ml) [40]. Blumenol A đã được phân lập từ một số lồi cây tuy nhiên việc nghiên cứu ảnh hưởng của nĩ đối với các hoạt tính sinh học của cây chưa nhiều. Vì vậy, cần thêm nữa những thử nghiệm về tác dụng dược lí của dịch chiết lá Dứa thơm và blumenol A phân lập từ lồi này. B, Hợp chất 2: Acid 3,4-dihydroxybenzoic Acid 3,4-dihydroxybenzoic là một loại axit phenolic phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Nĩ cĩ cấu trúc tương tự với axit gallic, axit caffeic, axit vanillic và axit syringic là những hợp chất chống oxy hĩa nổi tiếng. Acid 3,4-dihydroxybenzoic phân bố rộng rãi và cĩ mặt trong hầu hết các cây ăn được dùng trong y học dân gian [34]. Nĩ cũng là một hợp chất rất phổ biến trong chế độ ăn uống, cĩ trong cám và gạo lứt ngũ cốc [19] và hành tây [25]. Acid 3,4-dihydroxybenzoic được phát hiện trong nhiều loại trái cây như mận [39]; quả lý gai [31]; nho [31]và các loại hạt như hạnh nhân thường [38]. Nĩ cĩ trong các sản phẩm cĩ nguồn gốc thực vật như dầu ơ liu hoặc rượu vang trắng [35, 36]. Acid 3,4-dihydroxybenzoic cũng được tìm thấy trong nhiều loại gia vị như cây hồi, cây hương thảo [25]. Nĩ cịn là thành phần hoạt tính sinh học trong một số cây thuốc như cây cẩm quỳ [45, 11], cây bạch quả Nhật Bản [26]. Axit 3, 4-dihydroxybenzoic đã được phân lập từ ethyl acetate của phân đoạn metanolic của lá, thân và rễ cây dương xỉ Trichomanes chinense L. (họ Hymenophyllaceae) [27]. Nghiên cứu về thuộc tính kháng khuẩn cho thấy hợp chất phân lập được cĩ hoạt động chống lại vi khuẩn gây bệnh thương hàn Salmonella thypimurium. Đồng thời hợp chất này cho thấy khả năng chống oxy hĩa đáng kể mạnh hơn 1,8 lần so với axit ascorbic và ngang bằng với axit gallic [27]. Axit 3,4- dihydroxybenzoic được phân lập từ phần vỏ cây Machilus thunbergii Sieb. et Zucc. ( họ Lauraceae) được phát hiện cĩ các hoạt động bảo vệ thần kinh đáng kể chống lại độc tính thần kinh do glutamate trong các tế bào vỏ chuột được nuơi cấy sơ cấp ở 38
  48. nồng độ từ 0,1 µm đến 10,0 µm và cĩ thể so sánh với MK-801, một chất ức chế nổi tiếng đối với thụ thể glutamate [52]. Axit 3,4-dihydroxybenzoic cĩ trong nước chiết xuất từ cánh hoa dâm bụt Hibiscus sabdariffa (họ Malvaceae) thể hiện tác dụng hạ huyết áp và bảo vệ tim mạch trong các giai đoạn thiết lập của mơ hình tăng huyết áp mạch máu ở chuột [23]. Nhiều cơng trình nghiên cứu đã được thực hiện về Acid 3,4-dihydroxybenzoic và đã cĩ nhiều tác dụng sinh học được biết đến như: chống xơ hĩa [16], chống viêm [9], giảm đau [9], chống vi rút [49], chống tăng lipid máu [10], bảo vệ tim mạch [37], bảo vệ gan [17], bảo vệ thận [23]. Đặc biệt acid 3,4-dihydroxybenzoic ở mức 1% và 2% khi cho chuột được điều trị bằng d-galactose trong 8 tuần làm giảm nồng độ oxy phản ứng của protein carbonyl, carboxymethyllysine, pentosidine, sorbitol, fructose và methylglyoxal. Acid 3,4-dihydroxybenzoic ở mức 2% hoặc 4% khi cung cấp cho chuột bị tiểu đường trong 12 tuần rất hữu ích trong việc ngăn ngừa các biến chứng tiểu đường liên quan đến glycation [12]. Do đĩ acid 3,4-dihydroxybenzoic cĩ thể là một chất chống đái tháo đường đầy hứa hẹn cho tương lai. Ngồi ra, Acid 3,4- dihydroxybenzoic cĩ thể ức chế quá trình sinh ung thư hĩa học trong ống nghiệm và tạo ra các tác dụng