Khóa luận Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ lá cây Gan heo (Dicliptera chinensis (L.) Ness)

Nội dung text: Khóa luận Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ lá cây Gan heo (Dicliptera chinensis (L.) Ness)

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC MAI DIỄM QUỲNH NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LÁ CÂY GAN HEO (Dicliptera chinensis (L.) Ness) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa : QH.2013.Y Ngƣời hƣớng dẫn : 1. TS. VŨ ĐỨC LỢI 2. PGS.TS. NGUYỄN QUỐC HUY HÀ NỘI – 2018
2. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến người thầy hướng dẫn cho tôi là TS. Vũ Đức Lợi – giảng viên Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Quốc Huy, đơn vị Cục Khoa học công nghệ và Đào tạo, Bộ Y Tế đã chỉ bảo tôi thêm được rất nhiều kiến thức mới, và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu để tôi có thể hoàn thành tốt được khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các kĩ thuật viên tại Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Bộ môn Bào chế và Công nghệ dược phẩm, Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược, các thầy - cô đã dạy dỗ, dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học vừa qua. Cảm ơn đề tài khoa học công nghệ cấp Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số: QG.17.28 đã hỗ trợ kinh phí để chúng tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè, đã luôn bên cạnh - đồng hành, cổ vũ, tiếp thêm sức mạnh cho tôi trong quá trình học tập, rèn luyện và thực hiện khóa luận. Cuối cùng tôi xin kính chúc các thầy - cô luôn luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công hơn nữa trong công việc cũng như sự nghiệp trồng người. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2018 Sinh viên Mai Diễm Quỳnh @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
3. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Kí hiệu, viết tắt Tên đầy đủ 1 ALT Aspartate Amino Transferase 2 AST Alanin Amino Tranferase 3 DCP Dicliptera Chinensis polysaccharide 4 DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer 5 DMN Dimethyl nitrosamine 6 D Doublet 7 Dd Double of doublet 8 ESI-MS Phổ khối 9 EtOH Ethanol 10 EtOAc Ethyl acetate 11 HF Bệnh xơ gan 12 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao 13 HSC Tế bào hình sao ở gan 14 H&E Hematoxylin & Eosin 15 Hz Hertz 16 MeOH Methanol 17 m/z mass to charge ratio 18 Mp melting point 19 M Multiplet 20 NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 21 Q Quartet 22 S Singlet 23 T Triplet 24 UV- VIS Phổ tử ngoại- khả kiến 25 v/v Volume to volume ratio @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
4. DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng 7 phương pháp hóa học 2 Bảng 1.2: Bảy hợp chất đã được phân lập từ chiết xuất etyl 10-11 axetat 3 Bảng 1.3: Ảnh hưởng tới sự hình thành nang trứng và sinh 14 sản ở chuột cái 4 Bảng 3.1: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất C16H22O4 và chất 25-26 so sánh L @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
5. DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1: Hình vẽ một số bộ phận chi Dicliptera 3 2 Hình 1.2: Tiêu bản lá cây Gan heo 6 3 Hình 1.3: Một số tiêu bản bột cây Gan heo 6 4 Hình 2.1: Mẫu cây Gan heo 16 5 Hình 2.2: Sơ đồ chiết tách và phân đoạn 18 6 Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất phân đoạn loài Dicliptera 21 Chinensis (L.) Ness 7 Hình 3.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn 24 ethyl acetat 8 Hình 3.3: Cấu trúc phân tử 1 27 9 Hình 3.4: Cấu trúc phân tử 2 28 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
6. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC TÊN KÍ HIỆU, VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật, phân bố 2 1.1.1. Vị trí phân loại chi Dicliptera 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật chi Dicliptera . 2 1.1.3. Số lượng, đặc điểm các loài thuộc chi Dicliptera 3 1.1.4. Đặc điểm thực vật của cây Gan heo 4 1.1.5. Đặc điểm bột dược liệu và vi phẫu cây Gan heo 5 1.2. Thành phần hóa học của cây Gan heo 7 1.3. Một số tác dụng dược lý đã được nghiên cứu 11 1.3.1. Tác dụng chống xơ gan 11 1.3.2. Tác dụng bảo vệ gan 12 1.3.3. Tác dụng chống oxy hóa. 13 1.3.4. Tác dụng trên chức năng sinh sản ở chuột cái 13 1.4. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền 15 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2. 1. Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.1. Nguyên vật liệu 16 .1. . a ch t v dung i s dụng @ School of Medicine and 17 Pharmacy, VNU
7. 2.1.3. Trang thiết bị, dụng cụ, máy móc 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu 18 . .1. Phương pháp chiết xu t, phân lập hợp ch t 18 . . . Phương pháp xác định c u trúc hợp ch t 19 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1. Kết quả chiết xuất, phân lập hợp chất 23 3.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ cây Gan heo 27 3.2.1. Hợp ch t 1 27 3.2.2. Hợp ch t 2 30 3.3. Bàn luận 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 1. Kết luận 34 2. Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
8. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam có vị trí địa lý nằm gần vành đai nhiệt đới, cây cối vì vậy mà có sự sinh trưởng, phát triển mạnh mẽ. Thực vật không chỉ dùng làm lương thực cho con người mà còn là kho thuốc điều trị bệnh quý giá. Nguồn dược liệu của nước ta vô cùng đa dạng, phong phú. Hiện nay trên thế giới nói chung cũng như Việt Nam nói riêng, xu hướng sử dụng sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên ngày càng phát triển. Do vậy, nghiên cứu phát triển thuốc và các sản phẩm chữa bệnh từ thực vật là một xu hướng được quan tâm hiện nay. Cây Gan heo có tên khoa học là Dicliptera chinensis (L.) Nees thuộc chi Dicliptera họ Acanthaceae là một cây thuốc rất phổ biến và được sử dụng từ lâu đời. Trong đời sống, ngoài việc sử dụng cây Gan heo để nhuộm thực phẩm thì trong Y học Việt Nam và Trung Quốc, nó còn được dùng để chữa cảm mạo, sốt cao, lên sởi, giảm niệu; dùng ngoài trị lở, sưng, rôm sẩy, mụn nhọt [2, 12]. Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện thấy tác dụng hiệu quả trong điều trị gan bị tổn thương do viêm, xơ gan, tác dụng chống oxy hóa [22, 24, 30 ]. Hiện các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu các loài thuộc chi Dicliptera để tìm ra các tác dụng mới ứng dụng trong điều trị bệnh. Việc nghiên cứu cây Gan heo giúp chúng ta xác định thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây thuốc để sử dụng chúng hợp lý, an toàn và hiệu quả. Sử dụng các phương pháp chiết xuất, phân lập để xác định thành phần hóa học của cây thuốc. Tuy nhiên, những nghiên cứu về cây ở Việt Nam và thế giới còn khá ít, chính vì vậy, tôi tiến hành đề tài: “Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ lá cây Gan heo (Dicliptera chinensis (L.) Ness)” với mục tiêu: 1. Chiết xuất, phân lập đƣợc một số hợp chất từ lá cây Gan heo. 2. Xác định đƣợc cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập ở trên. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
9. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật, phân bố 1.1.1. Vị trí phân loại chi Dicliptera Theo Hệ thống phân loại về ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta của tác giả .Takhtajan, chi Dicliptera có vị trí phân loại như sau [30]: Giới thực vật: Plantae. Ngành Ngọc Lan: Magnolipphyta Lớp ỏ Tháp út: Equisetopsida C. Agardh Phân lớp Mộc Lan: Magnoliidae Novák ex Takht ộ Hoa Môi: Lamiales Họ Rô: Acanthaceae Chi: Dicliptera 1.1.2. Đặc điểm thực vật chi Dicliptera . - Dạng sống: dạng cây thân thảo. - Lá: lá đơn mọc cách, lá hình trứng. Lá bắc hình bầu dục, có lông hoặc hình trứng ngược. - Cụm hoa: dạng xim, dạng chùy hay chùm hoặc bông ở nách lá hay ở đỉnh cành, có khi ở trên thân. Đôi khi hoa đơn độc ở nách lá hoặc đỉnh cành. - Hoa: Tất cả chi đều có hoa lưỡng tính. Hoa mẫu 4 hoặc mẫu 5. - Tràng: Tràng dạng ống, môi trên 3 khía, môi dưới nguyên. - Bao phấn : thường 2 ô, các ô bao phấn hình thuôn, gần tròn hoặc hình đường; bao phấn đính lưng, mở dọc; gốc bao phấn thường có phần phụ dạng móc hoặc lông. Bao phấn đính trên chỉ nhị lệch nhau. - Bộ nhụy: Tất cả đều có bầu thượng. Bầu hình tròn, gần tròn, hoặc bầu dục; bầu phủ lông mịn hoặc nhẵn. - Quả: ở Việt Nam chỉ có dạng quả nang, mở 2 mảnh, quả có lông, giá noãn dựng đứng ở gốc. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
10. - Hạt ép dẹt, bề mặt nhiều điểm nốt, bề mặt hạt thường có lông [9]. 2 3 1 Hình 1.1. Một số hình vẽ bộ phận chi Dicliptera [9] 1. Lá hình trứng 2. Hạt 3. Quả nang 1.1.3. Số lượng, đặc điểm các loài thuộc chi Dicliptera - Trên thế giới Chi Dicliptera họ Acanthaceae) bao gồm hơn 150 loài vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. hi này phân bố ở hâu : Trung Quốc, Lào, ampuchia, Thái Lan, Indonesia, Malaysia, hâu Phi, hâu c và Mỹ [2, 4, 10]. - Việt Nam Chi Dicliptera gồm 4 loài [4 ; [8]: Loài D. bupleuroides Nees in all Lưỡng thiệt : ây cỏ cứng cao 30cm; thân vuông, thường đen khi khô, có khi nâu đậm, không có lông, lóng dài 3-4cm. Lá mọc đối, phiến lá hình trái xoan, mặt trên nâu đen, mặt dưới nâu. Hoa hình môi mọc thành chùm ít hoa mọc ở nách lá; đài 6-8mm; vành cao 1,5mm. Loài D.chinensis Nees in D ửu căn : ây cỏ thân có bốn cạnh, có lông mịn. Lá mọc đối hình bầu dục thon, có lông mịn. Hoa hình môi bẹt, môi trên nguyên. Quả nang, hạt có ít lông. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
11. ây được phân bố ở các khu vực: Cao ằng, ắc ạn chợ Đồn , Thái Nguyên, Hà Giang, Yên ái, H a ình, Nam Định, Hà Nội, Huế, Sài G n Loài D. leonotis Dalz. x . . larke lưỡng thiệt : ây cỏ nằm rồi đứng, thân tr n, có lông lúc c n non. Lá có phiến thon to 2-6 x 2cm, nhọn hai đầu, mỏng, dài 2-10cm. Hoa mọc thành chùm ở kẽ lá, hình môi; môi trên hình xoan nhọn, môi dưới ba rang. Quả nang có lông. Hạt hình tr n hoặc dẹt. ây được phân bố ở các khu vực: huyện miền núi hiêm Hóa, Na Hang tỉnh Tuyên Quang, huyện miền núi tỉnh Quảng Nam, huyện H a Vang thành phố Đà Nẵng và một số tỉnh khác Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Thái Nguyên). Loài D. vestita R. en Hạ mái phủ : Cây cỏ có thân mảnh, lóng dài 4-7cm. Lá hình bầu dục hay hình trái xoan, to 4-7 x 3cm có lông sáp mịn. Hoa hình môi, môi trên xoan rộng, hia rang to hơn môi dưới ba rang mọc ở nách lá có nhiều lông, lá đài hình kim. Quả nang nhỏ, có lông. ây mọc hoang và được trồng nhiều ở địa phương các tỉnh miền núi và trung du phía bắc như: ao ằng Thạch n , Lạng Sơn Văn Quan , ắc Kạn chợ Đông , Thái Nguyên, Tuyên Quang, Quảng Ninh, Sơn La 1.1.4. Đặc điểm thực vật của cây Gan heo - Tên khác: Lá diễn, Cửu văn, an thái. - Tên khoa học : Dicliptera chinensis (L.) Ness Gan heo là cây thân thảo sống hằng năm hay vài ba năm, cao 30-80cm. Thân và cành non có 4 cạnh, có lông tơ, các mấu phình to tựa như đầu gối. Lá mọc đối. màu xanh lục, phiến lá hình trứng thuôn, dài 2-7cm, rộng 2-4cm, đầu và gốc đều nhọn, có lông thưa. Các lá bắc hình trái xoan dài 8-11mm, các tiền diệp hẹp [2, 4]. Hoa màu trắng hồng, mọc thành xim ở nách lá và ở đầu cành. Ra hoa từ mùa đông đến mùa hạ (từ tháng 12 đến tháng 5). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
