Khóa luận Nghiên cứu chế tạo hệ dẫn thuốc nano Paclitaxel phối hợp Curcumin và đánh giá tác động của chúng lên các tế bào ung thư

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu chế tạo hệ dẫn thuốc nano Paclitaxel phối hợp Curcumin và đánh giá tác động của chúng lên các tế bào ung thư

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC LÊ THỊ HẢO NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HỆ DẪN THUỐC NANO PACLITAXEL PHỐI HỢP CURCUMIN VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA CHÚNG LÊN CÁC TẾ BÀO UNG THƯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH-2012 NGƯỜI HƯỚNG DẪN 1. TS. HÀ PHƯƠNG THƯ 2. PGS.TS. DƯƠNG THỊ LY HƯƠNG Hà Nội – 2017
2. LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô đã giảng dạy không những về mặt kiến thức mà còn cả kinh nghiệm để em có một kiến thức nền vững chắc trong suốt 5 năm học vừa qua. Tiếp theo em xin bày tỏ sự tri ân và lòng biết ơn sâu sắc đến: 1. TS. Hà Phương Thư – Trưởng phòng vật liệu nano Y Sinh, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2. PGS.TS Dương Thị Ly Hương – Bộ môn Dược lý – Dược Lâm Sàng, Khoa Y – Dược Đại học Quốc Gia Hà Nội. 3. Ths. Đỗ Hải Đoan, Phòng vật liệu nano Y Sinh, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cũng như tạo những điều kiện về tài liệu tham khảo, phòng thí nghiệm cũng như kinh phí của đề tài để em có thể hoàn thành khóa luận này trong những điều kiện tốt nhất. Em xin cảm ơn đề tài cấp viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, MS. VAST03.04, 2016-2017 (chủ nhiệm TS. Hà Phương Thư) đã tài trợ kinh phí giúp em thực hiện đề tài nghiên cứu của mình. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn bộ các anh chị thuộc Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đặc biệt các anh chị thuộc phòng vật liệu nano Y Sinh đã giúp đỡ, hỗ trợ em trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận này. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm động viên, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Dù đã rất cố gắng nhưng khóa luận của em vẫn khó tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy em rất mong nhận được những ý kiến phản hồi từ phía các thầy cô để khóa luận thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn! Sinh Viên Lê Thị Hảo
3. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Diễn giải CMC Nồng độ micel tới hạn CUR Curcumin DCM Dichloromethan EE% Hiệu suất mang thuốc EtOH Ethanol FDA Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ FTIR Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier L-LA L-lactic acid NF-κB Yếu tố nhân Kappa B PCL Poly- caprolacton PEG Poly ethylen glycol PGA Poly glycolic acid PLA Poly Lactid PLGA Poly lactic-co-glycolic acid TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua TPGS Tocopheryl polyethylen glycol 1000 succinat
4. DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên Hình Trang Hình 1 Cơ chế nhắm đích bị động và chủ động của hệ 5 phân phối thuốc có kích thước nano Hình 2 Cấu tạo của axit olic 6 Hình 3 ức độ biểu hiện của thụ thể olat trên các mô 7 thường và khối u Hình 4 ột số hệ phân phối thuốc cấu trúc nano 10 Hình 5 Cấu trúc mixen tạo nên bởi copolyme (dạng di- 11 block) không mang thuốc (a) và mang thuốc (b) Hình 6 Công thức hóa học của PTX 12 Hình 7 Công thức hóa học của Cur 13 Hình 8 Cấu trúc của L-LA 15 Hình 9 Công thức của TPGS 16 Hình 10 Công thức của copolyme PLA-TPGS 17 Hình 11 Hình ảnh của các hạt nano (PTX+Cur)/PLA- 17 TPGS Hình 12 Copolyme PLA-TPGS được tạo bởi monome L- 19 LA và TPGS. Hình 13 Phổ hồng ngoại FTIR của nano (Cur+PTX)- 23 PLA-TPGS-Fol với 5 tỉ lệ khác nhau giữa PLA và TPGS Hình 14 Phổ hồng ngoại FTIR của (1) Cur, (2) PTX, (3) 24 Acid folic, (4) PLA-TPGS 1:1 và (5) (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol với tỉ lệ PLA- TPGS 1:1 Hình 15 Hình ảnh FESEM của nano (Cur+PTX)-PLA- 28 TPGS-Fol với 5 tỉ lệ khác nhau giữa PLA và TPGS (a) 1:1, (b) 2:1, (c) 1:3, (d) 2:1, (e) 3:1 Hình 16 Thế zeta của hạt nano (Cur +PTX) PLA-TPGS- 30 Fol tại các tỉ lệ của PLA và TPGS: 1:3 (a), 1:2 (b), 1:1 (c), 2:1 (d), 3:1 (e) Hình 17 Phương trình đường chuẩn của Cur và PTX 31
5. DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1 Tỉ lệ và khối lượng của PLA và TPGS thực 20 nghiệm Bảng 2 Các dao động đặc trưng của các chất 21 Bảng 3 Các dao động đặc trưng của các chất 25 Bảng 4 Thế zeta của hệ nano tại 5 tỉ lệ khác nhau của 28 PLA-TPGS Bảng 5 Hiệu suất bọc thuốc của Curcumin và Paclitaxel 31 Bảng 6 Kết quả gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào được 32 chọn
6. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về ung thư 3 1.2. Tổng quan về hệ phân phối thuốc mới - hệ nano 4 1.2.1. Cơ chế hướng đích của hệ phân phối thuốc nano 5 1.2.2. Các vật liệu có thể dùng để tạo ra chất mang nano 8 1.3. Hệ phân phối thuốc nano mang đồng thời Paclitaxel và Curcumin dựa trên copolyme PLA-TPGS ((Cur+PTX)-PLA-TPGS) 11 1.3.1. Paclitaxel 12 1.3.2. Curcumin 13 1.3.3. Tác dụng hiệp đồng của Curcumin và Paclitaxel 14 1.3.4. Tổng quan về hệ micel copolyme PLA-TPGS 15 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu 19 2.2. Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1. Tổng hợp copolyme PLA-TPGS 19 2.2.2. Chuẩn bị dung dịch TPGS gắn với folat 21 2.2.3. Tổng hợp hạt nano (Cur + PTX)-PLA-TPGS gắn folat 21 2.2.4. Hiệu suất bọc thuốc (EE%) 22 2.2.5. Đánh giá các đặc trưng vật liệu 23 2.2.6. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào 23 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1. Tính đặc trưng vật liệu 24 3.1.1. Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier (FTIR) 24 3.1.2. Hình thái và kích thước 27 3.2.3. Thế zeta 29 3.2. Hiệu suất bọc thuốc (EE %) 32
7. 3.3. Thử nghiệm gây độc tế bào 33 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO
8. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư hiện nay vẫn đang là một trong các nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Sự phát triển của ung thư trong những năm gần đây đang thực sự là một mối lo ngại lớn đối với các quốc gia trên thế giới và thu hút được quan tâm rất lớn, không chỉ trong cộng đồng khoa học, đặc biệt là dược sĩ, các nhà sinh học và hóa học, mà còn trong cộng đồng nói chung. Việc chữa trị ung thư tiêu tốn rất nhiều công sức và tiền bạc. Tuy nhiên, các thuốc điều trị ung thư truyền thống thường thiếu tính đặc hiệu đối với những tế bào ung thư và có độ tan trong nước thấp. Chúng không những tiêu diệt tế bào ung thư mà còn tiêu diệt cả những tế bào khỏe mạnh của cơ thể, do đó không đem lại hiệu quả chữa trị cao và gây nên nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng. Do đó, nhu cầu cấp bách là cần phát triển phương pháp điều trị ung thư không có hoặc rất ít tác dụng phụ đến các tổ chức lành. Sự phát triển vượt trội của công nghệ nano trong thời gian gần đây đã tạo ra những bước tiến đáng kể trong tất cả các lĩnh vực của khoa học công nghệ. Trong ngành dược, các hệ phân phối thuốc nano đã cho thấy những ưu thế vượt trội so với những hệ phân phối thuốc truyền thống. Các hệ phân phối thuốc nano có thể hướng đích tác dụng chọn lọc tới các tế bào, khối u ung thư theo hai cơ chế: hướng đích thụ động và hướng đích chủ động, nhờ đó giảm thiểu tối đa tác dụng phụ của thuốc đến mô lành đồng thời tăng hiệu quả điều trị, giảm liều thuốc cần sử dụng. Song song với đó, sử dụng kết hợp các loại thuốc trong điều trị ung thư cũng được xem như là một hướng tiếp cận đầy tiềm năng. Phối hợp thuốc trong điều trị ung thư có thể tạo nên tác dụng hiệp đồng, giúp tăng hiệu quả trị liệu, giảm thiểu tác dụng phụ, giảm liều dùng, ngăn chặn hoặc giảm hiện tượng kháng đa thuốc. Paclitaxel (PTX) là một trong những thuốc điều trị ung thư truyền thống được chiết xuất từ vỏ của cây Taxus brevifolia, dùng để điều trị nhiều 1
