Khóa luận Đánh giá tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường type 2 của cao chiết hạt cà phê xanh (Coffea canephora)

Nội dung text: Khóa luận Đánh giá tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường type 2 của cao chiết hạt cà phê xanh (Coffea canephora)

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  NGUYỄN THỊ TRANG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG TÍP 2 CỦA CAO CHIẾT HẠT CÀ PHÊ XANH (Coffea canephora) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  NGUYỄN THỊ TRANG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG TÍP 2 CỦA CAO CHIẾT HẠT CÀ PHÊ XANH (Coffea canephora) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn 1: PGS.TS Bùi Thanh Tùng Người hướng dẫn 2: PGS.TS Vũ Mạnh Hùng Hà Nội – 2020
3. LỜI CẢM ƠN Để thực hiện và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, tôi đã nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ cũng như là quan tâm, động viên từ gia đình, bạn bè và toàn thể thầy cô trong khoa. Nghiên cứu khoa học cũng được hoàn thành dựa trên sự tham khảo, học tập kinh nghiệm từ các kết quả nghiên cứu liên quan, các sách, báo chuyên ngành của nhiều tác giả ở các cơ quan, các tổ chức nghiên cứu, tổ chức chính trị của Việt Nam và các nước khác trên thế giới Đặc biệt hơn nữa là sự hỗ trợ của cán bộ giảng viên các trường đại học và sự giúp đỡ, tạo điều kiện về vật chất và tinh thần từ phía gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp. Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn hai thầy đã hướng dẫn tôi trong khóa luận này là PGS.TS Bùi Thanh Tùng và PGS.TS Vũ Mạnh Hùng và các thầy cô trong Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng khoa Y Dược. Các thầy cô là người trực tiếp hướng dẫn khoa học đã luôn dành nhiều thời gian, công sức hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học. Thầy cô cũng là người luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo những kĩ năng, kiến thức không chỉ trong khóa luận này mà còn định hướng cho tôi trên con đường tương lai sắp tới, giúp tôi vững tin trên con đường phía trước. Tôi xin trân trọng cám ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược cùng toàn thể các thầy cô giáo công tác trong khoa đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tuy có nhiều cố gắng, nhưng trong đề tài nghiên cứu khoa học này không tránh khỏi những thiếu sót. Em kính mong quý thầy cô, các chuyên gia, những người quan tâm đến đề tài, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè tiếp tục có những ý kiến đóng góp, giúp đỡ để đề tài được hoàn thiện hơn. Một lần nữa em xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày 5 tháng 5 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Trang
4. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU 1 Chương I: TỔNG QUAN 2 1. Bệnh tiểu đường 2 1.1 Khái niệm 2 1.2 Phân loại 2 1.3 Các yếu tố nguy cơ của bệnh tiểu đường típ 2 3 1.3.1 Thừa cân và béo phì 3 1.3.2 Tuổi 3 1.3.3 Tiền sử gia đình 4 1.3.4 Yếu tố gen 4 1.3.5 Chế độ dinh dưỡng và hoạt động thể lực 4 1.4 Cơ chế bệnh sinh của tiểu đường típ 2 4 1.5 Các biến chứng bệnh tiểu đường 6 1.6 Phương pháp điều trị bệnh tiểu đường 6 1.6.1 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 1 6 1.6.2 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 2 7 1.7 Dịch tễ học 7 2. Mô hình gây tiểu đường 8 2.1 Tác nhân hóa học 9 2.2 Phẫu thuật gây tiểu đường 12 2.3 Tiểu đường do di truyền 12 3. Tổng quan về enzym α–glucosidase và chất ức chế enzym α- glucosidase 12 3.1 Enzym và chất ức chế enzym 12
5. 3.2 Enzym α–glucosidase 13 3.3 Các chất ức chế enzym α-glucosidase 14 4. Quá trình oxy hóa, chất chống oxy hóa và phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro 16 4.1 Quá trình oxy hóa trong cơ thể 16 4.2 Cơ chế chống oxy hóa 17 4.3 Các chất chống oxy hóa 17 4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro 19 5. Quan niệm về tiểu đường của đông y 21 6. Cây cà phê vối (Coffea canephora )– hạt cà phê xanh 22 6.1 Cây cà phê vối (Coffea canephora ) 22 6.2 Đặc điểm thực vật và phân bố cây cà phê vối 23 Đặc điểm thực vật của cây cà phê vối 23 6.3 Thành phần hóa học của hạt cà phê 24 6.4 Tác dụng dược lý 26 Chương II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 1. Đối tượng nghiên cứu 28 1.1 Mẫu nghiên cứu 28 1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 29 1.3 Động vật thí nghiệm 29 2. Phương tiện nghiên cứu 30 2.1 Hóa chất và thuốc thử 30 2.2 Thiết bị và dụng cụ 30 3. Phương pháp nghiên cứu 31 3.1 Xây dựng mô hình chuột tiểu đường típ 2 31 3.2 Đánh giá tác dụng hạ glucose của dịch chiết hạt cà phê xanh 32 3.3 Đánh giá tác tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết hạt cà phê xanh theo phương pháp DPPH 33 3.4 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α–glucosidase in vitro của dịch chiết hạt cà phê xanh 35
6. 4. Phương pháp xử lý số liệu 36 Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 1. Kết quả 37 1.1 Quy trình chiết, tách hạt cà phê xanh bằng ethanol 37 1.2 Xây dựng mô hình tiểu đường típ 2 thực nghiệm 37 1.3 Tác dụng của cao chiết hạt cà phê xanh trên chuột nhắt thực nghiệm 38 1.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết hạt cà phê xanh theo phương pháp DPPH 41 1.5 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α–glucosidase in vitro của dịch chiết hạt cà phê xanh 42 2. Bàn luận 44 Chương IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 47 1. Kết Luận 47 2. Đề Xuất 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO
7. DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl DMSO Dimethyl sulfoxid EtOAc Ethyl Acetate EtOH Ethanol FDA Hiệp hội Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ HPTLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) IU Đơn vị quốc tế (Interational Unit) mTOR Mammalian target of the rapamycin n-BuOH n-buthanol RNS Nitrogen hoạt tính ROS Oxy hoạt tính
8. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1. 1 Các biến chứng của bệnh tiểu đường. 6 Hình 1. 3 Công thức hóa học của Streptozocin 9 Hình 1. 4 Công thức hóa học của Alloxan 10 Hình 1. 5 Công thức hóa học của Acarbose 14 Hình 1. 6 Cây cà phê vối (Coffea canephora) 23 Hình 1. 7 Cấu trúc phân tử của acid clorogenic 25 Hình 1. 8 Cấu trúc phân tử của Cafein. 25 Hình 2. 1 Cây cà phê vối (Coffea canephora) 28 Hình 2. 2 Hạt cà phê vối (Coffea canephora) 28 Hình 2. 3 Chuột nhắt trắng chủng Swiss. 29 Hình 2. 4 Chuột được tiêm màng bụng Alloxan monohydrate . 31 Hình 3. 1 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do DPPH của cao chiết toàn phần, các phân đoạn của hạt cà phê xanh và axit ascorbic. 41
9. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1 Các chất tự nhiên có tác dụng ức chế hoạt động của enzym α – glucosidase 15 Bảng 1. 2 Các chất chống oxy hóa nội sinh 18 Bảng 1. 3 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 20 Bảng 1. 4 Các chất thơm trong cà phê rang Coffea canephora và Coffea arabica 26 Bảng 3. 1 Sự thay đổi nồng độ glucose huyết trước và sau 72 giờ tiêm Alloxan 38 Bảng 3. 2 Chỉ số đường huyết của chuột tiểu đường do Alloxan gây ra trước và trong 28 ngày điều trị bằng thuốc và cao chiết hạt cà phê. 39 Bảng 3. 3 Trọng lượng của chuột trước và sau 28 ngày điều trị 40 Bảng 3. 4 Giá trị IC50 của cao chiết toàn phần và các phân đoạn của hạt cà phê xanh và axit Ascorbic về khả năng quét gốc tự do DPPH. 42 Bảng 3. 5 Kết quả IC50 của cao chiết của hạt cà phê xanh và Acarbose. 42
10. MỞ ĐẦU Ngày nay, bệnh tiểu đường hay còn gọi là tiểu đường ngày càng phổ biến và có sự gia tăng về tỉ lệ và mức độ ảnh hưởng đến sức khỏe. Tiểu đường là một trong những nguyên nhân gây tử vong và gây ra các biến chứng bệnh trầm trọng ảnh hưởng đến sức khỏe cũng như chất lượng cuộc sống của người bệnh. Mặc dù đã có những tiến bộ đáng kể trong điều trị bệnh tiểu đường bằng các thuốc đường uống nhưng việc tìm kiếm các loại thuốc mới vẫn tiếp tục vì những hạn chế do các tác dụng bất lợi và chi phí điều trị của các thuốc đang được sử dụng [60]. Ở Việt Nam, các bệnh nhân mắc bệnh mãn tính thường có xu hướng sử dụng các loại thuốc Đông Y hoặc thuốc Y học cổ truyền có nguồn gốc từ tự nhiên do độc tính thấp, rẻ tiền và sẵn có của chúng để giảm bớt các gánh nặng về kinh tế khi sử dụng các thuốc tân dược[40]. Vì vậy, trong những năm gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành để đánh giá tiềm năng của các hợp chất tự nhiên được tìm thấy từ cây cỏ để chữa bệnh béo phì và tiểu đường mà ít gây tác dụng phụ, đồng thời tác dụng của thuốc có hiệu quả trong thời gian kéo dài điển hình như: Thân cây Ý dĩ, thân cây Mướp đắng, quả cây Chuối hột [14], [18], [21]. Các nghiên cứu này đã cho thấy kết quả khả quan, có thể dần dần đưa vào sử dụng lâm sàng [4]. Cây cà phê là loài cây công nghiệp khá phổ biến ở nước ta, được trồng nhiều ở vùng Tây Nguyên. Trong đó, 3 loài cà phê được trồng nhiều nhất ở nước ta là cà phê chè (coffea arabica), cà phê vối (coffea canephora), cà phê mít (coffea excels). Loài được trồng nhiều, cho năng suất cao là cà phê vối (coffea canephora). Cây cà phê là loài cây thân gỗ hoặc cây bụi chứa nhiều thành phần có tác dụng điều trị nhiều bệnh. Một số nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng cây cà phê có tác dụng trên tim mạch, thần kinh, hô hấp Nhưng qua tìm hiểu thì tại Việt Nam chưa có nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa, hạ đường huyết của hạt cà phê xanh để phục vụ cho việc phát triển thành sản phẩm có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường. Do đó, đề tài nghiên cứu khoa học: “Đánh giá tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường type 2 của cao chiết hạt cà phê xanh (Coffea canephora)” được thực hiện nhằm các mục tiêu sau: 1. Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của cao chiết hạt cà phê xanh trên mô hình in vivo của chuột nhắt bị tiểu đường bằng Alloxan. 2. Đánh giá tác dụng chống oxi hóa in vitro theo phương pháp DPPH. 3. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro. 1
11. Chương I: TỔNG QUAN 1. Bệnh tiểu đường 1.1 Khái niệm Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) “Tiểu đường là một rối loạn chuyển hóa do rất nhiều nguyên nhân, được mô tả là sự tăng đường huyết mạn tính cùng với rối loạn chuyển hóa carbohydrat, chất béo và protein, nó là hậu quả của sự suy giảm tiết insulin và giảm hoạt tính insulin” [57] Theo định nghĩa của Hiệp hội Đái Tháo Đường Hoa Kỳ năm 2019 (American Diabetes Association - ADA): “Tiểu đường là bệnh rối loạn chuyển hóa đặc trưng bởi sự tăng đường huyết, gây ra bởi sự giảm tiết insulin và/hoặc giảm hoạt tính của insulin. Sự tăng đường huyết mạn tính dẫn đến những tác hại lâu dài, rối loạn hoặc suy yếu chức năng các cơ quan đặc biệt là mắt, thận, hệ thần kinh, tim và mạch máu” [30] Theo hướng dẫn của bộ y tế Việt Nam: “Bệnh tiểu đường là bệnh rối loạn chuyển hóa không đồng nhất, có đặc điểm tăng glucose huyết do khiếm khuyết về tiết insulin, về tác động của insulin, hoặc cả hai. Tăng glucose mạn tính trong thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa carbohydrat, protid, lipid, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim và mạch máu, thận, mắt, thần kinh” [7] Tiểu đường là bệnh rối loạn chuyển hóa của cơ thể, đặc trưng bởi sự tăng glucose trong máu. Bệnh gây ra nhiều biến chứng phức tạp trên nhiều bộ phận của cơ thể. 1.2 Phân loại Tiểu đường nguyên phát [2], [6], [7], [30] - Tiểu đường típ 1: do phá hủy tế bào β đảo tụy, thường dẫn đến sự thiếu insulin tuyệt đối. - Tiểu đường típ 2: do giảm chức năng của tế bào beta tụy tiến triển trên nền tảng đề kháng insulin - Tiểu đường thai kỳ: được chẩn đoán trong khoảng từ tháng thứ ba đến tháng thứ chín của thai kỳ và được phát hiện lần đầu trong lúc mang thai. 2
12. Tiểu đường thứ phát: Bệnh tiểu đường do các nguyên nhân khác: giảm chức năng tế bào β do khiếm khuyết gen; bệnh nội tiết; tăng đường huyết do thuốc và hóa chất như sử dụng glucocorticoid, trong điều trị HIV/AIDS hoặc sau khi ghép tạng. 1.3 Các yếu tố nguy cơ của bệnh tiểu đường típ 2 Bệnh tiểu đường típ 2 hay còn gọi là tiểu đường không phụ thuộc insulin thường thấy ở người trên 40 tuổi và có thể trạng béo. Bệnh tiểu đường típ 2 là một rối loạn mạn tính mà nguyên nhân được cho là do có sự tương tác giữ yếu tố gen và yếu tố môi trường [24]. 1.3.1 Thừa cân và béo phì Tỷ lệ người trưởng thành bị thừa cân (BMI từ 25 – 30 kg/m2) và béo phì (BMI >30 kg/m2) trên thế giới đã được dự đoán là sẽ tăng lên 57% vào năm 2030. Thừa cân và béo phì dẫn tới viêm, tăng tiết từ mô mỡ các hoạt chất nhóm adipocytokyne. Tất cả những hiện tượng này đều có vai trò gây ra kháng insulin ở gan, mô cơ và làm tăng nguy cơ dẫn đến bệnh tiểu đường [58]. Theo khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới, đối với người châu Á, BMI từ 23-25 kg/m2 là thừa cân và trên 25 kg/m2 là béo phì [24]. Đặc điểm của đa số bệnh nhân tiểu đường ở Việt Nam thường có BMI bình thường nhưng lượng mỡ của cơ thể thường cao, đặc biệt là ở phụ nữ [36]. Nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy những người có BMI > 23 kg/m2 thì có nguy cơ mắc tiểu đường typ 2 cao gấp 2,89 lần so với người bình thường. 1.3.2 Tuổi Nguy cơ tiểu đường tăng cùng với tuổi do tăng tính kháng insulin liên quan tới béo phì và tình trạng ít vận động. Cùng với thời gian, các tế bào β suy yếu do chúng phải tăng tiết insulin để bù đắp cho sự tăng mức độ kháng insulin của cơ thể. Ở châu Á, tỷ lệ này cao ở người trẻ tuổi và trung niên (độ tuổi lao động sản xuất chính của xã hội). Điều này gây nên gánh nặng lớn cho các nước Châu Á mà trong đó chủ yếu là những nước đang phát triển và kém phát triển [55]. Tại Việt nam, nghiên cứu dịch tễ bệnh tiểu đường tại 4 thành phố lớn thực hiện năm 2003 cho kết quả tỷ lệ mắc tiểu đường ở nhóm người dưới 35 tuổi là 0,9% còn ở nhóm người 45-54 tuổi là 6,5% và ở nhóm người 55-64 tuổi là 10,3%. 3
