Khóa luận Nghiên cứu bào chế Liposome Doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng Ethanol

50 trang yendo 10330

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu bào chế Liposome Doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng Ethanol", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_nghien_cuu_bao_che_liposome_doxorubicin_2mgml_bang.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu bào chế Liposome Doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng Ethanol

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU TRANG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME DOXORUBICIN 2MG/ML BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU TRANG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME DOXORUBICIN 2MG/ML BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn Ths. Nguyễn Văn Lâm Nơi thực hiện Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2014
LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội và bộ môn Bào chế đã tạo điều kiện cho em được làm khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường đã dìu dắt giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua. Với tình cảm chân thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến ThS. Nguyễn Văn Lâm Là người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế, trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu. Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè những người đã quan tâm động viên, khích lệ giúp em hoàn thành khóa luận. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thu Trang
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 6 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU 7 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ 8 ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Doxorubicin 2 1.1.1. Đại cương về doxorubicin 2 1.1.2. Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường 3 1.2. Đại cương về liposome 4 1.2.1. Khái niệm 4 1.2.2.1. Ưu điểm 4 1.2.2.2. Nhược điểm 5 1.2.3. Phân loại 6 1.2.3.1. Theo kích thước và số lớp 6 1.2.3.2. Theo cấu trúc lớp vỏ 6 1.2.4. Phương pháp bào chế 7 1.2.4.1. Phương pháp Batzri và Korn 7 1.2.4.2. Phương pháp Bangham 8 1.2.4.3. Phương pháp Deamer và Bangham 8 1.3. Bào chế liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol 9 1.4. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin 11 1.4.1. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin trên thế giới 11 1.4.2. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin tại Việt Nam 12 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu 14 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.2. Nguyên vật liệu 14 2.1.3. Phương tiện nghiên cứu 14 2.2. Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1. Phương pháp bào chế liposome doxorubicin 15 2.2.2. Phương pháp đánh giá liposome doxorubicin 15
2.2.2.1. Phương pháp đánh giá hình thức, kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân 15 2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng doxorubicin toàn phần và hiệu suất liposome hóa 16 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu 17 2.2.4. Điều kiện thí nghiệm 17 Chương 3. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 18 3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn 18 3.2. Xây dựng quy trình bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol 19 3.2.1. Quy trình bào chế chung 19 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật trong quy trình bào chế đến kích thước tiểu phân và hiệu suất liposome hóa 20 3.2.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi 20 3.2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 24 3.2.3. Đánh giá vai trò của giai đoạn làm giảm kích thước tiểu phân trong quy trình bào chế 27 3.2.3. Đề xuất quy trình bào chế và đánh giá một số chỉ tiêu của liposome doxỏubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol 29 3.2.3.1. Quy trình bào chế 29 3.2.3.2. Đánh giá một số chỉ tiêu của liposome tạo ra 30 3.3. Bàn luận 32 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Viết tắt Từ/cụm từ đầy đủ 1 CHL Cholesterol 2 HSPC Phosphatidyl dầu đậu nành đã hydrogen hóa 3 SPC Phosphatidylcholin dầu đậu nành 4 HEPES Dung dịch đệm N-2-hydroxy ethyl piperazin – N – 2 – ethan sulfonic acid 5 PDI Chỉ số đa phân tán 6 DOX Doxorubicin 7 DOX.HCl Doxorubicin hydroclorid 8 KTTP Kích thước tiểu phân 9 TCCS Tiêu chuẩn cơ sở 10 TKKH Tinh khiết hóa học 11 USP Dược điển Mỹ 12 DĐVN Dược điển Việt Nam 13 TMT-LS Liposome tác động vào khối u di căn 14 EE Hiệu suất liposome hóa 15 PEG Polyethylen glycol
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng biểu Trang Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu được sử dụng. 14 Kết quả đo mật độ quang các mẫu dung dịch doxorubicin ở Bảng 3.1 18 bước sóng 233 và 481 nm (pH 4). Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến Bảng 3.2 20 KTTP và hiệu suất liposome hóa. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến KTTP, phân bố KTTP Bảng 3.3 21 liposome. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến KTTP và hiệu suất Bảng 3.4 23 liposome hóa. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến KTTP Bảng 3.5 25 và hiệu suất liposome hóa. Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến KTTP và hiệu suất liposome 25 hóa Bảng 3.7 So sánh các giai đoạn trong quy trình bào chế liposome 27 doxorubicin bằng các phương pháp khác nhau Bảng 3.8 Ảnh hưởng của quá trình làm giảm KTTP đến KTTP và 28 hiệu suất liposome hóa Bảng 3.9 Kết quả KTTP và hiệu suất liposome hóa 31
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Số hiệu Tên các hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1 Công thức hóa học của doxorubicin hydroclorid. 2 Hình 1.2 Cấu trúc liposome. 4 Hình 1.3 Kích thước một số loại liposome. 6 Hình 1.4 Sơ đồ hệ thống kim phun tạo dòng. 9 Hình 3.1 Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ doxorubicin. 18 Liposome doxorubicin bào chế theo các tỷ lệ dung môi khác Hình 3.2 21 nhau. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi PDI (A) và KTTP (B) theo tỷ lệ Hình 3.3 21 dung môi. Đồ thị phân bố KTTP theo thể tích các mẫu trước (A) và sau Hình 3.4 24 (B) lọc tiếp tuyến. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP, PDI (A) và hiệu suất Hình 3.5 23 liposome hóa (B) theo tỷ lệ dung môi. Đồ thị biểu diến sự thay đổi KTTP, PDI (A) và hiệu suất Hình 3.6 26 liposome hóa (B) theo nhiệt độ. Hình 3.7 Sơ đồ quy trình bào chế. 30 Hình 3.8 Ảnh chụp TEM liposome. 31
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, liposome là lĩnh vực nghiên cứu được đẩy mạnh ứng dụng trong nhiều ngành nghề khoa học khác nhau như sinh học, hóa sinh, dược phẩm, mỹ phẩm, hóa trị liệu ung thư, enzym trị liệu đặc biệt trong lĩnh vực đưa thuốc tới đích. Trong bào chế hiện đại, liposome thu hút được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới với những ưu điểm nổi bật như: khả năng hướng đích thụ động đối với các tế bào ung thư, tăng hiệu quả điều trị và khoảng điều trị, tăng khả năng ổn định của dược chất được bao gói, tránh tác dụng trên các tế bào lành, cải thiện dược động học, giảm chuyển hóa và tăng thời gian tuần hoàn, bắt cặp linh động với các vị trí phối tử đặc biệt để đạt tác dụng hướng đích Trên thế giới liposome được bào chế bằng nhiều phương pháp khác nhau, được đưa vào sản xuất với nhiều chế phẩm sử dụng rộng rãi trên thị trường dưới dạng thuốc tiêm liposome doxorubicin. Trong nước các nghiên cứu về liposome hiện nay còn nhiều hạn chế, chưa có chế phẩm nào được đưa vào sản xuất. Các nghiên cứu về liposome ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sử dụng phương pháp hydrat hóa film, tuy nhiên phương pháp này hiện có nhiều nhược điểm như: liposome thu được không đồng nhất, kích thước lớn và đa lớp, sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại với môi trường, thời gian quy trình bào chế kéo dài (12 – 14h), khó áp dụng được trên quy mô công nghiệp Yêu cầu đặt ra cần có một phương pháp bào chế mới thay thế và hạn chế các nhược điểm của phương pháp nói trên. Do vậy đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol” được tiến hành nhằm mục đích: 1. Bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol. 2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của liposome tạo ra.
2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Doxorubicin 1.1.1. Đại cương về doxorubicin - Công thức phân tử: C27H29NO11. HCl. - Khối lượng phân tử: 579,99. Hình 1.1. Công thức hóa học của doxorubicin hydroclorid - Tên khoa học: (8S, 10S)-10-((3-amino-2, 3, 6-trideoxy-α-L-lyxo-hexopyranosyl) oxy) -7, 8, 9, 10-tetrahydro-6, 8, 11- tri hydroxyl-8-(2-hydroxy acetyl)-1-methoxy-5, 12-napthacenedion [22]. - Tính chất: điều kiện thường tồn tại ở dạng tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam không mùi, tan trong nước, methanol, acetonotril, tetrahydrofuran. Không tan trong chloroform, aceton, ethyl ether, benzen [22]. - Doxorubicin bền trong dung dịch có pH gần 4 [10]. - Doxorubicin là chất nhạy cảm với ảnh sáng ở nồng độ thấp, tuy nhiên ở nồng độ điều trị doxorubicin được cho là không bị phân hủy đáng kể bởi ánh sáng, không nhất thiết phải có biện pháp riêng để bảo vệ. Thực tế dung dịch doxorubicin trong NaCl 0,9% có thể ổn định trong 24 ngày khi bảo quản trong lọ PVC ở 25oC, lâu hơn khi bảo quản trong xylanh làm bằng polypropylen ở 4oC [22]. - Cơ chế tác dụng: doxorubicin gắn vào DNA làm ức chế các enzym cần thiết để sao chép và phiên mã DNA, đặc biệt gây gián đoạn mạnh chu kỳ phát triển tế bào ở giai đoạn phân bào S và giai đoạn gián phân [2]. - Dược động học: sau khi tiêm tĩnh mạch, doxorubicin nhanh chóng phân bố đến các mô phổi, gan, tim, lách, thận, bị chuyển hóa ở gan tạo thành doxorubicinol.
