›

Khóa luận Đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong Rau đắng biển (Bacopa monnieri) thu hái tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC

pdf 61 trang thiennha21 18/04/2022 4400
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong Rau đắng biển (Bacopa monnieri) thu hái tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_danh_gia_ham_luong_triterpen_glycosid_tong_so_tron.pdf

Nội dung text: Khóa luận Đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong Rau đắng biển (Bacopa monnieri) thu hái tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG TRITERPEN GLYCOSID TỔNG SỐ TRONG RAU ĐẮNG BIỂN (Bacopa monnieri) THU HÁI TẠI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG TRITERPEN GLYCOSID TỔNG SỐ TRONG RAU ĐẮNG BIỂN (Bacopa monnieri) THU HÁI TẠI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn: 1. TS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG 2. TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH Hà Nội - 2020
  3. LỜI CẢM ƠN Bản luận văn được hoàn thành tại Khoa hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Phương và TS. Nguyễn Thị Thanh Bình. Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Thị Phương và TS. Nguyễn Thị Thanh Bình, PGS. TS. Nguyễn Hữu Tùng những người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, chu đáo, luôn động viên khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Dược liệu, PGS.TS. Phương Thiện Thương (Trưởng khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu) cùng toàn thể anh chị, bạn bè, cán bộ, nhân viên Khóa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đặc biệt là anh Nguyễn Đình Quân – người đã luôn theo sát, hướng dẫn cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em cũng xin gửi lời cảm ơn quý thầy cô trong Khoa Y-Dược đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt năm năm theo học tại trường. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên cạnh, ủng hộ, động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Cuối cùng em xin kính chúc các thầy cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Ánh
  4. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril Association of Official Analytical Hiệp hội các nhà Hóa phân AOAC Chemists tích High performance liquid HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography High performance liquid HPLC- Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography photodiode array PDA ghép nối detector mảng iod detetion R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi RSD(%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối TLTK Tài liệu tham khảo
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là Bảng 1.1 4 jujubogenin trong Rau đắng biển Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là Bảng 1.2 5 pseudojujubogenin trong Rau đắng biển Bảng 1.3 Cấu trúc một số hợp chất cucurbitacin 6 Một số phương pháp định lượng triterpen glycosid trong Bảng 1.4 15 Rau đắng biển Bảng 2.1 Danh sách các mẫu dược liệu Rau đắng biển thu thập 19 Bảng 3.1 Chương trình gradient 28 Bảng 3.2 Thời gian lưu tương đối của các bacosid 29 Bảng 3.3 Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống 30 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích của píc Bảng 3.4 32 bacosid A3 Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại 32 Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp 33 Hàm lượng tryterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid Bảng 3.7 34 A3) trong dược liệu Rau đắng biển thu hái tại Việt Nam
  6. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Hình ảnh cây và hoa Rau đắng biển 3 Hình 1.2 Cấu trúc của Luteolin và Apigenin 7 Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 11 Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC phân tích Rau đắng biển 28 Hình 3.2 Vị trí các píc bacosid trong Rau đắng biển 29 Hình 3.3 Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc của phương pháp 31 So sánh phổ UV của bacosid A3 trong mẫu thử và mẫu Hình 3.4 31 chuẩn
  7. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về cây Rau đắng biển 2 1.1.1. Vị trí, phân loại 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật 2 1.1.3. Phân bố 3 1.1.4. Bộ phận dùng 3 1.1.5. Thành phần hóa học 3 1.1.6. Một số tác dụng dược lý 7 1.2. Tổng quan về phương pháp HPLC 10 1.2.1. Nguyên tắc hoạt động 10 1.2.2. Cấu tạo HPLC 10 1.3. Những nghiên cứu về định lượng hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong Rau đắng biển 14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Đối tượng nghiên cứu 19 2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị 22 2.2.1. Chất chuẩn 22 2.2.2. Hóa chất 22 2.2.3. Thiết bị 22 2.3. Phương pháp nghiên cứu 23
  8. 2.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn 23 2.3.2. Xây dựng phương pháp định lượng bacosid tổng số trong Rau đắng biển 23 2.3.3. Áp dụng trên một số mẫu dược liệu Rau đắng biển 25 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu 26 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 27 3.1. Khảo sát điều kiện phân tích và quy trình xử lý mẫu 27 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích 30 3.2.1. Tính thích hợp hệ thống 30 3.2.2. Tính chọn lọc của phương pháp 30 3.2.3. Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 31 3.2.4. Độ lặp lại 32 3.2.5. Độ đúng 33 3.3. Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (Tính theo bacosid A3) trong Rau đắng biển 34 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 36 4.1. Về thu thập mẫu dược liệu 36 4.2. Về xây dựng phương pháp định lượng 36 4.3. Về kết quả định lượng triterpen glycosid tổng số trong các mẫu Rau đắng biển 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Rau đắng biển (Bacopa monnieri) là một loại thảo dược vị đắng, tính mát, có tác dụng kích thích thần kinh, trợ tim, thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, nhuận tràng [11, 13, 24, 26]. Ngày nay, ngoài việc sử dung rau đắng biển như một loại thức ăn, rau đắng biển được sử dụng như một vị thuốc trong các thang thuốc sắc, dịch ép tươi, tán bột sau phơi khô. Ngoài ra, trên thị trường Việt Nam hiện nay đã có một số chế phẩm đông dược được sản xuất từ vị thuốc này như: Hoạt huyết bổ máu Đại Bắc, thông huyết Tuệ Linh, chế phẩm phối hợp Ginkgo Giloba 6000 mg và Brahmi 3000 mg, Các nghiên cứu trong và ngoài nước đã cho thấy tác dụng nổi bật của rau đắng biển trên hệ thần kinh giúp cải thiện trí nhớ, tăng cường khả năng nhận thức, học hỏi là nhờ vào hoạt chất triterpen glycosid với 5 loại chính có trong rau đắng biển gồm: bacopasid I, bacosid A3, bacopasid II, bacopasid X và Bacopasaponin C [13, 21, 23, 26]. Hiện nay, ở nước ta việc đánh giá hàm lượng triterpen glycosid trong rau đắng biển còn chưa được tiêu chuẩn hóa. Hơn nữa, trong dược điển Việt Nam V chưa đề cập đến dược liệu rau đắng biển cũng như các thành phần hóa học trong dược liệu này. Do đó, việc định lượng hàm lượng các triterpen glycosid trong rau đắng biển là rất cần thiết. Theo Dược điển Mỹ (USP 40), chất chuẩn bacosid A3 được sử dụng để xây dựng quy trình chiết xuất và định lượng tổng các loại triterpen glycosid chính chiếm hàm lượng chủ yếu trong Rau đắng biển [41]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện công việc “Đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong Rau đắng biển (Bacopa monnieri) thu hái tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC” với mục tiêu: - Xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) bằng phương pháp HPLC. - Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) trong các mẫu dược liệu Rau đắng biển thu thập tại một số tỉnh ở Việt Nam. 1
