›

Khóa luận Nghiên cứu chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nước của lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f.)

pdf 49 trang thiennha21 18/04/2022 7650
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nước của lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_chiet_xuat_phan_lap_mot_so_hop_chat_tu.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nước của lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f.)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ===  === NGUYỄN THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT NƯỚC CỦA LÁ CÂY KHÔI ĐỐM (Sanchezia nobilis Hook.f) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT NƯỚC CỦA LÁ CÂY KHÔI ĐỐM (Sanchezia nobilis Hook.f) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH. 2014.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. VŨ ĐỨC LỢI ThS. BÙI THỊ XUÂN HÀ NỘI – 2019 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Đức Lợi – Chủ nhiệm Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và ThS. Bùi Thị Xuân, Giảng viên Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, là những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khoá luận này. Em xin chân thành cảm ơn đề tài khoa học công nghệ cấp Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số: QG.18.20 đã hỗ trợ kinh phí và tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Bộ môn Dược liệu – Dược cổ truyền của Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến tất cả quý Thầy cô trong Khoa Y Dược đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại trường. Em xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, những người đã luôn theo sát động viên, quan tâm và tạo điều kiện giúp con có thể hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, ngày 31 tháng 5 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Hiền @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT STT Kí hiệu, viết tắt Tên đầy đủ 1 1H -NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 2 13C -NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C Distortionless Enhancement by Polarization 3 DEPT Transfer 4 d Doublet 5 dd Doublet of doublet 6 EtOH Ethanol 7 ESI-MS Phổ khối ion hóa phun mù điện tử 8 HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation 9 HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Nồng độ ức chế 50% (Half maximal inhibitory 10 IC50 concentration) 11 MeOH Methanol 12 m/z Khối lượng/điện tích 13 NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 14 s Singlet 15 TLC Sắc ký lớp mỏng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình vẽ Tên hình vẽ Trang Hình 1.1 Hình ảnh hoa và lá của cây Khôi đốm 4 Hình 1.2 Đặc điểm vi phẫu thân 5 Hình 1.3 Đặc điểm vi phẫu lá 6 Hình 1.4 Đặc điểm bột thân 7 Hình 1.5 Đặc điểm vi phẫu bột lá 8 Hình 1.6 Công thức cấu tạo các hợp chất phân lập được từ Khôi đốm 12 Hình 2.1 Hình ảnh cây và hoa Khôi đốm 17 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Khôi đốm 21 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nước 22 Hình 3.3 Cấu trúc hợp chất NX1 24 Hình 3.4 Cấu trúc hợp chất NX2 26 Hình 3.5 Cấu trúc hợp chất NX3 28 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng biểu Tên bảng biểu Trang Khối lượng các cắn phân đoạn dịch chiết ethanol Bảng 3.1 20 từ lá Khôi đốm Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của NX1 và chất tham khảo 23 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR của NX2 và chất tham khảo 25 Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR của NX3 và chất tham khảo 27 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC BẢNG BIỂU MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi Sanchezia 3 1.1.1. Vị trí phân loại 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Sanchezia 3 1.2. Tổng quan về loài Khôi đốm 4 1.2.1. Đặc điểm về loài Khôi đốm 4 1.2.2. Đặc điểm vi phẫu 5 1.2.3. Đặc điểm bột 6 1.2.4. Phân bố 8 1.2.5. Thành phần hóa học 9 1.2.6. Tác dụng sinh học 12 1.2.7. Công dụng 15 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.1. Nguyên vật liệu 17 2.1.2. Trang thiết bị, dụng cụ 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất 18 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  8. 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất 20 3.1.1. Chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn 20 3.1.2. Phân lập hợp chất 21 3.2. Kết quả xác định cấu trúc hợp chất 23 3.2.1. Hợp chất NX1: 4',5,7-Trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon 23 3.2.2. Hợp chất NX2: Kaempferol-3-O- -L-arabinofuranosid 24 3.2.3. Hợp chất NX3: Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid 26 3.3. Bàn luận 29 3.3.1. Về chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn từ lá Khôi đốm 29 3.3.2. Về phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. MỞ ĐẦU Nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, khí hậu nóng ẩm quanh năm nên Việt Nam có hệ sinh thái vô cùng phong phú, đa dạng, đi cùng với đó là tiềm năng to lớn về tài nguyên dược liệu (thực vật, động vật, khoáng vật) nói chung và tài nguyên cây thuốc nói riêng. Bên cạnh đó, Việt Nam có nền y học dân tộc lâu đời với tri thức sử dụng các loại dược liệu, các bài thuốc có giá trị dùng để chữa các bệnh thông thường và nan y. Hiện nay, không chỉ Việt Nam mà trên thế giới, với xu hướng “trở về thiên nhiên” thì việc sử dụng các thuốc từ dược liệu của người dân ngày càng gia tăng, ít có những tác động có hại và phù hợp với qui luật sinh lý của cơ thể hơn. Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), khoảng 80% dân số hiện nay trên thế giới vẫn dựa vào thuốc có nguồn gốc tự nhiên trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Vì vậy, những bài thuốc sử dụng thảo dược là đối tượng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản chất các hoạt chất có trong cây cỏ thiên nhiên. Từ đó, định hướng cho việc nghiên cứu, chiết xuất để tìm ra các loại thuốc mới hay bằng con đường tổng hợp để tạo ra những chất có hoạt tính trong việc chữa trị nhiều loại bệnh. Cây Khôi đốm có tên khoa học là Sanchezia nobilis Hook.f. hay Sanchezia speciosa Leonard, ngoài ra còn có nhiều tên gọi khác nhau Xăng sê, Ngũ sắc, thuộc chi Sanchezia (họ Ô Rô Acanthaceae) [1]. Trên thế giới cây này đã được nghiên cứu về tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, chống tăng sinh tế bào in vitro, tác dụng kháng khuẩn [37,39]. Ở Việt Nam, dân gian ta đã truyền nhau sử dụng cây Khôi đốm như một vị thuốc quý để chữa bệnh viêm dạ dày, cách chữa bệnh chỉ cần lấy vài lá tươi rửa sạch ăn với chút muối là cắt cơn đau ngay lập tức, dùng một thời gian là khỏi hẳn hoặc có thể sắc lá khô thay nước chè uống hằng ngày [3]. Tuy nhiên, những nghiên cứu thành phần hóa học về loài cây này ở cả Việt Nam và thế giới còn khá ít, mới có một số công bố cho thấy cây có chứa một số nhóm chất như: flavonoid, glycosid, carbohydrat, alcaloid, steroid, phenolic, saponin và tannin [36]. Việc nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Khôi đốm sẽ chứng minh kinh nghiệm sử dụng của loài cây này trong dân gian, hướng đến việc tìm kiếm các hợp @chấ tSchool có hoạt tínhof Medicine sinh học, xây and dựng Pharmacy, VNU 1
