Khóa luận Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân (Hedera nepalensis K. Koch) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị ITS

65 trang thiennha21 18/04/2022 5891

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân (Hedera nepalensis K. Koch) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị ITS", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_nghien_cuu_da_dang_di_truyen_nguon_gen_day_thuong.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân (Hedera nepalensis K. Koch) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị ITS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  BÙI THỊ YẾN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  Người thực hiện: Bùi Thị Yến NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa : QH2015.Y Người hướng dẫn : PGS. TS. Đinh Đoàn Long ThS. Phạm Thị Hồng Nhung Hà Nội – 2020
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã may mắn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu cả về vật chất, tinh thần của thầy cô, bạn bè. Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Đinh Đoàn Long, ThS. Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, những người đã trực tiếp hướng dẫn tôi, chỉ dạy tận tình trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn cô Đỗ Thị Lệ Hằng, bạn Đỗ Hạnh Nguyên đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong thực hành thí nghiệm. Các thầy cô, các bạn không chỉ trang bị cho tôi kinh nghiệm và kỹ năng chuyên môn mà còn truyền cho tôi tình yêu, lòng nhiệt huyết với nghiên cứu và luôn sẵn sàng giúp đỡ mỗi khi tôi gặp khó khăn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Y Dược học cơ sở đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin cảm ơn những cán bộ tại Viện dược liệu - Bộ Y tế đã không quản ngại khó khăn thu thập và cung cấp mẫu vật giúp đỡ tôi thực hiện đề tài một cách thuận lợi nhất. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại nhà trường. Chúng tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ kinh phí của Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam cho đề tài mã số NVQG-2018/02 do PGS.TS Đinh Đoàn Long chủ trì để thực hiện nghiên cứu này. Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và sự yêu thương đến gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn ở bên cổ vũ, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận này. Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2020 Tác giả Bùi Thị Yến
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT bp Cặp bazơ (base pair) DNA Deoxyribo Nucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide 5’ Triphosphate Genbank Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế H.helix Hedera helix L (Thường xuân) H.nepalensis Hedera nepalensis K.Koch (Dây thường xuân) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) ITS Vùng đệm trong được sao mã (Internal transcribed spacer) Kit Thermo GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) ML Maximum Likelihood NCBI Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (National Center for Biotechnology Information) NJ Neighbor - Joining OD Mật độ quang học (Optical Density) PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) RNA Ribo Nucleic Acid UPGMA Unweighted PairGroup with Method using arthmetic Averages
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thông tin các mẫu thực vật được nghiên cứu 19 Bảng 3.1. Nồng độ và OD260/280 DNA tổng số của của các mẫu nghiên cứu 24 Bảng 3.2.Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân dòng đoạn gen ITS 27 Bảng 3.3. Các haplotype trong nghiên cứu 30 Bảng 3.4. Khoảng cách di truyền (phía dưới bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía trên bên phải) giữa 11 nhóm mẫu nghiên cứu và H.nepalen sis (AJ131238.1), H.helix (AM503887.2), H. sinensis (GU054623.1) và Kalopanax septemlobus (MH711151.1) 31 Bảng 3.5. Vị trí các nucleotide sai khác khi so sánh các trình tự trên BioEdit 32 Bảng 3.6. Các trình tự tham chiếu trên Genbank 35
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc tổng quát của vùng rDNA trong thực vật. 9 Hình 1.2. Dạng cây phát sinh loài biết rõ nguồn gốc 11 Hình 1.3. Cây Dây thường xuân H. nepalensis . 13 Hình 1.4. Phân bố địa lý của H. nepalensis tại miền Bắc nước ta 14 Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 21 Hình 2.2. Hiển thị kết quả giải trình tự qua phần mềm BioEdit 23 Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số của một số mẫu trên gel agarose 1,2 %. 24 Hình 3.2. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi phản ứng nhân dòng gen ITS 26 Hình 3.3. Tối ưu nồng độ DNA phản ứng nhân dòng gen ITS 26 Hình 3.4. Tối ưu nồng độ mồi phản ứng nhân dòng gen ITS 27 Hình 3.5. Kết quả PCR nhân dòng gen ITS của một số mẫu 28 Hình 3.6. Kết quả hiển thị giải trình tự của mẫu H1 qua phần mềm BioEdit 28 Hình 3.7. Kết quả so sánh BLAST của mẫu H4 và H. nepalensis (AJ131238). 29 Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp UPGMA dựa trên chỉ thị phân tử ITS 35 Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp NJ dựa trên chỉ thị phân tử ITS 36 Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp ML dựa trên chỉ thị phân tử ITS 36 Hình 4.1. Phân bố địa lý các haplotype của Dây thường xuân ở các tỉnh Lào Cai, Hà Giang, Lạng Sơn 46
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Đa dạng và phân loại sinh học 3 1.1.1. Khái niệm đa dạng sinh học 3 1.1.2. Đa dạng di truyền 3 1.1.3. Thực trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam 3 1.1.4. Các phương pháp phân loại học 4 1.2. Công cụ phân tích đa dạng di truyền và tiến hóa 6 1.2.1. Tổng quan về chỉ thị DNA 6 1.2.2. Các kỹ thuật chỉ chị DNA 7 1.2.3. Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS) 8 1.2.4. Các phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại 10 1.3. Tổng quan về Dây thường xuân (Hedera nepalensis K. Koch) 13 1.3.1. Phân loại học loài Hedera nepalensis K. Koch 13 1.3.2. Đặc điểm hình thái và phân bố địa lý 14 1.3.3. Giá trị y học 14 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.1. Vật liệu thực vật 19 2.1.2. Hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu 20 2.1.3. Thiết bị 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số 21 2.2.2. Nhân dòng đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR 22 2.2.3. Giải trình tự 22 2.3.4. Xử lý số liệu và phân tích kết quả 23 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 i
3.1. Tách chiết DNA tổng số 24 3.2. Kết quả nhân dòng đoạn gen ITS bằng phản ứng PCR 25 3.2.1. Kết quả các phản ứng tối ưu 25 3.2.2. Kết quả nhân dòng gen ITS từ các mẫu thực vật 28 3.3. Giải trình tự 28 3.4. Độ tương đồng của trình tự gen ITS được khuếch đại 29 3.5. Cây phát sinh chủng loại dựa trên vùng gen ITS 30 3.5.1. Lựa chọn mô hình 30 3.5.2. Khoảng cách di truyền 30 3.5.3. Xây dựng cây chủng loại 35 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 37 4.1. Tách chiết DNA tổng số 37 4.2. Tối ưu quy trình nhân dòng gen ITS bằng phản ứng PCR và giải trình tự 38 4.3. Khoảng cách di truyền 40 4.5. So sánh giữa các phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại 41 4.5.1. Phương pháp UPGMA 41 4.5.2. Phương pháp Neighbor- Joining 42 4.5.3. Phương pháp Maximum LikeLihood 42 4.6. Dự đoán trong bảo tồn và chọn tạo giống 43 4.7. So sánh với phân tích hình thái học 44 4.8. Phân tích địa lý của các mẫu nghiên cứu 45 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 ii
ĐẶT VẤN ĐỀ Trên thế giới cũng như ở nước ta xu hướng sử dụng dược liệu và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ thực vật ngày một tăng cao. Theo số liệu của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), khoảng 80% dân số ở các nước đang phát triển có nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu liên quan đến y học cổ truyền [23]. Trong gần 20 năm trở lại đây, ước tính có khoảng 40 - 50% các thuốc được đưa ra thị trường đều trực tiếp hoặc gián tiếp có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên [25]. Tại Mỹ, doanh số bán thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thực vật tăng 8,5%, đạt tổng doanh thu khoảng 8 tỷ USD trong năm 2017 [51]. Cây dược liệu được coi là kho tàng vô giá cung cấp các hợp chất sinh học phục vụ nghiên cứu phát triển thuốc, là thành phần không thể thiếu của ngành dược liệu, góp phần phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng, nâng cao đời sống và phát triển kinh tế - xã hội [23]. Đây là một trong những lý do ngày càng có nhiều loài cây thuốc được đầu tư nghiên cứu, mở rộng quy mô sản xuất để phát triển thành các sản phẩm chất lượng đáp ứng cho thị trường [23]. Họ Nhân Sâm (Araliaceae) là thực vật cung cấp nhiều cây thuốc quý, được dân gian sử dụng lâu đời. Tuy nhiên, các loài trong chi Hedera của họ này còn ít được biết đến ở Việt Nam. Trong chi này, Thường xuân (Hedera helix) và Dây thường xuân (Hedera nepalensis) là hai loài được nghiên cứu nhiều nhất [19]. Ở châu Âu, Thường xuân đã được sử dụng từ rất lâu đời, một trong những sản phẩm nổi tiếng trên khắp thế giới là siro ho Prospan® của Công ty Engelhard Arzneimitel GmbH&Co.KG (Cộng hòa Liên bang Đức). Ở Việt Nam, Thường xuân không phải cây bản địa nhưng Dây thường xuân được ghi nhận phân bố ở nhiều vùng núi cao miền Bắc và hai loài này có hình thái dễ nhầm lẫn. Một số nghiên cứu dược lý đã ghi nhận Dây thường xuân có nhiều tác dụng như chống ung thư, chống oxy hóa, hạ đường huyết, giảm đau, kháng viêm [32, 39, 43, 57]. Mặc dù có tiềm năng dược lý như vậy, song nghiên cứu về Dây thường xuân ở Việt Nam còn hạn chế, đặc biệt là nghiên cứu về đa dạng di truyền. Khai thác dược liệu quá mức, không có định hướng và kiểm soát chặt chẽ đã và đang đe dọa trực tiếp đến nguồn tài nguyên cây thuốc ở nước ta. Do đó, công tác bảo tồn đa dạng sinh học, các nguồn gen quý đang là mối quan tâm hàng đầu của các nhà quản lý và Nhà nước. Đánh giá được mức độ đa dạng di truyền nguồn gen cây thuốc kết hợp với các phân tích thành phần hóa học của từng giống cây cho phép chúng ta chọn lọc được giống cây sản xuất hiệu quả hợp chất quan tâm. Qua 1
đó, thông tin về nguồn gen giúp chúng ta đưa ra được chiến lược bảo tồn và phát triển cây thuốc tiềm năng một cách hiệu quả và bền vững. Hiện nay, các chỉ thị DNA đã trở thành một trong những công cụ hỗ trợ đắc lực cho nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinh học. Nó giúp xác định khoảng cách di truyền và đặc trưng cấp độ cá thể, quần thể phục vụ bảo tồn và chọn giống [14, 26, 38]. Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer, viết tắt là ITS) là một chỉ thị phân loại tốt ở thực vật. Song ITS có phải là một chỉ thị tốt để đánh giá mức độ đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân ở Việt Nam hay không? Để đi tìm lời giải cho câu hỏi này chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân (Hedera nepalensis K. Koch) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị ITS” với hai mục tiêu: 1. Xây dựng quy trình tối ưu nhân dòng vùng gen ITS của cây Dây thường xuân. 2. Định danh khoa học của các mẫu Dây thường xuân thu thập tại Việt Nam thông qua xây dựng cây phát sinh loài dựa trên chỉ thị phân tử ITS. Để thực hiện mục tiêu nghiên cứu trên, tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu như sau: 1. Tách chiết DNA tổng số của 45 mẫu Dây thường xuân. 2. Tối ưu quy trình nhân dòng gen ITS với cặp mồi đặc hiệu. 3. Nhân dòng gen ITS bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen. 4. Phân tích số liệu thu được và xây dựng cây phát sinh chủng loại. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Đa dạng và phân loại sinh học 1.1.1. Khái niệm đa dạng sinh học Theo Công ước đa dạng sinh học năm 1992: Đa dạng sinh học là sự phong phú của mọi cơ thể sống có từ tất cả các nguồn trong các hệ sinh thái mà chúng tạo nên; đa dạng sinh học gồm sự đa dạng trong loài (đa dạng di truyền), giữa các loài (đa dạng loài) và các hệ sinh thái (đa dạng các hệ sinh thái). Đa dạng sinh học có tầm quan trọng to lớn đối với thiên nhiên và con người. Nó mang giá trị sinh thái và môi trường, bảo vệ tài nguyên đất và nước, điều hòa khí hậu, mang giá trị kinh tế lớn nếu biết khai thác và sử dụng đúng cách [9]. 1.1.2. Đa dạng di truyền Đa dạng di truyền hay còn gọi là đa dạng nguồn gen là một phần của đa dạng sinh học. Đa dạng di truyền thể hiện sự phong phú của những biến dị trong cấu trúc di truyền của các cá thể bên trong loài hoặc giữa các loài; bên trong hoặc giữa những quần thể. Đa dạng di truyền xuất phát từ những đột biến nhỏ như thêm, mất, thay thế hoặc đảo vị trí nucleotide trong chuỗi DNA, hoặc từ các đột biến ở cấp độ cao hơn như các đột biến về số lượng hoặc cấu trúc nhiễm sắc thể. Đa dạng di truyền là sự đa dạng ở cấp độ phân tử, là nền tảng cho sự đa dạng của sinh giới [4]. Đây là mức độ nhỏ nhất để cấu thành nên các tổ chức lớn hơn như tế bào hoặc cơ quan. Nghiên cứu đa dạng di truyền chính là nghiên cứu sự biến đổi của sinh vật hay quần thể sinh vật ở cấp độ di truyền (gen, DNA). Ngày nay, nghiên cứu đa dạng sinh học nói chung, đa dạng di truyền nói riêng đang ngày càng được phát triển, góp phần giúp định danh chính xác hệ thống sinh vật khổng lồ. Ngoài ra, đây còn là cơ sở cho bảo tồn phát triển nguồn gen, lai chọn tạo giống mới, nghiên cứu tiến hóa 1.1.3. Thực trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam Việt Nam là một đất nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, trải dài gần 3260 km theo chiều dọc, địa hình ¾ là đồi núi, nên có nguồn tài nguyên sinh vật vô cùng phong phú. Theo các tài liệu thống kê, Việt Nam là một trong 25 nước có mức độ đa dạng sinh học cao trên thế giới, trong đó xếp thứ 16 về mức độ đa dạng sinh học (chiếm 6,5% số loài có trên thế giới). Chỉ kể đến thực vật, Việt Nam có khoảng 20000 loài trên cạn và dưới nước; gần 4000 loài thực vật có giá trị làm thuốc và có nhiều loài thuộc dược liệu quý hiếm. 3
Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, suy thoái đa dạng sinh học đang ngày một nặng nề. Đó là một vấn đề gây nhức nhối toàn cầu. Các chuyên gia cho rằng tốc độ tuyệt chủng hiện tại của các loài thực vật đang cao hơn 100 đến 1000 lần so với mức tự nhiên. Cứ sau 2 năm, chúng ta lại mất ít nhất một loại dược liệu [23]. Trong khi đó, còn tới 90% số loài chưa được thống kê, nghiên cứu thì nhiều loài trong số đó đã bị tuyệt chủng. Nhiều nguyên nhân trực tiếp và gián tiếp khác nhau dẫn đến sự suy thoái đó như khai thác, sử dụng không bền vững; cháy rừng, chuyển đổi phương thức sử dụng đất, ô nhiễm môi trường, chiến tranh, yếu kém trong công tác quản lý [4, 9]. Hàng ngày, hàng giờ đều đang có sự gia tăng nguy cơ tuyệt chủng của một số loài nào đó. Do đó, các nghiên cứu phục vụ bảo tồn và phân tích đa dạng sinh học là vô cùng cần thiết, quan trọng, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Hiện nay, nước ta có nguồn dược liệu lớn, dự báo một nguồn gen phong phú nhưng việc tạo ra giá trị kinh tế từ nguồn dược liệu này còn rất hạn chế. Các sản phẩm từ dược liệu chưa được chuẩn hóa, dẫn đến khó tạo ra các sản phẩm ổn định, có giá trị cao. Đặc biệt, phát triển thuốc từ dược liệu gặp nhiều hạn chế do mối nghi ngại lớn về tác dụng, sự ổn định về chất lượng, khó phân biệt về hình thái. Vì vậy, nghiên cứu đa dạng di truyền càng trở lên có ý nghĩa, giúp xác định chính xác danh pháp khoa học của các loài, từ đó kết hợp với các nghiên cứu dược lý để có biện pháp bảo vệ và phát triển các nguồn gen tạo được các sản phẩm chất lượng tốt. 1.1.4. Các phương pháp phân loại học Phân loại học có vai trò và ý nghĩa đối với nhiều ngành, nhiều lĩnh vực [13]. Có nhiều cách phân chia về các phương pháp phân loại học, phần dưới đây sẽ trình bày một số phương pháp phân loại chính được sử dụng hiện nay. 1.1.4.1. Phương pháp phân loại học truyền thống Trong phân loại học truyền thống có bao hàm phân loại học dựa trên chỉ thị cảm quan (hình thái, màu sắc, mùi vị ) và chỉ thị hóa học (sắc ký lớp mỏng - Thin Layer Chromatography - TLC; sắc ký lỏng cao áp - High-Performance Liquid Chromatography - HPLC ). Phương pháp phân loại bằng đặc điểm hình thái (phương pháp hình thái học) là một phương pháp giữ vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu phân loại học. Nó được sử dụng rất rộng rãi và phổ biến. Phương pháp cho phép so sánh các đặc điểm hình thái của các cơ quan trong cơ thể sinh vật, trước hết là cơ quan sinh dưỡng và sinh sản. Nhờ việc làm nổi bật các đặc điểm giống, khác nhau và nhờ tính ổn định 4
của chúng mà ta có thể sắp xếp các sinh vật vào các nấc thang phân loại khác nhau, xác định được mối quan hệ thân cận. Hạn chế lớn nhất của phương pháp là phân biệt các loài đồng hình. Đôi khi do lợi ích kinh tế hoặc lỗi trong khâu thu hái mà người ta có thể nhầm lẫn các sinh vật với nhau một cách vô tình hoặc cố ý; gây hậu quả nghiêm trọng nhất là với các cây có chất độc [3, 6, 8]. Tuy vậy, chúng ta không thể phủ nhận và thay thế được vai trò to lớn của các cách phân loại truyền thống đối với phân loại học nói chung. 1.1.4.2. Phương pháp phân loại học hiện đại Phân loại học phân tử Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và tin sinh học, các kỹ thuật chỉ thị sinh học phân tử ra đời từ thập kỷ 80 của thế kỷ trước đem lại những thành tựu kỳ diệu và bước tiến quan trọng trong phân loại học [13, 14, 26]. Phân loại học phân tử xác định các loài dựa trên các đặc điểm khác biệt về trình tự DNA, protein hoặc isozyme. Phần lớn chỉ thị phân tử được sử dụng hiện này là các chỉ thị DNA, các chỉ thị này nằm gần hay liên kết với gen và không có hoặc ít ảnh hưởng đến kiểu hình. Bằng phương pháp này, sự khác biệt giữa các cơ thể hoặc các loài khác nhau trở nên nhanh và chính xác. Phương pháp đặc biệt có ích trong trường hợp giải quyết các vấn đề về loài đồng hình hay nghiên cứu các biến dị, khắc phục một phần nhược điểm của phương pháp phân loại truyền thống [13]. Phân loại học hiện trạng số (numerical taxonomy) sử dụng các dấu hiệu giống nhau của sinh vật (từ 60 trở lên) mà không xét nguồn gốc của các dấu hiệu. Phương pháp căn cứ vào mức độ giống nhau của các đối tượng để xác định quan hệ phân loại bằng cách dùng các thuật toán. Ưu điểm của phương pháp này là loại bỏ được tính chủ quan và đảm bảo tính tự nhiên của hệ thống phân loại. Tuy nhiên nhược điểm lớn là đã loại trừ yếu tố tiến hóa và không thể thay thế phương pháp phân loại truyền thống [13]. Phân loại học Phylocod xác định các đặc điểm tổ tiên, các đặc điểm phân ly từ tổ tiên và hình thành các bậc tiến hóa đơn dòng xác định như các loài. Khác với phân loại truyền thống phân chia thành nhiều thứ bậc (loài, giống, họ, bộ ), Phylocod chỉ là hệ thống danh pháp. Theo phương pháp này, số lượng loài sẽ tăng lên hay vấn đề mẫu chuẩn của loài sẽ là những điểm hạn chế. Vì vậy, hệ thống danh pháp này chỉ mang tính tham khảo [13]. 5
Cận phân loại học (Parataxonomy) sử dụng để so sánh tổng quát về mức độ phong phú của sinh vật nói chung của một khu vực. Phương pháp phân loại này chủ trương phân thành các đơn vị phân loại mà không thành các loài theo những nguyên tắc chung. Nó có thể phù hợp cả những người không chuyên về phân loại học bằng cách phân loại bằng mắt thường. Vì vậy, nhiều nhà khoa học cho rằng đây sẽ chỉ là một kỹ thuật trợ giúp trong phân loại học [13]. 1.2. Công cụ phân tích đa dạng di truyền và tiến hóa 1.2.1. Tổng quan về chỉ thị DNA Nhiệm vụ chính cho bất kỳ chuyên gia về hệ thống thực vật, sinh thái học, sinh học tiến hóa và bảo tồn hoặc chuyên gia pháp y ứng dụng là định danh chính xác mẫu động thực vật một cách nhanh chóng, có thể lặp lại và độ đáng tin cậy cao. Chỉ thị DNA sử dụng các đoạn trình tự gen hoặc DNA đặc hiệu là một công cụ hữu ích để xác định, nhận dạng loài. Số lượng nghiên cứu sử dụng mã vạch được sử dụng ngày càng nhiều. Bằng cách kết hợp các thế mạnh của di truyền phân tử, công nghệ giải trình tự và tin sinh học, chỉ thị DNA cung cấp một phương tiện nhanh chóng và chính xác để nhận biết các loài đã biết, mô tả và đặt tên trước đó và lấy thông tin về chúng. Cho đến ngày nay, công cụ này khám phá hàng ngàn loài động thực vật chưa được đặt tên, đặc biệt là trong quần xã sinh vật nhiệt đới. Là một công cụ khám phá đa dạng sinh học mang tính cách mạng [26], chỉ thị DNA đã giúp tìm kiếm các loài có tiềm năng mới đối với khoa học, phân tích dữ liệu di truyền của chúng, đặc biệt là với các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Dựa trên chỉ thị DNA, nhiều mã vạch DNA được phát triển. Mã vạch DNA là các trình tự đặc hiệu cho phép xác định một đơn vị phân loại nào đó như loài. Đối với những người sử dụng phân loại học ứng dụng, mã vạch DNA đóng vai trò là phương tiện để xác định các loài quy định, các loài xâm lấn và các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Ngoài ra nó còn để kiểm tra danh tính và độ tinh khiết của các sản phẩm thực vật, như thuốc thảo dược thương mại và thực phẩm chức năng. Mã vạch DNA hiện đang được sử dụng để giải quyết các vấn đề sinh thái, tiến hóa và bảo tồn. Quá trình tạo và áp dụng mã vạch DNA thực vật cho mục đích nhận dạng đòi hỏi hai bước cơ bản: 1) xây dựng thư viện mã vạch DNA của các loài đã biết và 2) khớp với chuỗi mã vạch DNA của một mẫu chưa biết so với thư viện mã vạch DNA. Bước đầu tiên yêu cầu các nhà phân loại chọn một đến vài cá thể cho mỗi loài để làm mẫu tham chiếu trong thư viện mã vạch DNA. Mô, tế bào có thể được thu trực tiếp từ các mẫu vật tươi hoặc các mẫu khô, không bị nhiễm nấm mốc. Khi 6
thư viện mã vạch DNA hoàn tất, mẫu chưa biết sẽ được tách chiết DNA tổng số và mã vạch DNA được tạo ra của mẫu vật sẽ được so sánh với mã vạch DNA đã biết bằng cách sử dụng một số loại thuật toán phù hợp [38]. Chỉ thị DNA là công cụ hữu ích giúp phân loại các loài [13, 26, 38]. Đoạn gen được sử dụng có thể tìm thấy ở tất cả các sinh vật (hoặc ít nhất là trong các thành viên của một nhóm loài), các trình tự nucleotide sẽ giống nhau hoặc rất giống nhau ở các cá thể trong cùng một loài. Vì vậy khu vực này có thể được sử dụng cho nhận dạng các loài bằng cách so sánh trình tự của chỉ thị DNA trong sinh vật thử nghiệm với trình tự tham khảo từ các cơ sở dữ liệu. Các vùng gen được dùng làm chỉ thị DNA ở thực vật bao gồm các trình tự DNA trong lạp thể và DNA trong nhân. Hiện nay, các chỉ thị dựa trên trình tự DNA là một phương pháp xác định các loài một cách hiệu quả. Tuy nhiên, mỗi phương pháp phân loại đều có những mặt hạn chế. Chỉ thị DNA phân biệt các loài với nhau, nhưng không có đủ dữ liệu để mô tả các loài mới nên có thể gây xáo trộn, làm thay đổi hệ thống phân loại truyền thống đã ổn định với hệ thống danh pháp từ hàng trăm năm nay [13]. 1.2.2. Các kỹ thuật chỉ chị DNA Các kỹ thuật chỉ thị DNA được sử dụng nhiều trong nghiên cứu quan hệ di truyền, phát sinh chủng loại và phân loại phân tử; trong lập bản đồ liên kết di truyền, nhận biết gen; trong chọn giống bao gồm đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết giống, chọn lọc các tính trạng kháng bệnh, chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường, năng suất và phẩm chất giống. Mỗi kỹ thuật khác nhau sẽ được ứng dụng vào từng đối tượng mà nhà nghiên cứu hướng đến, hoặc kết hợp nhiều các phương pháp khác nhau để phân tích. Các kỹ thuật không sử dụng PCR như đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), lấy dấu cắt hạn chế (Restriction Endonuclease Fingerprinting - REF). Các kỹ thuật sử dụng PCR như DNA đa hình được nhân bản ngẫu nhiên (Randomly Amplified Polymorphic - DNA/ RAPD); PCR với mồi ngẫu nhiên (Arbitrarily primed PCR - AP-PCR); đa hình độ dài chuỗi nhân bản (Amplified Sequence Length Polymorphism - ASLP); nhân bản chọn lọc các locus đa hình (Selective Amplification of Polymorphic Loci - SAMPL). Kỹ thuật chỉ thị dựa trên các tiểu vệ tinh gồm có chuỗi lặp lại đơn giản giữa (Inter-Simple Sequence Repeats - ISSR); chuỗi lặp lại ngược được đánh dấu (Inverse Sequence-Tagged Repeats - ISTR). Các kỹ thuật PCR các chuỗi đặc trưng như vị trí chuỗi đánh dấu (Sequence-Tagged-Site - STS); đa hình độ dài chuỗi đơn giản (Single Sequence Length Polymorphism - 7
SSLP); các chuỗi lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeats - SSR). Các kỹ thuật chỉ thị gen nhảy như đa hình gen nhảy ngược giữa được nhân bản (Inter- Retrotrasposon Amplified Polymorphis - IRAP); đa hình sự gắn dựa trên gen nhảy ngược (Retrotrasposon-Based Insertion Polymorphism - RBIP). Các kỹ thuật chỉ thị nhân khác có thể kể đến vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS); đa hình đơn nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism - SNP). Các kỹ thuật chỉ thị lục lạp như chuỗi lặp lại đơn giản lục lạp (Chloroplast Simple Sequence Repeats - cpSSR); phân tích đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn DNA lục lạp (Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis cpDNA - RFLPA cpDNA). Công nghệ hỗ trợ hiện đại như công nghệ sắp xếp đa dạng (Diversity array Technology - DarT); giải trình tự thế hệ thứ hai (Next-geneation sequencing - NGS) [14]. 1.2.3. Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS) Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS) nằm giữa gen RNA ribosome tiểu đơn vị nhỏ và gen RNA ribosome tiểu đơn vị lớn là một dấu hiệu phát sinh gen được sử dụng rộng rãi cho phân loại nhiều loài. ITS ở thực vật nhân thực chứa rRNA 5,8S được bảo tồn và các khu vực có thể biến đổi là ITS1 và ITS2. Các vùng này có chiều dài có thể thay đổi và khuếch đại bằng cách sử dụng các đoạn mồi bổ sung cho các vùng được bảo tồn của các gen sườn của chúng. Có nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc loại bỏ các khu vực được bảo tồn dẫn đến phân loại chính xác hơn [47]. Các vùng tổ chức nhân (nucleolar organizing regions – NORs) nằm trong nhiễm sắc thể chứa các DNA ribosome (rDNA) là các phần của các đơn vị lặp lại (Hình 1.1a) được sắp xếp theo thứ tự nhất định với số lượng bản sao lên đến 30000 trong một tế bào [14, 20, 45]. Do đó, vùng rDNA như một công cụ cho các nghiên cứu phát sinh gen do thành phần cấu trúc của nó khác nhau về mức độ bảo tồn [31]. Xen kẽ giữa các rDNA là các vùng intron không được sao mã với chức năng chưa được biết rõ. Mỗi Exon (rDNA) chứa các tiểu phần ribosome nhỏ (16S-18S), vùng ITS và tiểu phần lớn (26S-28S). Theo đó, Hình 1.1b thể hiện được vùng ITS bao gồm ba phần là ITS1, 5,8S và ITS2 nằm xen kẽ giữa các tiểu phần ribosome. Vùng này được gọi chung là vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer –ITS). 8
Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc tổng quát của vùng rDNA trong thực vật. (a) Vị trí nhiễm sắc thể của các vùng rDNA. (b) Cấu tạo của vùng Intron, Exon liền kề [45] Hai vùng đệm ITS1 và ITS2 có độ dài không vượt quá 300 bp [20], tổng độ dài vùng ITS dao động từ 600 – 700 bp [14]. Có một điểm lý thú cho vùng gen này là mức độ tiến hóa của nó nhanh nên dễ dàng thay đổi về trình tự cũng như độ dài. Bên cạnh đó, các vùng liền kề thì có trình tự rất bảo thủ, thuận tiện cho việc thiết kế mồi cho phản ứng PCR nhân dòng vùng gen ITS. Ngoài ra, do đoạn trình tự gen không dài, nên việc khuếch đại là không khó khăn. Phân tích vùng gen ITS là một kỹ thuật chỉ thị phân tử quan trọng cho nghiên cứu đa dạng di truyền giúp phân loại phân tử các nhóm taxon có liên kết gần gũi [44]. Bởi vì ITS có tính bảo thủ cao trong loài nhưng lại thay đổi ở các loài khác nhau [22]. Có nhiều nghiên cứu đã tiến hành phân tích riêng biệt từng vùng trình tự ITS1 và ITS2, song kết quả cho thấy chưa đủ bằng chứng để phân tích tiến hóa. Do đó sự kết hợp dữ liệu vùng ITS cho kết quả khả quan hơn. Hầu hết các nghiên cứu được báo cáo, sự khác biệt giữa các chuỗi ITS chủ yếu là do đột biến điểm. Một tỷ lệ tương đối nhỏ của những vị trí bị chèn (insert) hoặc xóa (indels) nucleotide trong các trình tự tương tự nhau để giữ lại tín hiệu đủ cho phân tích phát sinh gen [20]. Nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng vùng gen ITS có thể được tiến hành bằng cách: Sử dụng những cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại số lượng bản sao vùng gen mong muốn; tiến hành giải trình tự trực tiếp; xây dựng cây phát sinh phân loài sử dụng các trình tự nghiên cứu và các trình tự tham chiếu có sẵn trên Genbank. Với đặc tính như trên, hiện nay, ITS đã và đang được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như phân tích di truyền và phân loại, nghiên cứu phát sinh 9
loài Điển hình có thể kể tên các nghiên cứu ứng dụng của các chi, họ khác nhau như Sorghum (Poaceae) [53], Glycine [37], họ Rosoideae [27], chi Bambusa [29], thậm chí cả nấm [50] hoặc các nghiên cứu về sự khác biệt di truyền trong họ Araliaceae [42, 55, 58], Dendropanax [41], sự khác biệt di truyền qua không gian và thời gian của Dây thường xuân (Hedera sp.) [30], Ngoài ra, hiện nay để dữ liệu phân tích thêm đồ sộ và có độ tin cậy lớn hơn, người ta thường kết hợp phân tích da dạng di truyền của nhiều gen chỉ thị khác nhau. Trong đó, một sự kết hợp phổ biến là sử dụng cả vùng gen nhân ITS và cả cùng gen lục lạp (matK, atpB, ndhF, rbcL, tnrH - tnrK, ) để phân tích. 1.2.4. Các phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại Theo Darwin, tất cả các loài sinh vật đều tiến hóa từ một tổ tiên chung. Mối quan hệ giữa các loài sinh vật được biểu diễn bởi một cây phân loài. Dữ liệu đầu vào cây tiến hóa hay cây phân loài có thể là một hay nhiều yếu tố chứa thông tin khác nhau liên quan đến chúng, như là thông tin về cấu trúc hoặc là thông tin về hình dáng bên ngoài [16]. Về mặt nguyên tắc, các sinh vật có cấu trúc bên ngoài và hình dáng càng giống nhau thì chúng càng có quan hệ gần gũi. Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, sinh học phân tử cũng như tin sinh học, chúng ta hoàn toàn có thể giải mã bất kỳ một hay nhiều đoạn gen nào chúng ta mong muốn, thậm chí là toàn bộ hệ gen của sinh vật. Đó là dữ liệu quan trọng và là bước tiến vượt bậc hữu ích cho ngành phân loại học. Những gì chúng ta cần là những đoạn DNA hay axit amin của mẫu nghiên cứu để so sánh giữa chúng với nhau và với dữ liệu sẵn có. Từ đó, chúng ta có cơ sở để xây dựng cây phát sinh loài. Đây là một công cụ suy luận giúp các nhà phân loại học tái lập lại sự tiến hóa và phân loài trong tự nhiên. Một cây phân loài thường có cấu trúc nhị phân thể hiện mối quan hệ tiến hóa giữa các loài sinh vật: (1) mỗi đỉnh (nút lá) của cây biểu hiện cho một loài sinh vật hiện tại; (2) mỗi nút bên trong biểu diễn cho một loài sinh vật tổ tiên; (3) mỗi cạnh của cây sẽ nối hai nút của cây và biểu diễn mối quan hệ trực tiếp giữa hai loài sinh vật ở hai nút của cây; (4) độ dài của cạnh cho biết khoảng cách tiến hóa giữa chúng. Có 2 dạng cây thường gặp là cây không gốc (không có thông tin về các loài tổ tiên, cạnh của cây không thể hiện mối quan hệ cha - con giữa các đỉnh của cây) và cây có gốc (các cạnh trên cây thể hiện mối quan hệ cha con giữa các đỉnh của cây) [16]. 10
Hình 1.2. Dạng cây phát sinh loài biết rõ nguồn gốc Cụ thể, có nhiều phương pháp khác nhau sử dụng những thuật toán khác nhau để giúp chúng ta tái hiện mối quan hệ phát sinh có thể có được thể hiện thông qua cây phát sinh chủng loại từ dữ liệu một nhóm các trình tự đã biết. Một số phương pháp hay được sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loại sẽ được trình bày ở phần dưới đây. 1.2.3.1. Phương pháp Ma trận khoảng cách (Distance Matrix) Đây được cho là một nhóm các thuật toán đơn giản nhất đã được sử dụng từ lâu trong các nghiên cứu phát sinh loài. Được bắt đầu sử dụng từ những năm 1990 các thuật toán này sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các loài dựa trên các dấu hiệu hình thái. Trong đó thuật toán lập nhóm không có trọng số dùng trung bình số học (UPGMA - Unweighted PairGroup with Method using arthmetic Averages) [52] phân tích tất cả các dấu hiệu qua đó xác định khoảng cách di truyền giữa tất cả các cặp trình tự, biểu diễn thành dạng ma trận khoảng cách (dạng đối xứng) rồi gộp từng cặp mẫu có khoảng cách di truyền giữa chúng là nhỏ nhất [10]. Ma trận khoảng cách D = (dij) biểu diễn khoảng cách giữa n loài là ma trận trong đó mỗi phần tử dij là khoảng cách giữa 2 nút của cây trong quan hệ phát sinh [16]. Khoảng cách giữa các đỉnh (nút lá) và các nút bên trong cây được chỉ rõ. Khoảng cách dij thỏa mãn 3 điều kiện: Tính đối xứng (dij = dji với mọi i, j); tính phân biệt (dij ≠ 0 chỉ khi i ≠ j); bất đẳng thức tam giác: dij < dik + dkj với mọi i, j. Nhìn chung các thuật toán dựa trên “ma trận khoảng cách” cho kết quả phân tích nhanh, phù hợp để xử lý một lượng dữ liệu lớn, cho biết khoảng cách di truyền tương đối giữa các loài nhưng không phản ánh được sự tiến hóa của mỗi gen [10]. Ngoài ra, một phương pháp khác là Gom cụm lân cận (NJ – Neighbor joining cũng rất được hay dùng trong xây dựng cây phát sinh chủng loại với lượng dữ liệu đồ sộ) [48]. Theo thuật toán này, tỷ lệ tiến hóa được tính toán tự do và khác nhau giữa các dòng khác nhau. Phương pháp này gần như tương tự với UPGMA, 11
tuy nhiên xuất hiện “cụm lân cận” tức là, hai trình tự được gọi là lân cận (gần nhau) trong một cây, nếu như giữa chúng chỉ có duy nhất một nút. 1.2.3.2. Phương pháp Tiết kiệm tối đa (Maximum Parisimony) Dựa trên nguyên tắc sinh học là “đột biến hiếm khi xảy ra”. Thuật toán này cho rằng: Cây tiến hóa phù hợp nhất là cây có đột biến thấp nhất trên tất cả các cây tiến hóa có thể giữa các taxon được phân tích. Do vậy, cây tiến hóa thu được từ phương pháp này được gọi là cây tích phân tiến hóa tối ưu [10]. Chỉ số tin cậy cho từng nhánh cây gọi là giá trị tin cậy (bootstrap), một nhánh chỉ được coi là có độ tin cậy khi giá trị này đạt trên 70% [33]. Ưu điểm của phương pháp này là tốc độ tính toán nhanh và được cho là khách quan nhất. Phương pháp không đưa ra bất kì một giả định nào về quá trình tiến hóa, mà dựa trên nguyên lý giản tiện tối đa: Cây tốt nhất được chọn ra dựa vào việc giảm thiểu hóa số lượng các vị trí thay thế cần thiết để giải thích cho các vị trí mang thông tin. 1.2.3.4. Phương pháp Xác suất tối đa (Maximum Likelihood) Đây là một phương pháp xác suất [10, 60] thuần túy thường được dùng để kiểm chứng lại các cây tiến hóa đã xây dựng bởi các phương pháp khác. Phương pháp này đánh giá một giả thiết tiến hóa bằng xây dựng tất cả các cây tiến hóa có khả năng xảy ra. Tiếp theo, xác định cây tiến hóa nội suy là cây có xác suất xảy ra cao nhất qua việc phân tích các yếu tố tiến hóa. Chẳng hạn, về đại thể tần số đột biến đồng hoán cao hơn khoảng 3 lần so với các đột biến dị hoán [10]. Đây được coi là phương pháp cung cấp thông tin chính xác và chi tiết hơn cả so với các phương pháp khác. Nhưng thực tế, tốc độ xử lí thông tin theo phương pháp này chậm và không khả thi khi phân tích một lượng dữ liệu lớn. Phương pháp này cũng cho ra cây tiến hóa có độ tin cậy khi giá trị độ tin cậy (bootstrap) đạt trên 70% ở mỗi nhánh [33]. Thông thường trong các nghiên cứu được tiến hành dựa trên nhiều phương pháp khác nhau, kết quả nghiên cứu tốt là khi các cây tiến hóa được xây dựng từ nhiều phương pháp nhưng cho cấu trúc tương đồng. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng ba phương pháp là: Tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony), hợp lý tối đa (Maximum Likelihood) và phương pháp ma trận khoảng cách với thuật toán UPGMA bằng phần mềm MEGA X. 12
1.3. Tổng quan về Dây thường xuân (Hedera nepalensis K. Koch) 1.3.1. Phân loại học loài Hedera nepalensis K. Koch Vị trí của chi Hedera trong hệ thống phân loại thực vật như sau: Ngành Ngọc lan Magnoliophyta Lớp Ngọc lan Magnoliopsida Phân lớp Hoa hồng Rosidae Bộ Hoa tán Apiales Họ Nhân sâm Araliaceae Chi Hedera Loài Hedera nepalenis K. Koch Đặc điểm hình thái chung của chi Hedera: Theo những nghiên cứu gần đây, chi Hedera bao gồm 16 loài [19] khác nhau phân bố châu Âu, Bắc Phi, Macaronesia và châu Á. Trong họ Nhân sâm (Araliaceae), chi Hedera (L.) là chi đại diện duy nhất có đặc điểm hình thái dạng dây leo. Chúng là những cây leo thường xanh có nhiều rễ móc khí sinh, nhẵn và không có gai. Lá mọc so le, lá đơn không có lá kèm, phiến lá phân thùy, dài từ 5 – 10 cm, rộng từ 3 - 8 cm, gân chân vịt. Cụm hoa chùy, gồm nhiều tán, có lông sao. Hoa nhỏ, màu vàng trắng và lục trắng; lá bắc rất nhỏ, dài có 5 răng nhỏ; tràng 5, gốc rộng, có một mào cuốn ở giữa; nhị 5; bầu 5. Quả hạch tròn, khi chín có màu đen [1, 3, 5]. H. nepalnensis là loài có dây bò dài có thể lên tới 20 m, có nhiều rễ mọc khí sinh ở các mắt, lá đơn, cụm hoa có lông đỏ nâu, mọc rải rác trong rừng thưa; phổ biến ở độ cao 1000 – 3000 m [1, 2]. Hình 1.3. Cây Dây thường xuân H. nepalensis [61]. 13
1.3.2. Đặc điểm hình thái và phân bố địa lý Theo các nghiên cứu về phát sinh chủng loài cho thấy Châu Á chính là trung tâm xuất xứ của chi Hedera, sau đó các loài thuộc chi phát tán đến Châu Âu và vùng Địa Trung Hải. Ngày nay, các loài thuộc chi Hedera phân bố chủ yếu ở các vùng ôn đới và cận nhiệt đới như Châu Âu và một số vùng Châu Á với nền nhiệt trung bình tương đối mát từ 26 – 30oC và cần độ ẩm cao [7]. Hai loài đến nay được sử dụng rộng rãi và nghiên cứu nhiều hơn cả về dược học là Thường xuân (H. helix) và Dây thường xuân (H. nepalensis) đều có phạm vi phân bố tương đối hẹp trên thế giới. Theo thống kê của Viện Dược liệu ở Việt Nam có trữ lượng lớn Dây thường xuân phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền phía Bắc nước ta như Sơn La, Lào Cai, Hòa Bình, Lai Châu, Hà Giang (Hình 1.3) Hình 1.4. Phân bố địa lý của H. nepalensis tại miền Bắc nước ta 1.3.3. Giá trị y học 1.3.3.1. Nghiên cứu dược lý trên thế giới Tác dụng chống ung thư Năm 2015, Laila và cộng sự thực hiện nghiên cứu trong ống nghiệm: Phân tích tác dụng ức chế và gây độc các dòng tế bào ung thư của các phân đoạn dịch chiết H. nepalensis. Thí nghiệm sử dụng 05 mẫu thử là chiết xuất thô (HNC), phân đoạn n-hexane (HNN), phân đoạn ethyl acetate (HNE), phần dịch chiết còn lại (HNA) và Lupeol. Các phân đoạn này lần lượt được tiến hành các xét nghiệm 14
