›

Khóa luận Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của rễ cây cốt khí củ (polygonum cuspidatum sieb. et zucc - polygonaceae)

pdf 56 trang thiennha21 18/04/2022 5921
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của rễ cây cốt khí củ (polygonum cuspidatum sieb. et zucc - polygonaceae)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_hoat_tinh_khang_khuan_va_khang_nam_cua_re.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của rễ cây cốt khí củ (polygonum cuspidatum sieb. et zucc - polygonaceae)

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH BÙI THỊ PHƯƠNG THẢO KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM CỦA RỄ CÂY CỐT KHÍ CỦ (POLYGONUM CUSPIDATUM SIEB. ET ZUCC - POLYGONACEAE) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC TPHCM - 2018
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH BÙI THỊ PHƯƠNG THẢO KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM CỦA RỄ CÂY CỐT KHÍ CỦ ( POLYGONUM CUSPIDATUM SIEB. ET ZUCC - POLYGONACEAE) Chuyên ngành : Sản xuất và phát triển thuốc KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Hướng dẫn khoa học: ThS. Nguyễn Thị Hồng Phúc TPHCM - 2018
  3. LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Chữ ký sinh viên SV. BÙI THỊ PHƯƠNG THẢO
  4. LỜI CẢM ƠN Quãng thời gian đại học 5 năm tại khoa Dược trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã để lại trong tôi rất nhiều kỉ niệm đẹp về thầy cô và bạn bè. Một chặng đường dài nổ lực và cố gắng cùng chúng bạn, may mắn thay chặng đường cuối ấy tôi được thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp. Để khóa luận của tôi được hoàn thành không chỉ là sự cố gắng của bản thân mà còn có rất nhiều sự giúp đỡ động viên từ gia đình, các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên và bạn bè. Xin gửi ngàn lời cảm ơn tới ba mẹ đã sinh thành và cho con một cuộc sống thật tốt, cảm ơn các anh chị đã luôn yêu thương em. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô ThS. Nguyễn Thị Hồng Phúc Cô PGS. TS. Võ Thị Bạch Huệ Cô TS. Nguyễn Hữu Lạc Thủy đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn thầy DS. Phan Cảnh Trình, các anh (chị) và các bạn bộ môn Vi sinh – Ký sinh khoa Dược – ĐH Y Dược Tp. HCM đã hướng dẫn và giúp đỡ em trong thời gian làm việc tại đây. Cảm ơn tất cả các Thầy, Cô và Anh, Chị kỹ thuật viên của khoa Dược – Trường ĐH Nguyễn Tất Thành, đặc biệt là thầy Đoàn Phú Quý, chị Trần Hà Linh kỹ thuật viên bộ môn Kiểm nghiệm đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này. Cảm ơn tất cả bạn bè của tôi, những người đã đồng hành cùng tôi trong 5 năm qua và những người bạn cùng làm đề tài khóa luận tốt nghiệp niên khóa 2013 – 2018. .
  5. MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH iv DANH MỤC CÁC BẢNG v ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Tổng quan về dược liệu 3 1.1.1 Vị trí phân loại, hình thái và phân bố 3 1.1.2 Bộ phận dùng và công dụng dân gian 4 1.1.3 Thành phần hóa học 4 1.1.4 Hoạt tính sinh học 7 1.2 Công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về hoạt tính kháng vi sinh vật của rễ cây cốt khí củ 9 1.3 Tình hình bệnh nhiễm trùng và thuốc điều trị hiện nay 10 1.3.1 Tình hình bệnh nhiễm vi khuẩn và thuốc điều trị 10 1.3.2 Tình hình bệnh nhiễm vi nấm và thuốc điều trị 11 1.4 Tổng quan về vi khuẩn và vi nấm gây bệnh trên người 12 1.4.1 Escherichia coli 12 1.4.2 Pseudomonas aeruginosa 13 1.4.3 Staphylococcus aureus 13 1.4.4 Candida albicans 14 1.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật 15 1.5.1 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật 15 1.5.2 Xác định giá trị MIC 15 1.5.3 Kỹ thuật hiện hình sinh học 15 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.1 Nguyên liệu 16 i
  6. 2.1.2 Vi sinh vật thử nghiệm 16 2.1.3 Môi trường nuôi cấy và thử hoạt tính kháng vi sinh vật 16 2.1.4 Hóa chất, dung môi 17 2.1.5 Dụng cụ, trang thiết bị 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Khảo sát sơ bộ thực vật học rễ cốt khí củ 19 2.2.2 Lựa chọn dung môi chiết xuất rễ cốt khí củ 21 2.2.3 Khảo sát việc chiết tách cao toàn phần và tách phân đoạn với dung môi có độ phân cực khác nhau từ rễ cốt khí củ. 21 2.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của rễ cốt khí củ 23 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 Kết quả 26 3.1.1 Khảo sát thực vật học rễ cây cốt khí củ 26 3.1.2. Lựa chọn dung môi chiết xuất 29 3.1.3 Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn 31 3.1.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật 31 3.2 Bàn luận 38 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 4.1 Kết luận 40 4.2 Kiến nghị 40 ii
  7. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ tiếng Anh Chữ viết đầy đủ tiếng Việt CHCl3 Chloroform Extended - spectrum beta – ESBL Mở rộng phổ beta – lactamases lactamases EtOAc Ethyl acetat HBV Hepatitis B virus Virus viêm gan B ICU Intensive care unit Đơn vị hồi sức tích cực Minimal bactericidal MBC Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu concentratiol MeOH Methanol MIC Minimal inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu Meticilline - resistant Staphylococcus aureus kháng MRSA Staphylococcus aureus kháng sinh meticilline Meticilline - susceptible Staphylococcus aureus còn MSSA Staphylococcus aureus nhạy với kháng sinh meticilline SKLM Sắc ký lớp mỏng TI Therapeutic index Chỉ số điều trị TT Thuốc thử WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới DMSO Dimethyl sulfoxide DĐVN Dược điển Việt Nam OD Optic density Mật độ quang học CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc Human immunodeficiency virus Hội chứng suy giảm miễn dịch HIV infection mắc phải ở người iii
  8. DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Sơ đồ phân loại thực vật cây cốt khí củ 3 Hình 1.2 Toàn cây (A), lá và hoa (B), rễ (C) của cây cốt khí củ 4 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học emodin, chrysophanol và physion 5 Hình 1.4 Cấu trúc các chất thuộc nhóm stilbenoids có hoạt tính kháng virus 9 Hình 1.5 Escherichia coli 12 Hình 1.6 Pseudomonas aeruginosa 13 Hình 1.7 Staphylococcus aureus 13 Hình 1.8 Candida albicans 14 Hình 2.1 Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn 20 Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn 22 Hình 3.1 Rễ cốt khí củ 26 Hình 3.2 Soi bột rễ cốt khí củ 27 Hình 3.3 Phản ứng hóa học định tính alkaloid, coumarin và tanin 28 Hình 3.4 Phản ứng hóa học định tính anthranoid, saponin, chất khử và acid hữu cơ 28 Hình 3.5 Sắc ký đồ hệ dung môi Toluen - EtOAc (93:7) 29 Hình 3.6 Sắc ký đồ hệ dung môi CHCl3 - EtOAc (11:1) 30 Hình 3.7 Sắc ký đồ hệ dung môi MeOH - EtOAc - H2O (13,5:100:10) 30 Hình 3.8 Kết quả vòng kháng khuẩn MSSA 32 Hình 3.9 Kết quả vòng kháng khuẩn MRSA 33 Hình 3.10 Kết quả vòng kháng khuẩn C. albicans 33 Hình 3.11 Kết quả tự sinh đồ cao phân đoạn n - hexan 36 Hình 3.12 Kết quả tự sinh đồ cao phân đoạn chloroform 36 Hình 3.13 Kết quả tự sinh đồ cao phân đoạn ethyl acetat 37 Hình 3.14 Sắc ký lớp mỏng cao toàn phần, n - hexan, chloroform, ethyl acetat và cao nước. 37 iv
  9. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các chất đã được phân lập từ cây Cốt khí củ 6 Bảng 2.1 Các vi si sinh vật thử nghiệm 16 Bảng 2.2 Hóa chất, dung môi 17 Bảng 2.3 Trang thiết bị sử dụng 18 Bảng 2.4 Bảng đối chiếu đường kính vòng kháng vi sinh vật 24 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát thành phần hóa học rễ cốt khí củ 27 Bảng 3.2 Khối lượng cao toàn phần và cao phân đoạn 31 Bảng 3.3 Đường kính vòng ức chế vi sinh vật của cao toàn phần và cao phân đoạn (mm) 34 Bảng 3.4 Kết quả MIC của cao toàn phần và các cao phân đoạn trên vi khuẩn MSSA và MRSA (mg/ml) 35 Bảng 3.5 Bảng kết quả giá trị Rf 37 v
  10. Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - Năm học 2017 – 2018 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM CỦA RỄ CÂY CỐT KHÍ CỦ (POLYGONUM CUSPIDATUM SIEB. ET ZUCC - POLYGONACEAE) Bùi Thị Phương Thảo Hướng dẫn khoa học: ThS. Nguyễn Thị Hồng Phúc Mở đầu: Bệnh lý về nhiễm trùng ngày một thay đổi do các vi sinh vật biến đổi theo hướng bất lợi. Tình trạng kháng kháng sinh là vấn đề của y tế toàn cầu hiện nay. Vì vậy, việc đi tìm những loại kháng sinh mới thực sự cần thiết. Xuất phát từ vấn đề trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM CỦA RỄ CÂY CỐT KHÍ CỦ POLYGONUM CUSPIDATUM SIEB. ET ZUCC - POLYGONACEAE”. Đối tượng nghiên cứu: Rễ của cây cốt khí củ, tên khoa học Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc họ Polygonaceae. Phương pháp nghiên cứu: Chiết xuất cao với dung môi ethanol 80 % (TT). Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và đánh giá MIC trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm. Xác định vết cho hoạt tính kháng khuẩn bằng kỹ thuật hiện hình sinh học. Kết quả: Cao toàn phần và các cao phân đoạn cho khả năng kháng tốt chủng MSSA, MRSA và C. albicans, với MIC từ 0,45 – 4,55 mg/ml. Cao phân đoạn n – hexan và chloroform cho nồng độ MIC thấp nhất đối với hai chủng vi khuẩn MSSA và MRSA (MIC = 0,45 mg/ml). Bằng kỹ thuật hiện hình sinh học đã xác định được vết số 4 (Rf = 0,80) trên sắc ký đồ cho khả năng kháng MSSA. Kết luận: Cao toàn phần và cao phân đoạn của rễ cây cốt khí củ có tiềm năng lớn trong việc tìm ra các ứng dụng điều trị chống lại các chủng vi sinh vật đề kháng thuốc. Từ khóa: Cốt khí củ, dịch chiết cồn, cao phân đoạn, kháng vi khuẩn, kháng vi nấm.