12. Quả nang ngắn có lông tơ ở phía đầu. Hạt dẹt.  Phân bố của cây Gan heo: Cây của vùng lục địa Ðông Nam Á Châu, được tìm thấy ở Việt Nam, Trung Quốc và Lào [4]. Việt Nam phổ biến ở các tỉnh miền núi phía bắc. Thường mọc hoang ở ven đường, ven suối, bãi trống hoặc thành đám ở dọc bờ mương, rãnh nước, nơi ẩm mát, các tỉnh thuộc vùng núi thấp và trung du gồm ao ằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Nam Định, Yên ái, Tuyên Quang, ắc ạn, Thái Nguyên [2, 10, 14]. Có thể thu hái toàn cây quanh năm, dùng tươi hay phơi khô. 1.1.5. Đặc điểm bột dược liệu và vi phẫu cây Gan heo - Đặc điểm vi phẫu lá cây Gan heo [15]: Lá cây Gan heo là lá có các gân hình lông chim nêm lá chia ra làm hai phần: Phần gân lá và phần phiến lá ở hai bên. Phiến lá gồm có: Biểu bì trên cấu tạo bởi lớp tế bào sống, sắp xếp đều đặn nhau, không có diệp lục, không có lỗ khí. Biểu bì dưới khác với biểu bì trên là có lỗ khí, biểu bì mang lông che chở đơn hoặc đa bào. Gân lá: Gân lá lồi lên ở cả hai mặt. Ngoài cùng là hai lớp biểu bì trên và dưới cấu tạo bởi những tế bào kéo dài theo chiều dọc của gân giữa. Tiếp theo là tới lớp mô dày trên và mô dày dưới , cấu tạo bởi tế bào có vách dày bằng cellulose làm nhiệm vụ nâng đỡ. Mô giậu cấu tạo bởi hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn nhau . Phía trong là mô xốp , mô mềm gồm các tế bào hình đa giác kích thước khác nhau, xếp lộn xộn. Các libe gỗ là các tế bào xếp thành một hình cung hoặc một vòng trong bao xung quanh lấy gỗ. Bột phần trên mặt đất của cây Gan heo: Bột có màu nâu. Soi dưới kính hiển vi thấy có các thành phần sau: Lông tơ che chở đơn bào, lông tơ che chở đa bào, bào thạch, lỗ khí, biểu bì mang lỗ khí, mảnh mô mềm, mảnh mạch điểm, mảnh mạch xoắn, mảnh mạch, tế bào. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5
13. Biểu bì trên Phiến lá Mô dày trên Mô giậu Gỗ Mô mềm Mô dày dưới Biểu bì dưới Hình 1.2. Vi phẫu lá cây Gan heo [15] Hình 1.3. Một số vi phẫu bột cây Gan heo [15] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
14. 1. Lông che chở đơn bào 5. Lỗ khí 2. Mảnh mạch xoắn 6. Mảnh bần 3. Mảnh mô mềm 7. Bào thạch 4. Hạt tinh bột 1.2. Thành phần hóa học của cây Gan heo - Dịch chiết cây Gan heo được định tính các hợp chất bằng phương pháp hóa học [15]. Bảng 1.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phương pháp hóa học Ghi chú: (- âm tính, + dương tính không rõ, ++ dương tính rõ, +++ dương tính rất rõ. STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận 1 Acid amin TT. Ninhydrin ++ Có 2 Alkaloid TT. Mayer - TT. Bouchardat - Không có TT. Dragendorff - 3 Anthranoid Phản ứng Borntraeger - Không có 4 Caroten H2SO4 đặc +++ Có 5 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc +++ Có 6 Coumarin Mở vòng lacton - Không có 7 Đường khử TT Fehling +++ Có 8 Flavonoid NaOH 10% +++ Hơi NH4OH +++ Có Cyanidin +++ FeCl3 5% +++ 9 Glycosid tim Phản ứng Liebermann - Baljet - Không có Keler Kiliani - @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
15. 10 Saponin Hiện tượng tạo bọt +++ Có Hiện tượng phá huyết 11 Tanin Gelatin + Pb(CH3COO)2 10% +++ Có Cu(CH3COO)210% +++ FeCl3 5% +++ 12 Acid hữu cơ Bột Na2CO3 +++ Có Kết luận sơ bộ: nhận thấy trong thành phần của cây Gan heo chứa các nhóm chất: acid amin, caroten, chất béo, đường khử, flavonoid, saponin, tannin, acid hữu cơ. - Một số hợp chất phân lập từ lá cây Gan heo mà Việt Nam đã nghiên cứu được do nhóm tác giả Vũ Đức Lợi và Nguyễn Tiến Vững [17]. Lá Gan heo được chiết siêu âm trong dung môi ethanol và bằng phương pháp sắc ký cột đã phân lập được 3 hợp chất. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ khối, phổ cộng hưởng hạt nhân và so sánh với các dữ liệu công bố của các hợp chất liên quan. Ba hợp chất phân lập được xác định cấu trúc là: kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid(1) nicotiflorin (2) 6-hydroxy-1,12-oleanadien-3-on(3) Hợp chất 3 lần đầu tiên phân lập được từ lá cây Gan heo. - Nhóm tác giả tại trường đại học Bắc Kinh, Trung Quốc đã nghiên cứu thêm được một loại verebroside mới có tên dicliptercerebroside đã được phân lập từ Dicliptera chinensis . Trong đó, Cerebrosides là tên phổ biến cho một nhóm glycosphoridolid gọi là các monoglycosylceramid là thành phần quan trọng trong cơ thịt động vật và các màng tế bào thần kinh. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