9. bệnh ung thư như ung thư vú, buồng trứng, phổi [41]. Tuy nhiên, việc sử dụng PTX trong điều trị gây ra nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng như phản ứng quá mẫn, gây độc thần kinh, mắt v.v Điều đó có thể do độ tan trong nước thấp của PTX cũng như tính chọn lọc đến các tế bào khối u kém [26,41]. Để giải quyết vấn đề này, cần làm tăng độ tan trong nước của PTX và hạn chế tối đa tác dụng có hại đến cơ thể. Curcumin(Cur) là một chất polyphenol màu vàng được chiết xuất từ rễ của cây nghệ (Curcuma longa) sống phổ biến ở vùng khí hậu nhiệt đới Đông Nam Á [39]. Cur đã được chứng minh không những có tác dụng chống oxy hóa mạnh mà còn diệt được các tế bào ung thư với rất ít độc tính[3,12,45]. Sự kết hợp của Cur và PTX cho tác dụng hiệp đồng ức chế sự phát triển của các khối u do Cur ngăn cản PTX hoạt hóa yếu tố nhân Kappa B, là yếu tố làm bất hoạt sự chết theo chương trình của tế bào [18]. Hơn nữa, Cur còn có khả năng ức chế hoạt động của bơm tống thuốc P-Glycoprotein – một trong các cơ chế của tế bào ung thư kháng lại PTX – nhờ đó tăng hiệu quả trị liệu của PTX. Tuy nhiên Cur cũng có độ tan trong nước thấp và nhanh bị đào thải ra khỏi cơ thể nên ứng dụng trong lâm sàng để điều trị ung thư bị giới hạn đáng kể [7]. Bởi những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “ Nghiên cứu chế tạo hệ dẫn thuốc nano Paclitaxel phối hợp Curcumin và đánh giá tác động của chúng lên các tế bào ung thư” với mục tiêu: 1). Bào chế hệ nano trên cơ sở copolyme PLA - TPGS mang đồng thời PTX và Cur và gắn yếu tố hướng đích olat. 2). Đánh giá hiệu quả tác động của hệ trên một số tế bào ung thư. 2
10. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về ung thư Ung thư là một thuật ngữ chung cho một nhóm lớn các bệnh có thể ảnh hưởng đến bất kỳ phần nào của cơ thể. Các thuật ngữ khác được sử dụng là các khối u ác tính và u. ột đặc tính của ung thư là tạo nhanh các tế bào bất thường phát triển vượt ra ngoài phạm vi thông thường của chúng, và sau đó có thể xâm nhập vào các bộ phận liền kề của cơ thể và lây lan đến các cơ quan khác, quá trình thứ hai được gọi là di căn. Di căn là những nguyên nhân chính gây tử vong do ung thư . Tỷ lệ ung thư có xu hướng tăng nhanh ở phần lớn các nước trên thế giới. Tổ chức Y tế thế giới(WHO) nhận định đây là đại dịch đang xảy ra trong hiện tại. Ước tính mỗi năm trên toàn cầu có hơn 14,1 triệu người mới mắc và 8,2 triệu người chết do ung thư, trong đó gần 70% là ở các nước đang phát triển và có thể tăng gấp đôi lên 14,6 triệu người vào năm 2035. Số lượng các trường hợp mới mắc được dự kiến sẽ tăng khoảng 70% trong 2 thập kỷ tới. Hiện khoảng 23 triệu người đang sống với ung thư. Nếu không có các biện pháp can thiệp kịp thời thì các con số này sẽ tăng lên 30 triệu vào năm 2020. Và cũng theo WHO, trong 178 quốc gia, vùng lãnh thổ có tỷ lệ mắc và tử vong do ung thư nhiều nhất thế giới, Việt Nam đứng thứ 78. Năm bệnh ung thư phổ biến nhất ở Việt Nam là ung thư gan, phổi, dạ dày, ung thư vú và ung thư trực tràng [15]. Các phương pháp điều trị ung thư phổ biến hiện nay là phẫu thuật, xạ trị và hóa trị. Trong hóa trị liệu, các dược chất phổ biến như cisplatin, mitoxantron, estramustin, doxorubicin, etoposid, vinblastin, paclitaxel,vinorelbin, hoặc kết hợp các loại thuốc với nhau đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị ung thư và cũng đã cải thiện chất lượng cuộc sống [8,31,34]. Tuy nhiên, bên cạnh hiệu quả trong diệt tế bào ung thư, các thuốc này còn gây nhiều tác dụng không mong muốn trên tế bào lành. Do đó, công cuộc tìm kiếm các thuốc mới, các liệu pháp điều trị mới, hoặc phối hợp các 3
11. dược chất với nhau để nâng cao hiệu quả điều trị, giảm thiểu tác dụng không mong muốn vẫn đang là một thách thức đặt ra với các nhà khoa học. Do đó, một nhu cầu cấp bách là cần tìm ra phương pháp điều trị ung thư không có hoặc rất ít tác dụng phụ đến các cơ quan bình thường. 1.2. Tổng quan về hệ phân phối thuốc mới - hệ nano Nhiều hệ phân phối thuốc đã và đang được nghiên cứu và phát triển nhằm tăng khả năng vận chuyển và giải phóng thuốc tại những vùng khối u mang bệnh và do đó giảm thiểu những tác động xấu tới những cơ quan của cơ thể. Trong đó hệ phân phối thuốc nano có tiềm năng ứng dụng rất cao, thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu và phát triển. Công nghệ nano liên quan đến việc thiết kế, phân tích, bào chế các vật liệu trong đó có ít nhất một chiều có kích thước từ 1-100 nm. Các vật liệu nano có diện tích bề mặt lớn so với thể tích, các tính chất hóa, lý, sinh học của chúng cũng rất khác biệt so với các vật liệu có kích thước lớn. Những tính chất siêu việt này đã mở ra những cơ hội mới trong việc ứng dụng công nghệ nano trong các lĩnh vực như y học và sinh học. Nhờ đó, thuật ngữ “y học nano” đã được hình thành [28]. Mục tiêu của y học nano là áp dụng của công nghệ nano vào y học cho việc phòng bệnh, chẩn đoán và trị liệu bằng cách dùng vật liệu nano để thao tác các hệ thống sinh học ở mức độ tế bào hay xuống thấp hơn nữa ở cấp độ phân tử. Những nghiên cứu trong y học nano phần lớn liên quan đến việc mang thuốc đến các tế bào bệnh và chẩn đoán bệnh ở mức phân tử. Với kích thước cỡ nano mét, các hệ phân phối thuốc nano không chỉ giúp cải thiện tính tan của các thuốc không tan mà còn có khả năng tập trung thuốc tại vùng khối u thông qua hai cơ chế hướng đích: bị động và chủ động. 4
12. Hướng đích chủ động Tế bào ung thư Nhập bào Tế bào nội mô Hoạt chất có hoạt tính Giải phóng hoạt chất trong tế bào Hướng đích bị động Mạch bạch huyết Hình 1: Cơ chế nhắm đích bị động và chủ động của hệ phân phối thuốc có kích thước nano 1.2.1. Cơ chế hướng đích của hệ phân phối thuốc nano * Hướng đích bị động Các nhà khoa học đã nhận thấy có sự khác biệt giữa vùng mô bình thường khoẻ mạnh và mô ung thư, tế bào của vách huyết quản trong vùng mô khoẻ mạnh có sự liên kết rất khít khao, trong khi đó ở vách huyết quản của mô ung thư xuất hiện những khoảng hở có kích cỡ khoảng 600-800 nm. Phân tử thuốc tự do có thể đi xuyên vách thông qua sự thẩm thấu và khuếch tán tự động, có tác dụng và tiêu diệt các tế bào khỏe mạnh lẫn tế bào ung thư mà không phân biệt. Ngược lại, nếu thuốc đưa vào cơ thể dưới dạng hạt có kích thước nano, độ lớn của hạt không cho nó đi qua vách huyết quản của mô bình thường nhưng có thể chui lọt qua những khoảng hở đi vào khối u ung thư [5]. Các nhà toán học còn có thể tính toán hình dạng tối ưu làm sao để hạt có thể 5