  11. Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2017 - 2018 ANTIMICROBIAL AND ANTIFUNGAL ACTIVITIES OF THE ROOT OF POLYGONUM CUSPIDATUM SIEB. ET ZUCC – POLYGONACEAE Bui Thi Phuong Thao Supervisor: M.S Nguyen Thi Hong Phuc Introduction: Infection diseases is changing because bacteria is also changing by day, and it certainly is not a good change. Antibiotic resistance is a global health problem. Therefore, finding new antibiotics are a matter of urgency, from that issue we had done the research “ANTIMICROBIAL AND ANTIFUNGAL ACTIVITIES OF THE ROOT OF POLYGONUM CUSPIDATUM SIEB. ET ZUCC – POLYGONACEAE”. Materials: The dried root of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc, Polygonaceae. Methods: The antibacterial activities of the extracts and fractions were determined by the well diffusion agar and minimum inhibitory concentration (MIC) methods. Using bioautography to identify traces for antimicrobial activity. Results: Morphological description and identification of constituents are the same as in the Viet Nam pharmacopoeias, volume V. Major chemical compositions: Anthranoid, flavonoid, coumarin and tanin. 80 % Ethanol is selected as a solvent to extract roots. All the crude extract and fractions possesses a broader antibacterial spectrum and greater antibacterial activities against MSSA, MSRA and C. albicans, with a range of MIC values between 0,45 – 4,55 mg/mL. The n - hexan and chloroform fractions of the ethanol extracts had lowest MIC (0,45 mg/mL) on MSSA and MRSA. By bioautography we found out that track 4 (Rf = 0,80) had antimicrobial activitives against MSSA. Conclusion: The crude extract and fractions from Polygonum cuspidatum may provide a promising antibacterial agent for therapeutic applications against drug - resistant bacteria. Keywords: Polygonum cuspidatum, ethanol extract, fractions, antimicrobial activity, antifungal activity.
  12. ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội ngày càng phát triển kéo theo đó là những hệ luỵ lớn như: ô nhiễm môi trường, sự biến đổi của khí hậu, ô nhiễm thực phẩm, Con người ngày nay cũng chịu tác động bởi rất nhiều yếu tố bên ngoài vì vậy mà bệnh tật cũng ngày một gia tăng về số lượng và biến đổi về độc tính đặc biệt là các bệnh nhiễm trùng. Tình trạng kháng kháng sinh là vấn đề của y tế toàn cầu hiện nay. Theo “Báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt Nam năm 2008-2009” mức độ kháng kháng sinh phổ biến trong nhóm vi khuẩn Gram âm bao gồm: Acinetobacter sp., P. aeruginosa, E. coli và Klebsiella sp, khoảng 30-70 % vi khuẩn Gram âm kháng các kháng sinh cephalosporin thệ hệ 3 và 4, xấp xỉ 40-60 % kháng với các kháng sinh nhóm aminoglycosides và fluoroquinolones. Có tới 40 % các chủng Acinetobacter sp. giảm nhạy cảm với imipenem [3]. Trong số các nước thuộc mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP), Việt Nam có mức độ kháng penicillin cao nhất (71,4 %) và kháng erythromycin (92,1 %) [34]. 75 % các chủng Pneumococci kháng với 3 loại kháng sinh trở lên [22]. Xuất phát từ thực tiễn nan giải trên việc nghiên cứu tìm ra phương thuốc mới điều trị bệnh nhiễm trùng mang tính cấp thiết. Đầu tư nghiên cứu phát triển nguồn nguyên liệu hóa dược, dược liệu là chía khóa để giải quyết hữu hiệu thực trạng này. Tuy nhiên, với điều kiện kinh tế, kỹ thuật của một nước đang phát triển như Việt Nam, việc sản xuất nguyên liệu hóa dược còn nhiều hạn chế. Thêm vào đó, Việt Nam giàu tiềm năng cây thuốc, vì vậy việc nghiên cứu và phát triển thuốc từ dược liệu tạo thuận lợi để ngành công nghiệp dược nước ta phát triển theo hướng hiện đại hóa các thuốc y học cổ truyền, thuốc có nguồn gốc dược liệu và tận dụng nguồn tài nguyên dược liệu. Từ lâu, dân gian đã sử dụng cốt khí củ làm thuốc hạ cholesterol, chống ho, giãn phế quãn, cầm máu, ức chế tụ cầu, Các stilben trong cốt khí củ, đặc biệt là resveratrol có tác dụng làm giảm LDL, chống oxi hóa, ngăn chặn sự phát triển của ung thư da, làm giảm tổn thương ở tổ chức gan. Lấy nền tảng từ kinh nghiệm dân 1
  13. gian và một số công trình nghiên cứu về cây cốt khí củ, chúng tôi tiến hành đề tài “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của rễ cây cốt khí củ Polygonum cuspidatum Sieb. Et Zucc - Polygonaceae” với các mục tiêu cụ thể như sau: 1. Khảo sát thực vật học rễ cốt khí củ. 2. Khảo sát việc chiết tách cao toàn phần và tách phân đoạn với dung môi có độ phân cực khác nhau từ rễ cốt khí củ. 3. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của rễ cốt khí củ. 2
  14. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về dược liệu 1.1.1 Vị trí phân loại, hình thái và phân bố Cốt khí củ còn gọi là huyết đan, tử kim long, ban trượng căn, hổ trượng căn, điền thất. Tên khoa học: P. cuspidatum Sieb. et Zucc. Theo phân loại thực vật học cốt khí củ thuộc: Giới: Thực vật Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Polygonales Họ: Polygonaceae Phân họ: Polygonoideae Chi: Polygonum Loài: Polygonum cuspidatum Hình 1.1 Sơ đồ phân loại thực vật cây cốt khí củ Cốt khí củ có nguồn gốc ở vùng Đông Á, sau lan xuống khắp các vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới, bao gồm Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, Lào và một vài nơi khác. Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở vùng núi cao, từ 1000 - 1600 m và được trồng rải rác trong nhân dân ở vùng trung du và đồng bằng Bắc Bộ [10]. Cốt khí củ là cây nhỏ sống lâu năm, cao 0,50 – 1 m. Trên thân và cành thường có những đốm tím hồng. Lá mọc so le, cuống ngắn, bóng và có màu hồng. Phiến lá hình trứng rộng, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới màu nhạt hơn, dài 5 – 12 cm rộng 3,5 – 8 cm, đỉnh lá có mũi nhọn. Bẹ chìa ngắn. Hoa mọc thành chùm ở nách lá. Hoa nhỏ màu trắng. Hoa đực 8 nhị, hoa cái có bầu 3 góc. Qủa 3 cạnh màu nâu đỏ [20]. Cốt khí củ ưa sáng, ưa ẩm, nhưng ráo nước (úng ngập dễ làm thối củ) thường mọc thành khóm trong các thung lũng, nơi gần nguồn nước. Cây sinh trưởng mạnh từ mùa xuân đến mùa thu, bắt đầu cho thu hoạch củ từ tháng 9 trở đi. 3
  15. Hình 1.2 Toàn cây (A), lá và hoa (B), rễ (C) của cây cốt khí củ 1.1.2 Bộ phận dùng và công dụng dân gian Củ cốt khí là rễ phơi hay sấy khô của cây cốt khí củ. Dược liệu có mặt ngoài nâu xám, sần sùi, nhăn nheo theo chiều dọc, có các mấu đốt và gióng, mặt cắt ngang màu vàng bẩn, lõi gần như rỗng, phần không rỗng có màu nâu sẫm. Chất nhẹ, hơi cứng, mùi không rõ, vị hơi đắng [2]. Theo y học cổ truyền, rễ cốt khí củ có vị đắng, tính ấm. Quy kinh can, tâm bào với công năng hoạt huyết thông kinh, chỉ thống, trừ phong thấp, thanh thấp nhiệt, tiêu viêm, sát khuẩn. Ở Việt Nam rễ cốt khí củ thường được dùng để chữa tê thấp, tổn thương đau đớn do bị ngã, bị thương, là một vị thuốc thu liễm cầm máu. 1.1.3 Thành phần hóa học Thành phần hóa học nổi bật của rễ cốt khí củ là hai nhóm chất chính chiếm hàm lượng lớn là các anthranoid (chủ yếu là anthraquinon) và các stilbenoid. Đây là các thành phần hóa học quyết định cho nhiều hoạt tính có giá trị của cốt khí củ như kháng khuẩn, chống ung thư, chống oxy hóa, phòng ngừa bệnh tim mạch Bên cạnh đó nó cũng bao gồm nhiều nhóm hợp chất khác như flavonoid, phenylpropanoid, phenol, quinone, acid amin, bổ trợ với hai nhóm hợp chất chính làm cho cốt khí củ có hoạt tính sinh dược học cao. Rễ chứa các dẫn chất anthranoid ở dạng tự do và dạng kết hợp glycosid với hàm lượng 0,1 – 0,5 %. Các thành phần đã được xác định: chrysophanol, emodin, physcion, emodin 8 - 훽 – glucosid. Ngoài các dẫn chất 4
  16. anthranoid trong rễ còn có polydatin là một stilben glucoside khi thủy phân cho resveratrol. Trong rễ còn có tanin [20]. Dựa vào các kỹ thuật phân tích phổ 3 hợp chất đã được phân lập từ cao ether dầu hỏa và cao ethyl acetat của rễ Cốt khí (Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.). Dựa vào các kỹ thuật phân tích phổ UV, EIMS, H-NMR và C-NMR người ta nhận thấy hai trong ba hợp chất này được xác định là emodin và physcion. Hợp chất thứ ba được định tính sơ bộ là một dẫn chất của resveratrol [21]. Hình 1.3 Cấu trúc hóa học emodin, chrysophanol và physion 5
  17. Một số nhóm chất đã được phân lập từ rễ cốt khí củ được thể hiện trong bảng 1.1 Bảng 1.1 Các chất đã được phân lập từ cây Cốt khí củ [31] Nhóm Stt Chất được phân lập chất Quinones 1 Physcion 2 Emodin 3 Fallacinol 4 Questin 5 Anthraglycoside A Stilbenes 6 Resveratrol 7 Polydatin 8 Resveratrol-4′-O-glucoside 9 Resveratrol 4-O-D-(2′-galloyl)glucopyranoside 10 Resveratrol 4-O-D-(6′-galloyl)glucopyranoside Flavonoid 11 Rutin 12 Quercetin 13 Querectin-3-O-arabinoside 14 Quercitrin 15 Hyperoside Counmarin 16 Coumarin và ligans 17 7-Hydroxy-4-methoxy-5-methylcoumarin 18 Sodium (−)-lyoniresinol-2a-sulfate 19 Sodium (+)-isolaricireinol-2a-sulfate Hợp chất 20 Protocatechuic acid khác 21 2,5-Dimethyl-7-hydroxy chromone 22 Torachrysone-8-O-d-glucoside 23 5,7-Dihydroxy-1(3H)-isobenzofuranone 6