  10. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây Rau đắng biển 1.1.1. Vị trí, phân loại Vị trí phân loại của loài Bacopa monnieri trong hệ thống phân loại thực vật học: Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta); Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida); Bộ: Hoa Môi (Lamiales); Họ: Hoa Mõm Chó (Scrophulariaceae); Chi: Bacopa; Loài: Monnieri (L.); [45] Rau đắng biển có tên khoa học là Bacopa monnieri (L.) Pennell., thuộc họ Hoa mõm chó (Scrophulariaccae), chi Rau đắng biển (Bacopa), có tên khoa học đồng nghĩa khác là Herpestis monnieri (L.) Rothm. Ở Việt Nam, Rau đắng biển còn được gọi là rau Sam trắng, Sam trắng [1, 10]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật Cây thảo, sống lâu năm, cao 10-20 cm. Thân nhẵn, phần gốc mọc bò, bén rễ ở những mấu, phần trên mọc đứng. Thân có vị đắng. Lá mọc đối, không cuống, hình trái xoan, mọng nước, dài 0,8-1,2 cm, rộng 3-5 mm, gốc thuôn, đầu tù, hai mặt nhẵn. Lá có màu xanh đậm ở trên mặt, xanh nhạt ở mặt dưới, một gân chính, gân phụ không rõ. Hoa màu trắng, mọc đơn độc ở kẽ lá trên một cuống dài. Hoa không đều, lưỡng tính mẫu 5. Cuống hoa dài 2,6-5,6 cm, không lông, hai lá bắc con hình dải, dài 0,6 cm, ở đỉnh cuống hoa. Bao hoa: năm lá đài rời, không đều, lá đài sau to nhất, hình trứng, có năm gân chính, dài 0,8 cm, rộng 0,5 cm, hai lá đài trước hình trứng, mũi nhọn, 3 gân chính, dài 0,7 cm, rộng 0,4 cm, hai lá đài bên nhỏ nhất, hình dải, 1 gân, có lông ở bìa, dài 0,6 cm, rộng 0,1 cm. Năm lá đài không đều, cao 5-6 mm, năm cánh hoa có màu tím nhạt, dính nhau ở thành ống. Bốn nhị, bầu không lông. Quả nang hình trứng, nhẵn, có đài còn lại, hạt nhỏ, có góc cạnh. Hạt nhiều, rất nhỏ, mùa hoa tháng 4-9 [6, 8, 10]. 2
  11. Hình 1.1 Hình ảnh cây và hoa Rau đắng biển [42, 43] 1.1.3. Phân bố Chi Bacopa tương đối lớn, có khoảng 70 loài, phân bố rải rác khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; song tập trung nhiều ở khu vực Trung và Nam Mỹ. Ở Việt Nam chỉ có 2 loài. Loài Rau đắng biển được coi là cây liên nhiệt đới, đồng thời cũng có thể thấy vùng cận nhiệt đới. Ở châu Á, rau đắng biển phân bố rộng rãi từ vùng Nam Trung Quốc, Việt Nam, Lào đến các nước khác ở Đông Nam Á. Ở Việt Nam, Rau đắng biển phân bố ở khắp các vùng đồng bằng và trung du miền Bắc và miền Nam. Cây ưa sáng, thường mọc trên đất ẩm, pha cát lẫn với các loại cỏ thấp ở bờ ruộng, bãi sông, bờ kênh mương, Cây ra hoa quả nhiều năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt. Cây còn có khả năng mọc chồi khỏe từ kẽ lá, kể cả phần còn sót lại sau khi cắt. Do đó, Rau đắng biển cũng bị coi là loại cỏ dại ảnh hưởng tới cây trồng [10]. 1.1.4. Bộ phận dùng Dược liệu Rau đắng biển là phần trên mặt đất dùng tươi hoặc phơi khô của cây Rau đắng biển [8, 10]. 1.1.5. Thành phần hóa học Thành phần hóa học chính có tác dụng dược lý của Bacopa monnieri là các triterpen glycosid, sterol, sterol glycosid, các phenylethan glycosid, cucurbitacin, alkaloid và flavonoid [10, 15]. Trong đó thành phần quan trọng là các hợp chất thuộc nhóm saponin và các saponin trong Bacopa monnieri được xác định là các triterpen glycosid nhóm dammaran (bacosids). 3
  12. 1.1.5.1. Triterpen glycosid Thành phần hóa học chính có hoạt tính trong B.monnieri là các hợp chất triterpen glycosid có cấu trúc nhân dammaran (bacosids) với aglycon là jujubogenin và pseudojujubogenin [21]. ( Bảng 1.1 và 1.2). Cấu trúc của các saponin này khác nhau về phần đường. Những saponin quan trọng bao gồm: bacosid A1, bacosid A2, bacosid A3[24, 34, 35], các bacopasaponin A-D [18, 20, 30, 31], các bacosaponin E và F [31], bacopasaponin G [20], bacopasaponin I và II [18], bacopasaponin III-V [17, 18, 20], bacopasaponin VI-VIII [41], bacopasaid N1, bacopasid N2 và bacopasid X [21]. Trong các saponin này, các bacopasaponin A, E, F và bacopasid VIII là các jujubogenin bisdesmosid [29]. Hơn nữa, hai triterpen glycosid nhóm drammaran được acyl hóa là bacomosaponin A và bacomosaponin B cũng đã được phân lập bằng kỹ thuật quang phổ [15]. Trong những năm đầu nghiên cứu về B.monnieri, thành phần hóa học đầu tiên trong B.monnieri được xác định là 3-(α-L-arabinopyranosyl)-O-β-D-glucopyranosid- 10,20-dihydroxy-16-keto-dammar-24-en thường được gọi là bacoside A đã được phân lập và được coi là thành phần có tác dụng lên hệ thần kinh giúp tăng cường trí nhớ. Sau đó, vào cùng thời điểm, người ta đã xác định bacosid B chỉ khác bacosid A ở góc quay quang học [15]. Tuy nhiên các nghiên cứu tiếp theo đã chỉ ra rằng bacosid A và bacosid B không phải là những hợp chất hóa học đơn lẻ, mà chúng được chứng minh là các hỗn hợp của triterpen glycosid. Nghiên cứu gần đây cho thấy bacosid A là hỗn hợp của bốn triglycosidic saponin: bacosid A3, bacosid II, 훼-L-arabinofuranosyl-(1→2)-(β- D-glucopyranosyl-(1→3)- 훼-L-arabinofuranosyl] jujubogenin (còn gọi là bacopasid X) và bacopasaponin C [21] và bacosid B là một hỗn hợp của bacopasid N1, bacopasid N2, bacopasid IV và bacopasid V. Bảng 1.1: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là jujubogenin trong rau đắng biển [41] 4
  13. Jujubogenin STT Tên chất R 1 Bacosid A3 β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-(훼-L-arabinofuranosyl (1→2))-O-(β-D-glucopyranosyl) 2 Bacopasid N1 β-D-glucopyranosyl-(1→3)- β-D-glucopyranosyl 3 Bacopasid IV β-D-glucopyranosyl-(1→3)- 훼-L-arabinofuranosyl 4 Bacopasid X 훼-L-arabinofuranosyl-(1→2)-(β-D-glucopyranosyl- (Bacopasaponin (1→3)- 훼-L-arabinofuranosyl C isomer) Bảng 1.2: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là pseudojujubogenin trong rau đắng biển [41] Pseudojujubogenin STT Tên chất R 5 Bacopasaponin C β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-(훼-L-arabinofuranosyl- (1→2))-훼-L-arabinofuranosyl 6 Bacopasid N2 β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl 7 Bacopasid II 훼-L-arabinofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl- (1→3))-β-D-glucopyranosyl 8 Bacopasid V β-D-glucopyranosyl-(1→3)-훼-L-arabinofuranosyl 1.1.5.2. Cucurbitacin Phần trên mặt đất của B.monnieri sau khi được chiết bằng methanol 50%, cô đặc và để qua đêm. Lấy phần dịch chiết đi lọc và phân đoạn liên tiếp với Ethyl Acetat (EtOAc) và n-Butanol (n-BuOH). Chiết xuất EtOAc đã được phân tích bằng sắc ký 5
  14. silicagel để thu được các cucurbitacin: cucurbitacin A-D, cucurbitacin E và ba phenylethanoid glycosid gồm: monnierasid I, III và plantiosid B [28]. Bảng 1.3: Cấu trúc một số hợp chất cucurbitacin [28] R=R2=H, R1=OH Bacobitacin A R=R1=H, R2=Ac Bacobitacin B R=B, R1=R2=H Bacobitacin C R=B, R1 = OH, R2 = H Bacobitacin D 1.1.5.3. Flavonoid Ngoài các thành phần đã được phân lập và xác định cấu trúc đã nêu trên, có nhiều nghiên cứu xác định được thành phần flavonoid trong rau đắng biển là luteolin và apigenin [14]. Một nghiên cứu được thực hiện bởi Anju Varshney và các cộng sự, tiến hành định lượng Luteolin trong các bộ phận khác nhau ở phần trên mặt đất của rau đắng biển thu hái ở các vùng của Ấn Độ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và thu được kết quả hàm lượng Luteolin tại thân của B. monnieri tại vùng Chembur, Mumbai là 0,0940 ± 0,0047 mg/ 500g; trong khi hàm lượng Luteolin trong lá B. monnieri thu hái tại cùng Bhayander, Maharashtra là 0,01691 ± 0,0024 mg/ 500g [12]. Ngoài ra, một nghiên cứu khác cũng định lượng hàm lượng Luteolin và Apigenin ở các phần trên mặt đất trong dịch chiết Methanol (MeOH) của B. monnieri bằng sắc ký lỏng pha đảo lần lượt là 0,22% và 0,45% [11]. 6
  15. Luteolin Apigenin Hình 1.2. Cấu trúc của Luteolin và Apigenin 1.1.5.4. Các thành phần khác: Ngoài các triterpen glycosid đã được phân lập và xác định cấu trúc, một số thành phần hóa học khác cũng được tìm thấy trong rau đắng biển. Thành phần đầu tiên được phân lập và xác định trong monnieri là alkaloid brahmi. Sau đó, các alkaloid tiếp theo cũng được xác định là nicotin, herpestin [16]. Tiếp theo, hàng loạt các báo cáo phân lập được các glycosid: asiaticosid và thanakunicid [19]. 1.1.6. Một số tác dụng dược lý Rau đắng biển là một loại thảo dược lâu năm được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền như một loại thuốc bổ thần kinh để cải thiện trí thông minh và trí nhớ, tăng cường chức năng não và giúp gia tăng tuổi thọ. Theo y thuật Ayurveda, một hệ thống y học được phát triển tại Ấn Độ cách đây hơn 3000 năm, Rau đắng biển đã được sử dụng lần đầu tiên để bảo vệ thần kinh chống lại chứng mấy trí nhớ. Trong suốt bốn thập kỉ qua, Rau đắng biển và các hợp chất được phân lập từ nó ngày càng thu hút rất nhiều các nhà nghiên cứu hóa sinh vì các tác dụng dược lý bảo vệ thần kinh đáng chú ý đã được xác định như: tác dụng chống lại chứng mất trí nhớ, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer; chống trầm cảm, lo âu; chống co giật và chống oxy hóa, [29] Ngoài ra, nhiều nghiên cứu về dược lý cũng chỉ ra rằng, B.monnieri mang nhiều tác dụng khác như tác dụng chống viêm, chống vi khuẩn Helicobacter Pylori, thuốc chống giun, chống ung thư, an thần và làm ổn định hoạt động của các tế bào mast, [8, 15]. 1.1.6.1. Tác dụng cải thiện trí nhớ và khả năng nhận thức, học hỏi. Những nghiên cứu trong dịch chiết cồn của các hợp chất được phân lập từ B.monnieri đã chứng minh tác dụng giúp tăng cường nhận thức và trí nhớ của nó trên 7