  10. phương pháp phân tích các hợp chất có trong dược liệu và góp phần nâng cao giá trị tiềm năng của cây Khôi đốm trong kho tàng cây thuốc Việt Nam. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nước của lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f.)” được thực hiện với mục tiêu: 1. Chiết xuất, phân lập được một số hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nước của lá cây Khôi Đốm. 2. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  11. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi Sanchezia 1.1.1. Vị trí phân loại Theo “Hệ thống phân loại về ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)” của tác giả A.Takhtajan (1997), chi Sanchezia có vị trí phân loại như sau [48]: Giới Thực vật: Plantae Ngành Ngọc lan: Magnolipphyta Lớp Cỏ tháp bút: Equisetopsida C. Agardh Phân lớp Mộc lan: Magnoliidae Novák ex Takht Bộ Hoa môi: Lamiales Họ Ô rô: Acanthaceae Chi: Sanchezia 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Sanchezia Cây bụi hay cây cỏ, rễ không có lông. Thân cây trơn nhẵn, màu xanh lá cây. Lá dài, lớn đến 26cm, màu xanh đậm có vân trắng kem hoặc vàng, hình mác. Hoa mọc đơn độc hoặc hợp lại thành chùm, thường lớn, có màu cam, vàng, đỏ hoặc tím, mọc ở ngọn, lá bắc thường có màu, đài 5 thùy, tràng 5, dính nhau thành hình ống, nhị 4, nhị 2 lép nhị 2 thò ra, bao phấn 2 ô. Quả nang, 6-8 hạt, hạt hình cầu [4,25]. Sanchezia được đặt theo tên của Jose Sanchez, một giáo sư về thực vật học ở Cadiz, Tây Ban Nha vào thế kỷ XIX [26]. Trên thế giới, chi Sanchezia (họ Acanthaceae) bao gồm gần 60 loài ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chi này phân bố ở khu vực châu Phi, châu Úc, Mỹ, một số nước Đông Nam Á và nhiều hòn đảo ở khu vực Ấn Độ - Thái Bình Dương như Quần đảo Cook, Hawaii, Fiji và New Caledonia. Chi Sanchezia tập trung, đa dạng nhất ở Peru và Ecuador [15,19,24]. Với sự đa dạng về mặt hình thái nên nhiều loài thuộc chi Sanchezia được trồng làm cây cảnh và hàng rào [19,39,45]. Tuy nhiên, chỉ có loài S. speciosa hay S. nobilis được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  12. Ở Việt Nam, chi này có 1 loài có tên khoa học là Sanchezia speciosa hay Sanchezia nobilis, được gọi là cây Xăng sê, Ngũ sắc hay Khối đốm. Phân bố chủ yếu ở miền núi Tây Giang - Quảng Nam, Hòa Vang - tỉnh Đà Nẵng, miền núi Chiêm Hóa, Na Hang - Tuyên Quang và một số tỉnh khác (Nam Định, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Thái Nguyên) [1,2,5]. 1.2. Tổng quan về loài Khôi đốm 1.2.1. Đặc điểm về loài Khôi đốm Tên khoa học: Sanchezia speciosa Leonard hay Sanchezia nobilis Hook.f. [1]. Tên Việt Nam: Xăng sê, Khôi đốm, Lá ngũ sắc [1]. Cây bụi, cao 0,5-1,5 m, thân và gân chính của lá có màu lục, đỏ hoặc vàng, gân bên màu trắng [4]. Lá đơn mọc đối hình chữ thập; cuống lá ngắn, hình trụ; phiến lá hình mũi mác, dài 10-25 cm, rộng 3-7 cm, nhẵn, mép lá hơi lượn sóng, mặt trên có màu xanh đậm, mặt dưới xanh nhạt; hệ gân lông chim, có 9-12 đôi gân bên [9,44]. Hoa mọc thành cụm hoa bông gồm 3 bông nhỏ trở lên, ở ngọn; cuống ngắn; có lá bắc màu lục hay đỏ, hình trứng, đỉnh tù, nhẵn, ôm lấy 1 cụm hoa [4,9,44]. Hoa lưỡng tính, màu xanh lục mờ, mùi nhạt đặc trưng [10]. Đài nhiều, hình vảy, dài 1,5-1,8 cm, rộng 3-5 mm, tròn ở đỉnh [43]. Tràng hình ống tròn, màu vàng có sáp, cao 4-5 cm, rộng 7-8 cm ở phía trên, thu hẹp dần xuống dưới đến 3 mm, nhẵn, các thùy dài 3-4 mm, tròn, có khía; chỉ nhị dài, nhị 4 trong đó có 2 nhị phát triển dài 4-4,5 cm, có lông và 2 nhị tiêu giảm [44]. Quả nang có 8 hạt [4]. Hình 1.1. Hình ảnh hoa @ và School lá của cây ofKhôi Medicine đốm and Pharmacy, VNU 4
  13. 1.2.2. Đặc điểm vi phẫu 1.2.2.1. Thân Thân non vi phẫu hình tròn. Cấu tạo từ ngoài vào trong gồm: ngoài cùng là lớp biểu bì cấu tạo bởi một hàng tế bào, có lông che chở đơn bào; tiếp theo là mô dày gồm 6-8 hàng tế bào xếp thành hình tròn khép kín; mô mềm gồm 5-7 lớp tế bào, bên trong có chứa tinh thể calcioxalat hình kim và các hạt tinh bột đơn; libe gần như hình tròn khép kín, libe ở ngoài, gỗ ở trong, thỉnh thoảng bị gián đoạn bởi một số tế bào mô mềm; mô mềm ruột cấu tạo bởi nhiều lớp tế bào, các tế bào thành mỏng, to, hình đa giác xếp lộn với nhau [9]. Thân già vi phẫu hình vuông. Cấu tạo tương tự thân non, ngoại trừ có thêm lớp bần bên ngoài cùng [9]. 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình 1.2. Đặc điểm vi phẫu thân [6] 1: Biểu bì; 2: Mô dày; 3: Mô mềm; 4: Sợi; 5: Libe; 6: Gỗ; 7: Tinh thể calci oxalat hình kim; 8: Mô mềm ruột 1.2.2.2. Lá Vi phẫu gân lá lồi lên ở 2 mặt trên và dưới. Biểu bì trên và biểu bì dưới cấu tạo bởi 1 hàng tế bào đa giác xếp đều đặn nhau. Mô dày trên và mô dày dưới cấu tạo bởi nhiều lớp tế bào thành dày lên ở các góc. Mô mềm cấu tạo bởi các tế bào thành mỏng, gần tròn @ bên School trong có of ch ứMedicinea các tinh th ểand canxi Pharmacy, VNU 5
  14. oxalat và các hạt tinh bột, rải rác có các bó mạch phụ. Libe gỗ xếp thành hình vòng cung gồm libe ở phía ngoài và gỗ ở phía trong. Một số tế bào biểu bì thành lông che chở, lông tiết. Vi phẫu phiến lá: Gồm biểu bì trên và biểu bì dưới cấu tạo bởi 1 hàng tế bào đa giác sắp xếp đều đặn nhau. Mô giậu ngay dưới biểu bì trên cấu tạo bởi 2 hàng tế bào hình chữ nhật sắp xếp đều đặn nhau. Mô khuyết cấu tạo bởi các tế bào hình gần tròn xếp lộn xộn. Vi phẫu cuống lá hình chén, có các đặc điểm tương tự gân lá, tuy nhiên có thêm lớp mô dày sát lớp biểu bì [10]. 8 1 2 9 3 4 5 6 7 Hình 1.3. Đặc điểm vi phẫu lá [6] 1: Biểu bì trên; 2: Mô dày trên; 3: Gỗ; 4: Libe; 5: Mô mềm; 6: Mô dày dưới; 7: Biểu bì dưới; 8: Mô giậu; 9: Mô khuyết 1.2.3. Đặc điểm bột 1.2.3.1. Bột thân Bột có màu xanh lá hơi vàng, vị đắng. Soi dưới kính hiển vi thấy có các đặc điểm sau: Mảnh bần màu nâu, mảnh biểu bì mang lông che chở, mảnh mạch xoắn, mạch điểm, tinh thể calci oxalat hình kim, sợi, tinh bột, lông che chở [9]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
  15. Lông Mảnh mô mềm Mạch xoắn Hạt tinh bột Tinh thể calci oxalat Mô dày Sợi Mạch điểm Hình 1.4. Đặc điểm bột thân [9] 1.2.3.2. Bột lá Bột lá có màu xanh nhạt, vị hơi đắng, soi dưới kính hiển vi thấy có các đặc điểm: Mảnh biểu bì, mảnh biểu bì mang lông tiết, mảnh biểu bì mang lỗ khí, lông che chở, mảnh mô mềm, mảnh mô khuyết, mảnh mô giậu, mảnh mô dày, mảnh mạch xoắn, mảnh mạch điểm, sợi, tinh thể calci oxalat hình kim, lông che chở, lông tiết, tinh bột [9]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
  16. Tinh thể calci Lớp biểu bì trên oxalate Tinh bột Sợi Lớp biểu bì dưới Lông Mô khuy ết Mô mềm Mạch xoắn Mô giậu Mạch điểm Hình 1.5. Đặc điểm vi phẫu bột lá [9] 1.2.4. Phân bố Trên thế giới, cây Khôi đốm đã có từ lâu năm ở rừng mưa nhiệt đới miền Trung và Nam Mỹ (Ecuador) và được tìm thấy trên nhiều hòn đảo ở khu vực Ấn Độ - Thái Bình Dương như Quần đảo Cook, Hawaii, Fiji và New Caledonia. Loài này được trồng ở rất nhiều nơi làm cây cảnh và hàng rào [15,19,39]. Cây phát triển mạnh ở nơi @ có School khí hậu mátof mMedicineẻ và trong lành. and V ìPharmacy, VNU 8
  17. vậy, ở Việt Nam cây Khôi đốm được tìm thấy ở các huyện miền núi cao như Tây Giang, tỉnh Quảng Nam, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng và ở một số huyện miền núi Chiêm Hóa, tỉnh Tuyên Quang [1,4]. Ngoài ra, cây được trồng ở Hà Nội, Thừa Thiên Huế [2]. 1.2.5. Thành phần hóa học Qua các tài liệu thu thập được, thành phần hóa học của loài Khôi đốm mới có một số công bố cho thấy, cây chứa một số nhóm chất như: flavonoid, glycosid, carbohydrat, alcaloid, steroid, phenolic, saponin và tannin [36]. Các hợp chất hóa học được phân lập từ các bộ phận khác nhau của loài này và một số hợp chất tự nhiên lần đầu được phân lập. Năm 2013, từ phần trên mặt đất của cây Khôi đốm thu hái tại vườn bách thảo Aswan ở Ai Cập, Ahmed E. Abd Ellah và cộng sự đã phân lập và xác định được 5 hợp chất matsutake bao gồm [15]: - Octen-3-ol (1) - 3-O-β-glucopyranosyl-1-octen-3-ol (2) - 3-O-β-glucopyranosyl-(1-6)-β-glucopyranosyl-1-octen-3-ol (3) - 3-O-β-arabinopyranosyl-(1-6)-β-glucopyranosyl-1-octen-3-ol (4) - 3-O-β-arabinopyranosyl-(1-6)-β-glucopyranosyl-(1-6)-β- glucopyranosyl-1-octen-3-ol (5). Trong đó, bốn hợp chất 1-4 lần đầu phân lập từ họ Acathanceae và hợp chất 5 lần đầu tiên phân lập từ tự nhiên [15]. Năm 2014, Ahmed E. Abd Ellah và cộng sự tiếp tục phân lập được 9 hợp chất từ cây Khôi đốm, trong đó 6 hợp chất khác nhau từ dịch chiết methanol của lá, rễ cây và ba hợp chất flavonoid từ dịch chiết methanol của hoa. 9 hợp chất bao gồm [8]: - Ba hợp chất cinnamyl alcohol glycosid: 9-O-β -glucopyranosyl trans- cinnamyl alcohol (6), 9-O-β-xylopyranosyl-(1→6)-O-β-glucopyranosyl- (1→6)-O-β glucopyranosyltrans-cinnamyl alcohol (7), Syringin (8). - Một hợp chất neolignan glucosid: 4-O-β-glucopyranosyl dehydrodiconiferyl alcohol (9). - Hai hợp chất benzyl alcohol glycosid: 7-O-β-glucopyranosyl benzyl alcohol (10) và 7-O-β-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-glucopyranosyl benzyl alcohol (11). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