  18. 1.1.4 Hoạt tính sinh học 1.1.4.1 Chống oxy hóa Các nhà khoa học Chin-Yuan Hsu, Yu-Pei Chan và Jeli Chang đã nghiên cứu chiết xuất ethanol của P. cuspidatum có khả năng chống oxy hóa. Các kết quả cho thấy giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50 % gốc tự do DPPH) của chiết xuất P. cuspidatum là 110 μg/ml thấp hơn so với (+) – catechin và L – ascorbic trong phương pháp dọn gốc tự do DPPH. Trong phương pháp dọn các gốc superoxide là 3,2 μg/ml và 8 μg/ml trong phương pháp peroxid hóa lipid. Kết quả này tốt hơn hẳn so với IC50 của (+) – catechin trong phương pháp dọn các gốc superoxide là 40 μg/ml và 17 μg/ml trong phương pháp peroxid hóa lipid. Dịch chiết P. cuspidatum còn có khả năng bảo vệ ADN trước tác nhân UV và H2O2 gần như hoàn toàn với liều 5000 μg/ml. Các tổng phenol và hàm lượng flavonoid của dịch chiết là 641,1 ± 42,6 mg/g và 62,3 ± 6,0 mg/g [25]. Chất chiết xuất ethanol và ethyl acetat của P. cuspidatum có tác dụng đáng kể đối với các gốc DPPH và hydroxyl. Tổng hàm lượng phenolic của P. cuspidatum là 276,78 ± 39,31 và 231,73 ± 5,04 mg/ml. Cả hai chất chiết xuất đều cho tác động bảo vệ chống lại sự phân rã sợi DNA do gốc hydroxyl gây ra [27]. 1.1.4.2 Ngừa ung thư Chiết xuất ethanol và ethyl acetat của rễ P. cuspidatum gây ra quá trình tự chết tế bào apoptosis và ức chế sự tăng trưởng ở các dòng tế bào A549 và H1650, điều này cho thấy rằng chất chiết xuất từ rễ P. cuspidatum có tác dụng chống tăng sinh trên tế bào ung thư phổi ở người [27]. 1.1.4.3 Trị đái tháo đường Protein kinase AMP đóng vai trò trung tâm trong việc điều tiết chuyển hóa glucose và lipid, do đó nó được coi là một mục tiêu trị liệu mới cho hội chứng chuyển hóa như bệnh đái tháo đường type 2. Resveratrol đã được chỉ rõ là làm tăng hấp thu glucose trong tế bào C2C12 thông qua kích hoạt protein kinase AMP, nó làm giảm HG-do superoxid sản xuất thông qua việc tăng SIRT1 trong bạch cầu đơn nhân, đây là một dấu hiệu cho thấy tiềm năng trị đái tháo đường của resveratrol [30,37]. 1.1.4.4 Giảm đau, chống trầm cảm 7
  19. Ở Việt Nam, độc tính cấp và tác dụng giảm đau, an thần của cốt khí củ cũng đã được nghiên cứu, theo đó ở liều 80 g/kg ở chuột nhắt trắng gấp 200 lần liều dùng lâm sàng, cốt khí củ vẫn chưa gây ra độc tính cấp, đây cũng là liều tối đa cho chuột cống uống được. Kết quả nghiên cứu về tác dụng giảm đau cho thấy cốt khí củ giảm đau theo kiểu Morphin (tác động lên vỏ não và trung tâm dưới vỏ gây ra một phản ứng kích thích hệ thống giảm đau) và theo cơ chế ngoại biên. Ngoài giảm đau, cốt khí củ còn có tác dụng ức chế thần kinh trung ương, làm giảm các hoạt động của chuột nhưng không gây ngủ, làm giảm đáp ứng kích thích tiếng động, ánh sáng, ức chế được một phần trạng thái hưng phấn do cafein gây ra [14]. Tác dụng chống trầm cảm của resveratrol thể hiện ở việc làm gia tăng đáng kể serotonin và noradrenaline ở mức liều 40 hoặc 80 mg/kg ở các vùng não, có thể liên quan đến kích hoạt serotonergic và noradrenergic, ức chế hoạt động của monoamin oxidase A (MAO-A ) [36]. 1.1.4.5 Kháng virus Một nghiên cứu khác của các chất từ chiết xuất cồn và nước của P. cuspidatum. chống lại virus viêm gan HBV trong tế bào HepG2. Chiết xuất ethanol của P. cuspidatum có thể ức chế vào việc sản xuất HBV với liều tối thiểu hiệu quả là 10 μg/ml. Chiết xuất nước của P. cuspidatum cũng có thể ức chế sự sản xuất HBV ở liều cao 30 μg/ml. Sự biểu hiện của HBsAg được tăng lên đáng kể trong cả chiết xuất ethanol và chiết xuất nước nhưng nó phụ thuộc vào liều và thời gian. Nhưng chiết xuất nước ở mức liều cao lại ức chế sự biểu hiện của HbeAg, dịch chiết nước chỉ có thể làm tăng HbeAg ở mức liều 3 μg/ml [23]. Chiết xuất ethanol 70 % của P. cuspidatum cho thấy tác dụng ức chế chống lại sự hình thành đồng bộ hóa HIV-1 ở nồng độ không độc tế bào trên in vitro với EC50 (nồng độ ức chế 50 % sự sao chép của virus) là 13,94 ± 3,41 µg/ml. Thông qua phân đoạn có hoạt tính sinh học, 20 hợp chất phenolic, bao gồm tám chất trong nhóm stilbenoids, được phân lập từ rễ của P. cuspidatum. Kết quả cho thấy các hợp chất 1, 13, 14 và 16 biểu hiện hoạt tính kháng virus khá mạnh chống lại tế bào cytopathic do HIV-1 gây ra trên các tế bào lympho C8166 ở nồng độ không gây độc tế bào, với giá 8
  20. trị EC50 (nồng độ ức chế 50% sự sao chép của virus) là 4,37 ± 1,96 µg/ml, 19,97 ± 5,09, 14,40 ± 1,34 µg/ml và 11,29 ± 6,26 µg/ml và giá trị của chỉ số trị liệu (TI) lần lượt là là 8,12, lớn hơn 10,02, lớn hơn 13,89 và lớn hơn 17,71 [26]. Hình 1.4 Cấu trúc các chất thuộc nhóm stilbenoids có hoạt tính kháng virus 1.2 Công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về hoạt tính kháng vi sinh vật của rễ cây cốt khí củ Trong thời gian nghiên cứu chúng tôi tìm kiếm được một số công trình nghiên cứu ngoài nước về hoạt tính kháng vi sinh vật của rễ cây cốt khí củ. Nghiên cứu thử kháng khuẩn được thực hiện trên ba chủng Gram dương B. cereus, L. monocytogenes, S. aureus, hai chủng Gram âm E. coli và S. anatum. Người ta thấy rằng các chủng vi khuẩn Gram dương nhạy cảm hơn so với chủng vi khuẩn Gram âm, chúng bị ức chế sự tăng trưởng ở nồng độ thấp và cũng có thể bị tiêu diệt trong đó S. aureus bị ức chế mạnh nhất, tiếp theo đó là L. monocytogenes và B. cereus với MIC 156,3 – 312,5 μg/mL và MBC 312,5 – 1250 μg/ml. Đối với chủng vi khuẩn Gram âm S. anatum nhạy cảm hơn E. coli, MIC và MBC đối với Gram âm phải đạt hơn 2500 μg/ml [32]. 9
  21. Nghiên cứu trên chủng vi khuẩn kháng thuốc khác gồm có S. aureus, A. baumannii và P. aeruginosa nhận thấy phân đoạn ethyl ether (EE) của chiết xuất ethanol có phổ kháng khuẩn rộng hơn và hoạt tính kháng khuẩn lớn hơn với các giá trị MIC từ 0,1 - 3,5 mg/ml. Chiết xuất EE cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất và phổ kháng khuẩn rộng đối với các chủng S. aureus, A. baumannii và P. aeruginosa với các vùng ức chế trung bình là 26,00 mm, 20,33 mm và 17,00 mm. Chiết xuất ethyl acetat cho hoạt tính kháng khuẩn hơi thấp hơn so với chiết xuất EE [35]. P. cuspidatum đã được sử dụng trong y học dân gian Hàn Quốc để cải thiện vệ sinh răng miệng, khi nghiên cứu trên 2 chủng vi khuẩn cư trú và gây bệnh tại khoang miệng Streptococcus mutans và Streptococcus sobrinus người ta thấy rằng dịch chiết cốt khí củ cho khả năng kháng khuẩn rộng với MIC 0,50 – 4,00 mg/ml, MBC cao gấp hai đến bốn lần MIC [33]. 1.3 Tình hình bệnh nhiễm trùng và thuốc điều trị hiện nay 1.3.1 Tình hình bệnh nhiễm vi khuẩn và thuốc điều trị Trong các biến chứng của đái tháo đường liên quan tới nhiễm trùng thì nhiễm trùng da và mô mềm đang trở thành nguyên nhân hàng đầu gây tàn tật và tử vong. Nghiên cứu của Vũ Ngọc Hiếu và Phạm Hồng Nhung thực hiện trên 487 bệnh nhân đái tháo đường có bệnh phẩm nhiễm trùng da và mô mềm dương tính với vi tại Bệnh viện Bạch Mai. Tỉ lệ vi khuẩn gram âm chiếm 55,7 %. Tỉ lệ phân lập được đa tác nhân là 14,7 %. Tác nhân hàng đầu phân lập được là S. aureus (34,2 %). Tỉ lệ S. aureus kháng methicillin (MRSA) là 53,7 %. Tất cả các chủng S. aureus và hầu hết các chủng Enterococcus spp. còn nhạy vancomycin. Đa số các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae còn nhạy với nhóm carbapenem và amikacin. P. aeruginosa có tỉ lệ kháng kháng sinh nhóm carbapenem tương đối cao, còn khá nhạy với piperacillin- tazobactam và amikacin [12]. Tại khoa ICU bệnh viện Nhân Dân Gia Định khi lấy mẫu bệnh phẩm của 220 bệnh nhân để phân tích. Kết quả cho thấy đề kháng kháng sinh thường gặp là ceftriaxone 88 %, ceftazidime 80 %, ciprofloxacin 77 %, cefepim 75 %, levofloxacin 72 %. Nhìn chung, tỉ lệ đề kháng cho từng kháng sinh một là 93 %, kháng cùng lúc hai loại kháng sinh 87 %. Ba tác nhân vi khuẩn chính yếu phân 10