Nitrate, xét nghiệm NFκB, xét nghiệm aromatase và xét nghiệm quinone reductase 1 (QR1). Tiềm năng gây độc tế bào được đánh giá trên 3 dòng tế bào ung thư là MCF-7, MDA-MB-231, Hela với xét nghiệm sulforhodamine B (SKB). Kết quả phân tích chỉ ra rằng cả chiết xuất thô và các phần phân đoạn trong H. nepalensis đều có khả năng ức chế sự tăng trưởng (hơn 60%) của ba dòng tế bào ung thư. Cụ thể là chất lupeol được phân lập từ n-hexane, ethyl acetate có giá trị IC50 thay đổi đa dạng 2,32 – 10,2 μM; ức chế 84,78% sản xuất oxid nitric (50 μM) với giá trị IC50 2,1 ± 1,3 μM. Đồng thời, lượng lupeol được đánh giá trên HPLC đầu dò DAD trong các mô khác nhau (rễ, thân, lá) đã chứng minh được lá H.nepalensis là một nguồn lupeol phong phú (0,196 mg/100 mg trọng lượng khô). Báo cáo này là báo cáo đầu tiên đưa ra tiềm năng của H. nepalensis chứa các tác nhân hóa trị ung thư và gây độc tế bào [35]. Các phân tích dược lý của T. Li và cộng sự (2015) thực hiện chứng minh saponin từ H. nepalensis K. Koch có tác dụng chống ung thư thông qua việc gây ra sự chết theo chu trình của các tế bào ung thư trong ống nghiệm. Họ đã tìm thấy rằng một chiết xuất ethanol 95% từ H. nepalensis K. Koch có thể ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thư phổi không phải tế bào nhỏ ở người A549 (28,39 ± 4,36 μg/ml). Hai hợp chất chống ung thư là pulsatilla saponin A và hederagenin 3- O -α-L-arabinopyranoside (phân lập từ chiết xuất ethanol 95% của H. nepalensis K. Koch) dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của tế bào A549 trong ống nghiệm. Các hoạt động ức chế tăng trưởng của pulsatilla saponin A thông qua việc gây ra sự chết theo chu trình cho tế bào A549 đã được báo cáo trước đây bởi những người khác. Tuy nhiên, các hoạt động ức chế tăng trưởng tế bào A549 của hederagenin 3- O -α-L-arabinopyranoside, cũng như hành động gây ra apoptosis của nó chưa từng được báo cáo trước đây. Những kết quả này có thể giúp phát triển hướng trị liệu mới trong tương lai chống ung thư phổi không phải tế bào nhỏ từ H. nepalensis K. Koch [43]. Một nghiên cứu mới đây nhất của Qamar và cộng sự (2019), các tác giả đã nỗ lực thực hiện các thí nghiệm để sàng lọc một số cây thuốc ít được khám phá trước đó. Tổng cộng 10 cây thuốc thuộc các họ, chi khác nhau được sử dụng, trong đó có H. nepalensis. Thí nghiệm chứng minh các cây thuốc lựa chọn có hoạt tính chống ung thư mạnh với giá trị gây độc tế bào tối thiểu (IC50 > 3 μM) và độc tính thấp hoặc không đáng kể. Theo đó, những cây thuốc được đánh giá về gây độc tế bào phụ thuộc vào liều thông qua xét nghiệm MTT trong ống nghiệm và mô hình 15
khối u trên động vật (IC50 trong khoảng 0,009 - 0,528 mg/mL). Các phát hiện chỉ ra rằng những cây này có khả năng ức chế sự phát triển của khối u bằng cách nhắm vào các mục tiêu phân tử như chống tăng sinh, prooptotic, chống di căn và chống angiogen. Chúng được sử dụng rộng rãi vì tính có sẵn, giá cả phải chăng và tác dụng phụ tối thiểu [46]. Tác dụng chống oxi hóa Nghiên cứu được thiết kế để xác định các hợp chất polyphenolic (có tác dụng chống oxy hóa) trong các phân đoạn H. nepalensis được thực hiện bởi Laila Jafri và cộng sự (2014). Các mẫu nghiên cứu bao gồm: chiết xuất thô của H. nepalensis và các phần phân đoạn của nó thu trong các dung môi n -hexane, ethyl acetate và nước. Khả năng chống oxy hóa của H. nepalensis được đánh giá bằng cách đo khả năng loại bỏ nhóm hydro peroxide (H2O2). Tất cả các phân đoạn dịch chiết cho thấy tiềm năng loại bỏ hydro peroxide đáng kể ( P < 0,05) với giá trị IC50 từ 31,19 đến 200 g/mL. Trong đó, phần ethyl acetate cho thấy hoạt tính chống oxy hóa cao nhất bằng phương pháp phosphomolybdenum, sau đó là n -hexane, chiết xuất thô và phần nước. Nghiên cứu là bằng chứng cho thấy phần ethyl acetate của H. nepalensis có tiềm năng chống oxy hóa với hàm lượng phenolic và flavonoid cao [36]. Một nghiên cứu khác xác định tiềm năng chống oxy hóa của dịch chiết methanol của H. nepalensis thử trong môi trường nước và lipid. Trong môi trường nước, nghiên cứu sử dụng các xét nghiệm dọn gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl) và ABTS (2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate). Trong khi đó, ở môi trường lipid đánh giá khả năng chống oxy hóa bằng đánh giá chỉ số ôi hóa (TBARS – Thiobarbituric Acid Reactive Substances). Cơ chế dọn gốc tự do trong dung dịch có chứa nồng độ chất tự do xác định là làm giảm màu của dung dịch; sau đó đo độ hấp thụ quang ở bước sóng thích hợp. Kết quả của nghiên cứu đưa ra hàm lượng các gốc DPPH, ABTS, TBARS lần lượt là 26,7 ± 0,2 (mM TE/g); 54,7 ± 1,6 (mmol TE/g); 393 ± 3,4 (mmol TE/g). Nghiên cứu xác định trong dịch chiết chiết thô của H. nepalensis chứa hai chất có khả năng chống oxy hóa là axit chlorogen và rutin [43]. Tác dụng chống tiểu đường Samreen Saleem và cộng sự (2014) đã nghiên cứu về các chất có khả năng ức chế DPP-4 của 2 loài Fagonia cretica và H. nepalensis có tác dụng trong điều trị tiểu đường. Các mẫu thử bao gồm chiết xuất thô của H. nepalensis, các phân đoạn 16
trong các dung môi hexane, ethyl acetate và nước. Tất cả các phần này đều có tác dụng ức chế hoạt động của DPP-4 (DPP-4 được biết đến là làm bất hoạt hai hormone incretin được gọi là peptide giống glucagon 1 (GLP-1) và polypeptide phụ thuộc glucose (GIP)). Triterpenoid lupeol được tìm thấy từ H. nepalensis với IC50 là 31,6 μM. Các hợp chất flavonoid được báo cáo là chất ức chế hiệu quả của DPP-4 và cải thiện được tình trạng đường huyết trong mô hình động vật. Tác dụng này được giải thích là do đặc tính chống oxy hóa của ﬂavonoid nên chúng có khả năng chống tiểu đường và ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy ức chế DPP-4 có thể là một cơ chế hoạt động hợp lý [17, 49]. Waleed Javed Hashmi và cộng sự (2018) sử dụng chiết xuất thô của H. nepalensis (HNC) trên chuột. Kết quả cho thấy làm giảm đáng kể mức đường huyết (phụ thuộc thời gian) và các dấu hiệu chức năng gan được phục hồi về mức bình thường tăng cao đáng kể (P < 0,05). HNC làm gia tăng mức độ men catalase (CAT), superoxide effutase (SOD) và giảm glutathione (GSH). Ngoài ra, định lượng HPLC cho thấy điều trị HNC dẫn đến sự gia tăng đáng kể (p < 0,001) về mức độ dẫn truyền thần kinh (dopamine và serotonin) so với nhóm kiểm soát Alzheimer (AC). Nhìn chung, kết quả nghiên cứu cho thấy H. nepalensis có tiềm năng điều trị trong điều trị các bệnh như Alzheimer và tiểu đường [57]. Tác dụng giảm đau Phản ứng đau cơ bản và thử nghiệm hiệu quả của thuốc giảm đau bằng cách quan sát phản ứng với cơn đau do nhiệt được thực hiện thông qua thử nghiệm Hot Plate. H. nepalensis cho thấy khả năng giảm đau vừa phải là 59,1% so với morphine là 80% [34]. Các polyphenol có mặt trong cây được cho là có vai trò chính trong hoạt động giảm đau. Cơ chế của phản ứng này được đặc trưng bởi sự giải phóng các chất trung gian giảm đau nội sinh như là cyclooxygenase hay arachidonic. Tác dụng kháng viêm Trong các thử nghiệm chống viêm, chiết xuất thô của cây cho thấy sự ức chế phù nề đáng kể, phụ thuộc vào liều sử dụng. Xét nghiệm carrageenan được sử dụng để đánh giá khả năng chống viêm của cây thuốc. H. nepalensis được báo cáo là có khả năng ức chế phù nề lên đến 63,3 %, P < 0,05 có ý nghĩa thống kê. Cơ chế chính của tác dụng chống viêm được cho là cây thuốc chứa hoạt tính có khả năng ức chế được đáng kể các chất trung gian gây viêm như serotonin, histamine, bradykinin Các tác giả tiếp tục làm xét nghiệm histamine để đánh giá xác nhận lại của thí 17
nghiệm carrageenan với nồng độ hiệu quả nhất là 200 mg/kg. Sự ức chế phù tối đa được phát hiện ở 90 phút. H nepalensis cho kết quả ức chế trung bình ở mức 63,5 % (P < 0,01), cho thấy khả năng kháng viêm đáng kể do histamine gây ra [34]. Ngoài ra, cũng trong các nghiên cứu đã chỉ ra một vài tác dụng khác của H nepalensis cần được đánh giá nghiên cứu thêm như tác dụng chống trầm cảm, chống đông máu [34], tác dụng hạ huyết áp [49] mở ra tiềm năng nghiên cứu phát triển thuốc từ H nepalensis là rất lớn. 1.3.3.1. Nghiên cứu dược lý trong nước Ở Việt Nam, nhìn chung các nghiên cứu về Dây thường xuân còn rất ít và hạn chế. Đã có một vài nghiên cứu về nông – sinh học và nhân trồng như Viện Dược liệu đã ghi nhận Dây thường xuân hay có tên khác là Bách cước ngô công [7] phân bố ở Sơn La, Lào Cai, Hòa Bình, Lai Châu, Hà Giang và bước đầu được xác định là Hedera nepalensis K.Koch. Nghiên cứu để xác định đặc điểm sinh thái và khả năng nhân giống của Hedera nepalensis K.Koch. Theo đó, đây là loài có dây bò tới 20 m, có nhiều rễ mọc khí sinh ở các mắt, lá đơn, cụm hoa có lông đỏ nâu, mọc rải rác trong rừng thưa, ở độ cao 100 – 1600 m. Về công dụng: Thân, lá, hạt uống với rượu ấm có thể giải ngộ độc. Hạt ngâm rượu chữa bệnh phong huyết, đau lưng. Còn dùng trị viêm khớp, viêm gan, đau đầu, nôn máu, mắt mờ, nhọt độc sưng đau. Lá hơ nóng chườm chữa sưng hạch. Quả hãm uống trị thấp khớp [1, 5, 12]. Theo y học cổ truyền Bộ phận dùng: tất cả các bộ phận của cây (rễ, thân, lá, quả) có thể dùng tươi hoặc phơi khô. Tính vị: Dây thường xuân có vị đắng, tính mát, tác dụng trong khu phong, giải độc, hoạt huyết, tiêu sưng. Quả có vị ngọt, tính ấm được dùng để trừ phong huyết [7]. Công dụng: Lấy lá dây thường xuân giã nhỏ chế với rượu sau đó gạn lấy dịch uống, phần bã còn lại đem đắp vào chỗ sưng đau. Trường hợp bị phong thấp hay mụn lở thì lấy thân rễ ngâm rượu uống hoặc sắc. Ngoài ra, quả Dây thường xuân đem ngâm rượu hoặc thuốc sắc có công dụng chữa huyết bế trong bụng, giảm đau lưng, mỏi gối ở người già [7]. Dây thường xuân là một loại cây thông thường có chứa các hợp chất có thể chất làm loãng dịch nhầy và làm cho dễ long đờm hơn. Nó thường được kết hợp với các nguyên liệu như: cỏ xạ hương và hoa anh thảo để làm dịu cơn ho. 18
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu thực vật 45 mẫu lá thường xuân, trong đó 44 mẫu được thu thập từ các tỉnh khắp Việt Nam; 01 mẫu được thu thập từ vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc do Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu (Bộ Y tế) cung cấp (Bảng 2.1). Các mẫu lá nhận về phòng thí nghiệm đã sấy khô đựng trong túi nilon chứa silicagel bảo quản ở nhiệt độ phòng. Sau đó được nghiền mịn trong nitơ lỏng và chia đều vào các ống eppendorf 1,5 mL và bảo quản ở -30 ºC đến khi được sử dụng tách chiết DNA tổng số. Bảng 2.1. Thông tin các mẫu thực vật được nghiên cứu STT Ký hiệu Địa điểm lấy mẫu Tọa độ lấy mẫu mẫu (huyện, tỉnh) 1 H1* Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E 2 H2* Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E 3 H3 Sa Pa, Lào Cai 22°21'10.29"N - 103°51'36.04"E 4 H4* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'28.47"N - 104°35'57.14"E 5 H5* Sa Pa, Lào Cai 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E 6 H6* Sa Pa, Lào Cai 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E 7 H9* Sa Pa, Lào Cai 22°22'59.25"N - 103°47'6.49"E 8 H13* Sa Pa, Lào Cai 22°23'0.01"N - 103°47'9.97"E 9 H14* Sa Pa, Lào Cai 22°23'0.01"N - 103°47'9.97"E 10 HH Vườn TV Hoa Nam, TQ 23°11'12"N - 113°21'51"E 11 H16* Đồng Văn, Hà Giang 23°14'49.81"N - 105°11'36.53"E 12 H17* Đồng Văn, Hà Giang 23°14'46.36"N - 105°11'30.49"E 13 H18* Đồng Văn, Hà Giang 23°15'01.61"N - 105°11'24.46"E 14 H19* Đồng Văn, Hà Giang 23°15'48.33"N - 105°09'56.85"E 15 H20* Đồng Văn, Hà Giang 23°15'20.97"N - 105°10'29.61"E 16 H21* Đồng Văn, Hà Giang 23°14'39.08"N - 105°12'48.68"E 17 H22* Đồng Văn, Hà Giang 23°14'38.03"N - 105°12'52.79"E 18 H23* Đồng Văn, Hà Giang 23°14'37.25"N - 105°47'6.49"E 19 H24* Đồng Văn, Hà Giang 23°12'49.49"N - 103°47'6.49"E 20 H25* Đồng Văn, Hà Giang 23°13'00.07"N - 105°10'31.06"E 21 H26* Đồng Văn, Hà Giang 23°14'39.08"N - 105°10'38.25"E 22 H27* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'18.38"N - 104°35'45.13"E 23 H28* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'43.50"N - 104°36'11.35"E 24 H29* Xín Mần, Hà Giang 22°38'51.74"N - 104°35'05.68"E 25 H30* Xín Mần, Hà Giang 22°39'01.08"N - 104°35'31.20"E 26 H31* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°40'11.06"N - 104°36'11.85"E 19