  18. - Ba hợp chất flavonoid: apigenin-7-O-β–glucopyranoside (12), apigenin-7-Ogentiobioside (13), apigenin-7-O- β–glucuronopyranoside (14). Hợp chất 7 lần đầu tiên phân lập từ tự nhiên, bốn hợp chất 6, 8, 9 và 13 lần đầu phân lập từ họ Acathanceae và các hợp chất 10-12 và 14 lần đầu tiên được phân lập từ chi Sanchezia [9]. Theo [31], tiến sĩ Vũ Đức Lợi và cộng sự đã tìm thấy được 4 hợp chất trong lá cây Khôi đốm: Quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranosid (quercitrin) (15), Quercetin 3-O-β-D-galactopyranosid (hyperosid) (16), Sitosterol-3-O-β-D- glucopyranosid (daucosterol) (17), 3-Metyl-1H-benz[f]indolo-4,9-dion (18). Năm 2018, từ phân đoạn dịch chiết ethylacetat của lá cây Khôi đốm thu hái ở tỉnh Nam Định, thạc sĩ Bùi Thị Xuân và cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất: 9-methoxycanthin-6-on (19), 9-hydroxyheterogorgiolid (20), O-methyl furodysinin lacton (21). Các hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ cây Khôi đốm [7]. Một số công thức hóa học của các hợp chất có trong các bộ phận của cây Khôi đốm được trình bày ở hình 1.6. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  19. 15 16 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  20. 17 18 19 20 21 Hình 1.6. Công thức cấu tạo các hợp chất phân lập được từ Khôi đốm 1.2.6. Tác dụng sinh học 1.2.6.1. Thử nghiệm độc tính Brine Shrimp Năm 2015, Abu Shuaib Rafshanjani và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm độc tính Brine Shrimp trên các phân đoạn dịch chiết n-hexan và ethyl acetat của lá Khôi đốm với ấu trùng thử nghiệm là Artemia salina Leach, các mẫu chứng là vincristine sulphate và dung dịch DMSO, mỗi mẫu thử 3 lần và thử với nhiều nồng độ khác nhau (5, 10, 20, 40, 80 µg/ml). Kết quả cho thấy cả hai phân đoạn n-hexan và ethyl acetat đều dương tính với thử nghiệm với LC50 lần lượt là 19,95 µg/ml và 12, @88 School µg/ml, cao of hơn Medicine liều chết LC and50 củ aPharmacy, VNU 12
  21. vincristine sulphate (10,96 µg/ml). Như vậy, cả 2 phân đoạn đều an toàn hơn vincristine sulphate, trong đó phân đoạn ethyl acetat có hoạt tính mạnh hơn phân đoạn n-hexan [36]. 1.2.6.2. Tác dụng gây độc tế bào ung thư Paydar và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào in vitro của dịch chiết methanol từ lá Khôi đốm bằng phương pháp MTT trên các dòng tế bào: tế bào ung thư vú MCF-7, tế bào ung thư da SK-MEL-5 và tế bào nội mô mạch máu rốn của người HUVEC. Kết quả cho thấy dịch chiết methanol có tác dụng ức chế tốt sự tăng trưởng của dòng tế bào MCF-7 với IC50 là 23,20 ± 1,18 µg/ml; có tác dụng ức chế vừa phải trên dòng tế bào SK-MEL-5 với IC50 là 62,56 ± 5,32 µg/ml và có tác dụng ức chế yếu trên dòng tế bào HUVEC với IC50 là 91,15 ± 2,8 µg/ml. Trong khi doxorubicin có tác dụng ức chế mạnh trên cả 3 dòng tế bào với IC50 lần lượt là 1,93 ± 0,12; 7,95 ± 0,92; 8,29 ± 1,37 µg/ml. Như vậy, dịch chiết methanol có tác dụng gây độc tế bào chọn lọc hơn so với doxorubicin [37]. Năm 2017, Từ dịch chiết dichloromethan và methanol của vỏ và rễ loài Sanchezia speciosa, Nusrat Shaheen và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm độc tính Brine Shrimp và khả năng gây độc tế bào trên dòng tế bào Hela ở người bằng phương pháp MTT. Kết quả cho thấy, đối với thử nghiệm độc tính Brine Shrimp, dịch chiết dichloromethan của rễ cây có tác dụng gây độc đáng kể với IC50 là 2,52 µg/ml so với chất đối chứng etoposide có IC50 là 7,46 µg/ml và có khả năng gây độc tế bào Hela với IC50 là 46,7 ± 1,7 µg/ml trong khi chất đối chứng doxorubicin có IC50 là 0,1 ± 0,02 µg/ml. Đánh giá hiệu quả khả năng ức chế dòng tế bào Hela, nồng độ của rễ S. speciosa cho thấy sự ức chế tăng sinh tế bào tối ưu ở 100 µg/ml. Như vậy, dịch chiết dichloromethan của rễ Sanchezia speciosa có tiềm năng chống ung thư trên tế bào Hela ở người [35]. 1.2.6.3. Tác dụng chống oxy hóa Năm 2013, Paydar và cộng sự đã tiến hành đánh giá tác dụng chống oxy hóa của lá cây Khôi đốm bằng phương pháp ORAC để xác định khả năng hấp thụ gốc oxy hóa tự do. Kết quả là dịch chiết methanol của lá có chỉ số ORAC là 55,77 ± 1,73 µg/ml, trong khi đó chỉ số ORAC của quercetin là 63,07 ± 0,93 µg/ml. Như vậy, khả năng chống @ oxy School hóa của dofịch Medicinechiết methanol andcủa lá Pharmacy, VNU 13
  22. Khôi đốm gần tương đương như quercetin. Điều này cho thấy lá Khôi đốm có tác dụng chống oxy hóa hiệu quả [37]. Một nghiên cứu khác của tiến sĩ Bùi Thanh Tùng và cộng sự năm 2016 đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được trong dịch chiết ethanol từ lá Khôi đốm qua khả năng quét gốc DPPH. Bốn chất đã được cô lập từ lá của cây Khôi đốm bao gồm: Quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranosid (quercitrin) (1), quercetin 3-O-β-D-galactopyranosid (hyperosid) (2), sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (daucosterol) (3), 3-metyl-1H-benz [f] indolo-4,9-dion (4) được đem thử nghiệm, kết quả là các hoạt động chống oxy hoá theo thứ tự sau: hợp chất 2 > hợp chất 1 > hợp chất 4 > hợp chất 3. Giá trị IC50 của gốc tự do cho hai hợp chất 2 và 1 là 20,83 ± 1,29 mg/ml và 25,79 ± 2,57 mg/ml. Điều này cho thấy hai hợp chất Quercetin 3-O-α-L- rhamnopyranosid (quercitrin) và Quercetin 3-O-β-D-galactopyranosid (hyperosid) có tính chống oxy hóa mạnh và góp phần vào nguồn chất chống oxy hóa trong tự nhiên [49]. 1.2.6.4. Tác dụng chống viêm Tác dụng chống viêm của dịch chiết ethanol từ lá Khôi đốm được tiến sĩ Vũ Đức Lợi và cộng sự đánh giá trên mô hình gây phù chân chuột bởi dung dịch muối natri carrageenan 1% với liều dùng của dịch chiết là 3 g/kg và 1,5 g/kg theo trọng lượng cơ thể chuột. Kết quả cho thấy ở cả hai liều 3 g/kg và 1,5 g/kg của dịch chiết ethanol từ lá Khôi đốm đều có tác dụng giảm phù nề trong 24h và có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,01, p<0,05) [31]. Năm 2016, tiến sĩ Bùi Thanh Tùng và cộng sự đã tiến hành đánh giá tác dụng kháng viêm in vitro của bốn hợp chất phân lập được trong dịch chiết ethanol từ lá Khôi đốm bằng thử nghiệm ức chế biến tính albumin do nhiệt. Bốn chất đã được phân lập từ lá của cây Khôi đốm bao gồm: Quercetin 3-O- α-L-rhamnopyranosid (quercitrin) (1), quercetin 3-O-β-D-galactopyranosid (hyperosid) (2), sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (daucosterol) (3), 3- Metyl-1H-benz [f] indolo-4,9-dion (4) được đem thử nghiệm, kết quả là hợp chất 4 có tác dụng chống viêm mạnh nhất với IC50 là 193,70 5,24 µg/ml, hợp chất 3 có tác dụng chống viêm trung bình với IC là 245,592 3,17 @ School of Medicine50 and Pharmacy, VNU 14