3 Khoảng 40 – 50% bị đào thải qua mật trong 5 – 7 ngày ở dạng chưa chuyển hóa; 5% bị đào thải qua nước tiểu trong 5 ngày. Doxorubicin không qua hàng rào máu não nhưng qua nhau thai và bài tiết qua tuyến sữa [2], [5], [22]. Dược động học của liposome doxorubicin khác hẳn so với doxorubicin dạng tự do. Doxorubicin khi gắn với liposome đã PEG hóa có thời gian tồn tại trong vòng tuần hoàn kéo dài hơn và ít phân bố tới các mô hơn. Các liposome doxorubicin phân bố nhiều tới các mô ung thư có hệ mạch không bình thường. Dạng liposome doxorubicin không PEG hóa cũng cho thấy nồng độ đỉnh doxorubicin toàn phần trong huyết tương cao hơn so với khi sử dụng doxorubicin dạng thông thường [5], [22]. - Chỉ định chính: ung thư vú, u xương ác tính (sarcom xương) và u xương Ewing, u mô mềm, u khí phế quản, u lympho ác tính cả hai dạng Hodgkin và không Hodgkin, ung thư biểu mô tuyến giáp (carcinoma tuyến giáp). Ung thư đường tiết niệu và sinh dục: ung thư tử cung, ung thư bàng quang, ung thư tinh hoàn. Khối u đặc ở trẻ em: Sarcom cơ vân, u nguyên bào thần kinh, u Wilm, bệnh leucemi cấp [2]. Chỉ định tương đối: ung thư tuyến tiền liệt, cổ tử cung, âm đạo, dạ dày. Có tác dụng tốt trên một số ung thư hiếm gặp như đa uy tủy xương, u màng hoạt dịch, u nguyên bào võng mạc [2], [22]. - Chống chỉ định: có biểu hiện suy giảm chức năng tủy xương rõ, suy tim, quá mẫn với các thành phần của thuốc [2], [22]. - Tác dụng không mong muốn: độc tính cao, phụ thuộc đường dùng, liều dùng và tần số dùng thuốc. Các tác dụng không mong muốn thường gặp: rụng tóc, buồn nôn, đặc biệt là chèn ép tủy và độc tính trên tim. Ngoài ra còn gặp một số tác dụng phụ khác như: suy giảm chức năng tủy xương, viêm miệng, rối loạn tiêu hóa, nóng rát bàng quang và niệu đạo [2], [22]. 1.1.2. Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường - Chế phẩm dạng quy ước: + Dung dịch tiêm: Adorucin, Adriamicin, Adrim, Doxorubicin DBL, Doxorubicin Ebewe + Bột pha tiêm: Adriblastina, Doxorubicin, Doxorubicin sevycal, Doxtie, Zodox
4 - Chế phẩm dạng liposome doxorubicin: Caelyx, Doxil, Lipo-dox, Myocet 1.2. Đại cương về liposome 1.2.1. Khái niệm Liposome là một dạng đặc biệt của vi nang, bao gồm một vỏ phospholipid kép có đầu thân nước hướng ra ngoài, gồm một hay nhiều lớp đồng trục bao bọc ngăn nước ở giữa hoặc ngăn cách bởi các ngăn nước, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn nanomet [4]. Hình 1.2. Cấu trúc liposome [8]. 1.2.2. Ưu nhược điểm của liposome 1.2.2.1. Ưu điểm - Phospholipid là tá dược phân giải sinh học cao, không độc với cơ thể, không gây đáp ứng miễn dịch khi đưa vào tuần hoàn do vậy liposome được coi là hệ vận chuyển thuốc có tính tương hợp sinh học cao nhất [23]. - Liposome có thể mang đồng thời cả dược chất thân nước và dược chất thân dầu. Dược chất có thể phân bố ở các vị trí khác nhau tùy thuộc đặc tính thân dầu thân nước và tương tác lý hóa của dược chất với lớp phospholipid [18]. - Cấu tạo và tính chất hóa lý tương tự màng sinh học nên liposome dễ dàng thấm qua tế bào làm tăng sinh khả dụng của dược chất, mang các dược chất chữa bệnh nội bào [3], [4].
5 - Liposome cho phép vận chuyển thuốc tới tế bào đích thậm chí là đến các tổ chức bên trong tế bào đích bằng cách gắn thêm các ligand trên màng liposome do đó làm thay đổi chỉ số điều trị của thuốc [23]. - Làm thay đổi phân bố sinh học của một số dược chất có độc tính cao, dùng liều thấp như: thuốc điều trị ung thư, thuốc sát khuẩn do đó làm giảm phân bố thuốc tại cơ quan lành, tăng phân bố tại đích so với dược chất tự do, làm giảm độc tính và tác dụng không mong muốn, tăng hiệu quả điều trị, tiết kiệm dược chất [3], [4], [23]. - Thể hiện ưu điểm của dạng siêu vi nang: bảo vệ dược chất tránh tác động bất lợi của ngoại môi trong quá trình bảo quản hay trên đường vận chuyển tới vị trí tác dụng trong cơ thể: pH, enzym, tác nhân oxy hóa làm tăng độ tan của dược chất hoặc kéo dài tác dụng của thuốc [3], [4]. 1.2.2.2. Nhược điểm Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng liposome hiện nay vẫn chưa được sử dụng rộng rãi do một số nhược điểm sau: - Phospholipid không bền về mặt hóa học nên tuổi thọ của liposome ngắn. Liposome dễ bị thanh thải bởi hệ thực bào, thời gian tuần hoàn khó kéo dài [4]. - Có nhiều thông số tác động đến kích thước, chất lượng của liposome trong quá trình sản xuất dẫn đến khó kiểm soát sự thống nhất giữa các lô mẻ nên khó triển khai sản xuất lớn [4]. - Tỷ lệ liposome hóa của dược chất thấp, khó mang dược chất có phân tử lượng lớn [4]. - Phospholipid chủ yếu được chiết tách từ nguồn nguyên liệu tự nhiên do đó rất khó kiểm soát mức độ tinh khiết của nguyên liệu. Phospholipid có thể lẫn các lysophospholipid hoặc các sản phẩm khác của quá trình oxy hóa phospholipid [21]. - Đa số các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe người sử dụng cũng như môi trường [26]. - Hầu hết các phương pháp bào chế liposome đều chỉ thích hợp với quy mô phòng thí nghiệm, khó triển khai trên quy mô lớn [21].
6 - Hiện chưa có thông tin đầy đủ về mức độ an toàn của các chế phẩm liposome. Ví dụ như hội chứng tay chân (Hand and foot syndrome) không xuất hiện khi sử dụng doxorubicin dạng tự do nhưng lại được tìm thấy khi sử dụng liposome doxorubicin tuần hoàn kéo dài [21]. 1.2.3. Phân loại 1.2.3.1. Theo kích thước và số lớp [11] Gồm các loại: Liposome đa lớp đồng trục (MLV), liposome kép (liposome trong liposome – MVV), Liposome đơn lớp lớn (LUV), Liposome đơn lớp nhỏ (SUV), Liposome đơn lớp khổng lồ (GUV), Liposome đa lớp nhỏ (OLV) Hình 1.3. Kích thước một số loại liposome [5] 1.2.3.2. Theo cấu trúc lớp vỏ - Liposome quy ước: cấu tạo gồm có vỏ lipid và nhân nước. Nhược điểm: thời gian tồn tại ngắn trong hệ tuần hoàn do bị các tế bào trong hệ thống miễn dịch bắt giữ, khả năng hướng đích kém do cơ chế thụ động, có nguy cơ giải phóng dược chất vào các tế bào bình thường [1], [5], [7]. - Liposome hiện đại: Cấu trúc được thay đổi để khắc phục nhược điểm của liposome quy ước nhằm tạo ra một hệ mang thuốc hiệu quả gồm: + Liposome gắn các yếu tố ổn định (long circualating liposomes): độ ổn định cao, thời gian tồn tại trong tuần hoàn từ vài ngày đến hàng tuần [4], [5], [7], [20]. + Liposome miễn dịch (immune liposomes): bề mặt gắn kháng thể, có khả năng liên kết với receptor đặc trưng tại cơ quan đích, có thể giải phóng dược chất tại ngoại bào gần tế bào đích [4], [5], [7], [20]. + Liposome miễn dịch tồn tại lâu trong tuần hoàn (long circulating immune liposomes): liposome kết hợp ưu điểm của liposome tồn tại lâu trong tuần hoàn và
7 liposome miễn dịch nhằm cải tiến hơn nữa khả năng mang thuốc tới đích của liposome [1], [4]. + Liposome nhạy cảm nhiệt độ (temperature sensitive liposome) [1], [4]. + Liposome nhạy cảm pH (pH sensitive liposome) [1], [4]. + Lipoplexes: gồm phospholipid cationic liên kết với AND (lipofectin) để chuyển gen, điều trị bệnh về gen, không bền và độc ở liều cao [4]. + Virosome: dùng vỏ virus làm chất mang đóng vai trò như một vaccin tạo đáp ứng miễn dịch cho cơ thể [4], [13]. + Proliposome: là liposome ở dạng bột đông khô, khi dùng thêm pha nước hydrat hóa tạo hỗn dịch liposome [4]. + Ethosome: ngoài thành phần phospholipid còn chứa tỷ lệ lớn alcol (ethanol, isopropanol), bào chế với mục đích tăng thấm thuốc qua da [4]. + Liposome linh động (flexible liposome): là liposome đơn lớp nhỏ, được bào chế từ phosphatidylcholin với sự có mặt của chất diện hoạt (Tween 80, muối mật, natri cholat, ) và ethanol, có tác dụng tăng thấm thuốc qua da, được ứng dụng nhiều trong mỹ phẩm. Liposome linh động có khả năng thấm qua lớp sừng còn được gọi là transferosome [4]. + Niosome: sử dụng chất diện hoạt không ion hóa thay cho phospholipid. Độ ổn định có thể cao hơn, hiệu suất gắn dược chất cao hơn, rẻ tiền hơn so với liposome. Niosome gần đây được phát triển như một chất mang thuốc tương tự liposome, cải thiện sinh khả dụng cho các dược chất ít tan, thấm kém, tăng độ ổn định cho các dược chất kém bền [4]. + Arsonoliposome: là dạng liposome sử dụng arsonolipid thay cho phosphonolipid, dùng trong điều trị ung thư và diệt ký sinh trùng vì khả năng tăng độc tính với tế bào ung thư và đơn bào [4]. 1.2.4. Phương pháp bào chế 1.2.4.1. Phương pháp Batzri và Korn (pha loãng ethanol) Được Batzri và Korn mô tả năm 1973, còn được gọi là phương pháp pha loãng ethanol hay tiêm ethanol. Quy trình bào chế gồm các bước: Hòa tan phospholipid và
8 các thành phần tạo màng vào ethanol. Bơm nhanh dung dịch này vào môi trường nước hoặc hệ đệm, kết hợp khuấy trộn. Do thay đổi dung môi sẽ tạo thành các SUV có kích thước khoảng 25 nm. Siêu lọc để loại ethanol và tinh chế liposome. Liposome thu được có kích thước nhỏ (30-110 nm) khá đồng nhất mà không phải trải qua quá trình siêu âm [3], [4], [17], [19]. 1.2.4.2. Phương pháp Bangham (hydrat hóa màng film) Do Bangham đưa ra từ năm 1965, với các bước tiến hành: Hòa tan phospholipid và các thành phần tạo vỏ liposome vào dung môi hữu cơ (chloroform, methanol ). Bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm trong bình cất quay tạo màng mỏng phospholipid bám trên thành bình cất. Thêm dung dịch nước có hệ đệm (như hệ đệm phosphat pH 7,0 – 7,4) vừa cho vừa lắc để xảy ra quá trình hydrat hóa màng phospholipid tạo thành liposome. Quá trình hydrat hóa nên được tiến hành ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ chuyển o pha của lipid Tc, thông thường từ 50 – 60 C. Dược chất được phối hợp vào liposome theo cơ chế chủ động hoặc thụ động. Phương pháp này thu được liposome nhiều lớp, kích thước không đồng nhất (từ 50-1000 nm) [3], [4], [19]. 1.2.4.3. Phương pháp Deamer và Bangham (bơm ether) Hòa tan dược chất trong nước, đun cách thủy để duy trì nhiệt độ khoảng 55 – 65oC. Hòa tan các thành phần tạo màng liposome vào ether. Bơm từ từ dung dịch ether vào dung dịch nước từ phía đáy, khi tiếp xúc với pha nước, ether sẽ bốc hơi tạo thành liposome to một lớp có kích thước 200 – 1000 nm. Phương pháp tiến hành nhanh nhưng hiệu suất tạo liposome thấp, dược chất phải tiếp xúc với nhiệt độ và dung môi, có thể ảnh hưởng tới độ ổn định của chế phẩm [3], [4], [19]. Ngoài ra còn có thể bào chế liposome theo một số phương pháp khác [4], [17]: - Phương pháp bốc hơi pha đảo. - Phương pháp đông khô. - Phương pháp dùng chất diện hoạt. - Phương pháp màng tiếp hợp. - Phương pháp phun hỗn hợp chất lỏng hòa tan trong khí siêu tới hạn. - Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn.