  22. lập được là A. baumannii , K. pneumoniae , P. aeruginosa.[19]. Việc sử dụng thuốc có nguồn gốc hóa dược để điều trị tuy có nhiều kết quả khả quan nhưng lại làm tăng tính kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh. Thảo dược đang ngày càng chứng minh được vai trò quan trọng của chúng trong y học như là một giải pháp an toàn sinh học, thay thế cho các thuốc hóa học tổng hợp. Các loại cao chiết của cây môn ngọt đều cho hiệu quả tương đương hoặc cao hơn so với thuốc kháng sinh ampicillin (ở nồng độ 5 µg/ml) đối với khả năng ức chế loài vi khuẩn E. coli [6]. Các loại cao của cây huyền diệp, tô mộc, đơn đỏ, mò hoa trắng, sài đất, mỏ quạ, bồ công anh, xuân hoa đều có khả năng ức chế vi khuẩn in vitro tốt đối với 2 loài vi khuẩn Staphylococcus spp. và Streptococcus spp., trong đó sài đất và mò hoa trắng có khả năng ức chế vi khuẩn tốt nhất [9]. Tnh dầu cây kinh giới ở Thừa Thiên Huế cũng cho hoạt tính kháng vi khuẩn S. aureus và E. coli [17]. 1.3.2 Tình hình bệnh nhiễm vi nấm và thuốc điều trị Theo nghiên cứu của Hà Tuấn Minh và Lê Hữu Doanh tại Bệnh viện Da liễu Trung ương thì nấm miệng chủ yếu là do nấm Candida, trong đó C. albicans là nguyên nhân chính. Nghiên cứu thực hiện trên 69 bệnh nhân bị nhiễm nấm miệng thì phân lập được 9 loại Candida gồm C. albicans (71 %), C. tropicalis (8,70 %), C. parpsilosis (5.80 %), C. krusei (4,35 %), C. lusitaniae (4,35 %), C. glabrata (2,90 %), C. guilliemondi (1,45 %), C. flumata (1,45 %), C. pelliculosa (1,45 %). Đánh giá hiệu quả của kháng sinh chống nấm nystatin là (100 %) và amphotericin B (100 %), econazole (63,27 %), miconazole (61,22 %), itraconazole (44,90 %), ketoconazole (38,78 %), fluconazole (24,49 %) chống lại C. albicans. Thuốc bị kháng nhiều nhất là fluconazole 8,16 %, tiếp theo là itraconazole 6,12 %, miconazole và ketoconazole cùng 4,08 %[16]. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hà và cộng sự đã phát hiện và xác định các chủng nấm gây nhiễm nấm máu tại Bệnh viện Bạch Mai. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ nhiễm nấm máu trên tổng số bệnh nhân cấy máu dương tính là 9,80 %. Các chủng nấm gây bệnh chủ yếu được phân lập từ Khoa ICU chiếm 22 % là Candida sp. đứng hàng thứ tư (7,90 %) trong tổng số chủng vi sinh vật gây bệnh và là tác nhân gây bệnh thường gặp nhất ở các bệnh nhân nhiễm trùng huyết do nhiều căn nguyên. 11
  23. Căn nguyên chính gây nhiễm nấm máu là Candida sp. (83,60 %), trong nhóm đó có các loài thường gặp là C. albicans (38,20 %) và C. tropicalis (36,10 %), ngoài ra còn gặp Talaromyces marneffei (6,00 %) và Pichia ohmeri (4,30 %) [8]. Các bệnh nhiễm nấm hiện nay được điều trị chủ yếu bằng các loại thuốc tân dược như nystatin, fluconazole, ketoconazole , nhưng các loại thuốc này cũng đang gặp phải tình trạng đề kháng. Vì vậy việc nghiên cứu các loại dược thảo có khả năng kháng nấm là rất cần thiết: Phân lập được chất hydroxychavicol từ lá cây trầu không kháng lại C. albicans với MIC = 0,512 mg/ml [7]. Các tinh dầu quế, sả chanh, húng quế, bạc hà đều cho tác dụng kháng S. cerevisiae và A. niger [15]. Tinh dầu cây kinh giới cũng được nghiên cứu và chứng minh có khả năng kháng được C. albicans [17]. 1.4 Tổng quan về vi khuẩn và vi nấm gây bệnh trên người 1.4.1 Escherichia coli Phân ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacterí Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Escherichia Loài: Escherichia coli [1, 18]. Hình 1.5 Escherichia coli Escherichia do Escherich phát hiện lần đầu tiên năm 1885. Giống này gồm nhiều loài, trong đó E. coli có vai trò quan trọng nhất. E. coli thuộc họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) là trực khuẩn Gram âm, hiếu kỵ khí tùy tiện. Kích thước trung bình từ 2 – 3 μm x 0,5 μm, trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E. coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động. E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ từ 5 – 40 oC. Trong điều kiện thích hợp E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút. Trong đường tiêu hóa E. coli chiếm khoảng 80 % các vi khuẩn hiếu khí. Nhưng E. coli cũng là vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm 12
  24. đường tiết niệu, viêm đường mật, đứng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết. E. coli có thể gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương [5]. 1.4.2 Pseudomonas aeruginosa Phân ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacterí Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Chi: Pseudomonas Hình 1.6 Pseudomonas aeruginosa Loài: Pseudomonas aeruginosa [1] P. aeruginosa còn gọi là trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn Gram âm, thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn, hai đầu tròn. Kích thước từ 0,5 – 1,0 μm x 1,5 – 5,0 μm. [5]. Chúng mọc ở biên độ nhiệt rộng (10 – 44 oC), nhưng tối ưu ở 35 oC. Trong môi trường đặc có thể gặp hai loại khuẩn lạc một loại to, nhẵn, bờ trải dẹt, giữa lồi lên và một loại khác thì xù xì [11]. Trực khuẩn mủ xanh là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện. Khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị mắc các bệnh ác tính hoặc mạn tính, dùng lâu dài corticoid, . thì dễ mắc bệnh nhiễm trùng nội sinh hoặc ngoại sinh do trực khuẩn mủ xanh. Trực khuẩn mủ xanh từ môi trường bên ngoài xâm nhập vào cơ thể qua các vết thương hở (nhất là vết bỏng). Tại chỗ xâm nhập, chúng gây viêm có mủ, nếu cơ thể suy giảm sức đề kháng, chúng có thể xâm nhập vào và gây viêm các phủ tạng hoặc gây bệnh toàn thân [5]. 1.4.3 Staphylococcus aureus Giới: Prokaryote Phân nghành: Firmicute Lớp: Firmibacteria Họ: Micrococceae Chi: Staphylococcus Loài: Staphylococcus aureus [1] Hình 1.7 Staphylococcus aureus 13
  25. S. aureus là một trong 3 loài có vai trò quan trọng trong y học S. epidermidis và S. saprophyticus. Giống Staphylococcus thuộc nhóm vi khuẩn tụ cầu, Gram dương thường sống ký sinh trên da lỗ mũi và đường hô hấp trên của người. S. aureus hay còn gọi là tụ cầu vàng có đường kính từ 0,8 – 1,0 μm và đứng thành hình chùm nho, bắt màu Gram dương, không có lông và nha bào, thường không có vỏ. Tụ cầu vàng gây bệnh cho người suy giảm đề kháng hoặc chúng có nhiều yếu tố độc lực. Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây nhiều loại bệnh khác nhau như: Nhiễm khuẩn ngoài da do tụ cầu vàng ký sinh ở da và niêm mạc mũi, nên nó có thể xâm nhập qua các lỗ chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp, nhiễm khuẩn bệnh viện do tụ cầu. 1.4.4 Candida albicans Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Phân ngành: Saccharomycotina Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae Chi: Candida Hình 1.8 Candida albicans Loài: Candida albicans Đặc tính sinh lý của C. albicans: C.albicans có thể phát triển tốt ở 20 – 38 oC, pH từ 2,5 – 7,5, hình dạng tế bào thay đổi từ đơn bào hình bầu dục sang dạng sợi, tế bào nhuộm Gram dương. Ở một số môi trường nuôi cấy khác nhau thì cấu tạo hình thể của C.albicans cũng có thay đổi. [28]. Bệnh do nấm Candida gây ra: Candida sống hoại sinh trên cơ thể người khi gặp điều kiện thuận lợi, nhất là cơ thể giảm sức đề kháng sẽ chuyển sang dạng gây bệnh do một số yếu tố sau: Yếu tố sinh lý, yếu tố bệnh lý, yếu tố nghề nghiệp. Candida có thể gây bệnh ở nhiều cơ quan trong cơ thể, cơ quan nông phổ biến là da và niêm mạc. Bệnh ở niêm mạc như đẹn, viêm thực quản, viêm ruột, viêm âm đạo - âm hộ, Bệnh 14
  26. trên da như viêm da, viêm móng và viêm quanh móng. Bệnh nội tạng như viêm nội mạc cơ tim, bệnh đường hô hấp, bệnh Candida lan tỏa. [28]. 1.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật 1.5.1 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật Để khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật có thể tiến hành hai phương pháp là phương pháp đĩa giấy khuếch tán và phương pháp khuếch tán qua giếng thạch. Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn phương pháp khuếch tán qua giếng thạch. 1.5.2 Xác định giá trị MIC Việc xác định MIC dựa vào phương pháp pha loãng trong môi trường rắn hoặc lỏng. Mẫu thử được pha loãng ½ liên tục trong môi trường, sau đó cho vào một lượng vi khuẩn xác định. Sau thời gian ấp, tìm nồng độ thấp nhất ức chế được sự tăng trưởng của vi khuẩn khi quan sát bằng mắt thường [4]. 1.5.3 Kỹ thuật hiện hình sinh học [24] Kỹ thuật hiện hình sinh học tiếp xúc: Các bản sắc ký sau khi khai triển bằng hệ dung môi thích hợp được đặt trên bề mặt thạch đã cấy vi sinh vật để chất thử khuếch tán. Các vết cho hoạt tính kháng vi sinh vật trên bản SKLM sẽ cho vùng ức chế vi sinh vật trên đĩa thạch. Kỹ thuật hiện hình sinh học ngâm: Bản SKLM sẽ đươc ngâm hoặc che phủ bằng môi trường thạch sau đó vi sinh vật thử nghiệm được cấy lên tấm sắc ký và đem đi ủ. Sau thời gian thích hợp, vi sinh vật sẽ phát triển trên mặt SKLM tại vị trí không có chất ức chế . 15
  27. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu Rễ cốt khí củ được thu mua tại đường Hải Thượng Lãn Ông, Quận 5, Tp. Hồ Chí Minh. Nguyên liệu được định danh dựa vào hình ảnh và tài liệu tham khảo để tránh nhầm lẫn. Mẫu nguyên liệu sau khi sơ chế được xay nhỏ đến dạng bột thô, bảo quản trong bao nylon kín. 2.1.2 Vi sinh vật thử nghiệm Vi sinh vật thử nghiệm do Bộ môn Vi sinh – Ký sinh, khoa Dược, Đại Học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh lưu trữ và cung cấp. Bảng 2.1 Các vi si sinh vật thử nghiệm Stt Tên vi sinh vật Mã số 1 Escherichia coli ATCC 25922 2 Meticilline - resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300 3 Meticilline - susceptible Staphylococcus aureus ATCC 29213 4 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 5 Candida albicans ATCC 10231 2.1.3 Môi trường nuôi cấy và thử hoạt tính kháng vi sinh vật Môi trường 1: Sabouraud Dextrose Agar (SDA) Peptone casein 10 g Glucose 20 g Agar 15 g Nước cất 1 lít 16