  23. µg/ml, hợp chất 1 và 2 có tác dụng chống viêm yếu. Điều này cho thấy, hai hợp chất sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (daucosterol) (3), 3-metyl-1H- benz [f] indolo-4,9-dion (4) là các hợp chất tự nhiên có tiềm năng trong điều trị các bệnh liên quan đến viêm [49]. 1.2.6.5. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Năm 2014, Abu Shuaib và cộng sự đã đánh giá tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và diệt côn trùng của cây Xăng sê bằng phương pháp khuếch tán đĩa, trên 15 chủng vi khuẩn Gram (+) và Gram (-), 6 chủng nấm và một Tribolium castaneum. Kết quả cho thấy trong 3 phân đoạn thu được từ dịch chiết ethanol của lá Khôi đốm, phân đoạn chloroform thể hiện tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm tốt hơn hai phân đoạn ether dầu hỏa và ethyl acetat [39]. Giá trị MIC của các phân đoạn chloroform, ethyl acetat, ether dầu hỏa đối với 15 chủng vi khuẩn lần lượt nằm trong khoảng 16-64, 32-128 và 64- 128 µg/ml. Phân đoạn chloroform có tác dụng kháng khuẩn mạnh trên các chủng Escherichia coli, Salmonella paratyphi, Bacillus megaterium, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa và Shigella shiga. Phân đoạn ethyl acetat có tác dụng tốt trên chủng vi khuẩn Shigella sonnei và Shigella dysenteriae [39]. Vùng ức chế đối với các chủng nấm của các phân đoạn nằm trong khoảng 8 ± 0,01 cho tới 18 ± 0,41 mm với nồng độ 50 µg/đĩa. Phân đoạn chloroform có tác dụng tốt trên các chủng Candida albicans, Rizopus oryzae, Aspergillus niger và Trycophyton rubrum. Phân đoạn ethyl acetat có tác dụng ức chế vừa phải trên chủng Rizopus oryzae và Trycophytonrubrum trong khi phân đoạn ether dầu hỏa hầu như không có tác dụng [39]. Thí nghiệm diệt côn trùng Tribolium Castaleum (Herbst) cho thấy tỷ lệ tử vong của côn trùng là 60%, 40%, 20% ở liều lượng 50 mg/ml trong 48h tương ứng với phân đoạn chloroform, ethyl acetat và ether dầu hỏa [39]. 1.2.7. Công dụng Trị viêm loét dạ dày tá tràng. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
  24. Cách dùng: lấy vài lá tươi rửa sạch và nhai sống với một hạt muối là cắt cơn đau lập tức, dùng một thời gian thì khỏi hẳn. Ngoài việc ăn sống còn có thể sắc lá khô thay nước chè uống hằng ngày [3]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
  25. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên vật liệu Lá cây Khôi đốm được thu hái vào tháng 1/2018 tại Thị trấn Cổ Lễ, huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định, phơi sấy, bảo quản trong túi nilon kín. Mẫu cây này được ThS. Nguyễn Quỳnh Nga, Viện Dược liệu giám định tên khoa học là: Sanchezia nobilis Hook.f., họ Acanthaceae (họ Ô rô). Mẫu cây được lưu tại: Phòng tiêu bản, Khoa Tài Nguyên Dược Liệu, Viện Dược liệu (số hiệu tiêu bản: DL-150118). Hình 2.1. Hình ảnh cây và hoa Khôi đốm 2.1.2. Trang thiết bị, dụng cụ 2.1.2.1. Hóa chất và dung môi - Dung môi hóa chất dùng để chiết xuất và phân lập: Ethanol (EtOH), n- hexan, ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), chloroform, nước cất đạt tiêu chuẩn tinh khiết. - Hạt nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Sigma-Aldrich). - Chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 63-200 μm, Merck), pha đảo RP-18 (30-50 μm, Merck) . @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
  26. - Bản mỏng silica gel F254 tráng sẵn và RP-18 F254s tráng sẵn (Merck), hiện màu bằng thuốc thử acid sulfuric 10% và đốt nóng ở 110oC. 2.1.2.2. Trang thiết bị - Sắc ký cột: sắc ký các loại cột thủy tinh có kích cỡ khác nhau, tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phổ khối ESI-MS: đo trên máy AGILENT 1260 Series LC-MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ). - Nhiệt độ nóng chảy: đo trên máy SMP10 BioCote, Khoa Y Dược, ĐHQGHN. - Góc quay cực riêng: đo trên máy PLR-4, MRC scientific instruments, Khoa Y Dược, ĐHQGHN. - Cá c dung̣ cu ̣ thí nghiêṃ thườ ng quy: ống nghiệm, bình nón, bình gan,̣ cố c có mỏ, pipet - Các thiết bị khác: Tủ sấ y, tủ hút, cân phân tích, đèn tử ngoại phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng dài 365 nm. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất - Chiết xuất bằng ethanol và tách các thành phần bằng chiết lỏng lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần, thu lấy phân đoạn dịch chiết nước. - Phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 63-200 μm; 0,040-0,063 mm, Merck), pha đảo RP-18 (30-50 μm, Merck) và hạt nhựa trao đổi ion Diaion HP-20. - So sánh thành phần bằng sắc ký lớp mỏng (TLC): được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 (Merck), độ dày 0,2 mm và RP- 18F254s, độ dày 0,25 mm (Merck). Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, sau đó được phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong @ ethanolSchool và đofốt nóngMedicine trên bếp đi andện từ .Pharmacy, VNU 18
  27. - Xác định độ tinh khiết của hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
  28. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất 3.1.1. Chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn Lá Khôi đốm được rửa sạch, phơi khô, làm nhỏ. Cân 2,5 kg lá cây Khôi đốm đã làm nhỏ và ngâm chiết bằng 8L dung môi EtOH 80% ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày, rút lấy dịch chiết lần một. Bổ sung thêm dung môi ngập dược liệu 2-3cm (8L/lần) và tiếp tục chiết thêm hai lần, thu được dịch chiết lần hai và lần ba. Gộp dịch chiết 3 lần, lọc các dịch chiết ethanol thu được qua giấy lọc đem cất thu hồi ethanol dưới áp suất giảm thu được khoảng 150 g cao chiết tổng ethanol. Hòa tan 100g cao đặc trong nước nóng, tỷ lệ thể tích cao đặc: nước cất nóng (1:1) thu được dịch chiết nước. Dịch chiết nước đem lắc lần lượt với các dung môi: n-hexan, ethyl acetat; mỗi dung môi được chiết lặp lại 3 lần, mỗi lần 500ml dung môi trong 30 phút, thu được các phân đoạn dịch chiết tương ứng. Các phân đoạn dịch chiết được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách thủy ở nhiệt độ 600C đến cắn thu được các cắn tương ứng n- hexan (9,2g), ethyl acetat (28,8g) và dịch nước còn lại (26,6g). Bảng 3.1. Khối lượng các cắn phân đoạn dịch chiết ethanol từ lá Khôi đốm % so với nguyên liệu STT Phân đoạn Khối lượng cắn (g) khô 1 Cắn toàn phần EtOH 150 6 2 Cắn n-hexan 9,2 0,368 3 Cắn etylacetat 28,8 1,152 4 Cắn nước 26,6 1,064 Sơ đồ chiết xuất lá cây Khôi đốm được trình bày theo hình 3.1: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
  29. Dược liệu (2,5 kg) Chiết với ethanol 80% (8,0 lít x 3 lần) Lọc Dịch chiết ethanol Ethanol thu hồi Cao Ethanol (150g) Nước cất Dịch chiết nước n-hexan Dịch chiết n-hexan Dịch chiết nước ( n-hexan thu hồi Ethyl acetat Cắn n-hexan (9,2g) ( Dịch chiết ethyl acetat Cắn nước (26,6g) Ethyl acetat thu hồi Cắn ethyl acetat (28,8 g) Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Khôi đốm 3.1.2. Phân lập hợp chất Lớp nước (N, 25,0 g) được triển khai trên cột sắc ký trao đổi ion với chất hấp phụ là Diaion HP-20 với hệ dung môi tăng dần nồng độ methanol trong nước (50, 75, 100%) thu được 3 phân đoạn N1 (6,8 g), N2 (8,1 g), N3 (7,3 g). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
  30. Phân đoạn N2 (8,1 g) được hòa tan trong một lượng tối thiểu dung môi methanol sau đó tẩm với 25,0g silicagel, cô quay dưới áp suất thấp thu được bột mẫu. Bột này được phân tách bằng sắc ký cột silicagel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi chloroform: methanol (30:1→ 1:1; v/v) thu được 4 phân đoạn N2.1 (1,1 g), N2.2 (1,8 g), N2.3 (1,6 g), N2.4 (2,1 g). Triển khai sắc ký phân đoạn N2.1 với chất hấp phụ silicagel, hệ dung môi rửa giải ethanol : methanol (2:1, v/v) thu được hợp chất NX1 (16 mg). Triển khai sắc ký phân đoạn N2.2 với chất hấp phụ silicagel, hệ dung môi rửa giải chloroform : methanol (1:2, v/v) thu được hợp chất NX2 (15 mg). Phân đoạn N2.3 tiến hành sắc ký trên cột pha đảo kích thước 80 cm x 3 cm, hệ dung môi rửa giải methanol : nước (1:3, v/v), thu được hợp chất NX3 (16 mg). Sơ đồ phân lập cắn nước được trình bày theo hình 3.2 Cắn nước (N) SKC Diaion HP-20 (MeOH: H2O 50, 75, 100%) N1 N2 N3 SKC (CHCl 3: MeOH 30:1→1:1) N2.1 N2.2 N2.3 N2.4 SKC (EtOH: MeOH SKC (CHCl : MeOH SKC (MeOH: H O 3 2 2:1) 1:2) 1:3) Hợp chất Hợp chất Hợp chất NX1 NX2 NX3 Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nước @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