9 1.3. Bào chế liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol So với các phương pháp bào chế trước đây, phương pháp pha loãng ethanol có ưu điểm nổi bật với quy trình bào chế đơn giản, dễ thực hiện, tạo ra các liposome có kích thước nhỏ, tương đối đồng nhất mà không cần trải qua quá trình siêu âm làm giảm KTTP. Quy trình bào chế liposome theo phương pháp pha loãng ethanol được bố trí rất đơn giản: Lipid và các thành phần tạo màng với nồng độ phù được được hòa tan trong ethanol, tiêm nhanh vào môi trường nước hoặc hệ đệm phù hợp kết hợp khuấy trộn ở tốc độ phù hợp. Dược chất được hòa tan dung dịch ethanol hoặc trong môi trường đệm phụ thuộc vào độ tan. Do thay đổi dung môi, các SUV có kích thước khoảng 25 nm được tạo thành. Siêu lọc để loại ethanol và tinh chế liposome [3], [4], [11], [19]. Phương pháp pha loãng ethanol hiện nay được cải tiến bằng cách sử dụng hệ thống kim phun nhằm khắc phục hạn chế, nâng cao quy mô bào chế. Pha nước, pha ethanol được làm nóng tới 55oC. Pha nước được bơm liên tục nhờ bơm nhu động từ (2) sang (3), quay trở lại (2), trong quá trình bơm khi pha nước đi qua hệ thống kim phun, pha ethanol có hòa tan phospholipid được bơm dưới áp lực nén của (5) qua thiết bị đầu kim phun (1) [25]. 1. Hệ thống kim phun (2, 3). Pha nước 4. Pha ethanol 5. Thiết bị nén khí nito 6. Bơm nhu động Hình 1.4. Sơ đồ hệ thống kim phun tạo dòng [25]. Hiệu suất và chất lượng liposome tạo thành có thể phụ thuộc vào các yếu tố: tốc độ tiêm; nồng độ phospholipid trong dung dịch ethanol và trong dung dịch đệm; đường kính bơm kim tiêm, áp suất bơm; pH và áp suất thẩm thấu dung dịch đệm; tốc
10 độ khuấy trộn; tỷ lệ thể tích ethanol/đệm [4], [17].Trong nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố trên được tiến hành bởi Kremer và cộng sự năm 1977 đã chỉ ra rằng tốc độ tiêm không ảnh hưởng đến quá trình tạo liposome [17]. Một số dung môi thân nước có thể thay thế cho ethanol như propanol, isopropanol, ethyl acetat Đặc biệt trong trường hợp ethanol ảnh hưởng đến độ ổn định của dược chất [12]. Dược chất được liposome hóa bằng phương pháp tiêm ethanol rất đa dạng như enrofloxacin, cyprofloxacin, indomethacin, triamcinolon [17], beclomethason với hiệu suất liposome hóa lên đến 93% [14]. Dược chất có thể gắn theo cơ chế thụ động: dược chất thân nước được hòa tan vào pha nước, dược chất thân dầu được hòa tan trong ethanol. Cũng có thể gắn theo cơ chế chủ động: thường áp dụng với dược chất thân nước. Theo cơ chế thụ động dược chất thân dầu đạt hiệu suất gắn vào liposome rất cao (~100%), hiệu suất gắn của dược chất thân nước rất thấp (~16%). Kích thước và độ đồng nhất của liposome không khác nhau nhiều giữa hai loại dược chất. Từ đó cho thấy phương pháp tiêm ethanol phù hợp cao hơn với việc liposome hóa dược chất thân dầu [15]. Bên cạnh đó, phương pháp pha loãng ethanol còn tồn tại nhiều hạn chế như: giới hạn về độ tan của phospholipid trong ethanol (40mM đối với phosphatidylcholin) và tỷ lệ thể tích ethanol/pha đệm (≤ 7,5 v/v) do đó liposome thu được thường bị pha loãng; hiệu suất liposome hóa thấp đặc biệt với các dược chất thân nước, dung môi ethanol tồn dư cần được loại bỏ bằng phương pháp thẩm tách [4], [17], [19]. Phương pháp pha loãng ethanol hiện được ứng dụng nhiều trên thế giới, được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu bào chế liposome. Năm 2008, Johnston Micheal J. W. và cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome DOX bằng phương pháp pha loãng ethanol. Các lipid được sử dụng là disteroyl phosphatidylcholin, cholesterol, spingomyelin trứng được hòa tan trong ethanol, bơm vào dung dịch MgSO4 để tạo liposome. Lọc ép 10 lần qua màng polycacbonat 100 nm thu được liposome có kích thước 110 nm ± 25 nm. Dược chất DOX được hòa tan thành dung dịch rồi phối hợp vào liposome ủ trong 90 phút ở 65oC. Các tác giả đã
11 tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ lipid – thuốc đến khả năng giải phóng thuốc và sự toàn vẹn của liposome trong công thức liposome DOX. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng DOX có thể gắn vào liposome để đạt giá trị D/L cao đến 0,46%. Tỷ lệ thuốc được giải phóng từ liposome có thể thay đổi trong một khoảng rộng tương ứng với sự thay đổi các giá trị D/L và sự liposome hóa. Đồng thời nghiên cứu cũng chỉ ra rằng nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi cấu trúc và làm vỡ màng liposome là do sự lắng thuốc ở các cấu trúc bên trong liposome [16]. Năm 2010, Chiraz Jaafar – Maalei đã cải tiến phương pháp tiêm ethanol bằng cách sử dụng thêm một màng liên kết để bào chế liposome với dược chất indomethacin và beclomethason, khảo sát một số yếu tố như dòng chảy pha nước, nồng độ phospholipid Hiệu suất liposome hóa thu được với indomethacin là 63%, beclomethason 93%, kích thước giao động trong khoẳng 50 – 160 nm [14]. Philippe Gentine năm 2011 đã tiến hành nghiên cứu một số dung môi thân nước thay thế cho ethanol sử dụng trong phương pháp pha loãng ethanol như propanol, butanol, isopropanol, ethyl acetat Kết quả cho thấy chỉ có isopropanol tạo liposome có kích thước nhỏ (84,8 ± 5,5 nm), chỉ số đa phân tán PDI nhỏ (0,224 ± 0,012) và không phụ thuộc nhiều vào các yếu tố khảo sát như nồng độ phospholipid, thể tích dung môi, tốc độ bơm, tốc độ khuấy trộn. Tác giả cho rằng có thể dùng isopropanol để thay thế cho ethanol trong sản xuất liposome [12]. 1.4. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin 1.4.1. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin trên thế giới Trong những năm gần đây trên thế giới, liposome DOX vẫn thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học. Zhaohui Wang và cộng sự (năm 2012) đã nghiên cứu bào chế liposome miễn dịch gắn peptid hướng đích trong điều trị ung thư di căn (TMT-LS) sử dụng liposome có gắn một peptid hướng đích di căn ung thư cụ thể. Liposome được bào chế bằng phương pháp hydrat hóa film (SPC: CHL: DSPE PEG = 20: 10: 2) hydrat hóa bằng 123mM amoni sulfat, siêu âm trong 30 phút sử dụng sắc ký lọc gel Sephadex G-50 thu lấy các liposome có kích thước 100 nm, nạp DOX nhờ phương pháp tạo chênh
12 lệch pH, tinh chế liposome bằng phương pháp lọc trên gel. Sau quy trình bào chế thu được các TMT-LS có kích thước 94,41 ± 0,1 nm, hiệu suất liposome hóa gần 100%. Phân tích qua đo dòng tế bào cho thấy nồng độ TMT-LS-DOX tập trung tại dòng tế bào ung thư di căn (MDA-MB-435S và MDA-MB-23J) cao hơn hẳn so với LS-DOX trong khi đó không có sự khác biệt đáng kể về nồng độ dược chất tại khối u giữa TMT-LS-DOX và LS-DOX ở dòng tế bào ung thư không di căn (MCF-7). Sau 14 ngày, kích thước khối u từ 6,6 ± 1,57 cm giảm xuống 3,63 ± 0,37 cm khi điều trị bằng LS-DOX và 1,71 ± 0,33 cm khi sử dụng TMT-LS-DOX [24]. Antonella Accardo và cộng sự (năm 2012) đã nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng của liposome DOX gắn nhóm peptid MonY-BN tới các receptor bombesin tại tế bào ung thư (DSPC-MonY-BN-DOX). Liposome với thành phần bao gồm DSPC và MonY-BN (tỷ lệ mol 97: 3) được bào chế bằng phương pháp bốc hơi pha đảo, được đùn qua màng polycarbonat kích thước lỗ lọc 100 nm nhờ áp suất khí Nitơ tạo ra liposome đường kính 145,5 ± 31,5nm và chỉ số đa phân tán PDI 0,2 ± 0,05, thế Zeta -12,8 ± 3,6mV. Nạp DOX bằng phương pháp chênh lệch pH sử dụng đệm HEPES pH 7,4 bên ngoài liposome, hiệu suất liposome hóa 95,0 ± 2,7%. Liposome DSPC/MonY-BN tập trung trong tế bào PC-3 là 2,7% ± 0,3% ở 37oC so với liposome DSPC peptid tự do 1,4 ± 0,2%. Ở 37oC DSPC-MonY-BN-DOX ức chế sự phát triển khối u cao hơn (60%) so với DSPC/ DOX liposome không đặc hiệu (36%) [9]. Từ một số nghiên cứu nói trên ta có thể nhận thấy rằng xu hướng hiện nay trên thế giới là tập trung phát triển các dạng liposome nhạy cảm với điều kiện môi trường hoặc có bề mặt gắn thêm các nhóm liên kết với kháng nguyên của tế bào u nhằm tăng tính hướng đích, tăng tác dụng điều trị, giảm tác dụng phụ. 1.4.2. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin tại Việt Nam Năm 2011, Đào Thanh Tùng đã nghiên cứu bào chế và đánh giá các đặc tính của liposome DOX bằng phương pháp hydrat hóa film với thành phần tạo màng gồm có SPC và CHL, dược chất được đưa vào liposome bằng hai phương pháp thụ động và chủ động qua tạo chênh lệch pH qua màng. Kết quả đã khảo sát được công thức tỷ lệ mol SPC: CHL (7:3), tỷ lệ mol dược chất: lipid (5:1) và xây dựng quy trình bào chế
13 liposome DOX với kích thước 80%. Hàm lượng dược chất trong hệ phân tán~1mg/ml. Nghiên cứu bước đầu đã khảo sát và đưa ra công thức bào chế liposome DOX tuy còn nhiều hạn chế như: liposome tạo ra có kích thước lớn và không đồng đều bằng các nghiên cứu tham khảo trước đó, hiệu suất liposome hóa chưa cao do sử dụng phương pháp tạo chênh lệch pH bằng cách điều chỉnh pH thông thường sau khi hydrat hoá, do đó trong và ngoài liposome vẫn cùng một hệ đệm [7]. Dựa trên cơ sở tiếp nối các kết quả thu được và khắc phục những hạn chế còn tồn tại từ nghiên cứu của Đào Thanh Tùng, năm 2012 Nguyễn Văn Lâm đã tiến hành nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome DOX 2mg/ml ở quy mô phòng thí nghiệm và đánh giá tác dụng của chế phẩm trên khối u động vật. Liposome được bào chế bằng phương pháp hydrat hóa film có thành phần tạo màng SPC: CHL (10:2), dược chất đưa vào liposome bằng phương pháp chủ động thông qua tạo chênh lệch pH giữa hai bên màng bằng thay đệm amoni sử dụng phương pháp lọc tiếp tuyến ở môi trường bên ngoài liposome. Giảm KTTP bằng quá trình siêu âm. Liposome thu được có KTTP 80%. TCCS cho thuốc tiêm liposome DOX đã được đề xuất và thẩm định tại Viện kiểm nghiệm thuốc TW. Đánh giá tác dụng của liposome DOX trên khối u động vật cho thấy ưu thế vượt trội của thuốc tiêm dạng liposome so với dạng dung dịch đặc biệt trên khối u dưới da. Tuy nhiên nghiên cứu vẫn chưa giải quyết được những nhược điểm chung của phương pháp hydrat hóa màng film (quy trình kéo dài, nhiều công đoạn, cần siêu âm làm giảm kích thước tiểu phân ) [5].
14 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu - Liposome. - Liposome DOX. 2.1.2. Nguyên vật liệu Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu được sử dụng. Tiêu STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc chuẩn 1 Doxorubicin hydroclorid Ấn Độ USP 2 Cholesterol Sigma Aldrich USP Phosphatidylcholin dầu đậu nành 3 Lipoid USP đã hydrogen hóa (HSPC) 4 Ethanol tuyệt đối Trung Quốc TKHH 5 Acid citric Trung Quốc TKHH HEPES 6 (N-2-hydroxy ethyl piperazin – N – Mỹ USP 2 – ethan sulfonic acid) 7 Kali dihydrophosphat Trung Quốc TKHH Triton X100 (Octylphenolpoly – 8 Amresco Ohio-Mỹ TKHH (ethylen glycolether)) 9 Túi thẩm tích Spectrum laboratory-Mỹ TCCS 10 Natri hydroxid Trung Quốc TKHH 11 Natri clorid Trung Quốc TKHH 12 Dung dịch tiêm truyền glucose 5% Việt Nam DĐVN 2.1.3. Phương tiện nghiên cứu - Bể điều nhiệt (hãng Buchi-Đức). - Thiết bị đồng nhất hóa tốc độ cao Unidriver X1000. - Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Modules, màng polysulfone, kích cỡ lỗ 10kD, diện tích lọc 20cm2 (Mỹ).
15 - Thiết bị phân tích kích thước tiểu phân Zetasizer ZS90 (Malvern-Anh). - Máy ly tâm lạnh Universal 320R (Hettich-Đức). - Máy quang phổ UV-VIS U-1800 (Hitachi-Nhật Bản). 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp bào chế liposome doxorubicin 2.2.1.1. Bào chế liposome trắng chưa mang dược chất Được tiến hành theo các nghiên cứu đã tham khảo trước đó [5]: - Cân phosphatidylcholin và cholesterol (100: 30 kl/kl) hòa tan hoàn toàn trong thể tích ethanol phù hợp. - Chuẩn bị dung dịch đệm citrat 300mM pH 4. - Phối hợp pha ethanol vào pha nước bằng loại bơm tiêm phù hợp, kết hợp khuấy trộn và duy trì nhiệt độ thích hợp. - Lọc tiếp tuyến để cô đặc hệ liposome về 10ml. - Đổi môi trường bên ngoài liposome bằng phương pháp lọc tiếp tuyến sử dụng đệm HBG (20mM HESPES / 1l dung dịch glucose). 2.2.1.2. Nạp dược chất Dựa trên sự chênh lệch pH. - Sau khi đổi đệm HEPES bên ngoài liposome, sự chênh lệch pH tạo động lực cho quá trình nạp dược chất theo cơ chế chủ động. - Cân chính xác lượng DOX.HCl để đạt hàm lượng 2mg/ml sử dụng thiết bị khuấy từ để DOX hòa tan và khuếch tán vào trong liposome. Ủ trong 10p để khuếch tán hoàn toàn. - Liposome được đóng lọ thủy tinh, đậy kín, bọc giấy và bảo quản ở 2 – 8oC. 2.2.2. Phương pháp đánh giá liposome doxorubicin 2.2.2.1. Phương pháp đánh giá hình thức, kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân - Hình thức: liposome doxorubicin sau khi được bào chế phải là hỗn dịch đục mờ màu đỏ cam, để lâu có thể bị lắng cặn nhưng dễ dàng phân tán đều trở lại khi lắc nhẹ
16 - Hình dạng và cấu trúc liposome: sử dụng phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền qua với kỹ thuật nhuộm soi âm bản xác định hình thái và cấu trúc của liposome. - KTTP và phân bố KTTP: sử dụng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) với thiết bị Zetasizer ZS90. Đánh giá KTTP và phân bố KTTP dựa vào giá trị đường kính trung bình (Zaverage), bảng và đồ thị phân bố kích thước theo thể tích, chỉ số đa phân tán (PDI). 2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng doxorubicin toàn phần và hiệu suất liposome hóa - Xây dựng đường chuẩn định lượng DOX tự do ở bước sóng 233 nm, DOX toàn phần ở bước sóng 481 nm, xây dựng đường hồi quy tuyến tính biểu hiện tương quan giữa mật độ quang và nồng độ DOX. - Định lượng DOX toàn phần: tiến hành theo các nghiên cứu được tham khảo trước đó [1], [7], với các giai đoạn chính: + Phá vỡ cấu trúc liposome bằng Triton 10%. + Pha loãng đến tỷ lệ thích hợp, đo quang ở 481 nm [1], [7]. + Nồng độ DOX.HCL toàn phần tính theo công thức: DTP Ctp = × ′c × K' D’C DTP, D’C: mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn đem đo. CTP: hàm lượng DOX toàn phần của mẫu liposome doxorubicin (mg/ml) C’C: Nồng độ DOX trong dung dịch chuẩn (mg/ml) K’: Hệ số pha loãng. - Định lượng DOX tự do bên ngoài liposome: tiến hành theo các nghiên cứu được tham khảo trước đó [1], [7] theo các bước chính: + Lọc bằng túi thẩm tích để DOX tự do khuếch tán ra môi trường bên ngoài. + Hút dịch bên ngoài túi thẩm tích, pha loãng, đo quang ở 233 nm [1], [7]. + Nồng độ DOX.HCl tự do được tính theo công thức: DN CN = × c × K DC DN,DC: mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn đem đo
17 CN: Hàm lượng DOX tự do của mẫu liposome doxorubicin (mg/ml). CC: Nồng độ DOX trong dung dịch chuẩn (mg/ml). K: Hệ số pha loãng. - Hiệu suất liposome hóa (hàm lượng DOX được gắn vào liposome). Tính theo công thức: CTP.V0 – CN.VN H = (%) CTP.V0 H: Hiệu suất liposome hóa. CN, CTP: Hàm lượng DOX tự do và DOX toàn phần (mg/ml). VN, V0: Thể tích dung dịch DOX tự do và toàn phần (ml). 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu: - Mỗi thí nghiệm làm 3 lần và lấy kết quả theo giá trị trung bình. Các số liệu được xử lý thống kê để xác định giá trị trung bình, độ lệch chuẩn S, ở mức tin cậy p = 0,95. - Xử lý thống kê bằng phần mềm và Microsoft Office Excel. 2.2.4. Điều kiện thí nghiệm DOX là một chất có độc tính, không dễ khuếch tán hay bay hơi nhưng có khả năng lây nhiễm qua dụng cụ, môi trường thí nghiệm và tiếp xúc trực tiếp. Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện: - Khu vực thí nghiệm riêng biệt, tránh ánh sáng, được vệ sinh trước và sau làm thí nghiệm. Có thiết bị bảo hộ cho người làm nghiên cứu. - Trang thiết bị, dụng cụ dùng xong phải được xử lý riêng. Các dụng cụ được ngâm với dung dịch sulfocromat để oxy hóa hết DOX. - Các chất thải được ngâm với sulfocromat trước khi xử lý riêng.