16. Cấu trúc của dicliptercerebrosid được xác định là: 1-O-β-D- glucopyranosyl-2N - [(2'R) -2'-hydroxy- (9Z) -palmitoleoyl] -2S, 3S, 4R-C (20) -phytosphingosine [26]. Như vậy, nhóm tác giả đã phân lập được 3 chất từ dịch chiết Dicliptera chinensis đó là: Dicliptercerebroside Asperglaucide Amidoalcohol ác câu trúc trên được xác định trên bằng phương pháp quang phổ. - Vào tháng 6 năm 2006, 3 tác giả trên cũng có bài báo trên Pubmed là: Gao YT, Yang XW , Ai TM [25]. Các hợp chất được tách bằng sắc ký cột silica gel, pha chế sắc kí lớp mỏng và HPL đảo ngược, cấu trúc của chúng được xác định bằng các phương pháp quang phổ của UV, NMR và MS. Bảy hợp chất đã được phân lập từ chiết xuất ethyl axetat. Cấu trúc của chúng được xác định là: octasulphur (I) secoisolariciresinol dimethyl eter dicalat (II) 5-methoxy-4, 4'-di-O-methyl secolariciresinol (III) methyl ester chinensinaphthol (IV) loliolide (V) β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside (VI) stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranoside (VII). Trong đó, công thức hóa học của các chất được xác định như sau: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
17. Bảng 1.2. Bảy hợp chất đã được phân lập từ chiết xuất etyl axetat STT Tên chất Công thức hóa học 1 Octasulphur 2 Secoisolariciresinol O OH dimethyl eter dicalat OH HO O OH 3 5-methoxy-4, 4'-di-O- methyl secolariciresinol 4 Methyl H3C O O ester chinensinaphthol O O O O O CH3 H3C @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
18. 5 Loliolid H3C CH3 O HO O CH3 6 Beta -sitosterol 3-O-β-D- glucopyranosid 7 Stigmasterol 3-o-β-D- glucopyranoside 1.3. Một số tác dụng dƣợc lý đã đƣợc nghiên cứu 1.3.1. Tác dụng chống xơ gan Nghiên cứu chỉ ra rằng nhóm chất polysaccarid có trong cây Gan heo (Dicliptera chinensis ) tác dụng vào TGF-β / Smad và ức chế hoạt động của tế bào hình sao ở chuột đã bị gây xơ gan bởi dimethylnitrosamine. Nghiên cứu này nhằm theo dõi tác động của Dicliptera chinensis polysaccharide (DCP) trên bệnh xơ gan HF và sự hoạt động các tế bào hình sao gan (HSC). - Mô hình xơ gan được gây ra bởi tiêm dimethyl nitrosamines (DMN) trong chuột. Chuột trong nhóm điều trị được tiêm tĩnh mạch với nồng độ DCP khác nhau (0, 100, 300 mg / kg). Đồng thời dùng các thuốc nhuộm và phép thử để phát hiện ra các biểu hiện các tế bào trên gan. Kết quả cho thấy DCP làm giảm sự xơ gan do DMN gây ra ở chuột và các biểu hiện TGF-β1, pSmad2 / 3 và α-SMA giảm đáng kể trong mô gan theo liều [36]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
19. Như vậy, DCP nhắm mục tiêu tới TGF-β / Smad và ức chế sự kích hoạt tế bào Stellen ở chuột bị gây xơ gan do dimethylnitrosamine. 1.3.2. Tác dụng bảo vệ gan - Việc kiểm tra bệnh học cho thấy liều cao và trung bình của D P đã cho thấy hiệu quả đáng kể trong việc cải thiện sự xơ gan, làm giảm viêm, hoại tử. DCP có hiệu quả cải thiện chức năng gan, như đã thấy trong việc làm giảm nồng độ men gan ALT, aspartate aminotransferase (AST), tổng bilirubin T IL trong khi tăng albumin L và giảm nồng độ huyết thanh của hoại tử khối u .Yếu tố alpha (TNF-α , interleukin-6 (IL-6) ở chuột HF. Ngoài ra, hàm lượng acid hyaluronic (HA), collagen type IV (IV-C), type III precollagen (PCIII) và laminin (LN) trong mô gan ở chuột nhắt bị xơ gan giảm đáng kể, trong khi biểu hiện chuyển đổi yếu tố tăng trưởng- Β l TGF-β l), collagen type I (Col-I), protease kim loại-1 (TIMP-1) [34]. Như vậy, DCP có hoạt tính đối kháng hiệu quả đối với độc tính gan ở DMN ở chuột nhắt HF, cơ chế chống fibrotic có liên