  16. hệ thần kinh nhờ vào sự có mặt của bacosid A và bacosid B [15]. B.monnieri cũng được xác định là có hoạt tính kháng cholinesterase giúp tăng việc tiếp nhận thông tin và khả năng học tập của chuột bị gây mất trí nhớ bởi scopalamin, natri nitrit và BN52021 (yếu tố kích hoạt tiểu cầu, PAF,chất đối kháng thụ thể) [29]. Một nghiên cứu được thực hiện bởi Uabundit và cộng sự trên mô hình động vật mắc bệnh Alzeimer do dùng chất AF64A ( một chất độc thần kinh đặc hiệu cho tế bào thần kinh) cho thấy, chiết xuất của B.monnieri có thể giảm thiểu sự suy giảm trí nhớ và thoái hóa các tế bào thần kinh ở đồi hải mã. Chiết xuất B.monnieri giúp cải thiện thời gian thoát khỏi ra trong mô hình thử nghiệm mê cung nước Morris và giảm nhẹ sự giảm của các tế bào thần kinh và mật độ của nó. Những phát hiện này cho thấy rằng B.monnieri giúp tăng cường nhận thức và bảo vệ thần kinh chống lại bệnh Alzheimer [27]. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu của Viện Dược Liệu ở Việt Nam cũng tham gia nghiên cứu đánh giá tác dụng cải thiện khả năng học tập và trí nhớ trong cao chiết cồn ở rau đắng biển trên mô hình chuột nhắt trắng bị suy giảm trí nhớ do thiếu máu não cục bộ, một tròn những mô hình mất trí nhớ giống bệnh Alzheimer [5]. Bên cạnh những nghiên cứu trên mô hình động vật của Rau đắng biển, cũng có nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng dược lý trên hệ thần kinh người. Một nghiên cứu được tiến hành trên 76 người có độ tuổi từ 40 đến 65 của Steven Roodentrys đánh giá chức năng của bộ nhớ và mức độ lo lắng. Kết quả của thử nghiệm đã chỉ ra rằng, rau đắng biển có ảnh hưởng đáng kể trong việc ghi nhớ các thông tin mới [33]. Một nghiên cứu khác của C.Stough và cộng sự cũng đưa ra kết quả rằng cao chiết Rau đắng biển với liều sử dụng là 300mg/ngày giúp cải thiện quá trình xử lý thông tin, học tập bằng lời nói và quá trình ghi nhớ ở người [32]. 1.1.6.2. Tác dụng đối với những rối loạn tâm thần Từ thời xa xưa rau đắng biển đã được biết đến như một loại thảo dược giúp điều trị các rối loạn tâm thần và có thể là một thuốc hướng thần tiềm năng. Với sự phát triển của khoa học hiện đại ngày nay, rất nhiều bằng chứng đã được đưa ra để chứng minh điều này. Nghiên cứu của Yun Zhon và cộng sự đã chỉ ra được tác dụng chống trầm cảm và lo lắng của cao chiết rau đắng biển và một số hoạt chất của nó bao gồm: bacosid I,II, bacopasaponin C [39]. Một nghiên cứu khác gần đây của Manavi và cộng sự (2010) cũng chứng minh rằng với liều dùng 80mg/kg của rau đắng biển có tác dụng chống lại rối loạn tâm thần bao gồm cả trầm cảm và lo lắng [22]. 8
  17. Cao chiết Rau đắng biển (chứa 25% bacosid A) có tác dụng an thần tương đương benzodiazepin và lorazepin. Hoạt tính này tùy thuộc vào liều lượng sử dụng và đặc biệt là không gây phản ứng phụ như tạo sự lãng quên, nhầm lẫn như lorazepam và còn giúp cải thiện trí nhớ [13]. Ngoài ra, Rau đắng biển cũng được biết đến với tác dụng có lợi đối với bệnh động kinh. Gần đây, một nghiên cứu đã khẳng định về vai trò kiểm soát cơn động kinh thông qua việc giảm thụ thể GABA ở vùng thể vân và vùng hải mã trong não chuột cống trắng của loài cây này và hoạt chất bacosid A được phân lập từ nó [26]. 1.1.6.3. Tác dụng chống oxy hóa Rau đắng biển đã được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa dựa trên thử nghiệm não chuột thông qua việc thay đổi nồng độ của các enzym superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT) và glutathion peroxidase (GPX). Khi so sánh với hoạt tính chống oxy hóa của deprenyl , rau đắng biển tác dụng vào mọi khu vực trong não bộ, trong khi đó deprenyl chỉ giới hạn tại khu vực vỏ não và khu vực trán [41]. Rau đắng biển được coi như một loại thảo dược bảo vệ não chống lại các tổn thương oxy hóa. Một nghiên cứu khác ở Việt Nam vào năm 2009 của Nguyễn Thị Thu Hương và các cộng sự về tác dụng chống oxy hóa invitro của Rau đắng biển tại trung tâm Sâm và Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh của 5 phân đoạn chiết từ rau đắng biển là cao toàn phần (cao RĐB); cao chiết bằng ethanol (cao EtOH); cao chiết bằng methanol (cao MeOH); saponin toàn phần chiết từ dược liệu (Sdl) và saponin toàn phần chiết từ rau đắng biển (Sc). Các kết quả chỉ ra rằng, mẫu Sdl và Sc có hoạt tính dập tắt gốc tự do tương đương nhau nhờ tác dụng ức chế hình thành MDA tỷ lệ thuận với nồng độ mẫu. Tuy nhiên Sc có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn Sdl. Mẫu cao RĐB, cao EtOH và cao MeOH cũng có hoạt tính dập tắt gốc tự do tương đương nhau. Nhìn chung, cao MeOH có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn cao RĐB và cao EtOH, còn cao RĐB và cao EtOH có hoạt tính chống oxy hóa xấp xỉ nhau [7]. 1.1.6.4. Các tác dụng khác Ngoài những tác dụng trên, rau đắng biển cũng được chứng minh mang các tác dụng khác như: Tác dụng trên huyết áp, chống ung thư, trên hô hấp và huyết áp, Cao khô chiết cồn của cây rau đắng biển có tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư Walker carcinosarcoma 256 khi tiêm bắp cho chuột cống trắng. Ancaloid bradmin chiết từ cây Rau đắng biển với liều 0,5 mg/kg ở mèo có tác dụng làm hạ huyết áp. 9
  18. Tuy nhiên, liều nhỏ hơn lại gây tăng huyết áp nhẹ do co mạch và kích thích cơ tim [8]. 1.2. Tổng quan về phương pháp HPLC 1.2.1. Nguyên tắc hoạt động Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào yếu tố đó. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được detector phát hiện và chuyển qua bộ phận xử lý số liệu. Thời gian chất phân tích được rửa giải được ghi lại nhờ detector gọi là thời gian lưu. Thời gian lưu phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích và thành phần của pha động và pha tĩnh [3, 4, 23]. Pha tĩnh Trong HPLC, pha tĩnh là các hợp chất được gắn lên chất mang thường là các hạt hình cầu có đường kính 1,5 – 10 μm, có nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích. Pha tĩnh có độ phân cực khác nhau, dựa vào độ phân cực của pha tĩnh mà người ta phân ra hai loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo. - Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực (các silica có chứa nhóm alkyl ít cacbon mang nhóm chức phân cực –CN, -NH2, ), pha động không phân cực. - Sắc ký pha đảo: pha tĩnh không phân cực (các silica gắn mạch cacbon dài C18, C8, ), pha động phân cực. Pha động Pha động trong HPLC là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc ký. Trong sắc ký pha thuận, pha động là các dung môi ít phân cực như hexan, isopropylether, ngược lại trong sắc ký pha đảo, pha động là các dung môi phân cực như nước, methanol, acetonitril, 1.2.2. Cấu tạo HPLC Nguyên tắc cấu tạo của một bộ máy sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận kết nối với nhau [2, 3, 4, 23]. - Hệ thống cấp pha động; - Bơm sắc ký lỏng; 10
  19. - Bộ phận tiêm mẫu; - Cột sắc ký; - Đầu dò detector (nhận tín hiệu); - Bộ phận thu nhận và xử lý số liệu. Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao [15] 1.2.2.1. Hệ thống cấp pha động Tất cả các dung môi trong pha động dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích nhằm mục đích tránh làm hỏng sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra píc tạp trong quá trình phân tích. Pha động trước khi đưa vào bình chứa pha động cần được lọc qua màng lọc 0,45μm và loại bỏ khí hòa tan trong pha động (ví dụ: N2, O2) bằng cách: rung siêu âm, sục khí trơ Heli có khả năng hòa tan thấp trong pha động. Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra: 11