27 H32* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'28.47"N - 104°35'57.14"E 28 H33* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°40'08.44"N - 104°36'17.29"E 29 H34* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°40'00.73"N - 104°36'19.57"E 30 H35* Đồng Văn, Hà Giang 23°14'47.62"N - 105°12'43.66"E 31 H37* Đồng Văn, Hà Giang 23°14'47.62"N - 105°12'43.66"E 32 H38* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'31.37"N - 104°36'11.12"E 33 H40* Đồng Văn, Hà Giang 23°14'47.62"N - 105°12'43.66"E 34 H41* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'31.37"N - 104°36'11.12"E 35 H42* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'31.37"N - 104°36'11.12"E 36 H43* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°40'04.61"N - 104°35'59.54"E 37 H44* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°40'04.61"N - 104°35'59.54"E 38 H45* Sa Pa, Lào Cai 22°22'59.25"N - 103°47'6.49"E 39 H46* Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E 40 H47* Sa Pa, Lào Cai 22°22'51.15"N - 103°47'45.99"E 41 H48 Sa Pa, Lào Cai 22°21'10.29"N - 103°51'36.04"E 42 H49* Lộc Bình, Lạng Sơn 21°50'56.21"N - 106°55'4.78"E 43 H50* Lộc Bình, Lạng Sơn 21°50'53.03"N - 106°55'4.96"E 44 H51* Lộc Bình, Lạng Sơn 21°50'51.63"N - 106°55'2.76"E 45 H52 Đà Lạt, Lâm Đồng 11°56'11.56"N - 108°27'28.12"E Ghi chú phân loại hình thái: * - H. nepalensis; - H. helix 2.1.2. Hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu Tách DNA tổng số: Bộ kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini (Thermo Scientific, Mỹ). Nhân dòng đoạn gen đích ITS: Cặp mồi 17SE (5’ACG AAT TCA TGG TCC GGT GAA GTG TTC3’) và 28SE (5’ TAG AAT TCC CCG GTT CGC TCG CCG TTA C3’) được đặt tổng hợp từ công ty Phusa Biochem (Việt Nam), 5X Buffer, dNTP mix (Thermo Scientific), Phusion DNA Polymerase (Thermo Scientific), nước khử ion. Điện di: Gel Agarose, 5X DNA loading dye (Lonza), GeneRuler 100bp DNA Ladder (Thermo Scientific), Lambda DNA/HindIII Ladder (Thermo Scientific). 2.1.3. Thiết bị Các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm được tiến hành trong Phòng thí nghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Các thiết bị bao gồm: Cân phân tích, Máy quang phổ NP80 (Nanophotometer, Đức), Máy chụp ảnh gel (Gel Doc It, Mỹ), Hệ thống điện di (Cleaver Scientific Ltd, Anh), Bể ổn nhiệt, Máy lắc VELP (Scientifica, Đức), Tủ ấm (Panasonic, Nhật Bản), Tủ lạnh âm sâu -30oC (Panasonic, Nhật Bản), Tủ mát 4oC (FRIMED, Nhật Bản). 20
Máy PCR (Prime Thermal Cycler, Anh), Tủ an toàn sinh học (ESCO, Singapore), Máy li tâm EBA 21 (Hettich Zentrifugen, Đức). 2.2. Phương pháp nghiên cứu Quy trình nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ Hình 2.1. Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số được tách chiết từ mẫu lá khô đã được nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng, sử dung bộ kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ). Bộ kit sử dụng công nghệ màng silica dưới dạng cột quay thuận tiện, không độc hại và tiết kiệm thời gian, tách chiết được DNA có kích thước lên đến 30 kb. Quy trình tách chiết được thực hiện theo khuyến cáo của hãng (Phụ lục 1). 21
Kiểm tra và định lượng DNA DNA tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra sự có mặt bằng cách điện di trên gel agarose 1,2 % với hiệu điện thế 100 V, 500 mA trong khoảng thời gian 40 phút trong đệm TAE 1X. Chúng tôi sử dụng tỉ lệ là 4 µL mẫu và 1 µL DYE 5X. Định lượng nồng độ DNA và độ tinh sạch bằng cách đo chỉ số OD260/280 (tỷ lệ hấp thụ quang của DNA ở bước sóng 260 nm so với độ hấp thụ quang tại bước sóng 280 nm) trên máy quang phổ NP80. Mỗi mẫu DNA tổng số được đo 02 lần và lấy giá trị trung bình của 02 lần đo. Nồng độ DNA thu được càng cao và giá trị OD260/280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 được coi là DNA tách chiết có độ tinh sạch cao. 2.2.2. Nhân dòng đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR Để tìm ra quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định cho các mẫu trong quá trình PCR, chúng tôi tiến hành 3 loại phản ứng tối ưu: Tối ưu nhiệt độ, tối ưu nồng độ DNA và tối ưu nồng độ mồi. Các phản ứng đều có đối chứng âm là các ống phản ứng không bổ sung DNA khuôn để loại bỏ khả năng bị nhiễm mẫu trong quá trình thao tác. Đối chứng dương là mẫu DNA Dây thường xuân đã khuếch đại thành công đoạn gen GBSSI (mẫu H3). Chúng tôi sử dụng enzyme Phusion Hight-Fidelity DNA Polymerase có hiệu suất cao hơn Taq thông thường đến 52 lần, giảm thiểu thời gian của phản ứng PCR. Enzyme này cho hiệu suất cao ngay cả với những phản ứng có chứa DNA có nhiều sản phẩm thứ cấp như DNA tổng số có nguồn gốc thực vật. Mỗi phản ứng PCR bao gồm 25 μL bao gồm 5x buffer, dNTP 2M, Phusion DNA polymerase, mồi 17SE/28SE, nước khử ion và DNA khuôn. Phản ứng nhân dòng gen ITS được tiến hành trên máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, Mỹ). Kiểm tra sản phẩm PCR: Điện di trên Gel agarose 1,5% trong điều kiện 100 V, 500 mA với thời gian 45 phút trong đệm TAE 1x, sử dụng thang chuẩn GeneRuler 100 bp DNA Ladder để xác định kích thước. Ảnh điện di được chụp trên máy soi Gel Doc (Mỹ). 2.2.3. Giải trình tự Chúng tôi tiến hành đóng gói sản phẩm của phản ứng PCR trong ống eppendorf 1,5 mL, thể tích khoảng 20 μL gửi đi hãng First Base (Malaysia) để tinh sạch và giải trình tự theo 01 chiều mồi xuôi 17SE. Kết quả giải trình tự sau khi nhận được hiển thị thông qua phần mềm BioEdit ver 7.2.6.1 hoặc Chromas pro 2.1.6, qua đó xác định được kiểu gen của mẫu nghiên cứu. Cách đọc kết quả: 04 nucleotide 22
được thể hiện bằng 04 màu khác nhau (G: màu đen, T: màu đỏ, C: màu xanh dương, A: màu xanh lá cây). Hình 2.2. Hiển thị kết quả giải trình tự qua phần mềm BioEdit 2.3.4. Xử lý số liệu và phân tích kết quả Sau khi thu được trình tự của đoạn gen ITS của các mẫu cần quan tâm, chúng tôi tiến hành chỉnh sửa, lắp ghép đoạn trình tự bằng phần mềm Sequencher ver 5.4.6 cắt bỏ những đoạn trình tự bị nhiễu (thường là đoạn đầu và đoạn cuối). Tiếp theo các trình tự sẽ được sử dụng để so sánh với các mẫu đã có sẵn trên ngân hàng Genbank thông qua để xem xét về sự tương đồng. Kết hợp giữ các mẫu thu được cùng với các trình tự có sẵn trên ngân hàng Genbank, chúng tôi tiến hành xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng nhiều phương pháp khác nhau (UPGMA, Maximum likelihood, Neiber- Joining) thông qua phần mềm MEGA phiên bản X với giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại. Dựa trên kết quả thu được từ cây phát sinh, tiến hành định danh nguồn gen Dây thường xuân dựa theo các phân nhánh với các trình tự đã lựa chọn tham chiếu. 23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số của 45 mẫu tách chiết theo Kit Thermo, sau đó điện di trên gel agarose 1,2 %. Kết quả bước đầu ghi nhận thông qua điện di như sau: Tất cả các mẫu đều quan sát được một băng DNA tổng số với kích thước tương ứng khoảng 23,1 kb của marker, băng rõ rét chứng tỏ DNA thu được có nồng độ cao, ít đứt gãy và đủ điều kiện để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Băng điện di DNA tổng số của một số mẫu thực vật thể hiện ở Hình 3.1. Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số của một số mẫu trên gel agarose 1,2 %. Làn M: Lamda DNA/HindIII marker. Làn 01-19: mẫu DNA tổng số thu của mẫu thực vật có ký hiệu tương ứng. Làn (-): Đối chứng âm Định lượng và đo độ tinh sạch của DNA tổng số các mẫu lá khô cho kết quả: Nồng độ DNA trung bình đạt 12,23 ng/μL ± 4,28; chỉ số hấp thụ quang đo ở bước sóng 260 và 280 nm có giá trị trung bình 2,00 ± 0,80. Số liệu chi tiết thống kê ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Nồng độ và OD260/280 DNA tổng số của của các mẫu nghiên cứu STT Ký hiệu mẫu Nồng độ trung bình (ng/µL) OD260/280 trung bình 1 H1 6,15 2,016 2 H2 11,70 2,071 3 H3 7,75 2,214 4 H4 11,20 2,154 5 H5 12,35 2,148 6 H6 4,10 1,952 7 H9 12,75 2,125 8 H13 16,60 2,049 9 H14 21,05 2,024 10 HH 9,20 1,806 11 H16 10,7 1,372 12 H17 12,05 1,700 13 H18 6,35 2,702 24
14 H19 5,50 1,964 15 H20 11,65 1,371 16 H21 15,30 1,672 17 H22 12,00 1,446 18 H23 7,45 2,569 19 H24 15,00 2,128 20 H25 14,55 1,441 21 H26 11,90 2,088 22 H27 12,85 2,295 23 H28 11,45 1,991 24 H29 8,75 2,303 25 H30 15,15 1,870 26 H31 19,35 1,548 27 H32 18,85 1,508 28 H33 7,55 1,325 29 H34 12,55 1,540 30 H35 9,15 1,289 31 H37 10,20 1,299 32 H38 14,50 1,480 33 H40 5,60 1,750 34 H41 7,95 1,574 35 H42 7,15 1,644 36 H43 8,65 1,730 37 H44 10,75 1,667 38 H45 11,30 2,825 39 H46 15,70 2,635 40 H47 13,40 3,526 41 H48 17,25 3,017 42 H49 18,30 3,021 43 H50 18,70 3,041 44 H51 17,70 2,565 45 H52 22,25 2,392 Trung bình 12,23 ± 4,28 1,997 ± 0,80 3.2. Kết quả nhân dòng đoạn gen ITS bằng phản ứng PCR 3.2.1. Kết quả các phản ứng tối ưu Chúng tôi tiến hành tối ưu các thành phần của phản ứng nhân dòng đoạn gen ITS như nhiệt độ gắn mồi, nồng độ DNA, nồng độ mồi, để đảm bảo có được một quy trình nhân dòng gen đặc hiệu và ổn định. 25
Tối ưu nhiệt độ gắn mồi Phản ứng tối ưu nhiệt độ gắn mồi là một trong những phản ứng quan trọng nhất quyết định hiệu suất của PCR. Chúng tôi tiến hành PCR với 9 nhiệt độ xung quanh nhiệt độ gắn mồi tham khảo cho gen ITS. Kết quả điện di trên gel agarose 1,5% cho thấy: Ở dải nhiệt độ từ 43,9 – 62,1 ºC đều xuất hiện các băng điện di đặc hiệu, có độ sáng tăng dần, đặc biệt từ 55,1 – 62,1 ºC các băng sáng đều, rõ nét, đặc hiệu. Để phản ứng PCR không bị ảnh hưởng do nhiệt độ cao, do đó chúng tôi lựa chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng nhân dòng gen ITS là 55,1ºC (Hình 3.2) Hình 3.2. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi phản ứng nhân dòng gen ITS; Làn M: Thang chuẩn Gene Ruler 100 bp; Ký hiệu trên các làn: nhiệt độ gắn mồi (ºC); Làn (-): Đối chứng âm; Làn (+): Đối chứng dương Tối ưu nồng độ DNA Chúng tôi lựa chọn dải nồng độ DNA theo cấp sô nhân: 0,75; 1,25; 2,5; 5; 10; 20 ng/µL. Sản phẩm PCR điện di trên gel agarose 1,5%. Theo đó, ở dải nồng độ đã chọn, các băng đều lên đặc hiệu, sáng rõ, riêng ở nồng độ 5 ng/µL cho băng sáng rõ nét nhất. Do đó chúng tôi lựa chọn 5 ng/µL là nồng độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng nhân dòng gen ITS (Hình 3.3) Hình 3.3. Tối ưu nồng độ DNA phản ứng nhân dòng gen ITS; Làn M: Thang chuẩn Gene Ruler 100 bp; Ký hiệu trên các làn:nồng độ DNA (ng/µL); Làn (-): Đối chứng âm; Làn (+): Đối chứng dương 26
Tối ưu nồng độ mồi Để tăng độ lặp lại cho phản ứng, chúng tôi tiến hành tối ưu nồng độ mồi ở 03 lô mẫu khác nhau với dải 0,1; 0,3; 0,9 µM. Sản phẩm của phản ứng PCR tối ưu nồng độ mồi được điện di trên gel agarose 1,5% cho các băng đặc hiệu, sáng rõ. Từ 03 lô mẫu, chúng tôi lựa chọn được tại nồng độ 0,3 µM phản ứng PCR cho hiệu suất cao nhất (Hình 3.4). Hình 3.4. Tối ưu nồng độ mồi phản ứng nhân dòng gen ITS; Làn M: Thang chuẩn Gene Ruler 100 bp; Ký hiệu trên các làn:nồng độ mồi (µM) tương ứng với 3 lô mẫu; Làn (-): Đối chứng âm; Làn (+): Đối chứng dương Thông qua kết quả trên đây, chúng tôi xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR nhân dòng đoạn gen ITS là: Gắn mồi ở 55,1 ºC, nồng độ DNA là 5 ng/µL và nồng độ mồi là 0,3 µM. Thành phần của một phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày chi tiết dưới Bảng 3.2. Chúng tôi sử dụng quy trình này cho tất cả các phản ứng nhân dòng đoạn gen ITS của tất cả các mẫu thực vật trong nghiên cứu này, có sử dụng đối chứng âm (không chứa DNA khuôn) và đối chứng dương (mẫu H4). Bảng 3.2.Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân dòng đoạn gen ITS Nồng độ Thành phần Thể tích (µL) Chu trình nhiệt Hoạt động 5x buffer 1x 5,0 dNTP 2 mM 0,2 mM 2,5 *Biến tính ban đầu: 98 ºC trong 30 giây Phusion DNA 0,02 u/ μL 0,25 *Lặp lại 35 chu kỳ: polymerase - Biến tính: 98 ºC trong 10 giây 2u/ μL - Gắn mồi: 55,1 ºC trong 30 giây Mồi xuôi 0,3 μM 0,75 - Kéo dài chuỗi: 72 ºC trong 30 giây Mồi ngược 0,3 μM 0,75 *Tổng hợp cuối: 72 ºC trong 10 phút Nước khử ion 14,75 *Giữ sản phẩm ở 4 ºC DNA tổng số 5 ng/µL 1,0 Tổng thể tích 25 27
3.2.2. Kết quả nhân dòng gen ITS từ các mẫu thực vật Chúng tôi tiến hành PCR với điều kiện như trên cùng 45 mẫu DNA tổng số đã tách chiết thành công. Sản phẩm thu được điện di trên gel agarose 1,5% (Hình 3.5). Chúng tôi ghi nhận 45/45 mẫu nghiên cứu cho sản phẩm PCR đặc hiệu, sáng rõ với kích thước tương ứng khoảng 900 bp so với Thang chuẩn Gene Ruler 100 bp. Sản phẩm này đủ điều kiện để gửi giải trình tự. Hình 3.5. Kết quả PCR nhân dòng gen ITS của một số mẫu; Làn M: Thang chuẩn Gene Ruler 100 bp; Ký hiệu trên các làn: ký hiệu các mẫu phân tích; Làn (-) :Đối chứng âm; Làn (+): Đối chứng dương 3.3. Giải trình tự Sản phẩm PCR sau khi giải trình tự bởi hãng First Base (Malaysia) được hiển thị thông qua phần mềm BioEdit ver 7.2.6.1 hoặc Sequencher ver 5.4.6 (Hình 3.6). 45/45 mẫu được giải trình tự với mồi xuôi 17SE. Chúng tôi nhận thấy chiều dài đoạn gen ITS của các mẫu dao động từ từ 839 (H48) đến 858 (H4) khi chưa xử lý đoạn nhiễu. Kết quả này tương đối đồng đều giữa các mẫu và với kết quả điện di. Hình 3.6. Kết quả hiển thị giải trình tự của mẫu H1 qua phần mềm BioEdit 28
3.4. Độ tương đồng của trình tự gen ITS được khuếch đại Các chuỗi trình tự được tinh chỉnh bằng cách cắt bỏ những nucleotide nhiễu thông qua phần mềm Sequencher ver 5.4.6. Phần mềm BLATS ( với chế độ Nucleotide BLAST được sử dụng để so sánh các chuỗi trình tự mẫu thu được với hàng ngàn trình tự có sẵn trên Genbank. Chúng tôi tìm ra các trình tự có độ tương đồng chuỗi từ cao đến thấp trên Genbank, xác định đoạn gen đã được nhân lên có chứa hoàn toàn vùng gen ITS. Một ví dụ cụ thế được đưa ra dưới đây là mẫu H4. Theo đó, trình tự mẫu H4 có độ tương đồng 100% với mẫu H.nepalensis đối chứng (AJ131238) trên ngân hàng Genbank. Sự sắp xếp dóng hàng các nucleotide của hai mẫu so sánh được thể hiện trên Hình 3.7. Hình 3.7. Kết quả so sánh BLAST của mẫu H4 và H. nepalensis (AJ131238). “Query” là trình tự của H4, “Sbjct” là trình tự của H.nepalensis (AJ131238.1) 29