  28. Môi trường 2: Tryptic Soy Agar (TSA) Pepton 15 g Pepton đậu nành 5 g NaCl 5 g Agar 15 g Nước cất 1 lít Môi trường 3: Mueller hinton agar (MHA) Beet extract 2 g Acid Digest của Casein 17.5 g Tinh bột 1.5 g Agar Bios Special 17 g Nước cất 1 lít 2.1.4 Hóa chất, dung môi Bảng 2.2 Hóa chất, dung môi Stt Hóa chất Xuất xứ 1 Ethanol 50 % Trung Quốc 2 Ethanol 80 % Trung Quốc 3 Ethanol 96 % Trung Quốc 4 n - hexan Trung Quốc 5 Chloroform Trung Quốc 6 Methanol Trung Quốc 7 Ethyl acetat Trung Quốc 8 DMSO Cách pha dung môi Pha dung môi ethanol (TT): Xách định độ cồn cần pha loãng: Cho lượng cồn cần pha loãng vào ống đong 250 ml. Thả nhẹ nhàng cồn kế vào trong ống đong để yên 2 phút. Đọc và ghi các kết quả 17
  29. nhiệt độ trên nhiệt kế, độ cồn biểu kiến trên cồn kế. Độ cồn biểu kiến ≥ 56 %, tra bảng Gay – Lussac. b-c Tính lượng cồn cao độ cần dùng X = p x a-c x: Thể tích cồn cao độ cần lấy (ml) p: Thể tích cồn cần pha (ml) a > b > c: Độ cồn thực (%) Pha dung môi DMSO 10 % (TT): Dung môi DMSO 10 % (TT) được pha từ dung dịch DMSO 100 % (TT) với dung môi pha loãng là nước cất. Pha 5 ml DMSO 10 % (TT): Dùng micropipet hút 4,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm có nắp. Tiếp theo hút 0,5 ml DMSO 100 % (TT) cho vào ống nghiệm. Lắc ống nghiệm cho DMSO 100 % (TT) phân bố đều. 2.1.5 Dụng cụ, trang thiết bị Bảng 2.3 Trang thiết bị sử dụng Stt Thiết bị Model Nguồn gốc 1 Bếp cách thủy HH – S6 Trung Quốc 2 Đèn UV254, UV365 CM - 10 Mỹ 3 Cân phân tích Sartorius Đức 4 Tủ hood BS - 122 Việt Nam 5 Lò hấp tiệt trùng Hirayama Nhật 6 Tủ vô trùng Esco AVC – 4A1 Mỹ 7 Tủ ấm RI 28 -2 Mỹ 8 Máy vortex 3412EU Đức Các dụng cụ sử dụng: Bình lắng gạn, pipet, phễu, bình sắc ký, bản mỏng silicagel 60 F254, erlen, becher, ống nghiệm. 18
  30. 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát sơ bộ thực vật học rễ cốt khí củ 2.2.1.1 Khảo sát đặc điểm hình thái rễ: Mô tả đặc điểm thực vật học dựa trên quan sát mẫu dược liệu đã chọn. 2.2.1.2 Khảo sát cấu tạo vi học bột dược liệu: Nhận xét cảm quan và quan sát dưới kính hiển vi và so sánh với tài liệu. Chuẩn bị bột soi: Dược liệu được cắt nhỏ và sấy ở nhiệt độ khoảng 60 oC, tán nhỏ, dùng máy xay nghiền nát thành bột. Rây qua rây số 32 (rây mịn), phần còn lại trên rây được tán, xay lại và rây tiếp cho đến khi tất cả dược liệu thành bột mịn. Quan sát bột bằng cảm quan (nhận định màu sắc, mùi vị, ) trước khi soi kính hiển vi. Lên tiêu bản dược liệu: Cho một giọt nước vào giữa phiến kính. Dùng que sạch trộn đều bột, lấy một ít bột cho vào giữa giọt nước, dùng 1 góc của lá kính (lamelle) khuấy nhẹ để phân tán bột rồi đật lamelle lại. Dùng ngón tay trỏ di nhẹ trên lamelle để các phân tử của bột tách rời và phân tán đều, đồng thời loại bớt bọt khí. Loại bỏ phần bột và nước thừa phía ngoài lamelle bằng khăn giấy, lau sạch mặt lamelle và phiến kính trước khi soi kính hiển vi. 2.2.1.3 Định tính sơ bộ thành phần hóa học của bột dược liệu: Dùng phản ứng hóa học dựa theo phương pháp Ciuley để xác định nhóm hợp chất có trong dịch chiết [13]. 19
  31. Bốc hơi đến cắn, hòa trong nước acid. Phản ứng với thuốc thử chung alkaloid. Alkaloid Hiện tượng: Có tủa. Bốc hơi đến cắn. Cho tác dụng với kiềm, soi UV365. Coumarin Hiện tượng: Tăng cường độ phát quang. Làm phản ứng Cyanidin. Flavonoid Hiện tượng: Có màu đỏ. Phản ứng với dung dịch FeCl Dịch 3 và dung dịch gelatin muối. chiết cồn Hiện tượng: Xanh rêu/ xanh đen Tanin với FeCl3. Tủa bông với gelatin. Bốc hơi đến cắn. Hòa trong nước, lắc mạnh. Saponin Hiện tượng: Bọt bền trên 15 phút. Phản ứng với thuốc thử Fehling. Hợp chất khử Hiện tượng: Tủa đỏ gạch. Thêm một ít tinh thể Na2CO3. Acid hữu cơ Hiện tượng: Có bọt khí. Hình 2.1 Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn 20
  32. 2.2.2 Lựa chọn dung môi chiết xuất rễ cốt khí củ Khảo sát với 3 dung môi: Ethanol 50 % (TT), ethanol 80 % (TT) và ethanol 96 % (TT) và tiến hành chiết xuất theo quy trình sau: Làm ẩm 5 g bột dược liệu với 20 ml mỗi dung môi trong 30 phút. Bổ sung thêm 30 ml dung môi đã chọn và ngâm lạnh trong 24h. Lọc, dịch chiết được cô trên bếp cách thủy ở nhiệt độ 80 oC đến khi còn khoảng 20 ml. Dịch chiết trên được dùng để khảo sát hệ dung môi pha động và chọn độ cồn thích hợp cho chiết xuất. Mẫu thử: Dùng pipet khắc vạch 10 ml hút 5 ml dịch chiết của từng mẫu, cô cách o thủy ở 80 C tởi cắn bằng chén sứ. Hòa tan cắn với 2 ml CHCl3. Chấm khoảng 5 μl dịch chiết lên bản mỏng silica gel 60 F254 và triển khai bằng các hệ dung môi với tỉ lệ khác nhau. Sau khi khai triển, lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí hay sấy nhẹ cho bay hết dung môi. Sau đó, phát hiện bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm. Điều kiện sắc ký lớp mỏng:  Lượng mẫu chấm: 5 μl  Bản silica gel 60 F254  Pha động: Toluen – EtOAc (93:7), CHCl3 – EtOAc (11:1) và MeOH – EtOAc – H2O (13,5:100:10).  Khai triển 1 lần  Phát hiện bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm. 2.2.3 Khảo sát việc chiết tách cao toàn phần và tách phân đoạn với dung môi có độ phân cực khác nhau từ rễ cốt khí củ. 2.2.3.1 Chiết xuất cao toàn phần: Phương pháp ngâm lạnh Làm ẩm 1 kg bột dược liệu với 500 ml ethanol 80 % (TT) trong 30 phút. Thêm 4,5 lít ethanol 80 % (TT), tiếp tục ngâm lạnh trong 72h. Sau đó, lọc và thu dịch chiết, tiếp tục chiết lạnh bã dược liệu còn lại với 5 lít ethanol 80 % (TT) trong 72h. Gộp các dịch chiết và cô thu hồi dung môi, thu được cao toàn phần. 2.2.3.2 Chiết xuất cao phân đoạn Từ cao toàn phần, lắc với: n – hexan, chloroform, ethyl acetat để phân tách thành 21
  33. các phân đoạn có độ phân cực khác nhau. Cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao phân đoạn. Bột dược liệu Ethanol 80 % (TT) x 2 lần Cao toàn phần Lắc với n – hexan Dịch nước Cao n – hexan Lắc với chloroform Dịch nước Cao chloroform Lắc với ethyl acetat Dịch nước Cao ethyl acetat Cao nước Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn 22
  34. 2.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của rễ cốt khí củ 2.2.4.1 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Nguyên tắc phương pháp: Bơm dung dịch thử vào các giếng đã được đục lỗ. Nếu chất thử có sự ức chế vi khuẩn sẽ cho vòng ức chế xung quanh đĩa. Dựa vào đường kính đo vùng ức chế có thể đánh được khả năng kháng khuẩn của mẫu thử. Chuẩn bị môi trường thử nghiệm: Môi trường sau khi được pha và hấp khử trùng, cho vào mỗi đĩa petri có đáy phẳng và đặt lên mặt phẳng để thạch có bề dày đồng nhất, khoảng 4 mm. Thể tích môi trường khoảng 20 – 25 ml/đĩa (đĩa có đường kính 90 mm). Để nguội ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Chuẩn bị vi sinh vật: - Vi khuẩn: Sau khi cấy hoạt hóa trên đĩa thạch TSA, ủ ở 37 °C trong 24 giờ, vi khuẩn được pha trong dung dịch nước muối sinh lý 0,85 % và phân tán đều bằng máy vortex. Huyền dịch vi khuẩn được điều chỉnh về giá trị OD 0,08 – 0,12 tại bước sóng 625 nm hoặc được pha loãng với canh thang sao cho nồng độ đục bằng thang McFarland 0,5. Giá trị này tương đương với khoảng 1 – 2 x 108 CFU/ml. - Nấm men được hoạt hóa trong môi trường SDA (Candida albicans) trong vòng 48 giờ ở nhiệt độ 37 ℃. Sau đó phân tán trong dung dịch nước muối sinh lý 0,85 % và phân tán đều bằng máy vortex. Huyền dịch vi nấm được điều chỉnh về giá trị OD 0,08 – 0,12 tại bước sóng 530 nm hoặc được pha loãng với canh thang sao cho nồng độ đục bằng thang McFarland 0,5. Giá trị này tương đương với khoảng 1 – 5 x 106 CFU/ml. Vi khuẩn, vi nấm sau khi được pha chế phải được sử dụng trong vòng 30 phút. Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác 100 mg cao toàn phần và cao phân đoạn hòa tan vào trong 1 ml DMSO 10 % (TT). Tiến hành khảo sát: Huyền dịch vi khuẩn được trải đều trên mặt thạch bằng que bông vô trùng. Lặp lại 3 lần, mỗi lần xoay hộp 60°. Lần cuối cùng xoay tròn que bông xung quanh thành đĩa để vi khuẩn được trải đều. Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch bằng ống thép không rỉ. Cho vào mỗi lỗ 100 μl dung dịch chất kháng khuẩn. 23
  35. Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp môi trường. Ủ đĩa thạch trong tủ ấm ở 37 °C. Đọc kết quả sau 16 – 18 giờ đối với vi khuẩn và 20 – 24 giờ đối với vi nấm. Chất thử có tác động kháng khuẩn sẽ cho vòng ức chế xung quanh lỗ. Đo và ghi nhận đường kính vòng ức chế bằng thước kẹp có độ chia nhỏ nhất bằng 0,01 mm. Khả năng kháng mạnh hay yếu được đánh giá sơ bộ bằng giá trị đường kính vòng ức chế theo bảng 2.4. Bảng 2.4 Bảng đối chiếu đường kính vòng kháng vi sinh vật [29] Đường kính vòng kháng vi sinh vật Mức độ kháng vi sinh vật (mm) ≥ 15 Mạnh 10 - 14 Vừa < 9 Yếu 0 Không kháng 2.2.4.2 Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật MIC Những mẫu cao có tác động ức chế sẽ được thử nghiệm tìm MIC bằng phương pháp pha loãng trong môi trường rắn. MIC là nồng độ tối thiểu ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn quan sát được bằng mắt thường. Nguyên tắc: Việc xác định MIC dựa vào phương pháp pha loãng trong môi trường rắn. Mẫu thử được pha loãng ½ liên tục trong môi trường thích hợp, sau đó cho vào một lượng vi khuẩn xác định. Sau thời gian ấp, tìm nồng độ thấp nhất ức chế được sự tăng trưởng của vi khuẩn khi quan sát bằng mắt thường [4]. Phương pháp: Pha loãng trong môi trường rắn. Chuẩn bị dung dịch: Hòa tan chính xác lượng cao toàn phần và các cao phân đoạn trong DMSO 10 % (TT) thành dung dịch mẹ. Từ dung dịch mẹ, pha loãng với môi trường MHA thành dãy có 10 nồng độ chất thử giảm dần với độ pha loãng là 2. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm theo mô tả ở mục 2.2.4.1. Khi sử dụng pha loãng tiếp với dung môi DMSO 10 % (TT) 10 lần để có mật độ khoảng 107 CFU/ ml. 24