hỗ trợ sinh sản và chống tăng sinh ở các mơ khác nhau [43]. Các nghiên cứu 3,4-Dihydroxybenzoic acid cĩ tiềm năng lớn ứng dụng trong điều trị. Các tác dụng điển hình như kháng khuẩn, chống viêm, ức chế tăng sinh các tế bào ung thư, hoạt tính liên quan đến chống tiểu đường, của thành phần trên phù hợp với cơng dụng điều trị trong y học cổ truyền của cây Dứa thơm. Tuy nhiên, trong tương lai cần thêm các nghiên cứu xác minh tác dụng sinh học 3,4-Dihydroxybenzoic acid cĩ trong lồi này, nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho phát triển thuốc từ Pandanus amaryllifolius. 39
  49. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khĩa luận đã thu được một số kết quả như sau: - Đã mơ tả được đặc điểm hình thái thực vật và xác định được tên khoa học của cây Dứa thơm là Pandanus amaryllifolius Roxb., thuộc họ Dứa dại (Pandanaceae). - Đã mơ tả được đặc điểm vi phẫu lá và đặc điểm bột lá của lồi nghiên cứu gĩp phần tiêu chuẩn hĩa lồi này. - Đã định tính được các nhĩm chất cĩ trong lá cây Dứa thơm (Pandanus amaryllifolius) bao gồm flavonoid, saponin, tanin, coumarin, acid hữu cơ, alcaloid, đường khử, chất béo, polysaccharid và caroten. - Đã chiết xuất, phân lập bằng phương pháp sắc ký cột thu được 02 hợp chất từ lá cây Dứa thơm. - Đã xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được: Dựa vào kết quả đo nhiệt độ nĩng chảy, phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân, xác định được cấu trúc 2 hợp chất vừa phân lập được là Blumenol A ((6S,9R)-6-hydroxy-3-oxo- alpha ionol) và 3,4-Dihydroxybenzoic acid (3,4-Dihydroxy-benzoic acid) Kiến nghị: - Tiếp tục nghiên cứu, phân lập các hợp chất khác từ các bộ phận của cây Dứa thơm. - Nghiên cứu đánh giá thêm về tác dụng sinh học của các phân đoạn dịch chiết, đặc biệt là hoạt tính ức chế tế bào ung thư và chống tiểu đường 40
  50. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương và các cộng sự (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 1, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, 9. 2. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Tập 2, Nhà xuất bản Y học, 175- 179 3. Nguyễn Thị Thanh Lan (2018), Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần một số hợp chất hĩa học bằng dung mơi khơng phân cực trong lá dứa thơm, Khoa Hĩa, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng, 5-11. 4. Vũ Đức Lợi, Phạm Giang Nam, Hồng Văn Hùng, Nguyễn Thị Phương (2016), “Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ lá cây gối hạc (Leea rubra Blume ex Spreng.)”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, 32 (1), tr. 12-17. 5. Vũ Đức Lợi, Lê Thị Thu Hường (2017), Thực hành: Thực vật Dược liệu Dược học cổ truyền, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội, 11-89. 6. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cơ lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, 80-148. 7. Nguyễn Thị Lệ Thủy, Ngơ Thị Lộc (2015), Nghiên cứu quy trình sản xuất trà lá dứa dại đĩng chai, Khoa Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học mở TP.HCM, 10. 8. Mai Hùng Thanh Tùng (2018), “Các isoprenoid và coumarin từ cây khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz)”, Tạp chí Khoa học cơng nghệ và Thực phẩm, 14 (1), tr. 39-44.