13. chui qua kẽ hở huyết quản với số lượng tối đa. Từ đó làm gợi ý đến việc nghiên cứu phát triển các thuốc điều trị ung thư được bọc trong các hạt kích thước nano nhằm tăng tính hướng đích, dẫn đến tăng hiệu quả điều trị bệnh. Khi được đưa vào cơ thể, hạt nano mang thuốc sẽ theo hệ thống tuần hoàn qua mạch máu để đến mô đích. Kích cỡ của hạt mang thuốc là một yếu tố quan trọng cho việc vận chuyển thuốc. Kích cỡ này phải trong phạm vi từ 4 đến 400 nm. Nếu nhỏ hơn 4 nm, hạt sẽ nhanh chóng bị thải ra theo đường bài tiết. Nếu lớn hơn 400 nm, hạt sẽ bị hệ thống miễn dịch phát hiện và loại trừ ra khỏi cơ thể. * Hướng đích chủ động: Cơ chế hướng đích chủ động dựa trên những liên kết đặc hiệu cuả các thụ thể có mặt trên tế bào ung thư đối với các tác nhân hướng đích đặc hiệu đối với các thụ thể đó. ối loại tế bào ung thư sẽ có một hoặc nhiều thụ thể đặc hiệu. Để đạt được khả năng nhắm đích có tính chọn lọc cao, những hệ phân phối thuốc có thể được gắn với các yếu tố hướng đích như: hormon, kháng thể, và những dẫn xuất của vitamin [27]. Trong đó hệ gắn thuốc với axit olic được nghiên cứu ứng dụng nhiều trị liệu ung thư [24]. Axit folic Hình 2. C u t củ it ic Axit folic (Hình 2) là một vitamin rất cần thiết cho các quá trình sinh tổng hợp nucleotid, vì vậy, nó được sử dụng để kéo dài quá trình sống 6
14. của tế bào. Tế bào thường vận chuyển folat qua màng thông qua những thụ thể của folat (folat-receptor ( )). Những thụ thể của folat ( ) thường được biểu hiện quá mức ở tế bào ung thư giúp những tế bào ác tính được cung cấp đầy đủ nhu cầu vitamin cho sự phát triển của chúng [33]. Thụ thể folat (FR) : Thụ thể olat của người (khối lượng cỡ 38 kDa) bao gồm 3 dạng - , - , và - . ỗi dạng có khả năng bám dính khác nhau đối với olat. Hằng số phân ly KD của mỗi dạng đối với olat lần lượt là: FR- = 0,1 n , FR- = 1 n , - = 0,4 n . Hằng số phân ly càng nhỏ cho thấy khả năng bám dính càng cao. Vì có ái lực cao đối với olat, nên thụ thể - là đối tượng được nghiên cứu khá kĩ trên các dòng tế bào ung thư. - chỉ biểu hiện ở mức độ rất thấp trên các mô thường, song lại biểu hiện rất cao ở các mô thư ác tính như: ung thư buồng trứng, ung thư dạ con, ung thư não, thận ức độ biểu hiện của thụ thể olat được biểu hiện qua lượng olat bám trên một mg protein được tách ra từ các mô, khối u tương ứng. Mức độ biểu hiện của thụ thể folat ở mô khối u cao hơn nhiều so với mô lành (Hình 3). Các nhà khoa học có thể tận dụng các đặc điểm này để gắn folat lên các hệ phân phối thuốc, giúp tăng khả năng bám dính của những hệ dẫn thuốc này lên tế bào ung thư, qua đó tăng nồng độ của thuốc tại những vùng khối u và giảm thiểu nồng độ của thuốc tại những cơ quan, tế bào lành. Hình 3: M c độ bi u hiện củ th th t t ên m thư ng và khối u. 7
15. Cơ chế: Sau khi bám lên những thụ thể folat nằm trên bề mặt của tế bào ung thư, những hệ gắn folat sẽ được tiếp nhận và vận chuyển vào bên trong tế bào, tới những cơ quan nội bào gọi là endosom. Những endosom này có pH nằm trong khoảng từ 4.3 đến 6.9, phổ biến nhất là 5.0. pH của endosom có ảnh hưởng tới việc gắn của hệ olat vào thụ thể. Khi pH < 5 một số hệ gắn folat sẽ bị tách ra khỏi thụ thể folat và tồn tại bên trong tế bào. Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, tổng số hệ gắn folat được nhập bào sẽ gần như tỉ lệ thuận với số lượng thụ thể folat được biểu hiện trên một tế bào và tốc độ tiếp nhận những hệ gắn folat của một tế bào ung thư trung bình là 1-3 105 phân tử tế bào giờ [42]. Kết hợp copolyme và folat để tạo ra một hệ phân phối thuốc cấu trúc nano có khả năng hướng đích chủ động Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu được tiến hành dựa trên việc kết hợp copolyme và olat để tạo ra các hệ phân phối thuốc nano hướng đích mang lại nhiều tác dụng có lợi như các liposom, phức hợp polymer-thuốc, hạt nano lipid, và micel copolymeric. Ví dụ, năm 2011, ing - Fa - Hsieh cùng đồng nghiệp đã tiến hành tổng hợp hệ phân phối thuốc nano doxorubicin dựa trên copolyme poly(ethylen glycol)-poly )-poly(ethylen glycol) gắn yếu tố hướng đích olat ứng dụng trong điều trị ung thư vú [11]. Hay Wang J, Liu W cùng các cộng sự năm 2011 cũng đã tiến hành tổng hợp hệ phân phối thuốc có yếu tố hướng đích olat được tổng hợp từ monomethoxy-poly(ethylen glycol)- b-poly(lactid)-paclitaxel (MPEG-PLA-paclitaxel) và d- -tocopheryl polyethylen glycol 1000 succinat (TPGS)- olat đã chứng minh acid folic tăng cường khả năng phân phối thuốc của hệ nano mang thuốc điều trị ung thư đến các tế bào ung thư [47]. 1.2.2. Các vật liệu có thể dùng để tạo ra chất mang nano Để chế tạo được những hệ phân phối thuốc điều trị ung thư có khả năng nhắm đích tới tế bào ung thư như vậy, có hai vấn đề lớn được đặt ra. Thứ 8
16. nhất, những loại vật liệu nào phù hợp để có khả năng tạo ra những hệ chất mang có kích thước nano, có khả năng tương hợp sinh học cao, an toàn cho người bệnh. Thứ hai, lựa chọn những phối tử nào đặc hiệu đối với những thụ thể đặc trưng đối với từng loại tế bào ung thư là việc rất quan trọng quyết định tới khả năng nhắm đích và tính chọn lọc của việc điều trị. Những hệ vật liệu sử dụng để bào chế những hệ phân phối thuốc phải có khả năng tương thích sinh học cao, bảo vệ thuốc chống lại các quá trình chuyển hóa và thải trừ trong cơ thể thông qua sự hoạt động của các loại enzyme, không gây những phản ứng miễn dịch trong cơ thể và không gây độc cho cơ thể. Có thể chia những vật liệu được sử dụng trong việc dẫn truyền thuốc làm 3 loại [23]: - Các hạt vô cơ có cấu trúc xốp ( hạt SiO2 xốp) hoặc rỗng ( hạt vàng rỗng) - Các loại polyme thiên nhiên hoặc polyme tổng hợp - Các hệ mang sinh học: virus Một số hệ phân phối thuốc được tạo thành từ polyme được liệt kê trong Hình 4. Trong số đó, các polyme được sử dụng để tạo chất mang nano dưới dạng polymeric micel. Trong đó các polyme phân hủy sinh học vẫn được sử dụng rộng rãi hơn cả. Các polyme phân hủy sinh học như poly- caprolacton (PCL), poly lactid (PLA), poly glycolic acid (PGA), poly e-caprolacton, poly lactic-co-glycolic acid (PLGA). Những polyme này đã được cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ FDA, chứng minh là phân hủy sinh học, được sử dụng trong nhiều nghiên cứu do có độc tính thấp với cơ thể. Với tính chất kỵ nước giúp chúng có khả năng vận chuyển những loại thuốc ít tan trong nước lớn nhưng đồng thời khả năng phân tán trong nước rất hạn chế, và tốc độ phân hủy thấp trở thành rào cản để sản xuất hệ phân phối thuốc mới tiên tiến [46]. Vì vậy, thông thường, khi sử dụng các loại polyme này như một hệ phân phối thuốc, người ta thường sử dụng các chất nhũ hóa nhằm làm tăng khả năng phân tán của hệ trong môi trường cơ thể, qua đó làm tăng khả năng 9