  36. Tiến hành khảo sát: Chấm 1 µl dịch vi khuẩn lên đĩa để đạt được mật độ vi khuẩn trên đĩa thạch là 104 CFU/ml. Ủ ở nhiệt độ 35 – 37 °C. Đọc kết qua sau 16 – 18 giờ. Tìm đĩa có nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tạo khóm, nồng độ của đĩa thạch này là MIC của chất thử đối với vi khuẩn thử nghiệm. Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp hơn, mẫu cấy có thể bị nhiễm và thử nghiệm phải được thực hiện lại. Đọc kết quả: Nồng độ MIC là nồng độ thấp nhất tại đó ức chế vi sinh vật mọc lên đĩa thạch. Lặp lại 3 lần. 2.2.4.3 Kỹ thuật hiện hình sinh học Trong nghiên cứu sử dụng kỹ thuật hiện hình sinh học tiếp xúc. Nguyên tắc: Dựa vào phương pháp khuếch tán trên thạch. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm theo mô tả ở mục 2.2.4.1. Tiến hành SKLM mẫu cao phân đoạn n – hexan, chloroform, ethyl acetat: Chấm 2 điểm mẫu cao n – hexan, chloroform, ethyl acetat và triển khai song song trên cùng một bản mỏng trong cùng điều kiện. Sau khi triển khai 1 điểm chấm được dùng để phát hiện bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm, xác định số vết và giá trị Rf. Điểm chấm còn lại được dùng để phát hiện vết cho hoạt tính kháng vi sinh vật bằng kỹ thuật hiện hình sinh học tiếp xúc. Bản mỏng sau khi triển khai, đuổi hết dung môi để nguyên hoặc cắt ra thành từng mảnh và đặt trên bề mặt thạch đã có trải vi khuẩn thử nghiệm. Để 12 giờ ở nhiệt độ thấp, sau đó ủ ở điều kiện thích hợp. Các vết cho hoạt tính sẽ cho vòng ức chế vi khuẩn trên bề mặt. 25
  37. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả 3.1.1 Khảo sát thực vật học rễ cây cốt khí củ 3.1.1.1 Mô tả hình thái Rễ cốt khí củ hình trụ cong queo, vỏ sần sùi, nhăn nheo, màu nâu xám, có các đốt lồi lên chia củ thành từng gióng. Những rễ củ to được cắt thành lát mỏng 1 – 2 cm, phơi khô. Mặt cắt ngang thấy phần vỏ mỏng, phần gỗ dày. Thể chất rắn, có mùi nhẹ, vị hơi se đắng. Hình 3.1 Rễ cốt khí củ 3.1.1.2 Đặc điểm bột dược liệu Bột rễ cây cốt khí củ có màu vàng sẫm, mùi thơm, vị hơi đắng. Các cấu tử được tìm thấy trong bột rễ cây cốt khí củ: Mảnh mạch vạch, mạch mạng, mảnh bần, hạt tinh bột và sợi mô cứng. A B 26
  38. C D E F Hình 3.2 Soi bột rễ cốt khí củ Ghi chú: (A): Mẫu bột cốt khí củ (D): Sợi mô cứng (B): Mảnh mạch vạch (E): Hạt tinh bột (C): Mảnh mạch mạng (F): Mảnh bần 3.1.1.3 Định tính sơ bộ thành phần hóa học của bột dược liệu Xách định sơ bộ thành phần hóa học của rễ cốt khí củ ta thu được kết quả cho thấy rễ cốt khí củ có chứa các nhóm chất: Anthranoid, flavonoid, coumarin và tanin. Bảng 3.1 Kết quả khảo sát thành phần hóa học rễ cốt khí củ STT Thành phần Nhận biết Kết luận 1 Alkaloid Thuốc thử chung alkaloid - 2 Anthranoid Phản ứng màu hơ amoniac + 3 Coumarin Phát huỳnh quang + 4 Flavonoid Phản ứng cyanidin + 5 Tanin FeCl3 5%, gelatin muối + 6 Saponin Phản ứng tạo bọt bền trong môi trường nước - 27
  39. 7 Chất khử Thuốc thử Fehling - 8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 có sủi bọt - Ghi chú: (-) không có (+) có A B C Hình 3.3 Phản ứng hóa học định tính alkaloid, coumarin và tanin Ghi chú: (A): Alkaloid với các thuốc thử dragendorff, mayer, bertran, bouchardat (B): Coumarin (C): Tanin với thuốc thử gelatin muối và FeCl3 5 % B A C C D E Hình 3.4 Phản ứng hóa học định tính anthranoid, saponin, chất khử và acid hữu cơ Ghi chú: (A): Anthranoid quan sát mắt thường (B): Anthranoid quan sát sau hơ amoniac 28
  40. (C): Saponin tạo bọt không bền (D): Phản ứng định tính chất khử (E): Phản ứng định tính acid hữu cơ 3.1.2. Lựa chọn dung môi chiết xuất Tiến hành chiết xuất theo quy trình ở mục 2.2.2, dịch chiết thu được dùng để khảo sát lựa chọn dung môi chiết xuất. Kết quả sắc ký các hệ dung môi được thể hiện ở hình 3.3, 3.4 và 3.5. Kết quả khảo sát sắc ký lớp mỏng các dịch chiết từ ethanol 50 % (TT), ethanol 80 % (TT) và ethanol 96 % (TT), nhận thấy rằng: Với hệ dung môi CHCl3 – EtOAc (11:1) thì sắc ký đồ của dịch chiết từ ethanol 80 % (TT) cho 2 vết tách rõ ràng và đậm màu hơn so với dịch chiết từ ethanol 50 % (TT) và ethanol 96 % (TT), nên ethanol 80 % (TT) được chọn làm dung môi chiết xuất cao toàn phần để khảo sát hoạt tính sinh học. Ghi chú: (1): Ethanol 96 % (TT) (2): Ethanol 80 % (TT) (3): Ethanol 50 % (TT) (A): Quan sát bằng mắt thường (B): Quan sát dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm (C): Quan sát dưới đèn UV ở bước sóng 365 nm A B C (1) (2) (3) (1) (2) (3) (1) (2) (3) Hình 3.5 Sắc ký đồ hệ dung môi Toluen - EtOAc (93:7) 29
  41. A B C (1) (2) (3) (1) (2) (3) (1) (2) (3) Hình 3.6 Sắc ký đồ hệ dung môi CHCl3 - EtOAc (11:1) A B C (1) (2) (3) (1) (2) (3) (1) (2) (3) Hình 3.7 Sắc ký đồ hệ dung môi MeOH - EtOAc - H2O (13,5:100:10) 30
  42. 3.1.3 Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn 3.1.3.1 Chiết xuất cao toàn phần Từ 1 kg bột rễ cốt khí củ chiết bằng phương pháp ngâm lạnh với ethanol 80 % (TT), lọc và cô trên bếp cách thủy thu được 127,69 g cao toàn phần, hiệu suất quá trình chiết 12,77 %. 3.1.3.2 Chiết xuất cao phân đoạn Xử lý sơ bộ cao toàn phần theo quy trình sau: Cân 20 g cao toàn phần, hòa tan với 100 ml nước cất, tiến hành lắc phân bố với dung môi n – hexan sẽ tách ra làm hai phần là dịch n – hexan (màu vàng) và dịch nước (1). Phân đoạn n – hexan được cô quay dưới áp suất giảm thu được cao phân đoạn 1 (0,75 g). Dịch nước (1) tiếp tục lắc phân bố với chloroform thu được dịch chloroform (màu vàng) và phần dịch nước (2), phân đoạn chloroform được cô quay dưới áp suất giảm thu được cao phân đoạn 2 (0,99 g). Dịch nước (2) được lắc với ethyl acetat thu được dịch ethyl acetat (màu cam) và dịch nước (3), phân đoạn ethyl acetat được cô quay dưới áp suất giảm thu được cao phân đoạn 3 (3,56 g). Dịch nước (3) được cô trên bếp cách thủy thu được cao nước (5,06 g). Khối lượng cao phân đoạn được trình bày ở bảng 3.2 Bảng 3.2 Khối lượng cao toàn phần và cao phân đoạn Cao toàn Ethyl Phân đoạn n-hexan Chloroform Cao nước phần acetat Khối lượng (g) 20,00 0,75 0,99 3,56 5,06 Hiệu suất (%) 3,75 4,95 17,80 10,12 3.1.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật 3.1.4.1 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch Trộn đều lần lượt 100 mg cao toàn phần và cao phân đoạn trong 1 ml DMSO 10 % (TT) để được các dung dịch thử có nồng độ 100 mg/ml. Cho vào mỗi giếng 100 μl dung dịch chất kháng khuẩn, xác định hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch . Cao toàn phần và cao phân đoạn được khảo sát tác động kháng vi sinh vật trên 4 31
  43. vi khuẩn và 1 vi nấm bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch. Kết quả cho thấy, cao toàn phần và các cao phân đoạn n – hexan, chloroform cho tín hiệu kháng khuẩn mạnh trên 2 chủng vi khuẩn MSSA, MRSA và nấm mem C. albicans. Trong đó phân đoạn n – hexan cho tín hiệu kháng tốt trên chủng MSSA (22,93 mm) và C. albicans (27,32 mm), phân đoạn chloroform lại tốt trên chủng MRSA (18,93 mm). Cao ethyl acetat cho khả năng kháng khuẩn mạnh trên 2 chủng vi khuẩn MSSA (19,75 mm) và MRSA (19,28 mm), nhưng lại có vòng kháng khuẩn vừa đối với C. albicans (13,41 mm). Cao nước cho vòng kháng khuẩn với mức độ kháng vừa với MSSA (14,95 mm) và mạnh với MRSA (15,62 mm). Cao toàn phần và các cao phân đoạn đều không cho khả năng kháng khuẩn đối với 2 chủng vi khuẩn Gram âm Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa. Chứng âm là DMSO 10 % (TT) không cho vòng kháng khuẩn. Ghi chú: (1) Cao toàn phần (4) Cao ethyl acetat (2) Cao n – hexan (5) Cao nước (3) Cao chloroform (6) Chứng âm DMSO 10 % (TT) 1 2 1 5 6 2 3 6 5 4 3 4 Hình 3.8 Kết quả vòng kháng khuẩn MSSA 32
  44. 5 2 4 3 6 6 1 1 4 3 5 2 Hình 3.9 Kết quả vòng kháng khuẩn MRSA 1 1 2 5 5 2 6 6 3 4 4 3 Hình 3.10 Kết quả vòng kháng khuẩn C. albicans 33
  45. Bảng 3.3 Đường kính vòng ức chế vi sinh vật của cao toàn phần và cao phân đoạn (mm) Vi khuẩn Vi nấm Cao MSSA MRSA Ec Pa Ca TP 19,86 17,31 - - 16,98 n-hex 22,93 18,92 - - 27,32 CHCl3 18,45 18,93 - - 17,27 EtOAc 19,75 19,28 - - 13,41 CN 14,95 15,62 - - - Chứng âm - - - - - Ghi chú: Ec: Escherichia coli (TP): Cao toàn phần Pa: Pseudomonas aeruginosa (n – hex): Cao phân đoạn n – hexan Ca: Candida albicans (CHCl3): Cao phân đoạn chloroform (-): Không xác định được (CN): Cao nước 3.1.4.2 Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật Để đánh giá chính xác về hoạt tính kháng vi sinh vật của cao toàn phần và các cao phân đoạn rễ cốt khí củ, chúng tôi tiến hành xác định giá trị MIC trên chủng vi khuẩn MSSA và MRSA. Từ kết quả ở bảng 3.4, cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu của cao n – hexan và cao chloroform ở chủng vi khuẩn MSSA, MRSA bằng nhau và bằng 0,45 mg/ml. Khả năng kháng vi khuẩn MSSA, MRSA của cao ethyl acetat vơi MIC bằng 0,91 mg/ml là thấp hơn so với cao n – hexan và cao chloroform. Cao toàn phần có MIC bằng 1,14 mg/ml và cao nước có MIC bằng 4,55 mg/ml. 34
  46. Bảng 3.4 Kết quả MIC của cao toàn phần và các cao phân đoạn trên vi khuẩn MSSA và MRSA (mg/ml) Vi khuẩn Cao MSSA MRSA TP 1,14 1,14 n-hex 0,45 0,45 CHCl3 0,45 0,45 EtOAc 0,91 0,91 CN 4,55 4,55 Ghi chú: (TP): Cao toàn phần (CHCl3): Cao phân đoạn chloroform (n – hex): Cao phân đoạn n – hexan (CN): Cao nước 3.1.4.3 Xác định chất có hoạt tính kháng vi sinh vật bằng kỹ thuật tự sinh đồ Cao phân đoạn n – hexan, chloroform và ethyl acetat được hòa tan trong dung môi chloroform, đưa lên bản mỏng silicagel 60 F254, khai triển bằng hệ dung môi CHCl3 - EtOAc (11:1), sau đó phát hiện bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm. Bằng kỹ thuật hiện hình sinh học trên đối tượng MSSA, chúng tôi đã phát hiện được vết có hoạt tính kháng vi sinh vật, được thể hiện trong hình 3.11, 3.12 và 3.13. Khi phát hiện các vết trên bản sắc ký đồ bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm, có tất cả 4 vết được đánh số từ 1 đến 4 như hình 3.14. Giá trị Rf của các vết được trình bày ở bảng 3.5 Với phân đoạn n – hexan: Kết quả tự sinh đồ cho thấy vết số 4 (Rf = 0,80) cho vòng kháng khuẩn. Với phân đoạn ethyl acetat: Kết quả tự sinh đồ cho thấy vết số 4 (Rf = 0,80) cho vòng kháng khuẩn. Dựa trên kết quả tự sinh đồ của cao phân đoạn n – hexan, cao chloroform và cao ethyl acetat, chỉ có cao phân đoạn n – hexan và cao ethyl acetat cho vết kháng MSSA. Khi so với sắc ký đồ cả 3 cao đều cho 2 vết số 1 (Rf = 0,28) và vết số 3 (Rf = 0,78). 35
  47. Riêng chỉ cao phân đoạn n – hexan và cao ethyl acetat, có cùng vết số 4 (Rf = 0,80). Kết luận vết số 4 (Rf = 0,80) trên sắc ký đồ cho hoạt tính kháng vi khuẩn MSSA. 4 3 2 1 Hình 3.11 Kết quả tự sinh đồ cao phân đoạn n - hexan 3 1 Hình 3.12 Kết quả tự sinh đồ cao phân đoạn chloroform 36
  48. 4 3 1 Hình 3.13 Kết quả tự sinh đồ cao phân đoạn ethyl acetat 4 3 2 1 TP n-hex CHCl3 Et CN Hình 3.14 Sắc ký lớp mỏng cao toàn phần, n - hexan, chloroform, ethyl acetat và cao nước. Bảng 3.5 Bảng kết quả giá trị Rf Cao Vết số Rf TP n-hex CHCl3 EtOAc CN 1 0,28 x x x x 2 0,65 x x 3 0,78 x x x x 4 0,80 x x 37
  49. Ghi chú : (x) cho vết trên bản mỏng (TP): Cao toàn phần (n – hex): Cao phân đoạn n – hexan (CHCl3): Cao phân đoạn chloroform (CN): Cao nước 3.2 Bàn luận Dịch chiết cao ethanol 80 % (TT) khi tiến hành so sánh kết quả thử vi sinh vật với các tài liệu tham khảo, chúng tôi nhận thấy cao toàn phần có đường kính vòng kháng khuẩn chủng MSSA (19,86 mm) nhỏ hơn so với kết quả nghiên cứu dịch chiết cao methanol (TT) của Bin Shan và cộng sự (20,2 mm) [32] và dịch chiết ethanol 96 % (TT) của Pai We Soo có đường kính vòng kháng chủng MSSA ( 20 – 21 mm) [35]. Cao phân đoạn n – hexan (22,93 mm) lớn hơn kết quả của Pai We Soo (17 – 20 mm), cao phân đoạn chloroform (18,45 mm) nhỏ hơn so với Pai We Soo (17 – 20 mm). Đối với cao phân đoạn ethyl acetat (19,75 mm) cũng nhỏ hơn so với kết quả của Pai We Soo (23 – 26 mm). Phân đoạn cao nước của chúng tôi (14,95 mm) cao hơn của Pai We Soo (12 – 14 mm). Các chủng vi khuẩn gram âm E. coli và P. aeruginosa trên dịch chiết cao ethanol 80 % (TT) đều cho kết quả âm tính, về kết quả của Bin Shan E. coli ( 6,40 mm) và Pai We Soo trên chủng P. aeruginosa ( 11,50 mm). Dịch chiết cao toàn phần ethanol 80 % (TT) cho giá trị MIC là 1,14 mg/ml lớn hơn so với dịch chiết cao methanol (TT) của Bin Shan (MIC = 0,31 mg/ml) [32] và dịch chiết cao ethanol 96 % (TT) của Pai We Soo (MIC = 0,38 mg/ml). Dựa trên kết quả đường kính vòng kháng khuẩn cho thấy cao n – hexan có khả năng kháng khuẩn tốt trên vi khuẩn MSSA (22,93 mm) và nấm mem C. albicans (27,32 mm), cao n – hexan cho giá trị MIC thấp nhất đối với MSSA (0,45 mg/ml). Vì vậy, chúng tôi cho rằng cao phân đoạn n – hexan có tiềm năng cho việc phân lập chất tinh khiết cho hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm từ rễ cây cốt khí củ. Kết quả tự sinh đồ của cao n – hexan, cao chloroform và cao ethyl acetat cho thấy khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của rễ cây cốt khí củ không phải do một chất 38
  50. cụ thể quyết định tác dụng sinh học mà do nhiều nhóm chất cùng hỗ trợ. Trong đó, cao phân đoạn n – hexan cho khả năng kháng vi sinh vật tốt vì thế chúng tôi nhận định các nhóm chất kém phân cực dạng aglycon trong rễ cây cốt khí củ bao gồm: anthranoid, stilbenoids, flavonoid, coumarin cùng bổ trợ lẫn nhau tạo ra khả năng ức chế các vi khuẩn MSSA, MRSA và vi nấm C. albicans. 39
  51. CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau 2 tháng thực hiện, đề tài đã hoàn thành các mục tiêu đưa ra và thu được các kết quả như sau: 1. Định tính sơ bộ dược liệu rễ cây cốt khí củ:  Soi bột và tìm được các cấu tử chính của bột rễ cốt khí củ theo DĐVN V.  Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học cho thấy trong rễ cây cốt khỉ củ có các thành phần: Anthranoid, flavonoid, coumarin và tanin. 2. Khảo sát để chọn dung môi chiết xuất: Kết quả đã chọn được ethanol 80 % (TT) để chiết xuất cao toàn phần và 3 dung môi (n – hexan, chloroform, ethyl acetat) để tách các phân đoạn và cao phân đoạn đơn giản. 3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của cao toàn phần và các cao phân đoạn n – hexan, chloroform, ethyl acetat và cao nước của rễ cốt khí củ. Kết quả cho thấy cao phân đoạn n – hexan cho hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất trên chủng vi khuẩn MSSA và nấm men C. albicans. Cao phân đoạn ethyl acetat cho hoạt tính kháng khuẩn tốt trên chủng vi khuẩn MRSA. 4. Xác định nồng độ tối thiếu ức chế vi sinh vật: Kết quả giá trị MIC của cao toàn phần và các cao phân đoạn n – hexan, chloroform, ethyl acetat, cao nước đối với chủng vi khuẩn MSSA và MRSA là: 1,14 mg/ml, 0,45 mg/ml, 0,45 mg/ml, 0,91 mg/ml và 4,55 mg/ml. Cao n – hexan cho nồng độ kháng tốt (MIC = 0,45 mg/ml). 5. Từ kết quả tự sinh đồ để xách định chất kháng vi sinh vật. Kết quả phát hiện vết số 4 trên sắc ký đồ cho hoạt tính kháng chủng MSSA. 4.2 Kiến nghị Kết quả nghiên cứu được từ đề tài là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo của dược liệu này: 1. Mở rộng vùng dược liệu để đánh giá chính xác khả năng kháng vi sinh vật của rễ cốt khí củ. 2. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao toàn phần của rễ cốt khí củ. 3. Phân lập và xác định cấu trúc của chất cho hoạt tính kháng vi sinh vật của rễ cốt khí củ. 4. Chiết tách và tinh khiết hóa các chất hóa học đạt tiêu chuẩn làm chất đối chiếu. 40
  52. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Thanh Bảo (2008), Vi khuẩn học, Đại học Y Dược Tp.HCM. 2. Đỗ Huy Bích, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1, NXB Khoa Học Kỹ Thuật tr. 529-531. 3. Bộ Y tế - Việt Nam phối hợp với Dự án Hợp tác toàn cầu về kháng kháng sinh GARP Việt Nam và Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng ĐH Oxford (2008-2009), "Báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện ". 4. Bộ môn Vi sinh - Ký sinh trường Đại học Nguyễn Tất Thành (2015), Gíao Trình Thực Hành Vi Sinh Học, MIC, tr. 28 - 29. 5. GS.TS Lê Huy Chính (2007), Vi Sinh Vật Y Học, NXB Y Học, Hà Nội, tr. 133 - 141, 165 - 175, 218 - 221, 142 - 147. 6. Nguyễn Đức Độ, Võ Ngọc Thanh, Nguyễn Văn Băn, Phan Thanh Khiêm, Nguyễn Thị Tâm, Huỳnh Ngọc Thanh Tâm (2017), "Khảo sát đặc tính sinh hóa và khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ cây môn ngọt (colocasia esculenta)", tạp chí khoa học & công nghệ nông nghiệp", Tập 1(2), tr. 265 - 274. 7. Nguyễn Thu Gương, Nguyễn Vũ Giang Bắc, Lê Thị Lệ Uyên, Nguyễn Đinh Nga (2014), "Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất kháng nấm có trong cao chiết từ lá trầu không", Y Học TP. Hồ Chí Minh, Tập 18, tr. 235 - 239. 8. Nguyễn Nhị Hà, Phạm Hồng Nhung (2017), "Tình hình nhiễm nấm máu tại bệnh viện Bạch Mai từ tháng 1/2016 đến tháng 10/2016", Tạp chí nghiên cứu y học. 9. Nguyễn Thị Thanh Hà, Nguyễn Thanh Hải, Nguyễn Nam Phương, Nguyễn Văn Thanh (2017), "Tác dụng diệt khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết thảo dược trên vi khuẩn Staphylococcus spp. và Streptococcus spp. phân lập từ dịch viêm tử cung bò", Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, tr. 876 - 884.