  51. Tài liệu tiếng Anh 9. A. B. Lende, A. D. Kshirsagar, A. D. Deshpande và các cộng sự (2011), “Anti- inflammatory and analgesic activity of protocatechuic acid in rats and mice”, Inflammopharmacology, 19 (5), tr. 255–263. 10. A. R. Borate, A. A. Suralkar, S. S. Birje, P. V. Malusare, P. A. Bangale (2011), “Antihyperlipidemic effect of protocatechuic acid in fructose induced hyperlipidemia in rats”, International Journal of Pharma and Bio Sciences, 2 (4), tr. 456. 11. B. H. Ali, N. Al Wabel, G. Blunden (2005), “Phytochemical, pharmacological and toxicological aspects of Hibiscus sabdariffa L.: a review”, Phytotherapy Research, 19 (5), tr. 369–375. 12. B. Scazzocchio, R. Varì, C. Filesi và các cộng sự (2011), “Cyanidin-3-O-β- glucoside and protocatechuic acid exert insulin-like effects by upregulating PPARγ activity in human omental adipocytes”, Diabetes, 60 (9), tr. 2234–2244. 13. Bina Shaheen Siddiqui, Muhammad Nadeem Kardar, Nizam Uddin, Sobiya Perwaiz and Sabira Begu (2012), “Antituberculosis activity of the constituents from the aerial parts of Lawsonia alba Lam”, Journal of Pharmacy Research, 5 (12), tr. 5561-5563. 14. Byng JW, Smets EF, van Vugt R và các cộng sự (2018), “The phylogeny of angiosperms poster: a visual summary of APG IV family relationships and floral diversity”, The Global Flora, 1. 15. Byrne, L.T.; Guevara, B.Q.; Patalinghug, W.C.; Recio, B.V.; Ualat, C.R.; White, A.H. (1992) “The X-Ray Crystal-Structure of (+/-)-Pandamarine, The Major Alkaloid of Pandanus amaryllifolius”, Australian Journal of Chemistry, 45, tr. 1903–1908.
  52. 16. C. Li, W. Jiang, H. Zhu, J. Hou (2012), “Antifibrotic effects of protocatechuic aldehyde on experimental liver fibrosis”, Pharmaceutical Biology, 50 (4), tr. 413– 419. 17. C.-L. Liu, J.-M. Wang, C.-Y. Chu, M.-T. Cheng, T.-H. Tseng (2002), “In vivo protective effect of protocatechuic acid on tert-butyl hydroperoxide-induced rat hepatotoxicity”, Food and Chemical Toxicology, 40 (5), tr. 635–641. 18. Gilda Erosa-Rejĩn, Luis M. Peđa-Rodríguez, Olov Sterner (2009), “Secondary Metabolites from Heliotropium angiospermum”, Journal of the Mexican Chemical Society, 53(2), tr. 44-47. 19. E. A. Hudson, P. A. Dinh, T. Kokubun, M. S. J. Simmonds, A. Gescher (2000), “Characterization of potentially chemopreventive phenols in extracts of brown rice that inhibit the growth of human breast and colon cancer cells”, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention, 9 (11), tr. 1163–1170. 20. G. Jürgenliemk and A. Nahrstedt, (2002)“Phenolic compounds from Hypericum perforatum”, Planta Medica, 68 (1), tr. 88–91. 21. Ghisemzadeh, A and Jaafar, HZE, (2013). “Profiling of phenolic compounds and their antioxidant and anticancer activeties in pandan (Pandanus amaryllifolius Roxb.) extracts from different locations of Malysia”, BMC Complementary and Alternative Medicine, 13, tr. 341-349. 22. Hanna Mae C. Laluces, Atsushi Nakayama, Maribel G. Nonato, Thomas Edison dela Cruz, Mario A. Tan (2015), “Antimicrobial alkaloids from the leaves of Pandanus amaryllifolius”, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 5(10), tr. 151-153 23. J.-H. Lee, H.-J. Lee, H.-J. Lee và cộng sự (2009), “Rhus verniciflua Stokes prevents cisplatin-induced cytotoxicity and reactive oxygen species production in MDCK-I renal cells and intact mice”, Phytomedicine, 16 (2), tr. 188–197.