17. lưu thông trong hệ tuần hoàn. ặc dù vậy, khi sử dụng các chất nhũ hóa, kích thích của hệ mang thuốc thường lớn, không nằm trong vùng kích thước từ 200-800 nm. Vì vậy, chúng dễ bị bắt giữ bởi các đại thực bào và bị phân hủy bởi các enzyme trong hệ thống bài tiết của cơ thể. Đồng thời, với kích thước lớn, khả năng phân tán của những hệ phân phối thuốc này vào những vùng khối u ung thư bị giảm xuống. Hạt nano polyme Micel polyme Phức hợp polyme - thuốc/protein Hoạt chất Phối tử hướng đích điều trị Hình 4: Một số hệ phân phối thuốc c u t úc n n [37]. Để khắc phục nhược điểm này, các nhà khoa học đã tạo ra những copolyme. Micel copolyme hoạt động như các chất mang nano với nhiều thuận lợi, chẳng hạn như có độc tính thấp, tính ổn định cao và kích thước nhỏ. Copolyme lưỡng tính, trong công thức gồm các cấu trúc kỵ nước và ưa nước. Trong môi trường nước, chúng có thể tự tập hợp thành những cấu trúc vỏ- lõi 10
18. được gọi là micel copolymeric (Hình 5). Lõi kỵ nước có thể được coi như là vi môi trường để kết hợp các loại thuốc kỵ nước và bảo vệ chúng khỏi bị phá hủy trong khi lớp vỏ tham gia vào việc ổn định và cải thiện thời gian lưu của các micel trong các hệ thống tuần hoàn [9]. Phần ưa nước Phần kị nước Hình 5. C u t úc micel t nên bởi c p yme (d ng di-b ck) kh ng m ng thuốc ( ) và m ng thuốc (b). ột số polyme ưa nước như poly lactic acid (PLA) hoặc tocopheryl polyethylen glycol 1000 succinat (TPGS) có thể được kết hợp để làm tăng tốc độ phân hủy, giảm tính kỵ nước của các polyme phân hủy sinh học này, để tạo ra các hệ thống copolymeric micel mới cũng đã được đưa vào nghiên cứu. 1.3. Hệ phân phối thuốc n n m ng đồng th i P c it e và Cu cumin dự t ên copolyme PLA-TPGS ((Cur+PTX)-PLA-TPGS) Bên cạnh việc nghiên cứu và phát triển những hệ phân phối thuốc mới, một loạt các hợp chất tự nhiên có tác dụng chống ung thư kết hợp với các loại thuốc điều trị ung thư đang được điều trị phổ biến hiện nay vào các hệ phân phối thuốc nano cũng đang được nghiên cứu, phát triển, trong đó sự kết hợp giữa Cur và PTX vẫn đang thu hút được nhiều sự quan tâm, nghiên cứu từ các dược sĩ, nhà khoa học. 11
19. 1.3.1. Paclitaxel PTX (Hình 6) được chiết xuất từ vỏ cây Taxus brevifolia, là một trong những chất trị liệu hóa học hiệu quả nhất trong điều trị nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư buồng trứng, vú, đại tràng, bàng quang, thực quản, phổi, đa u tủy và ung thư Kaposi [41].Tuy nhiên, do độ hòa tan kém (độ tan dưới 0,5mg/L) và chỉ số điều trị thấp, ứng dụng lâm sàng của PTX là vẫn còn hạn chế. Bệnh nhân sau khi dùng PTX đều bị rụng tóc, hơn 90% bênh nhân bị suy tủy Một số bệnh nhân bị các phản ứng phụ như như sung huyết, ngoại ban (39%), kém ăn (25%), phù ngoại biên (10%)[13]. Vì vậy, vấn đề đặt ra là làm sao nâng cao tính tan, nâng cao hiệu quả trị liệu của PTX đồng thời làm giảm những hiệu ứng phụ do loại thuốc này gây ra. Theo Sang Cheon Lee và cộng sự, copolyme dựa trên poly ethylen glycol và poly(2-(4-vinylbenzyloxy)-N,N-diethylnicotinamid) đã có tác dụng làm tăng độ tan của PTX [25]. Hình 6. C ng th c hó học củ PTX 12
20. 1.3.2. Curcumin Curcumin (Cur) [1,7-Bis (4-hydroxy-3-medithoxyphenyl) -1,6- heptadien-3,5-dion] (Hình 7), một hợp chất màu vàng phân lập từ thân rễ cây nghệ Curcuma longa. Cur nhận được sự quan tâm lớn từ các nhà khoa học vì khả năng phòng ngừa ung thư của nó [6,19]. Hình 7. C ng th c hó học của Cur Bột nghệ từ lâu đã được sử dụng trong ẩm thực Ấn Độ và trong y học truyền thống châu Á để điều trị chứng khó tiêu hóa và viêm khớp. Curcumin 13
21. chiết xuất từ củ nghệ không chỉ là một chất chống oxy hóa mạnh, một hợp chất chống viêm mà còn có tác dụng phòng và điều trị ung thư. Nhiều sản phẩm từ curcumin đã được tổng hợp để điều trị ung thư (ung thư ruột, da, vú, dạ dày, buồng trứng, tuyến tiền liệt, dạ dày, loét tá tràng, vv) [1,2,10,44]. ặc dù curcumin đã được chứng minh là không độc hại và có các tác dụng chống ung thư đầy hứa hẹn nhưng ứng dụng của nó vẫn bị hạn chế do khả năng hòa tan trong nước và sinh khả dụng kém [48]. Theo kết quả nghiên cứu của Donatella Paolino và các cộng sự được công bố vào năm 2016, sử dụng copolyme methacrylic có thể làm tăng độ tan cũng như sinh khả dụng đường uống của curcumin [32]. 1.3.3. Tác dụng hiệp đồng của Curcumin và Paclitaxel Một số nghiên cứu đã được tiến hành nhằm tìm ra rằng liệu có bất cứ tác dụng hiệp đồng nào giữa Cur và PTX hay không. Và kết quả của những nghiên cứu này chỉ ra rằng thực sự giữa chúng có tác dụng hiệp đồng để làm tăng hiệu quả ức chế khối u qua trung gian NF-kappa B (NF-κB ). NF-κB là một protein phức tạp, có vai trò kiểm soát sự phiên mã của ADN, sự sản xuất cytokin, đáp ứng miễn dịch, trong nhiễm trùng virus và khả năng sống của tế bào chúng có mặt trong rất nhiều loại tế bào người và động vật. Trong các tế bào bình thường, thì NF-κB không được hoạt hóa nên đáp ứng của tế bào với quá trình apoptosis (quá trình tế bào tự chết theo chương trình) vẫn diễn ra bình thường. Đó là bởi vì N -κB hoạt hóa sẽ kiểm soát gen anti-apoptosis đặc biệt là T A 1 và T A 2, do đó loại bỏ hoạt động của họ enzym caspase - đóng vai trò chính trong các quá trình apoptosis. Việc ức chế NF-κB có thể làm tế bào ngừng phân chia, tăng trưởng, gây chết hoặc trở nên nhạy cảm hơn với các thuốc điều trị ung thư [23]. Hầu hết các chất điều trị ung thư đều hoạt hóa NF-kappa B trong đó có PTX. Và Cur thì đã ức chế PTX trong quá trình hoạt hóa N -kappa B và làm tăng hiệu quả ức chế khối u tăng sinh của PTX trong dòng tế bào ung thư vú 14
22. MDA-MB-231. Sự kết hợp của Cur và PTX cho phép suy ra sự ức chế tốt hơn về sự tăng sinh tế bào, làm tế bào tự chết theo chương trình nhiều hơn khi so sánh với việc chỉ dùng hoặc PTX hoặc Cur đơn thuần [18]. 1.3.4. Tổng quan về hệ micel copolyme PLA-TPGS PLA Poly-lactic acid (PLA) (Hình 8) là một polyme phân hủy sinh học và tương thích sinh học, được sử dụng rộng rãi trong y sinh học để làm cho chất mang nano an toàn và phân hủy sinh học để điều trị ung thư. Cục Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ ( DA) đã chấp thuận sử dụng của chúng trong các hệ thống phân phối thuốc. Các monome của PLA tức là, L-lactic acid (L-LA), mà có thể được tạo ra một cách hiệu quả bởi việc lên men từ các nguồn tái tạo được như tinh bột và đường. PLA phân hủy đến monome của nó, L-LA, là một chất chuyển hóa bình thường của con người [46]. Hình 8. C u t úc củ L-LA TPGS TPGS (D- -tocopheryl polyethylen glycol 1000 succinat) (Hình 9) được DA chấp thuận là dẫn xuất tan trong nước tự nhiên của Vitamin E (PEGylated vitamin E). TPGS không tích điện và rất ưa nước, được sử dụng như chất làm tăng độ tan, tăng cường hấp thụ và làm chất mang cho các công thức khác nhau. TPGS chủ yếu được nghiên cứu trong liposom và hạt nano 15