Thông qua phần mềm BLAST, 11 haplotype đã được lập ra (Bảng 3.3) khi so sánh từng chuỗi và 02 chuỗi với nhau. Điển hình có tới 21/44 (47,7%) mẫu thuộc haplotype N1 giống nhau và giống 100% với mẫu H. nepalensis (AJ131238.1) đối chứng, 05/45 mẫu thuộc nhóm N3 giống 100% với mẫu H. helix (AM503887.2) đối chứng. Các mẫu còn lại không có trình tự giống 100% trên Genbank nhưng có trình tự giống 100% khi so sánh với nhau được xếp vào các haplotype còn lại. Bảng 3.3. Các haplotype trong nghiên cứu Số STT Haplotype Tên mẫu lượng H1, H2, H4, H5, H6, H18, H19, H27, H28, H30, H34, 1 N1 21 H37, H38, H40, H41, H42, H43, H44, H45, H46, H47 2 N2 H20, H22, H23, H25, H26 5 3 N3 H9, H13, H14, HH, H52 5 4 N4 H31, H32, H33 3 5 N5 H16, H17, H35 3 6 N6 H50, H51 2 7 N7 H21, H24 2 8 N8 H48 1 9 N9 H3 1 10 N10 H49 1 11 N11 H29 1 Tổng 45 3.5. Cây phát sinh chủng loại dựa trên vùng gen ITS 3.5.1. Lựa chọn mô hình Trước khi tiến hành xây dựng cây phát sinh chủng loại, mô hình tiến hóa đặc trưng cho ITS được tính toán bằng phần mềm Mega X. Mô hình tối ưu được xác định là mô hình T92+G với phân phối Gamma là thích hợp nhất (BIC =3637,829); AICc =2424,941; -lnL =1182,367; R = 1,76); phân tích boostrap với 1000 lần lấy lại mẫu. Mức độ tin cậy được đánh giá theo giá trị bootstrap như sau: mức độ tin cậy cao: >85%; mức độ tin cậy trung bình: 65-85%; mức độ tin cậy thấp: <65%. 3.5.2. Khoảng cách di truyền Khoảng cách di truyền được thống kê qua phần mềm MEGA phiên bản X và BioEdit ver 7.2.6.1 (Bảng 3.4). Trong đó vị trí các nucleotide sai khác khi so sánh các mẫu với nhau và với các trình tự tham chiếu được thể hiện chi tiết ở Bảng 3.5. 30
Bảng 3.4. Khoảng cách di truyền (phía dưới bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía trên bên phải) giữa 11 nhóm mẫu nghiên cứu và H.nepalen sis (AJ131238.1), H.helix (AM503887.2), H. sinensis (GU054623.1) và Kalopanax septemlobus (MH711151.1) Tên nhóm [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [1] N1 - 1 9 1 6 5 2 11 10 2 1 0 9 3 43 [2] N2 0.0017 - 10 2 7 6 1 12 10 4 2 1 10 4 44 [3] N3 0.0152 0.0169 - 10 9 11 9 4 2 9 10 9 0 10 45 [4] N4 0.0017 0.0033 0.0169 - 7 6 3 12 10 4 2 1 10 4 44 [5] N5 0.0101 0.0118 0.0152 0.0118 - 3 6 11 9 3 7 6 9 3 44 [6] N6 0.0084 0.0101 0.0186 0.0101 0.0050 - 5 13 11 2 6 5 11 2 43 [7] N7 0.0034 0.0017 0.0152 0.0050 0.0101 0.0084 - 11 9 3 3 2 9 3 45 [8] N8 0.0186 0.0203 0.0067 0.0203 0.0187 0.0221 0.0186 - 4 11 12 11 4 12 46 [9] N9 0.0152 0.0169 0.0034 0.0169 0.0152 0.0186 0.0152 0.0067 - 9 10 9 2 10 45 [10] N10 0.0050 0.0067 0.0152 0.0067 0.0050 0.0033 0.0050 0.0186 0.0152 - 4 3 9 2 43 [11] N11 0.0017 0.0034 0.0169 0.0033 0.0118 0.0101 0.0050 0.0203 0.0169 0.0067 - 1 10 4 44 [12] AJ131238.1 0.0000 0.0017 0.0152 0.0017 0.0101 0.0084 0.0034 0.0186 0.0152 0.0050 0.0017 - 9 3 43 H. nepalensis [13]AM503887.2 0.0152 0.0169 0.0000 0.0169 0.0152 0.0186 0.0152 0.0067 0.0034 0.0152 0.0169 0.0152 - 10 45 H. helix [14]GU054623.1 0.0050 0.0067 0.0169 0.0067 0.0050 0.0033 0.0050 0.0203 0.0169 0.0034 0.0067 0.0050 0.0169 - 44 H. sinensis [15]MH711151.1 0.0759 0.0778 0.0798 0.0777 0.0781 0.0761 0.0798 0.0817 0.0798 0.0760 0.0778 0.0759 0.0798 0.0779 - K. septemlobus 31
Bảng 3.5. Vị trí các nucleotide sai khác khi so sánh các trình tự trên BioEdit Vị trí nucleotide sai khác Haplotype 18 32 33 34 65 72 80 82 93 98 124 136 139 170 173 175 182 188 190 191 [1] N1 T T A C T A T C T C C A A T T A T C G C [2] N2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [3] N3 C . . . . . . . . T A . . . . . . T . . [4] N4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [5] N5 . . . . . . . . . T . . . . . . . A . . [6] N6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [7] N7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [8] N8 C . . . . . . . . T . . . . . . . T A . [9] N9 C . T . . . . . . T . . . . . . . T . . [10] N10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [11] N11 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [12] AJ131238.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [13] AM503887.2 C . . . . . . . . T A . . . . . . T . . [14] GU054623.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [15] MH711151.1 C C . T C G C T C T . G T G C T C . . T 32
Vị trí nucleotide sai khác Haplotype 192 209 239 378 379 380 389 393 395 399 403 407 415 418 447 452 455 456 457 [1] N1 A T G G A C C C T T A G T T C T T A C [2] N2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [3] N3 . . . . . . . . . . . . . . . . . T [4] N4 . . . . . T . . . . . . . . . . . . . [5] N5 . . . . . . A . . . . A . . . . . . . [6] N6 . . . . . . A . . . . A . . . . . . . [7] N7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [8] N8 . . . . . . . . . . . . . . . . C . T [9] N9 . . . . . . . . . . . A . . . . . . T [10] N10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [11] N11 . . T . . . . . . . . . . . . . . . . [12] AJ131238.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [13] AM503887.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . T [14] GU054623.1 . . . . . . A . . . . A . . . . . . . [15] MH711151.1 G A . C G . . G C A C A C G T C . G . 33
Vị trí nucleotide sai khác Haplotype 472 516 522 537 540 541 543 547 551 552 556 558 562 582 583 588 [1] N1 T A A G G G G C G A G A T T C C [2] N2 . . . C . . . . . . . . . . . . [3] N3 . . C . . . . . A G . . . . G . [4] N4 . . . . . . . . . . . . . . . . [5] N5 . . C . . . . . T . . . . . . . [6] N6 . . C . . . . T T . . . . . . . [7] N7 . . C C . . . . . . . . . . . . [8] N8 . . C . . . . . A G . . . . G T [9] N9 . . C . . . . . A G . . . G . [10] N10 . . C . . . . . T . . . . . . . [11] N11 . . . . . . . . . . . . . . . . [12] AJ131238.1 . . . . . . . . . . . . . . . . [13] AM503887.2 . . C . . . . . A G . . . . G . [14] GU054623.1 . . C . . . . . . . . . . . . . [15] MH711151.1 C T . . T A C T A T A G C C . G Ghi chú: [12]. H. nepalensis [13]. H. helix [14]. H. sinensis [15]. K. septemlobus 34
3.5.3. Xây dựng cây chủng loại Một số loài tham chiếu sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.5. Trong đó, haplotype N1 tương đồng 100% với H. nepalensis (AJ131238.1); haplotype N3 tương đồng 100% với H. helix (AM503887.2); Haplotype N6 tương đồng 99,68% với H. sinensis (GU054623.1); K. septemlobus (MH711151.1) được chọn làm nhóm ngoại (outgroup) có độ tương đồng 93,83% với haplotype N1 và với H. nepalensis (AJ131238.1). Bảng 3.6. Các trình tự tham chiếu trên Genbank Mã hiệu Mã hiệu STT Tên loài STT Tên loài Genbank Genbank 1 H. nepalensis [56] AJ131238.1 3 H. sinensis [41] GU054623.1 2 H. helix [40] AM503887.2 4 K. septemlobus MH711151.1 3.5.3.1. Phương pháp UPGMA Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp UPGMA thể hiện ở Hình 3.8. Cây tối ưu được hiển thị với tổng chiều dài nhánh là 0,10606435 với thử nghiệm bootstrap (1000 lần lặp lại). Chỉ số hiển thị trên mỗi gốc nhánh thể hiện mức độ tin cậy của nhánh (%). Khoảng cách tiến hóa được tính toán bằng phương pháp Khả năng tổng hợp tối đa và được tính theo đơn vị số lượng thay thế cơ sở trên mỗi vị trí. Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp UPGMA dựa trên chỉ thị phân tử ITS 35
3.5.3.2. Phương pháp Neighbor Joing Cây tối ưu với tổng chiều dài nhánh = 0,10793442 được hiển thị. Tỷ lệ phần trăm của cây sao chép thể hiện thông qua chỉ số bootstrap (1000 lần lặp lại) được hiển thị bên cạnh các nhánh. Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp NJ dựa trên chỉ thị phân tử ITS 3.5.3.3. Phương pháp Maximum LikeLihood Cây hiển thị khả năng cao nhất (-1190,81). Chỉ số hiển thị trên mỗi gốc nhánh thể hiện mức độ tin cậy của nhánh (%). Cây được vẽ theo tỷ lệ, với chiều dài nhánh được đo bằng số lần thay thế trên mỗi vị trí. Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp ML dựa trên chỉ thị phân tử ITS 36
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 4.1. Tách chiết DNA tổng số Tế bào thực vật khó thu hồi DNA hơn so với các tế bào động vật bởi nó có lớp thành cellulose dày, cứng bao quanh. Nghiên cứu của Danka Boselová và cộng sự chỉ ra rằng, mẫu lá non, tươi nên được sử dụng để tách chiết DNA bởi khi đó hàm lượng DNA trong lá còn cao và thành cellulose vẫn còn mềm dẻo so với lúc đã khô cứng [21]. Trong phạm vi nghiên cứu này, do không đủ điều kiện sử dụng mẫu lá tươi, chúng tôi sử dụng mẫu lá khô được bảo quản trong silicagel. Vì vậy để lựa chọn được một quy trình tách chiết DNA tối ưu cho mẫu lá khô Dây thường xuân càng trở nên khó khăn hơn. Việc phân lập DNA từ các mô thực vật đòi hỏi sự tham gia của các carbohydrate và enzyme giúp cho sự ly giải thành tế bào. Bên cạnh đó, sự hiện diện của các polysacharide, polyphenol và các hợp chất thứ cấp khác nhau trong tế bào đặc biệt là các tế bào trưởng thành gây ra trở ngại lớn cho quá trình khuếch đại gen bằng PCR [24]. Nghiên cứu của Danka Boselvá và cộng sự đã tiến hành so sánh hiệu quả tách chiết của 05 phương pháp khác nhau trên mẫu lá non Thường xuân (Hedera helix) dựa trên các tiêu chí là nồng độ DNA thu được, độ hấp thụ quang, và hiệu suất PCR gen iPBS. Năm phương pháp sử dụng là Dellaporta và cộng sự (1983); Rogers và Bendich (1994); Padmalatha và Prasad (2006); NucleoSpin Plant II – Macherey-Nagel và GeneJET plant DNA kit. Kết quả của phân tích này cho thấy sử dụng các bộ kít thương mại tách chiết DNA tổng số cho hiệu quả PCR cao [21]. Cũng vậy, nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Thu Thảo và cộng sự cũng được thực hiện trên mẫu phân tích lá khô Dây thường xuân (Hedera nepalensis K.Koch.) thu thập tại một số tỉnh miền núi phía Bắc tại Việt Nam. Trong nghiên cứu tác giả sử dụng 04 quy trình tách chiết khác nhau là Mini-CTAB (Sanghai-Maroof và cộng sự, 1984), phương pháp CTAB cải tiến (Elias và cộng sự, 2004), DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ). Các chỉ tiêu đánh giá cũng dựa trên nồng độ, độ tinh sạch của DNA và hiệu suất PCR gen GBSSI. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, DNA được phân lập bằng GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) có hiệu quả cao hơn so với 03 phương pháp còn lại [15]. Dựa trên cơ sở của các nghiên cứu trên đây chúng tôi đã lựa chọn Kit Thermo làm quy trình tách DNA tổng số cho tất cả mẫu lá khô Dây thường xuân tại Việt Nam. 37
Theo đó, 45 mẫu lá khô Dây thường xuân tách chiết bằng kít Thermo cho nồng độ DNA trung bình 12,23 ng/μL ± 4,28; chỉ số hấp thụ quang đo ở bước sóng 260 và 280 nm có giá trị trung bình 2,00 ± 0,80. Tuy nhiên, có một số mẫu có A260/280 vượt ngoài ngưỡng có thể được giải thích do sự tồn tại của các hợp chất thứ cấp chưa được loại bỏ hoàn toàn khỏi quá trình tách chiết. Dựa vào kết quả nhân dòng vùng trình tự ITS, chúng tôi nhận thấy rằng chất lượng của DNA tổng số cho hiệu quả nhân dòng 100% các băng điện di sáng rõ và đặc hiệu, đủ điều kiện để tiến hành các phân tích tiếp theo. Như vậy phương pháp phân lập DNA bằng bộ kít Thermo trên mẫu lá khô Dây thường xuân cho hiệu quả cao. 4.2. Tối ưu quy trình nhân dòng gen ITS bằng phản ứng PCR và giải trình tự Mỗi thành phần của phản ứng PCR đều có những vai trò quan trọng nhất định. Việc tìm ra các điều kiện tối ưu của các thành phần phản ứng sẽ đem lại hiệu suất tối ưu cho phản ứng PCR nhân dòng đoạn gen mong muốn. Chúng tôi đã tiến hành tối ưu các thành phần phản ứng bao gồm nhiệt độ gắn mồi, nồng độ DNA và nồng độ mồi. Thí nghiệm cho mỗi phản ứng đã được tiến hành tối thiểu 3 lần để tránh khả năng ảnh hưởng của thao tác. Trong đó, tối ưu nhiệt độ gắn mồi là một trong những điều kiện cần thiết, quan trọng nhất để có một phản ứng PCR thành công, do đó nó luôn được tiến hành đầu tiên trước các yếu tố khác. Nhiệt độ gắn mồi của một cặp mồi phụ thuộc vào nhiều yếu tố như độ dài của đoạn mồi, mồi ngẫu nhiên hay đặc hiệu, nhiệt độ nóng chảy Tm do nhà sản xuất cung cấp, trình tự nucleotide cũng như mức độ giàu G, C của đoạn mồi Nhiệt độ gắn mồi có thể bao gồm một dải kéo dài, không lớn hơn nhiệt độ nóng chảy, phân bố theo hình chuông cân, mà ở đó đỉnh của hình chuông cân chính là nhiệt độ gắn mồi tối ưu nhất. Quan sát này có thể nhìn thấy rõ ở hình ảnh điện di sản phẩm của phản ứng tối ưu thành công. Đối với đoạn gen ITS, có rất nhiều cặp mồi có thể được sử dụng mà tùy thuộc vào mục đích của từng nghiên cứu: mong muốn đoạn cắt ở vị trí nào và độ dài của sản phẩm. Đối với mẫu thực vật, nồng độ DNA khuôn cao thường ức chế phản ứng nhân dòng do sự tồn tại của các tạp chất còn tồn lưu cùng DNA khuôn. Điều này thể hiện rõ trong Hình 3.3, khi nồng độ DNA khuôn cao hơn 5 ng/µL, lượng sản phảm PCR thu được giảm thể hiện qua băng điện di giảm dần độ sáng. Chính vì vậy, các mẫu DNA tổng số trong nghiên cứu đều được pha loãng về nồng độ 5 ng/µL để tiến hành phản ứng khuếch đại gen ITS. Nồng độ mồi trong phản ứng PCR cũng là một thông số quan trọng. Theo đó, nồng độ mồi quá cao hoặc quá thấp đều có thể ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng PCR (Hình 3.4). 38