  53. 24. Jiang J. (1999) "Volatile Composition of Pandan Leaves (Pandanus Amaryllifolius)”, Flavor Chemistry of Ethnic Food, tr. 105-106. 25. K. Herrmann (1989), “Occurrence and content of hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acid compounds in foods”, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 28 (4), tr. 315–347. 26. M. Ellnain-Wojtaszek (1997), “Phenolic acids from Ginkgo biloba L. Part II. Quantitative analysis of free and liberated by hydrolysis phenolic acids”, Acta Poloniae Pharmaceutica, 54 (3), tr. 229–232. 27. Nova Syafni, Deddi Prima Putra, Dayar Arbain (2012), “3,4-dihydroxybenzoic acid and 3,4-dihydroxybenzaldehyde from the fern Trichomanes chinense L.; isolation, antimicrobial and antioxidant properties”, Indonesian Journal of Chemistry, 12(3), tr. 273-278. 28. Nor FM, Mohamed S, Idris NA, Ismail R (2008) “ Antioxidative properties of Pandanus amaryllifolius leaf extracts in accelerated oxidation and deep frying studies”, Food Chemistry, 110 (2), tr. 319-327. 29. Ooi, L. S. M., Sun, S. S. M., Ooi, V. E. C. (2004), “Purification and characterization of a new antiviral protein from the leaves of Pandanus amaryllifolius (Pandanaceae)”, The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 36, tr. 1440-1446. 30. Ooi, L.S.M.; Wong, E.Y.L.; Sun, S.S.M.; Ooi, V.E.C. (2006), “Purification and Characterization of Nonspecific Lipid Transfer Proteins from the Leaves of Pandanus amaryllifolius (Pandanaceae)”, Peptides, 27, tr. 626–632. 31. P. Li, X. Q. Wang, H. Z. Wang, Y. N. Wu (1993), “High performance liquid chromatographic determination of phenolic acids in fruits and vegetables”, Biomedical and Environmental Sciences, 6 (4), 389–398.
  54. 32. P. Vitaglione, G. Donnarumma, A. Napolitano và các cộng sự (2007), “Protocatechuic acid is the major human metabolite of cyanidin-glucosides”, The Journal of Nutrition, 137 (9), tr. 2043–2048. 33. Peungvicha P, Thirawarapan SS, Watanabe H. (1998) , “Possible Mechanism of Hypoglycemic Effect of 4-Hydroxybenzoic Acid, a Constituent of Pandanus odorus Root”, Japanese Journal of Pharmacology, 78 (3), tr. 395-398. 34. R. H. Liu (2004), “Potential synergy of phytochemicals in cancer prevention: mechanism of action”, The Journal of Nutrition, 134 (12), tr. 3479S–3485S. 35. R. Masella, A. Cantafora, D. Modesti và các cộng sự (1999), “Antioxidant activity of 3,4-DHPEA-EA and protocatecuic acid: a comparative assessment with other olive oil biophenols”, Redox Report, 4 (3), tr 113–121. 36. R. Masella, R. Varì, M. D'Archivio và các cộng sự (2004), “Extra virgin olive oil biophenols inhibit cell-mediated oxidation of LDL by increasing the mRNA transcription of glutathione-related enzymes”, The Journal of Nutrition, 134 (4), tr. 785–791. 37. R. Zhou, L. F. He, Y. J. Li, Y. Shen, R. B. Chao, J. R. Du (2012), “Cardioprotective effect of water and ethanol extract of Salvia miltiorrhiza in an experimental model of myocardial infarction”, Journal of Ethnopharmacology, 139 (2), tr. 440–446. 38. S. Sang, K. Lapsley, W.-S. Jeong, P. A. Lachance, C.-T. Ho, R. T. Rosen (2002), “Antioxidative phenolic compounds isolated from almond skins (Prunus amygdalus Batsch),” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50 (8), tr. 2459– 2463. 39. S.I. Kayano, H. Kikuzaki, N. Fukutsuka, T. Mitani, and N. Nakatani (2002), “Antioxidant activity of prune (Prunus domestica L.) constituents and a new synergist,” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50 (13), tr. 3708–3712.