  53. 10. Trần Thanh Hà (2014), "Nghiên cứu thành phần hóa học rễ cây cốt khí củ (Reynoutria japonica Houtt.) ", tr. 4-5. 11. Phạm Thị Nguyệt Hằng (2014),"Phân lập và khảo sát hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của vi sinh vật nội sinh trong cây Muồng Trâu (Cassia alata L.)". 12. Vũ Ngọc Hiếu, Phạm Hồng Nhung (2017), "Mức độ kháng kháng sinh của một số vi khuẩn thường gặp gây nhiễm trùng da và mô mềm ở bệnh nhân đái tháo đường phân lập tại bệnh viện Bạch Mai ". 13. PGS. TS. Trần Hùng (2016), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đh Y Dược Tp. Hồ Chí Minh, tr. 29 - 31. 14. Nguyễn Trần Giáng Hương (2003), "Nghiên cứu độc tính cấp và một số tác dụng dược lý của cốt khí củ", Tạp chí y học thực hành, tr. 35-38. 15. Liêu Thùy Linh, Ngô Nguyễn Nhật Hà, Phan Thị Kim Liên, Trần Thị Minh Hà, Nguyễn Thúy Hương, Liêu Mỹ Đông (2017), "Khảo Sát Ảnh Hưởng Của Tinh Dầu Quế, Sả Chanh, Húng Quế, Bạc Hà Và Tác Dụng Kết Hợp Của Chúng Tới Saccharomyces cerevisiae và Aspergillus niger", Tạp chí Khoa học và Giáo dục, Trường Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm Tp. Hồ Chí Minh, tr. 134 - 127. 16. Hà Tuấn Minh, Lê Hữu Doanh (2016), "Mức độ nhạy cảm với kháng sinh chống nấm của một số chủng Candida gây bệnh ở miệng", Tạp chí nghiên cứu y học, tr. 40-46. 17. Đặng Thị Thanh Nhàn,Lê Thị Huyền (2017), "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của tinh dầu cây kinh giới (Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland.,)", Tạp chí Khoa học và Giáo dục, Trường Đại học Sư phạm Huế, tr. 85 - 91. 18. Lê Văn Phủng (2012), Vi khuẩn y học, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam. 19. Respiratory Society Ho Chi Minh City, Hôị Lao và Bệnh Phổi Việt Nam, Hội Hô Hấp Việt Nam, Bệnh Viện Chợ Rẫy (2017), "Hội nghị đề kháng kháng sinh trong viêm phổi cộng đồng và viêm phổi bệnh viện lần thứ 4", tr. 19, 23, 27, 64 - 66.
  54. 20. Ngô Thu Vân,Trần Hùng (2011), Dược liệu học, tập 1, NXB Y HỌC, tr. 339- 340. 21. Mai Thị Yến,Võ Văn Lẹo (2011), Khảo sát thành phần hóa học của cốt khí củ (Polygonum cuspidatum Sieb. Et Zucc.), Tập 15. Tài liệu tiếng nước ngoài 22. Debby Bogaert, NT Ha, Marcel Sluijter, N Lemmens, Ronald de Groot,PWM Hermans (2002), "Molecular epidemiology of pneumococcal carriage among children with upper respiratory tract infections in Hanoi, Vietnam", Journal of clinical microbiology, 40(11), pp. 3903-3908. 23. Jung-San Chang, Hong-Wen Liu, Kuo-Chih Wang, Mei-Chun Chen, Lien- Chai Chiang, Yi-Cheng Hua,Chun-Ching Lin (2005), "Ethanol extract of Polygonum cuspidatum inhibits hepatitis B virus in a stable HBV-producing cell line", Antiviral research, 66(1), pp. 29-34. 24. Irena M Choma, Edyta M Grzelak (2011), "Bioautography detection in thin- layer chromatography", Journal of Chromatography A, 1218(19), pp. 2684- 2691. 25. Chin-Yuan Hsu, Yu-Pei Chan,Jeli Chang (2007), "Antioxidant activity of extract from Polygonum cuspidatum", Biological research, 40(1), pp. 13-21. 26. Hong-Wei Lin, Ming-Xue Sun, Yun-Hua Wang, Liu-Meng Yang, Ying-Ruo Yang, Ning Huang, Li-Jiang Xuan, Ya-Ming Xu, Dong-Lu Bai,Yong-Tang Zheng (2010), "Anti-HIV activities of the compounds isolated from Polygonum cuspidatum and Polygonum multiflorum", Planta medica, 76(09), pp. 889-892. 27. Yun-Wei Lin, Fu-Jung Yang, Chia-Ling Chen, Wei-Ting Lee, Ruey-Shyang Chen (2010), "Free radical scavenging activity and antiproliferative potential of Polygonum cuspidatum root extracts", Journal of natural medicines, 64(2), pp. 146-152. 28. Dinesh K Maheshwari (2010), Plant growth and health promoting bacteria, Springer Science & Business Media, pp. 445.
  55. 29. DN Muanza, BW Kim, KL Euler,L Williams (1994), "Antibacterial and antifungal activities of nine medicinal plants from Zaire", International Journal of Pharmacognosy, 32(4), pp. 337-345. 30. Chang Eun Park, Min-Jung Kim, Jong Hwa Lee, Byung-Il Min, Hyunsu Bae, Wonchae Choe, Sung-Soo Kim,Joohun Ha (2007), "Resveratrol stimulates glucose transport in C2C12 myotubes by activating AMP-activated protein kinase", Experimental & molecular medicine, 39(2), pp. 222. 31. Wei Peng, Rongxin Qin, Xiaoli Li, Hong Zhou (2013), "Botany, phytochemistry, pharmacology, and potential application of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.: a review", Journal of ethnopharmacology, 148(3), pp. 729-745. 32. Bin Shan, Yi-Zhong Cai, John D. Brooks, Harold Corke (2008), "Antibacterial properties of Polygonum cuspidatum roots and their major bioactive constituents", Food Chemistry, 109(3), pp. 530-537. 33. J. H. Song, T. C. Yang, K. W. Chang, S. K. Han, H. K. Yi,J. G. Jeon (2007), "In vitro effects of a fraction separated from Polygonum cuspidatum root on the viability, in suspension and biofilms, and biofilm formation of mutans streptococci", J Ethnopharmacol, 112(3), pp. 419-25. 34. Jae-Hoon Song, Sook-In Jung, Kwan Soo Ko, Na Young Kim, Jun Seong Son, Hyun-Ha Chang, Hyun Kyun Ki, Won Sup Oh, Ji Yoeun Suh, Kyong Ran Peck (2004), "High prevalence of antimicrobial resistance among clinical Streptococcus pneumoniae isolates in Asia (an ANSORP study)", Antimicrobial agents and chemotherapy, 48(6), pp. 2101-2107. 35. Pai-Wei Su, Cheng-Hong Yang, Jyh-Ferng Yang, Pei-Yu Su, Li-Yeh Chuang (2015), "Antibacterial Activities and Antibacterial Mechanism of Polygonum cuspidatum Extracts against Nosocomial Drug-Resistant Pathogens", Molecules, 20(6), pp. 11119-11130. 36. Ying Xu, Zhichao Wang, Wenting You, Xiuhua Zhang, Shan Li, Philip A Barish, Matthew M Vernon, Xia Du, Gaowen Li, Jianchun Pan (2010),
  56. "Antidepressant-like effect of trans-resveratrol: involvement of serotonin and noradrenaline system", European neuropsychopharmacology, 20(6), pp. 405- 413. 37. Jung-Mi Yun, Alexander Chien, Ishwarlal Jialal, Sridevi Devaraj (2012), "Resveratrol up-regulates SIRT1 and inhibits cellular oxidative stress in the diabetic milieu: mechanistic insights", The Journal of nutritional biochemistry, 23(7), pp. 699-705.