Một vài trình tự mồi đã được sử dụng cho vùng gen ITS trong các nghiên cứu như là: JITSF1/ JITSR1, ITS3/ITS2, ITSW/ITSP, ITS4/ITS5 [29]; 18d/28cc [55]; PaITSF/ PaITSR [11]; Ở phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu 17SE (5’ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTC3’) và 28SE (5’TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC3’) để khuếch đại toàn bộ vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 và một phần các vùng trình tự bên cạnh. Nghiên cứu của Sun và cộng sự là nghiên cứu đầu tiên sử dụng cặp mồi này để khuếch đại vùng trình tự ITS của các mẫu cây Cao lương (Sorghum bicolor). Nhiệt độ gắn mồi tối ưu của cặp mồi 17SE/26SE và Taq DNA polymerase trong nghiên cứu này là 58 ºC trong 1 phút, khác với nhiệt độ gắn mồi tối ưu của chúng tôi là 55,1 ºC trong 30 giây. Sự khác biệt này được giải thích có thể là do sự khác nhau của enzyme DNA polymerase, thậm chí có thể do ảnh hưởng bởi sử dụng các hệ thiết bị khác nhau. Hơn nữa, trình tự mồi này đã được sử dụng trong khuếch đại vùng gen ITS ở các loài thuộc họ Araliaceae [54], và đặc biệt đã được sử dụng cho chi Hedera trong nghiên cứu trước đó của Vargas (1999) và D. Grivet (2002) [30, 56], rất gần với loài nghiên cứu mà chúng tôi đang lựa chọn. Tuy nhiên, nhân dòng gen ITS sử dụng đoạn mồi này cũng có hạn chế là đoạn trình tự cần nhân dòng dài, gây khó khăn hơn cho phản ứng PCR. Như đã tổng quan từ trước, vùng trình tự ITS là một vùng đệm phiên mã cho một đoạn rRNA không mã hóa nằm trong nhân. Vùng gen ITS có độ dài khoảng dao động từ 600 đến 700 bp. Tuy nhiên, theo kết quả giải trình tự nhận được lên tới khoảng 858 bp. Điều này là hoàn toàn phù hợp với cặp mồi mà chúng tôi lựa chọn, bao hàm một phần vùng lân cận 17S - 18S và 26S - 28S theo đúng cấu trúc đã cung cấp. Theo đó, kết quả vùng gen ITS nhân dòng với cặp mồi 17SE/28SE bao gồm đầu 3’ tiểu phẩn nhỏ ribosome 18S (100bp), đoạn ITS hoàn chỉnh dài 610 bp (ITS1, 5,8S và ITS2), và đầu 5’ tiểu phần lớn ribosome 28S (135 bp). Trong vùng gen ITS, đoạn ITS1 dài 122 bp, tiếp theo là đoạn 5,8S dài 162 bp và đoạn ITS2 dài 227 bp. Trong nghiên cứu phân tích phát sinh gen cây cao lương (Sorghum bicolor) và các loài liên quan của Sun và cộng sự (1994), vùng gen ITS có độ dài khoảng 588 bp. Độ dài này ngắn hơn độ dài của đoạn gen ITS trong nghiên cứu của chúng tôi, tuy nhiên do đây là hai loài rất khác nhau. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, chỉ thị gen ITS phân tách tốt các loài trong chi [53]. Ngoài ra, cặp mồi này cũng đã được sử dụng ở nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền ở chi Lan hoàng thảo (Dendrobium) và đoạn gen được nhân lên bằng cặp mồi 17SE/28SE có độ dài 857 bp [59], kết quả này khá tương đồng với độ dài vùng gen chúng tôi đã nhân lên được sau khi đọc kết quả giải 39
trình tự của mẫu Dây thường xuân trong nghiên cứu này. Đặc biệt, R. Vargas và cộng sự (1999) đã có nghiên cứu về 27 trình tự của 12 loài thuộc chi Hedera cũng sử dụng đoạn mồi này. Phân thích kiểu nhân cho thấy loài H. Nepalensis K. Koch, H. azorica, H. canariensis, H. maroccan, H. rhombea và H. Helix L. đều có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n=48, 2x. Các loài khác cho kết quả phân tích thể hiện sự đa bội (tứ bội 4x, lục bội 6x và bát bội 8x). Cũng tương đồng với nghiên cứu của chúng tôi, phân tích của R. Vargas cho thấy trong đoạn ITS hoàn chỉnh dài 610 bp thì vùng ITS1 dài 223 bp, 5,8S dài 163 bp và vùng ITS2 dài 224 bp. Cây phát sinh phân loại thành công được H. nepalensis với H. helix với chỉ số tin cậy rất cao (trên 91%) và 10 loài khác thuộc chi Hedera (H. algeriensis, H. azorica, H. canariensis, H. colehica K. Koch, H. cypria, H. hibernica, H. maderensis K. Koch, H. maroccana, H. pastuchovii, H. rhombea) [56]. Nghiên cứu này chính là cơ sở để chúng tôi lựa chọn chỉ thị ITS phân tích đa dạng di truyền trên Dây thường xuân ở Việt Nam. 4.3. Khoảng cách di truyền Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự DNA vùng gen ITS của 11 haplotype nghiên cứu cùng với 04 trình tự DNA vùng gen ITS của 03 loài thuộc chi Hedera với vai trò nhóm nội và 01 loài thuộc chi Kolopanax septemlobus làm nhóm ngoại. Phần mềm BioEdit ver 7.2.6.1 được sử dụng để dóng hàng tổng cộng 15 chuỗi trình tự kể trên. Kết quả cho thấy: Tổng số có 19 điểm sai khác giữa 11 haplotype, H. nepalensis đối chứng (AJ131238.1), H. helix đối chứng (AM503887.2) và H. sinensis đối chứng (GU053623) (Bảng 3.5) chiếm 3,17% trên toàn bộ trình tự so sánh. Trong đó, haplotype N1 bao gồm 21 mẫu chiếm tỷ lệ lớn nhất (46,7%) không có vị trí sai khác nào so với H. nepalensis đối chứng (AJ131238.1); haplotype N3 không có vị trí sai khác nào với với H. helix đối chứng (AM503887.2); haplotype N5, N6, N10 sai khác với H. sinensis đối chứng (GU053623) ở 2 hoặc 3 vị trí. So sánh giữa 11 haplotype với nhau, ta có: haplotype N2, N4, N11 sai khác với haplotype N1 ở 1 vị trí; haplotype N7 sai khác với haplotype N1 ở 2 vị trí (Bảng 3.4 phía trên bên phải). Như vậy, sơ bộ haplotype N1, N2, N4, N7, N11 có rất ít vị trí nucleotide sai khác với nhau (từ 1 đến 2 nucleotide) và với H. nepalensis đối chứng (AJ131238.1). So với halotype N1 và H. nepalensis (AJ131238), haplotype N2 đột biến ở vị trí nucleotide là 537 (G>C); haplotype N4 ở vị trí 380 (C>T); haplotype N11 đột biến ở vị trí 239 (G>T); haplotype N7 ở hai vị trí 522 (A>C) và 537 (G>C). Các vị trí này có thể là vị trí đặc trưng cho loài H. nepalensis ở các vùng địa lý khác 40
nhau của Việt Nam. Cũng vậy, haplotype N8, N9 chỉ sai khác với nhóm N3 và H. helix đối chứng (AM503887.2) ở 2 và 4 vị trí. Tiếp theo, dữ liệu xuất từ BioEdit ver 7.2.6.1 sẽ được chuyển qua xử lý tiếp tục bằng phần mềm Mega phiên bản X. Số liệu từ Bảng 3.4 (phía dưới bên trái) chỉ ra khoảng cách di truyền giữa các mẫu phân tích. Theo đó khoảng cách di truyền giữa haplotype N1 và haplotype N2, N4, N11 rất thấp chỉ 0,17%; đặc biệt không có sự khác biệt di truyền giữa haplotype N1 và mẫu đối chứng H. Nepalensis đối chứng (AM131238.1); haplotype N8 có khoảng cách di truyền lớn nhất với H. nepalensis đối chứng (AM131238) là 1,86% (12 vị trí sai khác). Tương tự, với haplotype N3 không có cách biệt di truyền nào với nhóm H. helix đối chứng (AM503887.2); khoảng cách di truyền lớn nhất với haplotype N6 là 1,86%. Với H. sinensis đối chứng (GU054623.1) khoảng cách di truyền dao động từ 0,33% (haplotype N6) tới 1,69% (haplotype N3, N9). Riêng với nhóm ngoại Kalopanax septemlobus (MH711151.1) khoảng cách di truyền với các haplotype còn lại rất cao, khoảng cách thấp nhất đã lên tới 7,59% (so với haplotype N1). 4.5. So sánh giữa các phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại Mục đích của phân nhóm các haplotype giúp tinh gọn cây phát sinh chủng loại, khu trú được thông tin của các mẫu. Ba mô hình xây dựng cây phát sinh chủng loại cho sự phân nhánh khá tốt và ổn định. 4.5.1. Phương pháp UPGMA Cây phát sinh xây dựng bằng phương pháp UPGMA trên khung đọc gen ITS cho ra cây phát sinh chủng loại như Hình 3.8. Ngoại trừ Kalopanax septemlobus là mẫu lấy từ GenBank chọn làm nhóm ngoại thì 14 nhóm mẫu còn lại sử dụng để phân tích đa dạng di truyền được xuất hiện trên cây chia thành hai nhánh chính có chỉ số độ tin cậy rất cao với nhánh I là 93% và nhánh II là 96%. Ở nhánh I này tiếp tục phân chia thành 2 nhánh IA gồm N1, N2, N4, N7, N11 và H. nepalensis; nhánh IB gồm N5, N6, N10 và H. sinensis. Nhánh II gồm N3, N8, N9 và H. helix (AM503887.2) với mức độ tin cậy trung bình – cao. Như vậy theo sự phân chia nhánh cây, ta sơ bộ nhận định các halotype N1, N2, N4, N7, N11 tương đồng cao với H. nepalensis. Haplotype N5, N6, N10 tương đồng cao với H. sinenis, Haplotype N3, N8, N9 tương đồng cao với H. helix. Như vậy theo phương pháp UPGMA, tại gốc nhánh I, chỉ số tin cậy rất cao, chứng tỏ phương pháp này phân loại được rõ ràng ba loài H. nepalensis, H. helix và H. sinensis dựa trên chỉ thị ITS. 41
4.5.2. Phương pháp Neighbor- Joining Cây phát sinh xây dựng bằng phương pháp NJ trên khung đọc gen ITS cho ra cây phát sinh chủng loại như Hình 3.9 trong đó có 7/12 chỉ số tin cậy ở gốc nhánh >62%. Về cơ bản cây phát sinh chạy bằng phương pháp này cho kết quả tương đồng với kết quả khi sử dụng phương pháp UPGMA: các mẫu nghiên cứu chia thành 2 nhánh chính. Tuy nhiên chỉ số tin cậy gốc nhánh I không cao bằng, chỉ đạt mức trung bình là 67%; chỉ số bootstrap ở gốc nhánh II rất cao đạt 98%. Các chỉ số tin cậy ở các gốc nhánh con khác cao hơn không nhiều so với các chỉ số tin cậy ở gốc nhánh của cây UPGMA. Theo đó thì haplotype N1, N2, N4, N7, N11 có quan hệ gần gũi với H. nepalensis (AJ131238.1); haplotype N5, N6, N10 có quan hệ gần gũi với H. Sinensis (GU054523.1); haplotype N3, N8, N9 có quan hệ gần gũi hơn với H. Helix (AM503887.2). Do vậy, bằng phương pháp này dựa trên vùng gen ITS phân biệt được H. nepalensis với H. helix có chỉ số tin cậy rất cao, H. nepalensis và H. sinensis còn tách biệt nhau ở mức trung bình. 4.5.3. Phương pháp Maximum LikeLihood Cây phát sinh chủng loại thu được bằng phương pháp ML trên khung đọc gen ITS thể hiện trên Hình 3.10. Cây phát sinh về cơ bản vẫn chia thành hai nhánh lớn như cây được phân tích bằng phương pháp UPGMA và NJ. Nhìn chung, kết qủa của cây ML có chỉ số tin cậy thấp nhất trong 3 cây phát sinh chủng loại chỉ đạt 4/12 gốc nhánh có độ tin cậy >70%. Đối với dữ liệu phân tích trong nghiên cứu này, phương pháp ML cho thấy kém hiệu quả về mặt thời gian. Mặc dù vậy, cây phát sinh này vẫn phân biệt H. nepalensis và H. helix với chỉ số tin cậy rất cao (98%), H. nepalensis và H. sinensis tách nhánh ở mực thấp (55%). Đầu tiên phải khẳng định một điều rằng cả ba phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên ba phương pháp UPGMA, NJ và ML dựa trên khung đọc gen ITS đều cho kết quả tương đồng nhau. Điều này chứng tỏ rằng dữ liệu phân tích rất ổn định và nhất quán. Các haplotype N1, N2, N4, N7, N11 thuộc loài H. nepalensis; N5, N6, N10 thuộc loài H. sinensis; N3, N8, N9 thuộc loài H. helix. Các cây phát sinh chủng loại đều phân loại rất rõ ràng hai loài H. nepalensis và H. helix. Đối với H. nepalensis và H. sinenis chỉ số tin cậy ở gốc nhánh không cao, vậy liệu đây thực chất là 2 loài hay chỉ là 1 loài? Thêm nữa, dữ liệu về số vị trí nucleotide sai khác ở H. nepalensis so với H. sinensis là 03 vị trí (389, 407, 522) đã bị tách làm 2 loài, trong khi nhóm N5 khác N6 tại tới 04 vị trí nucleotide, nhóm N8 khác N9 tại 04 vị trí nucleotide lại thuộc cùng một nhánh loài. Điều này có thể được giải thích 42
bằng việc các đột biến có ý nghĩa phát sinh loài hay không hay do đặc điểm của môi trường sống xuất hiện đột biến để thích nghi. So sánh giữa ba cây phát sinh chủng loại sử dụng ba phương pháp khác nhau cho thấy: Cây chạy bằng phương pháp UPGMA cho dạng cây với độ tin cậy của các nhánh cao hơn so với 2 phương pháp còn lại là NJ và ML. DNA chứa trong tế bào chất và trong nhân, trong tế bào chất DNA lại gồm DNA lục lạp và DNA ty thể. Tất cả các chỉ thị gen nhân, chỉ thị gen lục lạp hay ty thể đều có hiệu quả trong nghiên cứu đa dạng di truyền và phân loại tùy từng cấp độ. Hệ gen lục lạp có mức đột biến và tính bảo thủ thấp hơn so với hệ gen nhân [14]. Trong khi bộ gen ty thể có mức độ đột biến thấp nhất thì hệ gen nhân có tỷ lệ thay thế nucleotide nhanh hơn nhiều lần [28]. Chính vì vậy mà chỉ thị gen nhân nói chung hay chỉ thị gen ITS nói riêng, rất hữu ích đối với phân biệt những loài gần gũi hoặc thậm chí là phân biệt thứ loài. Trong nghiên cứu này, dựa trên chỉ thị ITS, hai loài H. helix và H. nepalensis được phân tách một cách rõ ràng, có tới 09/600 vị trí nucleotide sai khác chiếm 1,5%, chứng tỏ vùng gen ITS biến đổi khá nhanh. Trong khi đó phân tích gen matK của các mẫu Dây thường xuân thu thập tại Việt Nam của tác giả Đỗ Hạnh Nguyên, chỉ cho 02/792 vị trí sai khác ở 2 loài đó. Chỉ thị gen ITS phân tách tốt hai loài H. nepalensis và H. helix cũng tương tự với kết quả Vargas và cộng sự (1999). Theo đó, cây phát sinh chủng loại mà tác giả công bố chia làm 2 nhánh chính: (i) Nhánh các loài lưỡng bội và (ii) Nhánh các loài đa bội. Trong nhánh các loài lưỡng bội bao gồm 06 loài, có chứa H. nepalensis và H.helix. Hai loài này được phân tách rõ ràng với nhau với chỉ số tin cậy rất cao (97% và 91%) [56]. Trong khi đó H. nepalensis và H. sinensis gần gũi nhau hơn, chỉ số tách nhánh còn ở mức gây tranh cãi. Thông qua nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy vai trò phân loại của chỉ thị ITS là phân biệt các loài trong cùng một chi với nhau. 4.6. Dự đoán trong bảo tồn và chọn tạo giống Trong tiêu chuẩn hóa dược liệu, các nhà chọn giống phải chọn được nguồn gen đồng đều về năng suất, chất lượng để đảm bảo chất lượng dược liệu theo GACP-WHO. Sự đa dạng nguồn gen quá mức là bất lợi cho việc chọn giống để tiêu chuẩn hóa vì các thành phần hoạt chất trong đó kém ổn định. Tuy nhiên, trong thực tiễn nuôi trồng hoặc với mục đích thu thập nguồn gen để bảo tồn, nếu đồng đều quá mức lại không đáp ứng đủ đa dạng về thành phần. Hiện nay, với sự hỗ trợ của các phương pháp nghiên cứu kết hợp phân tích hình thái, thành phần hóa học và chỉ thị DNA, việc tiêu chuẩn hóa các quy trình chọn giống, nhân giống và trồng trọt trở 43