  55. 40. Sobiya Perwaiz, Bina Shaheen Siddiqui*, Muhammad Nadeem Kardar, Nizam Uddin, Sabira Begum (2012), “Antituberculosis activity of the constituents from the aerial parts of Lawsonia alba Lam.”, Journal of Pharmacy Research, 5(12), tr. 5561- 5563 41. Salim, A.A.; Garson, M.J.; Craik, D.J. (2004) "New Alkaloids from Pandanus amaryllifolius”, Journal of Natural Products, 67 (1), tr. 54–57. 42. Garson MJ. (1996). "Structural characterization of two novel pyrrolidinones from Pandanus amaryllifolius Roxb." ACGC Chemical Research Communications, 5, tr. 24-27. 43. T. Tanaka, T. Tanaka, M. Tanaka (2011), “Potential cancer Chemopreventive activity of protocatechuic acid,” Journal of Experimental and Clinical Medicine, 3 (1), tr. 27–33. 44. Mikio Ono (1991), “Flora of Bonin Islands”, Aliso: A Journal of Systematic and Floristic Botany, 13 (1), tr. 95-105. 45. T.-H. Tseng, J.-D. Hsu, M.-H. Lo và cộng sự (1998), “Inhibitory effect of Hibiscus protocatechuic acid on tumor promotion in mouse skin”, Cancer Letters, 126 (2), tr. 199–207. 46. Takayama, H., Ichikawa, T., Kitajima, M., Nonato, M.G. (2002), “Isolation and Structure Elucidation of Two New Alkaloids Pandamarilactonine-C and Pandamarilactonine-D from Pandanus amaryllifolius and Revision of Relative Stereochemistry and Pandamarilactonine-A and –B by Total Synthesis”, Chem. Pharm Bull, 50 (9), tr. 1303–1304. 47. Van de Laar FA, Lucassen PL, Akkermans RP, van de Lisdonk EH, Rutten GE, van Weel C (2005), “Alpha-glucosidase inhibitors for patients with type 2 diabetes: Results from a Cochrane systematic review and meta-analysis”, Diabetes Care, 28(1), tr. 154-163.
  56. 48. X. Li, X. Wang, D. Chen, S. Chen, “Antioxidant activity and mechanism of protocatechuic acid in vitro”, Functional Foods in Health and Disease, 7, tr. 232– 244. 49. Z. Zhou, Y. Zhang, X.-R. Ding và cộng sự (2007), “Protocatechuic aldehyde inhibits hepatitis B virus replication both in vitro and in vivo”, Antiviral Research, 74(1), tr. 59-64. 50. Sevil Oksuz, Ayhan Uluberlen, Asli barla (2002), “Terpenoids and aromatic compounds from Euphorbia heteradena”, Turkish Journal of Chemistry, 26, tr. 457-463. 51. Yoshio Takedad, HuiLiu, Katsuyoshi Matsunami, Hideaki Otsuka, Takakazu Shinzato, Mitsunori Aramoto (2006), “Bridelionosides A–F: Megastigmane glucosides from Bridelia glauca f. balansae”, Phytochemistry, 67(22), tr. 2483- 2493. 52. Y M Bao, L J An , S Guan, G F Shi, Y L Duan, B Jiang (2006), “Protocatechuic acid from Alpinia oxyphylla against MPP+-induced neurotoxicity in PC12 cells”, Food Chem Toxicol, 44(3), tr. 436-443.