  31. 3.2. Kết quả xác định cấu trúc hợp chất 3.2.1. Hợp chất NX1: 4',5,7-Trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon o Tính chất: Chất rắn màu vàng, nhiệt độ nóng chảy: tnc= 291 -293 C Rf = 0,51 (TLC, silica gel, ethylacetat : methanol : nước, 2:4:0,1; v/v/v), hiện màu đen với dung dịch sắt(III) chlorid : ethanol 5%, ESI-MS m/z 329,1 [M-H]-, + + 353,1 [M+Na] , 331,0 [M+H] , CTPT: C17H14O7. Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT của chất NX1 và chất tham khảo [23] được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của NX1 và chất tham khảo [23] NX1 Va,b NX1 Va,c δC δC δH (ppm) δH (ppm) Vị trí C DEPT ppm ppm (Mult, J=Hz) (Mult, J=Hz) 2 C 164,0 163,9 - - 3 CH 103,6 103,3 6,96 (d, 2,0) 7,06 (s) 4 C 181,8 181,7 - - 5 C 161,5 161,4 - - 6 CH 98,8 98,7 6,22 (d, 2,0) 6,31 (d, 1,7) 7 C 163,7 163,6 - - 8 CH 94,1 94,2 6,56 (d, 2,0) 6,66 (d, 1,6) 9 C 157,4 161,0 - - 10 C 103,6 103,7 - - 1' C 120,5 120,4 - - 2' CH 104,4 104,6 7,31 (d, 0,5) 7,41 (s) 3' C 148,3 157,3 - - 4' C 139,9 148,1 - - 5' C 148,3 157,3 - - 6' CH 104,5 104,6 7,31 (d, 0,5) 7,41 (s) OH-5 12,94 (s) 12,95 (s) 3'-OCH3 3,88 (s) 3,98 (s) 5'-OCH3 3,88 (s) 3,98 (s) aĐo trong CDCl3 , b125 MHz, c500 MHz của chất tham khảo [23] Hợp chất NX1 thu được dưới dạng chất rắn màu vàng. Phổ ESI-MS xuất hiện các pic ion m/z 329,1 [M-H]-, 353,1 [M+Na]+, 331,0 [M+H]+ ứng với công thức phân tử C17H14O7. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  32. Phổ 1H-NMR của NX1 cho các tín hiệu đặc trưng của một flavonoid với cặp hai tín hiệu tại H 6,22 và 6,56 đều dưới dạng doublet (J=2,0 Hz) điển hình của hai proton H-6 và H-8 của vòng A, tín hiệu singlet H 6,96 (1H, H-3) được xác định là proton thuộc vòng C. Tín hiệu singlet tương ứng với 2H tại H 7,31 cho thấy vòng B thế các vị trí C-3', C-4', C-5' và còn lại hai proton H- 2' và H-6'. Căn cứ vào tín hiệu singlet tại H 3,88 (6H, s, 2 x OCH3) có thể thấy hai nhóm methoxy này phải nối với C-3' và C-5', như vậy tại các vị trí C- 5, C-7, C-4' sẽ là các nhóm hydroxyl. Phổ 13C-NMR của NX1 cho thấy hợp chất này có 17 nguyên tử cacbon, trong đó 15 cacbon thuộc vào khung flavon và 2 cacbon còn lại là của nhóm methoxy. Tín hiệu cacbon cacbonyl tại C 181,8 cho thấy sự có mặt của nối đôi C-2/C-3. Tại các vị trí C-3', C-4' và C-5', giá trị C của C-4' thấp hơn C-3', C-5' phù hợp với sự metyl hóa nhóm hydroxyl trong phổ NMR. Tất cả các dữ kiện phổ NMR của NX1 hoàn toàn phù hợp với các dữ liệu đã công bố trong tài liệu tham khảo [24] cho phép kết luận về cấu trúc của NX1 là 4',5,7-trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon. Hình 3.3: Cấu trúc hợp chất NX1 3.2.2. Hợp chất NX2: Kaempferol-3-O- -L-arabinofuranosid o Tính chất: Chất rắn màu vàng, nhiệt độ nóng chảy: tnc= 224-226 C. Rf = 0,50 (TLC, silica gel, ethylacetat : acid formic : nước, 15:4:1, v:v:v), hiện màu đen với dung dịch Sắt(III) chlorid : ethanol 5%. Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT của chất NX2 và chất tham khảo [18] được trình bày ở bảng 3.2. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  33. Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMR của NX2 và chất tham khảo [18] NX2 Xa,b NX2 Xa,c Vị trí δC δC δH (ppm) δH (ppm) DEPT C ppm ppm (Mult, J=Hz) (Mult, J=Hz) 2 C 159,2 158,5 - - 3 C 134,8 134,9 - - 4 C 179,9 179,8 - - 5 C 163,1 163,0 - - 6 CH 99,8 99,9 6,21 (d; 2,0) 6,17 (d; 1,8) 7 C 165,9 166,1 - - 8 CH 94,7 94,8 6,38 (d; 2,0) 6,36 (d; 1,5) 9 C 158,6 159,3 - - 10 C 105,7 105,6 - - 1' C 122,7 122,8 - - 2' CH 131,9 131,9 7,94 (d; 9,0) 7,92 (d; 8,7) 3' CH 116,6 116,5 6,91 (d; 9,0) 6,89 (d; 9,0) 4' C 161,4 161,5 - - 5' CH 116,4 116,5 6,91 (d; 9,0) 6,89 (d; 9,0) 6' CH 131,8 131,9 7,94 (d; 9,0) 7,92 (d; 8,7) 1'' CH 109,6 109,6 5,48 (br, s) 5,46 (s) 2'' CH 83,2 83,3 4,31 (br, d) 4,30 (d; 3,0) 2’ 3'' CH 78,5 78,6 3,91 (dd; 3,0; 5,0) 3,89 (dd; 3,0; 5,1) 4''3’ CH 87,8 87,9 3,81 (dd; 4,5; 9,0) 3,79 (dd; 4,2; 8,9) 4’5'' CH2 62,4 62,5 3,50 (dd; 2,0; 12,5) 3,47 (d; 4,0) aĐo trong CDCl3 , b125 MHz, c500 MHz của chất tham khảo [18] 5’ Hợp chất NX2 thu được dưới dạng chất rắn có màu vàng đặc trưng cho các hợp chất flavonoid. Phổ 1H-NMR của NX2 xuất hiện hai vùng tín hiệu rõ ràng, một vùng tín hiệu của các proton vòng thơm nằm ở phía trường thấp và một vùng tín hiệu của một phân tử đường ở vùng trường cao hơn. Sự có mặt của một vòng thơm thế para (vòng B) được nhận biết bởi hai tín hiệu doublet tại H 7,94 (2H, d, J=9,0 Hz; H-2' & H-6'); 6,91 (2H, d, J=9,0 Hz; H-3' & H- 5'); hai tín hiệu broad singlet tại H 6,21 và 6,38 phù hợp với hai proton ở vị trí C-6 và C-8 của vòng A của các hợp chất flavonol. Ngoài ra, trên phổ này không thấy xuất hiện các proton olefin khác chứng tỏ rằng hợp chất flavonol này có các nhóm thế tại C-3', C-5 và @C-7. School Sự tương oftác cMedicineủa các tín hiệ uand vùng Pharmacy, VNU 25
  34. trường thấp này với phổ của hợp chất kaempferol cho phép khẳng định về cấu trúc kaempferol của phần aglycon trong NX2. Các dữ kiện phổ NMR của hợp chất NX2 chỉ ra nó là một dẫn xuất O- glycosid của kaempferol. Phân tử đường gồm 5 tín hiệu tại C 109,6 (C-1''); 83,2 (C-2''); 78,5 (C-3''); 87,8 (C-4''); 62,4 (C-5'') cho thấy đây là một furanose. Các giá trị C của phân tử đường này hoàn toàn trùng khớp với các giá trị tương ứng của -L-arabinofuranose đã được công bố. Với -L- arabinofuranose, ba tín hiệu dễ nhận biết nhất đó là cacbon anome và hai tín hiệu cacbon CH có độ chuyển dịch hóa học khá cao C 109,6 (C-1''), 83,2 (C- 2'') và 87,8 (C-4''). Tương tác giữa proton anome H 5,48 (H-1'') và cacbon C 134,8 (C-3) trên phổ HMBC cho phép xác định vị trí liên kết của arabinofuranose với khung kaempferol tại C-3. Tham khảo tài liệu hợp chất NX2 [18] được nhận biết là kaempferol-3-O- -L-arabinofuranosid. Hình 3.4: Cấu trúc hợp chất NX2 3.2.3. Hợp chất NX3: Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid Tính chất: Dạng bột màu vàng nhạt, phổ APCI-MS m/z 449,1, công thức phân tử C21H20O11. Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT của chất NX3 và chất tham khảo [18] được trình bày ở bảng 3.4 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  35. Bảng 3.4: Dữ liệu phổ NMR của NX3 và chất tham khảo [18] NX3 Xa,b NX3 Xa,c Vị trí δC δC δH (ppm) δH (ppm) DEPT C ppm ppm (Mult, J=Hz) (Mult, J=Hz) 2 C 159,2 159,1 - - 3 C 135,6 135,5 - - 4 C 179,6 179,5 - - 5 C 163,1 163,0 - - 6 CH 100,1 99,9 6,24 (d; 2,0) 6,18 (d; 1,8) 7 C 166,3 166,0 - - 8 CH 94,7 94,8 6,41 (d; 2,0) 6,38 (d; 2,1) 9 C 158,6 158,5 - - 10 C 105,6 105,7 - - 1' C 122,7 122,8 - - 2' CH 132,4 132,3 8,08 (d; 9,0) 8,05 (d; 9,0) 3' CH 116,2 116,1 6,90 (d; 9,0) 6,87 (dd; 2,1; 8,7) 4' C 161,6 161,5 - - 5' CH 116,2 116,1 6,90 (d; 9,0) 6,87 (dd; 2,1; 8,7) 6' CH 132,4 132,3 8,08 (d; 9,0) 8,04 (d; 9,0) 1'' CH 104,1 104,1 5,25 (d;7,5) 5,23 (d;7,5) 2'' CH 75,6 75,7 3,46 (m) 3,40 (dd; 7,2; 10,0) 3'' CH 78,5 78,4 3,24 (m) 3,25-3,40 (m) 4'' CH 71,4 71,3 3,36 (m) 3,25-3,40 (m) 3,20 (ddd; 2,1; 5,1; 5'' CH 78,2 78,4 3,45 (m) 7,5) 3,72 (dd; 2,0; 11,5) 3,71 (dd; 2,1; 11,7) 6'' CH2 62,7 62,6 3,51 (dd; 5,5; 12,0) 3,51 (dd; 5,4; 11,7) a b c Đo trong CD3OD , 125 MHz, 500 MHz của chất tham khảo [18] Hợp chất NX3 phân lập được dưới dạng bột màu vàng nhạt. Trên phổ khối lượng APCI-MS của hợp chất NX3 xuất hiện pic ion giả phân tử ở m/z 449,1 tương ứng với hợp chất có công thức phân tử C21H20O11. 1 Phổ H-NMR của NX3 xuất hiện cặp tín hiệu doublet tại δH 6,24 (1H, d, J=2,0Hz; H-6) và δH 6,41 (1H, d, J=2,0Hz; H-8) điển hình cho hai proton ở vị trí C-6 và C-8 của vòng A của hợp chất flavonol. Cặp tín hiệu doublet khác tại δH 6,90 (2H, d, J=9,0Hz; H-3', H-5') và δH 8,08 (2H, d, J=9,0Hz; H-2', H-6') đặc trong cho vòng thơm thế para. Tín hiệu proton anomer tại δH 5,25 (1H, d, J=7,5Hz; H-1'') gợi ý trong phân tử hợp chất NX3 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