quan đến việc điều chỉnh các enzyme huyết thanh chức năng, cải thiện chức năng trao đổi chất và ức chế phản ứng viêm trong mô gan - Các DCP có tác dụng làm giảm tổn thương gan ở chuột khi cho chuột sử dụng thuốc chống lao isoniazid và rifampicin. Chuột bị tổn thương gan trước và sau khi điều trị với D P đã được lấy mẫu máu và gan để xét nghiệm các chỉ số ALT, AST, AKP, NO, TNF-α, IL-6, xét nghiệm miễn dịch ELISA. Kết quả cho thấy bệnh lý trên gan ở chuột đã được cải thiện, số lượng các tế bào viêm đã giảm, các chỉ số xét nghiệm đều giảm nên có thể kết luận rằng DCP có hiệu quả điều trị trên gan bị tổn thương gây ra bởi thuốc kháng lao và có cơ chế liên quan tới tác dụng kháng viêm của nó [24]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
20. 1.3.3. Tác dụng chống oxy hóa Phương pháp: Dịch chiết metanol thô của các bộ phận trên mặt đất của Dicliptera roxburghiana DRM được lắc phân đoạn với các dung môi, tạo ra các phân đoạn n-hexane (DRHF), chloroform (DRCF), ethyl acetate (DREF), n-butanol (DRBF) và phần hòa tan còn lại là phần nước dư DR F. Nhóm tác giả Ahmad đánh giá các hoạt động chống oxy hoá của các phân đoạn thông qua các phương pháp phân tích khác nhau. Kết quả: Có sự xuất hiện của các chất oxi hóa như: flavonoid, phenol, tannin, alkaloids, saponin, terpenoid và coumarines. Trong đó hiện diện nhiều nhất trong dịch chiết MeOH, chloroform, EtOAc, n-butanol [19]. 1.3.4. Tác dụng trên chức năng sinh sản ở chuột cái  Ảnh hưởng tới thông số sinh lý, sinh hóa trên chuột cái chưa trưởng thành. Phương pháp: chiết xuất dung dịch nước của hỗn hợp lá (ADHJ) bốn cây thuốc (Aloe buettneri, Dicliptera verticillata, Macranthus hibiscus và Justicia insularis). Nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá phản ứng buồng trứng với hỗn hợp lá ở chuột cái chưa trưởng thành. Các liều lượng khác nhau của chiết xuất nước của J. insularis được cho chuột ăn hàng ngày, trong 20 ngày, đối với chuột cái chưa trưởng thành được phân thành 4 nhóm thực nghiệm gồm 20 con mỗi nhóm. Vào cuối giai đoạn thử nghiệm, một số thông số sinh hóa và sinh lý của chức năng buồng trứng đã được kiểm tra [31]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
21. Bảng 1.3. Ảnh hưởng của dung dịch hỗn hợp lá tới sự hình thành nang trứng và sinh sản ở chuột cái. Trọng lượng buồng trứng Tăng gấp 3 hoặc gấp đôi so với đối chứng Protein Tăng đáng kể 58,09% và 45,64% Cholesteron Giảm 70% ở chuột được tiêm Điểm xuất huyết Giảm Trọng lượng tử cung Giảm Thông số sinh và thai Tăng số lượng thể vàng Với kết quả như trên, hỗn hợp lá được dự đoán có khả năng điều chỉnh chu kì kinh nguyệt, đau bụng kinh và vô sinh ở phụ nữ. Rất có thể trong thành phần hỗn hợp dịch chiết chứa estrogen.  Hỗn hợp dịch chiết của Dicliptera verticillata làm thay đổi nồng độ estradiol (hormon nữ) và ảnh hưởng tới quá trình chuyển hóa gan trên chuột cái chưa trưởng thành: Năm 2002, nhóm tác giả gồm Telefo PB, Moundipa PF, Tchouanguep FM nghiên cứu tác dụng của hỗn hợp dịch chiết từ lá của các loài Aloe buettneri, Justicia insularis, Hibiscus macranthus và Dicliptera verticillata. Nhận thấy khi cho chuột cái chưa trưởng thành uống hỗn hợp dịch chiết, ở liều 13, 49 và 94 mg/kg mỗi ngày trong 15 ngày gây ra một sự gia tăng đáng kể nồng độ estradiol trong buồng trứng, trong huyết thanh và trọng lượng tử cung cũng tăng. Đồng thời cũng phát hiện sự giảm hoạt động của N- demethylase aminopyrine ở chuột điều trị [32]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