13. Nghiên cứu này cũng chứng minh rằng tuổi cao là một yếu tố nguy cơ đặc biệt, có liên quan chặt chẽ đến bệnh tiểu đường. 1.3.3 Tiền sử gia đình Tiền sử gia đình là một yếu tố quan trọng liên quan tới bệnh tiểu đường, điều này thể hiện cho vai trò của yếu tố di truyền đối với nguy cơ mắc bệnh. Những đối tượng có nguy cơ mắc bệnh cao nếu có ít nhất 1 người trong gia đình bị bệnh. Theo một nghiên cứu của Tạ Văn Bình và cộng sự, tiền sử gia đình có bố mẹ hoặc con ruột, anh, chị, em ruột bị mắc tiểu đường thì có nguy cơ mắc bệnh cao gấp 3,28 lần so với nhóm bình thường không có người thân trong gia đình mắc bệnh tiểu đường [36]. 1.3.4 Yếu tố gen Nghiên cứu ở các cặp sinh đôi đã cung cấp những bằng chứng thuyết phục về những ảnh hưởng của yếu tố di truyền đối với bệnh tiểu đường. Các cặp sinh đôi cùng trứng có tỷ lệ tương đồng cao hơn so với các cặp sinh đôi khác trứng. Sự tương đồng về nguy cơ mắc tiểu đường típ 2 ở người sinh đôi cùng trứng từ 34- 83% và ở người sinh đôi khác trứng là 16-40% [57]. 1.3.5 Chế độ dinh dưỡng và hoạt động thể lực Chế độ dinh dưỡng và luyện tập phù hợp là chìa khóa để chống lại trình trạng béo phì và cao huyết áp, tăng hoạt động của insulin và giảm sự tạo glucogen ở gan. Hoạt động thể lực có vai trò đặc biệt quan trọng đối với bệnh tiểu đường típ 2. Nhóm đối tượng ít vận động (<30 phút/ ngày) có nguy cơ mắc bệnh tiểu đường cao gấp 2,4 lần so với nhóm hoạt động nhiều. Nhiều nghiên cứu đã có thấy rằng việc vận động thể lực thường xuyên có tác dụng làm giảm nồng độ glucose máu đồng thời giúp duy trì sự ổn định của lipid máu, huyết áp và giúp cải thiện tinh thần. Sự phối hợp các hoạt động thể lực và điều chỉnh chế độ ăn phù hợp có thể giúp giảm 58% tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường típ 2 [58]. 1.4 Cơ chế bệnh sinh của tiểu đường típ 2 Tiểu đường típ 2 là dạng tiểu đường thường gặp nhất, chiếm khoảng 80 - 90% trong số bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường. Thông thường, với bệnh tiểu đường típ 2, trong cơ thể vẫn còn khả năng sản xuất insulin, nhưng insulin được sản xuất 4
14. ra không đủ hoặc các tế bào không thể sử dụng nó và được gọi là kháng insulin [30]. Có hai yếu tố cơ bản đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của tiểu đường típ 2 là đề kháng với insulin và suy giảm chức năng tiết insulin kết hợp với nhau [30]. Glucose đóng vai trò là nguồn cung cấp năng lượng chính cho các tế bào trong cơ thể. Tuy nhiên để có thể nhận được glucose các tế bào phải cần đến insulin hoạt động như một “chiếc chìa khóa” giúp glucose có thể vào được tế bào. Kháng insulin có thể xảy ra ở gan và các mô ngoại vi theo các hình thức sau: giảm sử dụng glucose ở các cơ quan, giảm thu nhận glucose ở mô ngoại vi và khả năng ức chế sản xuất glucogen ở gan bị giảm. Thừa cân và béo phì là những yếu tố quan trọng làm gia tăng tình trạng kháng insulin, trong đó béo phì thường là do cơ thể hấp thu quá nhiều chất béo nhưng lại ít vận động. Axit béo tự do có nhiều ở những người bệnh béo phì sẽ cạnh tranh với glucose trong chuyển hóa tại cơ vân dẫn đến sự rối loạn sử dụng glucose ở ngoại biên và gây nên tình trạng đề kháng insulin [14]. Khi cơ thể có hiện tượng kháng insulin, nồng độ glucose trong máu sẽ tăng cao hơn mức bình thường. Tế bào β đảo tụy lại đáp ứng bằng cách sản xuất nhiều hơn insulin. Quá trình này diễn ra kéo dài sẽ dẫn đến chức năng của tế bào β bị suy giảm. Ngoài ra khi cả axit béo tự do và insulin đều tăng, quá trình chuyển hóa sẽ tăng lên tại ty thể, làm gia tăng các gốc tự do dẫn đến gia tăng tình trạng viêm. Thêm vào đó, insulin trong máu cao còn gây hiện tượng stress lưới nội chất. Cả hai tình trạng này đều dẫn đến kết quả là tế bào sẽ chết theo chu trình. Hậu quả là tế bào β giảm tiết insulin. Khi nồng độ insulin ở tế bào cửa gan thấp, gan đáp ứng bằng cách giải phóng glucose vào máu trong khi nồng độ glucose đã cao sẵn sau bữa ăn. Ngoài ra ở tế bào cơ vân, nồng độ insulin thấp làm glucose ít vào tế bào, góp phần dẫn đến glucose trong máu cao. Trong giai đoạn này, nồng độ insulin thấp do tụy ít sản xuất và bài tiết insulin kèm theo tình trạng kháng insulin làm khả năng kiểm soát nồng độ glucose ngày càng xấu đi và có thể gây nên nhiều biến chứng nghiêm trọng cho người bệnh [14]. 5
15. 1.5 Các biến chứng bệnh tiểu đường Bệnh tiểu đường nếu không được điều trị tốt và quá trình điều trị không chặt chẽ sẽ gây ra các biến chứng nguy hiểm và các bệnh mạn tính, cấp tính kèm theo. Một số biến chứng cấp tính giai đoạn đầu của tiểu đường như: Nhiễm toan ceton – thường xảy ra với tiểu đường típ 2, hạ đường huyết – thường gặp bệnh nhân dùng thuốc hạ đường huyết quá liều hoặc dùng thuốc trong lúc đói bỏ bữa, hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu máu. Một số biến chứng mãn tính như: Biến chứng mạch máu lớn (bệnh mạch vành, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, ), các bệnh lý mạch máu nhỏ (bệnh lý võng mạc, bệnh lý thận, bệnh lý thần kinh,.)[2], [6]. Hậu quả để lại nặng nề, gây ra gánh nặng cho người bệnh và gia đình người bệnh. Hình 1. 1 Các biến chứng của bệnh tiểu đường. 1.6 Phương pháp điều trị bệnh tiểu đường 1.6.1 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 1 [2], [26] Do tế bào β tuyến tụy bị phá hủy bởi chất trung gian miễn dịch nên cơ thể không có khả năng tạo ra insulin. Do đó, bệnh nhân phải tiêm insulin thường xuyên trong suốt cuộc đời để bổ xung đủ lượng insulin cho cơ thể. 6
16. 1.6.2 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 2 [2], [26] Thuốc điều trị đối với nhóm đối tượng này được chia làm 3 nhóm chính: - Nhóm thuốc kích thích tụy bài tiết insulin như nhóm sulphonylurea: gliclazid, glibenclamid, glimepiride - Nhóm thuốc làm tăng nhạy cảm insulin ở ngoại vi, giảm đề kháng insulin như nhóm biguanide: metformin (thuốc duy nhất được sử dụng thuộc nhóm này); nhóm thiazolidinedion. - Thuốc ức chế enzym α-glucosidase như: acarbose, voglibose, miglitol làm hấp thu chậm glucose từ ruột vào máu. Đối với bệnh nhân tiểu đường típ 2, ngoài uống thuốc điều trị cần phải kết hợp với chế độ ăn, vận động thể lực hợp lí để điều trị đạt hiệu quả tốt nhất. Chế độ ăn lành mạnh là một yếu tố khá quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến bệnh tiểu đường, cần lựa chọn các loại thực phẩm có nhiều chất xơ, ăn nhiều đạm có nguồn gốc thực vật, ăn nhiều trái cây, ít chất béo. Chế độ tập luyện thường xuyên sẽ giúp cải thiện sức khỏe, giúp chống lại bệnh tật nhất là các bệnh về tim mạch, xương khớp. Vận động thường xuyên giúp tăng cường sức khỏe, giảm cân và giảm đường huyết nên được coi là một biện pháp quan trọng trong điều trị bệnh tiểu đường [58]. Hơn nữa, mỗi đối tượng cụ thể sẽ có bệnh lý kèm theo cũng như thể trạng khác nhau nên việc kết hợp các thuốc trong nhóm với nhau nhằm giảm đường huyết hữu hiệu. 1.7 Dịch tễ học Bệnh tiểu đường là căn bệnh rối loạn chuyển hóa hay gặp ở các nước phát triển và đang phát triển gây ra các gánh nặng về tài chính, y tế, xã hội nghiêm trọng. Bệnh gây ra các biến chứng nguy hiểm liên quan mật thiết với nhau, là nguyên nhân hàng đầu về các bệnh tim mạch, cụt chi, mù lòa, suy thận. Tiểu đường trở thành bệnh lý đáng báo động nhất trên toàn thế giới từ những năm đầu của thế kỷ 21. Theo cuộc điều tra của Liên đoàn Tiểu đường Thế giới (International Diabetes Federation - IDF): năm 2015 toàn thế giới có 415 triệu người (trong độ tuổi 20-79) bị bệnh tiểu đường (tiểu đường), tương đương cứ 11 người có 1 người bị tiểu đường. Năm 2017 dân số thế giới là 7,5 tỷ người trong đó có 425 triệu người (trong độ tuổi 20 - 79) bị bệnh tiểu đường. Dự tính đến năm 7
17. 2040 con số này sẽ là 642 triệu, tương đương cứ 10 người có 1 người bị tiểu đường [8] và đến năm 2045 con số này sẽ là 629 triệu; đặc biệt trong hai người trưởng thành (trong độ tuổi 20 - 79) bị tiểu đường thì có một người không được chẩn đoán. Đông Nam Á có số người trưởng thành bị tiểu đường cao thứ hai trong các vùng theo IDF, chiếm tỷ lệ 8,5% tổng số người bị tiểu đường trên thế giới, trong đó khoảng 45,8% các trường hợp bị tiểu đường không được chẩn đoán và gần 48,8% người trưởng thành mắc bệnh tiểu đường sống ở các thành phố [42]. Tại Việt Nam, trong kết quả công bố của “Dự án phòng chống tiểu đường quốc gia” do Bệnh viện Nội tiết Trung ương thực hiện năm 2012 trên 11000 người trong độ tuổi 30 - 69 sống tại 6 vùng miền gồm: miền núi phía Bắc, đồng bằng sông Hồng, duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Tây Nam Bộ đã cho thấy tỷ lệ hiện mắc tiểu đường trên toàn quốc ở người trưởng thành là 5,42%, tăng gấp gần hai lần so với tỷ lệ tiểu đường năm 2012 là 2,7%. Ngoài ra, tỷ lệ tiểu đường chưa được chẩn đoán trong cộng đồng lên tới 63,6% [3]. Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose trong cả nước là 7,3%, rối loạn glucose máu lúc đói 1,9% (năm 2003). Theo kết quả điều tra của Bộ Y tế, hiệp hội Nội tiết – Tiểu đường Việt Nam, nước ta hiện có hơn 3,16 triệu người mắc bệnh tiểu đường. Tỷ lệ này đang chiếm hơn 5% dân số trưởng thành trong độ tuổi 20-79. Và tỷ lệ người mắc bệnh tiểu đường ngày càng trẻ hoá. Nhưng một điều đáng mừng là có tới 70% trường hợp tiểu đường típ 2 có thể dự phòng hoặc làm chậm xuất hiện bệnh bằng tuân thủ lối sống lành mạnh, dinh dưỡng hợp lý và tăng cường luyện tập thể lực [8]. 2. Mô hình gây tiểu đường Thử nghiệm tiểu đường trên mô hình động vật là điều cần thiết để nâng cao nhận thức và hiểu biết về các khía cạnh khác nhau của cơ chế bệnh sinh từ đó tìm ra các liệu pháp và các phương pháp điều trị mới. Hầu hết các mô hình hiện nay đều sử dụng động vật gặm nhấm làm đối tượng thí nghiệm do nhiều ưu điểm của chúng như kích thước nhỏ, khoảng cách thế hệ ngắn, tính sẵn có và chi phí thấp. Bệnh tiểu đường thực nghiệm thường được gây ra ở động vật thí nghiệm bằng các phương pháp phổ biến như: tác nhân hóa học, phẫu thuật, di truyền [45]. 8
18. 2.1 Tác nhân hóa học Các tác nhân hóa học gây ra tiểu đường có thể phân thành ba loại: phá hủy tế bào β đảo tụy, gây ức chế tạm thời việc sản xuất và/hoặc tiết insulin, làm giảm chuyển hóa insulin trong mô đích. Streptozocin (STZ 61%) và Alloxan (31%) cho đến nay là những thuốc được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu về bệnh tiểu đường và giúp ích cho nghiên cứu nhiều khía cạnh của bệnh. Các loại thuốc này có thể được đưa vào cơ thể bằng cách tiêm tĩnh mạch, tiêm màng bụng hoặc tiêm dưới da. Liều cần thiết để gây ra bệnh tiểu đường phụ thuộc vào loại động vật, đường dùng thuốc và tình trạng dinh dưỡng. Tùy theo liều dùng của các thuốc này mà các hội chứng tương tự như tiểu đường típ 1, tiểu đường típ 2 hoặc không dung nạp glucose có thể được gây ra. Tác dụng gây độc tế bào của các loại thuốc này đều qua trung gian là các phản ứng oxy hóa nhưng chúng có sự khác nhau về cơ chế hoạt động [45].  Streptozotocin Streptozotocin (STZ) là chất hóa học thuộc nhóm hợp chất glucosamine nitrosorea, có công thức hóa học là C8H15N3O7, đã được thử nghiệm lâm sàng từ năm 1967. STZ tồn tại trong tự nhiên, chúng có khả năng gây độc đặc hiệu với tế bào β sản xuất insulin của tuyến tụy ở động vật có vú. STZ được phát hiện có trong một chủng vi khuẩn có tên là Streptomyces achromogenes vào những năm 50 của thế kỷ 20, hiện nay STZ đang được sử dụng trong y tế để điều trị một số ung thư trên đảo tụy Langerhan và là chất gây tiểu đường được sử dụng phổ biến nhất và có hiệu quả trên các mô hình động vật thực nghiệm, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu y học [56] . Hình 1. 2 Công thức hóa học của Streptozocin 9