  36. có mặt một gốc đường. Trên phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất NX3 xuất hiện của 21 nguyên tử carbon, trong đó có 11 nhóm methin và 1 nhóm methylen. Trong đó 6 tín hiệu tại δC 104,1; 75,6; 78,5; 71,4; 78,2 và 62,7 tương ứng với C-1'', C-2'', C-3'', C-4'', C-5'' và C-6'' khẳng định sự có mặt của nhóm glucopyranosyl và tín hiệu của 15 nguyên tử carbon thuộc vào khung flavonol có vòng B thế para. So sánh các dữ liệu phổ NMR của hợp chất NX3 với hợp chất kaempferol-3- O-β-D-glucopyranosid [18] thấy gần như hoàn toàn phù hợp. Tương tác HMBC giữa tín hiệu proton δH 5,25 (H-1'') với tín hiệu carbon δC 135,6 (C-3) gợi ý nhóm O-β-D-glucopyranosyl gắn vào vị trí số 3. Từ các dữ liệu phổ trên, cho phép kết luận hợp chất NX3 có tên là kaempferol-3-O-β-D- glucopyranosid. Hình 3.5. Cấu trúc hợp chất NX3 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  37. 3.3. Bàn luận 3.3.1. Về chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn từ lá Khôi đốm Đề tài đã chiết xuất được cao toàn phần từ lá Khôi đốm bằng phương pháp chiết lạnh: ngâm tại nhiệt độ phòng trong 3 ngày với dung môi EtOH 80%. Phương pháp có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền thu được khối lượng cắn toàn phần đạt 6% so với lượng dược liệu ban đầu. Cắn toàn phần sau đó được chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan, ethyl acetat thu được ba phân đoạn là n-hexan, ethyl acetat và và dịch chiết nước, đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách thủy ở nhiệt độ 600C thu được lần lượt các cắn phân đoạn với khối lượng đạt 0,368% ; 1,152% ; 1,064% so với nguyên liệu khô ban đầu. 3.3.2. Về phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất Kết quả phân lập được 3 hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nước của lá Khôi đốm thu tại tỉnh Nam Định. Cấu trúc các hợp chất này được xác định thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ khối, phổ cộng hưởng hạt nhân và so sánh với các dữ liệu công bố của các hợp chất liên quan. Ba hợp chất được xác định là 4',5,7-Trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon (NX1), Kaempferol-3-O- -L-arabinofuranosid (NX2), Kaempferol-3-O-β-D- glucopyranosid (NX3). 4',5,7-trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon: Đây là chất lần đầu tiên được phân lập từ lá cây Khôi đốm nói riêng và chi Sanchezia nói chung, là một flavonoid được tìm thấy chủ yếu trong các loại cỏ và ngũ cốc khác nhau thuộc họ Poaceae, như lúa mì, lúa mạch, tre, yến mạch, ngô, gạo và được phát hiện với hàm lượng cao trong họ Huperziaceae [33,42]. Hợp chất này có nhiều tác dụng sinh học được biết đến như chống viêm, chống oxy hóa, chống dị ứng, chống vi rút và ức chế sự hình thành khối u [16,33] như ức chế sự phát triển của ung thư biểu mô đại trực tràng [32], ung thư vú [11]. Các cơ chế phân tử liên quan đến hợp chất ngày càng được làm rõ như 4',5,7- trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon làm giảm phản ứng viêm trong các tế bào đơn nhân máu ngoại vi của người (hPBMC) thông qua điều chỉnh các con đường tín hiệu TLR4/NF-κB/STAT, @ p38MAPK School và of PI3K/AKT Medicine [46,4 7and] hay Pharmacy, VNU 29
  38. các cơ chế liên quan đến ung thư vú và ung thư trực tràng thông qua sự ức chế các hoạt động cyclooxygenase và P-glycoprotein [12,33]. Năm 2016, Jang Mi Han và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu in vitro cho thấy tiềm năng của hợp chất này liên quan đến ức chế sự hình thành khối u thông qua việc ngăn chặn kép yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu VEGFR2 và protein HIF-1α [16]. Năm 2017, từ lá của loài Casearia arborea (Salicaceae), Augusto L. Santos và cộng sự cho thấy hợp chất có tác dụng điều trị bệnh do nhiễm ký sinh trùng Leishmania gây ra và tác dụng điều hòa miễn dịch trên tế bào chủ do kích thích đại thực bào sản xuất ra NO (oxit nitric) [42]. Kaempferol-3-O- -L-arabinofuranosid: Là một flavonoid được phân lập từ một số loài thuộc họ khác nhau như Rubus rigidus var. camerunensis họ Rosaceae [34], Polygonum aviculare họ Polygonaceae. Đây cũng là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ cây Khôi đốm cũng như chi Sanchezia. Hợp chất này có tác dụng chống viêm, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư [54], tác dụng chống oxy hóa [34], [38], hoạt động bảo vệ thần kinh chống độc tính do glutamate gây ra trên các tế bào HT22 [50] và khả năng gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 [30]. Năm 2014, từ bộ phận trên mặt đất của loài Polygonum aviculare, Hyo Hyun Yang và cộng sự đã tiến hành đánh giá khả năng chống lão hóa trên nguyên bào sợi ở người (HDFs), kết quả cho thấy kaempferol-3-O- -L-arabinofuranosid làm giảm β- galactosidase liên quan đến lão hóa, một dấu ấn sinh học sử dụng rộng rãi của sự lão hóa tế bào. Kết quả nghiên cứu góp phần hướng đến sự phát triển của các chất bổ sung trong chế độ ăn uống và mỹ phẩm để ngăn ngừa lão hóa và các bệnh liên quan đến tuổi tác [51]. Dựa trên những nghiên cứu đã có cho thấy hợp chất này có khả năng ngăn ngừa viêm gan bằng cách vô hiệu hóa con đường tín hiệu TLR4/NF-κB [54] thì năm 2018, Fang-Xue Zhang và cộng sự đã đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây bệnh Parkinson ở chuột do lipopolysaccharide (LPS) gây ra, kết quả cho thấy hợp chất này làm giảm đáng kể việc sản xuất LPS gây ra các cytokine tiền viêm ở vùng đồi hải mã của chuột và trong tế bào hình sao trên ống nghiệm thông qua việc vô hiệu hóa TLR4/NF-κB. Như vậy, kaempferol-3-O- -L-arabinofuranosid có tác dụng cải thiện tình trạng viêm thần kinh @ doSchool LPS gây ofra, chMedicineống lại sự thoái and hóa Pharmacy, VNU 30
  39. thần kinh thông qua việc cản trở con đường tín hiệu TLR4/NF-κB. Điều này cho thấy tiềm năng về một chiến lược trị liệu mới trong tương lai để điều trị Parkinson một cách an toàn và hiệu quả [53]. Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid: là một flavonoid được biết đến có trong nhiều loài thực vật như cây tơ hồng, dâu tằm, trà xanh, rau má, cây hồng, rau đay, muồng trâu, trong cây thuốc (cam thảo, đỗ trọng), phân bố trong các họ thực vật như Ebenaceae, Rosaceae và Eucommiaceae [17,41]. Hợp chất này được biết đến với nhiều tác dụng dược lý đáng kể như chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư, bảo vệ thần kinh, có tác dụng với bệnh nhân đái tháo đường, chống viêm loét dạ dày [41]. Các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu kaempferol-3-O-β-D- glucopyranosid và xác định cơ chế cơ bản cho tác dụng bảo vệ, chống lại các phản ứng dị ứng trên mô hình gây hen dị ứng bằng ovalbumin ở chuột. Đó là hợp chất này có tác dụng ức chế bạch cầu ái toan và làm giảm số lượng bạch cầu ái toan trong các mô phổi [29]. Theo một nghiên cứu gần đây còn cho thấy điều trị bằng kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid có tác dụng ức chế sự phá hủy phế nang, làm mở rộng đường thở trong mô hình gây viêm trên chuột bằng ovalbumin [21]. Hợp chất này cũng được báo cáo có khả năng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư như dòng tế bào ung thư bạch cầu (HL-60) [10], tế bào ung thư gan (HepG2, Huh-7 và H22) [27], tế bào ung thư da (HaCaT, A375P và SK-MEL- 2) [52] và tế bào ung thư phổi (A549 và H1299) [13]. Năm 2018, J. Zhang và cộng sự nghiên cứu trên mô hình tổn thương da bằng tia UV ở dòng tế bào da HaCaT trên người trong ống nghiệm và mô hình thực nghiệm trên chuột Babl/c cho thấy kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid có thể là chất chống ung thư mới đầy tiềm năng trong việc phòng ngừa và điều trị bênh tổn thương da do tia cực tím UV gây ra - tiền thân của ung thư biểu mô tế bào vảy da, do hợp chất này có khả năng ức chế đặc hiệu mục tiêu phân tử đích p38 MAPK và gây độc tính thấp [52]. Các nghiên cứu cho thấy kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid có khả năng chống oxy hóa như khả năng ức chế stress oxy hóa gây ra bởi nội độc tố, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