22. 1.4. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền Tính vị: Gan heo có vị ngọt, nhạt, tính mát [2, 12]. Quy kinh: an, phế, thận [10 . ông năng: Thanh nhiệt, tiêu viêm, lợi tiểu, làm mát máu, sinh tân dịch, mát gan, lương huyết giải độc [2] Toàn cây được dùng làm thuốc, dùng ngoài, sắc uống, có thể làm phẩm nhuộm màu. Lá non, ngọn cây làm thực phẩm.[4, 6] Theo dân gian, dùng cả cây Gan heo với hàm lượng dùng 30-60g cây khô hay 60-120g cây tươi sắc uống, có tác dụng như sau: 1. Cảm mạo, sốt cao 2. Viêm phổi nhẹ, viêm ruột thừa cấp 3. Viêm gan cấp, viêm kết mạc 4. Viêm ruột, lỵ 5. Phong thấp viêm khớp 6. Giảm niệu, đái ra dưỡng trấp Dùng lá cây với các trường hợp bệnh: 1. Dùng ngoài trị lở sưng, rôm sẩy, mụn nhọt, bỏng rạ, dùng lá tươi giã nát xoa lên vùng da bị lở. 2. Dùng lá để nấu canh, nấu với thịt lợn, ăn rất mát và bổ gan. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
23. CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. 1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên vật liệu Mẫu lá cây Gan heo (Dicliptera chinensis L. Nees. được thu hái vào tháng 6 năm 2016 tại Thị trấn Cổ Lễ, huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định mang số hiệu (Vũ Đức Lợi 09 được gửi đến là mẫu tiêu bản dạng cây tươi có ảnh chụp chi tiết dạng sống, hoa, lá ). Mẫu tiêu bản có đủ tiêu chuẩn để giám định tên khoa học bao gồm cả cơ quan sinh dưỡng lẫn cơ quan sinh sản. Mẫu thực vật đã được Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giám định tên khoa học là: Dicliptera chinensis (L.) Nees, họ Ô rô-Acanthaceae (chi tiết theo phiếu giám định tên khoa học mẫu thực vật ở phụ lục 1) Mẫu khô: Lá Gan heo được rửa sạch, làm khô hoặc sấy khô với nhiệt độ khoảng 40°C và thái nhỏ, bảo quản để nghiên cứu thành phần hóa học và chiết xuất, phân lập. Hình 2.1. Mẫu cây Gan heo @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
24. 2.1.2. a ch t và dung m i dụng - Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập như: n-hexan, etyl acetat, dicromethal, EtOH, Cloroform, tO c, D M đ ều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và được chưng cất lại trước khi dùng. - Dung môi tinh khiết bao gồm: nước cất 2 lần, dimetylsulfosid (DMSO) - Các dung môi phân tích gồm: MeOH, n-hexan, EtOAc, H₂O dùng để phân tích sắc ký đều đạt tiêu chuẩn phân tích. - Sắc ký lớp mỏng: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254 Merck, độ dày 0,2mm. Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và 365nm sau đó hiện màu bằng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol. - Sắc ký cột: sắc ký cột sử dụng silica gel cỡ hạt 0.063-0.200mm (Merck) và cỡ hạt 0,040- 0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau. 2.1.3. Trang thiết bị, dụng cụ, máy móc - ác dụng cụ thí nghiệm thủy tinh: ống nghiệm, bình nón, bình gạn, cốc có mỏ, pipet - Các thiết bị khác: Tủ sấy, tủ hút, cân phân tích, kính hiển vi. - Phổ khối ESI-MS đo trên máy Varian gilent 1100 L -MSD tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Nhiệt độ nóng chảy: đo trên máy SMP10 io ote, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. - Góc quay cực riêng: đo trên máy PLR-4, MRC scientific instruments, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
25. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chiết xu t, phân lập hợp ch t Mẫu nghiên cứu sau khi được rửa sạch và phơi khô, thái nhỏ và ngâm chiết 3 lần trong dung môi ethanol, sử dụng chiết bằng thiết bị siêu âm (50oC, 3 giờ). Dịch chiết thu được lọc qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao toàn phần. Phân tán cao chiết này trong nước rồi chiết phân bố với các dung môi theo thứ tự tăng dần độ phân cực là n-hexan và ethyl acetat. ác phân đoạn n- hexan, ethyl acetat được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao từng phân đoạn tương ứng. Dược liệu Chiết với ethanol Dịch chiết ethanol Cao tổng ethanol Phân tán trong H2O Lắc phân đoạn với n-hexan Thu hồi dung môi Phân đoạn n- hexan Phân đoạn nước Lắc với ethyl acetat Thu hồi dung môi Phân đoạn ethyl acetat Phân đoạn H2O Hình 2.2: Sơ đồ chiết tách phân đoạn @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