19. STZ xâm nhập vào tế bào β đảo tụy thông qua chất vật chuyển glucose - GLUT2 và gây ra sự alkyl hóa axit deoxyribonucleic (DNA). Ngoài ra, STZ còn gây kích hoạt sự ribosyl hóa poly adenosin diphosphat và giải phóng nitric oxid. Kết quả là tế bào tụy bị phá hủy do hoại tử [45]. Sử dụng STZ trong mô hình bằng nhiều phương pháp: - STZ cho chuột mới sinh: Mô hình tiêm STZ cho chuột mới sinh (với sự thay đổi liều và ngày tiêm STZ) biểu hiện các giai đoạn khác nhau của tiểu đường típ 2 như làm giảm dung nạp glucose, glucose máu giảm nhẹ/ trung bình/ nặng. Các tế bào β ở chuột mới sinh tiêm STZ có sự tương đồng về đặc điểm bài tiết insulin ở bệnh nhân tiểu đường típ 2 [31], [61]. - Kết hợp Nicotinamid - Streptozocin (NAD - STZ): Nicotinamid là một chất chống oxy hóa có tác dụng bảo vệ bằng cách làm sạch các gốc tự do và do đó bảo vệ được một phần tế bào β khỏi tác động gây độc tế bào của STZ [52]. Tùy vào liều lượng STZ và cách thức tiến hành tiêm thuốc mà có thể gây mô hình động vật tiểu đường típ 1 hoặc tiểu đường típ 2. Liều trên chuột nhắt dao động từ 100 - 150 mg/kg [29], trên chuột cống dao động từ 40 - 100 mg/kg [28]. Một vấn đề khi sử dụng STZ là tác dụng độc hại của nó không giới hạn ở tuyến tụy vì nó có thể gây tổn thương thận, gây viêm và rối loạn chức năng nội mô.  Alloxan Alloxan, đôi khi được gọi là alloxan hydrate; 2,4,5,6-Tetraoxypyrimidine; 2,4,5,6-pỷimidinetetrone; Axit 5,5-dihydroxybarbituric. Nó là dẫn xuất của axit uric, không bền ở pH trung tính, khá ổn định ở pH=3. Hình 1. 3 Công thức hóa học của Alloxan 10
20. Alloxan cũng giống như streptozotocin là những hóa chất gây tiểu đường nổi bật nhất trong nghiên cứu bệnh tiểu đường. Cả hai đều là chất tương tự glucose gây độc tế bào. Mặc dù độc tính tế bào của chúng đạt được thông qua các con đường khác nhau, cơ chế hoạt động chọn lọc tế bào β của chúng là giống hệt nhau. Alloxan tác động trên tế bào qua bốn giai đoạn [54]: Giai đoạn thứ nhất: hạ đường huyết thoáng qua đầu tiên lên đến 30 phút bắt đầu trong vòng vài phút sau khi tiêm Alloxan. Phản ứng hạ đường huyết trong thời gian ngắn này là kết quả của sự kích thích thoáng qua bài tiết insulin, được ghi nhận bằng sự gia tăng nồng độ insulin trong huyết tương. Cơ chế cơ bản của chúng là giảm tiêu thụ tạm thời và tăng khả năng tiêu thụ ATP do ức chế quá trình phosphoryl hóa glucose thông qua ức chế glucokinase. Giai đoạn hạ đường huyết thoáng qua ban đầu này không được quan sát khi gây mô hình tiểu đường bằng streptozotocin, vì streptozotocin không ức chế glucokinase. Sự thay đổi hình thái là tối thiểu trong giai đoạn này. Giai đoạn thứ hai bắt đầu với sự gia tăng nồng độ glucose trong máu, 1 giờ sau khi tiêm alloxan và giảm insulin huyết tương. Giai đoạn tăng đường huyết này, thường kéo dài 2 - 4 giờ, được gây ra bởi sự ức chế bài tiết insulin dẫn đến hạ đường huyết. Trong giai đoạn này, các tế bào β cho thấy các đặc điểm hình thái thay đổi như: không bào nội bào, giãn màng lưới nội chất thô, giảm diện tích Golgi, giảm bài tiết và hàm lượng insulin, ty thể bị sưng Giai đoạn thứ ba, một lần nữa là giai đoạn hạ đường huyết, thường xảy ra sau khi tiêm alloxan và kéo dài vài giờ. Nó có thể gây co giật và thậm chí có thể gây tử vong nếu không sử dụng glucose, đặc biệt là khi glycogen ở gan bị cạn kiệt do đói. Sự hạ đường huyết nghiêm trọng này được tạo ra do lưu thông insulin (kết quả của việc tiết ra chất độc làm vỡ màng tế bào). Ngoài những thay đổi về hình thái được thấy trong giai đoạn đầu tiên, các nhân tế bào β có hình chóp và không có màu dương tính với TUNEL. Giai đoạn thứ tư là giai đoạn tăng đường huyết vĩnh viễn. Sự thoái hóa hoàn toàn và mất tính toàn vẹn của tế bào β được nhìn thấy trong 48-72 giờ sau khi tiêm Alloxan. Các tế bào khác vẫn còn nguyên vẹn, thể hiện tính chất chọn lọc tế bào β. Các mảnh vụn tế bào có nguồn gốc từ các tế bào β bị phá hủy được loại bỏ bởi các đại thực bào. 11
21. 2.2 Phẫu thuật gây tiểu đường Phương pháp này bao gồm cắt bỏ hoàn toàn hoặc một phần tụy để gây tiểu đường típ 1 hoặc típ 2. Trong lịch sử, mô hình mắc bệnh tiểu đường ở chó được Oskar Minkowski phát hiện thông qua phẫu thuật cắt bỏ tụy được coi là mô hình động vật đầu tiên về bệnh tiểu đường [51]. Một số nhà nghiên cứu đã sử dụng mô hình này để thử nghiệm các sản phẩm tự nhiên trên chuột, chó, linh trưởng [48], [77]. 2.3 Tiểu đường do di truyền Các động vật mắc bệnh tiểu đường típ 2 có thể được lấy từ việc chọn giống (các động vật có một hoặc một số gen đột biến được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác) hoặc từ lai tạo chuột ob không bị tiểu đường bằng nhân giống lặp đi lặp lại qua nhiều thế hệ với chuột BB, chuột tiểu đường béo phì Tsumara Suzuki. Những động vật này bị tiểu đường là do di truyền hoặc do khiếm khuyết đơn hoặc đa gen (chuột KK, chuột db/db hoặc chuột béo Zucker). Bệnh tiểu đường típ 2 ở người phần lớn là kết quả của sự tương tác giữa môi trường và sự khiếm khuyết đa gen. Do đó, động vật khiếm khuyết đa gen sẽ gần giống với người hơn động vật khiếm khuyết đơn gen [71]. 3. Tổng quan về enzym α–glucosidase và chất ức chế enzym α- glucosidase 3.1 Enzym và chất ức chế enzym Enzym là chất xúc tác sinh học được hình thành trong tế bào sinh vật có cấu trúc đặc thù và có thành phần cơ bản là protein. Trong tế bào sinh vật luôn xảy ra quá trình trao đổi chất, nhờ có enzym mà nhiều phản ứng hóa học xảy ra nhanh chóng với hiệu suất cao mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH. Các phân tử tham gia vào ngay lúc đầu của quá trình phản ứng được gọi là chất nền và enzym biến đổi chất nền thành các phân tử khác. Chúng có thể được thu nhận từ các cơ thể sống khác nhau của động vật, thực vật và vi sinh vật [27]. Enzym có tính đặc hiệu và chọn lọc rất cao đối với các chất nền của nó [19]. Vì vậy trong cơ thể sinh vật enzym có chức năng xúc tác chọn lọc, đóng vai trò định hướng tất cả các phản ứng xảy ra trong tế bào. Khi ở ngoài tế bào, nhiều enzym vẫn có khả năng hoạt động tương tự [75]. 12
22. Chất ức chế enzym là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzym. Các chất ức chế enzym có bản chất hóa học rất khác nhau, chúng có thể là các cation, các anion, các hợp chất hữu cơ phân tử nhỏ hoặc thậm chí là các protein. Chất ức chế có thể có phản ứng thuận nghịch hoặc không thuận nghịch với enzym. Thông thường được phân chia thành hai loại ức chế thuận nghịch là ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh [76]. Đối với chất ức chế cạnh tranh: chất kìm hãm có cấu trúc tương tự cơ chất, gắn thuận nghịch vào trung tâm phản ứng của enzym, gây giảm chức năng xúc tác của enzym. Đối với chất ức chế không cạnh tranh: chất kìm hãm gắn thuận nghịch vào vị trí khác trên enzym (vị trí dị lập thể) chứ không gắn vào vị trí xúc tác và làm thay đổi cấu hình vị trí hoạt động của enzym khiến chúng không phù hợp để cơ chất gắn vào. Dù theo hình thức ức chế nào thì khi chất kìm hãm được giải phóng, hoạt động xúc tác của enzym sẽ bình thường trở lại [19]. 3.2 Enzym α–glucosidase Enzym α-glucosidase có những tên gọi khác như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, α-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzym làm gẫy các liên kết bằng thủy phân) [64]. Enzym α-glucosidase là enzym 1 thành phần, có hoạt tính exohydrolysis, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α-1,4-glycoside ở đầu tận cùng không khử của carbonhydrate để giải phóng phân tử α-D-glucose. Chất nền đặc trưng của enzym này là các disaccharide, oligosaccharide, các aryl và akyl- α-glucosidase khác [74]. Enzym α-glucosidase là một trong những enzym thuộc lớp glycoside hydrolase – là một lớp các enzym thường tách liên kết glycoside giữa 2 phân tử carbohydrate, một trong những liên kết mạnh nhất được tìm thấy ở các polymer tự nhiên. Các enzym này có khả năng bẻ gãy các liên kết glycoside nhanh hơn 10- 17 lần so với phản ứng không có enzym xúc tác [34]. Nguồn gốc, phân bố: Enzym α-glucosidase được tìm thấy trên màng bề mặt của đường ruột, tham gia vào bước cuối của quá trình tiêu hóa [10]. 13
23.  Cơ chế hoạt động Chúng ta biết rằng carbohydrat chứa trong thức ăn là nguồn cung cấp đường cho cơ thể. Sau khi vào cơ thể, chúng được thủy phân thành những phân tử đường đơn bởi những enzym trong ruột non và các phân tử đường này được đưa đến các cơ quan, các tế bào ở khắp cơ thể [80]. Nguồn carbohydrat này sau khi vào cơ thể sẽ được các enzym ở tụy (α- amylase) và ruột non (α-glucosidase) tiết ra, thủy phân thành những phân tử đường đơn rồi thẩm thấu vào máu. Enzym α-glucosidase có chức năng xúc tác việc cắt đứt các liên kết 1,4-α-D-glucosid của cơ chất để giải phóng α-D-glucose [80]. Bằng cách kiềm chế sự hoạt động của enzym α-glucosidase có thể làm giảm sự thủy phân của carbohydrate và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào máu [34]. 3.3 Các chất ức chế enzym α-glucosidase Một số chất tổng hợp được sử dụng để ức chế hoạt động của enzym này được được sử dụng rộng rãi như Acarbose, Miglitol, Voglibose [2] Các chất này được sử dụng như một thuốc giúp điều trị tiểu đường típ 2, chúng ức chế các enzym α-glucosidase ở ruột. Acarbose là một tetrasaccharid, ít hấp thụ ở đường tiêu hóa và ức chế cạnh tranh với enzym α-glucosidase ở ruột non [26] có tác dụng chống tăng đường huyết sau ăn và không làm tăng tiết insulin, không làm hạ đường huyết. Tuy nhiên, Acarbose có tác dụng phụ thường gặp trên đường tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng, tiêu chảy, buồn nôn nhất là khi ăn đường mía và thực phẩm có đường do carbohydrate không được hấp thu và lên men ở đại tràng [26]. Vì vậy, việc nghiên cứu các dược liệu có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase rất cần thiết để giúp quá trình điều trị tiểu đường típ 2 có nhiều lựa chọn phù hợp. Hình 1. 4 Công thức hóa học của Acarbose 14
24. Ngoài các chất được tổng hợp hóa học thì trong tự nhiên cũng có nhiều chất có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase như: flavonoid, anthocyanidin, isoflavone, phenolic, curcuminoids, terpinoid, trong khi các chất hóa học được tổng hợp để sử dụng gây ra nhiều tác dụng phụ cho người dùng thì việc tìm kiếm các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên có tác dụng tương tự là rất cần thiết và được quan tâm trên toàn thế giới [80]. Bảng 1. 1 Các chất tự nhiên có tác dụng ức chế hoạt động của enzym α – glucosidase STT Nhóm hợp chất Tên hoạt chất Luteolin, Apigennin, Hesperetin, 1 Flavonoid Cyaniding-3-galactoside, (2R,3R,4R,5R) 2,5-bis(hydroxymethyl)-3,4- dihydroxypyrrolidine, 1-deoxynojirimycin 3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic axit Axit 28-O- α-larabinopyranosyl-(1 4)- α-1- 2 Alkaloid arabinopyranosyl-(1 3)-β-d-xylopyranosyl- (1 4)- α-lrhamnopyranosyl-(1 2)-β-d- fucopyranosyl ester, 3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic axit Axit 28-O- α-larabinopyranosyl-(1 4)- α-1- 3 Saponin- arabinopyranosyl-(1 3)-β-d-xylopyranosyl- triterpenoid (1 4)- α-lrhamnopyranosyl-(1 2)-β-d- fucopyranosyl ester, Curcumin 4 Curcuminoid Demethoxycurcumin Bídemethoxycurcumin Bromophenols 5 Miscellaneous 2,4,6-tribromophenol 2,4-dibromophenol 15
25. 4. Quá trình oxy hóa, chất chống oxy hóa và phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro Tiểu đường là một trong những những bệnh rối loạn chuyển hóa do sản xuất quá mức các loại oxy phản ứng (ROS) so với mức bình thường hoặc rối loạn chức năng trong cơ chế bảo vệ chống oxy hóa hoặc cả hai xảy ra đồng thời. ROS dư thừa được quét bởi các chất chống oxy hóa. Chất chống oxy hóa chống lại các gốc tự do thông qua các cơ chế sau: suy thoái gốc tự do; nhặt các gốc tự do Theo một số nghiên cứu, người bệnh bị tiểu đường mức độ chống oxy hóa giảm. Điều đó góp phần gây ra các biến chứng bệnh tiểu đường như chấn thương mô, tổn thương tế bào, dây thần kinh [9], [82] 4.1 Quá trình oxy hóa trong cơ thể Oxy hóa là quá trình xảy ra các phản ứng hóa học, trong đó các electron được chuyển sang chất oxy hóa hình thành nên gốc tự do. Sự gia tăng các gốc tự do trong cơ thể sinh ra các phản ứng dây chuyền gây phá hủy tế bào. Các gốc tự do là nguyên tử, phân tử hoặc ion với các electron chưa được ghép cặp rất không ổn định và chúng có xu hướng đạt cân bằng bằng cách lấy một electron từ một phân tử mà nó tiếp xúc. Phần lớn các phân tử sinh học không phải là gốc. Các gốc tự do trong cơ thể có 2 nguồn gốc chính sau: nguồn gốc nội sinh và nguồn gốc ngoại sinh - Gốc tự do nội sinh: các gốc tự do được chính cơ thể tạo ra trong những quá trình chuyển hóa tự nhiên như hô hấp tế bào (chủ yếu là superoxide sau đó H2O2), lưới nội chất (tạo thành superoxide – bởi cytochrome P450), quá trình trao đổi chất của tế bào . Trong cơ thể, ty thể là nguồn tạo ra nhiều gốc tự do nội bào. - Gốc tự do ngoại sinh: Do tác động bởi các yếu tố ngoại lai như tia tử ngoại từ ánh sáng mặt trời, thuốc lá, ô nhiễm môi trường Các dạng hoạt động của gốc tự do gồm có ROS (oxy hoạt tính), RNS (nitrogen hoạt tính), RSS có tác dụng chống lại vi sinh vật [12], [16], [65]. Bản chất của các gốc tự do là có khả năng phản ứng cao, thời gian tồn tại ngắn phụ thuộc vào bản chất và điều kiện của hệ mà nó tồn tại [22], [65]. 16
26. Cơ chế hình thành các gốc tự do trong cơ thể, gồm 3 cơ chế: Tạo ra từ chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể. Tạo ra từ quá trình peroxyd hóa lipid. Tạo ra từ phản ứng tạo gốc khác trong cơ thể. Đích phân tử chính của các gốc tự do là protein, ADN (acid deoxyribonucleic), ARN (acid ribonucleic), đường và lipid. Những phản ứng của gốc tự do có liên quan đến nhiều bệnh nguy hiểm như ung thư, tim mạch, béo phì, tiểu đường, bệnh Alzheimer, Parkinson, lupus ban đỏ, loét dạ dày [65], [68] 4.2 Cơ chế chống oxy hóa Các cơ chế chống oxy hóa [73]: - Ức chế các enzym xúc tác làm tăng sản xuất các ROS/ RNS. - Tác động vào đường truyền tín hiệu oxy hóa khử, thúc đẩy quá trình chống oxy hóa của tế bào. - Phản ứng trực tiếp với ROS/ RNS tạo ra các chất ít độc hoặc mất hoạt tính. Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa các chất oxy hóa và chất chống oxy hóa dẫn đến sự gián đoạn chuyền tín hiệu và kiểm soát oxy hóa khử gây ra nhiều thiệt hại cho các phân tử sinh học ảnh hưởng xấu đến cơ thể [78]. - Tổn hại tới lipid do bị oxy hóa: làm mất các dây nội chưa bão hòa (gây thay đổi trong tính lưu chảy và tính thấm của màng), tạo ra các chất có hoạt tính mạnh (gây ảnh hưởng tới tính đồng nhất của enzym màng). - Tổn hại tới protein do bị oxy hóa: làm kết tập, phân mảnh, phân tách protein; phản ứng với ion sắt của hem; biến đổi nhóm chức năng. Hậu quả: thay đổi hoạt tính enzym và phân giải protein. - Tổn hại tới DNA: bị oxy hóa làm đứt, gẫy chuỗi; tách vòng saccharide dẫn đến các đột biến, lỗi di truyền hoặc ức chế tổng hợp protein. - Các bệnh lý rối loạn: già hóa, béo phì, tiểu đường, viêm nhiễm, viêm tụy cấp, các bệnh thoái hóa thần kinh (bệnh Parkinson và bệnh Alzheimers). 4.3 Các chất chống oxy hóa Chất chống oxy hóa là các chất khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng, vì vậy người ta hay dùng các chất khử để chống oxy hóa. 17
27.  Các chất chống oxy hóa nội sinh Các chất chống oxy hóa nội sinh do cơ thể sinh ra được chia thành 2 loại, các chất chống oxy hóa có bản chất là enzym và các chất chống oxy hóa không phải enzym. Các chất chống oxy hóa có bản chất là enzym quan trọng ngăn chặn sự hình thành hoặc trung hòa các gốc tự do trong cơ thể là: glutathion peroxidase, catalase, superoxid dismutase, Glucose-6-phosphat dehydrogenase. Các chất chống oxy hóa không phải enzym cũng được tổng hợp trong cơ thể nhưng rất ít và chủ yếu được bổ sung từ thức ăn [65] Mỗi chất chống oxy hóa có cơ chế tác dụng riêng với từng loại gốc tự do khác nhau và có thể hiệp đồng với nhau để loại trừ gốc tự do. Nhờ các chất chống oxy hóa mà quá trình oxy hóa chỉ xảy ra ở mức độ sinh lý nhất định, khi đó các dạng oxy hóa hoạt động thực hiện được chức năng sinh lý và duy trì được sự cân bằng quá trình trao đổi chất. Việc tìm kiếm các hợp chất chống oxy hóa mới có thể tạo ra sự kết hợp hiệu quả trong điều trị một số bệnh có liên quan đến quá trình oxy hóa trong cơ thể Bảng 1. 2 Các chất chống oxy hóa nội sinh Các enzym Các chất không phải enzym Glutathione peroxidase Co-enzym: Q10 Catalase Vitamin A Superoxide dismutase Hợp chất chưa nito (non- Glucose-6-phosphat protein): uric dehydrogenase Hợp chất chưa lưu huỳnh: glutathione  Chất chống oxy hóa trong hóa dược Thuốc chống viêm: Theo nghiên cứu, nhóm thuốc nàyđược chứng minh là có tác dụng chống oxy hóa và được chia thành 3 nhóm: ● ● Nhóm 1: Những chất làm giảm gốc O2 , OH, H2O2 như aspirin, indomethacin, ibubrofen ● ● Nhóm 2: Những chất làm giảm OH nhưng làm giảm mạnh O2 , H2O2 như hydrocortisol, 2 -3 hydroxybenzoic Nhóm 3: Thuốc làm giảm ●OH ở nồng độ rất thấp như phenylbutanol. 18
28. Các chất chống oxy hóa tổng hợp: BHA (butylated hydroxyanisole), BHT (butylated hydroxytoluene), PG (propyl gallate), OG (octyl gallate), TBHQ (tert – butylhydroquinon)  Các chất oxy hóa có nguồn gốc thực vật Trong thế giới thực vật có rất nhiều chất có tác dụng chống oxy hóa và thuộc nhiều nhóm khác nhau. Đáng chú ý nhất là các vitamin và dẫn xuất của phenol: Vitamin E: Ức chế phản ứng oxy hóa lipid, bảo vệ các tế bào và các phần tử chức năng khỏi sự oxy hóa quá mức do đó có tác dụng chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ. Vitamin C: Là chất cho điện tử, có khả năng loại bỏ những gốc tự do ở pha nước của tế bào, có khả năng tái tạo Vitamin E từ dạng oxy hóa về dạng khử [35]. Flavonoid: Là một nhóm các phenolic thực vật có tác dụng chống oxy hóa và tạo phức chelat rất đáng chú ý. Chúng tập trung nhiều nhất trong các loại trái cây, rau quả, rượu, trà và cacao. Flavonoid tồn tại trong thực phẩm dưới dạng glycoside và polymer, được thoái hóa ở nhiều mức độ khác nhau trong đường tiêu hóa. Xu hướng ức chế quá trình trung gian tạo gốc tự do của một số flavonoid bị chi phối bởi cấu trúc hóa học của nó (cấu trúc nhân flavan, số lượng và vị trí các nhóm thế). Một số flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa cao EGCG trong chè xanh, Genistein trong đậu nành, quercetin, resveratrol [69]. Xanthan: Là một hợp chất phenol thực vật có hoạt tính chống oxy hóa, có mặt trong một số thực vật nhiệt đới. Ngoài ra còn có nhiều dẫn chất khác thuộc nhóm các phenolic tự nhiên cũng có tác dụng chống oxy hóa như carotenoid, acid phenolic, lignin 4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro Đánh giá khả năng chống oxy hóa có rất nhiều phương pháp thường được sử dụng, chúng được chia thành 2 loại: phương pháp in vitro và phương pháp in vivo [63]: 19
29. Bảng 1. 3 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa Các phương pháp in vitro Các phương pháp in vivo 1. Dọn gốc tự do DPPH 1. Khả năng làm giảm sắt trong 2. Dọn gốc tự do HO huyết tương. 3. Dọn gốc tự do nitric oxid 2. Khả năng làm giảm glutathione 4. Dọn gốc tự do peroxynitrite 3. Glutathion peroxidase 5. Phương pháp định lượng ABTS 4. Glutathion – S – Tranferase 6. Phương pháp TRAP 5. Superoxid dismutase 7. Phương pháp FRAP 6. Catalase 8. Dọn gốc tự do superoxid (SOD) 7. γ– glutanyl transpeptidase 9. Dọn gốc tự do hydroxyl 8. Glutathion reductase 10. Phương pháp HORAC 9. Peroxid hóa lipid 11. Phương pháp ORAC 10. Thử nghiệm LDL 12. Phương pháp RP 13. Phương pháp DMPD 14. Enzym xanthin oxidase 15. Phương pháp CUPRAC Một số thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro Thử tác dụng dọn gốc tự do DPPH Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng giữa gốc tự do DPPH (màu tím đỏ) với các chất chống oxy hóa để tạo ra hợp chất của DPPH có màu vàng và không hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 517 nm. Đo độ hấp thụ tại bước sóng 517 nm của dung dịch sau phản ứng để tính lượng DPPH còn lại trong hỗn hợp sau phản ứng. Ưu điểm: Nhanh, cho kết quả khá chính xác, dễ thực hiện và không tốn kém. Tuy nhiên, DPPH không tồn tại trong cơ thể sống nên phép thử này chỉ mang ý nghĩa xác định khả năng loại bỏ gốc tự do của mẫu cần thử. Dùng trong sàng lọc các mẫu dược liệu [22], [49], [63], [65]. ● Thử tác dụng dọn gốc tự do superoxid O2 ● Nguyên tắc: Gốc tự do O2 được hình thành trong quá trình oxy hóa xanthin ● thành acid uric được xúc tác bởi enzym xanthinoxidase. Gốc O2 tạo thành phản ứng với nitrobule tetrazolium sẽ tạo ra chất có màu xanh đậm, hấp thụ ở bước sóng 560 nm, đo hấp thụ quang của dung dịch phản ứng tại bước sóng 560 nm sẽ biết ● lượng O2 tham gia phản ứng [22], [50], [63], [65]. 20
30. Ưu điểm: Nhanh chóng, dễ thực hiện, yêu cầu ít máy móc, kết quả thu được tương đối ổn định và chính xác. Thử tác dụng dọn gốc tự do hydroxyl ●OH Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên phản ứng của đường 2–deoxyribose của gốc ●OH. Khi hoạt động sẽ oxy hóa đường deoxyribose để tạo ra sản phẩm cuối cùng là MDA (maloydialdehyd). Phân tử MDA khi phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) ở nhiệt độ cao sẽ có màu hồng có hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 532 nm. Đo hấp thụ quang của dung dịch tại bước sóng 532 nm sẽ cho biết nồng độ MDA được tạo ra sau quá trình oxy hóa. Từ đó tính được mức độ deoxyribose bị oxy hóa và mức độ dọn gốc tự do ●OH của mẫu thử. Ưu điểm: Nhanh chóng, dễ thực hiện, chi phí thấp. Tuy nhiên gốc ●OH có hoạt tính rất mạnh nên rất khó để đánh giá mức độ tác dụng và kết quả ít chính xác hơn các thử nghiệm khác [22], [49], [63], [65]. 5. Quan niệm về tiểu đường của đông y Bệnh tiểu đường trong y học cổ truyền được gọi là chứng tiêu khát mà nguyên nhân chủ yếu là do ăn uống không điều độ, ăn nhiều các chất cay nóng, béo, ngọt, do lao lực, do căng thẳng thần kinh tạo thành hỏa nhiệt, uất nhiệt làm phần âm của phủ tạng: phế, vị, thận bị hao tổn. Hải Thượng Lãn Ông có viết trong cuốn Y Trung Quan Kiện như sau: “chứng bệnh tiêu khát phần nhiều do hỏa làm tiêu hao chân âm 5 chất dịch bị khô cạn mà sinh ra” [4].Muốn chữa bệnh phải trị cả gốc và ngọn: trị ngọn là trị chứng khát nước, đói, tiểu nhiều. Bệnh tiểu đường trong y học cổ truyền chia ra làm ba mức độ: Nếu bệnh nhân thích uống nước nhiều thì bệnh chủ yếu ở thượng tiêu do phế âm hư; nếu thích ăn nhiều bệnh chủ yếu ở trung tiêu do vị âm hư gây đói và gầy; nếu bị đi tiểu nhiều thì bệnh chủ yếu ở phần hạ tiêu do thận âm hư không tàng trữ được tinh hoa của ngũ cốc, không làm chủ được thủy gây tiểu nhiều và nước tiểu có đường [4] Muốn chữa bệnh tiểu đường phải trị cả gốc và ngọn: trị ngọn là trị chứng khát nước, đói, tiểu nhiều; trị gốc là trị phế, tỳ, thận là những cơ quan có chức năng chuyển hóa và điều tiết trong cơ thể. Các thuốc Đông y được sử dụng trong điều trị tiểu đường: Sử dụng thuốc có nguồn gốc thực vật trong phòng và chữa bệnh là thói quen, kinh nghiệm và truyền thống của người dân Việt Nam và một số nước trên thế giới. Một nghiên 21
31. cứu về vấn đề sử dụng thảo dược thường xuyên cho bệnh nhân tiểu đường đã cho thấy liệu pháp thực vật là kinh tế nhất và hiệu quả hơn thuốc hiện đại [37]. Có rất nhiều loài cây đã được dùng theo kinh nghiệm dân gian để làm giảm nhẹ triệu chứng cũng như biến chứng của bệnh tiểu đường như: Cải xoong (Nasturium officinale Brassicaceae); Củ cải trắng (Ravanus sativus); Mướp đắng (Mormordica charantia Cucurbitaceae); Dừa cạn (Catharanthus roseus Apocynaceae); Bồ công anh (Taraxacum officinale Asteraceae); Dứa (Ananas sativus); Ổi (Psidium guajava); Rau má (Celltela asiatica); lựu (Punica granatum Linn.Fruits); Ngò tàu (Eryngium foetidum Apiaceae); Quỉ trâm thảo (Bidens pilosa Asteraceae); Bạch truật (Atractiloides macrocephala Asteraceae); Chuối Hột (Musra barjoo Sieb); Cam thảo nam (Scoparia ducis Scrophulariaceae); Hoài Sơn (Dioscorea persimilis Dioscoreaceae); Ngọc trúc (Polygotanum officinale Liliaceae); Xấu Hổ (Mimosa pudica Linn.) [33]. 6. Cây cà phê vối (Coffea canephora ) – hạt cà phê xanh 6.1 Cây cà phê vối (Coffea canephora ) Cây cà phê (loài Coffea.L) ở nước ta thường trồng 4 giống chính là: cà phê chè (coffea arabica), cà phê vối (coffea canephora), cà phê mít (coffea excels) và cà phê mít dâu da (coffea liberria) [1], [15], [17], [25] Cây cà phê vối được trồng nhiều nhất trong 4 loài, chúng có nguồn gốc từ vùng rừng xích đạo châu Phi, từ Guinca đến Uganda, phân bố rải rác dưới các tán cây thưa, thấp thuộc vùng châu thổ sông Côngô khoảng giữa 10o vĩ bắc và 10o vĩ nam. Cà phê vối sớm được thuần hóa và được trồng ở các vùng ở châu phi, đến năm 1900 du nhập vào đảo Java sau đó tiếp tục được đưa sang nhiều nước nhiệt đới khác. Hiện nay, chúng được trồng nhiều nhất ở các nước châu Phi, Indonesia, Việt Nam, Ấn Độ, chiếm trên 90% tổng diện tích trồng cà phê vối trên thế giới. [13] Cây cà phê vối (Coffea canephora) có: Tên khoa học: Coffea canephora Pierre hoặc Coffea robusta Vị trí phân loại trong giới thực vật [23]: Lớp: Magnoliopsida Bộ: Rubiales 22
32. Họ: Rubiaceae Chi: Coffea Loài: Coffea canephora Hình 1. 5 Cây cà phê vối (Coffea canephora) 6.2 Đặc điểm thực vật và phân bố cây cà phê vối Đặc điểm thực vật của cây cà phê vối [5], [13], [17], [20] Cà phê vối thuộc loại cây nhỡ, trong điều kiện tự nhiên có thể cao từ 8-12m phát triển theo một trục chính tạo thành nhiều đốt liên tục, mỗi đốt mang một đôi lá. Cành mang quả cấp một thường hình thành một lần theo chiều ngang hoặc nửa thẳng hay đứng so với thân chính. Mỗi năm cà phê có thể cho từ 8 đến 14 cặp cành mang quả. Cành là bộ khung của cây và quyết định năng suất hàng năm. Những cành phát sinh từ những đốt trên cành cơ bản hoặc cành nối tiếp gọi là cành thứ cấp. Rễ cà phê phân bố chủ yếu ở 0 – 30 cm và rộng xung quanh tán. Rễ chính mọc sâu 60 – 100 cm, rễ nhánh mọc theo hướng xiên ngang. Rễ rất thích hợp với vùng đất thoáng khí, tơi xốp, hàm lượng mùn cao. Khi pH thấp và hàm lượng nhôm tự do cao (> 50 ppm) có thể làm chết rễ tơ cà phê vối. Phiến lá to trung bình, chiều rộng từ 10-15cm, dài từ 20-30cm, hình bầu dục, hình mũi mác hoặc hình trứng, mũi nhọn, phiến lá gợn sóng, đuôi lá nhọn, mép là thường gợn sóng, có màu xanh sáng hoặc đậm. 23
33. Hoa mọc trên các nách lá ngang thành từng cụm, khoảng từ 1-5 cụm, mỗi cụm có từ 1-5 hoa, hoa có màu trắng, rất thơm, 5 cánh hoa đều, nhị ở đỉnh, xen kẽ với cánh hoa bầu có 2 ô mỗi ô chưa 1 noãn. Thời gian lúc cho hoa cho tới khi quả chin kéo dài từ 9-10 tháng. Quả hình tròn hoặc hình trứng, núm quả nhỏ, trên quả có nhiều gân dọc, có 2 nhân khi chín có màu đỏ hoặc hồng. Khối lượng trung bình 100 hạt ở độ ẩm 12% là từ 13-16g. Tỷ lệ quả tươi/ nhân biến động từ 4-6 lần tùy theo vùng trồng và điều kiện chăm sóc Hạt có dạng hình tròn, dày, màu xanh bạc, xanh lục hoặc xanh nâu tùy loại hoặc cách chế biến. Hạt cà phê vối có chiều dài từ 6-8mm, rộng từ 6-7mm nhỏ hơn so với hạt cà phê chè và cà phê mít. Bố phận thường sử dụng là hạt cà phê bên cạnh đó người ta cũng có thể sử dụng lá cà phê. 6.3 Thành phần hóa học của hạt cà phê Cà phê sống chứa:[13], [17], [23], [25] - Glucid: có nhiều (chiếm hơn một nửa so với dược liệu khô kiệt) trong đó có 5-8% đường khử và saccharose, ít mantol, polysaccharide (ranfinose và stachyose), galactomanan, xylan, araban, hemicellulose, cellulose. Không chứa tinh bột trong hạt già. - Lipid: 10-15% gồm các glycerid của các acid palmitic, stearic, oleic và linoleic. Phần không xà phòng hóa (5%) có sterol và diterpen: cafestol và kahweol. - Các loại acid có trong cà phê gồm: Acid isoclorogenic, acid oxalic, acid citric và acid malic (có ít), acid ursolie, acid neoclorogenic (acid cafeyl – 5 – quinic), acid cryptoclorogenic (acid cafeyl – 4 – quinic), acid clorogenic. Trong đó, acid clorogenic là thành phần có nhiều nhất trong hạt cà phê xanh chiếm từ 5-10%. Trong cà phê, acid clorogenic thường kết hợp với cafein dưới dạng phức chất của kali và cafein clorogenat. Trong cà phê có chứa các ester khác của acid quinic và các acid cùng họ với các cafeic như acid p.coumaric và acid ferulic. 24
34. Các hợp chất nitơ có trong cà phê gồm: Protid (chiếm 10-15%); trigonelin; các base có nhân purin như cafein (1-2.5%), xanthin, guanine, adenine và theobromin. Hình 1. 6 Cấu trúc phân tử của acid clorogenic Cafein có trong nhiều loài Coffea như: C. canephora (1,5 - 2,5 có khi tới 3%), C. arabica 0,8-1,5%. Một số loài cà phê hoang dại không có cafein. Chúng có ở nhiều bộ phận khác nhau của cây như trong lá có 0,5 - 1,0% (có nhiều trong lá non); hoa có 0,5-0,9%; thân có 0,08%; thịt quả có 0,9%. Hình 1. 7 Cấu trúc phân tử của Cafein. Lá và quả chưa chín của loài Coffea canephora chứa acid pipecolic cùng với prolin và hydroxyprolin. Trong quả chín của loài Coffea canephora còn chứa chất bay hơi gồm nhiều thành phần trong đó có hexanal 21%; 2(E) – hexenal 11%; 3 – methyl – 1 – butanol 9%; 3 – methyl – 1 – butanal 8,5%; 1 – hexanol 8,4%; decanal 0,19%; Me hexanoat 0,33%; pulegon 0,44%; α – isomenthon 0,45%; 2 – nonanon 0,55%. Hoa của loài Coffea canephora chứa một số hợp chất hợp có nito như các dẫn chất phenylethan và các epoxygeraniol (2, 3 – epoxygeraniol và 6, 7 – epoxygeraniol). Cà phê rang có chứa nhiều thay đổi về hóa học: Nước giảm khoảng 5% so với lúc chứa rang. Chất vô cơ không thay đổi. Glucid thay đổi nhiều Saccharose có phần chuyển hóa, nhiều chất hòa tan xuất 25
35. hiện do các polysaccharide không hòa tan chuyển hóa. Các acid clorogenic bị phân hủy một phần, nhất là các đồng phân không tạo ra phức với cafein. Cafein có phần bị thăng hoa. Trigonelin giảm đi với sự xuất hiện của amid nicotinic (từ 2 mg% ở cà phê sống nay lên tới 13-43 mg% ở cà phê rang). Các chất thơm trong cà phê rang Coffea canephora (I) và Coffea arabica (II) là (mg/kg) Bảng 1. 4 Các chất thơm trong cà phê rang Coffea canephora và Coffea arabica Hàm lượng trong Hàm lượng STT Tên chất Coffea canephora trong (mg/kg) Coffea Arabica (mg/kg) 1 2 – furfurylthiol 1,73 1,08 2 methional 0,095 0,24 3 3 – mercapto – 3 – 0,115 0,13 methylbutyl format 4 2 – ethyl – 3,5 – 0,94 0,33 dimethylpyrazin 5 2,3 – diethyl – 5 – 0,31 0, 095 methylpyrazin 6 guaicol 28,2 4,2 7 4 – vinylguaicol 177,7 64,8 8 4 – ethylguaiacol 18,1 1,63 9 vanillin 16,1 4,8 10 (E) - β – damescenon 0,205 0,195 11 4- hydroxyl – 2,5 – dimethyl – 0,63 1,47 3(2H) – furanon 12 5 – ethyl – hydroxyl – 4 – 0,085 0,16 methyl – 2 (5H) – furanon 13 5 – ethyl – 4- hydroxyl – 2 – 14,3 17,3 methyl – 3(2H) – furanon 6.4 Tác dụng dược lý Tác dụng dược lý đã được nghiên cứu của cây cà phê [13], [17], [23] Theo tài liệu nước ngoài, quả cà phê tươi có tác dụng hạ sốt, lợi tiểu, hạt cà phê rang là đồ uống có tác dụng kích thích. Cafein là hoạt chất chính trong hạt cà phê. Nó các tác dụng kích thích thần kinh trung ương, hệ tim mạch, lợi tiểu và làm giãn cơ trơn. 26
36. Đối với hệ thần kinh trung ương, Cafein có tác dụng mạnh nhất trong các methylxanthin. Người dùng cafein hoặc đồ uống có chứa cafein cảm thấy tỉnh táo, mất buồn ngủ, ít mệt mỏi và suy nghĩ minh mẫn. Cafein dùng với liều lớn thì kích thích thần kinh trung ương càng phát triển, xuất hiện trạng thái bồn chồn, lo lắng, mất ngủ. Ở những người quen dùng cà phê, những triệu chứng này nhẹ hơn. Liều cao làm xuất hiện co giật cục bộ hoặc toàn thân. Cafein còn có tác dụng kích thích hô hấp đặc biệt trong trường hợp bệnh lý như hô hấp bị ức chế bởi các opioid hoặc hô hấp cheyne stokes. Đối với hệ tim mạch, cafein có tác dụng làm giảm trở kháng ngoại vi, kích thích tim. Liều 250-300 mg cafein gây nên nhịp tim nhanh, huyết áp tăng nhẹ cả huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trương, nhưng cũng với liều trên đối với những người thường xuyên dùng cà phê thì các triệu chứng trên không xuất hiện. Ở nồng độ cao hơn, cafein có tác dụng làm tăng nhịp tim rõ rệt, ở những người mẫn cảm có thể xuất hiện loạn nhịp tim, hiện tượng này cũng gặp ở những người dùng quá nhiều đồ uống có cafein. Tuy vậy, ở những người khỏe mạnh bình thường, nguy cơ xuất hiện loạn nhịp tim do cafein là rất thấp. Đối với cơ trơn, cafein có tác dụng làm giãn cơ trơn khí phế quản đặc biệt đối với khí phế quản bị co thắt như ở những bệnh nhân hen xuyễn. Trên lâm sàng hoặc trong các mô hình gây co thắt khí phế quản thực nghiệm. Đối với cơ vân, cafein có tác dụng tăng cường khả năng làm việc của cơ bắp ở người. Cafein với liều 6 mg/kg làm tăng khả năng chạy đua của những vận động viên trượt tuyết. Đối với hệ tiết niệu, cafein tăng cường sự hình thành nước tiểu, gia tăng tốc độ lọc của cầu thận và tăng lượng máu qua thận. Công dụng của cà phê đã được nghiên cứu [5], [13], [17], [23] Cà phê được dùng làm đồ uống dưới dạng chiết hãm bằng nước sôi từ bột hạt cà phê rang hoặc dưới dạng cà phê hòa tan. Uống cà phê làm mất buồn ngủ, giúp tinh thần tỉnh táo, giảm cảm giác mệt mỏi. Còn dùng làm thuốc lợi tiểu, chữa phù thũng, giúp tiêu hóa. Uống quá nhiều đồ uống có cà phê gây rối loạn tiêu hóa được xem là do chất cafeotoxin, một thành phần độc bay hơi được hình thành trong quá trình rang cà phê và chỉ có một phần bay hơi. Alkaloid cafein và các dạng muối như cafein citrate và cafein nitri benzoate được dùng trong trường hợp cấp cứu ngộ độc opioid và các thuốc gây ngủ khác. Trong cuộc sống, hạt cà phê sống được giã nát ngâm với rượu uống chữa tê thấp, sốt rét. Cà phê rang uống có tác dụng tiêu mỡ, tiêu độc rượu và thuốc phiện. 27
37. Chương II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu 1.1 Mẫu nghiên cứu Hạt cà phê được thu hoạch vào tháng 6 năm 2019 ở Buôn Ma Thuật, làm sạch, sấy khô ở 50 oC đến khối lượng không đổi và bảo quản. Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật học bởi bộ môn dược liệu- dược cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Hình 2. 1 Cây cà phê vối (Coffea canephora) Hình 2. 2 Hạt cà phê vối (Coffea canephora) 28
38. 1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 1 kg hạt cà phê sau khi thu hoạch được làm sạch và sấy khô ở 50oC. Hạt cà phê được nghiền nhỏ, tiến hành chiết xuất bằng ethanol (EtOH) 70 %, lặp lại 3 lần và gộp dịch chiết, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết toàn phần ethanol. Cao chiết này được phân tán vào nước cất tỷ lệ 1:1 và chiết phân bố lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetate và n- butanol (mỗi dung môi 3 lần). Các phân đoạn được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được phân đoạn tương ứng là n-hexane, ethyl acetate và n-butanol. 1.3 Động vật thí nghiệm Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng chủng Swiss có trọng lượng trung bình là 22.5 ± 2,5 g được mua từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, khỏe mạnh. Chuột được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 30C với chu kỳ sáng 12 giờ và tối 12 giờ, cho ăn thức ăn tiêu chuẩn (được cấp từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương) trong 3 - 4 ngày để thích nghi với điều kiện môi trường trước khi tiến hành thí nghiệm. Hình 2. 3 Chuột nhắt trắng chủng Swiss. 29
39. 2. Phương tiện nghiên cứu 2.1 Hóa chất và thuốc thử - Acid ascorbic (99%, Sigma – Aldrich, Singapore) - 1,1 – diphenyl – 2 – picrylhydrazyl (DDPH, Sigma – Aldrich, Singapore) - Streptozotocin (250 mg, Aladdin, Trung Quốc) - Enzym - glucosidase - P-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) - 4-Nitrophenol (Sigma) - Gliclazide (DiamicronRMR 60 mg) - Dung môi: n-hexan, ethylacetat (EtOAc), n-buthanol (n-BuOH), ethanol (Trung Quốc), methanol (MeOH) (Merck), nước cất. - Các loại hóa chất khác đều đạt độ tinh khiết cao 2.2 Thiết bị và dụng cụ - Máy đo quang UV Aligent technologies Cary 60 UV – VIS, Mỹ. - Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal - Máy đo glucose huyết One Touch Ultra và que thử tương ứng. - Máy đo pH HANNA HI8314, Mỹ - Cân phân tích AY 220 của hãng Shimadzu, Nhật Bản. - Máy cô quay chân không Rovapor R- 210 (Buchi- Đức) - Máy khuấy từ của hãng Shimadzu, Nhật Bản. - Máy li tâm của hãng Shimadzu, Nhật Bản. - Giấy lọc (đường kính 11 cm), phễu lọc, đầu côn các loại - Cuvet (1 ml, 3 ml), Eppendorf 1,5 ml (50 chiếc/túi) - Micro pipet một đầu kênh 2-20 μL, 10-100 μL, 100-1000 μL. - Các dụng cụ khác sử dụng trong thực nghiệm: ống nghiệm, đầu côn, pipet, bình định mức, đũa thủy tinh, bếp từ, bình cầu, các loại cốc có mỏ dung tích 25 – 500ml . 30
40. 3. Phương pháp nghiên cứu Chuột được nuôi thích nghi Mẫu hạt cà phê xanh với điều kiện thí nghiệm Chiết bằng ethanol, cô quay chân không Gây ĐTĐ bằng cách tiêm màng bụng alloxan liều 150mg/kg Cao ethanol của hạt cà phê xanh Chiết phân đoạn Chuột có nồng độ glucose Cao chiết các phân huyết cao( >11,1 mmol/l) đoạn của hạt cà phê xanh Đánh giá tác dụng hạ Đánh giá tác dụng chống Đánh giá tác dụng ức chế đường huyết trên chuột oxy hóa theo phương enzyme α–glucosidas in đái tháo đường típ 2 pháp DPPH vitro Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu 3.1 Xây dựng mô hình chuột tiểu đường típ 2 Hình 2. 4 Chuột được tiêm màng bụng Alloxan monohydrate. 31
41. Chuột nghiên cứu khi mua về sẽ được nuôi 3-4 ngày để thích nghi với môi trường trước khi tiến hành thí nghiệm. Sau đó chúng được phân ngẫu nhiên thành 2 lô thí nghiệm. Lô 1 cho nhịn ăn 18 giờ, chuột sẽ được tiêm alloxan monohydrate bằng cách tiêm màng bụng với liều 150 mg/kg được pha trong nước muối sinh lý. Lô 2 được tiêm nước cất. Sau 72 giờ chuột được kiểm tra đường huyết. Chuột có giá trị đường huyết trên 11,1 mmol/l (đo lúc đói) được xem như thành công và sử dụng cho những thí nghiệm khảo sát khả năng hỗ trợ hạ đường huyết sau này. 3.2 Đánh giá tác dụng hạ glucose của dịch chiết hạt cà phê xanh Phân lô chuột tiến hành nghiên cứu: Chuột bị tiểu đường típ 2 được tiến hành phân lô để nghiên cứu khả năng hạ đường huyết khi xử lý với các mẫu nghiên cứu khác nhau. Mỗi nhóm chuột gồm 4 con được phân nhóm ngẫu nhiên. Nhóm 1: Nhóm chứng sinh lý, chuột bình thường, được cho uống nước cất. Nhóm 2: Nhóm chứng bệnh tiểu đường: Chuột bị tiểu đường do tiêm Alloxan. Nhóm 3: Nhóm đối chiếu chứng dương: Chuột tiểu đường được cho uống 5 mg/kg gliclazide (nhóm thuốc đối chứng dương) Nhóm 4: Chuột tiểu đường được cho uống 150 mg/kg thể trọng cao chiết hạt cà phê xanh. Nhóm 5: Chuột tiểu đường được cho uống 300 mg/kg thể trọng cao chiết hạt cà phê xanh. Các nhóm chuột được điều trị trong 28 ngày. Trọng lượng và đường huyết được xác định vào 8-9 giờ sáng vào các ngày thứ 0, ngày thứ 5, ngày thứ 10,ngày thứ 15, ngày thứ 25 và ngày thứ 28 (chuột cho nhịn ăn cả đêm trước khi đo). Sau khi đo các chỉ tiêu khoảng 60 phút chuột được cho ăn và uống nước bình thường. Cách pha mẫu: Cao chiết ethanol của hạt cà phê xanh được hòa tan trong nước với nồng độ thích hợp (liều 1: 0,15 g/ 20 ml và liều 2: 0,3 g/ 20 ml) sau đó cho chuột uống dựa vào cân nặng của chuột (0,2 ml/10g) theo liều ở nhóm 4 và nhóm 5. Phương pháp định lượng glucose huyết 32
42. Định lượng glucose huyết bằng kỹ thuật enzym. Glucose oxidase bị oxy hóa nhờ sự xúc tác của các enzym có trên bề mặt của vùng phản ứng giấy thử và đọc kết quả trên máy đo đường huyết On - Call Plus do hãng ACON Laboratories Inc, Mỹ sản xuất. Nguyên lý hoạt động Khi máu tiếp xúc với bề mặt của vùng phản ứng que thử, glucose (trong máu) sẽ phản ứng với oxy (trong không khí) nhờ xúc tác của enzym glucooxydase (có ở trên bề mặt vùng phản ứng của giấy thử) tạo acid gluconic và hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide vừa tạo ra sẽ oxy hóa thuốc nhuộm trên bề mặt vùng phản ứng làm biến đổi màu của giấy thử vùng phản ứng (từ màu kem chuyển dần sang màu xanh). Độ đậm màu xanh tuỳ thuộc vào nồng độ glucose chứa trong mẫu máu. Tiến hành Máy On – Call Plus đo lượng đường glucose trong máu toàn phần. Máu được thấm vào đầu trên của que thử và tự động hút vào vùng đo nơi phản ứng xảy ra. Gắn một que thử để bật máy. Nhấn nút C để chọn mã số chính xác với mã ghi trên lọ que thử. Tạo vết cắt trên đuôi chuột, bỏ giọt máu đầu, lấy giọt máu thứ 2. Mẫu máu dùng cho việc đo là 1µl, phải là một máu tròn đầy. Thấm nhẹ giọt máu vào điểm nhận máu trên đầu que thử. Sau 5 giây kết quả sẽ hiện thị trên màn hình. 3.3 Đánh giá tác tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết hạt cà phê xanh theo phương pháp DPPH Có nhiều phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro được sử dụng. Một trong số đó là phương pháp đánh giá khả năng quét gốc tự do 1,1- diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH) được áp dụng khá phổ biến và có giá trị nghiên cứu cao [63], [65]. Nguyên tắc Hợp chất 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa, dung dịch có màu tím đỏ phản ứng với 33
43. các chất chống oxy hóa để tạo ra phức hợp màu vàng không hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại bước sóng 517 nm. Khi cho chất cần đánh giá vào dung dịch này nếu chất đó có khả năng quét các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Tiến hành đo hấp thụ tại bước sóng 517 nm sẽ cho biết lượng DPPH còn lại sau phản ứng. Khả năng chống oxy hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dung dịch thử nghiệm so với chất đối chứng. Cách tiến hành Mẫu thử được pha thành các nồng độ khác nhau. Hỗn hợp phản ứng gồm: 170 µl dung dịch DPPH (nồng độ 0,24 mg/ml) trong methanol, 100 µl dịch thử các mẫu và 730 µl methanol được ủ ở 25oC tránh ánh sáng trong 15 phút, sau đó đem đo độ hấp thụ bằng máy quang phổ ở bước sóng 517 nm. Song song với mỗi mẫu thử, tiến hành đo mẫu chứng với cùng điều kiện và thành phần gồm: 830 µl methanol và 170 µl dung dịch DPPH (nồng độ 0,24 mg/ml trong methanol). Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Cách đánh giá kết quả Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Đánh giá tác dụng chống oxi hóa thông qua mật độ quang học (OD), từ đó tính được phần trăm ức chế (I%) và xác định được IC50 bằng phần mềm Sigma Plot 10.0. Tính I% (phần trăm ức chế) theo công thức sau [9]. − 풕 % = 풙 − 풐 Trong đó: I %: phần trăm ức chế Ac: Độ hấp thụ của mẫu chứng At: Độ hấp thụ của mẫu thử Ao: Độ hấp thụ của mẫu trắng (sử dụng methanol) Tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết được so sánh với chất chuẩn là acid Ascorbic. Giá trị chống oxy hóa IC50 của mẫu được tính dựa theo đồ thị nồng độ mẫu thử (C) và phần trăm ức chế (I%). 34
44. 3.4 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α–glucosidase in vitro của dịch chiết hạt cà phê xanh Thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym α–glucosidase in vitro của dịch chiết hạt cà phê xanh được tiến hành tại Viện công nghệ sinh học -Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam [39], [44], [46], [67]. Chuẩn bị hóa chất, thiết bị cần thiết: Hóa chất: Enzym α-glucosidase (CAS No 9001-42-7, Sigma) p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) (CAS No 3767-28-0, Sigma) 4-Nitrophenol (Sigma) (CAS No 100-02-7, Sigma) Dimethyl sulfoxide (CAS No 67-68-5, Sigma) Thiết bị: máy quang phổ BIOTEK – USA. Nguyên lý Enzym α-glucosidase xúc tác quá trình chuyển chất nền p-nitrophenyl-α- Dglucopyranoside thành α-D-glucose và p-nitrophenol có màu vàng. α-glucosidase p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside α-D-glucose + p-Nitrophenol Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng tại bước sóng 410 nm ở thời điểm 30 phút sau phản ứng, phản ánh lượng sản phẩm p-Nitrophenol sinh ra, qua đó phản ánh hoạt độ của enzym α-glucosidase. Phương pháp: Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase được thực hiện trên đĩa 96 giếng. Mẫu thử được pha loãng bằng DMSO và nước deion thành một dãy các nồng độ, nồng độ lần lượt phản ứng là 256, 64, 14, 4, 1 µg/ml hoặc pha loãng tiếp với mẫu hoạt tính nhỏ hơn 1 µg/ml. Acarbose được sử dụng làm chất tham khảo. Các thành phần phản ứng bao gồm 4 µl phosphate buffer 100 mM pH 6.8; 25 µl α-glucosidase 0.2 U/ml, 10 µl mẫu thử, 25 µl p-Nitrophenyl-α-D- glucopyranoside 2.5 mM. 35
45. Ở mẫu đối chứng, mẫu thử được thay bằng đệm phản ứng. Thí nghiệm được o ủ ở nhiệt độ 37 C. Sau 30 phút, phản ứng được dừng bằng 100 µg/ml Na2CO3. Độ hấp thụ được của phản ứng được xác định trên máy BIOTEK với bước sóng 410 nm (A). Cách đánh giá kết quả Khả năng ức chế enzym α - glucosidase của mẫu thử được xác định bằng công thức: (đố풊 풉ứ풏품)− ( ẫ풖 풕풉ử) Độ ức chế % = 풙 (đố풊 풉ứ풏품) IC50 là nồng độ ức chế 50% hoạt động enzym α-glucosidase, sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính Tablecurve. 4. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu nghiên cứu được lưu trữ và xử lý thống kê sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2010, phần mềm SigmaPlot 10.0 (Systat Software Inc, Mỹ) và TableCurve2Dv4. Số liệu được biểu diễn dưới dạng X ± SD (X: Giá trị trung bình; SD: độ lệch chuẩn). TableCurve2Dv4. Giá trị IC50 được tính dựa vào đồ thị và phương trình biểu diễn nồng độ của dịch chiết hạt cà phê xanh. 36
46. Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Kết quả 1.1 Quy trình chiết, tách hạt cà phê xanh bằng ethanol Hạt cà phê được thu hoạch vào tháng 6 năm 2019 ở Buôn Ma Thuật, làm sạch, sấy khô ở 50 oC đến khối lượng không đổi và bảo quản. 1 kg hạt cà phê sau khi thu hoạch được làm sạch và sấy khô ở 50oC. Hạt cà phê được nghiền nhỏ, tiến hành chiết xuất bằng ethanol (EtOH) 70 %, lặp lại 3 lần và gộp dịch chiết, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết toàn phần ethanol (512 g) đạt hiệu suất 51.2%. 1 kg hạt cà phê Cao chiết toàn phân EtOH (512 g) Chiết phân đoạn Cao n -hexane Cao ethyl acetate Cao n-butanol (142g) (72g) (218g) Kết quả quá trình chiết, tách hạt cà phê 1.2 Xây dựng mô hình tiểu đường típ 2 thực nghiệm Chuột được chọn là chuột nhắt trắng chủng Swiss, được mua từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, khỏe mạnh và trưởng thành, khối lượng trung bình là 22,5 ± 2,5 g, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 3 con ( tách riêng đực, cái). Những lô chuột được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 30C với chu kỳ sáng 12 giờ và tối 12 giờ, cho ăn thức ăn tiêu chuẩn (được cấp từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung 37
47. ương) trong 3 - 4 ngày để thích nghi với điều kiện môi trường trước khi tiến hành thí nghiệm. Trên thế giới có nhiều nghiên cứu sử dụng alloxan để gây tiểu đường, tuy nhiên về liều sử dụng, đường dùng và động vật thí nghiệm công bố có nhiều điểm còn chưa tương đồng. Qua nghiên cứu tài liệu, chúng tôi nhận thấy các nghiên cứu thường sử dụng liều tiêm màng bụng là 100-200 mg/kg trên chuột nhắt trắng và liều tiêm tĩnh mạch từ 60-100 mg/kg trên chuột nhắt trắng. Trên cơ sở tổng quan tài liệu và một số thử nghiệm thực tế, chúng tôi lựa chọn động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng, gây mô hình bằng cách tiêm màng bụng alloxan monohydrate với liều là 150mg/kg (cho kết quả tốt nhất gây tiểu đường với glucose huyết trên 11,1 mmol/l và tỷ lệ tử vong là 0%) Bảng 3. 1 Sự thay đổi nồng độ glucose huyết trước và sau 72 giờ tiêm Alloxan Chỉ số đường Chỉ số đường Chuột huyết trước khi huyết sau khi Tỷ lệ thành công tiêm alloxan tiêm 72 giờ (%) (mmol/l) (mmol/l) Lô 1 ( 150 mg/kg) 6,5 ± 0,54 16,66 ± 1,83* 72 % Lô 2 ( nước cất) 6,38 ± 0,67 6,44 ± 1,03# 0% (*: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô 2, P<0,05,; # Khác biệt không có ý nghĩa thống kê) Chuột sau khi tiêm alloxan liều 150 mg/kg có sự tăng lên rõ rệt về chỉ số đường huyết sau 72 giờ thí nghiệm với tỷ lệ thành công là 72%( 25 con), trong khi lô chứng âm không thấy có sự tăng lên về chỉ số đường huyết. Kết quả trên tương tự với nhiều nghiên cứu trên thế giới sử dụng các phương pháp gây tiểu đường ở chuột. Như vậy có thể khẳng định chúng tôi đã xây dựng thành công mô hình tiểu đường và có thể sử dụng cho các nghiên cứu đánh giá khả năng hỗ trợ hạ đường huyết tiếp theo. 1.3 Tác dụng của cao chiết hạt cà phê xanh trên chuột nhắt thực nghiệm Với mô hình đã được xây dựng trong phần phương pháp nghiên cứu, các chỉ số được ghi chép lại được trình bày ở bảng dưới đây: 38
48. Bảng 3. 2 Chỉ số đường huyết của chuột tiểu đường do Alloxan gây ra trước và trong 28 ngày điều trị bằng thuốc và cao chiết hạt cà phê. Ngày Thay Ngày 0 Ngày 15 Ngày 28 Nhóm đổi (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (n = 4 con) (%) Nhóm 1: Nhóm chứng sinh lý 6,9 ± 0,52 6,3 ± 1,13 6,75 ± 1,27 ↓ 2,17 Nhóm 2: tiểu đường do alloxan 15,2 ± 1,18 14,65 ± 0,52 15,7 ± 0,64* ↑ 3,29 Nhóm 3: tiểu đường do alloxan + 5 mg/kg 16,1 ± 1,05 13,8 ± 2,69 12,08 ± 0,32 ↓ 24,97 Gliclazide Nhóm 4: tiểu đường do alloxan + Cao 18,22 ± 1,61 15,5 ± 1,58 12,38 ± 0,46 ↓ 32,05 chiết – 150 mg/kg Nhóm 5: tiểu đường do alloxan + Cao 16,68 ± 1,30 13,4 ± 2,14 10,67 ± 0,95 ↓ 36,03 chiết – 300 mg/kg ( : sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô 2, P<0,05,; * Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm 1) Bảng trên cho thấy, nhóm 1 chứng sinh lý (chuột được cho uống nước cất) nồng độ đường huyết ổn định, không có sự thay đổi nhiều với giá trị ngày đầu là 6,9 ± 0,52 (mmol/l) và ngày thứ 28 là 6,75 ± 1,27 (mmol/l) lượng đường huyết giảm 2,17% so với ngày đầu làm thí nghiệm. Nhóm 2 tiểu đường do alloxan (chuột được cho uống nước cất) nồng độ đường huyết thay đổi ít, ở ngày thứ nhất là 15,2 ± 1,18 (mmol/l) và ngày thứ 28 là 15,7 ± 0,64 (mmol/l) (tăng 3,29%) chứng tỏ chuột vẫn ở trạng thái bệnh lý tiểu đường. Ở cả 3 nhóm 3,4,5 đều có sự giảm xuống rõ rệt về nồng độ đường huyết ở ngày đầu tiên và ngày thứ 28 làm thí nghiệm. Cụ thể, ở nhóm 3 tiểu đường do alloxan và được điều trị bằng gliclazide nồng độ đường huyết giảm đáng kể từ 16,1 ± 1,05 (mmol/l) giảm còn 12,08 ± 0,32 (mmol/l) (giảm 24,97 % so với ngày đầu làm thí nghiệm), nhóm 4 và 5 là nhóm tiểu đường do alloxan và được điều trị bằng cao chiết hạt cà phê xanh với liều lần lượt là 150 mg/kg và 300 mg/kg cho thấy có tác dụng hạ đường huyết sau 28 ngày điều trị. Nhóm 4 được điều trị bằng cao chiết với liều 150 mg/kg thì đường huyết của chuột từ 18,22 ± 1,61(mmol/l) giảm còn 12,38 ± 0,46 (mmol/l) còn nhóm 5 được điều trị bằng cao chiết với liều gấp đôi là 300 mg/kg thì đường huyết ngày 39
49. thứ 28 của thí nghiệm là 10,67 ± 0,95 (mmol/l). nồng độ đường trong máu của nhóm 4 và nhóm 5 ở ngày thứ 28 làm thí nghiệm giảm lần lượt 32,05% và 36,03% so với ngày đầu tiến hành thí nghiệm. Như vậy việc sử dụng cao chiết EtOH của hạt cà phê xanh cho thấy tác dụng hạ đường huyết trên mô hình chuột tiểu đường do alloxan gây ra. Cho thấy hạt cà phê xanh có tiềm năng trong việc phòng ngừa và hỗ trợ điều trị tiểu đường. Bên cạnh đó chúng tôi cũng tiến hành ghi chép về trọng lượng cửa chuột trước và sau khi điều trị. Bảng 3. 3 Trọng lượng của chuột trước và sau 28 ngày điều trị Ngày 0 Ngày 28 (g) (g) Nhóm 1: Nhóm chứng sinh lý 19,36 ± 0,65 26,1 ± 1,10 Nhóm 2: Tiểu đường do alloxan 20,41 ± 0,77 25,44 ± 1,49* Nhóm 3: Tiểu đường do alloxan + 5 mg/kg Gliclazide 20,22 ± 0,32 24,56 ± 0,46* Nhóm 4: Tiểu đường do alloxan + Cao chiết – 150 20,41 ± 0,23 23,94 ± 1,39* mg/kg Nhóm 5: Tiểu đường do alloxan + Cao chiết – 200 20,16 ± 0,22 25,19 ± 0,23* mg/kg (*: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê, P>0,05,) Trọng lượng của chuột là một trong số các chỉ tiêu cần xét đến khi đánh giá hiệu quả tác động của các chất được thí nghiệm trên chuột. Trọng lượng trung bình của chuột khi đưa vào thí nghiệm nằm trong khoảng 22,5 ± 2,5 g tại ngày 0. Sau 28 ngày điều trị trong lượng trung bình của chuột tăng lần lượt là 26,1 ; 25,44 ; 24,56 ; 23,94 ; 25,19 tương ứng ở các nhóm chứng sinh lý, chứng âm, chứng dương, nhóm sử dụng cao chiết liều 150 mg/kg và nhóm sử dụng cao chiết liều 300 mg/kg. Trọng lượng của chuột có sự tăng lên nhưng không có sự khác biệt về mặt thống kê. Điều này chứng tỏ việc sử dụng cao chiết từ hạt cà phê xanh không gây ảnh hưởng đến trọng lượng của chuột thí nghiệm. 40
50. 1.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết hạt cà phê xanh theo phương pháp DPPH Tác dụng chống oxy hóa in vitro trên mô hình quét gốc tự do DPPH của các mẫu thử cao chiết toàn phần và các phân đoạn n-Hexan, EtOAc và n-Butanol và mẫu chứng được trình bày ở hình sau. Cao chiết toàn phần Phân đoạn n-Hexane 300 600 250 500 200 400 300 (µg/mL) (µg/mL) 150 độ độ 100 200 Nồng Nồng 50 100 0 0 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Phần trăm ức chế (%) Phần trăm ức chế (%) Phân đoạn Butanol Phân đoạn EtOAc 140 70 120 60 100 50 80 40 (µg/mL) (µg/mL) 60 30 độ độ 40 20 Nồng Nồng 20 10 0 0 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 Phần tram ức chế (%) Phần tram ức chế (%) Axit ascorbic 30 25 20 (µg/mL) 15 độ 10 Nồng 5 0 0 20 40 60 80 100 Phần tram ức chế (%) Hình 3. 1 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do DPPH của cao chiết toàn phần, các phân đoạn của hạt cà phê xanh và axit ascorbic. 41
51. Bảng 3. 4 Giá trị IC50 của cao chiết toàn phần và các phân đoạn của hạt cà phê xanh và axit Ascorbic về khả năng quét gốc tự do DPPH. Mẫu Cao chiết n-Hexan EtOAc n-Butanol Acid Ascorbic thử toàn phần IC50 155,86 ± 2,01 295,12 ± 2,12 35,26 ± 3,9 60,25 ± 1,13 14,94 ± 1,03 (µg/ml) Từ kết quả ở bảng 3.4 cho thấy tác dụng quét gốc tự do DPPH in vitro của các phân đoạn phụ thuộc vào nồng độ, ở các nồng độ khác nhau của cao chiết thể hiện khả năng quét gốc tự do khác nhau. Ở nồng độ càng cao thì khả năng quét gốc tự do của cao chiết càng lớn. Trong các mẫu thử, phân đoạn EtOAc thể hiện tác dụng quét gốc tự do DPPH tốt nhất với IC50 là 35,26 ± 3,9 µg/ml, sau đó là phân đoạn Butanol và cao chiết toàn phần hạt cà phê với IC50 lần lượt là 60,25 ± 1,13 µg/ml và 155,86 ± 2,01 µg/ml. Phân đoạn n-Hexan thể hiện tác dụng chống oxy hóa yếu hơn với giá trị IC50 thu được là 295,12 ± 2,12 µg/ml. Song song với mẫu thử tiến hành tương tự với mẫu chứng là acid Ascorbic thu được giá trị IC50 là 14,94 ± 1,03 µg/ml cho thấy thí nghiệm hoạt động ổn định. 1.5 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α–glucosidase in vitro của dịch chiết hạt cà phê xanh Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các mẫu thử được trình bày ở bảng sau: Bảng 3. 5 Kết quả IC50 của cao chiết của hạt cà phê xanh và Acarbose. Tên mẫu Giá trị IC50 (µg/ml) Cao chiết toàn phần 2,40 ± 0,11 n-Hexan 2,25 ± 0,06 EtOAc 2,21 ± 0,04 n-Butanol 5,90 ± 0,56 Acarbose 124,6 ± 1,10 42
52. Qua bảng trên cho thấy cao chiết toàn phần và các phân đoạn đều có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase, đặc biệt là phân đoạn etyl acetat có biểu hiện hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase mạnh với giá trị IC50 là 2,21± 0,04 µg/mL. Tiếp đến là cao hexan với giá trị IC50 là 2,25 ± 0,06 µg/mL và phân đoạn n-Butanol với giá trị IC50 là 5,90 ± 0,56 µg/mL. Ngoài ra cao EtOH của cà phê cũng có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase với giá trị IC50 là 2,40 ± 0,11 µg/mL. Chất đối chứng được sử dụng trong thí nghiệm là Acarbose có giá trị IC50 là 124,6 ± 1,10 µg/mL. Chất đối chứng dương Acarbose hoạt động ổn định trong thí nghiệm. 43
53. 2. Bàn luận Bệnh tiểu đường típ 2 đang dần trở thành bệnh lý phổ biến nhất trên giới, chúng sinh ra nhiều biến chứng cực kỳ nguy hiểm trên nhiều cơ quan của cơ thể như trên tim, thận, mạch máu và để lại các biến chứng nghiêm trọng ( mù mắt hoặc phải cắt cụt chi) [58]. Bệnh tiểu đường típ 2 là bệnh lý đặc trưng bởi sự đề kháng insulin và sự suy giảm chức năng tiết insulin của các tế bào β tuyến tụy. Dựa trên cơ sở này nên nhiều mô hình tiểu đường thực nghiệm đã được xây dựng theo xu hướng sự đề kháng với insulin hoặc làm giảm chức năng của các tế bào β tuyến tụy. Bên cạnh đó, nhu cầu về việc nghiên cứu các thuốc điều trị tiểu đường ngày càng tăng cũng là một trong số các nguyên nhân thúc đẩy việc xây dựng mô hình tiểu đường thực nghiệm. Hiện nay đã phát hiện được nhiều chất có tác dụng gây tiểu đường được sử dụng để gây mô hình tiểu đường thực nghiệm, với mỗi mô hình được xây dựng đều ẩn chứa các ưu điểm và những hạn chế. Alloxan là một trong những tác nhân gây tiểu đường phổ biến thường được sử dụng để đánh giá khả năng chống tiểu đường của cả hợp chất tinh khiết và chiết xuất thực vật trong các nghiên cứu liên quan đến bệnh tiểu đường. Alloxan là một trong số những dẫn chất dẫn xuất của axit uric. Alloxan có cấu trúc tương tự glucose gây độc tế bào [72].Bệnh tiểu đường do alloxan gây ra là một dạng tiểu đường phụ thuộc insulin xảy ra do việc sử dụng hoặc tiêm alloxan cho động vật [38], [79]. Nó được chứng minh gây mô hình tiểu đường thành công trên nhiều loài động vật như chuột, thỏ, khỉ, mèo, chó [66], [81] tạo mô hình bằng cách tiêm tĩnh mạch hoặc tim màng bụng với liều alloxan phù hợp với từng loài động vật. Tuy nhiên, việc tiêm màng bụng alloxan với liều đơn ở mức 150-200 mg/kg có vẻ hiệu quả nhất [41]. Vì vậy, mô hình gây tiểu đường được sử dụng trong nghiên cứu này là tiêm màng bụng alloxan với liều là 150 mg/kg thu được chuột có đường huyết phù hợp để tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng hỗ trợ điều trị tiểu đường của cao chiết hạt cà phê xanh. Qua kết quả thu được cho thấy cao chiết hạt cà phê xanh có tác hạ đường huyết tương đương với thuốc đối chứng dương là gliclazide trên chuột bị tiểu đường do alloxan. Cơ chế gây tiểu đường của alloxan là ức chế chọn lọc bài tiết insulin do glucose gây ra thông qua ức chế đặc hiệu glucokinase, cảm biến glucose của tế bào β và gây ra tình trạng tiểu đường phụ thuộc insulin thông qua khả năng gây ra sự hình thành ROS, dẫn đến hoại tử chọn lọc của các tế bào β tuyến tụy. Cơ chế 44
54. gây tiểu đường này của alloxan là do các tính chất hóa học của alloxan, sự hấp thu tế bào chọn lọc và tích lũy alloxan bởi tế bào β tuyến tụy. Như vậy, một trong những cách để phòng ngừa và giảm các triệu chứng của bệnh tiểu đường là sử dụng các chất chống oxy hóa. Các chất oxy hóa trong dược liệu có đặc tính quét các gốc tự do là do sự góp mặt của nhóm hydroxyl trong công thức cấu tạo của chúng [10]. Phương pháp DPPH là một trong các phương pháp được sử dụng rộng rãi trong các mô hình nghiên cứu đánh giá khả năng chống oxy hóa của các chất trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới [12]. Vì thế trong nghiên cứu này chúng tôi cũng sử dụng phương pháp DPPH để đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các mẫu thử. Chất đối chứng chúng tôi sử dụng là acid Ascorbic thu được giá trị IC50 của acid Ascobic là 14,94 ± 1,03 µg/ml. Qua nghiên cứu đã được tiến hành thì kết quả thu được cho thấy tác dụng của cao chiết hạt cà phê xanh ở các phân đoạn đều có tác dụng quét các gốc tự do DPPH và nồng độ cao chiết càng cao thì khả năng quét các gốc tự do cũng tăng lên. Trong đó, cao chiết etyl acetat có tác dụng tốt nhất trong các phân đoạn chiết của hạt cà phê xanh với IC50 là 35,26 ± 3,9 µg/ml. điều này chứng tỏ rằng, trong cao chiết phân đoan EtOAc của hạt cà phê có chứa nhiều chất có khả năng quét các gốc tự do DPPH hơn các cao chiết phân đoạn khác. Kết quả nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa của cà phê trong nghiên cứu này cũng tương đồng với các nghiên cứu trên thế giới. Babova O và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng quét gốc DDPH của cao chiết ethanol hạt cà phê xanh với 2 loài Coffea Arabica và Coffea Canephora cho thấy các cao chiết này có tác dụng chống oxi hóa cao, đặc biết là ở loài Coffea Arabica [32]. Alexandros Priftis và cộng sự đã chứng minh dịch chiết từ cà phê xanh và cà phê rang đều có tác dụng quét gốc tự do mạnh, ngăn ngừa được các tổn thương ADN do các gốc tự do gây ra [53]. Tương tự, Ningjian Liang và cộng sự chứng minh các hoạt chất có trong cà phê như caffeine, axit chlorogenic, melanoidins, trigonelline, cafestol và kahweol đều có tác dụng chống oxy hóa trên động vật và trên người [47]. Richtier Gonçalves cũng chứng minh dịch chiết cà phê có tác dụng chống oxy hóa thông qua tác dụng quét gốc tự do DPPH và ABTS (2, 2’- azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) [59]. Bên cạnh liệu pháp chống oxy hóa thì một hướng khác để điều trị được thực hiện trong nghiên cứu là ức chế enzym α-glucosidase. Enzym α-Glucosidase là một enzym nằm trong màng tế bào đường ruột, tham gia vào bước cuối cùng của 45
55. quá trình tiêu hóa, enzym này giúp xúc tác quá trình phân hủy các đường disaccharide thành monosaccharide [70].Vì vậy, các chất ức chế enzym này có vai trò quan trong trong việc điều trị bệnh tiểu đường bằng cách làm giảm quá trình hấp thu đường từ đường tiêu hóa vào máu. Các chất ức chế enzym α-glucosidase đã được sử dụng làm thuốc điều trị bệnh tiểu đường típ 2 như Acarbose, miglitol, voglibose [11]. Acarbose là thuốc tân dược được sử dụng rộng rãi hiện nay và cũng là một chất chứng dương trong các nghiên cứu về tác dụng ức chế enzym α- glucosidase. Trong nghiên cứu này acarbose được sử dụng làm chất chứng dương cho các thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế enzym α-glucosidase. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy cao chiết toàn phần và các phân đoạn hạt cà phê xanh có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase mạnh hơn nhiều so với acarbose với giá trị IC50 là 2,40 ± 0,11 µg/mL thấp hơn gần 52 lần so với IC50 của chất đối chứng (124,6 ± 1,10 µg/mL). Như vậy, trong cao chiết hạt cà phê xanh có chứa nhiều hợp chất có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase. Trong đó cao chiết phân đoạn etyl acetat có biểu hiện hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase mạnh nhất với giá trị IC50 là 2,21± 0,04 µg/mL, sau đó là cao hexan với giá trị IC50 là 2,25 ± 0,06 µg/mL và phân đoạn n-Butanol với giá trị IC50 là 5,90 ± 0,56 µg/mL thấp hơn rất nhiều so với acarbose. Vì vậy, hướng nghiên cứu tiếp theo sẽ tiến hành tách chiết các hợp chất từ cao chiết hạt cà phê xanh để phân lập các hợp chất có khả năng ức chế enzym này với giá trị IC50 cao. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đồng với các công bố trước đây. Shin-Duk Kim đã phân lập hợp chất β-carboline alkaloid norharman (9H- pyrido[3.4- b]indole) từ hạt cà phê và cho thấy đây là hợp chất ức chế mạnh enzym α-Glucosidase với IC50 là 180 ± 3.2 µM [43]. Marilisa Alongi và cộng sự cũng chứng minh cà phê rang có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase với IC50 là 180 ± 2.92 mg/ml [29]. Ngoài ra, Zheng Yinan và cộng sự cho thấy dịch chiết nước của hạt cà phê ức chế enzym α-glucosidase có thể là do hợp chất chính acid chlorogenic đảm nhiệm [62]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng chỉ ra rằng cao chiết hạt cà phê có khả năng ức chế enzym α-glucosidase, là bước ngăn cản quá trình hấp thụ glucose, giúp hỗ trợ điều hòa đường huyết. 46
56. Chương IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 1. Kết Luận Từ các mục tiêu đã nêu ra trong nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu và kết quả thực nghiệm đưa đến các kết luận sau: - Sau 28 ngày chuột tiểu đường được điều trị bằng cao chiết hạt cà phê xanh với 2 mức liều là liều 150 mg/kg và 300 mg/kg, nồng độ đường huyết giảm rõ rệt ngay cả ở liều 150 mg/kg. điều này chứng tỏ rằng cao chiết hạt cà phê có tác dụng hỗ trợ điều trị tiểu đường. - Tác dụng chống oxy hóa của cao chiết hạt cà phê ở các phân đoạn khác nhau: sau khi tiến hành nghiên cứu chúng tôi đã xác định được tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH của cao chiết các phân đoạn của hạt cà phê xanh . Với giá trị IC50 là 35,26 ± 3,9 µg/ml thì cao chiết hạt cà phê xanh phân đoạn etyl acetat có tác dụng chống oxy hóa tốt nhất trong các phân đoạn cao chiết hạt cà phê. - Tác dụng ức chế enzym α – glucosidase của cao chiết hạt cà phê xanh thấp hơn rất nhiều so với chất đem đi so sánh là acarbose. Cao chiết toàn phần và các phân đoạn hạt cà phê xanh có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase mạnh hơn nhiều so với acarbose với giá trị IC50 là 2,40 ± 0,11 µg/mL. Trong đó cao chiết phân đoạn etyl acetat có biểu hiện hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase mạnh nhất với giá trị IC50 là 2,21± 0,04 µg/mL 2. Đề Xuất Từ những kết quả thu được của nghiên cứu về hạt cà phê xanh, chúng tôi có một số đề xuất như sau: - Cần tiến hành thêm các nghiên cứu để biết rõ về thành phần hóa học cũng như công thức của các chất có trong hạt cà phê xanh, đặc biệt là xác định các hoạt chất có trong cao chiết phân đoạn etyl acetat của hạt cà phê xanh. - Tiếp tục tiến hành thêm các nghiên cứu để phân lập các hoạt chất chính từ hạt cà phê xanh để làm rõ hơn về tác dụng và cơ chế của loài hạt cũng như loài cây này trong việc điều trị tiểu đường. - Kết quả của nghiên cứu đã chúng minh rằng hạt cà phê xanh có tác dụng hỗ trợ điều trị tiểu đường vì vậy cần tiến hành thêm các nghiên cứu đánh giá độ tính cấp và độ tính bán trường diễn của cao chiết từ hạt cà phê hoặc các bộ phận khác từ cây cà phê. 47
57. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Quy trình kỹ thuật trồng cà phê, 10TCN;84-87. 2. Bệnh viện Bạch Mai, (2017), Tiểu đường, NXB Y học, pp. 411 -416. 3. Bệnh viện Nội tiết Trung ương. Báo cáo Hội nghị tổng kết hoạt động của Dự án phòng chống tiểu đường quốc gia năm 2012 và triển khai kế hoạch năm 2013, 2013. 4. Bộ môn Y học cổ truyền, Trường Đại học Y Hà Nội, (1999), Tiểu đường, NXB Y học, pp. 542-543. 5. Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, Trung tâm khuyến nông quốc gia, (2012), kỹ thuật trồng-chăm sóc-thu hoạch và phê với bền vững ở Việt Nam, NXB Nông Nghiệp, pp. 6. Bộ Y tế, (2009), Tiểu đường, NXB Giáo Dục, pp. 179 – 191. 7. Bộ Y Tế. Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị tiểu đường typ 2, 2017. 8. Bộ Y Tế. Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị tiểu đường typ 2, 2017. 9. Bùi Thanh Tùng, Đặng Kim Thu, Nguyễn Thanh Hải, (2016), "Tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym acetylcholinesterase của curcuminoid", Tạp chí Dược Học, 56 (12), pp. 8-12. 10. Bùi Thanh Tùng, Đặng Kim Thu, Phạm Thanh Hải, Nguyễn Thanh Hải, (2018), "Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của các phân đoạn dịch chiết quả Lựu (Punica granatum Linn)", Tạp chí Y Dược cổ truyền Việt Nam, 5 (18), pp. 59-63. 11. Bùi Thanh Tùng, Đặng Kim Thu, Phạm Thanh Hải, Nguyễn Thanh Hải, (2018), "Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của các phân đoạn dịch chiết quả Lựu (Punica granatum Linn))", " Tạp chí Y Dược cổ truyền Việt Nam, 5(18) pp. 59- 63. 12. Đàm Trung Bảo, (2001), "Các gốc tự do", Tạp chí Dược Học, 6 pp. 29-30. 13. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, et al, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, pp. 297-300. 14. Đỗ Quốc Việt, Trần Văn Sung, Nguyễn Thanh Thủy, (2006), "Sơ bộ nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cây Chuối hột (Musa balbisiana Colla.) trên chuột thực nghiệm", Tạp chí Dược học, 5 pp. 8-10. 15. Lại Văn Chuyển, Vương Hải, Nguyeễn Trọng Hiệu. Điều tra khoanh vùng sương muối gây hại cây cà phê tỉnh Sơn La. Báo cáo tổng hợp đề tài nghiên cứu cấp tỉnh, 1999. 16. Lê Thành Phước. Chất chống oxy hóa và nguyên tố vi lượng thiết yếu. Tài liệu chuyên đề D5K66, 2016. 17. Nguyễn Sỹ Nghị, Trần An Phong, (1996), Cây cà phê Việt Nam, NXB Nông Nghiệp, pp. 18. Nguyễn Thị Đông. Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết phân đoạn cloroform thân cây ý dĩ trên động vật thực nghiệm. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2013. 48
58. 19. Nguyễn Văn Mùi, (2015), Enzym học, NXB ĐHGHN, pp. 361. 20. Phạm Xuân Vinh. Nghiên cứu kỹ thuật bón phân komix nhằm tăng năng xuất cho vườn cây cà phê robusta tại huyện Krong Ana tỉnh Đắc Lắc. Luận văn thạc sĩ nông nghiệp: Trường đại học Nông Nghiệp I, 2007. 21. Phùng Thanh Hương, Nguyễn Xuân Thắng, (2010), "Tác dụng hạn chế tăng glucose huyết của thân cây Mướp đắng trên một số mô hình gây tăng glucose huyết thực nghiệm", Tạp chí Dược học, 1 pp. 22-25. 22. Viện Dược Liệu, (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và kỹ thuật, pp. 23. Võ Văn Chi, (1991), Cây thuốc An Giang, Ủy ban khoa học kỹ thuật An Giang, pp. 24. Đỗ Thị Thanh Bình, Nguyễn Thị Khanh, (2006), Nội Tiết Học, NXB Y Học, pp. 25. Phạm Quang Anh. Hệ sinh thái cà phê Đắc Lắc In: học B c k, ed: Trường Đại học Tổng Hợp Hà Nội- Trường Đại học Tổng Hợp Huế, 1985. 26. Bộ Y Tế. Hormon và thuốc điều trị rối loạn nội tiết In: học D l, ed: NXB Y học, 2012;303-304. Tài liệu Tiếng Anh 27. A.I.Pinho, C.S.Oliveira, F.L.Lovato, E.P.Waczuk, et al, (2017), "Antioxidant and mercury chelating activity of Psidium guajava var. pomitera L. leaves hydroalcoholic extract", Journal Toxicol Environ Health A, 80 pp. 1301-1313. 28. Akbarzadeh, (2007), "Induction of diabetes by Streptozotocin in rats", Indian Journal of Clinical Biochemistry, 22 (2), pp. 60-61. 29. Alongi Marilisa, Anese Monica, (2018), "Effect of coffee roasting on in vitro α- glucosidase activity: Inhibition and mechanism of action", Food research international, 111 pp. 480-487. 30. American Diabetes Association, (2017), "Standards of Medical Care in Diabetes", 40 (1), pp. 11-75. 31. Arulmozhi DK, Veeranjaneyulu A, Bodhankar SL, (2004), "Neonatal streptozotocin-induced rat model of Type 2 diabetes mellitus: A glance", Indian Journal of Pharmacology, 36 (4), pp. 217. 32. Babova Oxana, Occhipinti Andrea, Maffei Massimo E, (2016), "Chemical partitioning and antioxidant capacity of green coffee (Coffea arabica and Coffea canephora) of different geographical origin", Phytochemistry, 123 pp. 33-39. 33. Babu, P.A., (2007), "A database of 389 medicinal plants for diabetes", Bioinformation, 1 (4), pp. 130. 34. C.C.W, (2010), "Yeast α-glucosidase inhibition by isoflavonones from plants of Leguminosae as an in vitro alternative to acarbose ", Journal of agricultural and food chemistry, 58 pp. 9988-9991. 35. Carr, A.C., B. Frei (1999), "Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans", Am J Clin Nutr, 69 (6), pp. 1086-1107. 36. D.S.LE, K. Kusama, S. Yamamoto, (2006), "Acommunity based picture of type 2 diabetes mellitus in Vietnam", J Atheroscler Thromb, 13 pp. 16-20. 49
59. 37. Diarra, (2016), "Medicinal Plants in Type 2 Diabetes: Therapeutic and Economical Aspect", International Journal of Preventive Medicine, 7 pp. 56. 38. G. Gomori, M.G. Goldner, (1945), "Acute nature of alloxan damage", Proc Soc Exp Biol Med, 58 (3), pp. 232-233. 39. Haimin Chen X Y, Wei Lin, Li Zheng, Weiwei Zhang (2004), "A New Method for Screening a-Glucosidase Inhibitors and Application to Marine Microorganisms", Pharmaceutical Biology, 42 (6), pp. 416-421. 40. Hui H, Tang G, Go VLW, (2009), "Hypoglycemic herbs and their action mechanisms", Chin Meld, 4 (1), pp. 11-14. 41. I.F. Federiuk, H.M. Casey, M.J. Quinn, M.D. Wood, et al, (2004), "Induction of type-1 diabetes mellitus in laboratory rats by use of alloxan: route of administration, pitfalls, and insulin treatment", Compar Med 54 (3), pp. 252-257. 42. International Diabetes Foudation, (2017), "Diabetes Atlas Eighth Edition", pp. 43. Kim Shin-Duk, (2015), "α-Glucosidase inhibitor isolated from coffee", J Microbiol Biotechnol, 25 (2), pp. 174-177. 44. Kim Y. M., Wang M. H., Rhee H. I., (2004), "A novel a-glucosidase inhibitor from pine bark", Carbohydr Res, 339 pp. 715-717. 45. Kumar S, Singh R, Vasudeva N, Sharma S, (2012), "Acute and chronic animal models for the evaluation of anti-diabetic agents", Cardiovascular Diabetology, 11 (1), pp. 9. 46. Li T., Zhang X. D., Song Y. W., Liu J. W., (2005), "A Microplate-Based Screening Method for α-Glucosidase Inhibitors", Nat Prod Res Dev, 10 pp. 1128- 1134. 47. Liang Ningjian, Kitts David D, (2014), "Antioxidant property of coffee components: assessment of methods that define mechanisms of action", Molecules, 19 (11), pp. 19180-19208. 48. McIntosh CHS, Pederson R, (1999), "Noninsulin-dependent animal models of diabetes mellitus", Experimental models of diabetes, pp. 337-398. 49. Molyneux, Philip (2004), "The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity", Songklanakarin J Sci Technol, 26 (2), pp. 211-219. 50. Nguyen, Q.-V., J.-B. Eun, (2011), "Antioxidant activity of solvent extracts from Vietnamese medicinal plants", Journal of Medicinal Plants Research, 5 (13), pp. 2798-2811. 51. Oztürk Y, Altan VM, Yildizoğlu-Ari N, (1996), "Effects of experimental diabetes and insulin on smooth muscle functions", Pharmacological reviews, 48 (1), pp. 69-112. 52. Pellegrino M, Christopher B, Michelle M, Gerard R, (1998), "Development of a new model of type II diabetes in adult rats administered with streptozotocin and nicotinamide", Diabetes, 47 pp. 224-229. 53. Priftis Alexandros, Stagos Dimitrios, Konstantinopoulos Konstantinos, Tsitsimpikou Christina, et al, (2015), "Comparison of antioxidant activity between green and roasted coffee beans using molecular methods", Molecular medicine reports, 12 (5), pp. 7293-7302. 50
60. 54. Rerup CC (1970), "Drugs producing diabetes through damage of the insulin secreting cells", Pharmacological reviews, 22 (4), pp. 485-518. 55. Shaw J E, Sicree R A, Zimmet P Z, (2010), "Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030", Diabetes Res Clin Pract, 87 (1), pp. 4-14. 56. Swanston-Flatt, (1990), "Tradational plant treatments for diabetes. Studies in normal and streptozotocin diabetic mice", diabetologia, 33 (8), pp. 462-464. 57. T.scully, (2012), "Diabetes in numbers", Natute, 485 (2-3), pp. 58. Uusitupa M, (2002), "Lifestyles matter in the prevention of type 2 diabetes", Diabetes Care, 25 (9), pp. 1650-1651. 59. VIEIRA, Thais Maria Ferreira de Souza, (2018), "Potential antioxidant of brazilian coffee from the region of Cerrado", Food Science and Technology, 38 (3), pp. 447-453. 60. Wadkar KA, Magdum CS, Patil SS, Naikwade NS, (2008), "Antidiabetic potential and Indian medicinal plants", Journal Herbal Meld and Toxical, 2 (1), pp. 45-50. 61. Young DA, Ho RS, Bell PA, Cohen DK, et al, (1990), "Inhibition of hepatic glucose production by SDZ 51641", Diabetes, 39 (11), pp. 1408-1413. 62. Zheng Yinan, Liu Keyue, Jia Guiyan, Li Huiping, et al, (2007), "Effect of hot- water extract of coffee seeds on postprandial blood glucose concentration in rats", pp. 63. Alam M N, Bristi N J, Rafiquzzaman M, (2013), "Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity", Saudi Pharm J, 21 (2), pp. 143-152. 64. Arsiningtyas I S, Gunawan-Puteri M D, Kato E, Kawabata J, (2014), "Identification of alpha-glucosidase inhibitors from the leaves of Pluchea indica (L.) Less., a traditional Indonesian herb: promotion of natural product use", Nat Prod Res, 28 (17), pp. 1350-1353. 65. Carocho M, Ferreira I C, (2013), "A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives", Food Chem Toxicol, 51 pp. 15-25. 66. Cruz A B, Jr., Amatuzio D S, Grande F, Hay L J, (1961), "Effect of intra-arterial insulin on tissue cholesterol and fatty acids in alloxan-diabetic dogs", Circ Res, 9 pp. 39-43. 67. Hakamata W, Kurihara M, Okuda H, Nishio T, et al, (2009), "Design and screening strategies for alpha-glucosidase inhibitors based on enzymological information", Curr Top Med Chem, 9 (1), pp. 3-12. 68. Halliwell B, (1994), "Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause, or consequence?", Lancet, 344 (8924), pp. 721-724. 69. Heim K E, Tagliaferro A R, Bobilya D J, (2002), "Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships", J Nutr Biochem, 13 (10), pp. 572-584. 70. Jung H A, Ali M Y, Choi J S, (2016), "Promising Inhibitory Effects of Anthraquinones, Naphthopyrone, and Naphthalene Glycosides, from Cassia obtusifolia on alpha-Glucosidase and Human Protein Tyrosine Phosphatases 1B", Molecules, 22 (1), pp. 51
61. 71. Ktorza A, Bernard C, Parent V, Penicaud L, et al, (1997), "Are animal models of diabetes relevant to the study of the genetics of non-insulin-dependent diabetes in humans?", Diabetes Metab, 23 Suppl 2 pp. 38-46. 72. Lenzen S, (2008), "The mechanisms of alloxan- and streptozotocin-induced diabetes", Diabetologia, 51 (2), pp. 216-226. 73. Lopez-Alarcon C, Denicola A, (2013), "Evaluating the antioxidant capacity of natural products: a review on chemical and cellular-based assays", Anal Chim Acta, 763 pp. 1-10. 74. Okada S, Ishii K, Hamada H, Tanokuchi S, et al, (1996), "The effect of an alpha- glucosidase inhibitor and insulin on glucose metabolism and lipid profiles in non- insulin-dependent diabetes mellitus", J Int Med Res, 24 (5), pp. 438-447. 75. Rai P K, Mehta S, Watal G, (2010), "Hypolipidaemic & hepatoprotective effects of Psidium guajava raw fruit peel in experimental diabetes", Indian J Med Res, 131 pp. 820-824. 76. Rattanachaikunsopon P, Phumkhachorn P, (2007), "Bacteriostatic effect of flavonoids isolated from leaves of Psidium guajava on fish pathogens", Fitoterapia, 78 (6), pp. 434-436. 77. Rees D A, Alcolado J C, (2005), "Animal models of diabetes mellitus", Diabet Med, 22 (4), pp. 359-370. 78. Sies H, (2015), "Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine", Redox Biol, 4 pp. 180-183. 79. Still W J, Martin J M, Gregor W H, (1964), "The Effect of Alloxan Diabetes on Experimental Atherosclerosis in the Rat", Exp Mol Pathol, 3 pp. 141-147. 80. Tadera K, Minami Y, Takamatsu K, Matsuoka T, (2006), "Inhibition of alpha- glucosidase and alpha-amylase by flavonoids", J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo), 52 (2), pp. 149-153. 81. Villarruel M C, Fernandez G, de Ferreyra E C, de Fenos O M, et al, (1982), "Studies on the mechanism of alloxan-diabetes potentiation of carbon tetrachloride- induced liver necrosis", Br J Exp Pathol, 63 (4), pp. 388-393. 82. Zaidun N H, Thent Z C, Latiff A A, (2018), "Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin", Life Sci, 208 pp. 111-122. 52