  40. thông qua việc điều chỉnh con đường tín hiệu TLR4-PKCβ2-NADPH, từ đó dẫn đến sự chết theo chương trình của biểu mô và tăng bạch cầu ái toan [14]. Năm 2013, từ dịch chiết lá cây dâu tằm, Jiwon Choi và công sự đã chỉ ra rằng trong số các hợp chất phân lập được thì kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid có tác dụng bảo vệ lớn nhất, chống lại stress oxy hóa trên mô hình tan máu tế bào hồng cầu người do gốc tự do AAPH gây ra và ngăn ngừa sự suy giảm GSH trong hồng cầu [40]. Trên mô hình gây độc tế bào thần kinh bằng 6-hydroxydopamine (6- OHDA) ở loài giun Caenorhabditis elegans do Haifeng Li và công sự tiến hành, kết quả cho thấy kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid làm giảm sự thoái hóa thần kinh ở giun C. Elegans và tăng vòng đời của giun. Nó cũng làm giảm nồng độ ROS, ức chế peroxid hóa lipid và tăng hoạt động của các enzym SOD và GPx. Hơn nữa, nó có khả năng tăng cường enzym acetylcholinesterase và làm giảm mức độ phiên mã của gen egl-1 liên quan đến sự chết của tế bào thần kinh [26]. Một nghiên cứu khác đánh giá tác dụng của kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid đối với hệ thống thần kinh trung ương trên mô hình chuột cho thấy hợp chất này có tác dụng đáng kể lên hoạt động trao đổi chất của chuột như làm giảm hoạt động tự phát, tăng tỷ lệ số giấc ngủ, rút ngắn thời gian ngủ khi chuột được điều trị bằng natri pentobarbital với liều thấp hơn liều ngưỡng và kéo dài thời gian ngủ với natri pentobarbital ở liều cao hơn liều ngưỡng. Ngoài ra, hợp chất này còn làm giảm tần suất, mức độ co giật. Như vậy, việc sử dụng kaempferol-3-O-β-D- glucopyranosid trong điều trị có thể góp phần cải thiện các bệnh lý liên quan đến hệ thần kinh trung ương trong tương lai [28]. Năm 2012, M.Ke và cộng sự cho thấy kaempferol-3-O-β-D- glucopyranosid có tác dụng chống tăng đường huyết. Nó giúp ngăn ngừa bệnh bệnh võng mạc tiểu đường, một biến chứng nặng nề của đái tháo đường bằng cách giảm sự biểu hiện quá mức của yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) trong võng mạc và làm giảm bớt các tác động gây ra khi nồng độ glucose trong máu cao [20]. Đánh giá tác dụng chống viêm loét dạ dày trên mô hình gây loét trên chuột thì nhóm Klein-Júnior LC và @ cộ Schoolng sự đã chofỉ Medicinera rằng ở liề uand uống Pharmacy, VNU 32
  41. kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid 30 mg/kg sử dụng cho chuột có tác dụng làm giảm phần trăm diện tích tổn thương, tổng diện tích tổn thương và chỉ số loét dạ dày [22]. Cả 3 hợp chất này đều chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào trước đây về cây Khôi đốm, cũng như chi Sanchezia nói chung. Vì vậy, đây là đóng góp mới của đề tài, làm phong phú hơn tri thức về thành phần hóa học cây Khôi đốm và chi Sanchezia. Tuy nhiên, các nghiên cứu của đề tài chỉ mới là bước đầu, tạo cơ sở cho việc nghiên cứu sâu hơn về Khôi đốm; bổ sung tư liệu cho việc sử dụng cây làm thuốc trong dân gian, cũng như phục vụ cho lĩnh vực kiểm nghiệm dược liệu sau này. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
  42. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khóa luận đã thu được một số kết quả như sau : + Chiết xuất, phân lập: Đã sử dụng phương pháp chiết ngâm với dung môi EtOH 80% và bằng phương pháp sắc ký cột để chiết xuất phân lập được 3 hợp chất từ lá của cây Khôi đốm + Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được: Thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ khối và phổ cộng hưởng hạt nhân, đã xác định được cấu trúc của 3 hợp chất: 4',5,7-trihydroxy-3',5'- dimethoxyflavon (NX1), kaempferol-3-O- -L-arabinofuranosid (NX2), kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid (NX3). Đây là lần đầu tiên 3 hợp chất này được phân lập từ lá cây Khôi đốm. Kiến nghị: + Tiếp tục triển khai phân lập các hợp chất khác từ loài Sanchezia nobilisHook.f. + Dựa trên kết quả đã nghiên cứu về thành phần hóa học, cần nghiên cứu xác định hàm lượng hoạt chất trong các bộ phận của cây và đánh giá tác dụng sinh học của loài này về tác dụng chống viêm giảm đau, chống loét dạ dày và các tác dụng sinh học khác. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
  43. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Tiến Bân, (2003), Danh mục các loài thực vật Việt Nam, Nhà xuất bản Nông nghiệp, tr. 272-273. 2. Phan Văn Chiêu, (2011), Đông nam dược nghiệm phương, Nhà xuất bản Thuận Hóa, tr. 856. 3. Nguyễn Trung Hòa, (2012), Đông y toàn tập, Nhà xuất bản Thuận Hóa, tr. 1234-1235. 4. Phạm Hoàng Hộ, (2000), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản trẻ, tr. 39. 5. Đỗ Tất Lợi, (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 518-520. 6. Nguyễn Thị Mai, (2017), "Nghiên cứu thành phần hóa học lá cây Xăng sê", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học, Khoa Y Dược, ĐHQGHN. 7. Bùi Thị Xuân, Vũ Đức Lợi, Vũ Thị Mây và cộng sự, (2018), "Một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f.)", Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 34 (1), tr. 42-47. Tiếng Anh 8. Abd-Ellah A., Mohamed K., Backheet E., et al., (2014), "Cinnamyl Alcohol, Benzyl Alcohol, and Flavonoid Glycosides from Sanchezia nobilis", Chemistry of Natural Compounds, 50 (5). 9. Ahmed E. Abd-Ellah, Khaled M. Mohamed, Enaam Y. Backheet and Mahmoud H. Mohamed, (2006), "Macro-and micromorphology of Sanchezia nobilis Hook. cultivated in Egypt: leaf, stem and flower", Bulletin Pharmaceutical Sciences, Vol. 29, Part 2, pp. 300-327. 10. Burmistrova O, Quintana J, Diaz J G, Estevez F, (2011), "Astragalin heptaacetate-induced cell death in human leukemia cells is dependent on caspases and activates the MAPK pathway", Cancer Letters, 309 (1), pp. 71-77. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  44. 11. Cai H, Hudson E A, Mann P, Verschoyle R D, et al, (2004), "Growth-inhibitory and cell cycle-arresting properties of the rice bran constituent tricin in human-derived breast cancer cells in vitro and in nude mice in vivo", British Journal of Cancer, 91 (7), pp. 1364-1371. 12. Cai H, Al-Fayez M, Tunstall R G, Platton S, et al, (2005), "The rice bran constituent tricin potently inhibits cyclooxygenase enzymes and interferes with intestinal carcinogenesis in ApcMin mice", Molecular Cancer Therapeutics, 4 (9), pp. 1287-1292. 13. Chen M, Cai F, Zha D, Wang X, et al, (2017), "Astragalin-induced cell death is caspase-dependent and enhances the susceptibility of lung cancer cells to tumor necrosis factor by inhibiting the NF-small ka, CyrillicB pathway", Oncotarget, 8 (16), pp. 26941-26958. 14. Cho I H, Gong J H, Kang M K, Lee E J, et al, (2014), "Astragalin inhibits airway eotaxin-1 induction and epithelial apoptosis through modulating oxidative stress-responsive MAPK signaling", BMC Pulmonary Medicine, 14, pp. 122. 15. Ellah A. E. A., Mohamed K. M., Backheet E. Y., et al., (2013), "Matsutake alcohol glycosides from Sanchezia nobilis", Chemistry of Natural Compounds, 48 (6), pp. 930-933. 16. Han J M, Kwon H J, Jung H J, (2016), "Tricin, 4',5,7-trihydroxy- 3',5'-dimethoxyflavone, exhibits potent antiangiogenic activity in vitro", International Journal of Oncology, 49 (4), pp. 1497-1504. 17. Han S, Hanh Nguyen T T, Hur J, Kim N M, et al, (2017), "Synthesis and characterization of novel astragalin galactosides using beta- galactosidase from Bacillus circulans", Enzyme Microbial Technology, 103 pp. 59-67. 18. Hyoung Ja Kim, Eun-Rhan Woo, and Hokoon Park, (2004), "A Novel Lignan and Flavonoids from Polygonum aviculare", Journal of Natural Products, 57 (5), pp. 581-586. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  45. 19. Jean-Yves Meyer, Christophe Lavergne, (2004), "Beautés fatales: Acanthaceae species as invasive alien plants on tropical Indo-Pacific Islands", Diversity and Distributions, 10 pp. 333–347. 