›

Khóa luận Đánh giá độc tính và tác dụng hạ sốt của cao chiết lá bàng biển (Calotropis gigantea)

pdf 55 trang thiennha21 18/04/2022 4900
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Đánh giá độc tính và tác dụng hạ sốt của cao chiết lá bàng biển (Calotropis gigantea)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_danh_gia_doc_tinh_va_tac_dung_ha_sot_cua_cao_chiet.pdf

Nội dung text: Khóa luận Đánh giá độc tính và tác dụng hạ sốt của cao chiết lá bàng biển (Calotropis gigantea)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ĐẠI HỌC Y DƯỢC –––––––––––––––––––––– TRẦN THỊ HIỀN LỢI ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG HẠ SỐT CỦA CAO CHIẾT LÁ BÀNG BIỂN (Calotropis gigantea) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ĐẠI HỌC Y DƯỢC –––––––––––––––––––––– TRẦN THỊ HIỀN LỢI ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG HẠ SỐT CỦA CAO CHIẾT LÁ BÀNG BIỂN (Calotropis gigantea) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2016.Y Người hướng dẫn: TS. LÊ THỊ XOAN NCS. ThS. ĐẶNG KIM THU HÀ NỘI - 2021
  3. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho phép em xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS. Lê Thị Xoan – phó trưởng Khoa Dược lý Sinh hóa, Viện Dược liệu TW và NCS. ThS Đặng Kim Thu đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Thị Phượng và các anh chị đang làm việc tại khoa Dược lý Sinh hóa, Viện dược liệu TW đã hết lòng giúp đỡ, đưa ra những bài học kinh nghiệm quý báu, động viên em và đồng hành cùng em trong suốt thời gian làm đề tài. Nhân dịp này, em chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo – Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng với các thầy cô giảng dạy tại trường nói chung và các thầy cô ở Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng nói riêng đã tạo điều kiện, trang bị những kiến thức, kỹ năng chuyên ngành, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập, thực hành và nghiên cứu tại trường. Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn động viên và sát cánh bên em trong những lúc khó khăn và trong thời gian thực hiện đề tài này. Mặc dù bản thân đã có nhiều nỗ lực, nhưng cũng không thể tránh khỏi những hạn chế, thiếu sót trong thực hiện và báo cáo luận văn. Em kính mong được nhận những lời đóng góp ý kiến quý báu từ thầy, cô giáo để khóa luận được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2021 Sinh viên Trần Thị Hiền Lợi
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT BB Bàng biển BuOH n-Butanol DCM Dicholoromethane EtOAc Ethylacetate IL1,6,8 Interleukin 1,6,8 LPS Lipopolysaccharide PGE2 Prostaglandin E2 TNF Yếu tố hoại tử u DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Các chất gây sốt 5 Tác dụng hạ sốt của cao chiết toàn phần trên Bảng 3.1 30 thỏ gây sốt bằng LPS Tác dụng hạ sốt của cao chiết phân đoạn liều 25 Bảng 3.2 32 mg/kg trên thỏ gây sốt bằng LPS Tác dụng hạ sốt của cao chiết phân đoạn liều 50 Bảng 3.3 33 mg/kg trên thỏ gây sốt bằng LPS Tỉ lệ tử vong của các lô chuột nhắt trắng sau Bảng 3.4 34 khi uống cao chiết tiêu chuẩn lá Bàng biển Bảng 3.5 Tính LD50 theo phương pháp Karber - Behrens 34 Tác dụng hạ sốt của cao chiết tiêu chuẩn trên Bảng 3.6 36 thỏ gây sốt bằng LPS
  5. DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ STT Tên hình Trang Hình 1.1 Vùng dưới đồi 4 Hình ảnh lá và hoa cây Bàng biển (Calotropis Hình 1.2 10 Gigantea (L.) Dryand) Cấu trúc một số hợp chất glycoside cardenolide Hình 1.3 12 phân lập từ rễ cây Bàng biển Cấu trúc một số hợp chất phân lập từ lá cây Bàng Hình 1.4 12 biển Hình 2.1 Sơ đồ chuẩn bị cao chiết toàn phần Bàng biển 21 Hình 2.2 Sơ đồ chuẩn bị cao chiết phân đoạn Bàng biển 22 Hình 2.3 Sơ đồ chuẩn bị cao chiết tiêu chuẩn Bàng biển 23 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ Hình 2.4 27 sốt của cao chiết dược liệu
  6. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về sốt 3 1.1.1. Khái niệm sốt 3 1.1.2. Sinh nhiệt và thải nhiệt: 3 1.1.3. Sự điều nhiệt 3 1.1.4. Chất gây sốt 5 1.1.5. Cơ chế gây sốt 5 1.1.6. Các giai đoạn của sốt 6 1.2. Một số mô hình gây sốt thực nghiệm 7 1.3. Tổng quan về Bàng biển 9 1.3.1. Nguồn gốc, phân loại 9 1.3.2. Phân bố, sinh thái 10 1.3.3. Đặc điểm thực vật 10 1.3.4. Thành phần hóa học 11 1.3.5. Một số nghiên cứu của dược liệu Bàng biển 13 1.3.6. Sử dụng trong y học cổ truyền 17 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2. Nguyên liệu nghiên cứu 20 2.1.2. Động vật thí nghiệm 23 2.1.3. Hóa chất, dụng cụ 24
  7. 2.1.4. Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 24 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu 24 2.2.2. Thời gian nghiên cứu 24 2.3. Nội dung nghiên cứu 24 2.4. Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ sốt 25 2.4.2. Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp 28 2.5. Phương pháp xử lý số liệu 29 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 30 3.1. Tác dụng hạ sốt của cao chiết toàn phần Bàng biển 30 3.2. Tác dụng hạ sốt của cao chiết phân đoạn Bàng biển 31 3.3. Độc tính cấp của cao chiết tiêu chuẩn Bàng biển 34 3.4. Tác dụng hạ sốt của cao tiêu chuẩn Bàng biển 36 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 38 4.1. Về kết quả đánh giá tác dụng hạ sốt của cao chiết toàn phần và cao chiết phân đoạn lá Bàng biển: 39 4.2. Về kết quả thử nghiệm độc tính cấp của cao chiết tiêu chuẩn Bàng biển 41 4.3. Về kết quả đánh giá tác dụng hạ sốt của cao chiết tiêu chuẩn Bàng biển 42 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO
  8. ĐẶT VẤN ĐỀ Sốt là một phản ứng thông qua trung gian não nhằm bảo vệ cơ thể trước những tác nhân gây bệnh. Trong sốt, nhiệt độ cơ thể tăng lên vượt qua khoảng thân nhiệt thông thường [19,7]. Sốt có tác dụng kích thích các quá trình chuyển hóa trong tế bào, tạo điều kiện cho việc tích lũy năng lượng dự trữ và tăng đáp ứng miễn dịch [5,8]. Tuy nhiên, sốt cao và kéo dài lại gây ra bất lợi cho cơ thể. Sốt khiến cơ thể bị mất nước, rối loạn chất điện giải, rất nguy hiểm đối với trẻ em và trẻ sơ sinh. Đối tượng bị sốt cao có thể gặp phải các tổn thương thần kinh chẳng hạn như co giật ở trẻ em, tăng nhịp tim, khó thở, giảm chức năng tiêu hóa .[5,8]. Để khắc phục các tình trạng này, một số các hoạt chất đã được dùng trong lâm sàng như paracetamol, ibuprofen, aspirin Tuy nhiên, chúng có nhiều tác dụng không mong muốn đôi khi thách thức các tác dụng chính của chúng. Các nguồn hoạt chất khác nhau đang được điều tra trên toàn thế giới để khắc phục các vấn đề về tác dụng không mong muốn và đáp ứng điều trị tốt hơn. Do vậy, việc tiếp tục tìm kiếm các thuốc có nguồn gốc từ thảo dược có hiệu quả, an toàn luôn là nhu cầu cần thiết, là xu hướng nghiên cứu được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm. Theo đánh giá của Bộ Y tế, Việt Nam là quốc gia phong phú về nguồn dược liệu của khu vực và thế giới. Năm 2018, thống kê của Viện Dược liệu cho thấy, cả nước đã ghi nhận 5.117 loài thực vật và nấm, 408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc, trong đó có nhiều loài dược liệu quý hiếm, đặc hữu. Trải qua hàng ngàn năm lịch sử, cha ông ta cũng đã phát hiện, tích lũy được kho tri thức khổng lồ về dược liệu và y học cổ truyền với gần 1.300 bài thuốc dân gian. Đây là điều kiện quan trọng để Việt Nam phát triển ngành công nghiệp dược liệu và nền y học cổ truyền, phục vụ công tác khám, chữa bệnh, chăm sóc sức khỏe cho nhân dân [1]. Bàng biển (Calotropis gigantea (L.) Dryand) thuộc họ Thiên lý – Asclepiadaceae. Đây là một dược liệu cổ truyền được biết đến với cái tên Lá hen hoặc Bồng bồng, thường có mặt trong các bài thuốc trị hen suyễn, viêm đường 1
  9. hô hấp, rối loạn tiêu hóa, [29]. Cây phân bố nhiều ở vùng ven biển các tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận. Từ nhiều phần của cây, người ta đã phân lập được các hoạt chất quan trọng như α, β – amyrin, caloside, terpen, flavonoid [10,15].Từ đó cho thấy Bàng biển là một loại dược liệu có nhiều tiềm năng trong nghiên cứu và phát triển, bằng chứng là ở Việt Nam và trên thế giới đã có những công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý của loài thực vật này. Bên cạnh đó, để có thể sử dụng và nâng cao hiệu quả của các thuốc có chứa Bàng biển thì việc tiến hành thử nghiệm độ an toàn của dược liệu là một công việc cần thiết. Tuy nhiên, qua tìm hiểu thì ở Việt Nam hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ sốt của Bàng biển. Do vậy, đề tài “Đánh giá độc tính và tác dụng hạ sốt của cao chiết lá Bàng biển (Calotropis Gigantea)” được tiến hành với mục tiêu sau: Mục tiêu 1: Đánh giá được tác dụng hạ sốt của cao chiết toàn phần, cao chiết phân đoạn và cao chiết tiêu chuẩn lá Bàng biển trên mô hình thỏ được gây sốt bằng lipopolysaccharid (LPS) Mục tiêu 2: Đánh giá được độc tính cấp của cao chiết tiêu chuẩn lá Bàng biển trên chuột nhắt trắng 2
  10. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về sốt 1.1.1. Khái niệm sốt Sốt là trạng thái cơ thể chủ động tăng thân nhiệt do trung tâm điều hòa nhiệt bị tác dụng bởi các chất gọi là chất gây sốt, đưa đến kết quả tăng sinh nhiệt kết hợp với giảm thải nhiệt. Sốt khác với nhiễm nóng và với các hiện tượng tăng thân nhiệt khác như ưu năng tuyến giáp/ tiêm dinitrophenol/thời kì rụng trứng vì các trường hợp này không có giảm thải nhiệt chủ động [5-8]. 1.1.2. Sinh nhiệt và thải nhiệt: Lượng nhiệt sinh ra trong cơ thể chủ yếu là sản phẩm phụ của chuyển hóa, cụ thể là các phản ứng hóa học ở tế bào [6-7]. Sự sinh nhiệt tăng hay giảm phụ thuộc vào tình trạng cơ thể nghỉ hay hoạt động. Khi cơ thể ở trạng thái nghỉ, cơ quan sinh nhiệt chủ yếu là gan, nhiệt sinh ra từ các phản ứng chuyển hóa cơ bản. Khi hoạt động, cơ thể cần sử dụng năng lượng ở mức cao, lúc này cơ quan sinh nhiệt chủ yếu là cơ, lượng nhiệt sinh ra có thể gấp năm lần chuyển hóa cơ bản [5,8]. Thải nhiệt là quá trình vận chuyển lượng nhiệt sinh ra từ các cơ quan và mô sâu đến da, sau đó lại từ da thoát ra môi trường. Da, các mô dưới da và lớp mỡ là lớp cách nhiệt hiệu quả, giúp nhiệt độ trung tâm có thể duy trì xung quanh mức 37oC. Để cân bằng với quá trình sinh nhiệt, cơ thể cũng có một hệ tỏa nhiệt gồm các mạch máu đi từ trung tâm và phân chia chằng chịt dưới da giúp thải nhiệt ra ngoài môi trường. Dòng máu này không điều chỉnh theo nhu cầu nuôi dưỡng cơ thể mà theo nhu cầu sinh nhiệt-thải nhiệt của cơ thể. Các cơ chế vật lý của sự thải nhiệt từ da ra môi trường bao gồm bức xạ nhiệt, truyền nhiệt và bay hơi (làm mất nhiệt qua mồ hôi, hơi thở) [6-7]. 1.1.3. Sự điều nhiệt Nhiệt độ của cơ thể được điều chỉnh hầu như hoàn toàn bởi cơ chế thần kinh, và hầu hết mọi cơ chế này tác dụng thông qua trung tâm điều hòa nhiệt 3