23. polyme, giúp tăng cường sự hấp thu của tế bào, tăng khả năng gây độc tế bào và cho thấy thời gian lưu kéo dài [22,30]. TPGS dễ hấp thụ trong ống tiêu hóa, và ức chế P-glycoprotein là thụ thể vận chuyển đa thuốc, ở trong ruột tăng cường khả năng gây độc của chất chống ung thư như doxorubicin, vinblastin, paclitaxel và curcumin [49,50]. Tiềm năng quan trọng đã được chứng minh cho TPGS là trong ứng dụng hạt nano và các công nghệ dựa trên lipid để phân phối thuốc. Cấu trúc hóa học của vitamin E TPGS gồm cả phần thân dầu và phần thân nước, dẫn đến nó có tính chất amphiphilic. Hơn nữa, đuôi alkyl ưa mỡ và phần đầu ưa nước là cồng kềnh và có diện tích bề mặt lớn. Đặc điểm như vậy khiến nó trở thành một chất nhũ hóa tốt, có khả năng nhũ hóa một loạt các hệ thống thân nước- dầu không thể trộn lẫn. Hình 9. C ng th c của TPGS Hệ micel PLA - TPGS được tổng hợp dựa trên sự kết hợp của monome acid L-lactic (L-LA) đã được chứng minh là phân hủy sinh học nên an toàn cho cơ thể [46] và D-a-tocopheryl polyethylen glycol 1000 succinat (TPGS) có nguồn gốc từ vitamin E. Hệ có cấu trúc vỏ-lõi, với lớp vỏ ưa nước (TPGS) và phần lõi kị nước (PLA) giúp làm tăng độ tan trong nước của các thuốc có độ tan thấp. Copolyme PLA-TPGS (Hình 10) đã được ứng dụng vào nhiều hệ phân phối thuốc nano bởi tính an toàn, phân hủy sinh học tự nhiên, khả năng 16
24. hướng đích tốt, cũng như dễ dàng tổng hợp được. Thêm vào đó, TPGS được hấp thu một cách dễ dàng trong đường tiêu hóa và cũng có khả năng ức chế P- glycoprotein, là một protein vận chuyển đa thuốc từ trong tế bào chất ngược trở ra để bài tiết vào đường ruột. Do đó cải thiện khả năng gây độc tế bào của nhiều hợp chất chống ung thư như doxorubicin, paclitaxel và curcumin [4,29]. Hình 10. C ng th c của copolyme PLA-TPGS Cơ chế m ng thuốc và c p yme PLA- TPGS Đối với các micel copolyme PLA- TPGS lõi kỵ nước gồm chuỗi PLA và đuôi alkyl thân nước của TPGS nên có thể bọc nhiều phân tử trị liệu nhỏ kị nước. Cur và PTX đã được đóng gói vào các lõi vì kị nước của nó thông qua sự tương tác kỵ nước, lực Van der Waals, vv. cung cấp một bề mặt ổn định giữa thuốc và môi trường nước ngoài [22] (Hình 11). 17
25. PTX Hình 11. Hình ảnh củ các h t nano (PTX+Cur)/PLA-TPGS 18
26. CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, đối tượng nghiên c u Tế bào: Dòng Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan) Dòng HeLa (HeLa cancer cell line – Dòng tế bào ung thư HeLa) Dòng LU-1 (Human lung adenocarcinoma – Ung thư biểu mô phổi) Dòng Vero (Vero cells – Tế bào biểu mô thận khỉ). Các tế bào trên được lấy từ Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn Lâm. Hóa chất: Acid lactic (3,6-dimethyl-1,4-dioxan-2,5-dion, C6H8O4), D-a- Tocopheryl polyetylen glycol 1000 succinat (C33O5H54, vitamin E TPGS hay TPGS), N-hydroxysuccinimid (NHS), 1-[3-dimethylamino) propyl]-3- ethylcarbodiimid hydrochlorid (EDC), Thiếc Octoat (Sn(OOCC7H15)2), Toluen, Dichlometan, Metanol, Ethanol, Curcumin, Paclitaxel. Các hóa chất (trừ Cur) đều được mua từ Sigma- Aldrich và đạt độ sạch phân tích. iêng Cur được mua từ viện hóa học, Viện Khoa học vật liệu, Viện Hàn Lâm. PTX được mua từ Sigma- Aldrich và đạt độ sạch phân tích, số lô 1537678. Nước cất được sử dụng trong suốt quá trình thí nghiệm. 2.2. Phương pháp nghiên c u 2.2.1. Tổng hợp copolyme PLA-TPGS Copolyme PLA-TPGS (Hình 12) được tổng hợp bằng phương pháp mở vòng trùng hợp của L-LA và TPGS với sự có mặt của chất xúc tác octoat thiếc [Sn (Oct)2] [38]. Tóm tắt, L-LA và TPGS với những tỉ lệ xác định được cho vào một bình đáy tròn 50ml, và được hòa tan trong 20ml toluen cũng 19
27. được cho vào bình, hỗn hợp được đun nóng và khuấy bằng máy khuấy từ. Khi o nhiệt độ đạt đến 110 C, 1ml Sn (Oct)2 (0,5% w / v) được hòa tan trong 10ml toluen và bổ sung vào bình cầu. Duy trì nhiệt độ ở 130oC trong suốt 7 tiếng để thực hiện phản ứng mở vòng. Sản phẩm thu được sẽ được hòa tan trong dichloromethan (DC ) và kết tủa trong methanol lạnh, ly tâm để thu được kết tủa. Tủa thu được sau ly tâm đem sấy qua đêm, cuối cùng thu được copolyme PLA-TPGS dạng bột màu trắng [17]. Hình 12. C p yme PLA-TPGS được t o bởi monome L-LA và TPGS Để tối ưu hóa cấu trúc của hệ phân phối thuốc, chúng tôi tiến hành thay đổi tỉ lệ khối lượng giữa PLA và TPGS để tìm ra tỉ lệ nào có sự kết hợp giữa hiệu suất bọc thuốc, độ bền của hệ cũng như khả năng tiêu diệt các tế bào khối u là tốt nhất, phục vụ cho các nghiên cứu về sau. Các mức tỷ lệ PLA:TPGS (w w) được thực hiện trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng sau: 20
28. Bảng 1. Tỉ lệ và khối ượng củ PLA và TPGS thực nghiệm Tỉ lệ PLA: TPGS Khối ượng thử nghiệm(g) PLA TPGS 1:1 0,2 0,2 1:2 0,2 0,4 1:3 0,2 0,6 2:1 0,4 0,2 3:1 0,6 0,2 2.2.2. Chuẩn bị dung dịch TPGS gắn với folat Đầu tiên, 100mg TPGS cùng 8,8 mg axit aspartic và 10mg EDC được hòa tan trong 10ml H2O, phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, sau 24h khuấy từ sẽ thu được dung dịch TPGS-COOH. Tiếp đó, 35mg axit olic, 11,4mg EDC, 3,96 mg ethylen diamin và 18mg NHS được hòa tan hoàn toàn o trong 7ml dung dịch NH4OH 2 và khuấy từ 6h ở 50 C để tạo thành dung dịch Folat đã hoạt hóa ( ol-NHS) đồng nhất. Sau đó, 100mg EDC và 25mg NHS được thêm vào dung dịch TPGS-COOH trên, khuấy từ 2h ở nhiệt độ phòng để thu được dung dịch TPGS-COOH hoạt hóa. Trong bước tiếp theo, dung dịch này được nhỏ giọt từ từ vào dung dịch Fol-NHS và điều chỉnh pH đến 8. Cuối cùng dung dịch được khuấy từ tại 37oC trong 4h [40]. 2.2.3. Tổng hợp hạt nano (Cur + PTX)-PLA-TPGS gắn folat Đầu tiên, 10mg copolyme PLA-TPGS được cho vào 10ml DC và khuấy từ trong 2h. Sau đó 10ml H2O được thêm vào hỗn hợp và tiếp tục khuấy cho đến khi lớp DCM trở nên trong suốt thì thu lấy lớp nước ở phía trên và thêm 1g TPGS vào lớp nước. Đồng thời, dung dịch của Cur và PTX cũng được chuẩn bị bằng cách cho 4mg Cur và 4mg PTX cùng hòa tan vào 10ml EtOH. Tiếp đó dung dịch thuốc được nhỏ từ từ vào lớp nước đã thu phía trên trong máy rung siêu âm. Sản phẩm sau khi rung siêu âm được khuấy từ trong 24h ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành đuổi dung môi EtOH và thêm 21
29. vào 1ml dung dịch Folat đã hoạt hóa, khuấy từ trong 2h để tạo thành hạt nano (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol. Hỗn hợp sau cùng được đem đi ly tâm và thu lấy phần dung dịch phía trên là phần chứa hệ phân phối thuốc nano để tiến hành các thử nghiệm về sau. 2.2.4. Hiệu suất bọc thuốc (EE%) Hiệu suất bọc thuốc (EE%) của PTX (hoặc Cur) của hệ nano được tính toán bởi độ hấp thụ cực đại UV-Vis tại các bước sóng 430 nm (đặc trưng cho Cur) và 227 nm (đặc trưng cho PTX) [14,20]. Quy trình [16,36]: Bước 1: Xác định phương trình đường chuẩn Cur và PTX - Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng (1) bao gồm EtOH : H2O với tỉ lệ 7:3 - Hòa tan hoàn toàn 2,000 mg Cur (PTX) trong 20,0ml dung dịch (1) thu được dung dịch (2). - Đường chuẩn bao gồm dãy 5 dung dịch chuẩn được chuẩn bị bằng cách thêm các thể tích tương ứng của dung dịch (2), sau đó bổ sung cho đủ 10,00ml bằng dung dịch (1) như trong Bảng 2: Bảng 2. Dãy nồng độ 5 dung dịch chuẩn STT Nồng độ (Cx) Thể tích dung dịch 1(ml) (mg/ml) 1 C1= 0,002 0,20 2 C2= 0,004 0,40 3 C3= 0,006 0,60 4 C4= 0,008 0,80 5 C5= 0,01 1,00 Bước 2: Định lượng Cur PTX có trong dung dịch chứa hệ phân phối thuốc nano (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol - Lấy 0,20 ml mỗi dung dịch chứa hệ (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol tương ứng với 5 tỉ lệ của PLA- TPGS thêm vào 3,50 ml dung dịch EtOH và 1,30 ml H2O. 22