  20. - Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của píc thay đổi - Trong trường hợp bọt quá nhiêu, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể bơm sẽ không hút được dung môi khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động. Trong bất kì trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai. 1.2.2.2. Bơm sắc ký lỏng Hệ thống bơm sắc ký lỏng phải giữ cho pha động luôn luôn chảy với một lưu lượng không đổi. Ống dẫn và hệ thống nối phải là loại chịu được áp suất sinh ra do hệ thống bơm. Máy sắc ký lỏng hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar (407atm), tốc độ dòng từ 0,1-9,999 ml/phút. Hệ thống được điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp hai chế độ vận hành của pha động bao gồm: - Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký - Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2-4 loại dung môi được đặt trong các bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình chạy sắc ký theo chương trình đã định trước (chương trình dung môi) nhờ bộ trộn. Tốc độ dòng pha động có thể thay đổi theo áp suất của bơm. 1.2.2.3. Bộ phận tiêm mẫu Mẫu được tiêm thẳng vào pha động ở ngay đầu cột với áp suất cao nhờ sự điều chỉnh dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu cho phép thể tích tiêm từ 5 μL - 100μL. Có hai cách tiêm mẫu vào cột là tiêm mẫu bắng tay hoặc tiêm mẫu tự động. Khi tiêm bằng tay có thể gây sai số do thể tích tiêm vào vòng chứa mẫu không đủ. 1.2.2.4. Cột sắc ký Một máy HPLC bình thường có hai cột : cột phân tích và cột bảo vệ - Cột phân tích Hiện nay, cột pha tĩnh thường được làm bằng thép không gỉ, ngoài ra còn có cột bằng thủy tinh hoặc chất dẻo. Chiều dài cột khoảng 10-30 cm, đường kính trong cột 1-10 mm, hạt nhồi cột cỡ 5-10 μm, Ngoài ra còn một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt. Lò cột giúp đảm bảo nhiệt độ ổn định cho cột. Chất nhồi cột: đường kính 1,8-5 μm có thể dùng cột ngắn 3-10 cm và nhỏ (đường kính trong 1 – 4,6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao. Chất nhồi cột tùy 12
  21. theo loại cột và kiểu sắc ký. Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha thường) hoặc là silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxid, polyme xốp, chất trao đổi ion. - Cột bảo vệ: Cột được nhồi các hạt nhồi cột và pha tĩnh tương tự như cột phân tích, nhưng ngắn hơn và rẻ hơn, dài 7,5 mm và giá chỉ bằng 1/10 cột phân tích thông thường; đặt trước cột sắc kí để loại bỏ bớt tạp và gia tăng tuổi thọ của cột phân tích. 1.2.2.5. Đầu dò (Detector) - Đầu dò là một bộ phận phát hiện chất phân tích khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo bản chất của chất phân tích mà sử dụng detector phù hợp. Một số loại detector hiện đang được sử dụng: - Detector quang phổ tử ngoại từ 200 đến 380 nm. - Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV/VIS) từ 190 đến 900 nm, áp dụng cho những chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại hoặc khả kiến. - Detector huỳnh quang sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang (tính chọn lọc). Đối với những chất có bản chất không phát huỳnh quang, cấu tạo dẫn xuất của chất phân tích có khả năng bắt huỳnh quang. - Hiện nay, có một số detector hiện đại hơn như: detector Diod Array, ELSD (detector tán xạ bay hơi) các detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất. - Ngoài ra còn một số loại detector khác là: + Detector chỉ số khúc xạ (RI): thường dùng để định lượng các hợp chất đường. + Detector điện hóa: Detector hoạt động dựa trên nguyên tắc đo điện thế, độ dẫn, điện phân, 1.2.2.6. Bộ phận ghi tín hiệu Bộ phận ghi tín hiệu giúp ghi lại tín hiệu phát hiện do detector truyền sang. Trước kia, người ta sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích píc, chiều cao, Ngày nay, các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên 13
  22. máy tính giúp lưu lại tất cả các thông số, phổ dồ và các thông số của píc như tính đối xứng, hệ số phân giải, trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD, 1.3. Những nghiên cứu về định lượng hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong Rau đắng biển Triterpen glycosid là thành phần chính và đã được nhiều nghiên cứu chứng minh tạo lên tác dụng trên hệ thần kinh của Rau đắng biển nên những hợp chất triterpen glycosid thường được lựa chọn làm chất đánh dấu hóa học trong tiêu chuẩn hóa dược liệu Rau đắng biển. Hầu hết các nghiên cứu trên thế giới đều sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng các bacosid trong Rau đắng biển. Một số chương trình chạy sắc ký trong các tài liệu tham khảo được tổng kết như bảng 1.4. 14
  23. Bảng 1.4. Một số phương pháp định lượng triterpen glycosid trong Rau đắng biển Phương Phương Dung TT pháp phân Điều kiện sắc ký TLTK pháp chiết môi chiết tích + Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm), kích thước hạt: 5µm + Pha động: ACN : TFA 0,1% (35:65, tt/tt) Chiết hồi + Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút 1 HPLC-DAD lưu cách Methanol [25] thủy + Thể tích tiêm mẫu: 20µL + Detector: PDA (205 nm) + Cột: Luna RP-18 (150 mm x 4,6 mm), kích thước hạt: 5µm + Cột bảo vệ: Phenomenex RP-18 2 HPLC-DAD Siêu âm Methanol [40] + Pha động: ACN : H3PO4 0.2% (35:65, tt/tt), điều chỉnh pH đến 3,0 bằng NaOH 5M 15
  24. + Thể tích tiêm: 20µL + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Detector: PDA (205 nm) + Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm) + Pha động: ACN : Na2SO4 0,05M (pH= 2,3) (31,5 : 68,5, tt/tt) + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút Chiết hồi 3 HPLC-DAD lưu cách Methanol + Nhiệt đô cột: 30oC [21] thủy + Thể tích tiêm: 20µL + Bước sóng phát hiện: 205 nm + Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm) Chiết hồi 4 HPLC-DAD lưu cách Methanol + Pha động đẳng dòng (isocratic): ACN : Na2SO4 (từ Na2SO4 [36] thủy khan 0,71%, kl/tt) (315 : 685, tt/tt), điều chỉnh về pH = 2,3 bằng acid sulfuric 16
  25. + Dung môi pha mẫu: MeOH 70% + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Nhiệt độ cột: 30oC + Thể tích tiêm mẫu: 20µL + Bước sóng phát hiện: 205 nm - Kết quả: Tỷ lệ thời gian lưu của các thành phần hóa học chính trong rau đắng biển: Bacopasid I, Bacosid A3, Bacopasid X và Bacopasaponin C so với Bacopasid II lần lượt là: 1,4; 0,9; 1,2; 1,3. + Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm) + Pha động (Gradient): ACN : đệm phosphat (từ KH2PO4 khan Chiết hồi và H3PO4, pH = 2,3) 5 HPLC-DAD lưu cách Methanol [38] + Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút thủy + Nhiệt độ cột: 27oC + Thể tích tiêm mẫu: 20µL 17
  26. + Detector: UV (205 nm) - Kết quả: Tỷ lệ thời gian lưu của các thành phần hóa học chính trong rau đắng biển: Bacopasid I, bacopasid II, bacopasid X và bacopasaponin C so với bacosid A3 lần lượt là: 0,73; 1,04; 1,15; 1,22. Nhận xét: Đối tượng nghiên cứu của tất cả các tài liệu tham khảo đều là Rau đắng biển được rửa sạch, sấy khô và nghiền thành bột. Các chương trình sắc ký đều sử dụng thành phần pha động chính là ACN cùng một dung dịch đệm nhất định có pH vùng acid, và chủ yếu chạy với chế đồ đẳng dòng pha động (isocratic). Các điều kiện sắc ký trong các tài liệu tham khảo hầu hết đều sử dụng cột sắc ký pha đảo C18, thể tích tiêm mẫu 20 µL, tốc độ dòng 1,0 – 1,5 ml/phút và bước sóng phát hiện là 205 nm. Trong Dược điển Anh [15], và USP 40 – NF35 [18], hàm lượng bacosid tổng số được tính là tổng hàm lượng bacopasid I, bacosid A3, bacopasid II, đồng phân isomer jujubogenin của bacopasaponin C (bacopasid X) và bacopasaponin C tính theo bacosid A3. Trong nghiên cứu này chúng tôi sẽ tiến hành định lượng triterpen glycosid tổng số tham khảo theo USP 40 – NF35. 18
  27. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là mẫu dược liệu Rau đắng biển được thu hái ở vùng một số tỉnh tại Việt Nam. Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học bởi Khoa Tài nguyên dược liệu, Viện Dược Liệu. Sau đó được gửi về Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu để tiến hành đánh xây dựng phương pháp và đánh giá chất lượng. Dược liệu tươi sau đó được sấy khô ở 55oC, bảo quản trong túi bóng kín ở nơi khô ráo thoáng mát. Bảng 2.1. Danh sách các mẫu dược liệu Rau đắng biển thu thập Tên Việt Tên khoa Ngày TT Ký hiệu Họ thực vật Nơi lấy Nam học lấy Bacopa Rau đắng Thái Thụy, 1 RĐB1 monnieri Scrophulariaceae 10-6- biển Thái Bình (L.) Wettst 2019 Bacopa 07- Rau đắng Tiền Hải, 2 RĐB2 monnieri Scrophulariaceae 07- biển Thái Bình (L.) Wettst 2019 Bacopa 07- Rau đắng Giao Thủy, 3 RĐB3a monnieri Scrophulariaceae 09- biển Nam Định (L.) Wettst 2019 Bacopa 07- Rau đắng Giao Thủy, 4 RĐB3b monnieri Scrophulariaceae 09- biển Nam Định (L.) Wettst 2019 Bacopa 07- Rau đắng Thuận An, 5 RĐB4a monnieri Scrophulariaceae 11- biển Huế (L.) Wettst 2019 Bacopa 07- Rau đắng Thuận An, 6 RĐB4b monnieri Scrophulariaceae 11- biển Huế (L.) Wettst 2019 19
  28. Bacopa 07- Rau đắng Cửa Tùng, 7 RĐB5a monnieri Scrophulariaceae 11- biển Quảng Trị (L.) Wettst 2019 Bacopa 07- Rau đắng Cửa Tùng, 8 RĐB5b monnieri Scrophulariaceae 11- biển Quảng Trị (L.) Wettst 2019 Nhật Lệ, Bacopa 07- Rau đắng Đồng Hới, 9 RĐB6a monnieri Scrophulariaceae 12- biển Quảng (L.) Wettst 2019 Bình Nhật Lệ, Bacopa 07- Rau đắng Đồng Hới, 10 RĐB6b monnieri Scrophulariaceae 12- biển Quảng (L.) Wettst 2019 Bình Bacopa Bố Trạch, 13- Rau đắng 11 RĐB7a monnieri Scrophulariaceae Quảng 07- biển (L.) Wettst Bình 2019 Bacopa Quỳnh 13- Rau đắng 12 RĐB8a monnieri Scrophulariaceae Lưu, Nghệ 07- biển (L.) Wettst An 2019 Bacopa Hoàng 13- Rau đắng 13 RĐB8b monnieri Scrophulariaceae Mai, Nghệ 07- biển (L.) Wettst An 2019 Bacopa Rau đắng Kiên 7- 14 RDB9a monnieri Scrophulariaceae biển Giang 2019 (L.) Wettst Bacopa Rau đắng Kiên 7- 15 RDB9b monnieri Scrophulariaceae biển Giang 2019 (L.) Wettst 20
  29. Bacopa Rau đắng Nga Sơn, 7- 16 RDB10a monnieri Scrophulariaceae biển Thanh Hóa 2019 (L.) Wettst Bacopa Hoàng Rau đắng 7- 17 RDB10b monnieri Scrophulariaceae Hóa, biển 2019 (L.) Wettst Thanh Hóa Bacopa Rau đắng Tĩnh Gia, 7- 18 RDB10c monnieri Scrophulariaceae biển Thanh Hóa 2019 (L.) Wettst Bacopa Quảng Rau đắng 7- 19 RDB10d monnieri Scrophulariaceae Xương, biển 2019 (L.) Wettst Thanh Hóa Bacopa Quảng Rau đắng 2- 20 RDB11a monnieri Scrophulariaceae Thành, TP biển 2019 (L.) Wettst Thanh Hóa Bacopa Quảng Rau đắng 4- 21 RDB11b monnieri Scrophulariaceae Thành, TP biển 2019 (L.) Wettst Thanh Hóa Bacopa Quảng Rau đắng 6- 22 RDB11c monnieri Scrophulariaceae Thành, TP biển 2019 (L.) Wettst Thanh Hóa Bacopa Quảng Rau đắng 8- 23 RDB11d monnieri Scrophulariaceae Thành, TP biển 2019 (L.) Wettst Thanh Hóa 21
  30. 2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị 2.2.1. Chất chuẩn - Các chất chuẩn chuẩn bacopasid I (CAS: 382148-47-2, LOT: PRF9012222), bacosid A3 (CAS: 157408-08-7, LOT: PRF9212143), bacopasid II (CAS: 382146- 66-9, LOT: PRF8062301), bacopasid X (CAS: 94443-88-6, LOT PRF9162411) và bacopasaponin C (CAS: 178064-13-6, LOT: PRF8062302) được cung cấp bởi hãng Biopurify Phytochemicals Ltd. với độ tinh khiết trên 98%. 2.2.2. Hóa chất - Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (methanol, acetonitril) của hãng Merck. - Các dung môi, hoá chất dùng để xử lý mẫu methanol, ethanol mua của Trung Quốc và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.) - Nước cất sử dụng là nước cất hai lần đã được deion hoá. 2.2.3. Thiết bị - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu bao gồm: Hệ bơm binary LC-30AD, detector SPD-M20A DAD, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-30AC, bộ phận ổn nhiệt CTO-10AS của Shimadzu. Phần mềm điều khiển Labsolution. - Cột sắc ký Zobax Eclip XDB C18 (250 x 4,6mm, 5µm) của Agilent. - Bếp cách thủy (Memmert, WB – 14 LO). - Cân phân tích (Precisa XT 220A), độ chính xác 0,00001 g. - Cân kỹ thuật điện tử (Ohaus) độ chính xác 0,01 g - Tủ sấy (Memmert, ULM 500). - Cân xác định độ ẩm (Sartorius, MA – 45). - Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm. 22
  31. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn - Dung dịch chuẩn gốc bacosid A3: Cân chính xác 10 mg chuẩn bacosid A3, hòa tan và định mức trong bình định mức 5 mL bằng methanol thu được dung dịch chuẩn gốc bacosid A3 có nồng độ khoảng 2 mg/ml. - Các dung dịch chuẩn bacopasid I, bacopasid II, bacopasid X và bacopasaponin C có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml trong methanol được sử dụng để xác định vị trí các píc bacopasid I, bacopasid II, bacopasid X và bacopasaponin C trong mẫu thử. Các dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở nhiệt độ 4 oC, sử dụng ổn định trong 02 tháng. 2.3.2. Xây dựng phương pháp định lượng bacosid tổng số trong Rau đắng biển 2.3.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký - Khảo sát chương trình pha động: Tiến hành khảo sát chương trỉnh rửa giải gradient với pha động gồm acetonitril (kênh B) phối hợp với nước (kênh A) theo các tỉ lệ khác nhau. Các kết quả thu được với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), và hệ số đối xứng (AS). RS ≥ 1,5; AS nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 (tối ưu xấp xỉ bằng 1); tR của các chất phân tích không quá dài nhưng phải đảm bảo tách xa nhau. Tiến hành sắc ký dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn bacosid A3 trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ghép nối với detector DAD (Shimadzu) để khảo sát điều kiện sắc ký. 2.3.2.2. Thẩm định phương pháp Sau khi khảo sát các điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng bacosid tổng số (tính theo bacosid A3) trong Rau đắng biển bằng HPLC theo hướng dẫn của AOAC. a. Độ thích hợp hệ thống Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị. 23
  32. Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở trên. Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích píc. Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích. Yêu cầu các giá trị thời gian lưu, diện tích píc có RSD ≤ 2%. b. Độ chọn lọc của phương pháp: - Tính chọn lọc của phương pháp: Là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng, píc của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các píc tạp. Trên sắc ký đồ mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn. Tiến hành chạy sắc ký dung dịch chuẩn bacosid A3, dung dịch thử Rau đắng biển và mẫu trắng methanol với chương trình đã lựa chọn. Ghi lại các thông số thời gian lưu và diện tích píc. Thời gian lưu píc bacosid A3 của dung dịch chuẩn, dung dịch thử Rau đắng biển phải tương đương nhau. Píc trong mẫu thử phải tách hoàn toàn với các píc khác trong nền mẫu. Hệ số chồng phổ của mẫu thử và mẫu chuẩn phải lớn hơn 0,99. c. Khoảng tuyến tính - Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đo được và nồng độ chất phân tích. Tiến hành sắc kí các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu đo được và nồng độ. Vẽ đồ thị thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính. Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất). - Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ các chất phân tích. Đánh giá đường chuẩn dựa vào giá trị R2 và độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn (Δ). Yêu cầu: 0,99 ≤ R2 ≤ 1. d. Độ lặp lại + Độ lặp lại của phương pháp: Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Tiến 24
  33. hành thí nghiệm 6 lần với cùng một nồng độ, xác định độ lệch tương đối RSD (%) của hàm lượng. - Tiến hành định lượng 6 lần riêng biệt trên một mẫu dược liệu và tính toán độ lệch chuẩn tương đối, theo AOAC yêu cầu RSD ≤ 1,5% đối với chất phân tích có hàm lượng trong mẫu ≥ 1,0%. 푆 푅푆 (%) = . 100 ⃐ ∑ ( − ̅)2 푆 = √ 푖=1 푖 − 1 Trong đó: xi : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ i. ̅ : Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm. N: Số lần thử nghiệm. e. Độ đúng Độ đúng của phương pháp: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng. Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lý thuyết. Thêm vào mẫu Rau đắng biển đã được xác định hàm lượng hoạt chất một lượng chính xác chất chuẩn ở 2 mức. Độ thu hồi được tính theo công thức − 푅(%) = 푡 푛 . 100 % R: độ thu hồi (%). 푡 : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử thêm chuẩn (µg/mL). Cn: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (µg/mL). : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (mg/mL). Độ thu hồi chấp nhận cho trường hợp chất phân tích có hàm lượng trong khoảng 1 – 10 % là: 95,0 – 102,0 %. 2.3.3. Áp dụng trên một số mẫu dược liệu Rau đắng biển Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) trong một số mẫu Rau đắng biển thu hái tại một số tỉnh ở Việt Nam. 25
  34. 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu - Một số đặc trưng thống kê: Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào dựa vào các hàm số trong Microsoft Excel. Giá trị trung bình (X): Hàm AVERAGE Độ lệch chuẩn (SD): Hàm STDEV 100 SD Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): % X - Tương quan hồi quy tuyến tính: Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích: Y = aC +b Trong đó Hệ số góc a: Hàm SLOPE; Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT; Hệ số tương quan r: Hàm CORREL - Hàm lượng triterpen glycosid trong mẫu thử được tính toán theo công thức sau: (푆 − ) × 1000 × 푃 × 퐹 (%) = 푡 × × (100 − ) Trong đó: Hệ số góc a: Hàm SLOPE; Hệ số chắn b X(%): Hàm lượng của triterpene glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) St: Diện tích píc của mỗi triterpen glycosid trong dung dịch thử F: Là hệ số đáp ứng của mỗi triterpen glycosid so với bacosid A3: 1,00 đối với bacosid A3, 1,03 đối với bacopasids I, 0,81 đối với bacopasida II, 0,99 đối với bacosid X và 0,75 đối với bacopasaponin C. P: Độ tinh khiết của chất chuẩn (%) m: Khối lượng mẫu thử (mg) B: Độ ẩm của mẫu thử (%) 26
  35. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 3.1. Khảo sát điều kiện phân tích và quy trình xử lý mẫu Tham khảo chuyên luận Bacopa trong USP 40 – NF 35, chúng tôi tiến hành định lượng bacosid tổng số (tính theo bacosid A3) trong dược liệu Rau đắng biển với quy trình xử lý mẫu như sau: Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 2,5 g dược liệu đã xay nhỏ vào bình cầu có dung tích 100 ml. Thêm chính xác 25 ml dung dịch methanol. Chiết hồi lưu cách thủy trong 10 phút. Để nguội về nhiệt độ phòng và gạn lấy lớp dịch. Tiếp tục chiết đến khi dịch chiết mất màu. Gộp các dịch chiết, cô dưới áp suất giảm và định mức đến 100 ml bằng methanol. Lọc dịch thử qua màng lọc cellulose acetat 0,45 µm thu được dịch sắc ký. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 10,0 mg bacosid A3 vào bình định mức 5 ml. Thêm 3 ml dung dịch methanol, lắc đều. Bổ sung bằng dung dịch trên đến vạch. Tiến hành pha loãng thu được dung dịch chuẩn bacosid A3 có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml. Chuẩn bị tương tự đối với các dung dịch chuẩn bacopasid I, bacopasid II, bacopasid X và bacopasaponin C. Điều kiện sắc ký: + Cột: Zobax Eclip XDB C18 (250 x 4,6mm, 5µm). + Pha động (Gradient): ACN : đệm phosphat (từ KH2PO4 khan và H3PO4, pH = 2,3). + Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút. + Nhiệt độ cột: 27oC. + Thể tích tiêm mẫu: 20 µL. + Detector: UV (205 nm). Tiến hành khảo sát một số chương trình gradient, kết quả thu được chương chình gradient như sau: 27
  36. Bảng 3.1. Chương trình gradient Thời gian % Kênh A % Kênh B (phút) 0 – 25 70 30 25 – 28 70 - 10 30 - 90 28 - 33 10 90 33 - 38 10 - 70 90 - 30 38 - 43 70 30 Sắc ký đồ thu được như sau: A-SKĐ HPLC mẫu chuẩn bacosid B-SKĐ HPLC phân tích các bacosid và mẫu A3 thử Rau đắng biển Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC phân tích Rau đắng biển (Ghi chú: 1: Mẫu thử Rau đắng biển; 2- Dung dịch chuẩn bacopasid I; 3- Dung dịch chuẩn bacosid A3; 4- Dung dịch chuẩn bacopasid II; 5- Dung dịch chuẩn bacopasid X; 6- Dung dịch chuẩn bacopasaponin C) Khi sử dụng các cột sắc ký khác nhau, thời gian lưu tương đối của các bacosid trong Rau đắng biển so với bacosid A3 có thể so với USP. Vì vậy, để xác định vị trí thời gian lưu của các bacosid trong Rau đắng biển, chúng tối tiến hành phân tích ồđ ng thời các các dung dịch chuẩn bacopasid I, bacopasid II, bacopasid X và bacopasaponin C. Kết quả thời gian lưu cũng như thời gian lưu tương đối của các bacosid so với bacosid A3 được trính bày như Bảng 3.2 và Hình 3.2. 28
  37. Bảng 3.2. Thời gian lưu tương đối của các bacosid Chất phân tích Thời gian lưu Thời gian lưu tương đối Bacopasid I 15,242 0,79 Bacosid A3 19,300 1,00 Bacopasid II 20,272 1,05 Bacopasid X 22,192 1,15 Bacopasaponin C 23,736 1,23 Hình 3.2. Vị trí các píc triterpen glycosid trong Rau đắng biển (Ghi chú: S1: bacopasid I, S2: bacosid A3, S3: bacopasid II, S4: bacopasid X và S5: bacopasaponin C) Nhận xét: Có thể thấy sự thay đổi thời gian lưu và thời gian lưu tương đối của các triterpen glycosid trong dược liệu Rau đắng biển so với bacosid A3. Điều này có thể giải thích do việc sử dụng các cột C18 khác nhau cũng như điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm. Sau khi xác định được thời gian lưu tương đối của các bacosid so với bacosid A3, chúng tôi sử dụng giá trị thời gian lưu tương đối đã xác định được và chỉ sử dụng mình dung dịch chuẩn bacosid A để tiến hành định lượng bacosid tổng số theo bacosid A3 trong dược liệu Rau đắng biển. 29
  38. 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích 3.2.1. Tính thích hợp hệ thống Tính thích hợp của hệ thống được đánh giá theo phương pháp như đã trình bày ở trên. Kết quả được đánh giá thông qua giá trị RSD (%) của diện tích píc và thời gian lưu sau 6 lần phân tích lặp lại cùng một mẫu chuẩn bacosid A3 có nồng độ 0,42 mg/ml. Kết quả được trình bày trong bảng 3.3. Bảng 3.3. Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống Thời gian lưu Diện tích píc TT (phút) (mAU.s) 1 19,300 1023497 2 19,322 1012322 3 19,301 1000211 4 19,319 1016123 5 19,323 1014312 6 19,309 1012218 Trung bình 19,312 1013114 RSD(%) 0,05 0,75 Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích píc và thời gian lưu đều nhỏ hơn 2 %, cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp và đảm bảo độ ổn định của phép phân tích định lượng bacosid tổng số trong Rau đắng biển. 3.2.2. Tính chọn lọc của phương pháp Tiến hành phân tích 3 mẫu: dung dịch bacosid A3 chuẩn, dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng methanol với điều kiện phân tích HPLC đã trình bày ở trên, thu được kết quả đánh giá bằng các sắc ký đồ tương ứng như hình sau: 30
  39. Hình 3.3. Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc của phương pháp mAU 17.767 0.9948 RDB-M1.lcd;14.652 200 150 100 50 249 0 223 200 250 300 350 nm Hình 3.4. So sánh phổ UV của bacosid A3 trong mẫu thử và mẫu chuẩn Thời gian lưu của píc bacosid A3 trên sắc ký đồ mẫu Rau đắng biển tương tự như thời gian lưu của các píc chuẩn tương ứng trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn. Bên cạnh đó, trên sắc ký đồ mẫu thử píc bacopasid I, bacosid A3, bacopasid II, jujubogenin isomer của bacopasaponin C và bacopasaponin được tách hoàn toàn khỏi các píc khác. Hệ số chồng phổ của bacosid A3 của mẫu thử so với mẫu chuẩn lớn hơn 0,99. Như vậy, phương pháp đủ đặc hiệu để định lượng bacosid tổng số trong Rau đắng biển. 3.2.3. Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn Chuẩn bị một dãy gồm dung dịch chuẩn bacosid A3 có nồng độ tăng dần từ 0,21 mg/ml đến 1,68 mg/ml rồi tiến hành phân tích HPLC với các điều kiện như đã trình bày ở trên. Kết quả xác định được khoảng tuyến tính từ 0,21 mg/ml đến 1,68 31
  40. mg/ml và phương trình hồi quy tuyến tính y = 2369732,91x + 30580,47 với hệ số tương quan R2 = 0,9998. Bảng 3.4. Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích của píc bacosid A3 Nồng độ Diện tích píc (mg/ml) (mAU.s) 0,21 511749 0,42 1023497 0,84 2046993 1,26 3029550 1,68 3991636 3.2.4. Độ lặp lại Tiến hành: Cân chính xác khoảng 2,5 g dược liệu. Xử lý mẫu theo quy trình đã trình bày ở trên để thu được dung dịch tiêm sắc ký. Tiến hành làm lặp lại 6 lần trên cùng một mẫu dược liệu. Kết quả được trình bày trong bảng 3.5. Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ lặp lại Hàm lượng (%)bacosid tổng (tính TT mdược liệu (g) theo bacosid A3) 1 2,5002 3,33 2 2,5011 3,33 3 2,5032 3,32 4 2,5045 3,24 5 2,5023 3,35 6 2,5012 3,24 Trung bình 3,30 RSD% 1,44 32
  41. Hàm lượng trung bình của bacosid (tính theo bacosid A3) trong mẫu dược liệu Rau đắng biển là 3,30% (tính theo khối lượng dược liệu khô tuyệt đối), với độ lệch chuẩn tương đối RSD = 1,44% < 1,5% cho thấy phương pháp xây dựng có độ lặp lại cao. 3.2.5. Độ đúng Mẫu thêm chuẩn: Cân chính xác khoảng 2,5 bột dược liệu và thêm một lượng bacosid A3 chuẩn, quá trình thêm chuẩn được tiến chuẩn bị ở 3 mức: 5 mg, 10 mg và 15 mg Sau đó, tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã trình bày ở trên. Mẫu không thêm chuẩn: cân chính xác khoảng 2,5 g bột dược liệu và tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã trình bày ở trên. Định lượng bacosid trong mẫu thêm chuẩn và mẫu không thêm chuẩn bằng HPLC, mỗi mức thêm chuẩn được làm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6. Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp Nồng độ Nồng Nồng độ Nồng thêm Độ thu Mdược liệu độ thêm mẫu thêm Trung độ thực chuẩn hồi (g) chuẩn chuẩn bình (mg/ml) tìm lại (%) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) 2,5001 25,001 0,789 0,048 96,7 2,5011 25,011 0,05 0,789 0,048 96,0 97,7 2,5044 25,044 0,792 0,050 100,3 2,5041 25,041 0,841 0,099 98,7 2,5016 25,016 0,10 0,840 0,099 99,0 98,4 2,5089 25,089 0,841 0,097 97,5 2,5012 25,012 0,898 0,157 104,7 2,5015 25,015 0,15 0,894 0,153 101,9 102,2 2,5002 25,002 0,891 0,150 99,9 33
  42. Độ thu hồi trung bình của phương pháp định lượng bacosid tổng số trong dược liệu Rau đắng biển bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC đạt trong khoảng 95-102%, chứng tỏ phương pháp đã xây dựng có độ đúng cao. 3.3. Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (Tính theo bacosid A3) trong Rau đắng biển Áp dụng phương pháp đã xây dựng, tiến hành đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (Tính theo bacosid A3) trong Rau đắng biển thu hái tại một số tính ở Việt Nam. Mỗi mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần độc lập. Kết quả như sau: Bảng 3.7. Hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) trong dược liệu Rau đắng biển thu hái tại Việt Nam Hàm lượng (%)bacosid tổng số TT Ký hiệu Nơi lấy Ngày lấy (tính theo bacosid A3) 1 RĐB1 Thái Thụy, Thái Bình 10-6-2019 3,22 ± 0,01 2 RĐB2 Tiền Hải, Thái Bình 07-07-2019 3,25 ± 0,01 3 RĐB3a Giao Thủy, Nam Định 07-09-2019 2,53 ± 0,01 4 RĐB3b Giao Thủy, Nam Định 07-09-2019 3,04 ± 0,03 5 RĐB4a Thuận An, Huế 07-11-2019 3,18 ± 0,02 6 RĐB4b Thuận An, Huế 07-11-2019 3,45 ± 0,04 7 RĐB5a Cửa Tùng, Quảng Trị 07-11-2019 3,16 ± 0,02 8 RĐB5b Cửa Tùng, Quảng Trị 07-11-2019 3,15 ± 0,02 Nhật Lệ, Đồng Hới, 9 RĐB6a 07-12-2019 2,94 ± 0,03 Quảng Bình Nhật Lệ, Đồng Hới, 10 RĐB6b 07-12-2019 3,50 ± 0,03 Quảng Bình 11 RĐB7a Bố Trạch, Quảng Bình 13-07-2019 2,04 ± 0,04 12 RĐB8a Quỳnh Lưu, Nghệ An 13-07-2019 2,47 ± 0,06 13 RĐB8b Hoàng Mai, Nghệ An 13-07-2019 1,89 ± 0,01 34
  43. 14 RDB9a Kiên Giang 7-2019 3,94 ± 0,03 15 RDB9b Kiên Giang 7-2019 3,58 ± 0,03 16 RDB10a Nga Sơn, Thanh Hóa 7-2019 3,17 ± 0,01 Hoàng Hóa, Thanh 17 RDB10b 7-2019 4,63 ± 0,01 Hóa 18 RDB10c Tĩnh Gia, Thanh Hóa 7-2019 3,53 ± 0,05 Quảng Xương, Thanh 19 RDB10d 7-2019 5,03 ± 0,04 Hóa Quảng Thành, TP 20 RDB11a 2-2019 5,74 ± 0,03 Thanh Hóa Quảng Thành, TP 21 RDB11b 4-2019 3,59 ± 0,04 Thanh Hóa Quảng Thành, TP 22 RDB11c 6-2019 3,85 ± 0,04 Thanh Hóa Quảng Thành, TP 23 RDB11d 8-2019 3,51 ± 0,05 Thanh Hóa Nhận xét: Kết quả thu được cho thấy hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) trong các mẫu Rau đắng biển nằm trong khoảng từ 1,89 – 5,74%. Trong đó, mẫu Rau đắng biển thu tại Thanh Hóa cho hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) cao nhất (5,74 ± 0,03). Kết quả thu được góp phần vào đánh giá chất lượng dược liệu Rau đắng biển tại Việt Nam. 35
  44. CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 4.1. Về thu thập mẫu dược liệu Rau đắng biển (Bacopa monnieri) là một loại thảo dược vị đắng, tính mát. Từ lâu, loài cây này đã được sử dụng rất phổ biến trong đời sống của con người như dùng làm rau ăn hoặc dùng làm thuốc trong y học cổ truyền Ấn Độ từ 3000 năm trước, có tác dụng bảo vệ trí nhớ, bổ thần kinh, tăng cường nhận thức và chống oxy hóa. Các kết quả điều tra đến nay cho thấy Rau đắng biển phân bố phổ biến ở Việt Nam ở độ cao đến 500m so với mực nước biển, tuy nhiên tập chung nhiều ở các tỉnh của Việt Nam: Thái Bình, Nam Định, Hải Phòng, Quảng Ninh, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Bình, Quảng Trị, Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Tây Ninh, Đồng Nai, TP Hồ Chí Minh, Vĩnh Long, Cần Thơ, Cà Mau, Đồng Tháp, Hậu Giang, An Giang. Tuy nhiên, hiện nay Dược điển Việt Nam chưa có chuyên luận Rau đắng biển. Phương pháp định lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) đã được đề xuất trong nhiều chuyên luận của dược điển Mỹ, Anh, tuy nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá nào trên đối đượng Rau đắng biển tại Việt Nam. Nghiên cứu này góp phần vào công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu Rau đắng biển tại Việt Nam. Nhóm thực hiện đề tài đã tiến hành thu thập mẫu Rau đắng biển tại các tỉnh ở cả ba miền Bắc Trung Nam như Thái Bình, Nam Định, Thanh Hóa, Nghệ An, Huế, Quảng Trị, Quảng Bình, Kiền Giang và vẫn đang tiếp tục thu thêm mẫu để đánh giá chất lượng dược liệu Rau đắng biển ở Việt Nam. 4.2. Về xây dựng phương pháp định lượng Hiện tại, Dược điển Mỹ cũng như Dược điển Anh đã có chuyên luận cho dược liệu Rau đắng biển, trong đó đã có tiêu chí đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) bằng phương pháp HPLC. Tuy nhiên, có một khó khăn thực tế khi áp dụng phương pháp này là thời gian lưu của các bacosid bị ảnh hưởng nhiều khi thay đổi các cột sắc ký khác nhau. Để có thể áp dụng được phương pháp theo điều kiện cơ sở phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành chạy chuẩn đơn của bacopasid I, bacosid A3, bacopasid II, đồng phân isomer jujubogenin của bacopasaponin C (bacopasid X) và bacopasaponin C để xác định thời gian lưu cũng như thời gian lưu tương đối của các bacosid so với bacosid A3. Sau khi xác định được các thông số này, chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp theo các tiêu chí đánh giá của AOAC, kết quả thu được cho thấy phương pháp đạt yêu cầu của AOAC. 36
  45. 4.3. Về kết quả định lượng triterpen glycosid tổng số trong các mẫu Rau đắng biển Trong nghiên cứu này chúng tôi đã định lượng hàm lượng triterpen glycosid trong 23 mẫu dược liệu Rau đắng biển (Bacopa monnieri) thu hái tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC. Kết quả thu được cho thấy hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) trong các mẫu Rau đắng biển nằm trong khoảng từ 1,89 – 5,74%. Trong đó, mẫu Rau đắng biển thu tại Thanh Hóa cho hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) cao nhất (5,74 ± 0,03). So sánh với một nghiên cứu khác của tác giả Trần Trung Nghĩa và các cộng sự (2017), kết quả hàm lượng triterpen glycosid trong một số mẫu Rau đắng biển nằm trong khoảng 1,71 – 4,45%, mẫu có hàm lượng triterpen glycosid cao nhất là mẫu Rau đắng biển được nhân giống và trồng tại Thanh Hóa [9]. Hàm lượng triterpen glycosid tổng trong nghiên cứu này không có sự chênh lệch nhiều so với khoảng hàm lượng triterpen glycosid tổng trong nghiên cứu của chúng tôi. Ngoài ra, các kết quả cũng đều cho thấy rằng Rau đắng biển được thu từ nhiều địa phương khác nhau có hàm lượng tritepen glycosid là khác nhau và vùng trồng mang hàm lượng cao nhất tại Thanh Hóa. Trong khi đó tiêu chuẩn nguyên liệu Rau đắng biển được quy định trong Dược điển Mỹ chỉ là 2,5% bacosid [37]. Các kết quả này cho thấy nguồn nguyên liệu Rau đắng biển của Việt Nam có chất lượng tốt thể hiện ở hàm lượng triterpen glycosid cao, nhiều hứa hẹn dùng làm nguyên liệu phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu. 37
  46. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Qua quá trình thực hiện đề tài, các mục tiêu đặt ra đã hoàn thành, cụ thể như sau: 1. Đã xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) trong dược liệu Rau đắng biển với điều kiện như sau: Điều kiện sắc ký: + Cột: Zobax Eclip XDB C18 (250 x 4,6mm, 5µm). + Pha động (Gradient): ACN : đệm phosphat (từ KH2PO4 khan và H3PO4, pH = 2,3). + Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút. + Nhiệt độ cột: 27oC. + Thể tích tiêm mẫu: 20 µL. + Detector: UV (205 nm). Chương trình gradient Thời gian % Kênh A % Kênh B (phút) 0 – 25 70 30 25 – 28 70 - 10 30 - 90 28 - 33 10 90 33 - 38 10 - 70 90 - 30 38 - 43 70 30 Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 2,5 g dược liệu đã xay nhỏ vào bình cầu có dung tích 100 ml. Thêm chính xác 25 ml dung dịch methanol. Chiết hồi lưu cách thủy trong 10 phút. Để nguội về nhiệt độ phòng và gạn lấy lớp dịch. Tiếp tục chiết đến khi dịch chiết mất màu. Gộp các dịch chiết, cô dưới áp suất giảm và định mức đến 100 ml bằng methanol. Lọc dịch thử qua màng lọc cellulose acetat 0,45 µm thu được dịch sắc ký. 38
  47. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 10,0 mg bacosid A3 vào bình định mức 5 ml. Thêm 3 ml dung dịch methanol, lắc đều. Bổ sung bằng dung dịch trên đến vạch. Tiến hành pha loãng thu được dung dịch chuẩn bacosid A3 có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml 2. Phương pháp được đánh giá thẩm định theo các tiêu chí của AOAC về: độ thích hợp hệ thống (các giá trị RSD đề nhỏ hơn 2%); độ lặp lại (RSD (%) nhỏ hơn 1,5 %); độ thu hồi (đều nằm trong khoảng 92 – 105%); đường chuẩn và khoảng tuyến tính (các giá trị R2 đều lớn hơn 0,99) 3. Áp dụng phương pháp trên 23 mẫu Rau đắng biển cho thấy cho thấy hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) trong các mẫu Rau đắng biển nằm trong khoảng từ 1,89 – 5,74%. Trong đó, mẫu Rau đắng biển thu tại Thanh hóa cho hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) cao nhất (5,74 ± 0,03). Đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) tại các thời điểm thu hái khác nhau và các vùng khác nhau. 39
  48. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Nguyễn Tiến Bân (Chủ Biên) (2003&2006), Danh lục các loài thực vật Việt Nam, 3, NXB. Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Hà Nội. 2. Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học. 3. Bộ Y Tế (2012), Hóa phân tích, 2, Nhà xuất bản Y học Hà Nội. 4. Hoàng Minh Châu (2002), Cơ sở hóa học phân tích, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ Thuật. 5. Quách Thị Lê Hà (2011), Triển khai mô hình đánh giá tác dụng của thuốc chống trầm cảm trên tế bào thần kinh vỏ não phôi thai chuột cống nuôi cấy và dòng tế bào NG 108-15 tại Viện Dược liệu, Đại học Dược Hà Nội. 6. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản trẻ. 7. Nguyễn Thị Thu Hương (2006), "Tác dụng chống oxy hóa in vitro của rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst, Scrophulariaceae)", Tạp chí dược liệu. 8. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học. 9. Trần Trung Nghĩa, Nguyễn Văn Tài,Lê Hùng Tiến (2017), "Xây dựng phương pháp định lượng Bacoside trong rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst bằng HPLC và tuyển chọn mẫu giống rau đắng biển có hàm lượng Bacoside cao", Tạp chí Khoa học & Công nghệ 4(9), tr. 86-92. 10. Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, 2, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. Tài liệu Tiếng Anh 11. Aiyalu Rajasekaran, Nagulsamy Sarathikumar (2014), "Simultaneous Estimation of Luteolin and Apigenin in Methanol Leaf Extract of Bacopa monnieri Linn by HPLC", British Journal of Pharmaceutical Research 4(13), pp. 1629-1637. 12. Anju Varshney, Sunita Shailajan,Naresh Chandra (2011), "Estimation of flavonoid-luteolin in different plant parts of Bacopa monnieri (L.) Wettst. by using HPTLC method", Analytical Chemistry: An Indian Journal 11(1).
  49. 13. Bhattacharya SK,Ghosal S (1998), "Anxiolytic activity of a standardized extract of Bacopa monniera: an experimental study", Phytomedicine, 5(2), pp. 77-82. 14. Bailey Kr,Crawley Jn (2001), "Methods of behavior analysis in neuroscience ", Chemical Rubber Company press, 2nd edition. 15. Bhandari Pamita, Sendri Nitisha,Devidas Shinde Bhagatsing (2020), "Dammarane triterpenoid glycosides in Bacopa monnieri: A review on chemical diversity and bioactivity", Phytochemistry, 172, pp. 112276. 16. Bose KC, Bose NK (1931), "Observations on the actions and uses of Herpestis monniera", Journal of the Indian Medical Association, 1, pp. 60. 17. Chakravarty AK, Garai S, Masuda K, Nakane T,Kawahara N (2003), "Bacopasides III-V: three new triterpenoid glycosides from Bacopa monniera", Chem Pharm Bull (Tokyo), 51(2), pp. 215-7. 18. Chakravarty AK, Sarkar T, Masuda K, Shiojima K, Nakane T,Kawahara N (2001), "Bacopaside I and II: two pseudojujubogenin glycosides from Bacopa monniera", Phytochemistry, 58(4), pp. 553-6. 19. Chen Yun-Bo,Lai Shi-Long (2005), "Effects of drug serum in broken bushen yizhi formulas on cell model of Alzheimer disease", Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research, pp. 250-253. 20. Chia-Chung Hou, Shwu-Jiuan Lin,Juei-Tang Cheng (2002), "Bacopaside III, Bacopasaponin G, and Bacopasides A, B, and C from Bacopa monniera", journal of Natural Products, 65(12), pp. 1759-1763. 21. Chillara Sivaramakrishna, Chillara Vrao,Golakoti Trimurtulu (2005), "Triterpenoid glycosides from Bacopa monnieri", Phytochemistry, 66(23), pp. 2719-2728. 22. Chopra RN, Nayar SL,Chopra IC (1956), Glossary of Indian Medicinal Plants, 32. 23. Harvey D (2000), Modern analytical chemistry, McGraw-Hill New York. 24. Jain P, Kulshreshtha DK (1993), "Bacoside A1, A minor saponin from Bacopa monniera", Phytochemistry, 33(2), pp. 449-451.
  50. 25. Kumar N, Abichandani LG, Thawani V,Gharpure KJ (2016), "Efficacy of Standardized Extract of Bacopa monnieri (Bacognize(R)) on Cognitive Functions of Medical Students: A Six-Week, Randomized Placebo-Controlled Trial", Evid Based Complement Alternat Med, 2016, pp. 4103423. 26. Nanteetip Limpeanchob, Somkiet Jaipan (2008), "Neuroprotective effect of Bacopa monnieri on beta-amyloid-induced cell death in primary cortical culture", Journal of Ethnopharmacology, 120(1), pp. 112-117. 27. Nimisha Pulikkal Sukumaran,Augustine Amalraj (2019), "Neuropharmacological and cognitive effects of Bacopa monnieri (L.) Wettst – A review on its mechanistic aspects", Complementary Therapies in Medicine, 44, pp. 68-82. 28. Pamita Bhandari, Neeraj Kumar,Bikram Singh (2007), "Cucurbitacins from Bacopa monnieri", Phytochemistry, 68(9), pp. 1248-1254. 29. Ramawat Kg, Mérillon Jm (2008), Bioactive Molecules and Medicinal Plants, Springer. 30. Saraswati Garai, Shashi B Mahato (1996), "Bacopasaponin D-A pseudojujubogenin glycoside from Bacopa monniera", Phytochemistry, 43(2), pp. 447-449. 31. Shashi B Mahato,Saraswati Garai (2000), "Bacopasaponins E and F: two jujubogenin bisdesmosides from Bacopa monniera", Phytochemistry, 53(6), pp. 711-714. 32. Stough C, Lloyd J, Clarke J, Downey L, Hutchison C,Rodgers (2001), "The chronic effects of an extract of Bacopa monniera (Brahmi) on cognitive function in healthy human subjects", Psychopharmacology, 156, pp. 481-484. 33. Steven Roodenrys,Dianne Booth Msc (2002), "Chronic Effects of Brahmi (Bacopa monnieri) on Human Memory", Neuropsychopharmacology, 27, pp. 279-281. 34. Subha Rastogi, Dinesh K Kulshreshtha (1998), "Bacoside A2-A triterpenoid saponin from Bacopa monnieri", Indian Journal of Chemistry, 38B, pp. 353- 356.
  51. 35. Subha Rastogi, Raghwendra Pal, Dinesh K (1994), "Bacoside A3, A triterpenoid saponin from Bacopa monniera", Phytochemistry, 36(1), pp. 133- 137. 36. The British Pharmacopoeia Commission Secretariat of the Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency (Mhra) (2016), British Pharmacopoeia, The Stationery Office. 37. The United States Pharmacopeial Concention (2015), The United State Pharmacopeia 38 NF 33 Second Supplement, Rockville, Maryland: United States Pharmacoperial Convention. 38. The United States Pharmacopeial Convention (2018), The United State Pharmacopeia 40 NF 35 Second Supplement, Rockville, Maryland : United States Pharmacopeial Convention. 39. Tripathi YB, Chaurasia S, Tripathi E, Upadhyay A, Dubey GP (1996), "Bacopa monniera Linn. as an antioxidant: mechanism of action", Indian J Exp Biol, 34(6), pp. 523-6. 40. Watoo Phrompittayarat, Sakchai Wittaya-Areekul, Kanchalee Jetiyanon (2007), "Determinationof Saponin Glycosides in Bacopa monnieri by Reversed Phase High PerformanceLiquid Chromatography ", Thai Pharmaceutical and Health Science Journal, 2(1), pp. 26-32. 41. Yun Zhou, Yun-Heng Shen, Chuan Zhang, Juan Su (2007), "Triterpene Saponins from Bacopa monnieri and Their Antidepressant Effects in Two Mice Models", Journal of Natural Products, 70(4), pp. 652-655. Webside 42. 43. 44. 45.
  52. PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU DƯỢC LIỆU RAU ĐẮNG BIỂN RDB-1 RDB-2
  53. RDB-3a RDB-3b
  54. RDB-4a RDB-4b
  55. RDB-5a RDB-5b
  56. RDB-6a RDB-6b
  57. RDB-7a RDB-8a
  58. RDB-8b RDB-9a
  59. RDB-9b RDB-10a
  60. RDB-10b RDB-10c
  61. RDB-10d RDB-11a