20. Ke M, Hu X Q, Ouyang J, Dai B, et al, (2012), "The effect of astragalin on the VEGF production of cultured Muller cells under high glucose conditions", Biomedical Materials and Engineering, 22 (1-3), pp. 113-119. 21. Kim Y H, Choi Y J, Kang M K, Park S H, et al, (2017), "Astragalin Inhibits Allergic Inflammation and Airway Thickening in Ovalbumin- Challenged Mice", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 65 (4), pp. 836-845. 22. Klein-Junior L C, Santin J R, Lemos M, Silveira A C, et al, (2013), "Role of gastric mucus secretion, oxinitrergic system and sulfhydryl groups on the gastroprotection elicited by Polygala cyparissias (Polygalaceae) in mice", Journal Pharmacy Pharmacology, 65 (5), pp. 767-776. 23. Kong C, Xu X, Zhou B, Hu F, et al, (2004), "Two compounds from allelopathic rice accession and their inhibitory activity on weeds and fungal pathogens", Phytochemistry, 65 (8), pp. 1123-1128. 24. Leonard E. C., (1926), "Notes on the genus Sanchezia", Journal of Washington Academy of Sciences, 16 pp. 484-492. 25. Leonard E. C., Smith L. B., (1964), "Sanchezia and related American Acanthaceae", 66 (768), pp. 313-343. 26. Li H, Shi R, Ding F, Wang H, et al, (2016), "Astragalus Polysaccharide Suppresses 6-Hydroxydopamine-Induced Neurotoxicity in Caenorhabditis elegans", Oxidative Medicine and Cellular Longevity , 2016 pp. 4856761. 27. Li W, Hao J, Zhang L, Cheng Z, et al, (2017), "Astragalin Reduces Hexokinase 2 through Increasing miR-125b to Inhibit the Proliferation of Hepatocellular Carcinoma Cells in Vitro and in Vivo", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 65 (29), pp. 5961-5972. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  46. 28. Li X, Tang Z, Fei D, Liu Y, et al, (2017), "Evaluation of the sedative and hypnotic effects of astragalin isolated from Eucommia ulmoides leaves in mice", Natural Product Research, 31 (17), pp. 2072-2076. 29. Liu J, Cheng Y, Zhang X, Zhang X, et al, (2015), "Astragalin Attenuates Allergic Inflammation in a Murine Asthma Model", Inflammation, 38 (5), pp. 2007-2016. 30. Liu J X, Di D L, Wei X N, Han Y, (2008), "Cytotoxic diarylheptanoids from the pericarps of walnuts (Juglans regia)", Planta Medica, 74 (7), pp. 754-759. 31. Loi Vu Duc, Tung Bui Thanh, Ha Vu Hoang and Tuyen Nguyen Manh, (2016), "Phytochemical and anti-inflammatory effect from the leaf of Sanchezia speciosa Leonard growing in Vietnam", Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 8 (7), pp. 309-315. 32. Malvicini M, Gutierrez-Moraga A, Rodriguez M M, Gomez- Bustillo S, et al, (2018), "A Tricin Derivative from Deschampsia antarctica Desv. Inhibits Colorectal Carcinoma Growth and Liver Metastasis through the Induction of Specific Immune Response", Molecular Cancer Therapeutics, 17 (5), pp. 966-976. 33. Mi Li , Yunqiao Pu , Chang Geun Yoo , Arthur J. Ragauskas, (2016), "The occurrence of tricin and its derivatives in plants, Green Chemistry", Green Chemistry, 18 (6), pp. 1439–1454. 34. Nguelefack T B, Mbakam F H, Tapondjou L A, Watcho P, et al, (2011), "A dimeric triterpenoid glycoside and flavonoid glycosides with free radical-scavenging activity isolated from Rubus rigidus var. camerunensis", Archives of Pharmacal Research, 34 (4), pp. 543-550. 35. Nusrat Shaheeen, Muhammaduzair, Bashir Ahmad Ch and Alamgeer, (2017), "Invitro Cytotoxicity Of Sanchezia Speciosa Extracts On Human Epithelial Cervical Cancer (Hela) Cell Line", Acta Poloniae Pharmaceutica Drug Research, 74 (5), pp. 1389-1394. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  47. 36. Parvin S., Rafshanjani M. A. S., Kader M. A., et al., (2015), "Preliminary phytochemical screening and cytotoxic potentials from leaves of Sanchezia speciosa Hook. f", International Journal of Advances in Scientific Research, 1 (3), pp. 145-150. 37. Paydar M., Wong Y L, Moharam B A, Wong W F, et al, (2013), "In vitro anti-oxidant and anti-cancer activity of methanolic extract from Sanchezia speciosa leaves", Pakistan Journal of Biological Sciences, 16 (20), pp. 1212-1215. 38. Phan V K, Nguyen T M, Minh C V, Nguyen H K, et al, (2010), "Two new C-glucosyl benzoic acids and flavonoids from Mallotus nanus and their antioxidant activity", Archives of Pharmacal Research, 33 (2), pp. 203- 208. 39. Rafshanjani M., Parvin S., Kader M., et al., (2014), "In vitro antibacterial, antifungal and insecticidal activities of ethanolic extract and its fractionates of Sanchezia speciosa Hook. f", International Research Journal Pharmacy, 5 (9), pp. 717-720. 40. Rasul A, Millimouno F M, Ali Eltayb W, Ali M, et al, (2013), "Pinocembrin: a novel natural compound with versatile pharmacological and biological activities", Biomedical Reseach International, 2013 pp. 379850. 41. Riaz A, Rasul A, Hussain G, Zahoor M K, et al, (2018), "Astragalin: A Bioactive Phytochemical with Potential Therapeutic Activities", Advances in Pharmacologycal Science, 2018 pp. 9794625. 42. Santos A L, Yamamoto E S, Passero L F D, Laurenti M D, et al, (2017), "Antileishmanial Activity and Immunomodulatory Effects of Tricin Isolated from Leaves of Casearia arborea (Salicaceae)", Chemical Biodivers, 14 (5). 43. Sciences W. A. o. and Sciences. W. A. o., (1922), "Journal of the Washington Academy of Sciences", Washington Academy of Sciences, 86 (3), pp. 6-3169. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  48. 44. Sciences W. A. o. and Sciences. W. A. o., (1926), "Journal of the Washington Academy of Sciences", Washington Academy of Sciences, 86 (3), pp. 9-2258. 45. Scotland RW, Vollesen K, (2000), "Classification of Acanthaceae", Kew Bulletin, 55 pp. 513-589. 46. Shalini V, Jayalekshmi A, Helen A, (2015), "Mechanism of anti- inflammatory effect of tricin, a flavonoid isolated from Njavara rice bran in LPS induced hPBMCs and carrageenan induced rats", Molecular Immunology, 66 (2), pp. 229-239. 47. Shalini V, Pushpan C K, G S, A J, et al, (2016), "Tricin, flavonoid from Njavara reduces inflammatory responses in hPBMCs by modulating the p38MAPK and PI3K/Akt pathways and prevents inflammation associated endothelial dysfunction in HUVECs", Immunobiology, 221 (2), pp. 137-144. 48. Takhtadzhian A. L., (1997), "Diversity and classification of flowering plants", Columbia University Press. 49. Tung Bui Thanh, Loi Vu Duc, Hai Nguyen Thanh , Vung Nguyen Tien, (2016), "In vitro antioxidant and anti-inflammatory activities of isolated compounds of ethanol extract from Sanchezia speciosa Leonard’s leaves", Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology, 28 (1), pp. 79- 84. 50. Yang H, Sung S H, Kim J, Kim Y C, (2011), "Neuroprotective diarylheptanoids from the leaves and twigs of juglans sinensis against glutamate-induced toxicity in HT22 cells", Planta Medica, 77 (8), pp. 841- 845. 51. Yang H H, Hwangbo K, Zheng M S, Son J K, et al, (2014), "Inhibitory effects of juglanin on cellular senescence in human dermal fibroblasts", Journal of Natural Medicines, 68 (3), pp. 473-480. 52. You O H, Shin E A, Lee H, Kim J H, et al, (2017), "Apoptotic Effect of Astragalin in Melanoma Skin Cancers via Activation of Caspases @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  49. and Inhibition of Sry-related HMg-Box Gene 10", Phytotherapy Research, 31 (10), pp. 1614-1620. 53. Zhang F X, Xu R S, (2018), "Juglanin ameliorates LPS-induced neuroinflammation in animal models of Parkinson's disease and cell culture via inactivating TLR4/NF-kappaB pathway", Biomedicine and Pharmacotherapy, 97 pp. 1011-1019. 54. Zhou G Y, Yi Y X, Jin L X, Lin W, et al, (2016), "The protective effect of juglanin on fructose-induced hepatitis by inhibiting inflammation and apoptosis through TLR4 and JAK2/STAT3 signaling pathways in fructose-fed rats", Biomedicine and Pharmacotherapy, 81 pp. 318-328. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU