›

Khóa luận Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học phân đoạn nước cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata)

pdf 53 trang thiennha21 15/04/2022 4090
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học phân đoạn nước cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_so_bo_thanh_phan_hoa_hoc_phan_doan_nuoc_c.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học phân đoạn nước cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata)

  1. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC NGUYỄN THỊ NGA KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN NƢỚC CÂY MỎ QUẠ CUDRANIA TRICUSPIDATA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS.TS NGUYỄN VĂN BẰNG HÀ NỘI, 2017
  2. LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Bằng ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin gửi lời cảm ơn TS. Hoàng Lê Tuấn Anh và các anh chị phòng Nghiên cứu cấu trúc – Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu tại Viện. Qua đây, em cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong khoa Hóa học, Trƣờng đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập ở trƣờng. Khóa luận tốt nghiệp không tránh khỏi những thiếu sót em rất mong nhận đƣợc sự góp ý, chỉ bảo của các thầy cô và các bạn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 26 tháng 4 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Nga
  3. LỜI CAM ĐOAN Đề tài “Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học phân đoạn nƣớc cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata) ’’ là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của PGS.TS Nguyễn Văn Bằng. Các kết quả, số liệu nêu trong khóa luận này là trung thực đƣợc làm từ thực nghiệm tại phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các kết quả không trùng với các kết quả đã đƣợc công bố trƣớc đây. Sinh viên Nguyễn Thị Nga
  4. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Nhiệm vụ chính của đề tài là: 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Nghiên cứu tổng quan về cây Mỏ quạ 3 1.1.1. Thực vật học 3 1.1.2. Mô tả cây 3 1.1.3. Phân bố và sinh thái 4 1.1.4. Bộ phận dùng 4 1.1.5. Tính vị và công dụng 5 1.1.6. Thành phần hóa học 6 1.1.7. Hoạt tính sinh học 11 1.2. Các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật 12 1.2.1 Chọn dung môi chiết 12 1.2.2. Quá trình chiết 14 1.3. Tổng quan về phƣơng pháp sắc kí 15 1.4. Một số phƣơng pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 19 1.4.1. Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy – IR) 19 1.4.2. Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy – MS) 20 1.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy – NMR) 21 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Mẫu thực vật 24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.2.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu 24
  5. 2.2.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất 24 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 25 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 27 3.1. Phân lập các hợp chất 27 3.2. Hằng số vật lí và dữ liệu phổ các chất 29 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Xác định cấu trúc hợp chất 1 30 4.2. Xác định cấu trúc hợp chất 2 36 KẾT LUẬN 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44
  6. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13C-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 13 Carbon - 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1H-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 1H-1H COSY 1H - 1H Chemical Shif Correlation Spectroscopy 2D-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều Tow - Dimensional NMR CC Sắc ký cột Column Chromatography DEPT Distortionless Ebhancement by Polarisation Transfer ESI-MS Phổ khối lƣợng phun điện tử. Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy FAB – MS Phổ khối lƣợng bắn phá nguyên tử nhanh Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy FI-MS Phổ khối lƣợng ion hóa thƣờng Field Ionization HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Connectivity HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence HR-FAB-MS Phổ khối lƣợng phân giải cao bắn phá nguyên tử nhanh High Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy MS Phổ khối lƣợng Mass Spectroscopy NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography
  7. DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH BẢNG Bảng 4.1: Số liệu phổ của hợp chất MQ30 và chất tham khảo 35 Bảng 4.2: Số liệu phổ của hợp chất MQ4 và chất tham khảo 42 HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh cây, hoa Mỏ quạ 4 Hình 3.1: Sơ đồ phân lập phân đoạn nƣớc cây Mỏ quạ 28 Hình 4.1.1: Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất 1 30 Hình 4.1.2: Phổ proton 1H của hợp chất 1 31 Hình 4.1.3: Phổ cacbon 13C của hợp chất 1 31 Hình 4.1.4: Phổ HMBC của hợp chất 1 32 Hình 4.1.5: Phổ HMBC của hợp chất 1 (tiếp) 33 Hình 4.1.6: Phổ HSQC của hợp chất 1 34 Hình 4.2.1: Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất 2 36 Hình 4.2.2: Phổ proton 1H của hợp chất 2 37 Hình 4.2.3: Phổ cacbon 13C của hợp chất 2 37 Hình 4.2.4: Phổ cacbon DEPT của hợp chất 2 38 Hình 4.2.5: Phổ HMBC của hợp chất 2 39 Hình 4.2.6: Phổ HMBC của hợp chất 2 (tiếp) 40 Hình 4.2.7: Phổ HSQC của hợp chất 2 40 Hình 4.2.8: Phổ HSQC của hợp chất 2 (tiếp) 41
  8. MỞ ĐẦU Cùng với sự phát triển của xã hội hiện nay thì con ngƣời cũng đang phải đối đầu với nguy cơ mắc các căn bệnh hiểm nghèo. Nguyên nhân đó là do ô nhiễm bầu không khí, ô nhiễm nguồn nƣớc Từ đó đòi hỏi việc nghiên cứu tìm ra các loại thuốc có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên cho hiệu quả cao, ít tác dụng phụ, ít độc tính lại dễ tìm nguồn nguyên liệu để ứng dụng trong y học, nông nghiệp và các mục đích khác phục vụ lợi ích của con ngƣời đã và đang là vấn đề đƣợc các nhà khoa học hết sức quan tâm. Hiện nay có khoảng 60-70% các loại thuốc chữa bệnh đang đƣợc lƣu hành hoặc đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên [14]. Nƣớc ta nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa có khí hậu nóng ẩm, lƣợng mƣa hàng năm lớn nên có rất nhiều điều kiện thuận lợi cho thảm thực vật phát triển. Nƣớc ta là một nƣớc có nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng. Theo ƣớc tính Việt Nam có khoảng 12000 loài thực vật, trong đó có rất nhiều loại thảo dƣợc quý hiếm [17]. Từ xa xƣa nhân dân ta đã biết dùng các loại thảo dƣợc để chữa bệnh và cho đến tận bây giờ vẫn còn nhiều bài thuốc quý đƣợc lƣu truyền. Những bài thuốc cổ truyền này đã đóng vai trò vô cùng quan trọng với sự phát triển của ngành y học nói chung và ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên nói riêng. Trong thế giới thực vật, cây Mỏ quạ (tên khoa học là Cudrania tricuspidata) là một loài cây đƣợc sử dụng nhƣ một dƣợc liệu quý. Theo kinh nghiệm dân gian, Mỏ quạ thƣờng đƣợc dùng chữa vết thƣơng phần mềm, bổ thận, lƣơng huyết, hoạt huyết, phá ứ, chữa ứ tích lâu năm, bế kinh, đau lƣng gối do phong thấp, làm thuốc khƣ phong [18]. Ngoài ra, trong cây còn chứa các thành phần hóa học có hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ thần kinh, chống 1
  9. béo phì, kháng viêm hay kháng insulin ở gan. Do vậy, nó nhƣ một loài cây thuốc quý, cần đƣợc nghiên cứu để giải thích tác dụng chữa bệnh của cây và tạo cơ sở để tìm kiếm phƣơng thuốc điều trị bệnh. Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên tôi chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp là: “Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học phân đoạn nƣớc cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata)” Nhiệm vụ chính của đề tài là: 1. Thu mẫu lá cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata), xử lý mẫu và tạo dịch chiết. 2. Phân lập các hợp chất trong phân đoạn nƣớc từ cây Mỏ quạ. 3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập đƣợc. 2
  10. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Nghiên cứu tổng quan về cây Mỏ quạ 1.1.1. Thực vật học Cây Mỏ quạ đƣợc phân loại thực vật học theo cách xác định nhƣ sau: Giới : Plantae Angiospermae Eudicots Rosids Bộ : Rosales Họ : Moraceae Tông : Moreae Chi : Cudrania Loài : C. Tricuspidata 1.1.2. Mô tả cây [1], [18], [19] Cây Mỏ quạ hay còn đƣợc gọi với các tên khác nhƣ: hoàng lồ, vàng lồ, xuyên phá thạch, sọng vàng, gai mang, mỏ quạ ba mũi Nó có tên khoa học là Cudrania tricuspidata (Carr.) Bur, thuộc họ Dâu tằm – Moraceae. Mỏ quạ là loài cây nhỏ, thân mềm yếu, nhiều cành, tạo thành bụi, có khi mọc thành cây nhỡ, chịu khô hạn rất khỏe, có nhựa mủ trắng, rễ cây hình trụ có nhiều nhánh, mọc ngang rất dài, nếu gặp đá có thể xuyên qua đƣợc (do đó có tên xuyên phá thạch có nghĩa là phá chui qua đá). Vỏ thân màu tro nâu, trên có nhiều biểu bì khổng màu trắng, thân và cành có rất nhiều gai, gai già hơi cong xuống trông nhƣ mỏ con quạ (do đó có tên là cây mỏ quạ). Lá mọc cách, hình trứng thuôn, hai đầu nhọn, mặt lá nhẵn, bóng, mép nguyên, có phiến xoan, dài 5-14cm, rộng 3-4,5cm, đầu có mũi dài, gốc tù, gân bên 6-7 đôi, cuống dài 10- 13mm. Hoa đầu ở nách lá, từng cặp, hoa đực có 4 lá đài, 4 nhị, hoa cái có 4 lá 3
  11. đài. Cụm hoa hình cầu, đƣờng kính 7-10mm, màu vàng nhạt, mọc thành đôi hay mọc đơn độc ở kẽ lá. Hoa đơn tính, đực cái khác gốc. Cây ra hoa vào tháng 4-5, có quả vào tháng 5-7. Mùa hoa đơn tại Hà Nội vào tháng 4. Quả màu hồng hợp thành quả kép. Mùa quả tháng 10-11. Hình 1.1: Hình ảnh cây, hoa Mỏ quạ 1.1.3. Phân bố và sinh thái Chi Cudrania có khoảng 10 loài ở vùng nhiệt đới châu Á và Australia. Ở Việt Nam, dự đoán có 5 loài. Mỏ quạ là loài quen thuộc, phân bố tƣơng đối phổ biến ở các tỉnh vùng núi thấp (dƣới 1000m), trung du và đồng bằng nhƣ Phú Thọ (Chân Mộng), Phú Quốc Trên thế giới, cây phân bố ở Hàn Quốc (chủ yếu là ở phía Nam), Trung Quốc, Nhật Bản, Australia [18], [20]. Mỏ quạ thuộc loại cây bụi gai, ƣa sáng, có khả năng chịu hạn. Cây mọc rải rác trong các tráng cây bụi ở đồi, đất sau nƣơng rẫy và ven rừng. Ở vùng đồng bằng, cây thƣờng gặp trong các lùm bụi quanh làng, ra hoa quả nhiều hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt, tái sinh cây chồi khỏe sau khi bị chặt [3]. 1.1.4. Bộ phận dùng Lá, rễ - Radix et Folium. Rễ và lá thu hái quanh năm. Lá dùng tƣơi, rễ phơi khô. 4
  12. 1.1.5. Tính vị và công dụng - Tính vị: Lá cây Mỏ quạ khi nhấm có vị tê tê ở lƣỡi. Cây có vị đắng và tính mát. - Công dụng: Mỏ quạ có nhiều tác dụng dƣợc lý đa dạng: chống dị ứng ở mức độ nhất định, trị đau nhức, tăng cƣờng thực bào, làm lành nhanh vết thƣơng phần mềm, trị phong thấp, một số chứng ho Lá mỏ quạ tƣơi đã đƣợc dùng chữa vết thƣơng phần mềm theo kinh nghiệm của cụ lang Long (Hải Dƣơng) nhƣ sau: Chủ yếu dùng lá mỏ quạ tƣơi, rồi tùy theo vết thƣơng, thêm một hai vị khác. Lá mỏ quạ tƣơi lấy về rửa sạch, bỏ cọng, giã nhỏ đắp vào vết thƣơng. Nếu vết thƣơng xuyên thủng thì phải đắp cả hai bên, băng lại. Mỗi ngày rửa và thay băng một lần. Thuốc rửa vết thƣơng là lá trầu không nấu với nƣớc (40g lá trầu, 2 lít nƣớc, nấu sôi để nguội, thêm vào đó 8g phèn phi, hòa tan, lọc và dùng rửa vết thƣơng). Sau 3-5 ngày đã đỡ, khi đó hai ngày mới cần rửa và thay băng một lần. Trƣờng hợp vết thƣơng tiến triển tốt nhƣng lâu đầy thịt thì thay thuốc sau: Lá mỏ quạ tƣơi và lá thòng bong, hai vị bằng nhau, giã lẫn cả hai thứ đắp lên vết thƣơng, mỗi ngày rửa và thay băng một lần. 3-4 ngày sau lại thay thuốc sau: lá mỏ quạ tƣơi, lá thòng bong, lá hàn the (Desmodium heterophyllum DC.) ba thứ bằng nhau, cứ 3 ngày mới thay băng một lần để vết thƣơng chóng lên da non. Sau 2-3 lần thay băng bằng 3 vị trên thì rắc lên vết thƣơng thuốc bột chế bằng phấn cây cau (sao khô) 20g, phấn cây chè (sao khô) 16g, ô long vĩ (bồ hóng) 8g, phèn phi 4g. Các vị tán mịn, trộn đều rắc lên vết thƣơng rồi để yên cho vết thƣơng đóng vẩy và róc thì thôi. Rễ đƣợc dùng trong nhân dân ta và ở Trung Quốc (Quảng Tây) làm thuốc khứ phong, hoạt huyết phá ứ, chữa ứ tích lâu năm, bị đả thƣơng, phụ nữ kinh bế, phong nhức lƣng gối, xƣơng khớp, hoàng đản,ung sang thũng độc. Ngày dùng 10-30g rễ dƣới dạng thuốc sắc. Dùng 5
  13. phối hợp với những vị thuốc khác. Theo kinh nghiệm nhân dân, phụ nữ có thai không dùng đƣợc [19]. Trong thời gian gần đây, dựa vào các bài thuốc từ thiên nhiên. Các nhà khoa học đã tìm đƣợc chất flavonoid có trong rễ của cây Mỏ quạ có tác dụng tốt trong việc kháng viêm, giảm đau đặc biệt đối với những bệnh về xƣơng khớp giúp tái tạo, bảo vệ các tế bào sụn khớp bị tổn thƣờng do gout gây ra. Quả dùng để ăn hoặc có thể nấu rƣợu. Bài thuốc dùng để hỗ trợ điều trị bênh về xƣơng khớp, Gout. Lá Mỏ quạ tƣơi, lấy về rửa sạch rồi bỏ cuống, giã nhỏ rồi đắp vào vết thƣơng. Dùng hàng ngày [20]. Bài thuốc cây mỏ quạ thƣờng dùng - Hỗ trợ điều trị ho do lao phổi: rễ mỏ quạ gai 40g, rung rúc 30g, bách bộ, hoàng liên ô rô, mỗi vị 20g. Tất cả rửa sạch cho vào ấm đổ 700ml nƣớc, sắc còn 350ml, chia 3 lần uống trong ngày, uống lúc còn ấm. 15 ngày 1 liệu trình. - Hỗ trợ điều trị phong thấp: mỏ quạ gai 40g, cành dâu, quế chi, thiên niên kiện mỗi vị 20g. Cho tất cả các vị vào ấm đổ 550ml nƣớc sắc nhỏ lửa còn 250ml chia 2 lần uống trong ngày. 10 ngày một liệu trình. - Phụ nữ bế kinh: lấy 30g rễ mỏ quạ gai rửa sạch, đổ 500ml nƣớc sắc còn 200ml, chia 2 lần uống trong ngày, dùng liền 10 ngày trƣớc chu kỳ kinh [21]. 1.1.6. Thành phần hóa học Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Mỏ quạ cho thấy, thành phần hóa học chủ yếu của cây là flavonoid ngoài ra còn có tanin pyrocatechic, acid hữu cơ và một số hợp chất khác. Yang Hee Jo cùng các cộng sự đã cô lập đƣợc 30 hợp chất trong đó có 2 hợp chất isoflavonoids mới là hợp chất cudracusisoflavone A và cudracusisoflavone B. Ngoài ra, hai mƣơi bảy hợp chất đã biết đó là 6
  14. genistein, orobol, 7,4’-dimethoxy-5-hydroxyisoflavone, genistin, oroboside, 3’-O-methylorobol-7-glucoside, sphaerobioside, wighteone, gancaonin A, 4’,5,7-trihydroxy isoflavonone, 5,7,3’,4’ tetrahydroxy-6-8-diprenylisoflavone, alpinumisoflavone, 4’-O-methylalpinumisoflavone, 5,3’,4’-trihydroxy-6’’,6’’- dimethylpyrano-[2’’,3’’;7,6]isoflavone, scandenone, derrone, derrone-4’-O- methylether, isochandalone, ulexin B, ulexone B, (+)-dihydrokaempferol, (+)- taxifolin, (2R, 3R)-7-(β-glucopyranosyloxy)-2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-2-(4- hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one, astragalin, hirsutrin, populnin, nicotiflorin, và rutin [15]. 7
  15. Jaeyoung Kwon và các cộng sự đã phân lập từ vỏ rễ của cây Mỏ quạ thu đƣợc 75 hợp chất, bao gồm 21 hợp chất mới có công thức hóa học nhƣ sau: 34 R = CH3 31 32 33 36 37 35 R = H 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 Hợp chất (31) và (32) có cùng công thức phân tử là C23H24O7, hợp chất (33) có công thức phân tử C23H24O8. Tên gọi của các hợp chất từ 34-42 là: (34) 16-methoxycudra-trixanthone M, (35) 16-hydroxycudratrixanthone M, (36) (cudratrixanthone R), (37) (cudratrixanthone S), (38) 7-O- demethylcudratrixanthone C, (39) cudratrixanthone T, (40) cudratrixanthone U, (41) cudratrixanthone V và (42) cudratrixanthone W. (43) có công thức phân tử là C25H26O7. (44) và (45) có tên gọi tƣơng ứng là (2R)- và (2S) - cudraflavanones H. Công thức phân tử của hợp chất (46) là C25H22O7, phân tích dữ liệu phổ NMR thấy có sự giống nhau giữa cấu trúc của (46) và cudraflavone B, 46 và cudracuspiphenone A cũng có cấu trúc gần tƣơng tự nhau sự khác biệt duy nhất là một nhóm prenyl đƣợc thay thế bằng nhóm 2- 8
  16. hydroxy-3-methylbut-3-enyl. Các hợp chất từ 47-51 có tên gọi lần lƣợt là (47) cudraphenone E, (48) cudrachromone A, (49) cudraphenol A, (50) cudraphenol B, (51) cudraphenol C. Thêm vào đó, 54 chất báo cáo trƣớc đây đƣợc xác định là dicycloeuchrestaflavanone B, cudraflavone A, 5,7- dihydroxychromone, isoimperatorin, xanthyletin, 4-hydroxybenzaldehyde, glutinol, achilleol A, axit oleic, demethylsuberosin, 5-dehydroxybavachinone A, imperatorin, isoencecalin, 2,4-dihydroxymethyl-benzoat, 4- (methoxymethyl) phenol, α-amyrin, gentisein, toxyloxanthon B, 2- deprenylrheediax-anthone B, 4'-O-demethylcrotaramin, brosimine B, pinocembrin, euchrestaflavanone C, 4'-hydroxyisoloncho- carpin, naringenin, 6-prenylnaringenin, tomentosanol D, dalenin, parvisoflavone A, alpinumisoflavone, 8-hydroxygenistein, laburnetin, biochanin A, erythrinin B, C, và G, cudracuspiphenone A, eriosematin A, decursinol angelate, cis-3',4'- diisovalerylkhellactone, 7-hydroxycoumar-in, 8-methoxypsoralen, bergapten, hyuganin C, 4- hydroxy-3- (4-hydroxybenzyl) benzyl methyl ete, 2,4-bis (4- hydroxybenzyl) phenol, 4-hydroxymethylbenzoat, vanil-lin, 3- methoxycarbonylindole, 4-hydroxybenzalaceton, lanosterol, γ- hexadecanolactone, axit hexadecanoic và 9,12-octadecadienoic [10]. Theo Dong-Cheol Kim và các cộng sự khác thì các cấu trúc của cudraflavanone D, cudraflavanone B, euchrestaflavanone C, (+)- dihydrokaempferol, steppogenin, cudraflavone C và kuwanon C đã đƣợc xác định trong các nghiên cứu trƣớc đó [8]. Bằng một số phƣơng pháp sắc kí và tách phân đoạn trong CH2Cl2 và EtOAc từ rễ của cây mỏ quạ Yang Hee Jo cùng các cộng sự đã cô lập đƣợc 31 hợp chất xanthones trong đó có 3 prenylated xanthones mới có công thức hóa học nhƣ sau: 9
  17. 52 R = H, R =OH R = H 1 2 3 56 R = OH 53 R1 = OH, R2 = OCH3 R3 = H 58 57 R = OCH3 54 R1 = OH, R2 = OCH3 R3 = OH 55 R1 = OH, R2 =OCH3 R3 = OCH3 59 60 R1 = OH, R2 = H 61 R1 = H, R2 = OH 66 R = OH 62 R = OH 64 65 67 R = OCH3 68 63 R = OCH3 69 70 71 72 73 74 75 76 R1 = H, R2 = OH 78 77 R1 = OH, R2 = H 80 81 79 82 Hợp chất (67) (80) (82) thu đƣợc có tên gọi lần lƣợt là cudracuspixanthone E, cudracuspixanthone F và cudracuspixanthone G. Đó là ba hợp chất mới ngoài ra còn 28 hợp chất đã biết là: 2,6- dihydroxyxanthone (52), isogentisin (53), alloathyriol (54), laxanthone-I (55), isocudraniaxanthone A (56), isocudraniaxanthone B (56), 1,3,5-trihydroxy-4- prenyl- xanthone (58), cudraxanthone H (59), cudratricusxan- thone K (60), 10
  18. dulxanthone B (61), macluraxanthone B (62), cudracuspixanthone A (63), cudratricus-xanthone A (64), gerontoxanthone I (65), maclura- xanthone C (66), alvaxanthone (68), isoalvaxanthone (69), cudraxanthone L (70), toxyloxanthone C (71), 2-deprenylrheediaxanthone B (72), 8-prenylxanthone (73), cudraxanthone M (74), cudratrixanthone H (75), cudracuspixanthone B (76), cudracuspi- xanthone C (77), cudraxanthone B (78), cudracus- pixanthone D (79) và cudraxanthone A (81) [16]. 1.1.7. Hoạt tính sinh học Trong cây Mỏ quạ chứa rất nhiều hợp chất flavonoid, những lớp chất này có rất nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm. Flavonoid là những chất oxy hóa chậm, ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do gây ra do vậy các hợp chất flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa là những chất có hoạt tính chống oxy hóa cao, nó tác dụng đến nhiều hệ enzym và ít độc với cơ thể sống. Khi đi vào cơ thể sống, flavonoid có thể tác động lên các biến đổi sinh hóa học một cách trực tiếp hay gián tiếp nhƣ thông qua hoạt động của các enzym hay hệ thống thần kinh, nội tiết Các kết quả thực nghiệm cho chúng ta thấy một số flavonoid có tác dụng chống ung thƣ thông qua khả năng hoạt hóa các enzym trong gan có nhiệm vụ chuyển hóa các chất gây ung thƣ. Một nghiên cứu trƣớc đây cho thấy quả của cây mỏ quạ có thể ức chế sự hoạt động của lipase tụy, một enzym quan trọng trong việc hấp thụ chất béo. Quả non có hàm lƣợng phenol và flavonoid cao hơn và có sự ức chế lipase tụy mạnh hơn so với quả chín. Phân tích HPLC cho thấy thành phần hoá học khác nhau giữa quả xanh và chín. Phân đoạn tiếp tục dẫn đến sự cô lập của 30 hợp chất bao gồm hai isoflavonoid mới. Phân tích các thành phần hóa học của quả chín và chín chƣa cho thấy một vòng 2,2-dimetylpyran, một prenyl xen kẽ, là chuỗi bên cạnh chi phối trong các quả chƣa chín, trong khi đó là một nhóm prenyl tuyến tính trong quả chín. Ngoài ra, một isoflavonoid 11
  19. mới từ quả chƣa chín cho thấy sự ức chế mạnh nhất trên lipase tụy. Kết hợp với nhau, giai đoạn chín là một yếu tố quan trọng để đạt đƣợc hiệu quả tối đa và trái chƣa chín của C. tricuspidata là một nguồn tốt về các thành phần hoạt tính sinh học mới để điều chỉnh chứng béo phì [10]. Hoạt tính kháng viêm, một số nghiên cứu về tác dụng của anthocyanin, leucoanthocyanin và axit phenolic lên vi khuẩn Salmonella cho thấy có tác dụng kìm hãm rõ rệt. Hầu hết các chất này có khả năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucoza. Pilar và các cộng sự đã nghiên cứu và thấy đƣợc rằng: hầu hết các polyphenol đều có khả năng chống khuẩn. Trong các nghiên cứu gần đây cho thấy chiết xuất từ C.tricuspidata có nhiều hoạt tính sinh học nhƣ bảo vệ gan, chống oxi hóa. 1.2. Các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật [7], [9], [11] 1.2.1 Chọn dung môi chiết Tùy thuộc vào đối tƣợng chất có trong các mẫu mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau. Các dung môi dùng cho quá trình chiết phải đƣợc lựa chọn một cách cẩn thận. Yêu cầu với dung môi dùng trong quá trình chiết Nó phải hòa tan đƣợc những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, khó bốc cháy. Trƣớc khi đƣợc sử dụng làm dung môi chiết những dung môi này nên đƣợc chƣng cất để loại bỏ tạp chất ta sẽ thu đƣợc dạng sạch trƣớc khi sử dụng nếu chúng có lẫn các chất có thể gây ảnh hƣởng tới chất lƣợng của quá trình chiết. Có một số chất dẻo thƣờng lẫn trong dung môi nhƣ điankyl phtalat, tri-n- butyl-axetylcitrat và tributylphotphat (bị lẫn trong quá trình sản xuất dung môi hoặc khâu bảo quản dung môi do các dung môi thƣờng đƣợc đựng trong các thùng chứa bằng nhựa hoặc các nút nhựa). 12
  20. Một số dung môi thường được sử dụng: Ngƣời ta hay sử dụng clorofom, metylen và metanol là những dung môi trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây nhƣ lá, thân, dễ, củ, quả, hoa. Tuy nhiên, metanol và clorofom thƣờng chứa điotylphtalat [đi-(2-etylhexyl) phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat], nó sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật. Ngoài ra chất này còn thể hiện hoạt tính trong quá trình thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Những tạp chất thƣờng lẫn trong clorofom nhƣ CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với một số hợp chất nhƣ các ankanoit tạo muối bậc 4. Tƣơng tự nhƣ vậy sự có mặt của HCl có thể gây ra sự phân hủy, sự khử nƣớc hay sự đồng phân hóa các hợp chất khác. Do clorofom có thể gây tổn thƣơng cho gan và thận nên khi sử dụng nó các thao tác phải cẩn thận khéo léo làm ở những nơi thông thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofom. Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn clorofom. Do khả năng phân cực của clorofom thấp hơn nên nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Trái lại các dung môi thuộc nhóm rƣợu phân cực hơn nên sẽ thấm tốt hơn qua màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu đƣợc lƣợng lớn các thành phần trong tế bào. Phần lớn các ancol là các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp do vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hòa tan đồng thời. Thông thƣờng dung môi cồn trong nƣớc có thể đƣợc xem là dung môi có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ. Tuy nhiên khi dùng metanol trong suốt quá trình chiết cũng có một vài sản phẩm mới đƣợc tạo thành. Ví dụ nhƣ trechlonolide A thu đƣợc từ Trechonaetes laciniata đƣợc chuyển hóa thành trechonolode B bằng quá trình metyl hóa khi đun nóng với metanol chứa một ít axit và quá trình phân hủy 13
  21. 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi Erythroxylum novogranatense đƣợc chiết trong metanol nóng. Ngƣời ta thƣờng ít sử dụng nƣớc để thu dung dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nƣớc của metanol. Đietyl ete là chất rất dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc đồng thời nó có xu hƣớng tạo ra peroxit dễ nổ, peroxit của đietyl ete dễ gây ra phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả năng tạo cholesterol nhƣ các carotenoid. Do vậy mà rất hiếm khi đietyl ete đƣợc sử dụng cho các quá trình chiết thực vật. Ngoài ra axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trƣờng axit. Quá trình chiết dƣới điều kiện axit hoặc bazơ thƣờng đƣợc sử dụng đối với các quá trình phân tách đặc trƣng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo ra các sản phẩm mong muốn. Trong cây thƣờng các chất chuyển hóa thứ cấp sẽ có độ phân cực khác nhau. Khi biết và hiểu đƣợc những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong cây đƣợc chiết sẽ rất quan trọng để từ đó có thể lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết tránh đƣợc sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn. Sau khi chiết dung môi đƣợc cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 300C – 400C, với một vài hóa chất có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. 1.2.2. Quá trình chiết Hầu hết quá trình chiết đơn giản đƣợc phân loại nhƣ sau: - Chiết ngâm. - Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet. - Chiết sắc với dung môi nƣớc - Chiết lôi cuốn theo hơi nƣớc. Một trong những phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật là chiết ngâm bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời 14
  22. gian. Thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh có khóa ở dƣới đáy để tạo tốc độ chảy cho quá trình tách rửa dung môi, dung môi nóng hoặc lạnh. Trƣớc kia, máy chiết ngâm thƣờng đƣợc làm bằng kim loại nhƣng hiện nay có thể dùng bình thủy tinh. Mẫu thực vật đƣợc ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ và sau đó chất chiết đƣợc lấy ra. Lƣu ý rằng sau một quá trình chiết 3 lần dung môi, cặn thu đƣợc không còn chứa những chất giá trị nữa. Có thể xác định sự kết thúc quá trình chiết bằng một số cách nhƣ: khi chiết các ankaloit ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của nhiều hợp chất này ra khỏi bình chiết bằng sự tạo thành kết tủa với các tác nhân đặc trƣng nhƣ Dragendorff và Mayer. Hay các flavoloid thƣờng là những chất màu bởi vậy khi dịch chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu là đã rửa hết những chất này trong quá trình chiết. Hoặc khi chiết các chất béo, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết. Trong trƣờng hợp các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde có thể đƣợc sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với anilin axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể biết đƣợc khi nào quá trình chiết kết thúc. Nhƣ vậy tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi chiết thích hợp và lựa chọn phƣơng pháp chiết hợp lí để đạt kết quả cao trong quá trình nghiên cứu. Ngoài ra có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các hợp chất mà ta có thể thu đƣợc một số hợp chất ngay trong quá trình chiết. 1.3. Tổng quan về phƣơng pháp sắc kí [2], [7] Phƣơng pháp sắc kí (chromatography) là một trong những phƣơng pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, đƣợc sử dụng trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng. 15
  23. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là dựa vào sự khác nhau về ái lực giữa các chất cần tách với chất hấp thụ. Độ phân cực của dung môi tăng dần từ ete dầu hỏa đến nƣớc. Sắc kí bao gồm pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tƣơng ứng với các tính chất của chúng (tính bị hấp thụ, tính tan ). Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, quá trình hấp phụ và phản hấp phụ sẽ lặp đi lặp lại. Kết quả là chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với chất tƣơng tác yếu hơn với pha này. Dựa vào đặc điểm này mà ngƣời ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí. Trên thế giới hiện nay chủ yếu sử dụng pha tĩnh là chất rắn (bao gồm các loại chất hấp phụ nhƣ silicagel, YMC, ODS, Al2O3 ) còn pha động đƣợc sử dụng là các chất lỏng (sắc kí lỏng), hay chất khí (sắc kí khí). Pha động đƣợc dùng trong sắc kí lỏng là các dung môi hữu cơ, trên nguyên tắc là chất phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi phân cực hơn và ngƣợc lại chất ít phân cực sẽ tan tốt hơn trong dung môi kém phân cực hơn. Phân loại các phương pháp sắc kí Tùy thuộc vào trạng thái tập hợp của pha động, ngƣời ta chia sắc kí thành 2 loại chính: - Sắc kí khí. - Sắc kí lỏng. Còn dựa vào cách tiến hành sắc kí ngƣời ta chia ra thành các phƣơng pháp sắc kí chủ yếu sau: Sắc kí cột (CC) Đây là phƣơng pháp sắc kí phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh bao gồm các loại silicagel (có độ hạt khác nhau) pha thƣờng cũng nhƣ pha đảo YMC, ODS, Dianion Chất hấp phụ đƣợc nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy 16
  24. tinh hay kim loại nhƣng phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn do đó khả năng tách càng cao và ngƣợc lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có độ hạt càng nhỏ thì tốc độ dòng chảy càng giảm. Trong một số trƣờng hợp lực trọng trƣờng không đủ lớn sẽ gây ra hiện tƣợng tắc cột (dung môi không chảy đƣợc) khi đó ngƣời ta phải sử dụng áp suất với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC). Trong sắc kí cột, tỉ lệ chiều cao cột (L) so với đƣờng kính cột (D) rất quan trọng, tỉ lệ này còn thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách nghĩa là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc kí tỉ lệ giữa quãng đƣờng đi của chất cần tách so với quãng đƣờng đi của dung môi đƣợc gọi là Rf, các chất khác nhau sẽ có Rf khác nhau. Dựa vào sự khác nhau về Rf mà ngƣời ta tách đƣợc từng chất ra khỏi hỗn hợp chất. Ngoài ra tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách. Chẳng hạn nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (từ 1/5-1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tùy vào hệ số tách (tức là phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất) hệ số này dao động trong khoảng 1/20 – 1/30. Việc đƣa chất lên cột hết sực quan trọng trong sắc kí cột tùy thuộc vào lƣợng chất và dạng chất mà ngƣời ta có thể đƣa chất lên cột bằng các phƣơng pháp khác nhau. Nếu lƣợng chất nhiều và chạy thô thì ngƣời ta phải tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn sau đó mới đƣa lên cột. Nếu tách tinh thì ngƣời ta thƣờng đƣa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với một lƣợng tối thiểu. Việc nhồi cột (bằng chất hấp phụ) cũng hết sức quan trọng. Có hai phƣơng pháp đƣa chất hấp phụ lên cột: 17
  25. 1. Phƣơng pháp nhồi cột khô: Chất hấp phụ đƣợc đƣa trực tiếp vào cột (cột đã rửa sạch bằng hỗn hợp sunfocromic, sấy khô và lót bông thủy tinh ở dƣới) sau đó dùng đũa thủy tinh có bọc cao su gõ nhẹ lên thành cột đến khi chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột không nén xuống đƣợc nữa. Tiếp đến dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt. 2. Phƣơng pháp nhồi cột ƣớt: Cho chất hấp phụ vào dung môi (thƣờng dùng là dung môi rửa cột sau này) trộn thành bột nhão sau đó đổ vào cột đến khi đủ lƣợng cần thiết. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là dễ đồng đều trên cột, không hay bị nứt cột khi chạy. Lƣu ý khi chuẩn bị cột phải không có bọt khí trong cột (nếu có bọt khí sẽ gây nên hiện tƣợng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và dung môi phải khô, cột không đƣợc nứt, gãy, dò, thời gian để cột ổn định phải mất 10- 12 giờ mới dùng đƣợc. Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hƣởng đến kết quả tách. Nếu tốc độ chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ chảy quá nhỏ sẽ kéo dài thời gian tách ảnh hƣởng đến tiến độ công việc. Ngày nay để chạy nhanh, tách nhanh các chất ngƣời ta dùng phƣơng pháp sắc kí cột nhanh có hệ thống bơm đẩy trộn dung môi tự động, lấy mẫu tự động dựa vào phổ tử ngoại. Thời gian để tách rất nhanh, chính xác. Sắc kí bản mỏng (TLC) Phƣơng pháp dùng chất hấp phụ tráng thành lớp trên kính để phân tích hay tinh chế các chất gọi là sắc kí bản mỏng. Sắc kí bản mỏng đƣợc dùng để phân tích định tính, định lƣợng và tinh chế các chất hay cũng có thể dùng để theo dõi quá trình chạy cột sắc kí. Chất hấp phụ thƣờng là silicagel. Việc sử dụng sắc kí bản mỏng điều chế (bản đƣợc tráng sẵn silicagel dày hơn) có thể đƣa lƣợng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc kí có 18
  26. thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu đƣợc từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trƣng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%. Đối với sắc kí bản mỏng việc lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy sắc kí cho Rf tốt rất quan trọng. Nếu kiểm tra độ tinh khiết và định tính phải có Rf ≥ 0,7, vệt tròn và sắc nét. Còn để khảo sát hỗn hợp hay theo dõi tiến trình phản ứng thì chọn dung môi sao cho các vệt tròn, sắc nét, rải đều trên toàn bản và có Rf càng xa nhau càng tốt. Kết quả chạy sắc kí bản mỏng phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện chạy sắc kí. Lƣợng dung môi cho vào bình sao cho không ngập vết chấm trên bản. Cho bản vào bình một cách dứt khoát và không nhắc đi nhấc lại làm lở chân bản mỏng gây ảnh hƣởng đến kết quả. Trong suốt quá trình chạy không nên xê dịch bình từ chỗ này sang chỗ khác. Theo dõi quá trình chạy sắc kí, không để dung môi chạy hết bản. 1.4. Một số phƣơng pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [2], [13] Để xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ ngƣời ta thƣờng dùng các phƣơng pháp phổ kết hợp. Các chất khác nhau có cấu trúc hóa học khác nhau nên ngƣời ta sẽ sử dụng phƣơng pháp phổ cụ thể cho từng chất. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phƣơng pháp phổ càng cao. Để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất một số trƣờng hợp ngƣời ta phải dựa vào các phƣơng pháp bổ sung khác nhƣ chuyển hóa hóa học, các phƣơng pháp sắc kí so sánh [4], [5]. 1.4.1. Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy – IR) Phổ hồng ngoại đƣợc xây dựng nhờ vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dƣới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi 19
  27. kiểu liên kết đƣợc đặc trƣng bởi một vùng bƣớc sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ hồng ngoại mà ngƣời ta có thể xác định đƣợc các nhóm chức đặc trƣng trong hợp chất, ví dụ nhƣ dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khoảng 1700-1750 cm-1. 1.4.2. Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy – MS) Nguyên tắc của phƣơng pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dƣới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó ngƣời ta có thể xác định đƣợc cơ chế phân mảnh và dựng lại đƣợc cấu trúc hóa học của hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lƣợng nhƣng có những phƣơng pháp chủ yếu sau: 1. Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dƣới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lƣợng khác nhau, phổ biến là 70 eV. 2. Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy) đƣợc gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này đƣợc thực hiện với năng lƣợng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu đƣợc chủ yếu là các pic ion phân tử và các pic đặc trƣng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lƣợng thấp dễ bị phá vỡ. 3. Phổ FAB (Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở mức năng lƣợng thấp, do đó phổ thu đƣợc cũng dễ thu đƣợc pic ion phân tử. 4. Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao. Ngoài ra, hiện nay ngƣời ta còn sử dụng kết hợp các phƣơng pháp sắc kí với khối phổ khác nhƣ: GC-MS (sắc kí khí – khối phổ), LC-MS (sắc kí 20
  28. lỏng – khối phổ). Các phƣơng pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dƣợc). 1.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy – NMR) Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân đƣợc xem nhƣ là một trong những phƣơng pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lí chung của các phƣơng pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hƣởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dƣới tác dụng của từ trƣờng ngoài. Sự cộng hƣởng khác nhau này đƣợc biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trƣng của phân tử còn đƣợc xác định dựa vào tƣơng tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling). Phổ 1H – NMR Trong phổ 1H-NMR độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton đƣợc xác định trong thang ppm từ 0 – 14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng nhƣ đặc trƣng riêng của từng phần. Từ những đặc trƣng của độ dịch chuyển hóa học và tƣơng tác spin mà ta có thể xác định đƣợc cấu trúc hóa học của hợp chất. Phổ 13C-NMR Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hƣởng ở một trƣờng khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, dải thang đo rộng 0 – 230ppm. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc 4 biến mất. Với phổ DEPT 1350 thì 21
  29. tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 nằm về một phía. Còn đối với phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH. Phổ 2D-NMR Đây là các kĩ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định tƣơng tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Thƣờng sử dụng một số kĩ thuật chủ yếu nhƣ sau: + Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): các tƣơng tác trực tiếp H-C đƣợc xác định nhờ vào các tƣơng tác trực tiếp trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tƣơng tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ. + Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H – 1H Chemical Shif Correlation Spectroscopy): phổ này biểu diễn các tƣơng tác xa của H-H chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử đƣợc nối ghép lại với nhau. + Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): đây là phổ biểu diễn tƣơng tác xa của H và C trong không gian phân tử. Nhờ vào các tƣơng tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng nhƣ toàn bộ phân tử đƣợc xác định về cấu trúc. + Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): phổ này biểu diễn các tƣơng tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử. Ngƣời ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kĩ thuật phổ NOE differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử bằng việc đƣa vào một xung đúng bằng từ trƣờng cộng hƣởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng nhƣ gần nhau về không gian sẽ cộng hƣởng mạnh hơn và cho tín hiệu phổ có cƣờng độ mạnh hơn. 22
  30. Ngoài ra, ngƣời ta còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơnghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể. Nhƣng phổ này có phạm vi sử dụng hạn chế vì yêu cầu tiên quyết là cần phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ. Nhƣ đã đề cập ở trên, ngoài việc sử dụng các loại phổ, ngƣời ta còn sử dụng kết hợp các phƣơng pháp chuyển hóa hóa học cũng nhƣ các phƣơng pháp phân tích, so sánh, kết hợp khác. Đặc biệt đối với phân tử có nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định chính xác đƣợc chiều dài các mạch. Hay đối với các phân tử có các đơn vị đƣờng thì việc xác định chính xác loại đƣờng cũng nhƣ cấu hình đƣờng thông thƣờng phải sử dụng phƣơng pháp thủy phân rồi xác định bằng phƣơng pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với các đƣờng chuẩn dự kiến. 23
  31. CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật Lá cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata) đƣợc thu tại Hồng Lý, Vũ Thƣ, Thái Bình vào tháng 4 năm 2015 và đƣợc xác định bởi TS. Trần Thị Phƣơng Anh bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam giám định. Mẫu tiêu bản (TB15.2015) đã đƣợc lƣu giữ tại Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu 4,5 kg mẫu khô cây Mỏ quạ, đƣợc cắt nhỏ, phơi khô, xay thành bột mịn rồi đƣợc ngâm chiết với metanol với sự hỗ trợ của thiết bị chiết siêu âm (mỗi lần 60 phút ở 40-50 oC, 3-5 lần). Lớp dung môi metanol đƣợc lọc qua giấy lọc rồi tiến hành cất loại dung môi metanol bằng thiết bị cất quay chân không áp suất giảm thu đƣợc 200 g cặn chiết metanol. 200 g cặn chiết metanol mẫu Mỏ quạ thu đƣợc ở trên đƣợc phân bố đều vào 2 phễu chiết có chứa 1L nƣớc cất. Sau đó, bổ sung vào mỗi phễu chiết 1L diclometan, lắc đều rồi để phân lớp qua đêm (3 lần). Lớp diclometan (dƣới) đƣợc lọc qua giấy lọc rồi cất loại diclometan bằng thiết bị cất quay chân không áp suất giảm thu đƣợc 80,0 g cặn diclometan. Lớp nƣớc (trên) đƣợc loại bỏ dung môi còn sót lại và nƣớc thu đƣợc 30,0 g cặn nƣớc. 2.2.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất Để phân tích và phân tách các phần chiết của cây cũng nhƣ phân lập các hợp chất, các phƣơng pháp sắc ký đã đƣợc sử dụng nhƣ: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát), sắc ký cột thƣờng (CC), sắc ký cột pha đảo. 24
  32. Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck); phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% đƣợc phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu. Sắc ký cột (CC): đƣợc tiến hành với chất hấp phụ là Silicagel pha thƣờng và pha đảo. Silicagel pha thƣờng có cỡ hạt là 0,040 - 0,063 mm (240 - 430 mesh). Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30 - 50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.). 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất Cấu trúc hóa học của các hoạt chất đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp phổ kết hợp nhƣ phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối lƣợng (MS) và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân đƣợc ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer của Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam. Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan). Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton đƣợc xác định trong thang ppm từ 0 ppm đến 14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng nhƣ đặc trƣng riêng của từng phân tử. Mỗi loại proton cộng hƣởng ở một trƣờng khác nhau và vì vậy chúng đƣợc biểu diễn bằng một độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào những đặc trƣng của độ dịch chuyển hóa học cũng nhƣ tƣơng tác spin coupling mà ngƣời ta có thể xác định đƣợc cấu trúc hóa học của hợp chất. 25
  33. Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hƣởng ở một trƣờng khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng đƣợc tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ o ppm đến 240 ppm). Phổ P istortionless h ncement Pol ris tion r nsfer : Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên các phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu phổ của 0 CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135 . Còn trên phổ DEPT 900 thì chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH. Phổ eteronucle r ultiple ond onnectivity): Đây là phổ biểu diễn các tƣơng tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tƣơng tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng nhƣ toàn bộ phân tử đƣợc xác định về cấu trúc. Phổ S ucler verh user ffect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tƣơng tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này, có thể xác định đƣợc cấu trúc không gian của phân tử. Độ quay cực đo trên máy JASCO DIP -1000 KUY polarimeter. 26
  34. CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1. Phân lập các hợp chất Phân đoạn nƣớc đƣợc hòa tan bằng thể tích tối thiểu hỗn hợp dung môi metanol/nƣớc (tỉ lệ 1/1 về thể tích) rồi tiến hành phân tách trên cột sắc ký sử dụng silicagel pha đảo C-18 với hệ dung môi rửa giải metanol/nƣớc (tỉ lệ 1/1 về thể tích, 2 L) thu đƣợc 2 phân đoạn chính là B1 và B2. Phân đoạn B1 (2,3 g) tiếp tục đƣợc tinh chế trên cột sắc ký sử dụng silicagel pha đảo C-18 với hệ dung môi rửa giải metanol/nƣớc (tỉ lệ 1,5/1 về thể tích, 2 L) thu đƣợc hợp chất 2-MQ4 (10 mg). Phân đoạn B2 đƣợc phân tách thành 3 phân đoạn nhỏ hơn (B2A – B2C) trên cột sắc ký sử dụng silicagel pha thƣờng với hệ dung môi rửa giải diclometan/metanol (tỉ lệ 7/1 về thể tích, 2,3 L). Phân đoạn B2A đƣợc tiến hành tinh chế trên cột sắc ký sử dụng silica gel pha thƣờng hexan/diclometan/metanol (tỉ lệ 4/8/1 về thể tích, 1,5 L) thu đƣợc hợp chất 1- MQ30 (7 mg). 27
  35. Phân đoạn nƣớc Sắc kí cột pha đảo C-18 Metanol/nƣớc (1:1), 2L B1 B2 (2,3g) Sắc kí cột pha đảo C -18 Sắc kí cột pha thƣờng Metanol/nƣớc:1,5/1 (2 L) Điclometan/metanol (7/1), 2.3L Hợp chất 2 MQ4 (10mg) B2A B2B B2C Sắc kí cột pha thƣờng Hexan/diclometan/metanol: 4/8/1 (1.3 L) Hợp chất 1 MQ30 (7mg) Hình 3.1: Sơ đồ phân lập phân đoạn nước cây Mỏ quạ 28
  36. 3.2. Hằng số vật lí và dữ liệu phổ các chất 3.2.1. Hợp chất 1 (MQ30): Licoflavone C - Công thức phân tử: C20H18O5 - Khối lƣợng phân tử: M = 338 1 - H-NMR (CD3OD, 500 MHz) H: 6,61 (1H, s, H-3); 6,29 (1H, s, H-6); 7,87 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2 , H-6 ); 6,95 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3 , H-5 ); 3,54 (1H, ft, J = 6,5 Hz, H-1); 5,26 (1H, t, J = 6,5 Hz, H-2); 1,84 (3H, s, H-4) và 1,71 (3H, s, H-5). 13 - C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δC:166,2 (C-2); 103,6 (C-3); 184,3 (C-4); 160,8 (C-5); 99,6 (C-6); 163,4 (C-7); 108,2 (C-8); 156,6 (C-9); 105,3 (C-10); 123,8 (C-1’); 129,5 (C-2’); 117,0 (C-3’); 162,7 (C-4’); 117,0 (C-5’);129,5 (C- 6’); 22,6 (C-1’’); 123,6 (C-2’’); 132,6 (C-3’’); 25,9 (C-4’’); 18,2 (C-5’’). 3.2.2. Hợp chất 2 (MQ4): Kaempferol-7-O-β-D-glucopyranoside - Công thức phân tử: C21H20O11 - Khối lƣợng phân tử: M = 448 1 - Phổ proton H-NMR (DMSO, 500 MHz) H: 6,42 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6); 6,79 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8); 8,08 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2 , H-6 ); 6,93 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3 , H-5 ); 5,06 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1 ); 3,26 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-2 ); 3,44 (dd, J = 6,0, 1,5 Hz, H-3 ); 3,18 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-4 ); 3,11 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-5 ); 3,71 (1H, brd, J = 10,0 Hz, Ha-6 ) và 3,48 (1H, dd, J = 11,5; 6,0 Hz, Hb-6 ) . 13 - Phổ cacbon C-NMR (DMSO, 125 MHz) δC: 147,5 (C-2); 176,2 (C- 4); 160,4 (C-5); 98,8 (C-6); 162,7 (C-7); 94,4 (C-8); 155,8 (C-9); 104,7 (C- 10); 121,6 (C-1’); 129,6 (C-2’); 115,5 (C-3’); 159,4 (C-4’); 115,5 (C-5’); 129,6 (C-6’); 99,9 (C-1’’); 73,1 (C-2’’); 77,2 (C-3’’); 69,6 (C-4’’); 76,4 (C- 5’’); 60,3 (C-6’’). 29
  37. CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định cấu trúc hợp chất 1 Hợp chất 1 thu đƣợc dƣới dạng bột màu vàng. Phổ 1H-NMR cho thấy các tín hiệu proton của vòng thơm với hệ tƣơng tác spin A2B2 tại δH 6,95 (2H, d, J = 8,5 Hz) và 7,87 (2H, d, J = 8,5 Hz). Một tín hiệu proton ở δH 6,61 (lH, brs), và một tín hiệu proton của vòng thơm dạng singlet ở δH 6,29 (lH, s) cho thấy hợp chất 1 là một flavone điển hình. Bên cạnh đó, cũng quan sát thấy sự có mặt của nhóm γ, γ-dimethylallyl với các tín hiệu đặc trƣng [δH 1,71 (3H, s); 1,84 (3H, s); 3,54 (2H, d, J = 6,5 Hz); 5,26 (1H, t, J = 6,5 Hz )]. Phổ 13 C- NMR và HSQC cho thấy tín hiệu của 20 cacbon bao gồm 15 cacbon khung flavone (Bảng 1) và 5 tín hiệu của nhóm γ, γ-dimethylallyl [δC 22,6 (CH2); 123,6 (CH); 132,6 (C); 25,9 (CH3) và 18,2 (CH3)]. Số liệu phổ NMR của 1 tƣơng tự nhƣ của hợp chất licoflavone C [12] ngoại trừ đối với tín hiệu của cacbon C-8 và C-10 (Bảng 1). Các tín hiệu ở δC 108,2 và 105,3 đƣợc gán cho C-8 và C-10 tƣơng ứng nhờ vào tƣơng tác HMBC từ proton δH 6,61 (H-3) đến cacbon δC 184,3 (C-4) / 105,3 (C-10) và proton δH 3,54 (H-2’’) đến cacbon δC 163,4 (C-7) / 108,2 (C-8) / 156,6 (C-9). Vị trí của nhóm γ, γ-dimethylallyl tại C-8 (δC 108,2) cũng đã đƣợc khẳng định. Từ các dữ liệu trên, cấu trúc hóa học của 1 đã đƣợc làm sáng tỏ nhƣ là licoflavone C (8-prenyl-4 ', 5,7- trihydroxyflavone). Hình 4.1.1: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 1 30
  38. Hình 4.1.2: Phổ proton 1H của hợp chất 1 Hình 4.1.3: Phổ cacbon 13C của hợp chất 1 31
  39. Hình 4.1.4: Phổ HMBC của hợp chất 1 32
  40. Hình 4.1.5: Phổ HMBC của hợp chất 1 (tiếp) 33
  41. Hình 4.1.6: Phổ HSQC của hợp chất 1 34
  42. Bảng 4.1: Số liệu phổ của hợp chất MQ30 và chất tham khảo a,b # H HMBC C C [1] C[a,b] DEPT mult. (J = Hz) (HC) 2 165.0 166.2 C - - 3 103.9 103.6 C 6.61 (brs) - 4 183.5 184.3 C - - 5 161.0 160.8 C - 6 99.3 99.6 CH 6.29 (s) 5, 7, 8, 10 7 162.2 163.4 C - - 8 105.4 108.2 C - - 9 156.0 156.6 C - - 10 107.4 105.3 C - - 1' 123.7 123.8 C - - 2' 129.3 129.5 CH 7.87 (d, 8.5) 2, 4’ 3' 116.9 117.0 CH 6.95 (d, 8.5) 1’, 4’ 4' 161.9 162.7 C - - 5' 116.9 117.0 CH 6.95 (d, 8.5) - 6' 129.3 129.5 CH 7.87 (d, 8.5) - 1'' 22.4 22.6 CH2 3.54 (d, 6.5) 7, 8, 9, 2’’, 3’’ 2'' 123.6 123.6 CH 5.26 (t, 6.5) 8, 4’, 5’ 3'' 132.1 132.6 C - - 4'' 25.8 25.9 CH3 1.84 (s) 2’’, 3’’, 4’’ 5'' 18.1 18.2 CH3 1.71 (s) 2’’, 3’’, 5’’ a b c đo trong CD3OD, đo tại 125 MHz, đo tại 500 MHz. 35
  43. 4.2. Xác định cấu trúc hợp chất 2 Hợp chất 2 thu đƣợc dƣới dạng bột màu vàng. Phổ 1H và 13C-NMR tƣơng tự nhƣ của hợp chất 1, ngoại trừ sự biến mất của nhóm γ, γ- dimethylallyl và các tín hiệu bổ sung của một đƣờng β-D-glucose [δH 5,06 (d, ’’ ’’ ’’ ’’ J = 7,5 Hz, H-1 ); cacbon ở δC 99,9 (C-1 ); 73,2 (C-2 ); 77,2 (C-3 ); 69,6 (C-4’’); 76,4 (C-5’’) và 60,3 (C-6’’) ]. Đƣờng β-D- glucose đƣợc xác định tại C-7 với sự tƣơng quan HMBC từ proton δH 6,42 (H-6) và 6,79 (H-8) tới ’’ cacbon δC 163,7 (C-7) và từ proton δH 5,06 H-1 ) đến cacbon δC 163,7 (C-7). Trên cơ sở những dữ liệu này và so sánh với các giá trị [6] (Bảng 1), hợp chất 2 đƣợc xác định là kaempferol-7-O-β-D-glucopyranoside. Hình 4.2.1: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 2 36
  44. Hình 4.2.2: Phổ proton 1H của hợp chất 2 Hình 4.2.3: Phổ cacbon 13C của hợp chất 2 37
  45. Hình 4.2.4: Phổ cacbon DEPT của hợp chất 2 38
  46. Hình 4.2.5: Phổ HMBC của hợp chất 2 39
  47. Hình 4.2.6: Phổ HMBC của hợp chất 2 (tiếp) Hình 4.2.7: Phổ HSQC của hợp chất 2 40
  48. Hình 4.2.8: Phổ HSQC của hợp chất 2 (tiếp) 41
  49. Bảng 4.2: Số liệu phổ của hợp chất MQ4 và chất tham khảo # a,b C C [1] C[a,b] H HMBC mult. (J = Hz) (HC) 2 147.6 147.5 - 3 136.1 nd - 4 176.1 176.2 - 5 160.4 160.4 - 6 98.9 98.8 6.42 (d, 2.0) 7 162.8 162.7 - 8 94.5 94.4 6.79 (d, 2.0) 9 155.8 155.8 - 10 104.7 104.7 - 1' 121.6 121.6 - 2' 129.7 129.6 8.08 (d, 9.0) 3' 115.5 115.5 6.93 (d, 9.0) 4' 159.4 159.4 - 5' 115.5 115.5 6.93 (d, 9.0) 6' 129.7 129.6 8.08 (d, 9.0) 1'' 100.0 99.9 5.06 (d, 7.5) 2'' 73.1 3.26 (t, 9.0) 3'' 77.2 3.44 (dd, 6.0, 1.5) 4'' 69.6 3.18 (t, 9.0) 5'' 76.4 3.11 (t, 9.0) 6'' 60.3 3.71 (brd, 10.0) 3.48 (dd, 11.5, 6.0) a b c đo trong DMSO-d6, đo tại 125 MHz, đo tại 500 MHz. 42
  50. KẾT LUẬN 1. Đã phân lập đƣợc 2 chất sạch đƣợc kí hiệu là MQ30 (1) và MQ4 (2) từ phân đoạn nƣớc của cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata) 2. Bằng các phƣơng pháp phổ hiện đại nhƣ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC và HSQC đã phân tích biện luận và xác định đƣợc cấu trúc hóa học của 2 hợp chất trên là licoflavone C và kaempferol-7-O-β-D-glucopyranoside. Licoflavone C Kaempferol-7-O-β-D-glucopyranoside 43
  51. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 1. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Tập 2, Nhà xuất bản Y học. 2. PGS.TS Nguyễn Hữu Đĩnh (2013), PGS.TS Đỗ Đình Rãng, Hóa học hữu cơ, Nhà xuất bản Giáo dục. 3. Đỗ Bích Huy, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Toàn (2004) Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập II, Nhà xuất bản Khoa học và Công nghệ Hà Nội. 4. Trần Đình Sơn, Vũ Thị Kim Ngọc, Nguyễn Thị Hồng Điệp, Phan Thanh Hải (2008), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, Quyển I, Nhà xuất bản Y học Hà Nội. 5. Trần Đình Sơn, Vũ Thị Kim Ngọc, Nguyễn Thị Hồng Điệp, Phan Thanh Hải (2008), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, Quyển I, Nhà xuất bản Y học Hà Nội. Tiếng anh 6. Arch. Pharm. Res, Vol 28 (4), 395-399, 2005 7. Cannell, R.J.P (1998), Natural Products Isolation. 8. Dong-Cheol Kim, Chi-Su Yoon, Tran Hong Quang, Wonmin Ko, Jong-Su Kim, Hyuncheol Oh and Youn-Chul Kim Prenylated Flavonoids from Cudrania tricuspidata Suppress Lipopolysaccharide-Induced Neuroinflammatory Activities in BV2 Microglial Cells. 9. Duc Do Khac, Sung Tran Van, Angela Martha Campos, Yean- Yves Lallemand and Marcel Fetizon (1990), Ellagic acid compounds from Diplopanax stahyanthus, Phytochemistry, Vol.29(1), 251-256. 44
  52. 10. Jaeyoung Kwon, Nguyen Tuan Hiep,Dong-Woo Kim, Sungeun Hong, Yuanqiang Guo, Bang Yeon Hwang, Hak Ju Lee,Woongchon Mar, and Dongho Lee, Chemical Constituents Isolated from the Root Bark of Cudrania tricuspidata and Their Potential Neuroprotective Eff ects. 11. K. R. Markham, B. Ternai, R. Stanley, H. Geiger and T. J. Mabry (1978), Tetrahedron, 34, 1389-1392. 12. Kiichiro kajiyama, Sachio demizu, Yukio hiraga, Kaoru kinoshita, Kiyotaka koyama, Kunio takahashi, Yukwoshi tamura, Kenzo okada and Takeshi kinoshit. New prenylflavones and dibenzoylmethane from glycyrrhiza inflata. Journal of natural products Vol. 55. No. 9. pp. 1197-1203, September 1992. 13. Lobe Songue, Kouam, Etienne Dongo, Theophile Ngando Mpondo and Robert L. White (2012), Article Chemical Constituents from Stem Bark and Roots of Clausena anisata Jules. 14. Peter J. Houghton and Lu Ming Lian (1986), Triterpenes from Desfonatainia spinosa, Phytochemistry, Vol. 15(8), 1939-1944 15. Yang Hee Jo, Seon Beom Kim, Qing Liu, Seon-Gil Do, Bang Yeon Hwang, Mi Kyeong Lee, Comparison of pancreatic lipase inhibitory isoflavonoids from unripe and ripe fruits of Cudrania tricuspidata. 16. Yang Hee Jo, Seon Beom Kim, Qing Liu, Bang Yeon Hwang, and Mi Kyeong Lee, Prenylated Xanthones from the Roots of Cudrania tricuspidata as Inhibitors of Lipopolysaccharide-Stimulated Nitric Oxide Production. Tài liệu wed 17. BA%ADt_Vi%E1%BB%87t_Nam 45
  53. 18. nha 19. qua-3410.html 20. 21. khoe-d111.html 46