30. - Tiến hành đo phổ hấp thụ UV-Vis và xác định độ hấp thụ cực đại của 5 dung dịch trên lần lượt ở các bước sóng 430 nm và 227 nm. - Dựa vào phương trình đường chuẩn của Cur và PTX thu được ở Bước 1 để xác định hàm lượng Cur và PTX có trong dung dịch (Cur+PTX)-PLA- TPGS-Fol. Bước 3: Hiệu suất bọc thuốc EE% được tính theo công thức: Trong đó m = khối lượng 2.2.5. Đánh giá các đặc trưng vật liệu Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier (FTIR) Phổ hồng ngoại của copolyme PLA-TPGS, Cur, PTX và nano (Cur + PTX)-PLA-TPGS- ol được xác định bằng phương pháp hạt pellet KBr trong máy đo quang phổ hồng ngoại Perkin Elmer (Perkin Elmer Spectrum Two, Waltham, assachusetts, U.S.A). Vùng khảo sát nằm trong khoảng 400 - 4000 cm-1 nhằm xác định liệu có tổng hợp thành công hay không hệ micel (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol. Xác định hình thái, kích thước hạt, thế zeta Hình thái của hệ micel được xác định bằng máy đo SE Hitachi S- 4800. Thế zeta của hạt nano (Cur + PTX)-PLA-TPGS- ol được đo bởi bằng phương pháp phổ tán xạ laze động (DLS) trên máy đo thế Zetasize phiên bản 7.03, Malvern instruments Ltd, Malvern, UK. 2.2.6. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào Phương pháp: Sử dụng phương pháp TT để đánh giá mức độ sống/chết tế bào ung thư dưới tác dụng của hệ phân phối thuốc nano (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol với 5 tỉ lệ khác nhau của PLA-TPGS. Thử nghiệm gây độc tế bào được tiến hành trên 4 dòng tế bào và tiến hành tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn Lâm và Khoa học Công nghệ Việt Nam [35]. 23
31. CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Tính đặc t ưng vật liệu 3.1.1. Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier (FTIR) Các sản phẩm thu được trong các công đoạn được đặc trưng hóa bằng phương pháp phân tích T- . Các liên kết đặc trưng của từng hợp chất được thể hiện qua những dao động đặc trưng của các liên kết đó. Số liệu được trình bày trong các kết quả thu được tương ứng. Các liên kết mới được hình thành trong các hợp chất mới đều là những liên kết có mặt trong các hợp chất ban đầu. Vì vậy, không xuất hiện các peak dao động mới trong các hợp chất mới, chỉ có sự dịch chuyển về số sóng tương ứng với các liên kết đó. Hình 13. Phổ hồng ngo i FTIR của nano (Cur+PTX)-PLA-TPGS- Fol với 5 tỉ lệ khác nh u giữ PLA và TPGS Nhận xét: Theo Hình 13 cho thấy phổ FTIR của các hạt nano tương ứng với 5 tỉ lệ khác nhau của PLA và TPGS hầu như không có sự khác biệt. 24
32. Do đó, chúng tôi chọn phổ hồng ngoại của hệ nano tương ứng với tỉ lệ PLA: TPGS là 1:1 để bàn luận và đánh giá chung về phổ FTIR cho cả 5 tỉ lệ. Hình 14. Phổ hồng ngo i FTIR của (1) Cur, (2) PTX, (3) Acid folic, (4) PLA-TPGS 1:1 và (5) (Cu +PTX)-PLA-TPGS-Fol với tỉ lệ PLA- TPGS 1:1 . Nhận xét: Theo Hình 14 và Bảng 3 phổ FTIR của (Cur + PTX)-PLA- TPGS- ol 1:1 có sự thay đổi rõ ràng so với phổ FTIR của PTX tinh khiết, Cur tinh khiết, axit olic và PLA-TPGS. Trong hình ảnh FTIR của PLA-TPGS đỉnh tại 1762cm-1 đặc trưng cho nhóm carbonyl (C=O) được dịch chuyển tới 1728 cm-1 trong phổ của (Cur + PTX)-PLA-TPGS-Fol 1:1. PTX được đặc trưng bởi dải C=O và C=C tại các đỉnh lần lượt là 1735 and 1644 cm-1, nhưng chúng có thể bị che bởi dải C=O của PLA-TPGS và Cur (1628 cm-1) . Đỉnh tại 1512 và 1458 cm-1 lần lượt được cho là của nhóm C=C ole ienic của Cur (1512 cm-1 đối với Cur tinh khiết) và vòng phenyl của axit folic (1485cm-1 trong phổ chuẩn). Dải C=C của PLA-TPGS (1546 cm-1) bị che phủ bởi C=C olefienic của Cur, do đó nó không được nhìn thấy trong phổ FTIR của (Cur + PTX)-PLA-TPGS-Fol. 25
33. Cuối cùng, đỉnh đặc trưng cho liên kết C-N của PTX bị dịch chuyển từ 1245 đến 1280 cm-1. So với các phổ riêng lẻ PLA-TPGS, Cur, PTX, acid folic, phổ hồng ngoại T- của hệ phân phối thuốc nano gắn folat chứa tất cả các peak đặc trưng của PLA-TPGS, Cur, PTX và acid olic. Trong đó, vị trí của các peak này có sự dịch chuyển so với các peak trong các chất đơn lẻ ban đầu. Tất cả các phân tích trên chứng minh Cur và PTX đã được bọc thành công bởi khối copolyme PLA-TPGS gắn folat để tạo thành hệ micel. Bảng 3. Các d động đặc t ưng củ các ch t Cur PTX Acid folic Copolyme PLA : (Cur + PTX)- TPGS PLA-TPGS-Fol 1:1 1735 C=O 1756 C=O 1728 chồng peak C=O của PTX và PLA- TPGS. 1628 1644 C=C Chồng peak C=O C=O của Cur và C=C của PTX 1512 1546 C=C C=O olefienic 1485 vòng 1458 C=C của phenyl folic acid 1245 C-N 1280 C-N của PTX 26
34. 3.1.2. Hình thái và kích thước (a) (b) 27
35. (c) (d) 28
36. (e) Hình 15. Hình ảnh FESEM của nano (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol với 5 tỉ lệ khác nh u giữ PLA và TPGS ( ) 1:1, (b) 2:1, (c) 1:3, (d) 2:1, (e) 3:1. Nhận xét: Theo lý thuyết hạt nano với kích thước nhỏ (dưới 200nm) có thể kéo dài thời gian lưu thông trong hệ tuần hoàn và thâm nhập dễ dàng vào khối u thông qua hiệu ứng tăng tính thấm và thời gian lưu (the Enhanced Permeability and Retention effect) [3], do đó sự xâm nhập của hạt nano vào tế bào khối u có thể được cải thiện và làm tăng hiệu quả điều trị. Có thể quan sát rõ ràng từ Hình 15 rằng hạt nano (Cur + PTX)-PLA-TPGS-Fol hầu hết có hình cầu với kích thước nhỏ khoảng 100nm và ít kết tập. Nhờ đó các hệ phân phối thuốc được tạo ra có tiềm năng ứng dụng trong điều trị ung thư. 3.2.3. Thế zeta Bảng 4. Thế zeta của hệ nano t i 5 tỉ lệ khác nh u của PLA-TPGS Tỉ lệ phối hợp 1:3 1:2 1:1 2:1 3:1 PLA:TPGS Thế zeta (mV) -27.60 -25.90 -15.50 -25.10 -28.40 29
37. Thế zeta (a) (b) (c) 30
38. (d) (e) Hình 16. Thế zeta của h t nano (Cur +PTX) PLA-TPGS-Fol t i các tỉ lệ củ PLA và TPGS: 1:3 ( ), 1:2 (b), 1:1 (c), 2:1 (d), 3:1 (e). Nhận xét: Sự ổn định của hạt nano có thể được dự đoán thông qua thế zeta, trị tuyệt đối của thế zeta càng cao thì hệ micel càng bền. Qua kết quả DLS ở Bảng 4 và Hình 16 cho thấy tất cả hệ nano tổng hợp được đều có điện tích âm nằm trong khoảng -15,5 đến -28,4 mV và được coi là tương đối ổn định. 31
39. 3.2. Hiệu su t bọc thuốc (EE %) 2 1.8 y = 179.04x + 0.078 R² = 0.9994 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.7 y = 65.994x - 0.0309 0.6 R² = 0.9992 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 Hình 17. Phương t ình đư ng chuẩn củ Cu và PTX Bảng 5. Hiệu su t bọc thuốc củ Cu và PTX Tỉ lệ của Cur được PTX được EE(%) PLA/TPGS mang mang Cur PTX (w/w) (mg/ml) (mg/ml) 1:3 0,14 0,14 35,00 34,70 1:2 0,15 0,16 37,50 39,80 1:1 0,17 0,18 42,50 44,50 2:1 0,27 0,26 67,50 65,30 3:1 0,32 0,33 80,10 82,60 32