nên thuận lợi hơn với các loài cây thuốc. Thông qua phân tích cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên chỉ thị gen ITS, sẽ cho những dự đoán định hướng để bảo tồn và chọn tạo giống. Theo những nghiên cứu trước đây, ở Việt Nam chỉ xuất hiện loài Dây thường xuân (H. nepalensis) tại các tỉnh miền núi phía Bắc. Tuy nhiên, trong phạm vi nghiên cứu của chúng tôi cho thấy khả năng tương đồng cao của các mẫu nghiên cứu với các loài khác như H. sinensis hay H.helix. Phân loại hình thái cho biết có 04 mẫu thuộc H. helix là H3, HH, H48, H52 (haplotype N3, N8, N9). Ngoại trừ mẫu HH thu tại Vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc làm đối chứng, các mẫu H. helix tại Việt Nam là do được nhập trồng và đã bị hoang dại hóa trong tự nhiên theo thời gian. Theo kết quả phân loại của nghiên cứu này, dựa vào chỉ thị ITS, có thêm 03 mẫu thuộc haplotype N3 (H9, H13, H14) tương đồng rất cao (100%) với H. helix đối chứng. Những mẫu cây này có thể sẽ là nguồn gen quý để làm dược liệu dựa trên cơ sở nhiều nghiên cứu về tác dụng của nó và sản phẩm thuốc ho nổi tiếng Prospan, Đức. Như vậy cần có đối chiếu lại những tài liệu về phân tích hình thái, đồng thời tiến hành những nghiên cứu về mặt hóa học để có thể khẳng định được sự tồn tại hoang dại của H. helix ở Việt Nam. Tương tự, do sự xuất hiện của các haplotype N5, N6, N10 gần gũi với H. sinensis cũng cần được nghiên cứu sâu hơn để có định hướng bảo tồn. H. nepalensis cũng vậy, dựa trên chỉ thị ITS, loài này xuất hiện 5 haplotype (N1, N2, N4, N7, N11) chiếm tỉ lệ lớn nhất. Cần phân tích thành phần hóa học để biết H. nepalensis có thành phần tương tự H. helix hay không, có thể thay thế được hay không, nếu có thì haplotype nào cho tỷ lệ hoạt chất cao nhất, từ đó có định hướng chuẩn hóa nguồn gen Dược liệu. Chính vì vậy, nghiên cứu của chúng tôi góp phần giúp phân loại sơ bộ các nguồn gen của chi Hedera tại Việt Nam nói riêng, để có những định hướng trong bảo tồn và chọn tạo nguồn gen Dược liệu. 4.7. So sánh với phân tích hình thái học Một lần nữa khẳng định lại rằng các haplotype N1, N2, N4, N7, N11 thuộc loài H. nepalensis; một số mẫu thuộc haplotype N3 (HH, H52), haplotype N8, N9 thuộc loài H. helix là hoàn toàn tương đồng với phân loại hình thái. Riêng haplotype N5, N6, N10 lại có xu hướng tách nhánh sang loài H. sinensis; haplotype N3 có mẫu H9, H13, H14 tách sang nhánh của H. helix thay vì được sơ bộ nhận định là H. nepalensis như phân tích hình thái học sẽ đặt ra một dấu hỏi để tiếp tục tiến hành phân tích kỹ lưỡng hơn về các mẫu này. Một luận điểm khác tin cậy là mã hiệu Genbank AJ131238.1 của H. nepalensis được lấy làm trình tự tham chiếu giống 44
100% với nhóm N1 đã được tác giả Vargas và cộng sự công bố năm 1999 sử dụng mẫu lá Dây thường xuân tại Lào Cai, Việt Nam [56]. Về bằng chứng phân tử phân tách 2 loài H. nepalensis và H. helix rất rõ ràng trước đó thì có thể kể đến sự tranh cãi rất nhiều khi phân định hai loài H. nepalensis và H. sinensis. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ phát hiện 3 vị trí sai khác nucleotide giữa 2 loài này là 389 (C>A), 407 (G>A) và 522 (A>C) đều thuộc vùng ITS2. Loài Dây thường xuân được mô tả và đặt tên theo hệ thống phân loại lưỡng phân lần đầu tiên bởi tác giả K.Koch với tên khoa học là Hedera nepalensis K.Koch vào năm 1853. Đến năm 1929, tác giả Wien gộp một loài khác là H. sinensis vào cùng loài H. nepalensis, và cho rằng loài H. nepalensis K.Koch là một tên đồng danh của H. sinensis. Tuy nhiên gần đây Jun Wen khi nghiên cứu về đặc điểm hình thái và DNA của chi Hedera trên thế giới (chỉ thị gen nhân – 2002; chỉ thị gen lục lạp – 2003) đã cho rằng loài Hedera nepalensis có 2 thứ H.nepalensis var. sinensis và H.nepalensis var. nepalensis [18, 19]. Loài tham chiếu H. sinensis (GU054623.1) này được chúng tôi tham khảo trên ngân hàng Genbank là kết quả của nghiên cứu của Li & Wen 2013 [41]. Vậy liệu các nhóm mẫu của chúng tôi có nằm trong trường hợp đang phân vân này? 4.8. Phân tích địa lý của các mẫu nghiên cứu Tỉnh Lào cai có tổng cộng 12/44 mẫu bao gồm 04 haplotype là N1 (chiếm 58,3%), N3 (chiếm 25%), N8 (chiếm 8,35%), N9 (chiếm 8,35%). Tỉnh Hà Giang có 28/44 mẫu bao gồm 08 haplotype là N1 (chiếm 50%), N2 (chiếm 17,7%), N4 (chiếm 10,7%), N5 (chiếm 10,7%), N7 (chiếm 7,1%), N11 (chiếm 3,8%). Tỉnh Lạng Sơn có 3/44 mẫu chứa 02 haplotype N6 (chiếm 66,7%), N10 (chiếm 33,3%). Đà lạt có 1/44 mẫu chỉ chứa haplotype N3. Hình 4.1 thể hiện phân bố địa lý các haplotype ở 3 tỉnh miền Bắc nước ta. Trong các tỉnh thu thập mẫu nghiên cứu, hầu hết các mẫu cho kết quả phân tích tương đồng cao với H. helix thuộc Sa Pa, Lào Cai. Tỉnh Hà Giang và Lạng Sơn không có sự xuất hiện của loài này. Do vậy Sa Pa, Lào cai có thể là khu vực tiềm năng có chứa sự xuất hiện của H. helix và có đặc điểm môi trường khí hậu và thổ nhưỡng phù hợp cho loài này. Trong khi đó Hà Giang là trung tâm đa dạng của H. nepalensis khi chứa cả 5 haplotype của loài này. Lạng Sơn và Đà Lạt có số mẫu thu thập được ít nên chưa thể có nhận định cụ thể. Tuy nhiên hai vùng này đều là vùng tiềm năng do 3 mẫu của Lạng Sơn (H49, H50, H51) có trình tự tương đồng cao với H. sinensis; 01 mẫu của Đà Lạt được phân loại tương đồng với H. helix. Do đó 45
chúng tôi khuyến cáo thu thập thêm mẫu tại các khu vực này để có cái nhìn tổng quan hơn về đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân tại hai tỉnh Lạng Sơn và Đà Lạt. Hình 4.1. Phân bố địa lý các haplotype của Dây thường xuân ở các tỉnh Lào Cai, Hà Giang, Lạng Sơn Vị trí địa lý phân bố mẫu cho thấy sự đa dạng trong tiến hóa nguồn gen Dây thường xuân. Theo đó, những nhóm phân loại là H. nepalensis có phân bố chủ yếu ở Sa Pa, Lào Cai và các huyện tỉnh Hà Giang; nhóm H. sinensis có ở Đồng Văn, Hà Giang và Lộc Bình, Lạng Sơn; H. helix bao gồm Sa Pa, Lào Cai và Đà Lạt, Lâm Đồng. Với số mẫu nghiên cứu hiện tại, chúng tôi sơ bộ nhận định các cây có phân bố địa lý giống nhau (cấp huyện) có xu hướng xếp lại thành một nhóm. Ví dụ như huyện Hoàng Su Phì có các mẫu H4, H27, H28, H31 – H34, H38, H42 – H44 và huyện Xí Mần có các mẫu H29, H30 đều thuộc H. nepalensis; huyện Lộc Bình, Lạng Sơn có H49, H50, H51 thuộc nhóm H. sinensis. Tuy nhiên, cùng một huyện cũng có những loài khác nhau như Sa Pa, Lào Cai có chứa cả H. nepalensis (H1, H2, H5, H6, H45 – H47) và H. helix (H3, H9, H13, H14, H48); Đồng Văn, Hà Giang có chứa cả H. nepalensis (H18 – H26, H37, H40) và H. sinensis (H16, H17, H35). 46
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1. Đã xây dựng thành công quy trình nhân dòng vùng gen ITS với độ dài khoảng 858 bp của mẫu Dây thường xuân thu thập ở Việt Nam. 2. Đã xây dựng thành công cây phát sinh chủng loại dựa trên chỉ thị ITS của 45 mẫu Dây thường xuân. Xác định 11 haplotype trong đó haplotype N1 chiếm tỷ lệ cao nhất (46,7%), có trình tự tương đồng 100% với trình tự H.nepalensis (mã số AJ131238) được công bố trên Genbank. Trong đó, 32 mẫu thuộc loài Hedera nepalensis; 06 mẫu thuộc loài Hedera sinensis; 07 mẫu thuộc loài Hedera helix. Kiến nghị 1. Tiếp tục thu thập các mẫu Dây thường xuân ở Việt Nam để đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen này trên khắp cả nước. 2. Mở rộng phân tích thêm một số chỉ thị phân tử khác như GBSSI, RAPD, trnK, hoặc kết hợp hai hay nhiều chỉ thị phân tích đồng thời để cung cấp thêm thông tin về quan hệ di truyền và tiến hóa của nguồn gen Dây thường xuân. 3. Nghiên cứu thêm về thành phần hóa học, tác dụng dược lý của các mẫu để tìm kiếm nguồn gen chỉ thị cho các giống sản xuất hoạt chất hàm lượng cao nhất. 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Tiến Bân (2003), Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Tập 2, Tr 1076. [2] Võ Văn Chi (1999), Cây cỏ có ích ở Việt Nam, Nhà xuất bản Giáo Dục. Tập 1, Tr 711. [3] Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học. [4] Nguyễn Anh Diệp, Ninh Trần, and Nguyễn Xuân Quỳnh (2007), Nguyên tắc phân loại sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật. [5] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, Quyển 2. [6] Đỗ Bích Huy (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kĩ thuật. [7] Đỗ Bích Huy (2004), "Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam (tập 1)", Nhà xuất bản Khoa học và kĩ thuật Hà Nội. [8] Đỗ Tất Lợi (1993), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học. [9] Vũ Đức Lợi, Nguyễn Tiến Vững, and Lê Thị thu Hường (2017), Tài nguyên cây thuốc, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. [10] Đinh Đoàn Long and Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. [11] Phan Kế Long, Vũ Đình Duy, Phan Kế Lộc et al. (2014), "Mối quan hệ di truyền của các mẫu Sâm thu ở Lai Châu trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng matK và ITS–rDNA", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 12(2). [12] Trần Văn Ơn (2004), Thực vật dược và phân loại thực vật, NXB Y học. [13] Đặng Ngọc Thanh and Trần Đức Lương (2018), "Thực trạng và xu hướng phát triển của phân loại học sinh vật", Khoa học & Công nghệ Việt Nam. [14] Nguyễn Đức Thành (2014), "Các kỹ thuật chỉ thị DNA trong nghiên cứu và chọn lọc thực vật", Tạp chí Sinh học, 36(3). [15] Nguyễn Thị Thu Thảo, "Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (Hedera nepalensis k. koch) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị GBSSI," Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học, Khoa Y Dược - Đại học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội, 2019. [16] Lê Sỹ Vinh (2014), Nhập môn Tin sinh học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. TIẾNG ANH [17] Ghulam Abbas, Hidayat Hussain, Ahmed Hamaed et al. (2019), "The Management of Diabetes Mellitus-Imperative Role of Natural Products
Against Dipeptidyl Peptidase-4, α-Glucosidase and Sodium-Dependent Glucose Co-Transporter 2 (SGLT2)", Bioorganic chemistry, 86, pp.305 -315. [18] Jennifer Ackerfield and Jun Wen (2002), "A morphometric analysis of Hedera L.(the ivy genus, Araliaceae) and its taxonomic implications", Adansonia, 24(2), pp.197-212. [19] Jennifer Ackerfield and Jun Wen (2003), "Evolution of Hedera (the ivy genus, Araliaceae): insights from chloroplast DNA data", International Journal of Plant Sciences, 164(4), pp.593-602. [20] Bruce G Baldwin, Michael J Sanderson, J Mark Porter et al. (1995), "The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny", Annals of the Missouri botanical garden, pp. 247- 277. [21] Danka Bošeľová, Jana Žiarovská, Lucia Hlavačková et al. (2016), "Comparative analysis of different methods of Hedera helix DNA extraction and molecular evidence of the functionality in PCR", Acta Fytotechnica et Zootechnica, 19(4), pp.144-149. [22] Thomas D Bruns, Thomas J White, and John W Taylor (1991), "Fungal molecular systematics", Annual Review of Ecology and systematics, 22(1), pp. 525-564. [23] Shi-Lin Chen, Hua Yu, Hong-Mei Luo et al. (2016), "Conservation and sustainable use of medicinal plants: problems, progress, and prospects", Chinese medicine, 11(1), p.37. [24] J Hugo Cota-Sánchez, Kirsten Remarchuk, and Kumary Ubayasena (2006), "Ready-to-use DNA extracted with a CTAB method adapted for herbarium specimens and mucilaginous plant tissue", Plant Molecular Biology Reporter, 24(2), p.161. [25] Gordon M Cragg, David J Newman, and Kenneth M Snader (1999), "Natural products in drug discovery and development", Journal of natural products, 60(1), pp.1-29. [26] Rob DeSalle and Paul Goldstein (2019), "Review and Interpretation of Trends in DNA Barcoding", Frontiers in Ecology and Evolution, 7, p.302. [27] Torsten Eriksson, Malin S Hibbs, Anne D Yoder et al. (2003), "The phylogeny of Rosoideae (Rosaceae) based on sequences of the internal transcribed spacers (ITS) of nuclear ribosomal DNA and the trnL/F region of chloroplast DNA", International Journal of Plant Sciences, 164(2), pp.197- 211. [28] Brandon S Gaut, "Molecular clocks and nucleotide substitution rates in higher plants," in Evolutionary biology, ed: Springer, 1998, pp. 93-120. [29] Jayadri Sekhar Ghosh, Samik Bhattacharya, and Amita Pal (2017), "Molecular phylogeny of 21 tropical bamboo species reconstructed by