18 Chương 3. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn Tham khảo các nghiên cứu trước đó đã khảo sát ảnh hưởng của tá dược đến phép đo quang cũng như lựa chọn các bước sóng thích hợp để tiến hành định lượng DOX tự do và toàn phần [7]. Xây dựng đường chuẩn định lượng DOX theo các tài liệu tham khảo đã nêu trong mục 2.2.2. Đo mật độ quang các dung dịch DOX chuẩn có nồng độ 1, 2, 4, 6, 10, 12 µg/ml ở bước sóng 233 nm, các dung dịch DOX chuẩn có nồng độ 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 µg/ml ở bước sóng 481 nm. Kết quả trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.1. Bảng 3.1. Kết quả đo mật độ quang các mẫu dung dịch doxorubicin ở bước sóng 233 và 481 nm (pH 4). Bước Nồng độ DOX (µg/ml) sóng 1 2 4 6 8 10 12 233 nm 0,052 0,100 0,194 0,305 0,438 0,544 0,663 pH 4 ± 0,002 ± 0,005 ± 0,004 ± 0,005 ± 0,002 ± 0,001 ±0,002 Bước Nồng độ dox (µg/ml) sóng 6 8 10 12 14 16 18 20 481 nm 0,112 0,160 0,234 0,263 0,306 0,342 0,377 0,195 pH 4 ±0,002 ± 0,001 ± 0,001 ± 0,001 ±0,001 ±0,001 0,7 y = 0,056x - 0,016 0,6 R² = 0,998 0,5 0,4 y = 0,019x + 0,007 R² = 0,998 0,3 quang ộ 0,2 t đ t ậ 0,1 M 0 Nồng độ dung dịch DOX µg/ml 0 5 10 15 20 25 Hình 3.1. Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ .
19 Nhận xét: kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ DOX và mật độ quang ở các điều kiện khảo sát tại hai bước sóng 233 nm và 481 nm ở pH 4 trong khoảng nồng độ khảo sát từ 1µg/ml đến 20µg/ml. Như vậy có thể áp dụng phương pháp đo quang ở khoảng nồng độ khảo sát để định lượng và xác định hiệu suất liposome hóa cho liposome DOX. 3.2. Xây dựng quy trình bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol 3.2.1. Quy trình bào chế chung Quy trình bào chế liposome DOX được tiến hành theo các bước đã nêu trong mục 2.2.1: - Pha ethanol: hòa tan 100mg HSPC, 30mg CHL trong Vml ethanol tuyệt đối (tỷ lệ về thành phần trong công thức được giữ nguyên so với các nghiên cứu tiến hành trước đó). - Pha nước: 100ml dung dịch đệm citrat 300mM pH 4. - Tiêm nhanh Vml ethanol vào 100ml dung dịch đệm tốc độ tiêm 0,5ml/s, kết hợp khuấy trộn 4000v/p bằng máy đồng nhất hóa tốc độ cao. + V= 3, 5, 7, 10 (ml) + Kiểm soát nhiệt độ trong và sau khi tiêm 10 phút (40oC, 50oC, 60oC, 70oC, 80oC) + Kết hợp thêm quá trình làm giảm kích thước tiểu phân bằng đùn qua màng có kích thước 200nm, 100nm để so sánh sự khác nhau giữa các mẫu thu được. - Cô đặc về 10ml bằng lọc tiếp tuyến. - Đổi đệm bên ngoài liposome bằng đệm HEPES pH 7,4. - Nạp dược chất DOX.HCL để đạt nồng độ 2mg/ml kết hợp thiết bị khuấy từ cho DOX.HCL tan hết, ủ ở nhiệt độ 50oC trong 10 phút, bảo quản ở 2 – 8oC trong 24h, sau đó tiến hành định lượng DOX toàn phần và xác định hiệu suất liposome hóa theo các bước đã nêu trong 2.2.2.2. Trong quá trình nghiên cứu, cố định các bước tiến hành và các thông số: hàm lượng HSPC, CHL, DOX.HCl; loại đệm sử dụng bên trong và bên ngoài liposome; tốc độ
20 tiêm, tốc độ khuấy trộn; quá trình nạp dược chất: nhiệt độ, thời gian ủ vào bảo quản liposome DOX. Tiến hành thay đổi các thông số: thể tích ethanol; nhiệt độ trong và sau quá trình khuấy trộn; kết hợp quá trình làm giảm KTTP bằng nén qua màng và khảo sát ảnh hưởng của các thông số nói trên tới KTTP và hiệu suất liposome hóa. 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật trong quy trình bào chế đến kích thước tiểu phân và hiệu suất liposome hóa 3.2.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi Thay đổi thông số về thể tích ethanol, cố định tất cả các thông số còn lại trong quá trình bào chế nhằm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến KTTP liposome và hiệu suất liposome hóa. Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến KTTP và hiệu suất liposome hóa. Thể tích Thể tích Tốc độ Hàm lượng Công HSPC CHL đệm Nhiệt độ ethanol khuấy trộn toàn phần thức (mg) (mg) citrat (oC) (ml) (v/p) (mg/ml) (ml) M3 100 30 100 3 60 4000 2 M5 100 30 100 5 60 4000 2 M7 100 30 100 7 60 4000 2 M10 100 30 100 10 60 4000 2 Kết quả - Hình thức: + Liposome thu được sau khi bào chế là hỗn dịch đồng nhất có màu trắng đục. + Hệ liposome DOX: M3, M5, M7, M10 là hỗn dịch đục mờ màu đỏ cam. Khi để lâu các mẫu M3, M5, M7 có thể xuất hiện hiện tượng lắng cặn nhưng dễ dàng phân tán đều trở lại sau khi lắc nhẹ. Trong khi đó liposome DOX M10 thưởng xuyên tạo cặn lắng. Cá biệt có trường hợp xuất hiện các tiểu phân có kích thước lớn quan sát được bằng mắt thường.
21 Hình 3.2. Liposome doxorubicin bào chế theo các tỷ lệ dung môi khác nhau. - KTTP, phân bố KTTP liposome được trình bày trong bảng 3.3. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến KTTP, phân bố KTTP liposome. Trước lọc tiếp tuyến Sau lọc tiếp tuyến Công thức PDI Zaverage (d.nm) PDI Zaverage (d.nm) M3 0,258 259,6 0,228 217,9 M5 0,254 214,9 0,217 206,9 M7 0,208 130,1 0,183 105,1 M10 0,213 153,7 0,207 149,9 PDI (A) Zaverage d.nm (B) 0,3 300 0,25 250 0,2 200 0,15 150 0,1 100 0,05 50 0 0 M3 M5 M7 M10 M3 M5 M7 M10 Trước lọc tt Sau lọc tt Trước lọc tt Sau lọc tt Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi PDI (A) và KTTP (B) theo tỷ lệ dung môi.
22 (A) (B) Hình 3.4. Đồ thị phân bố KTTP theo thể tích các mẫu trước (A) và sau (B) lọc tiếp tuyến. - Nhận xét: + Các mẫu liposome thu được ở các tỷ lệ dung môi khác nhau đều có kích thước nhỏ (< 260 nm trước lọc tiếp tuyến, và < 220 nm sau lọc tiếp tuyến), chỉ số đa phân tán PDI nhỏ (< 0,3), chứng tỏ hệ thu được tương đối đồng nhất. Không có sự khác biệt quá lớn giữa các mẫu. + Quan sát đồ thị phân bố KTTP và chỉ số đa phân tán PDI theo chiều tăng dần của tỷ lệ thể tích ta nhận thấy: từ M3 đến M7 các liposome thu được có kích thước giảm dần, KTTP liposme ở mẫu M10 tăng nhẹ so với mẫu M7. Chỉ số đa phân tán của hệ thu được cũng có sự biến đổi tương tự: giảm dần từ M3 đến M7, tăng nhẹ ở M10. Do vậy có thể nhận thấy ở tỷ lệ 7/100 ethanol/nước hệ thu được có KTTP nhỏ nhất, đồng nhất hơn so với các mẫu khác. + Dựa vào bảng số liệu cũng như đồ thị biểu diễn sự biến đổi các giá trị PDI và Zaverage của cùng một mẫu trước và sau khi lọc tiếp tuyến, ta nhận thấy sau khi lọc tiếp tuyến, hệ có sự thay về KTTP và phân bố KTTP, các mẫu khác nhau đều quan sát thấy Zaverage và PDI giảm chứng tỏ hệ thu được có KTTP nhỏ hơn đồng nhất hơn. + So sánh đồ thị phân bố KTTP theo thể tích của các mẫu và của cùng một mẫu (phụ lục 1) trước và sau lọc tiếp tuyến ta nhận thấy: sau lọc tiếp tuyến, phần lớn thể tích của hệ tập trung ở các hạt có KTTP nhỏ. Hiện tượng trên có thể do trong quá trình lọc tiếp tuyến ethanol tiếp tục bị loại đi dẫn đến sự tái cấu trúc tiểu phân của hệ, làm thay đổi phân bố KTTP theo thể tích.
23 Như vậy theo chiều tăng dần tỷ lệ dung môi hệ thu đươc có xu hướng đạt kích thước nhỏ hơn, đồng nhất hơn. Tuy nhiên khi tỷ lệ dung môi tăng tới một giá trị nhất định (10/100) hệ có xu hướng tăng KTTP và chỉ số đa phân tán. Về mặt hình thức ta cũng nhận thấy rằng các mẫu M10 thường xuyên xuất hiện hiện tượng kết lắng tiểu phân. Cá biệt còn xuất hiện một số mẫu liposome DOX có các tiểu phân với kích thước lớn dạng vẩn đục. Trong hệ thu được các tiểu phân có kích thước lớn (4000nm) cũng chiếm tỷ lệ thể tích đáng kể (3,7%). Kết quả quan sát được là phù hợp với các nghiên cứu trước đó chỉ ra rằng tỷ lệ ethanol/đệm nên nhỏ hơn 7,5/100 [18]. - KTTP, phân bố KTTP liposome DOX, hàm lượng toàn phần và hiệu suất liposome hóa được trình bày trong bảng 3.4. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến KTTP và hiệu suất liposome hóa. Hàm lượng Công thức PDI Zaverage (d.nm) toàn phần EE (%) (mg/ml) M3 0,245 228,0 1,88 ± 0,01 87,66 ± 1,34 M5 0,231 215,6 1,89 ± 0,05 88,55 ± 0,48 M7 0,203 123,0 2,03 ± 0,06 90,02 ± 1,00 M10 0,213 175,1 1,93 ± 0,05 89,63 ± 1,11 Zaverage d.nm (A) PDI EE % (B) 250 0,3 91 0,25 200 90 0,2 150 89 0,15 100 88 0,1 87 50 0,05 86 0 0 M3 M5 M7 M10 M3 M5 M7 M10 EE % Zaverage PDI Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP, PDI (A) và hiệu suất liposome hóa (B) theo tỷ lệ dung môi.
24 - Nhận xét: + Quan sát bảng giá trị KTTP và chỉ số đa phân tán PDI ta nhận thấy các mẫu đều thu được hệ tương đối đồng nhất với KTTP nhỏ ( 85%. Như vậy hiệu suất liposome hóa của liposome dox bào chế bằng phương pháp pha loãng ethanol cao tương đương phương pháp hydrat hóa màng film đã tiến hành trong các nghiên cứu trước đó [1], [5], [6]. + Quan sát đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP và chỉ số đa phân tán PDI theo tỷ lệ dung môi nhận thấy công thức M7 cho liposome DOX có KTTP và chỉ số đa phân tán PDI nhỏ nhất trong các mẫu tạo thành. + Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hiệu suất liposome hóa theo tỷ lệ dung môi cho thấy thấy hiệu suất liposome hóa tăng dần từ M3 đến M7 và lại giảm ở mẫu M10. Như vậy công thức M7 cho hiệu suất liposome hóa cao nhất trong các mẫu khảo sát. Kết quả nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến KTTP và hiệu suất liposome hóa cho thấy công thức M7 thu được hệ liposome có KTTP nhỏ, đồng nhất và hiệu suất liposome hóa cao tốt nhất trong số các công thức khảo sát. Điều này là phù hợp với các tài liệu tham khảo trước đó [17]. Do vậy lựa chọn tỷ lệ ethanol/nước là 7/100 để tiến hành nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố khác 3.2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ Như đã nói ở trên, mẫu 7/100 được chọn để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ trong và sau khi phối hợp hai pha tới KTTP và hiệu suất liposome hóa. Cố định tất cả các thông số khác trong quy trình bào chế thay đổi thông số nhiệt độ khảo sát bằng cách sử dụng bể điều nhiệt.
25 Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ duy trì trong và sau phối hợp hai pha đến KTTP và hiệu suất liposome hóa. Thể tích Thể tích Tốc độ Hàm lượng Công HSPC CHL Nhiệt độ đệm citrat ethanol khuấy toàn phần thức (mg) (mg) (oC) (ml) (ml) trộn (v/p) (mg/ml) M74 100 30 100 7 40 4000 2 M75 100 30 100 7 50 4000 2 M76 100 30 100 7 60 4000 2 M77 100 30 100 7 70 4000 2 M78 100 30 100 7 80 4000 2 Kết quả - Hình thức: hệ liposome DOX là hỗn dịch đục mờ màu đỏ cam, để lâu có thể xuất hiện hiện tượng lắng cặn nhưng dễ dàng phân tán đều trở lại sau khi lắc nhẹ. - KTTP, chỉ số đa phân tán, hàm lượng DOX toàn phần và hiệu suất liposome hóa được cho bởi bảng 3.6. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến KTTP và hiệu suất liposome hóa Sau lọc tiếp Liposome DOX Hàm lượng Công tuyến EE toàn phần thức Z Z (%) PDI average PDI average (mg/ml) (d.nm) (d.nm) M74 0,26 159,4 0,27 190,7 1,91 ± 0,03 89,41 ± 0,69 M75 0,22 148,3 0,24 184,5 1,91 ± 0,02 88,30 ± 0,59 M76 0,20 149,9 0,21 185,1 2,01 ± 0,06 90,52 ± 1,00 M77 0,25 163,8 0,27 190,1 1,98 ± 0,04 90,14 ± 2,04 M78 0,27 180,1 0,28 203,5 1,92 ± 0,03 88,67 ± 1,17 - Sự thay đổi KTTP, chỉ số đa phân tán PDI của liposome DOX và hiệu suất liposome hóa của hệ theo chiều tăng dần nhiệt độ bào chế được thể hiện trong đồ thị hình 3.6.
26 Zaverage d.nm PDI EE % 205 0,3 91 200 0,25 90,5 90 195 0,2 89,5 190 0,15 89 88,5 185 0,1 88 180 0,05 87,5 175 0 87 M74 M75 M76 M77 M78 M74 M75 M76 M77 M78 Zaverage PDI EE % Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP, PDI (A) và hiệu suất liposome hóa (B) theo nhiệt độ. - Nhận xét: + Quan sát bảng số liệu cho thấy liposome thu được với các mẫu khác nhau đều có kích thước nhỏ, độ đồng nhất cao, Zaverage 1,89 mg/ml, hiệu suất liposome hóa cao ( > 88%). + Khi quan sát đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP, chỉ số đa phân tán PDI, hiệu suất liposome hóa theo chiều tăng dần nhiệt độ bào chế ta nhận thấy khi nhiệt độ thay đổi xuất hiện xu hướng: Khi nhiệt độ tăng dưới 60oC, KTTP và chỉ số đa phân tán PDI của hệ giảm dần, hiệu suất liposome hóa tăng dần. Trong khi đó với khoảng nhiệt độ thay đổi từ 60oC đến 80oC, KTTP, PDI tăng dần trong khi hiệu suất liposome hóa có giảm dần. Như vậy mẫu M76 bào chế ở 60oC cho kết quả tốt nhất trong các nhiệt độ khảo sát với hệ liposome DOX có độ đồng nhất cao, chỉ số đa phân tán (PDI) thấp (0.213); KTTP nhỏ ( < 180nm), hiệu suất liposome hóa đạt 90,52%. Điều này có thể được hiểu khi nhiệt độ quá thấp, liposome kém linh động làm giảm khả năng tạo và tái tạo liposome. Các tài liệu tham khảo cũng chỉ ra rằng nên tiến hành bào chế ở nhiệt độ
27 o cao hơn nhiệt độ chuyển pha phospholipid (Tc 53 C) [25]. Tuy nhiên không nên bào chế ở nhiệt độ quá cao do nhiệt độ cao sẽ có thể gây phân hủy liposome, ngoài ra ở nhiệt độ quá cao lớp màng phospholipid quá lỏng lẻo, khó tạo thành liposome. Do vậy lựa chọn nhiệt độ bào chế 60oC, tiếp tục tiến hành nghiên cứu các yếu tố khác. 3.2.3. Đánh giá vai trò của giai đoạn làm giảm kích thước tiểu phân trong quy trình bào chế Bảng 3.7. So sánh các giai đoạn trong quy trình bào chế liposome doxorubicin bằng các phương pháp khác nhau. Quy trình bào chế Phương pháp pha loãng Phương pháp tiến hành liposome dox ethanol trong các nghiên cứu trước Tạo liposome theo quy Tạo liposome bằng trình 2.2.1. - Hydrat hóa màng film - Bốc hơi pha đảo Giảm KTTP và đồng nhất Giai đoạn hóa bằng siêu âm hoặc nén qua màng polycacbonat có kích thước phù hợp. Nạp dược chất thông Nạp dược chất thông qua qua tạo chênh lệch pH. tạo chênh lệch pH. - Như vậy khi so sánh với các phương pháp bào chế trước đó ta nhận thấy phương pháp pha loãng ethanol không trải qua quá trình làm giảm kích thước tiểu phân nhưng hệ mang thuốc tạo ra vẫn có kích thước nhỏ, đồng nhất, hàm lượng DOX toàn phần và hiệu suất liposome hóa thu được cao (theo kết quả thu được khi đánh giá ảnh hưởng tỷ lệ dung môi, nhiệt độ tới KTTP, chỉ số đa phân tán và hiệu suất liposome hóa).
28 Tuy nhiên để đánh giá sự cần thiết của quá trình làm giảm KTTP đến quy trình bào chế liposome DOX bằng phương pháp pha loãng ethanol, tiến hành bố trí thí nghiệm như sau: + công thức M761 bào chế bằng phương pháp pha loãng ethanol, lọc tiếp tuyến để cô đặc giảm thể tích, không sử dụng các biện pháp làm giảm KTTP, đổi đệm, nạp dược chất, xác định hàm lượng DOX toàn phần và hiệu suất liposome hóa. + công thức M762 bào chế bằng phương pháp pha loãng ethanol, lọc tiếp tuyến giảm thể tích, đùn qua màng 200 nm, 100 nm bằng thiết bị extrusion làm giảm KTTP, đổi đệm, nạp dược chất, xác định hàm lượng DOX toàn phần, hiệu suất liposome hóa. Kết quả - Hình thức: + Hệ liposome thu được sau bào chế các mẫu đều thu được hỗn dịch đồng nhất màu trắng đục. + Hệ liposome DOX hỗn dịch đục mờ màu đỏ cam, khi để lâu có thể xuất hiện hiện tượng lắng cặn nhưng dễ dàng phân tán đều trở lại khi lắc nhẹ. - Kết quả KTTP, phân bố KTTP liposome và hiệu suất liposome hóa được trình bày trong bảng 3.8. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của quá trình làm giảm KTTP đến KTTP và hiệu suất liposome hóa. Giai đoạn bào chế liposome chưa mang dược chất Sau nén qua Giai đoạn sau nạp dược chất Sau lọc tiếp Công màng tuyến thức polycacbonat Hàm lượng Zaverage Zaverage Zaverage EE PDI PDI PDI toàn phần (d.nm) (d.nm) (d.nm) (%) (mg/ml) M761 0,183 149,9 - - 0,213 175,1 2,04±0,06 90,52±1,00 M762 0,188 165,9 0,116 142,1 0,205 168,0 2,01±0,04 90,51±1,54 - Nhận xét:
29 + Với liposome chưa nạp dược chất, mẫu 2 cho hệ có kích thước nhỏ sau quá trình làm giảm KTTP bằng nén qua màng (Zaverage 90%. Như vậy không có sự khác biệt đáng kể ở các liposome DOX có và không trải qua quá trình làm giảm KTTP bằng nén qua màng. Do đó liposome bào chế bằng phương pháp pha loãng ethanol có thể không cần thiết phải trải qua quá trình làm giảm KTTP bằng nén qua màng. Do vậy lựa chọn quy trình bào chế liposome DOX không trải qua giai đoạn nén qua màng để làm giảm KTTP. 3.2.4. Đề xuất quy trình bào chế và đánh giá một số chỉ tiêu của liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol 3.2.4.1. Quy trình bào chế Từ quá trình thực nghiệm nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng kết hợp tài liệu tham khảo đề xuất quy trình cụ thể bào chế liposome DOX 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol. Công thức bào chế Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC) 100 mg Cholesterol 30 mg Ethanol 7ml Đệm citrat pH 4 100 ml Đệm HEPES pH 7,4 vừa đủ Doxorubicin hydroclorid 20 mg
30 Hòa tan HSPC: CHL (tỷ lệ kl 100: 30) trong Nhiệt độ: 60°C. 7ml ethanol/50oC. Bơm nhanh kết hợp khuấy trộn tốc độ cao Tốc độ: 4000 v/p Thời gian: 10 phút 100ml đệm citrat pH4 Màng PS 10kD Lọc tiếp tuy ến giảm thể tích Diện tich lọc: 28cm2 Đ ổ i đ ệ m bên ngoài 100ml đệm HEPES liposome b ằ ng l ọ c pH 7,4 ti ế p tuy ế n Đun cách thủy ở 50°C Hòa tan DOX.HCl, ủ 50oC/10p. Bảo quản 2 – 8oC Hình 3.7. Sơ đồ quy trình bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol 3.2.4.2. Đánh giá một số chỉ tiêu của liposome tạo ra - Hình thức: liposome DOX thu được sau bào chế bằng phương pháp pha loãng ethanol là hỗn dịch đục mờ màu đỏ cam. Để trong thời gian lâu có xuất hiện lắng cặn tuy nhiên khi lắc nhẹ, hệ dễ dàng phân tán đều trở lại. - KTTP, phân bố KTTP liposome và liposome DOX, hiệu suất liposome hóa cho bởi bảng 3.9.