  11. nằm ở vùng dưới đồi [6-7]. Để những cơ chế điều hòa này hoạt động, cần có bộ phát hiện nhiệt để xác định khi nhiệt độ cơ thể trở nên quá cao hoặc quá thấp. Hình 1.1. Vùng dưới đồi Vùng trước thị của vùng dưới đồi trước chứa số lượng lớn neuron nhạy cảm với nóng và neuron nhạy cảm với lạnh. Neuron nhạy cảm với nóng tăng lên 2-10 lần để đáp ứng với nhiệt độ cơ thể tăng 10oC [6]. Mặc dù các tín hiệu được phát ra từ các receptor nhiệt của vùng dưới đồi là vô cùng mạnh trong kiểm soát nhiệt độ cơ thể, các receptor ở các phần khác nhau của cơ thể cũng đóng vai trò trong điều hòa thân nhiệt. Đó là các receptor nhiệt trên bề mặt da cùng với các receptor nhiệt sâu được phát hiện chủ yếu ở tủy sống, trong nội tạng ở ổ bụng và trong hoặc quanh các tĩnh mạch lớn ở thượng vị, lồng ngực. Các receptor này chủ yếu phát hiện lạnh hơn là nóng [6-7]. Tín hiệu cảm giác nhiệt độ từ vùng trước thị của vùng dưới đồi trước được chuyển đến phần sau vùng dưới đồi. Phần sau vùng dưới đồi hợp nhất với vùng trung tâm và các tín hiệu cảm giác nhiệt ngoại vi để kiểm soát sự sinh nhiệt và phản ứng bảo toàn nhiệt của cơ thể [6]. Người ta đặt ra khái niệm “điểm đặt nhiệt” khi so sánh trung tâm điều nhiệt của cơ thể với bộ phận điều nhiệt (rơ-le nhiệt) của các dụng cụ đốt nóng: có thể vặn nấc của rơ-le để duy trì nhiệt độ cần thiết, ví dụ vặn nấc tủ ấm để nhiệt độ trong tủ luôn ở mức xác định (ví dụ 37oC). Trong sốt, điểm đặt nhiệt bị tác nhân gây sốt “vặn” cho tăng lên. Dù vậy, quá trình thải và tạo nhiệt vẫn cân bằng (cả hai đều tăng song hành) [5,8]. 4
  12. 1.1.4. Chất gây sốt Sốt là phản ứng của cơ thể trước sự xâm nhập của các yếu tố gây bệnh. Những yếu tố này có thể là vi khuẩn, virus, vi nấm và được gọi là chất gây sốt ngoại sinh. Chất gây sốt ngoại sinh gây sốt thông qua những chất hóa học trung gian gọi là chất gây sốt nội sinh [5,7-8]. Những chất gây sốt này được trình bày tại bảng 1.1. Bảng 1.1 Các chất gây sốt Chất gây sốt ngoại sinh Chất gây sốt nội sinh - Từ bên ngoài xâm nhập vào cơ - Có thể sinh ra mà không phụ thể (thường có nguồn gốc vi thuộc vào chất gây sốt ngoại khuẩn) kích thích đại thực bào sinh sinh ra các chất gây sốt nội sinh - Chất ngoại sinh phải thông qua chất gây sốt nội sinh mới có tác dụng - Vi khuẩn gram (+) và ngoại độc - Interleukin I (IL1) có nguồn tố, vi khuẩn gram (-) và nội độc gốc từ bạch cầu đơn nhân và tố mà bản chất là một đại thực bào. lipopolysaccharide (LPS). - Yếu tố hoại tử u TNF α có - Virus. nguồn gốc từ đại thực bào - Vi nấm. - TNF và IL6, IL8 có tác dụng - Thuốc gây sốt yếu hơn IL 1 và TNF α - Chất steroid gây sốt - TNF β có nguồn gốc từ (ethicholanolone). lymphocyte T, B - Phức hợp kháng nguyên kháng - Interferon (INF α, β, γ) thể. - Cytokine tiền viêm MIF-1α, - Kháng nguyên gây quá mẫn MIF-1β có nguồn gốc từ đại chậm thực bào. Chú thích: Tài liệu tham khảo số [5-8] 1.1.5. Cơ chế gây sốt Sốt có thể xuất hiện do tác dụng của chất gây sốt hoặc do tổn thương não. 5
  13. Các chất gây sốt, đặc biệt là LPS tác dụng vào vùng dưới đồi làm thay đổi điểm đặt nhiệt của trung tâm điều nhiệt. LPS có mặt ở vỏ vi khuẩn, vi khuẩn vào cơ thể lập tức bị thực bào. IL-1 được giải phóng từ các đại thực bào vào các dịch cơ thể, và đi lên trên tới vùng dưới đồi, gần như ngay lập tức hoạt hóa quá trình gây sốt, đôi khi làm tăng thân nhiệt đáng kể chỉ trong 8-10 phút. Lượng nhỏ khoảng 10 phần triệu gram nội độc tố LPS từ vi khuẩn, hoạt động phối hợp với bạch cầu máu, đại thực bào của mô, và lympho T cũng có thể gây sốt. Nhiều thử nghiệm đã cho thấy rằng IL-1 gây sốt bởi đầu tiên là tạo thành các prostaglandin, chủ yếu là PGE2 hoặc một chất tương tự, chúng tác động trên vùng dưới đồi gây ra phản ứng sốt. Những chất này làm cho điểm đặt nhiệt bị điều chỉnh vượt 37oC, hay nói cách khác, nhiệt độ 37oC bị trung tâm coi là nhiệt độ nhiễm lạnh, do vậy cơ thể phản ứng giống như bị nhiễm lạnh. Như vậy, trung tâm không bị “rối loạn” mà vẫn điều chỉnh được thân nhiệt và vẫn phản ứng đúng với quy luật với sự thay đổi nhiệt độ của môi trường. Khi chất gây sốt hết tác dụng hoặc khi sự tạo ra PG bị ngăn chặn thì sốt sẽ chấm dứt hoàn toàn hoặc chí ít là giảm đi, điểm đặt nhiệt trở về 37oC, cơ thể phản ứng giống như bị nhiễm nóng. Sốt quá cao, trung tâm mới bị rối loạn, mất khả năng điều chỉnh [6]. Sốt gây ra bởi tổn thương não: Khi một phẫu thuật viên mổ vào vùng dưới đồi, gần như luôn luôn xảy ra triệu chứng sốt cao; hiếm khi có hạ thân nhiệt; điều này đã chứng minh vai trò của vùng dưới đồi trong cơ chế điều nhiệt và bất cứ bất thường nào của vùng dưới đồi đều có thể gây sốt. Một tình trạng khác thường gây tăng thân nhiệt kéo dài là sự chèn ép vùng dưới đồi do u não [6-7]. 1.1.6. Các giai đoạn của sốt 1.1.6.1. Sốt tăng Ở giai đoạn này, chất gây sốt làm cơ thể tăng sinh nhiệt, giảm thải nhiệt gây ra sự mất cân bằng điều nhiệt. Biểu hiện trong giai đoạn này có sởn gai ốc, tăng hô hấp, tăng chuyển hóa, mức hấp thụ oxy tăng gấp 3-4 lần bình thường [5,8]. Trong trường hợp chất gây sốt có tác dụng mạnh, gây ra những cơn rùng 6
  14. mình, ớn lạnh, co mạch làm da tái nhợt, không có mồ hôi. Thân nhiệt lúc này tăng rất nhanh, dùng thuốc hạ sốt hầu như không có tác dụng. 1.1.6.2. Sốt đứng Giai đoạn này quá trình sinh nhiệt và thải nhiệt cân bằng với nhau (sinh nhiệt không tăng thêm nhưng thải nhiệt bắt đầu tăng). Mức độ hấp thu oxy giảm so với khi sốt tăng nhưng vẫn ở mức cao, khoảng 1,5-2 lần bình thường [5,8]. Lúc này, mạch ngoại vi giãn giúp đẩy nhanh quá trình thải nhiệt. Nhiệt độ ngoại vi tăng, da bắt đầu đỏ lên, khô nóng, không có mồ hôi. Tùy vào tác dụng của chất gây sốt mà nhiệt độ có thể tăng ít (37-38oC) hoặc tăng nhiều (sốt cao 38- 39oC hoặc sốt rất cao 39-41oC) [5,8]. Có thể dùng thuốc trong trường hợp nguy hiểm. 1.1.6.3. Sốt lui Giai đoạn này thải nhiệt tăng nhanh, mồ hôi vã ra, tăng tiết niệu. Các quá trình hô hấp, chuyển hóa, mức hấp thu oxy và thân nhiệt trở về bình thường [5,8]. 1.2. Một số mô hình gây sốt thực nghiệm 1.2.1. Mô hình gây sốt bằng men Mô hình của H. Gerhard Vogel đưa ra nhằm đánh giá tác dụng hạ sốt trên chuột được bố trí như sau: Chuẩn bị hỗn dịch 15% men Brewer’s trong nước muối 0,9%. Mô hình sử dụng các nhóm gồm 6 con chuột Wistar đực hoặc cái (150 g). Ghi lại nhiệt độ của chuột bằng cách đưa một cặp nhiệt độ vào trực tràng với độ sâu 2 cm. Gây sốt cho động vật thí nghiệm bằng cách tiêm 10 ml/kg hỗn dịch men vào dưới da ở phía sau gáy. Vị trí tiêm được xoa bóp để truyền dịch huyền phù bên dưới da. Nhiệt độ phòng được giữ ở mức 22–24°C. Ngay sau khi dùng men, thức ăn được rút ra. 18 giờ sau khi dùng men, nhiệt độ tại trực tràng bắt đầu tăng lên. Sau 30 phút sẽ thực hiện đo nhiệt độ tiếp. Chỉ những động vật có thân nhiệt cao hơn 38°C mới được đưa vào thử nghiệm. Chuột dùng thuốc thử nghiệm hoặc thuốc chứng dương bằng đường uống. Thuốc đối chứng có thể 7
  15. dùng acid acetylsalicylic, aminophenazone, phenacetin. Nhiệt độ trực tràng được ghi lại ở thời điểm 30, 60, 120 và 180 phút sau khi dùng thuốc [25] . Một mô hình gây sốt bằng men tương tự được đưa ra năm 1963 của Teotino và cộng sự [16] thử nghiệm trên chuột cống trắng với hỗn dịch 12% được tiêm dưới da (0,01 ml/g). 10 giờ sau, cho chuột dùng thuốc thử nghiệm bằng ống thông dạ dày. Xác định thân nhiệt trung bình của chuột ở các thời điểm 90, 180, 270 phút sau khi dùng thuốc. So sánh sự khác nhau giữa thân nhiệt trung bình giữa nhóm đối chứng và nhóm thử nghiệm. Đối với acid acetylsalicylic, sự khác nhau này là 1,3oC với liều 300 mg/kg. 1.2.2. Mô hình gây sốt bằng vaccin thương hàn – cận thương hàn Mô hình gây sốt này được mô tả bởi Godwani S. và cộng sự (1987) [16] thực hiện trên chuột cống trắng. Một lô chuột được tiêm dưới da vaccine thương hàn- cận thương hàn A/B với liều 1 mg/kg tiêm dưới da. Một hoặc 2,3 lô chuột khác được gây sốt bằng vaccine A/B và được dùng thêm một hoặc 2,3 loại thuốc thử nghiệm bằng đường uống. Thuốc đối chứng là natri salicylate. Nhiệt độ được đo 1 phút trước khi tiêm vaccine và tại thời điểm 60, 120, 180, 240 phút sau khi tiêm. 1.2.3. Mô hình gây sốt bằng Lipopolysaccharide (LPS) trên thỏ H. Gerhard Vogel mô tả mô hình thỏ gây sốt bằng LPS dựa trên nguyên tắc: Lipopolysaccharide từ vi khuẩn Gram âm, ví dụ E. coli, gây sốt cho thỏ sau khi tiêm tĩnh mạch. Chỉ các phân đoạn lipopolysaccharide phù hợp thì sẽ khiến nhiệt độ cơ thể sau 60 phút tăng từ 1°C trở lên với liều lượng từ 0,1 đến 0,2 µg/kg. Ở thỏ, người ta quan sát thấy hai lần tăng nhiệt độ cực đại. Cực đại đầu tiên xảy ra sau 70 phút, cực đại thứ hai sau 3 giờ [25]. Sử dụng thỏ cả hai giới và thuộc nhiều chủng khác nhau có khối lượng cơ thể từ 3 đến 5kg. Thỏ được đưa vào chuồng thích hợp và đo nhiệt độ với máy đo tự động được đưa vào trực tràng. Thỏ được nhốt lại vào chuồng trong 60 phút. Sau đó, liều 0,2 ml/kg chứa 0,2 µg lipopolysaccharide được tiêm tĩnh mạch vào tai thỏ. Sau 60 phút, mẫu thử được tiêm dưới da hoặc uống. Nhiệt độ cơ thể được 8
  16. theo dõi trong ít nhất 3 giờ. Trong hơn 30 phút, thân nhiệt của động vật thí nghiệm giảm ít nhất 0,5°C so với giá trị nhiệt độ trước khi sử dụng mẫu thử thì mẫu thử được coi là có tác dụng [25]. 1.3. Tổng quan về Bàng biển 1.3.1. Nguồn gốc, phân loại Bàng biển có tên khoa học là Calotropis gigantea (L.) Dryand thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae), được biết đến với tên khác là lá hen, bông bông, nam tỳ bà. Chi Calotropis gồm 4 loại cây, phân bố chủ yếu ở cùng nhiệt đới Châu Á và châu Phi. Ở Việt Nam, có hai loài là Bàng biển (Calotropis gigantea (L.) Dryand) và Bông bông núi (Calotropis procera (Ait.) Ait.f ) [27]. Vị trí phân loại [34]: + Giới: Plantae (Thực vật) + Ngành: Tracheophytes (Thực vật bậc cao) + Lớp: Angiosperms (Thực vật hạt kín) + Phân lớp: Eudicots (Thực vật hai lá mầm) + Nhánh: Asterids (Cúc) + Bộ: Gentianales (Bộ Long Đởm) + Họ: Asclepiadaceae (Họ Thiên lý) + Chi: Calotropis (Chi bòng bòng) + Loài: Calotropis gigantea (L.) Dryand 9
  17. Hình 1.2. Hình ảnh lá và hoa cây Bàng biển (Calotropis gigantea (L.) Dryand, nguồn ảnh 1.3.2. Phân bố, sinh thái Phân bố: được tìm thấy ở Việt Nam, Campuchia, Bangladesh, Indonesia, Malaysia, Philippines, Thái Lan, Sri Lanka, Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan, Nepal và nhiệt đới châu Phi [29]. Ở nước ta cây mọc nhiều nơi từ bắc chí nam. Thường mọc trên các cồn cát ở các tỉnh ven biển, nhưng cũng gặp ở đồng bằng và cả ở vùng trung du [15]. Cây thường được trồng bằng những đoạn cành. Bàng biển là loại cây bụi ưa sáng và có khả năng chịu hạn cao, thường mọc thành bụi lớn ở ven đồi, hai bên đường đi, nhất là các truông gai, bãi cát ven biển. Ở vùng đồi cát, truông gai khô cằn như Bình Thuận, Ninh Thuận, cây vẫn sinh trưởng phát triển tốt và ra hoa kết quả nhiều. Trong khi đó, những cây mọc hoặc được trồng ở đồng bằng Bắc Bộ thấy ra hoa nhiều nhưng ít quả. Cây không cần chăm sóc nhiều, ít bị sâu bệnh, thỉnh thoảng có sâu xanh hại lá [15]. 1.3.3. Đặc điểm thực vật Bàng biển là một loại cây bụi có hoa thường xanh mọc cao khoảng 2-3m, đôi khi đến 6m. Cây phân nhánh, hóa gỗ ở gốc, có thân cây đường kính tới 10
  18. 20cm. Cành có lông trắng, sáng lấp lánh [34]. Lá có cuống ngắn khoảng 0,5cm hoặc không có cuống, lá to hình thuôn, gốc hình tim, đầu tù hơi nhọn. Lá dài từ 12cm đến 20cm, rộng 5cm đến 10cm, hai mặt đều có lông trắng, mặt dưới nhiều hơn. Mặt dưới lá có gân nổi rõ; gân giữa rộng và có một tuyến lớn ở phần gần cuống lá. Xung quanh tuyến có lông màu hung đỏ, hơi cứng và thô [10]. Hoa mọc thành chùm dày đặc, màu trắng pha tím. Hoa có thùy hình trứng, mặt ngoài có lông, xuất hiện ở nách hoặc đầu cành. Mùa hoa gần quanh năm, chủ yếu tháng 12-1. Quả hình giáo, thuôn nhọn dần về phía đầu, chứa nhiều hạt có hình trứng dẹt, nhỏ, có vân trắng mượt, có chùm lông [12]. Tất cả các bộ phận của cây đều tiết ra nhựa mủ trắng khi bị cắt hoặc bẻ [34]. Mùa hoa quả vào tháng 5-8 [15]. 1.3.4. Thành phần hóa học Nhiều hoạt chất đã được phân lập từ cây và có hoạt tính sinh học như các flavonoids, triterpenoids, alkaloid, steroid, glycoside, saponin, terpens, enzyme, acid béo, este của calotropeols Cụ thể, người ta đã phân lập được từ phần trên mặt đất của Bàng biển các hợp chất calotropysid, taraxasteryl acetat. Nhựa mủ của BB chứa calotropin D (I) và D (II); triterpene; 2 đồng phân α và β-calotropeol. Ngoài ra còn có glutathione – 1 enzym tương tự paparin [15]. Trong rễ cây có chứa một dẫn xuất của naphtalene là calotropnaphtalene, hai dẫn xuất terpen là calotropisesquiterpen và calotropisesterpenol, một dẫn xuất thơm calotrobenzofuranone [29]. Nghiên cứu của Mai T. T. Nguyen và cộng sự (2020) cho thấy đã phân lập được 6 glycoside cardenolide là caloside A- F và chứng minh được các hợp chất này có độc tính với dòng tế bào PANC-1 và HeLa [46]. Cấu trúc của các hợp chất này được trình bày ở hình 1.3. 11
  19. Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất glycoside cardenolide phân lập từ rễ của cây BB Lá BB chứa các hợp chất α,β-calotropeol; α, β-amyrin; các acid béo no và không no. Nghiên cứu của Pratap Keshari Pattnaik và cộng sự (2017) cho thấy từ chiết xuất EtOH của lá phân lập được palmitic acid (46.01%), diterpene (26.53%), triterpene (17.39%), linoleic acid (5.13%) [36]. Trong khi đó, nghiên cứu của Khang D.H. Nguyen và cộng sự (2017) phân lập được một lignan mới là 90-methoxypinoresinol (1); hai hợp chất glycosylated 5-hydroxymethylfurfurals mới, calofurfuralside A (2) và calofurfuralside B (3); cùng với 9 hợp chất đã biết (4–12) [45]. Cấu trúc của những hợp chất này được trình bày trong hình 1.4. Hình 1.4. Cấu trúc của một số hợp chất phân lập từ lá của cây BB 12
  20. 1.3.5. Một số nghiên cứu của dược liệu Bàng biển 1.3.5.1. Nghiên cứu độc tính Bàng biển (BB) được biết đến từ lâu là một loại cây có thể gây độc khi dùng ở liều cao do chứa một số hợp chất như glycoside tim, calotropone Thậm chí, nhựa mủ của họ cây này còn có thể gây bỏng và giảm sút tầm nhìn của mắt nếu tiếp xúc trực tiếp [19]. Ngày nay, khi thiết lập một nghiên cứu về bất kì hoạt chất nào của BB, việc lập hồ sơ độc tính của cây là việc bắt buộc [29]. Công việc này hầu hết là thử độc tính cấp hoặc bán cấp trên động vật thí nghiệm. Jaliwala và cộng sự (2011) trong khi nghiên cứu các tác dụng chống ho, chống hen suyễn và long đờm đã kiểm tra và xác định LD50 của các cao chiết ethanol và cao nước từ phần trên mặt đất của dược liệu BB theo hướng dẫn của OECD 420. Các mức liều đầu tiên được thử nghiệm là 10, 100 và 1000 mg/kg; không có trường hợp tử vong nào được ghi nhận. Thử nghiệm được tiến hành với các mức liều cao hơn là 1.600, 2.900, 5.000 mg/kg và đã ghi nhận có trường hợp tử vong trong 24h sau khi uống. Kết quả cho thấy liều dùng an toàn là 250 và 500 mg/kg theo đường uống [28]. Trong một nghiên cứu tác dụng điều trị tiêu chảy của cao chiết toàn phần rễ BB, thử nghiệm độc tính cấp đường uống đã được thực hiện với liều duy nhất 2000 mg/kg. Các mức liều được sử dụng trong nghiên cứu lần lượt là 100, 200 và 400 mg/kg (Rahman và cộng sự, 2012) [29]. Cao chiết methanolic rễ BB được thử nghiệm độc tính cấp trong một nghiên cứu bảo vệ tim mạch với liều duy nhất 2000 mg/kg. Thử nghiệm độc tính cấp đường uống theo hướng dẫn của OECD 423, kết quả cho thấy cao chiết không có dấu hiệu gây độc tính ở động vật thí nghiệm. Các mức liều được sử dụng trong nghiên cứu là 200 và 400 mg/kg, tương đương 1/10 và 1/5 liều thử nghiệm độc tính (Davey và cộng sự, 2011) [29]. 1.3.5.2. Các nghiên cứu dược lý trên thế giới a. Tác dụng chống viêm, điều trị hen phế quản 13
  21. Hen phế quản là một bệnh viêm mãn tính, đặc trưng bởi sự co thắt phế quản và viêm đường hô hấp (theo GINA 2018). Cơ chế chính của hen phế quản là tình trạng viêm đường hô hấp mạn tính có sự tham gia của nhiều loại tế bào như tế bào mast, bạch cầu ái toan, tế bào lympho T và đại thực bào cùng với các chất trung gian hoá học (histamin, cysteinyl leukotriene, prostaglandin D2) dẫn tới một số thay đổi về mặt sinh lý bệnh học của đường hô hấp (đường dẫn khí bị hẹp lại, thay đổi cấu trúc đường dẫn khí và tăng tính phản ứng của phế quản) [4]. Trong y học cổ truyền, Bàng biển đã được dùng với tác dụng chữa hen suyễn. Thành phần hoạt chất quan trọng trong lá Bàng biển là α-và β-amyrin làm giảm tổng hợp leukotriene bằng cách ức chế enzyme lipoxygenase. Việc làm giảm leukotriene giúp mang lại hiệu quả chống viêm và giãn phế quản. Đồng thời, cơ chế chống viêm của BB được xác định tương tự như Dexamethasone - một corticoid có hoạt lực chống viêm mạnh [21]. Một nghiên cứu của Bulani và cộng sự (2011) đã sử dụng mô hình gây phản ứng phản vệ của albumin trứng và hợp chất 48/80 (polymer được tạo ra bởi sự ngưng tụ của N-methyl-p-methoxyphenethylamine với formaldehyde) có tác dụng giảm tế bào mast để đánh giá tác dụng chống viêm của cao chiết MeOH từ rễ BB. Liều đánh giá là 100, 200, 400 mg/kg. Tác dụng chống phản vệ và bảo vệ tế bào mast được ghi nhận ở liều 400 mg/kg, tác dụng của cao chiết dược liệu tương đương với thuốc đối chứng Dexamethasone [43]. Nghiên cứu của Khadar Shaik và cộng sự (2017) thực hiện đánh giá tác dụng kháng histamine gây co thắt phế quản trên chuột lang. Histamine là một trong những chất trung gian gây viêm chính trong giai đoạn cấp của bệnh hen phế quản, gây tăng phản ứng đường thở và thụ thể histamine H1 có hoạt động mạnh hơn H2. Nghiên cứu sử dụng cao chiết EtOH lá BB ở liều 50 mg và 100 mg/kg. Thuốc đối chứng là Clorpheneramine maleate 2 mg/kg. Kết luận từ nghiên cứu cho thấy tác dụng kháng histamine của chiết xuất BB có thể so sánh với thuốc đối chứng, ở liều 50 mg/kg có tác dụng và hoạt động chống co thắt tăng lên theo liều [30]. 14
  22. Tác dụng chống hen, chống ho và long đờm của các cao chiết từ hoa Bàng biển được Jaliwala (2011) thực hiện lần lượt trên ba đối tượng là chuột lang, chuột nhắt trắng và chuột cống trắng Wistat. Liều đánh giá là 250 mg và 500 mg/kg. Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết EtOH có tác dụng tại liều 250 mg/kg và tốt hơn các cao chiết khác từ hoa BB. Cao chiết H2O cho tác dụng phụ thuộc vào liều lượng [28]. b. Tác dụng hạ sốt Nghiên cứu của H. R. Chitme và cộng sự (2005) [26] đã đánh giá tác dụng hạ sốt của Bàng biển bằng cách sử dụng chứng gây sốt do vaccine thương hàn TAB (Typhoid) gây ra ở chuột và thỏ. Ở cả sốt do nấm men và sốt do vaccine TAB, sốt đã giảm đáng kể và nhiệt độ cơ thể trở về bình thường khi dùng liều 200 và 400 mg/kg theo đường dùng tiêm phúc mạc. Dựa trên kết quả của nghiên cứu này, có thể kết luận rằng cao chiết của BB có hoạt tính hạ sốt tiềm năng chống lại cả sốt do nấm men và sốt do vắc-xin TAB gây ra, cho thấy khả năng phát triển BB như một chất hạ sốt hiệu quả tương tự như paracetamol (kết quả từ liều 400 mg/kg). Một điều đáng chú ý ở nghiên cứu này là trong khi thử nghiệm độc tính cấp để tìm LD50 của cao chiết BB, nhóm nghiên cứu đã nhận thấy sự giảm nhiệt độ cơ thể nhẹ ở một số động vật thí nghiệm bị tăng thân nhiệt. Tác giả cho rằng, cơ chế hạ sốt của cao chiết dược liệu BB có liên quan đến việc ức chế enzyme sinh tổng hợp prostaglandin ở vùng dưới đồi. Shirsat Mrunal và cộng sự (2010) đã đánh giá hoạt tính hạ sốt của cao chiết chloroform, n-butanol, ethanol của lá Bàng biển trên mô hình gây sốt do nấm men gây ra ở chuột cống trắng. Cao chiết n-butanol và chloroform gần như cho thấy hoạt tính mạnh tương đương nhau khi so sánh với chất đối chứng được dùng trong nghiên cứu là paracetamol liều 150 mg/kg [29,40]. c. Tác dụng chống sốt rét Nghiên cứu của P.V.V. Satish, D. Santha Kumari & K. Sunita (2017) [35] nhằm đánh giá các hoạt động chống sốt rét in vitro của lá, thân và hoa của cây Bàng biển chống lại Plasmodium falciparum nhạy cảm với chloroquine (chủng 15
  23. 3D7) và độc tính tế bào của nó đối với các dòng tế bào THP-1. Cao chiết cho thấy hiệu lực trong hoạt động chống sốt rét in vitro thì sẽ được thử nghiệm thêm in vivo chống lại P. berghei (chủng ANKA) để xác nhận hiệu quả của nó. Trong số tất cả các cao chiết, cao chiết MeOH của lá BB cho thấy hoạt tính chống sốt rét cao nhất với giá trị IC50 là 12,17 µg/ml. Trong đánh giá độc tính tế bào, không có cao chiết nào cho thấy độc tính tế bào trên dòng tế bào THP-1. Kể từ khi cao chiết MeOH từ lá của BB cho thấy hoạt tính chống sốt rét tốt trong in vitro, nó đã được thử nghiệm in vivo và đã cho thấy hiệu quả chống lại ký sinh trùng sốt rét [35]. d. Tác dụng chống tiêu chảy Nghiên cứu được thực hiện trên cao chiết hydroethanolic của thân cây Bàng biển. Sử dụng dầu thầu dầu gây bệnh lý tiêu chảy, đi ngoài ra máu. Liều thử nghiệm là 250 mg/kg, 500 mg/kg, thực hiện trên đối tượng chuột cống trắng Wistar. Tần suất đi ngoài trung bình phụ thuộc vào liều lượng và giảm dần sau 4 giờ nhưng ở liều 500 mg/kg, gần như không có chuột nào đi ngoài ở khoảng thời gian 2 giờ ban đầu và sau 3 giờ, tần suất đi ngoài là 68%. Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết liều 500 mg/kg được dùng 1 giờ trước khi dùng dầu thầu dầu đã ức chế đáng kể sự đi ngoài và làm giảm đáng kể nhu động của ruột non [29]. e. Tác dụng chống oxy hóa Năm 2012, Deepa Krushna Ingawale và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu đánh giá tác dụng chống oxy hóa của cao chiết EtOH hoa Bàng biển trên đối tượng chuột nhắt trắng (25-30g), cả in vivo và in vitro. Mô hình in vivo sử dụng CCl4 gây tổn thương gan, liều đánh giá là 250 mg/kg và 500 mg/kg, thuốc đối chứng là silymarin với liều 100 mg/kg. Kết quả cho thấy, nhóm sử dụng cao chiết hoa BB làm giảm ALT và AST tương đương với nhóm sử dụng silymarin. Bên cạnh đó, nghiên cứu in vitro cũng cho thấy các hoạt động thu gom gốc anion hydroxyl, nitric oxide và hydrogen peroxide của cao chiết BB [24]. 16
  24. Nghiên cứu của Choudhary và cộng sự (2013) đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào β tuyến tụy của cao chiết cloroform thực hiện trên mô hình chuột cống trắng Wistar được gây bệnh tiểu đường bằng Streptozocin pha trong đệm citrate. Liều đánh giá là 100 và 200 mg/kg, thuốc đối chứng là glibenclamide 5 mg/kg. Kết quả cho thấy, cao chiết BB cho tác dụng giảm TBARS (Các chất phản ứng với axit thiobarbituric, đây là một cách phổ biến để đo các sản phẩm peroxy hóa lipid trong tế bào) và tăng mức superoxide dismutase, catalase và glutathione của tuyến tụy tương đương với thuốc đối chứng, điều này thể hiện đặc tính chống đái tháo đường của cao chiết BB [23]. Các tác dụng dược lý khác của loài cây này như tác dụng kháng khuẩn [22,32], tác dụng thúc đẩy hình thành tế bào thần kinh [31] cũng đã được chứng minh. 1.3.5.3. Các nghiên cứu dược lý được báo cáo tại Việt Nam Theo tìm hiểu, tại Việt Nam có rất ít tài liệu nghiên cứu tác dụng dược lý của dược liệu Bàng biển và chưa có nghiên cứu nào về tác dụng hạ sốt của dược liệu này. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cao chiết toàn phần, cao chiết phân đoạn và cao chiết tiêu chuẩn lá Bàng biển để đánh giá tác dụng hạ sốt trên mô hình thỏ gây sốt bằng lipopolysaccharide (LPS). 1.3.6. Sử dụng trong y học cổ truyền 1.3.6.1. Tại Việt Nam Dược liệu Bàng biển (Lá hen, Bồng bồng, Nam tỳ bà) [10] - Tính, vị: vị đắng chát, tính mát. Quy vào kinh phế. - Công năng: Trừ đờm, chỉ khái, giáng khí nghịch, tiêu độc. - Chủ trị: Hen suyễn kèm ho nhiều, đờm nhiều. Dùng ngoài trị bệnh ngoài da: lở, ngứa, rắn cắn. Chữa đau răng, chấy rận. - Bộ phận dùng: Toàn cây - Kêng kỵ: Phụ nữ có thai và trẻ em dưới 1 tuổi. Một số thang thuốc có thành phần chính là BB: 17
  25. - Chữa ho: Cần có 10 g BB, 15 g cam thảo đất cùng với 15 g vỏ rễ cây dâu. Các vị thuốc này đem rửa sạch rồi cho vào nồi, đổ thêm 1 thăng nước. Sắc trên lửa nhỏ để thu lấy khoảng 300 ml. Chia đều ra thành 3 lần uống trong ngày khi nước thuốc còn ấm. Dùng với liều lượng chỉ 1 thang mỗi ngày. - Chữa hen suyễn: Cần chuẩn bị 20 g BB, 30 g rau khúc cùng với khoảng 16 g cam thảo đất. Các vị thuốc này rửa sạch rồi cho hết vào ấm sắc cùng 600 ml nước để thu lấy 200 ml. Chia làm 2 lần uống trong ngày. Duy trì đều đặn mỗi ngày 1 thang đến khi triệu chứng của bệnh hết hẳn - Diệt chấy và trứng chấy: Nhựa cây BB cùng dầu dừa với lượng bằng nhau. Cho 2 nguyên liệu trên vào nồi rồi đun nóng trên lửa nhỏ cho tan vào nhau. Chờ thuốc ấm rồi thoa lên tóc và ủ trong khoảng 1 giờ. Cuối cùng gội lại đầu với nước sạch. 1.3.6.2. Trên thế giới Bàng biển được sử dụng phổ biến ở các nước Châu Á như Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ với công dụng trị hen suyễn. Tại Trung Quốc, BB còn dùng để trị giun sán và bệnh phong trong khi ở Ấn Độ thì được biết đến với công dụng trị ngộ độc, rắn cắn, co giật [29]. Mỗi bộ phận của cây đều có tác dụng nhất định. Lá được sử dụng để điều trị cảm lạnh nặng và các bệnh về tim. Nước ép của lá được sử dụng trong điều trị sốt. Ở Châu Phi, khói lá đốt khô được hít vào để làm dịu cơn hen [17]. Lá giã nát đắp lên dùng làm thuốc đắp lên vết loét, vết bỏng, nhức đầu và đau thấp khớp. Vỏ cây được dùng làm thuốc chữa bệnh viêm da và bệnh giang mai. Vỏ được tán thành bột dùng chữa tiêu chảy, kiết lỵ, tỳ vị hư hàn, co giật, đau thắt lưng, phù chân voi, phong, ghẻ lở, hắc lào, viêm phổi [17]. Nhựa mủ của cây đông lại khi ấm và được cho là có đặc tính tương tự như digitalis. Nó cũng được coi là chất khử trùng, gây nôn, nhuận tẩy và giảm tiết. Nhựa cây cũng được sử dụng trong việc điều trị một loạt các bệnh khác bao gồm 18
  26. bệnh kiết lỵ, bệnh phong, bệnh phù chân voi, động kinh, hen suyễn và nhiều bệnh khác. Khi trộn với muối, nó được dùng như một chất gây nôn để điều trị cảm lạnh nặng. Ở Nepal, nhựa mủ được dùng để chữa bong gân, đau nhức cơ thể, nhọt và mụn nhọt. Mủ sữa được sử dụng bên ngoài để cầm máu và điều trị một loạt các bệnh bao gồm nấm ngoài da, mụn nhọt, ghẻ, vết đốt, vết bỏng, vết bầm tím, vết cắt, vết loét và vết thương. Nó được áp dụng cho nướu và răng để điều trị sâu răng [17]. Rễ cây có tác dụng chữa phù chân voi, phong, kiết lỵ. Hoa trị vàng da, viêm loét, hen suyễn, giun sán, động kinh. Phần cùi quả có tác dụng phá thai [17]. Một số tác dụng khác: + Một chất xơ mịn thu được từ vỏ của thân cây. Nó được sử dụng nhiều để làm hàng dệt, lưới đánh cá, dây cung và làm giấy [12]. + Vỏ hạt trưởng thành chứa một lượng lớn tơ thô, có nhiều công dụng khác nhau. Ví dụ, nó có thể được sử dụng để nhồi gối, v.v. hoặc trộn với các loại sợi khác để làm vải hoặc có thể được sử dụng như một chất hỗ trợ nổi trong áo phao hoặc làm vật liệu nhồi [17]. + Nhựa mủ được sử dụng để làm thuốc nhuộm màu vàng và thuộc da. Một số bộ lạc châu Phi sử dụng nhựa mủ làm chất độc bôi ở đầu mũi tên.[42] + Thân cây hóa gỗ đôi khi được sử dụng để làm nhiên liệu, nhưng chất lượng kém. Tuy nhiên, than củi có chất lượng tốt được lấy từ gỗ và có thể được sử dụng để làm thuốc súng [12]. 19
  27. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Mẫu dược liệu Mẫu dược liệu Bàng biển (Calotropis gigantea, lá) được thu hái năm 2019 tại Kiên Lương - Kiên Giang. Dược liệu được thu mẫu và giám định tên khoa học bởi Thạc sỹ Cao Ngọc Giang, Bộ môn Tài nguyên dược liệu - Trung tâm Sâm và Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh, tiêu bản được lưu tại khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu. Mẫu được loại bỏ tạp rồi sấy khô ở nhiệt độ dưới 50oC đến khi có độ ẩm dưới 12%. Dược liệu được cắt, xay nhỏ đến kích thước 2-3 mm. 2.1.2. Nguyên liệu nghiên cứu Cao chiết toàn phần, cao chiết phân đoạn và cao tiêu chuẩn lá Bàng biển được cung cấp bởi Khoa Hóa Thực Vật- Viện Dược liệu. Quy trình chuẩn bị các cao chiết này được tóm tắt như sau: - Để chuẩn bị cao chiết cồn toàn phần, 100 g dược liệu được chiết hồi lưu 3 lần bằng ethanol 70% với tỷ lệ dung môi/dược liệu lần lượt là 10, 8, 8/1 (thể tích/khối lượng), thời gian tương ứng với mỗi lần chiết là 2,5 giờ, 2 giờ và 1 giờ. Dịch chiết của 3 lần được lọc rồi gộp lại, cất thu hồi ethanol dưới áp suất giảm, sau đó cô hết nước trên bếp cách thủy rồi sấy trong tủ sấy chân không đến khi thu được cao khô, độ ẩm dưới 5%. Sơ đồ chuẩn bị cao chiết cồn toàn phần, hiệu suất chiết và độ ẩm của các cao chiết được trình bày trong hình 2.1. 20
  28. Hình 2.1. Sơ đồ chuẩn bị cao chiết cồn toàn phần Bàng biển - Các phân đoạn chiết của Bàng biển được chuẩn bị mẫu như sau: 1kg lá Bàng biển khô được chiết hồi lưu 3 lần bằng ethanol 70% với tỷ lệ dung môi/dược liệu lần lượt là 10, 8, 8/1 (thể tích/khối lượng), nhiệt độ hồi lưu của dung môi, thời gian chiết cho 3 lần là 2,5h; 2h và 1,5h. Dịch lọc 3 lần chiết được cô cạn đến khi còn khoảng 1,5 – 2l. Các dịch này được chiết phân đoạn lỏng- lỏng lần lượt với các dung môi dichloromethane (DCM), ethyl acetate (EtOAC) và n-butanol (n-BuOH). Mỗi lần chiết với 1 loại dung môi được thực hiện tối thiểu 3 lần, theo dõi bằng quan sát màu dịch chiết ở pha hữu cơ và bằng chấm sắc ký lớp mỏng. Các phân đoạn dung môi hữu cơ riêng biệt được cất thu hồi dưới áp suất giảm, sấy khô trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ không quá 50oC đến khi độ ẩm dưới 5%. Sơ đồ quy trình chiết các phân đoạn và hiệu suất chiết được trình bày trong hình 2.2. 21
  29. Hình 2.2. Sơ đồ chuẩn bị cao chiết phân đoạn Bàng biển - Quy trình chuẩn bị cao chiết tiêu chuẩn Bàng biển: 200g lá Bàng biển khô được chiết hồi lưu 2 lần bằng ethanol 70% với tỷ lệ dung môi/dược liệu lần lượt là 8, 6/1 (thể tích/khối lượng), kích thước dược liệu < 2cm, thời gian chiết cho 2 lần là 2 h và 1,5 h. Dịch chiết hai lần được gộp lại cô bớt dung môi về thể tích khoảng 1000 ml. Dịch chiết sau đó được ly tâm trong 15 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút thu được phần cắn và phần dịch. Phần dịch được đem đi cất loại dung môi và sấy khô. Các cao chiết được sấy khô đến độ ẩm dưới 5%, cân khối lượng và định lượng hàm lượng flavonoid sau khi thủy phân tính theo isorhamnetin. Sơ đồ chuẩn bị cao chiết tiêu chuẩn, hiệu suất chiết và hàm lượng isorhamnetin trong cao sau thủy phân được trình bày trong hình 2.3. 22
  30. Hình 2.3. Sơ đồ chuẩn bị cao tiêu chuẩn Bàng biển 2.1.2. Động vật thí nghiệm Thỏ trưởng thành chủng New Zealand White, màu trắng, khỏe mạnh, cả 2 giống, cân nặng 1,8-2,2 kg, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do cơ sở Chăn nuôi và cung cấp động vật thí nghiệm Đan Phượng - Hà Nội cung cấp. Chuột nhắt trắng, cả hai giống đực và cái, cân nặng từ 18-25g, khỏe mạnh bình thường do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp. Động vật thí nghiệm được nuôi trong phòng chăn nuôi ở điều kiện duy trì nhiệt độ 24 - 25oC với độ ẩm 65 ± 5% và chu kỳ 12 giờ sáng-tối (sáng từ 6:00 - 23
  31. 18:00). Thức ăn và nước uống được cung cấp theo nhu cầu. Động vật được nuôi ổn định 3 - 5 ngày trước khi được sử dụng làm thí nghiệm. 2.1.3. Hóa chất, dụng cụ - Chất gây sốt lipopolysaccharide (Sigma- Aldrich, Hoa Kỳ). - Paracetamol (Biệt dược Efferalgan -Bristol-Myers Squibb, Pháp). 2.1.4. Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu - Cân: Cân phân tích Precisab XT 220A, độ chính xác 0,0001g; cân kỹ thuật Precisa BJ 610C. - Nhiệt kế điện tử Omron MC – 246. - Kim tiêm các thể tích, đầu kim tù để cho chuột uống thuốc. 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện tại khoa Dược lý Sinh hóa – Viện Dược liệu. 2.2.2. Thời gian nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 1/2020 đến tháng 5/2021. 2.3. Nội dung nghiên cứu Để đạt được các mục tiêu nghiên cứu đề ra, đề tài được thiết kế với các nội dung sau: Nội dung 1: Đánh giá được tác dụng hạ sốt của cao chiết toàn phần và cao chiết phân đoạn BB trên mô hình thỏ gây sốt bằng LPS thông qua các thử nghiệm: Đánh giá tác dụng hạ sốt của cao chiết toàn phần lá BB trên mô hình thỏ gây sốt bằng LPS. Đánh giá tác dụng hạ sốt của cao chiết phân đoạn lá BB trên mô hình thỏ gây sốt bằng LPS. Nội dung 2: Đánh giá được độc tính cấp của cao chiết tiêu chuẩn lá BB trên chuột nhắt trắng. 24
  32. Nội dung 3: Đánh giá được tác dụng hạ sốt của cao chiết tiêu chuẩn lá BB trên mô hình thỏ gây sốt bằng LPS. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ sốt Tác dụng hạ sốt của cao chiết lá Bàng biển được đánh giá trên mô hình thỏ gây sốt bằng LPS của H. Gerhard Vogel [25] có sửa đổi cho phù hợp thực tế phòng thí nghiệm. Nguyên tắc: Đại phân tử LPS vào cơ thể làm sinh tổng hợp TNF-α, IL1, IL6 [44] và prostaglandin E2 [37] tác dụng vào vùng dưới đồi làm thay đổi điểm đặt nhiệt của cơ thể gây ra phản ứng sốt. Mẫu thử được coi là có tác dụng khi sự thay đổi thân nhiệt động vật thí nghiệm của lô thử nghiệm so với lô chứng bệnh lý đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05 và p < 0,01). Bố trí thí nghiệm: Thỏ cả hai giống đực cái, trọng lượng 1,8-2,2 kg, được nuôi ổn định với điều kiện nghiên cứu. Thí nghiệm được thực hiện theo 4 đợt. Bố trí thí nghiệm theo từng đợt được trình bày bên dưới. Đợt 1: Mẫu thử là cao chiết toàn phần Bàng biển. Chia thành 5 lô thỏ, mỗi lô được bố trí như sau: - Lô 1 (n=6 con): chứng bệnh lý, uống nước cất. - Lô 2 (n=6 con): lô thí nghiệm, uống cao chiết cồn toàn phần liều 125 mg/kg - Lô 3 (n=6 con): lô thí nghiệm, uống cao chiết cồn toàn phần liều 250 mg/kg - Lô 4 (n=6 con): lô thí nghiệm, uống cao chiết cồn toàn phần liều 500 mg/kg - Lô 5 (n= 5 con): chứng dương, uống Paracetamol liều 150 mg/kg. Đợt 2: Mẫu thử là cao chiết phân đoạn Bàng biển liều 25 mg/kg. Chia thành 5 lô thỏ, mỗi lô được bố trí như sau: 25
  33. - Lô 1 (n=6 con): chứng bệnh lý, uống nước cất. - Lô 2 (n=6 con): lô thí nghiệm, uống cao chiết phân đoạn Dichloromethane (DCM) liều 25 mg/kg. - Lô 3 (n=6 con): lô thí nghiệm, uống cao chiết phân đoạn Ethyl Acetate (EtOAc) liều 25 mg/kg. - Lô 4 (n=6 con): lô thí nghiệm, uống cao chiết phân đoạn n-Butanol (n- BuOH) liều 25 mg/kg. - Lô 5 (n= 5 con): chứng dương, uống Paracetamol liều 150 mg/kg. • Đợt 3: Mẫu thử là cao chiết phân đoạn Bàng biển liều 50 mg/kg. Chia thành 6 lô thỏ, mỗi lô được bố trí như sau: - Lô 1 (n=6 con): chứng bệnh lý, uống nước cất. - Lô 2 (n=6 con): lô thí nghiệm, uống cao chiết phân đoạn Dichloromethane (DCM) liều 50 mg/kg. - Lô 3 (n=6 con): lô thí nghiệm, uống cao chiết phân đoạn Ethyl Acetate (EtOAc) liều 50 mg/kg. - Lô 4 (n=6 con): lô thí nghiệm, uống cao chiết phân đoạn n-Butanol (n- BuOH) liều 50 mg/kg. - Lô 5 (n=6 con): lô thí nghiệm, uống cao nước liều 50 mg/kg. - Lô 6 (n= 5 con): chứng dương, uống Paracetamol liều 150 mg/kg. Đợt 4: Mẫu thử là cao chiết tiêu chuẩn Bàng biển. Chia thành 5 lô thỏ, mỗi lô được bố trí như sau: - Lô 1 (n=6 con): chứng bệnh lý, uống nước cất. - Lô 2 (n=6 con): lô thí nghiệm, uống cao chiết tiêu chuẩn liều 50 mg/kg - Lô 3 (n=6 con): lô thí nghiệm, uống cao chiết tiêu chuẩn liều 100 mg/kg - Lô 4 (n=6 con): lô thí nghiệm, uống cao chiết tiêu chuẩn liều 150 mg/kg 26
  34. - Lô 5 (n= 5 con): chứng dương, uống Paracetamol liều 150 mg/kg. Tiến hành: - Đo nhiệt độ trực tràng thỏ tại các thời điểm trước khi gây sốt, mỗi con đo 2 lần, mỗi lần cách nhau khoảng 30 phút (nếu 2 lần đo mà số liệu không tương đương nhau thì đo lại lần thứ 3). - Cho uống nước cất đối với lô bệnh lý và cho uống thuốc với lô thử và lô chứng. - Ngay sau thời điểm cho thỏ uống thuốc, gây sốt bằng LPS được pha trong nước cất, tiêm tĩnh mạch tai thỏ liều 200 µg/kg (thể tích tiêm 0,2 ml/kg thỏ). - Đo nhiệt độ trực tràng thỏ sau khi gây sốt 60 phút, 90 phút và 120 phút (hình 2.4.). Hình 2.4. Sơ đồ thiết kế thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ sốt của cao chiết dược liệu Thông số đánh giá: - Nhiệt độ của thỏ ở thời điểm ban đầu (To) và ở các thời điểm 60, 90 và 120 phút sau khi tiêm LPS của các lô bệnh lý, lô thử và chứng dương paracetamol. - Sự thay đổi nhiệt độ (∆t) của thỏ ở các lô nghiên cứu ở các thời điểm 60, 90 và 120 phút so với thời điểm ban đầu To. 27
  35. TB∆tbệnhlý− TB∆tthử - Phần trăm (%) giảm nhiệt: x 100 TB∆tbệnhlý - Trong đó: + TB∆tbệnhlý: Giá trị trung bình sự thay đổi nhiệt độ (∆t) của các con thỏ ở lô chứng bệnh lý + TB∆tthử: Giá trị trung bình sự thay đổi nhiệt độ (∆t) của các con thỏ ở lô uống thuốc thử nghiệm tác dụng hạ sốt. 2.4.2. Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp Thử nghiệm độc tính cấp được thực hiện theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon và Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu của Bộ Y Tế [2,9], có điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Tiến hành: Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn 18 giờ, nước uống đầy đủ. Nước cất và thuốc thử được đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù với cùng thể tích. Theo dõi tình trạng chung và số lượng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ sau khi cho uống. Tìm liều cao nhất chuột không chết và liều thấp nhất gây chết 100%. Tiếp tục theo dõi tình trạng chung của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc thử lần đầu (theo dõi về sự ăn uống, hoạt động thần kinh, đi lại, leo trèo, bài tiết, ) Nếu chuột chết, mổ chuột để đánh giá đại thể các tổn thương của các cơ quan, nếu cần thiết có thể làm xét nghiệm vi thể một số phủ tạng. Thông số đánh giá: LD50 – Liều tối thiểu gây chết 50% số động vật thí nghiệm. Sử dụng công thức tính LD50 của Behrens – Karber [9,11]: 28
  36.  LD50 = Df – ( ) 푛 Trong đó: Df: Liều tối thiểu làm chết 100% chuột a: trị số trung bình của số chuột chết giữa 2 lô kế tiếp b: Hiệu số liều giữa 2 lô kế tiếp n: Số động vật mỗi lô hoặc trung bình số động vật giữa các lô thí nghiệm. 2.5. Phương pháp xử lý số liệu Kết quả được biểu diễn dưới dạng M SE trong đó M là trị số trung bình, SE là sai số chuẩn. So sánh ∆t của các lô mẫu thử với lô chứng bệnh lý tại cùng thời điểm. Kết quả nghiên cứu được trình bày dưới dạng M SE. Sự khác biệt giữa các nhóm được đánh giá bằng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (ONE WAY ANOVA) sau đó sử dụng test hậu kiểm Student-Newman-Keuls để so sánh từng cặp sử dụng phần mềm phân tích thống kê SigmaPlot 12.0 (SYSTA Software Inc, Richmond, CA, USA). So sánh các giá trị trung bình đạt ý nghĩa thống kê với P < 0,05. 29
  37. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 3.1. Tác dụng hạ sốt của cao chiết toàn phần Bàng biển Tác dụng hạ sốt của cao chiết toàn phần lá Bàng biển trên thỏ gây sốt bằng LPS được trình bày trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Tác dụng hạ sốt của cao chiết toàn phần trên thỏ gây sốt bằng LPS Chứng Cao chiêt toàn phần Bàng biển Paracetamol Lô bệnh lý 125 mg/kg 250 mg/kg 500 mg/kg 150 mg/kg Thông số (n=6) (n=6) (n=6) (n=6) (n=5) To 38,6±0,2 38,5±0,1 38,7±0,1 38,7±0,2 38,9±0,1 t 39,9±0,1 39,2±0,2 39,5±0,1* 39,7±0,3 39,2±0,1 60 ∆t 1,3±0,1 0,6±0,1 0,8±0,1 1,0±0,2 0,4±0,1 phút % giảm nhiệt 51,8 41,7 26,9 72,3 t 39,8±0,1 39,3±0,1* 39,5±0,1 39,6±0,2 39,1±0,1 90 ∆t 1,2±0,1 0,8±0,1* 0,8±0,1* 0,8±0,1* 0,3±0,1 phút % giảm nhiệt 31,1 32,4 29,6 78,0 t 39,8±0,1 39,3±0,1* 39,3±0,2* 39,3±0,2 39,1±0,1 120 ∆t 1,2±0,1 0,7±0,1* 0,6±0,1 0,6±0,1 0,2±0,1 phút % giảm nhiệt 37,0 51,1 48,2 84,5 * p <0,05, p <0,01 khi so sánh với nhóm chứng bệnh lý Nhận xét: Sau khi tiêm LPS, lô chứng bệnh lý có sự tăng nhanh nhiệt độ ở thời điểm 60 phút và duy trì nhiệt độ cao ở các thời điểm 90, 120 phút so với thời điểm ban đầu với mức tăng nhiệt trung bình là 1,2-1,3oC. Thỏ được uống thuốc đối chứng dương Paracetamol liều 150 mg/kg có nhiệt độ giảm rõ rệt và cho thấy tác dụng hạ sốt tại các thời điểm 60, 90 và 120 phút từ thời điểm gây sốt (p < 0,01) với tỷ lệ % giảm nhiệt so với lô chứng bệnh lý lần lượt là 72,3%; 78% và 84,5%. Lô uống cao chiết toàn phần BB với liều 125 mg/kg tại cả 3 thời điểm 60 phút, 90 phút và 120 phút sau khi gây sốt đều cho thấy tác dụng hạ sốt đạt ý 30
  38. nghĩa thống kê với p < 0,01 (tại thời điểm 60 phút) và p < 0,05 (tại thời điểm 90 và 120 phút) so với lô chứng bệnh lý, tương đương % giảm nhiệt lần lượt là 51,8; 31,1; 37,0%. Cao chiết toàn phần BB với liều 250 mg/kg tại các thời điểm nghiên cứu đều cho thấy tác dụng hạ sốt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý với p <0,05 (sau 90 phút) và p <0,01 (sau 60 phút và 120 phút) cùng với % giảm nhiệt độ lần lượt là 41,7; 32,4 và 51,1% so với lô chứng bệnh lý cùng thời điểm. Lô uống cao chiết toàn phần BB với liều 500 mg/kg tại các thời điểm 60 phút, 90 phút và 120 phút sau khi gây sốt có % giảm nhiệt lần lượt là 26,9; 29,6 và 48,2% so với lô chứng bệnh lý cùng thời điểm, trong đó có thời điểm 90 phút và 120 phút ức chế đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý với p < 0,05 (tại 90 phút) và p < 0,01 (tại 120 phút). 3.2. Tác dụng hạ sốt của cao chiết phân đoạn Bàng biển Nhằm tìm hiểu phân đoạn có vai trò quan trọng đối với tác dụng hạ sốt của cao chiết Bàng biển, nghiên cứu tiếp theo được tiến hành để đánh giá tác dụng của các cao phân đoạn của Bàng biển bao gồm diclomethan (DCM), Ethyl Acetate (EtOAc), n-Butanol (n-BuOH), cao nước trên mô hình thỏ gây sốt bằng LPS. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.2 và bảng 3.3. 31
  39. Bảng 3.2. Tác dụng hạ sốt của cao chiết phân đoạn BB liều 25 mg/kg trên thỏ gây sốt bằng LPS Chứng DCM EtOAc BuOH Paracetamol Lô bệnh lý 25 mg/kg 25 mg/kg 25 mg/kg 150 mg/kg Thông số (n=6) (n=6) (n=6) (n=6) (n=5) -15 phút 38,9±0,1 38,8±0,1 39,0±0,1 38,8±0,1 38,8±0,1 To 38,8±0,1 38,8±0,1 38,9±0,1 38,8±0,1 38,8±0,1 t 40,0±0,1 39,8±0,1 40,0±0,1 40,0±0,1 39,2±0,1 60 ∆t 1,2±0,1 1,9±0,0 1,1±0,1 1,2±0,1 0,4±0,0 phút % giảm nhiệt 11,59 8,7 -5,80 66,96 t 40,2±0,1 39,9±0,1 40,1±0,1 40,0±0,1 39,1±0,1 90 ∆t 1,3±0,1 1,2±0,1 1,2±0,1* 1,2±0,1 0,3±0,1 phút % giảm nhiệt 10,31 9,49 8,86 77,22 t 40,0±0,1 40,0±0,1 39,9±0,1 39,9±0,1 39,0±0,1 120 ∆t 1,2±0,1 1,3±0,1 1,0±0,1 1,1±0,1 0,2±0,1 phút % giảm nhiệt -7.04 16,90 4,23 81,41 * p 0,05). 32
  40. Bảng 3.3. Tác dụng hạ sốt của cao chiết phân đoạn BB liều 50 mg/kg trên thỏ gây sốt bằng LPS Chứng DCM EtOAc BuOH Nước Paracetamol Lô bệnh lý 50 mg/kg 50 mg/kg 50 mg/kg 50 mg/kg 150 mg/kg Thông số (n=6) (n=6) (n=6) (n=6) (n=6) (n=5) To 38,9±0,1 38,8±0,1 38,9±0,1 38,8±0,1 38,9±0,1 38,8±0,1 t 40,0±0,1 39,7±0,1 39,9±0,1 39,8±0,1 39,9±0,2 39,1±0,0 60 ∆t 1,1±0,1 0,9±0,1 1,1±0,1 1,0±0,1 1,0±0,1 0,3±0,1 phút % giảm nhiệt 13,85 0,00 6,15 5,38 70,46 t 40,2±0,1 40,0±0,0 39,8±0,1 * 39,9±0,1 39,9±0,1 39,2±0,1 90 ∆t 1,3±0,0 1,2±0,1 1,0±0,1 * 1,1±0,1 1,1±0,1 0,4±0,1 phút % giảm nhiệt 9,21 22,37 12,50 17,11 71,58 t 40,0±0,1 39,8±0,2 39,9±0,1 39,8±0,1 39,9±0,1 39,1±0,1 120 ∆t 1,1±0,0 1,0±0,2 1,0±0,1 1,0±0,1 1,1±0,1 0,3±0,1 phút % giảm nhiệt 6,06 6,06 6,06 4,55 76,36 * p <0,05, p <0,01 khi so sánh với nhóm chứng bệnh lý Nhận xét: Sau khi được tiêm chất gây sốt LPS, nhóm chứng bệnh lý có sự tăng nhiệt độ nhanh chóng và duy trì nhiệt độ cao tại các thời điểm 60, 90, 120 phút so với thời điểm ban đầu. Thỏ được uống thuốc chứng dương Paracetamol liều 150 mg/kg cho thấy tác dụng hạ sốt tại các thời điểm 60, 90 và 120 phút (p < 0,01) với % ức chế tăng nhiệt độ lần lượt tại các thời điểm là 70,46%; 71,58%; 76,36%. Lô thỏ sử dụng thuốc thử là cao chiết phân đoạn Ethylacetate ở thời điểm 90 phút cho thấy tác dụng hạ sốt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) với % ức chế tăng nhiệt độ tương ứng là 22,37%. Trong khi các phân đoạn khác chưa thể hiện được tác dụng này. 33
  41. 3.3. Độc tính cấp của cao chiết tiêu chuẩn Bàng biển Kết quả độc tính cấp của cao chiết tiêu chuẩn Bàng biển thể hiện qua tỷ lệ tử vong của các lô chuột nhắt trắng được trình bày trong bảng 3.4 và giá trị LD50 được thể hiện ở bảng 3.5. Bảng 3.4. Tỉ lệ tử vong của các lô chuột nhắt trắng sau khi uống cao chiết tiêu chuẩn lá BB Liều uống Chuột chết Chuột sống Tỉ lệ chết Số lô Số chuột/lô (g/kg) (con) (con) (%) 1 8,3 10 0 10 0 2 9,36 10 3 7 30 3 10,4 10 3 7 30 4 13 10 4 6 40 5 14,6 10 8 2 80 6 16,25 10 10 0 100 Bảng 3.5. Tính LD50 theo phương pháp Karber - Behrens Df 16,25 a 1,5 3 3,5 6 9 b 1,06 1,04 2,6 1,6 1,65 ab 1,59 3,12 9,1 9,6 14,85 Tổng ab 38,26 38,26 Xác định được LD50 = 16,25 - = 12,424 g/kg 10 Theo bảng ngoại suy liều tương đương giữa các loài [2], tính được liều LD50 đường uống trên thỏ như sau: LD50 (thỏ): 12,424 * 0,25 = 3,105 g/kg = 3106 mg/kg Nhận xét: - Lô chuột 1: chuột được cho uống với liều 8,3 g/kg, sau khi uống khoảng 15 phút có 4/10 chuột có biểu hiện mệt (ít vận động), sau khoảng 120 phút thì 34
  42. chuột trở lại hoạt động bình thường. Sau 72 giờ theo dõi không có chuột nào chết, tất cả chuột của lô thí nghiệm đều sống, khỏe mạnh. - Lô chuột 2: chuột được cho uống với liều 9,36 g/kg, sau khi uống khoảng 15 phút có 6/10 chuột có biểu hiện mệt (ít vận động, thở dốc), sau khoảng 20 phút có 1 chuột chết, sau 25 phút có thêm 1 chuột nữa chết và sau 90 phút có 1 chuột chết, các chuột còn lại thì trở lại hoạt động bình thường sau 120- 180 phút (mổ bụng chuột chết không phát hiện được bất thường tại các cơ quan nội tạng). Sau 72 giờ theo dõi, có 3/10 chuột chết, 7 chuột còn lại đều khỏe mạnh. - Lô chuột 3: chuột được cho uống với liều 10,4 g/kg, sau khi uống khoảng 10 phút có 7/10 chuột có biểu hiện mệt (ít vận động, thở dốc), sau khoảng 60 phút có 3 chuột chết, các chuột còn lại trở lại hoạt động bình thường sau khoảng 120-180 phút (mổ bụng chuột chết không phát hiện được bất thường tại các cơ quan nội tạng). Sau 72 giờ theo dõi, có 3/10 chuột chết, 7 chuột còn lại đều khỏe mạnh. - Lô chuột 4: chuột được cho uống với liều 13,0 g/kg, sau khi uống khoảng 10 phút có 7/10 chuột có biểu hiện mệt (ít vận động, thở dốc), sau khoảng 20 phút có 4 chuột chết, các chuột còn lại trở lại hoạt động bình thường sau khoảng 120-180 phút (mổ bụng chuột chết không phát hiện được bất thường tại các cơ quan nội tạng). Sau 72 giờ theo dõi, có 4/10 chuột chết, 6 chuột còn lại đều khỏe mạnh. - Lô chuột 5: chuột được cho uống với liều 14,6 g/kg, sau khi uống khoảng 10 phút có 10/10 chuột có biểu hiện mệt (ít vận động, thở dốc), sau khoảng 15 phút bắt đầu có chuột chết, có 8 chuột chết trong khoảng 15 phút đến 180 phút sau khi uống, các chuột còn lại trở lại hoạt động bình thường sau khoảng 120-180 phút (mổ bụng chuột chết không phát hiện được bất thường tại các cơ quan nội tạng). Sau 72 giờ theo dõi, có 8/10 chuột chết, 2 chuột còn lại đều khỏe mạnh. 35
  43. - Lô chuột 6: chuột được cho uống với liều 16,25 g/kg, chuột có biểu hiện ngộ độc rất nhanh, sau khoảng 3-5 phút đã có chuột nằm, thở dốc, co giật và chết từ phút thứ 10 sau uống. Sau 20 phút tất cả 10/10 chuột chết (mổ bụng chuột chết không phát hiện được bất thường tại các cơ quan nội tạng). 3.4. Tác dụng hạ sốt của cao tiêu chuẩn Bàng biển Để đánh giá tác dụng hạ sốt của cao chiết tiêu chuẩn Bàng biển, thỏ được tiêm dung dịch LPS sau đó được uống cao chiết ở các liều 50, 100 và 150 mg/kg và chứng dương Paracetamol liều 150 mg/kg. Kết quả chỉ số thân nhiệt thỏ ở các thời điểm, mức độ thay đổi nhiệt độ so với thời điểm ban đầu (∆t) được trình bày ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Tác dụng hạ sốt của cao chiết tiêu chuẩn trên thỏ gây sốt bằng LPS Chứng Cao tiêu chuẩn BB Paracetamol Lô bệnh lý 50 mg/kg 100 mg/kg 150 mg/kg 150 mg/kg Thông số (n=6) (n=6) (n=6) (n=6) (n=5) To 39,0±0,1 38,9±0,1 38,9±0,1 39,0±0,1 39.0±0,1 t 40,1±0,1 40,0±0,1 39,8±0,1 39,9±0,1 39,4±0,1 60 ∆t 1,2±0,1 1,1±0,1 0,9±0,1 * 0,9±0,1 * 0,4±0,1 phút % giảm nhiệt 8,63 22,30 25.18 64,75 t 40,2±0,1 40,0±0,1 39,9±0,1 39,9±0,1 * 39,5±0,1 90 ∆t 1,3±0,1 1,1±0,1 0,9±0,1 0,9±0,1 * 0,5±0,1 phút % giảm nhiệt 8,67 25,33 32.00 62,67 t 40,1±0,1 39,9±0,1 39,8±0,1 * 39,9±0,1 39,4±0,1 120 ∆t 1,2±0,1 1,0±0,1 0,8±0,1 0,9±0,1* 0,4±0,1 phút % giảm nhiệt 14,29 30.00 25,71 68,57 * p <0,05, p <0,01 khi so sánh với nhóm chứng bệnh lý Nhận xét Kết quả bảng cho thấy, tại các thời điểm 60, 90 và 120 phút sau khi gây sốt, nhiệt độ của thỏ ở lô chứng bệnh lý tăng từ 1,2 – 1,3oC so với thời điểm ban đầu To. 36
  44. Thỏ được uống thuốc chứng dương Paracetamol liều 150 mg/kg có nhiệt độ giảm rõ rệt với % giảm nhiệt tại các thời điểm 60, 90 và 120 phút lần lượt là 62,75; 62,67 và 68,57 % cho thấy tác dụng hạ sốt tốt (p 0,05). Lô uống cao chiết BB liều 100 mg/kg đều cho thấy tác dụng hạ sốt tại cả 3 thời điểm 60 phút (p < 0,05), 90 và 120 phút (p < 0,01) với % ức chế giảm nhiệt so với lô chứng bệnh lý cùng thời điểm lần lượt là 22,3; 25,33 và 30,0%. Ở lô thỏ cho uống cao chiết BB liều 150 mg/kg cho thấy tác dụng hạ sốt ngay tại thời điểm 60 phút (p < 0,05) và tiếp tục duy trì tác dụng hạ sốt ở thời điểm 90 phút và 120 phút (p <0,05), tỷ lệ % giảm nhiệt so với nhóm chứng bệnh lý cùng thời điểm lần lượt là 25,18; 32,0; 25,71%. 37
  45. CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN Bàng biển (BB) là loại cây bụi thường xanh mọc ở các nước châu Á như Việt Nam, Ấn Độ, Châu Phi. Mỗi một bộ phận từ nhựa mủ đến lá, hoa của cây đều được sử dụng trong chăm sóc sức khỏe và kể cả trong đời sống hằng ngày. Theo kinh nghiệm dân gian, BB được biết đến nhiều với tác dụng chữa hen suyễn, rắn cắn, tiêu chảy. Bắt đầu từ năm 2005, trên thế giới đã xuất hiện nghiên cứu tác dụng hạ sốt của BB, tuy nhiên, ở nước ta hiện tại chưa có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng này. Bên cạnh đó, qua nhiều nghiên cứu và thực tế đã cho thấy BB là một loại cây có chứa một số độc tố nguy hiểm. Vì vậy, để góp phần tìm hiểu và nâng cao giá trị sử dụng của BB, khóa luận tập trung vào công việc nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng hạ sốt của cao chiết lá BB. Trong suốt nhiều thế kỷ, các nhà khoa học đã mô tả sốt là một căn bệnh, tuy nhiên, Carl Reinhold August Wunderlich sau này đã cho rằng “Sốt không phải là một căn bệnh, mà là phản ứng của cơ thể trước căn bệnh” [19]. Sốt là một phản ứng giúp tăng cường hoạt động của hệ miễn dịch, kích thích chuyển hóa tế bào và loại bỏ nguyên nhân gây bệnh. Tuy nhiên, cơn sốt cũng gây ra những phản ứng có hại như tăng nguy cơ xảy ra phản ứng quá mẫn, giảm kẽm và sắt trong máu, sốt quá cao gây mê sảng, lú lẫn, suy tim [19]. Sốt cao còn gây lừ đừ, co giật, biếng ăn ở trẻ nhỏ [41]. Quan điểm hiện đại vẫn cho rằng vẫn cần can thiệp hạ sốt khi sốt quá cao và kéo dài, đặc biệt trong chấn thương não cấp tính. Trong khóa luận này, tác dụng hạ sốt của cao chiết lá BB được nghiên cứu trên mô hình gây sốt cho thỏ bằng LPS liều 200 µg/kg. LPS là một đại phân tử có mặt ở vách tế bào của vi khuẩn Gram âm, LPS sử dụng trong nghiên cứu được tách từ vỏ vi khuẩn E. Coli. LPS có cấu tạo gồm polysaccharide ưa nước và một thành phần kỵ nước là lipid A (đây là thành phần chịu trách nhiệm về hoạt tính sinh học của LPS). Cơ chế gây sốt của LPS có thể là do các đại thực bào nhận biết LPS thông qua thụ thể Toll-like receptor (TLR4) và nhanh chóng sản xuất Prostaglandin E2 có khả năng gây ra phản ứng sốt [37,14]. Một nghiên cứu khác cho rằng cơ chế gây sốt của LPS là do sự gắn kết của LPS với một protein 38
  46. miễn dịch là Lipopolysaccharide Binding Protein (LBP). Phức hợp LPS-LBP gắn với CD14, một marker bề mặt của đại thực bào, làm sinh tổng hợp TNF-α, IL1, IL6 gây sốt [44]. Mô hình nghiên cứu tác dụng hạ sốt trên thỏ gây sốt bằng LPS sử dụng chứng dương là Paracetamol. Paracetamol là thuốc hạ sốt, giảm đau, chống viêm có bản chất là dẫn xuất aminophenol. Hoạt chất này làm hạ sốt dựa trên cơ chế ức chế enzym prostaglandin synthetase làm giảm tổng hợp prostaglandin E1 và E2 do đó ức chế các quá trình sinh nhiệt, tăng cường các quá trình thải nhiệt và lập lại cân bằng cho trung tâm điều nhiệt [13]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy lô chứng dùng Paracetamol liều 150 mg/kg có tác dụng hạ sốt tại tất cả thời điểm nghiên cứu. Kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu tác dụng hạ sốt của Saeed Ahmad và cộng sự [18]. Cho nên, phương pháp nghiên cứu của chúng tôi là phù hợp. 4.1. Về kết quả đánh giá tác dụng hạ sốt của cao chiết toàn phần và cao chiết phân đoạn lá Bàng biển: 4.1.1. Về kết quả đánh giá tác dụng hạ sốt của cao chiết toàn phần Bàng biển: Cao chiết toàn phần Bàng biển liều 125 mg/kg và 250 mg/kg có tác dụng hạ sốt đạt ý nghĩa thống kê tại tất cả các thời điểm nghiên cứu (p < 0,05). Nhóm thỏ được điều trị bằng cao chiết toàn phần liều 500 mg/kg cho thấy tác dụng hạ sốt ở thời điểm 90 và 120 phút sau khi gây sốt đã ghi nhận tác dụng hạ sốt đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05 và p < 0,01). Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, cao chiết toàn phần Bàng biển liều 125, 250 mg/kg có tác dụng hạ sốt ổn định hơn cao chiết liều 500 mg/kg. Pratap Keshari Pattnaik và cộng sự đã đưa ra kết quả phân lập các hoạt chất hóa học từ dịch chiết Ethanol của lá Bàng biển bao gồm palmitic acid (46.01%), diterpene (26.53%), triterpene (17.39%), linoleic acid (5.13%) [36]. Kết quả của nghiên cứu gợi ý rằng những chất này có thể đóng vai trò trong tác dụng hạ sốt của cao chiết toàn phần Bàng biển và cần có những nghiên cứu tiếp theo để làm sáng tỏ giả thuyết này. 39
  47. 4.1.1. Về kết quả đánh giá tác dụng hạ sốt của cao chiết phân đoạn Bàng biển: Cao chiết phân đoạn liều 50 mg/kg cho kết quả: 3 lô thỏ uống các phân đoạn DCM, BuOH và cao nước từ BB liều 50 mg/kg đều chưa thể hiện tác dụng hạ sốt tại các thời điểm nghiên cứu. Lô thỏ uống phân đoạn EtOAc liều 50 mg/kg cho thấy tác dụng hạ sốt tại thời điểm 90 phút sau khi gây sốt đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với nhóm đối chứng không được điều trị. Như vậy, phân đoạn ethylacetate là phân đoạn cho thấy tác dụng hạ sốt tiềm năng của dược liệu BB. Nghiên cứu về hóa thực vật cho thấy, từ phân đoạn EtOAc có tác dụng hạ sốt đã phân lập được 1 hợp chất thuộc nhóm cadenolid là 15β- hydroxycalotropin và 5 flavonoid là isorhametin và dẫn xuất của isorhamnetin như isorhametin-3- O-glucopyranosid, isorhamnetin-3-O-galactopyranosid, isorhametin-3-O- rutinosid, isoquercetin [3]. Kết quả nghiên cứu đã gợi ý rằng các chất này có thể đóng vai trò trong tác dụng hạ sốt của cao chiết Bàng biển và cần có những nghiên cứu tiếp theo để có thêm bằng chứng về cơ chế tác dụng hạ sốt của phân đoạn này. Ở Ấn Độ, Shirsat Mrunal và cộng sự [40] đã đánh giá hoạt tính hạ sốt của cao chiết toàn phần, các phân đoạn chloroform, n-butanol, ethanol, và cao nước của lá Bàng biển thu hái tại thành phố Udaipur, Ấn Độ trên mô hình gây sốt bằng nấm men ở chuột nhắt trắng. Kết quả nghiên cứu cho thấy phân đọan n-BuOH và Chloroform cho thấy hoạt tính hạ sốt khi so sánh với nhóm đối chứng không được điều trị. Nghiên cứu của Shirsat Mrunal sử dụng nấm men để gây sốt, cơ chế gây sốt của nấm men được cho rằng là do sự kết hợp giữa hai enzym iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase) và COX-2 (cyclooxygenase-2) [20]. Điều này có thể giải thích cho sự khác biệt về kết quả giữa nghiên cứu của chúng tôi và của tác giả Shirsat Mrunal. Ngoài ra, sự khác biệt này cũng có thể được giải thích do địa điểm thu hái, giống dược liệu, quy trình chiết xuất dẫn đến các hoạt chất trong dược liệu khác nhau. 40
  48. 4.2. Về kết quả thử nghiệm độc tính cấp của cao chiết tiêu chuẩn Bàng biển Việc xác định độc tính trên động vật thí nghiệm cần được tiến hành trước tiên nhằm cung cấp bằng chứng an toàn trước khi sử dụng trên người. Mục tiêu của thử nghiệm độc tính cấp là nhằm cung cấp thông tin cho việc xếp loại mức độ độc của thuốc, dự đoán triệu chứng và dự kiến biện pháp điều trị ngộ độc cấp; thiết lập mức liều cho những thử nghiệm độc tính và tác dụng cũng như phạm vi an toàn của thuốc nghiên cứu tiếp theo [2]. Trong quá trình bào chế cao tiêu chuẩn lá Bàng biển, isorhamnetin được sử dụng làm chất chuẩn đối chiếu. Mặc dù chưa có nghiên cứu nào chỉ ra isorhamnetin có độc tính, tuy nhiên, Bàng biển được biết đến là loài cây có chứa một số hoạt chất gây độc, nên việc đánh giá độ an toàn của cao chiết là cần thiết. Trong khóa luận này, thử nghiệm độc tính cấp của cao chiết tiêu chuẩn lá Bàng biển được thực hiện trên đối tượng là chuột nhắt trắng. Chuột sau khi được cho uống thuốc có biểu hiện mệt (thở dốc, ít hoạt động) từ liều 9,36 g/kg trở lên và sau 20 phút bắt đầu có chuột chết. Các chuột còn lại hồi phục sau khoảng thời gian 120-180 phút. Ở liều 16,25 g/kg ghi nhận chuột có biểu hiện ngộ độc rất nhanh, rõ ràng, sau 20 phút 10/10 chuột chết. Những chuột chết không có bất thường ở nội tạng. Kết quả thí nghiệm thu được LD0 là 8,3 g/kg và LD100 là 16,25 g/kg. Sử dụng công thức tính LD50 của Behrens – Karber xác định được LD50 là 12,424 g/kg qua đường uống. Từ bảng ngoại suy liều tương đương giữa các loài của quyết định 141/QĐ-K2ĐT [2] xác định được liều LD50 đường uống trên thỏ xấp xỉ 3106 mg/kg (tính hệ số ngoại suy trên thỏ là 0,25). Trong nghiên cứu tác dụng hạ sốt, chúng tôi sử dụng mức liều 50, 100, 150 mg/kg tương đương với 1/60, 1/30, 1/20 của LD50. Đây là mức liều tương đối an toàn với động vật thí nghiệm. Kết quả LD50 của cao chiết tiêu chuẩn Bàng biển đường uống trên chuột nhắt trắng là 12,424 g/kg. Từ bảng ngoại suy liều tương đương giữa các loài, giá trị LD50 ước tính trên người là 1,056 g/kg (tính hệ số ngoại suy trên người là 41
  49. 0,085). Từ kết quả nghiên cứu trên, theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới, cao chiết tiêu chuẩn lá Bàng biển là thuốc thử có độc tính ở mức trung bình [2]. Trên thế giới, các nhà nghiên cứu đã thực hiện nhiều thử nghiệm độc tính cấp để xác định LD50 của các mẫu cao chiết từ dược liệu Bàng biển trước khi tiến hành các nghiên cứu chính thức. H.R Chitme và cộng sự đã thử nghiệm độc tính cấp của cao chiết ethanol 50% từ phần trên mặt đất của Bàng biển trên đối tượng chuột nhắt trắng. Liều LD50 được xác định là 4600 mg/kg đường tiêm phúc mạc [26]. M.R Habib và cộng sự trước khi đánh giá tác dụng ức chế ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich của cao chiết ethylacetate từ hoa của dược liệu Bàng biển đã thử nghiệm độc tính cấp trên chuột nhắt trắng theo đường tiêm phúc mạc. Liều LD50 được xác định là 2225 mg/kg [33]. 4.3. Về kết quả đánh giá tác dụng hạ sốt của cao chiết tiêu chuẩn Bàng biển Khi nghiên cứu tác dụng hạ sốt của các phân đoạn cao chiết lá BB, kết quả cho thấy phân đoạn EtOAc cho kết quả hạ sốt tốt nhất. Nhóm nghiên cứu khoa Hóa Thực vật – Viện dược liệu tiến hành phân lập các hợp chất trong phân đoạn EtOAc cho thấy có nhóm hoạt chất chủ yếu là flavonoid (các dẫn xuất của isorhamnetin) chiếm hàm lượng cao [3]. Do đó, isorhamnetin là hoạt chất dùng để đối chiếu trong chiết xuất cao chiết tiêu chuẩn BB. Cao chiết tiêu chuẩn Bàng biển được nghiên cứu bào chế với mục đích tăng tác dụng hạ sốt, giảm độc tính khi thử nghiệm trên động vật thí nghiệm cũng như trong sử dụng trên người. Nghiên cứu tác dụng hạ sốt thực hiện với cao chiết tiêu chuẩn BB cho kết quả: Lô thỏ được điều trị bằng cao chiết liều 100 mg/kg và 150 mg/kg cho thấy tác dụng hạ sốt từ thời điểm 60 phút đến 90, 120 phút sau gây sốt (p < 0,05). Lô thỏ sử dụng cao chiết liều 50 mg/kg chưa cho thấy tác dụng hạ sốt tại các thời điểm nghiên cứu. Từ kết quả này cho thấy cao tiêu chuẩn Bàng biển có tác dụng hạ sốt tại mức liều 100 và 150 mg/kg, tương ứng với 1/30 và 1/20 của liều LD50. Đây là mức liều tương đối an toàn về độc tính cấp. H.R. Chitme cho rằng cơ chế hạ sốt của dược liệu Bàng biển có thể là do ức chế sản xuất prostaglandin [26], vì 42
  50. vậy, nghiên cứu tiếp theo nên được thực hiện nhằm tìm hiểu sâu hơn về cơ chế hạ sốt của dược liệu Bàng biển. Hoạt chất chính của lá Bàng biển chủ yếu thuộc nhóm flavonoid (calotropiside, isorhamnetin-3-0- rhamnoglucoside, isorhamnetin-3-0-glucoside, isorhamnetin 3-O-[2-O-β-D-galactopyranosy1-6-O-α-L-rhamnopyranosyl]-β-D- gluco-pyranosid [39]), hỗn hợp glycoside tim (calactin, calotoxin và calotropin) và một số chất mới được phân lập như 90-methoxypinoresinol, glycosylated 5- hydroxymethylfurfurals [45,38]. Những hoạt chất này gợi ý có thể quyết định đến cơ chế hạ sốt của dược liệu BB. Về tác dụng hạ sốt của dược liệu BB, năm 2005, H.R. Chitme và cộng sự [26] đã tiến hành nghiên cứu tác dụng hạ sốt của cao chiết Ethanol 50% từ các bộ phận trên mặt đất của cây BB. Nghiên cứu thực hiện trên mô hình thỏ gây sốt bằng vaccine TAB và chuột được gây sốt bằng men. Trong nghiên cứu, động vật thí nghiệm được dùng cao chiết liều 200 và 400 mg/kg cho thấy tác dụng hạ sốt rõ rệt kéo dài đến thời điểm 4 giờ sau khi gây sốt, đặc biệt liều 400 mg/kg làm giảm nhiệt độ cơ thể tương tự với thuốc chứng dương Paracetamol. Trong nghiên cứu này, điều đáng quan tâm là cao chiết BB cho tác dụng hạ nhiệt nhẹ trên cơ thể động vật thí nghiệm có thân nhiệt bình thường. Điều này khác với paracetamol - thuốc chỉ hạ nhiệt ở cơ thể bị sốt mà không hạ nhiệt ở cơ thể bình thường. Y học hiện đại có sẵn những hoạt chất hạ sốt có tác dụng rõ rệt như paracetamol, aspirin, ibuprofen Tuy nhiên, khi sử dụng những loại thuốc này, tác dụng không mong muốn gặp phải có thể là buồn nôn, nôn, dùng quá liều có thể gây tổn thương gan, thận, đường tiêu hóa hoặc tệ hơn là nhồi máu cơ tim, đột quỵ [13]. Việc nghiên cứu những thuốc hạ sốt có nguồn gốc từ dược liệu là một giải pháp an toàn và có thể đưa ra thị trường để ứng dụng rộng rãi. Bàng biển là loại cây dễ khai thác, thu hái với số lượng lớn và có thể triển khai nghiên cứu với quy mô lớn. Do đó, Bàng biển là dược liệu có tiềm năng trong việc phát triển các sản phẩm hạ sốt từ dược liệu. 43
  51. CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN - Nghiên cứu tác dụng hạ sốt của cao chiết lá Bàng biển cho thấy: + Cao chiết toàn phần Bàng biển liều 125, 250 mg/kg có tác dụng hạ sốt trên mô hình gây sốt bằng LPS trên thỏ. + Cao chiết phân đoạn EtOAc của bàng biển liều 50 mg/kg thể hiện tác dụng hạ sốt trên thỏ gây sốt bằng LPS, trong khi các phân đoạn khác không thể hiện tác dụng này. + Cao chiết tiêu chuẩn Bàng biển liều 100 mg/kg và 150 mg/kg có tác dụng hạ sốt trên mô hình gây sốt cho thỏ bằng LPS. - Nghiên cứu độc tính cấp theo đường uống trên chuột nhắt trắng cho thấy, cao chiết tiêu chuẩn Bàng biển có giá trị LD50 là 12,424 g/kg. ĐỀ XUẤT 1. Tiếp tục nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng hạ sốt của dược liệu Bàng biển để làm sáng tỏ công dụng của dược liệu. 2. Thực hiện nghiên cứu độc tính trường diễn, bán trường diễn của dược liệu Bàng biển. 44
  52. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Báo điện tử. Con đường đưa dược liệu trở thành thế mạnh của Việt Nam. Vietnamnet, 2018. 2. Bộ Y Tế, Cục Khoa Học Công Nghệ và Đào Tạo. Quyết định số 141/QĐ- K2ĐT về việc ban hành tài liệu chuyên môn "Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu", 2015. 3. Nguyễn Văn Tài, Tạ Thị Thủy, Phùng Như Hoa, et al. Hợp chất flavonoid phân lập từ lá bàng biển (Calotropis gigantea). Tạp chí Dược liệu (chấp nhận đăng), 2021. 4. PGS.TS Lê Thị Luyến. Bài giảng Bệnh Học phần Hen và COPD update 2018, 2018. 5. NXB Bộ Y Tế (2011), "Sinh lý bệnh học và miễn dịch - Phần Sinh lý bệnh", pp. 126-139. 6. Hoàng Văn Cường Y3C-HMU (2020), "Sinh lý Guyton bản Tiếng Việt - Chương 74. Điều nhiệt và sốt", pp. 911-922. 7. NXB Đại học Y Hà Nội (2006), "Sinh lý học - Tập 1", pp. 91-100. 8. NXB Đại Học Y Hà Nội (2012), "Sinh Lý Bệnh Học", pp. 230-246. 9. Đỗ Trung Đàm (1996), "Phương pháp xác định độc tính của thuốc", NXB Y học, pp. 11-137. 10. NXB Y Học (2017), "Dược điển Việt Nam 5 - Tập2", pp. 1224. 11. Hoàng Ngọc Anh, Phạm Nguyên Đông Yên, Lưu Công Thịnh, Võ Phùng Nguyên, et al (2011), "Những nghiên cứu bước đầu về dược tính và thành phần của nọc rắn độc Hòn Sơn (Cryptelytrops hosonesis Grismer)", Tạp chí Dược học Số 424 năm 51 pp. 37-41. 12. Đỗ Tất Lợi (2004), "Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam", Nhà xuất bản Y Học, pp. 718-719. 13. PGS.TS Mai Tất Tố, TS. Vũ Thị Trâm (2007), "Dược lý học (DSĐH) -Tập 2", Nhà xuất bản Y Học, pp. 264. 14. Trần Thị Trang (2020), "Nghiên cứu tác dụng hạ sốt và chống viêm của Bạch Đầu Ông (Vernonia cinerea)", Khóa luận tốt nghiệp ngành dược học, pp. 30.
  53. 15. Viện Dược Liệu (2006), "Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam - Tập 1", pp. 257- 260. 16. Viện Dược Liệu (2006), "Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo", pp. 305. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 17. (trang web) Tropical Plants Database. Calotropis Gigantea. Useful Tropical Plant 18. Ahmad S, Shah S M, Alam M K, Usmanghani K, et al (2014), "Antipyretic activity of hydro-alcoholic extracts of Moringa oleifera in rabbits", Pak J Pharm Sci, 27 (4), pp. 931-934. 19. Bartfai T, Conti B (2010), "Fever", ScientificWorldJournal, 10 pp. 490-503. 20. Bhat A S, Tandan S K, Kumar D, Krishna V, et al (2005), "Interaction between inhibitors of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase in Brewer's yeast induced pyrexia in mice: an isobolographic study", Eur J Pharmacol, 511 (2-3), pp. 137-142. 21. Bulani, Vipin & Biyani, Kailash & Kale, Ravindra & Joshi, et al (2011), "Inhibitory effect of Calotropis gigantea extract on Ovalbumin-induced airway inflammation and Arachidonic acid induced inflammation in a murine model of asthma", Int J Cur Bio Med Sci, pp. 19-25. 22. Chandrasekaran Rajkuberan K S, Gnanasekar Sathishkumar, Sivaperumal Sivaramakrishnan, (2015), "Antibacterial and cytotoxic potential of silver nanoparticles synthesized using latex of Calotropis gigantea L", Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc 136 pp. 924-930. 23. Choudhary, Naveen Kumar, et al (2012), "Antioxidant Potential and Protection of Pancreatic β- cells by Calotropis gigantea in Streptozocin Induced Diabetic Rats", Journal of Complementary and Integrative Medicine, 9 pp. Article 8. 24. Deepa Krushna Ingawale, Satish Karbhari Mandlik and Ajay Digambar Kshirsagar (2013), "Hepatoprotective activity of Calotropis gigantea flowers against carbon-tetrachloride-induced liver damage in mice", J Complement Integr Med 10(1) pp. 55-62.
  54. 25. H. Gerhard Vogel (2002), "Drug Discovery and Evaluation Pharmacological Assays", pp. 772-773. 26. H. R. Chitme, Ramesh Chandra, Sadhna Kaushik (2005), "Evaluation of Antipyretic Activity of Calotropis gigantea (Asclepiadaceae) in Experimental Animals", Phytother Res, 19 pp. 454-456. 27. Islam M R, Li Z Z, Gichira A W, Alam M N, et al (2019), "Population Genetics of Calotropis gigantea, a Medicinal and Fiber Resource Plant, as Inferred from Microsatellite Marker Variation in two Native Countries", Biochem Genet, 57 (4), pp. 522-539. 28. Jaliwala Y.A., Chourasia Neha, Bhatt N. K., Panda P.K., et al (2011), "Pharmacological evaluation of anti-tussive, anti-asthmatic and expectorant activities of Calotropis gigantea R.Br. in experimental animals", Journal of Pharmacy Research, 4(10) pp. 3383-3385. 29. Kadiyala M, Ponnusankar S, Elango K (2013), "Calotropis gigantiea (L.) R. Br (Apocynaceae): A phytochemical and pharmacological review", J Ethnopharmacol, 150(1) pp. 32-50. 30. Khadar Shaik, Shailaja Ande, Ravindrachary Dharmoji, Sowmya Ragini Yelwarthi (2017), "Pharmacological Screening of Anti-Asthmatic Activity of Ethanolic Extract of Calotropis Gigentea Leaves", PharmaTutor, 5(11) pp. 49-52. 31. Md Nazmul Haque, Md Mohibbullah, Yong-Ki Hong and Il Soo Moon (2018), "Calotropis gigantea Promotes Neuritogenesis", The American Journal of Chinese Medicine, 46(8) pp. 1-17. 32. Meenakshi Sharma, Sandeep Tandon, Ullal Anand Nayak, Damodhar Kappadi, et al (2017), "Calotropis gigantea extract as a potential anticariogenic agents against Streptococcus mutans: An in vivo comparative evaluation", J Conserv Dent 20(3) pp. 174-179. 33. Muhammad Rowshanul Habib, Muhammad Abdul Aziz, Muhammad Rezaul Karim (2010), "Inhibition of Ehrlich’s ascites carcinoma by ethyl acetate extract from the flower of Calotropis gigantea L. in mice", Journal of Applied Biomedicine, 8(1), pp. 47-54. 34. P. Suresh Kumar, Suresh. E and S.Kalavathy (2013), "Review on a potential herb Calotropis gigantea (L.) R. B", Sch Acad J Pharm, 2(2) pp. 135-143. 35. P.V.V. Satish, D. Santha Kumari & K. Sunita (2017), "Antiplasmodial efficacy of Calotropis gigantea (L.) against Plasmodium falciparum (3D7
  55. strain) and Plasmodium berghei (ANKA)", J Vector Borne Dis, 54 pp. 215-225. 36. Pratap Keshari Pattnaik, Dattatreya Kara, Hiranyamayee Chhatoi, Sajad Shahbazic (2017), "Chemometric profile & antimicrobial activities of leaf extract of Calotropis procera and Calotropis gigantea", Natural Product Research, 31(16) pp. 1954-1957. 37. Romanovsky A A, Steiner A A, Matsumura K (2006), "Cells that trigger fever", Cell Cycle, 5 (19), pp. 2195-2197. 38. Seeka C, Sutthivaiyakit S (2010), "Cytotoxic cardenolides from the leaves of Calotropis gigantea", Chem Pharm Bull (Tokyo), 58 (5), pp. 725-728. 39. Sen S, Sahu N P, Mahato S B (1992), "Flavonol glycosides from Calotropis gigantea", Phytochemistry, 31 (8), pp. 2919-2921. 40. Shirsat, Mrunal (2010), "Anti-inflammatory and Antipyretics activity of leaves Calotropis gigantean Linn", Journal of Global Pharma Technology, pp. 75-78. 41. Stanway D (2015), "Fever in children", Nurs Stand, 29 (26), pp. 51. 42. Tanuj Kanchan, Alok Atreya (2016), "Calotropis gigantea", WILDERNESS & ENVIRONMENTAL MEDICINE, 27 pp. 350-351. 43. Vipin Bulani, Mahesh M.GHAISAS, Dinesh Kumar (2011), "Anti- anaphylactic and Mast Cell Stabilizing Effect of Calotropis gigantea Extract", LATIN AMERICAN JOURNAL OF PHARMACY 30 pp. 363-367. 44. Wright S D, Ramos R A, Tobias P S, Ulevitch R J, et al (1990), "CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein", Science, 249 (4975), pp. 1431-1433. 45. Khang D.H. Nguyen, Phu H. Dang, Hai X. Nguyen, Mai T.T. Nguyen, et al (2017), "Phytochemical and cytotoxic studies on the leaves of Calotropis gigantea", Bioorg Med Chem Lett, 27(13) pp. 2902-2906. 46. Mai T. T. Nguyen, Khang D. H. Nguyen, Phu H. Dang, Hai X. Nguyen, et al (2020), "Calosides A−F, Cardenolides from Calotropis gigantea and Their Cytotoxic Activity", J Nat Prod 83(2) pp. 385-391.