40. Theo kết quả trong Bảng 5, EE % cao nhất cho cả Cur và PTX là ở tỉ lệ PLA/TPGS 3:1 với lần lượt là 80,10% và 82,60%. Trong khi đó, kết quả EE% thấp nhất cũng đều là ở tỉ lệ PLA/TPGS 1:3 với chỉ khoảng 35% đối với cả 2 thuốc. Điều này có thể được lý giải bởi vì Cur và PTX đều có tính chất kị nước nên nó sẽ tương tác với phần lõi kỵ nước PLA của hạt nano. Do đó khi giảm khối lượng PLA (từ 3:1 đến 1:3) sẽ dẫn tới lượng thuốc được bắt giữ trong lõi giảm và làm giảm EE%. So sánh EE% giữa 3 tỉ lệ 1:1, 1:2 và 1:3 thì gần như là tương tự nhau, có thể do ở các tỉ lệ này có lượng PLA ban đầu là giống nhau. Tuy tại tỉ lệ 1:3 tỷ lệ bọc cả Cur và PTX là thấp nhất, nhưng nồng độ của Cur là 0,14mg ml cao gấp hơn 12 lần so với độ tan của Cur tinh khiết trong nước [43] , tương tự là khoảng 1400 lần so với PTX [21]. Như vậy, hệ micel đã tổng hợp làm tăng đáng kể độ tan của Cur và PTX trong nước. 3.3. Thử nghiệm gây độc tế bà Bảng 6. Kết quả gây độc tế bà t ên 4 dòng tế bà được chọn Th tích Phần t ăm sống củ các dòng tế bà (%) mẫu S KH (l T Nhận ét mẫu mẫu/ml T dịch thí Hep-G2 HeLa LU-1 Vero nghiệm ) Dung - 100 100 100 100 m i Nồng Chứng 1,25 0,2 Dương độ 5 0,00 2,5 0,40 29,15 1,20 (+) PTX 0 tính g/ml 33
41. Dương 100 1,60 0,50 3,2 0,80 79,3 1,2 27,48 1,70 tính 3 (Cur+P dòng TB TX)- 86,97 0, 50 12,68 0,90 28,95 1,40 57,83 0,80 1 PLA- 30 TPGS 91,66 1, 25 25,82 0,70 55,04 0,60 68,34 1,30 2:1 70 98,25 0, 12,5 30,60 1,50 76,5 1,30 87,31 0,30 60 Dương 100 0,00 0,00 0,00 0,00 tính 4 (Cur+P dòng TB TX)- 79,11 1, 50 2,34 0,20 4,29 0,30 52,8 1,70 2 PLA- 90 TPGS 85,4 1,6 25 17,06 1,80 38,58 1,20 61,65 0,60 3:1 0 92,5 0,7 12,5 20,8 0,30 66,5 0,40 78,25 1,90 0 Dương 54,65 1, 100 0,00 0,00 6,3 0,50 tính 3 30 (Cur+P dòng TB TX)- 79,26 0, 50 5,40 0,60 13,6 0,40 48,50 0,70 3 PLA- 90 TPGS 88,2 0,8 25 11,86 0,80 16,56 0,80 69,9 1,20 1:2 0 92,22 0, 12,5 25,76 0,10 20,89 0,20 82,4 1,40 40 4 (Cur+P 100 0,00 0,00 60,77 1, 0,00 Dương 34
42. TX)- 90 tính 3 PLA- dòng TB TPGS 81,50 2, 50 3,54 0,20 0,00 50,20 0,90 1:3 20 85,20 0, 25 22,40 0,70 0,00 54,80 1,10 70 96,50 1, 12,5 29,50 0,50 0,00 70,97 1,20 30 Dương 13,20 1, 100 0,00 0,00 0,00 tính 4 80 (Cur+P dòng TB TX)- 75,70 0, 50 0,00 0,00 9,80 1,20 5 PLA- 60 TPGS 93,38 1, 25 9,04 1,30 11,33 0,40 58,1 0,60 1:1 90 98,5 0,4 12,5 12,1 0,70 35,92 1,50 71,2 0,90 0 Kết quả thu được được thể hiện trong Bảng 5 cho thấy, cả 5 hệ phân phối thuốc đều dương tính trên ít nhất 3 dòng tế bào với tỉ lệ tế bào sống sót thấp hoặc chết hoàn toàn, đôi khi thấp hơn so với dùng PTX đơn thuần. Trong đó hệ với tỉ lệ PLA:TPGS là 1:1 thì dường như hiệu quả hơn các hệ còn lại vì nó cho kết quả dương tính trên cả 4 dòng tế bào và tỉ lệ tế bào sống sót thấp hơn. Qua kết quả thử nghiệm có thể thấy khả năng gây độc tế bào của các hệ phân phối thuốc đã tổng hợp ở cả 5 tỉ lệ có khả năng gây độc mạnh tới các tế bào ung thư và rõ ràng đều phụ thuộc vào liều. Do đó, PLA-TPGS kết hợp với acid olic có thể là một cách hiệu quả, có tiềm năng để cải thiện sự phân phối thuốc tới đích của các chất điều trị ung thư, qua đó làm giảm thiểu các tác dụng không mong muốn của chúng đến cơ thể người bệnh . 35
43. CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Trong nghiên cứu này, hạt nano dựa trên khối copolyme PLA-TPGS mang đồng thời cả Cur và PTX đã được bào chế thành công. Tất cả 5 hệ phân phối thuốc tổng hợp được tương ứng với 5 tỉ lệ khác nhau của giữa PLA và TPGS đều cho kích thước hạt nhỏ nằm trong khoảng 100-200nm, hệ micel có độ ổn định tương đối. Các hệ nano tổng hợp được đã cải thiện đáng kể độ tan của cả Cur và PTX. Hạt nano (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol tổng hợp được có khả năng gây độc mạnh lên các dòng tế bào khối u đã thử nghiệm, khả năng gây độc tế bào đôi khi mạnh hơn khi so sánh với PTX đơn thuần do có yếu tố hướng đích Folat và kích thước hạt nhỏ. Tổng hợp từ các kết quả về hiệu suất bọc thuốc, kích thước, thế zeta và thử nghiệm gây độc tế bào chúng tôi cho rằng hệ nano với tỉ lệ PLA:TPGS là 1:1 là tối ưu nhất. Xét về thế zeta hệ có tỉ lệ PLA:TPGS 1:1 tuy có độ bền thấp hơn các hệ còn lại nhưng vẫn là một hệ khá ổn định. Hiệu suất bọc thuốc tốt trên 40%, vì EE % lớn sẽ làm kích thước hạt lớn không thâm nhập được vào trong các khối u và tế bào. Thêm vào đó, các hạt nano trong hệ này vẫn có kích thước nhỏ hơn 200nm và khả năng gây độc đến tế bào khối u là tốt nhất so với 4 hệ còn lại. Do hạn chế về mặt nguồn lực nên trong thử nghiệm gây độc tế bào chúng tôi chưa so sánh được hiệu quả gây độc tế bào khi chứng dương là Cur. Bên cạnh đó thời gian các phân đoạn thí nghiệm thường kéo dài cùng với điều kiện tài chính không cho phép chúng tôi được lặp lại thí nghiệm nhiều lần. Sau nghiên cứu này, chúng tôi hy vọng có thể tiến hành thêm các nghiên cứu liên quan đến việc thay đổi tỉ lệ giữa PLA-TPGS 1:1, Cur và PTX nhằm tìm ra các xu thế thay đổi của hệ từ đó có thể tối ưu hóa công thức của hệ nano hơn nữa. Bên cạnh đó, có thể tiến hành lại các thử nghiệm gây độc tế bào để có thể tìm ra giá trị IC50. 36
44. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Aggarwal B B, Kumar A, and Bharti A C (2003), "Anticancer Potential of Curcumin: Preclinical and Clinical Studies",Anticancer Res, 23 (1A), 363-398. 2. Aggarwal B B, and Shishodia S (2006), "Molecular Targets of Dietary Agents for Prevention and Therapy of Cancer",Biochem Pharmacol, 71 (10), 1397-1421. 3. Akhand A A, et al. (2001), "Glyoxal and Methylglyoxal Trigger Distinct Signals for Map Family Kinases and Caspase Activation in Human Endothelial Cells",Free Radic Biol Med, 31 (1), 20-30. 4. Akhtar N, et al. (2011), "The Emerging Role of P-Glycoprotein Inhibitors in Drug Delivery: A Patent Review",Expert Opin Ther Pat, 21 (4), 561-576. 5. Alexandru Mihai Grumezescu A F (2017), "Nanostructures for Cancer Therapy", (4), 197. 6. Anand P, Sundaram C, Jhurani S, Kunnumakkara A B, and Aggarwal B B (2008), "Curcumin and Cancer: An "Old-Age" Disease with an "Age-Old" Solution",Cancer Lett, 267 (1), 133-164. 7. Bayet-Robert M, et al. (2010), "Phase I Dose Escalation Trial of Docetaxel Plus Curcumin in Patients with Advanced and Metastatic Breast Cancer",Cancer Biol Ther, 9 (1), 8-14. 8. Berry W R (2005), "The Evolving Role of Chemotherapy in Androgen- Independent (Hormone-Refractory) Prostate Cancer",Urology, 65 (6 Suppl), 2-7. 9. Chen J, Xing M M Q, and Zhong W (2011), "Degradable Micelles Based on Hydrolytically Degradable Amphiphilic Graft Copolymers for Doxorubicin Delivery",Polymer, 52 (4), 933-941. 10. Choi H, Chun Y S, Kim S W, Kim M S, and Park J W (2006), "Curcumin Inhibits Hypoxia-Inducible Factor-1 by Degrading Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator: A Mechanism of Tumor Growth Inhibition",Mol Pharmacol, 70 (5), 1664-1671. 11. Cuong N-V, Li Y-L, and Hsieh M-F (2012), "Targeted Delivery of Doxorubicin to Human Breast Cancers by Folate-Decorated Star-Shaped Peg-Pcl Micelle",Journal of Materials Chemistry, 22 (3), 1006-1020. 12. El-Moselhy M A, Taye A, Sharkawi S S, El-Sisi S F, and Ahmed A F (2011), "The Antihyperglycemic Effect of Curcumin in High Fat Diet Fed Rats. Role of Tnf-Alpha and Free Fatty Acids",Food Chem Toxicol, 49 (5), 1129-1140.
45. 13. Feng S, and Huang G (2001), "Effects of Emulsifiers on the Controlled Release of Paclitaxel (Taxol) from Nanospheres of Biodegradable Polymers",J Control Release, 71 (1), 53-69. 14. Ghosh M, et al. (2011), "Curcumin Nanodisks: Formulation and Characterization",Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine, 7 (2), 162-167. 15. , " ". 16. , "In Vitro Comparative Studies of Zein Nanoparticles and Composite Chitosan Thermogels Based Injectable Formulation of Doxorubicin", (2017)Journal of Drug Delivery Science and Technology. 17. Jiang Z M, et al. (2015), "Crizotinib-Loaded Polymeric Nanoparticles in Lung Cancer Chemotherapy",Med Oncol, 32 (7), 015-0636. 18. Kang H J, Lee S H, Price J E, and Kim L S (2009), "Curcumin Suppresses the Paclitaxel-Induced Nuclear Factor-Kappab in Breast Cancer Cells and Potentiates the Growth Inhibitory Effect of Paclitaxel in a Breast Cancer Nude Mice Model",Breast J, 15 (3), 223-229. 19. Karmakar S, Banik N L, Patel S J, and Ray S K (2006), "Curcumin Activated Both Receptor-Mediated and Mitochondria-Mediated Proteolytic Pathways for Apoptosis in Human Glioblastoma T98g Cells",Neurosci Lett, 407 (1), 53-58. 20. Kim M J, et al. (2011), "Preparation, Characterization, Cytotoxicity and Drug Release Behavior of Liposome-Enveloped Paclitaxel/Fe3o4 Nanoparticles",J Nanosci Nanotechnol, 11 (1), 889-893. 21. Konno T, Watanabe J, and Ishihara K (2003), "Enhanced Solubility of Paclitaxel Using Water-Soluble and Biocompatible 2-Methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine Polymers",J Biomed Mater Res A, 65 (2), 209-214. 22. Kutty R V, et al. (2015), "In Vivo and Ex Vivo Proofs of Concept That Cetuximab Conjugated Vitamin E Tpgs Micelles Increases Efficacy of Delivered Docetaxel against Triple Negative Breast Cancer",Biomaterials, 63 58-69. 23. Lassen M M J K M. (2010), "Evolution of Amide Bond Formation," Arkivoc, 189-250. 24. Leamon C P, and Reddy J A (2004), "Folate-Targeted Chemotherapy",Adv Drug Deliv Rev, 56 (8), 1127-1141.
46. 25. Lee S C, et al. (2007), "Hydrotropic Polymeric Micelles for Enhanced Paclitaxel Solubility: In Vitro and in Vivo Characterization",Biomacromolecules, 8 (1), 202-208. 26. Miele E, Spinelli G P, Tomao F, and Tomao S (2009), "Albumin-Bound Formulation of Paclitaxel (Abraxane Abi-007) in the Treatment of Breast Cancer",Int J Nanomedicine, 4 99-105. 27. Moghimi S M, Hunter A C, and Murray J C (2001), "Long-Circulating and Target-Specific Nanoparticles: Theory to Practice",Pharmacol Rev, 53 (2), 283-318. 28. Moghimi S M, Hunter A C, and Murray J C (2005), "Nanomedicine: Current Status and Future Prospects",Faseb J, 19 (3), 311-330. 29. Mu L, and Feng S S (2003), "Plga/Tpgs Nanoparticles for Controlled Release of Paclitaxel: Effects of the Emulsifier and Drug Loading Ratio",Pharm Res, 20 (11), 1864-1872. 30. Muthu M S, Kulkarni S A, Raju A, and Feng S S (2012), "Theranostic Liposomes of Tpgs Coating for Targeted Co-Delivery of Docetaxel and Quantum Dots",Biomaterials, 33 (12), 3494-3501. 31. Oh W K, Tay M H, and Huang J (2007), "Is There a Role for Platinum Chemotherapy in the Treatment of Patients with Hormone-Refractory Prostate Cancer?",Cancer, 109 (3), 477-486. 32. Paolino D, et al. (2016), "Improvement of Oral Bioavailability of Curcumin Upon Microencapsulation with Methacrylic Copolymers",Frontiers in Pharmacology, 7 485. 33. Parker N, et al. (2005), "Folate Receptor Expression in Carcinomas and Normal Tissues Determined by a Quantitative Radioligand Binding Assay",Anal Biochem, 338 (2), 284-293. 34. Petrylak D P (2005), "Future Directions in the Treatment of Androgen- Independent Prostate Cancer",Urology, 65 (6 Suppl), 8-12. 35. Phan Q T, et al. (2016), "Characteristics and Cytotoxicity of Folate-Modified Curcumin-Loaded Pla-Peg Micellar Nano Systems with Various Pla:Peg Ratios",International Journal of Pharmaceutics, 507 (1), 32-40. 36. Phuong Thu H, et al. (2016), "Targeted Drug Delivery Nanosystems Based on Copolymer Poly(Lactide)-Tocopheryl Polyethylene Glycol Succinate for Cancer Treatment",Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology, 7 (1), 015001.
47. 37. Prabhu R H, Patravale V B, and Joshi M D (2015), "Polymeric Nanoparticles for Targeted Treatment in Oncology: Current Insights",International Journal of Nanomedicine, 10 1001-1018. 38. Sabharanjak S, and Mayor S (2004), "Folate Receptor Endocytosis and Trafficking",Adv Drug Deliv Rev, 56 (8), 1099-1109. 39. Shishodia S, Sethi G, and Aggarwal B B (2005), "Curcumin: Getting Back to the Roots",Ann N Y Acad Sci 206-217. 40. Singh R P, et al. (2016), "Transferrin Receptor Targeted Pla-Tpgs Micelles Improved Efficacy and Safety in Docetaxel Delivery",Int J Biol Macromol, 83 335-344. 41. Singla A K, Garg A, and Aggarwal D (2002), "Paclitaxel and Its Formulations",Int J Pharm, 235 (1-2), 179-192. 42. Slastnikova T A, Rosenkranz A A, Zalutsky M R, and Sobolev A S (2015), "Modular Nanotransporters for Targeted Intracellular Delivery of Drugs: Folate Receptors as Potential Targets",Current pharmaceutical design, 21 (9), 1227-1238. 43. Song Z, et al. (2011), "Curcumin-Loaded Plga-Peg-Plga Triblock Copolymeric Micelles: Preparation, Pharmacokinetics and Distribution in Vivo",J Colloid Interface Sci, 354 (1), 116-123. 44. Srivastava K C, Bordia A, and Verma S K (1995), "Curcumin, a Major Component of Food Spice Turmeric (Curcuma Longa) Inhibits Aggregation and Alters Eicosanoid Metabolism in Human Blood Platelets",Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 52 (4), 223-227. 45. Srivastava R M, Singh S, Dubey S K, Misra K, and Khar A (2011), "Immunomodulatory and Therapeutic Activity of Curcumin",International immunopharmacology, 11 (3), 331-341. 46. Vijayakumar M R, Muthu M S, and Singh S (2013), "Copolymers of Poly(Lactic Acid) and D-Alpha-Tocopheryl Polyethylene Glycol 1000 Succinate-Based Nanomedicines: Versatile Multifunctional Platforms for Cancer Diagnosis and Therapy",Expert Opin Drug Deliv, 10 (4), 529-543. 47. Wang J, et al. (2011), "Folate-Decorated Hybrid Polymeric Nanoparticles for Chemically and Physically Combined Paclitaxel Loading and Targeted Delivery",Biomacromolecules, 12 (1), 228-234. 48. Yallapu M M, Jaggi M, and Chauhan S C (2013), "Curcumin Nanomedicine: A Road to Cancer Therapeutics",Current pharmaceutical design, 19 (11), 1994-2010.
48. 49. Yang K Y, Lin L C, Tseng T Y, Wang S C, and Tsai T H (2007), "Oral Bioavailability of Curcumin in Rat and the Herbal Analysis from Curcuma Longa by Lc- Ms/Ms",J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 853 (1-2), 183-189. 50. Zhang Z, and Feng S S (2006), "Nanoparticles of Poly(Lactide)/Vitamin E Tpgs Copolymer for Cancer Chemotherapy: Synthesis, Formulation, Characterization and in Vitro Drug Release",Biomaterials, 27 (2), 262-270.