31 Bảng 3.9. Kết quả KTTP và hiệu suất liposome hóa Liposome sau lọc Liposome DOX Hàm lượng tiếp tuyến Giá trị toàn phần EE (%) Z Z PDI average PDI average (mg/ml) (d.nm) (d.nm) M7611 0,173 140,3 165,4 0,201 2,01 90,08 M7612 0,182 149,7 175,4 0,205 2,07 91 M7613 0,198 139,7 188,7 0,208 2,07 89 Trung 0,184 143,2 176,5 0,205 2,05 ± 0,04 90,03 ± 1,00 bình - Hình dạng cấu trúc liposome đánh giá thông qua hình ảnh chụp TEM cho bởi hình 3.8. Hình 3.8: Ảnh chụp TEM liposome. - Nhận xét: + Liposome thu được từ các mẫu có KTTP nhỏ (< 150 nm), hệ thu được có độ đồng nhất cao, PDI nhỏ (< 0,3). Liposome sau khi nạp dược chất có kích thước và độ đồng nhất thay đổi không nhiều so với trước khi nạp (Zaverage < 200 nm, PDI~0,2).
32 + Hàm lượng DOX toàn phần cho giá trị cao đạt mục tiêu bào chế đặt ra. Hiệu suất liposome hóa các mẫu thu được đều lớn hơn 88%, kết quả định lượng tương đương kết quả thu được từ các nghiên cứu tham khảo trước đó [1], [6]. + Hình ảnh chụp TEM cho thấy: sau khi lọc tiếp tuyến các liposome thu được có kích thước nhỏ (70 – 120 nm) và khá đồng nhất. Tuy nhiên vẫn còn một số tiểu phân có kích thước khá lớn (300 – 400 nm) nhưng không có liposome nào có kích thước vượt quá 500 nm. Khi quan sát hình ảnh ta cũng nhận thấy một số liposome vẫn chứa thêm cấu trúc đa khoang đa lớp nhưng số khoang số lớp không nhiều (dưới 3 khoang hay lớp trong một liposome). Hiện tượng đa khoang đa lớp có thể ảnh hưởng đến độ ổn định và khả năng mang dược chất của hệ. Khi dựa vào chỉ tiêu đánh giá là hình thái cấu trúc của liposome ta vẫn đề xuất thêm quá trình nén qua màng (extrusion) hoặc đồng nhất hóa dưới áp lực cao để chuyển các liposome này thành các liposome nhỏ đơn lớp. Với liposome tạo thành bằng phương pháp pha loãng ethanol có KTTP nhỏ, đồng nhất, do đó nếu kết hợp thêm giai đoạn làm giảm KTTP bằng nén qua màng vẫn cho thấy những ưu điểm vượt trội trong tiết kiệm chi phí cũng như thời gian quy trình bào chế do chỉ cần nén qua hai màng 200, 100nm, 10 chu kỳ mỗi màng. Quy trình bào chế và đặc tính liposome DOX thu được cho thấy ưu điểm vượt trội của phương pháp pha loãng ethanol và tính khả thi của phương pháp trong nghiên cứu. 3.3. Bàn luận - Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi: Sau quá trình khảo sát có thể nhận thấy tỷ lệ dung môi chủ yếu ảnh hưởng đến KTTP, phân bố KTTP của liposome và liposome DOX thu được mà ít ảnh hưởng đến hàm lượng DOX toàn phần hay hiệu suất liposome hóa. Giá trị KTTP và chỉ số đa phân tán PDI thu được kể trên là phù hợp với kết quả tham khảo từ các nghiên cứu trước đó cho thấy rằng khi nồng độ phospholipid trong ethanol càng nhỏ, kích thước các tiểu phân của hệ có xu hướng giảm xuống, tức là tỷ lệ ethanol/ nước càng lớn, liposome thu được có kích thước càng nhỏ, hệ càng đồng nhất. Độ lặp lại cao đối với giá trị KTTP, kém hơn ở phân bố KTTP nhưng thể hiện rõ ràng hơn [11]. Tuy nhiên tỷ lệ ethanol sử dụng cũng được
33 khuyến cáo nhỏ hơn 7,5/100 [17]. Không những thế, lượng ethanol tồn dư trong chế phẩm có thể gây trở ngại cho việc phát triển dạng thuốc tiêm, gây đau, gây hoại tử tại vị trí tiêm [18]. Ngoài yếu tố tỷ lệ dung môi, các nghiên cứu tham khảo trước đó cũng chỉ ra rằng nồng độ phospholipid trong dung dịch ethanol là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến KTTP và chỉ số đa phân tán của hệ thu được. Miquel Pons và cộng sự cho rằng nồng độ phospholipid/ethanol chỉ nên giới hạn dưới 40 mg/ml đảm bảo các liposome tạo ra có kích thước nhỏ, đồng nhất, các tiểu phân kích thước nhỏ chiếm phần lớn thể tích của hệ [17]. Trong phạm vi của nghiên cứu vẫn chưa tiến hành khảo sát được ảnh hưởng của yếu tố nồng độ phospholipid/ethanol. - Ảnh hưởng của giai đoạn lọc tiếp tuyến: Liposome thu được trước và sau lọc tiếp tuyến cũng nhận thấy có sự khác biệt về KTTP và phân bố KTTP. Điều này có thể lý giải do quá trình lọc tiếp tuyến loại đi lượng ethanol còn tồn dư trong hệ dẫn đến quá trình tái cấu trúc làm thay đổi KTTP và phân bố KTTP của hệ. Nhược điểm của liposome bào chế bằng phương pháp pha loãng ethanol là bị pha loãng nhiều so với liposome bào chế bằng các phương pháp khác do giới hạn về độ tan của phospholipid trong ethanol. Hàm lượng phospholipid có trong 100ml liposome bào chế theo phương pháp này chỉ tương đương với hàm lượng phospholipid có trong 10ml liposome bào chế bằng phương pháp hydrat hóa màng film. Do đó quá trình lọc tiếp tuyến không những có ảnh hưởng đến KTTP, phân bố KTTP mà còn là giai đoạn cần thiết để cô đặc hệ, đạt được nồng độ phospholipid theo yêu cầu. Ngoài ra quá trình lọc tiếp tuyến còn được sử dụng để đổi hệ đệm bên ngoài liposome tạo chênh lệch pH cho quá trình nạp dược chất vào liposome, và tiếp tục loại đi lượng dung môi ethanol còn lại trong hệ. Xét về mặt lý thuyết, ethanol sẽ bị loại đi hoàn toàn sau quá trình loc tiếp tuyến tuy nhiên vẫn cần phải đánh giá lượng ethanol tồn dư để xem xét loại ethanol bằng các biện pháp khác. - Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ duy trì trong quá trình khuấy trộn khi kết hợp hai pha ảnh hưởng đến độ linh động của phospholipid do đó ảnh hưởng đến khả năng tạo và tái tạo liposome. Xu hướng cho thấy khi nhiệt độ tăng (40oC – 60oC) độ linh động của phospholipid tăng thu được liposome có KTTP nhỏ hơn và đồng nhất hơn
34 tuy nhiên khi nhiệt độ tăng đến 80oC, liposome thu được lại có KTTP tăng và kém o đồng nhất. So với mốc nhiệt độ chuyển pha Tc của phospholipid HSPC (53 C) thấy đặc tính về KTTP và phân bố KTTP của liposome có liên quan tới nhiệt độ này. Do vậy có thể nhận thấy trong quá trình bào chế cần duy trì nhiệt độ cao hơn nhiệt độ chuyển pha của phospholipid nhưng không quá cao tránh làm ảnh hưởng tới KTTP cũng như phân bố KTTP của hệ. Kết quả này là phù hợp với kết quả tham khảo trong các nghiên cứu đã tiến hành trước [25]. Tuy nhiên trong điều kiện giới hạn về thời gian và phương tiện, nghiên cứu chưa thể tiến hành khảo sát được ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ trong khoảng hẹp quanh nhiệt độ chuyển pha của phospholipid tới KTTP và hiệu suất liposome hóa. - Ảnh hưởng của quá trình làm giảm KTTP bằng nén qua màng: Liposome tạo ra bằng phương pháp pha loãng ethanol chỉ cần trải qua quá trình cô đặc bằng lọc tiếp tuyến đã có thể đạt được KTTP và chỉ số đa phân tán PDI tương đương với liposome bào chế bằng các phương pháp khác sử dụng các biện pháp làm giảm kích thước tiểu phân khác nhau như siêu âm hay nén qua màng với KTTP nhỏ (nằm trong khoảng 150nm), đồng nhất (PDI 0,1-0,2). Tuy nhiên ảnh chụp TEM liposome cho thấy hiện tượng đa khoang đa lớp của các liposome thu được như đã bàn luận ở trên. Do đó vẫn đề xuất bổ sung thêm giai đoạn nén qua màng trong quy trình bào chế.Trong khuôn khổ hạn chế về thời gian, nghiên cứu vẫn chưa thể tiến hành đánh giá ảnh hưởng của giai đoạn nén qua màng tới độ ổn định của chế phẩm. Mặc dù vậy ta có thể nhận thấy nếu kết hợp thêm giai đoạn nén qua màng thì quy trình bào chế vẫn tiêu tốn ít năng lượng và chi phí hơn so với quy trình bào chế đã tiến hành trước đó. - Về lựa chọn các thông số kỹ thuật trong quy trình bào chế: Quy trình bào chế liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol khá đơn giản, cơ chế hình thành liposome chủ yếu trải qua 4 giai đoạn là: + Giai đoạn 1: Phospholipid được hòa tan với nồng độ phù hợp và tồn tại ở trạng thái tự do trong ethanol. + Giai đoạn 2: dung dịch ethanol được tiêm nhanh vào môi trường nước. Ethanol nhanh chóng bị pha loãng trong dung môi nước, phospholipid được chuyển nhanh
35 sang pha nước. Trong pha nước để làm giảm sức căng bề mặt các phân tử phospholipid có xu hướng tập hợp tạo thành các lớp kép. + Giai đoạn 3: các lớp kép phospholipid lớn dần về kích thước. + Giai đoạn 4: lớp kép đóng vòng tạo liposome. Mỗi giai đoạn đều có ảnh hưởng quan trọng đến sự hình thành liposome. Bất kỳ một sự thay đổi nào trong các giai đoạn nói trên đều có thể ảnh hưởng đến các đặc tính thu được của liposome. Quá trình nghiên cứu đã tiến hành đánh giá được ảnh hưởng của một số thông số khảo sát và nhận thấy: tỷ lệ dung môi được lựa chọn 7/100 để hạn chế sự tồn dư ethanol trong chế phẩm cuối cùng nhưng vẫn đảm bảo tạo ra liposome có KTTP nhỏ, đồng nhất. Nhiệt độ trong quá trình khuấy trộn hai pha luôn giữ cao hơn nhiệt độ chuyển pha của phospholipd tuy nhiên không nâng quá cao để đảm bảo phospholipid tồn tại ở trạng thái linh động dễ dàng tạo lớp kép và đóng vòng tạo liposome, trong nghiên cứu lựa chọn 60oC. Đồng thời vẫn đề xuất kết hợp thêm quá trình làm giảm KTTP bằng nén qua màng để làm giảm hiện tượng đa khoang đa lớp của các liposome thu được. - Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của liposome: trong phạm vi thời gian nghiên cứu có hạn cũng như các điều kiện thí nghiệm sẵn có, nghiên cứu chỉ tiến hành lựa chọn đánh giá một số đặc tính của liposome như: KTTP, chỉ số đa phân tán, phân bố KTTP, hình ảnh chụp TEM đánh giá hình thái cấu trúc liposome. Những thông số nói trên là các thông số cơ bản để đánh giá cấu trúc, kích thước nhưng vẫn có khả năng chứng minh được sản phẩm tạo bởi phương pháp nói trên là liposome, và liposome tạo ra có KTTP nhỏ, đồng nhất. Một số chỉ tiêu khác về các đặc tính của liposome như hàm lượng phospholipid, dung môi tồn dư, thế Zeta được đề xuất đánh giá trong các nghiên cứu tiếp theo, để đánh giá về độ ổn định, khả năng giải phóng dược chất, tác dụng dược lý của các chế phẩm bào chế được. Đồng thời cũng là cơ sở để tiếp tục nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình bào chế liposome DOX bằng phương pháp pha loãng ethanol. - Về tiềm năng của phương pháp: quy trình bào chế liposome DOX bằng phương pháp pha loãng ethanol được tiến hành nhằm khắc phục những hạn chế của các
36 phương pháp đã tiến hành trong các nghiên cứu trước đó [1], [5], [6], [7] như thời gian quy trình bào chế dài, nhất thiết phải sử dụng các biện pháp đồng nhất hóa làm giảm KTTP nhưng vẫn đảm bảo liposome tạo thành đạt được các đặc tính tương đương hoặc tối ưu hơn trong các nghiên cứu đã tiến hành trước đó với PDI ~ 0,2, KTTP < 200 nm, hiệu suất liposome hóa đạt 90%. Với những kết quả đạt được về quy trình bào chế cũng như các đặc tính liposome DOX thu được, phương pháp pha loãng ethanol mang lại một hướng đi mới khả quan trong các nghiên cứu tiếp theo nhằm bào chế liposome DOX để đạt được kích thước nhỏ, đồng nhất, hiệu suất nạp thuốc cao, quy trình bào chế đơn giản tiết kiệm thời gian và chi phí. Mặc dù vậy vẫn cần tiếp tục đánh giá thêm các chỉ tiêu chất lượng khác của liposome cũng như liposome DOX làm cơ sở tiến hành khảo sát ảnh hưởng khác trong quy trình bào chế nhằm tối ưu hóa quy trình.
37 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Nghiên cứu đã đạt được mục tiêu đề ra với các kết quả như sau: 1. Xây dựng quy trình bào chế liposome DOX 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol: + Công thức bào chế được giữ nguyên so với các nghiên cứu trước đó. + Đánh giá được ảnh hưởng của một số yếu tố như nhiệt độ, tỷ lệ thể tích, ảnh hưởng của quá trình làm giảm KTTP tới KTTP, hiệu suất liposome hóa. + Đề xuất được quy trình bào chế liposome DOX 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol với một số thông số đã được khảo sát. 2. Đánh giá được liposome tạo thành + Đưa ra được phương pháp đánh giá một số đặc tính của liposome. + Đánh giá được một số chỉ tiêu chất lượng của liposome tạo thành bằng phương pháp pha loãng ethanol: KTTP, phân bố KTTP, hình dạng cấu trúc liposome, hàm lượng DOX toàn phần và hiệu suất liposome hóa. Đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa các thông số trong quy trình bào chế. - Tiếp tục hướng nghiên cứu để có thể đánh giá thêm một số chỉ tiêu của liposome DOX bào chế được.
38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Nguyễn Chí Đức Anh (2012), Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 2 – 30. 2. Bộ Y tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam, NXB Y học, tr. 1225 – 1234. 3. Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2005), Một số chuyên đề về bào chế hiện đại, NXB Y học, tr. 158 – 187. 4. Phạm Thị Minh Huệ, Võ Xuân Minh (2013), Kỹ thuật nano và liposome ứng dụng trong dược học và mỹ phẩm, NXB Y học, tr. 50 – 93. 5. Nguyễn Văn Lâm (2012), Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin và đánh giá tác dụng trên động vật, Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội tr. 2 – 32. 6. Lê Phương Linh (2013), Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của liposome doxorubicin, khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 2 – 41. 7. Đào Thanh Tùng (2012), Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin, Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 2 – 42. Tài liệu Tiếng Anh 8. Abraham S. A et al. (2005), “The liposome formulation of doxorubicin”, Methods in enzymology, 391, p. 71. 9. Accardo A. et al. (2012), “Peptide – modified liposomes for selective targeting of bombesin receptors overexpressed by cancer cells: a potential theranostic agent”, International journal of nanomedicine, 7, p. 2007. 10. Beijnen J. H., Wiese G., Underberg W. J. M. (1985), “Aspect of the chemical stability of doxorubicin and seven other anthracydines in acidic solution”, Pharmaceutisch Weekblad, 7(3), pp. 109 – 116.
39 11. Domazou A. S., Luisi P. L. (2002), “Size distribution of spontaneously formed liposomes by the alcohol injection method”, Journal of Liposomes Research, 22(1), pp. 205 – 220. 12. Gentine P. et al. (2011), “Manufacture of liposomes by isopropanol injection characterization of the method”, Journal of Liposome Research, 22(1), pp. 18 – 30. 13. Huckriede A et al. (2005), “The virosome concept for influenza vaccines”, 23(1), pp. 26 – 38. 14. Jaafar M. C., Charcosset C., Fessi H. (2010) “A new method for liposome preparation using a membrane contactor”, Journal of Liposome Research, 21(3), pp. 213 – 220. 15. Jaafar M. C. et al. (2009), “Ethanol injection method for hydrophilic and lipophilic drug loaded liposome preparation”, Journal of Liposome Research, 20(3), pp. 228 – 243. 16. Johnson M. J. W et al. (2008), “Influence of drug to lipid ratio on drug release properties and liposome integrity in liposomal doxorubicin formulations”, Journal of Liposome Research, 18(2), pp. 145 – 157. 17. Pons M., Foradada M., Estelrich J. (1993), “Liposomes obtained by the ethanol injection method”, International journal of Pharmaceutics, 95(1-3), pp 51 – 56. 18. Ray A. (2012), “Liposome drug delivery system”, Asian Journal of Research in Pharmaceutical Sciences, 2(2), p. 3. 19. Riaz M. (1996), “Liposome preparation methods”, Pakistan journal of pharmaceutical sciences, 9(1), pp. 65 – 77. 20. Samad A., Sultana Y., Aqil M. (2007), “Liposome drug delivery systems: An update review”, Current drug delivery, 4(4), pp. 297 – 305. 21. Storm G., Crommelin D. J. A. (1998), “Liposome: quo vadis”, Pharmaceutical Science & Technology today, 1(1), pp. 19 – 31. 22. Sweetman S. C. (2009), “Martindale the complete drug reference Pharmaceutical Press”, pp. 712 – 714.
40 23. Torchlin V. P. (2005), “Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers”, Nature reviews drug discovery, 4(2), p. 15. 24. Wang Z. et al. (2012) “The use of a tumor metastasis targeting peptide to delivery doxorubicin-containing liposomes to highly metastatic cancer”, Biomaterials. 25. Vorauer-Uhl et al. (2002), “The crossflow injection technique: an improvement of the ethanol injection method”, Journal of liposome research, 12(3), pp. 259 – 270. 26. Yeh M. K. (2012), “Clinically proven liposome based drug delivery: formulation, characterization and therapeutic efficacy”, Open acess scientific reports, 1(3), p. 8.
41 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Đồ thị phân bố KTTP theo thể tích trước và sau lọc tiếp tuyến của các mẫu với tỷ lệ dung môi khác nhau.