26. Lựa chọn phân đoạn có tiềm năng bằng sắc kí lớp mỏng, tiến hành xử lý và phân lập. Quá trình nghiên cứu phân lập hợp chất từ các phân đoạn đã chọn chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký cột. ác phân đoạn trong quá trình phân lập được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng điều chế. Sắc ký cột : được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha đảo, lựa chọn hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Silica gel pha thường cỡ hạt là 0,063-0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040-0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau. Sắc ký lớp mỏng TL : được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254 Merck , độ dày 0,2 mm và RP-18 F254s, độ dày 0,25 mm (Merck). Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, sau đó được phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và đốt nóng trên bếp điện từ. Sắc ký lớp mỏng điều chế pTL : được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60G F254, độ dày 1,0 mm (Merck). Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol, đốt nóng trên bếp điện từ, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất bằng dung môi thích hợp. 2.2.2. Phương pháp xác định c u trúc hợp ch t Xác định cấu trúc của các chất phân lập được dựa trên phân tích kết quả phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), ngoài ra còn kết hợp với các thông số vật lí như Phổ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS), Góc quay cực được đo bằng máy DIP- 360, Điểm nóng chảy Mp và so sánh các d ữ liệu thực nghiệm và các dữ liệu được công bố để đưa ra kết quả chính xác nhất. a, Phổ khối lượng (MS) Phổ khối lượng cung cấp những thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ phân tử. Phổ khối lượng @không School xác định trofực Medicinetiếp khối lượng and của Pharmacy, VNU 19
27. ion mà xác định tỷ lệ giữa khối lượng m và điện tích (z) của ion (m/z). Khi đó để xác định khối lượng phân tử (M) cần phải biết số điện tích của ion. Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những định luật nhất định. Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau. Từ khối lượng các phân mảnh của phân tử, cùng các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một chất chưa biết. So sánh phổ khối của một chất chưa biết với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp định danh chất chưa biết đó dễ dàng và chính xác [16]. b, Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Khi đặt một chất có hạt nhân có số spin (I) lẻ 1H, 13 được đặt trong một từ trường ngoài (B0), các spin hạt nhân sẽ được sắp xếp lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái. Nếu dùng một bức xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường . Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng. Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó. ó 2 cách xác định năng lượng cộng hưởng này. Cách thứ nhất là xác định tần số cộng hưởng theo từng tần số trong suốt dải tần số cộng hưởng, cách này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân quét. Cách thứ hai là ghi nhận đồng thời mọi tần số cộng hưởng rồi sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhân. Kỹ thuật này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (Fourier transform - NMR, FT - NMR) và là kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện nay [16]. Nguyên thuỷ, phổ cộng hưởng từ hạt nhân là tần số cộng hưởng của các hạt nhân trong phân tử. Tuy nhiên, tần số hấp thu của hạt nhân thay đổi @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
28. theo từ trường ngoài B0. Để thuận tiện và loại bỏ ảnh hưởng của B0 trong số liệu phổ, người ta chia sự chênh lệch tần số cộng hưởng của hạt nhân so với một chất chuẩn thường dùng nhất là trimethyl silan, TMS) cho tần số cộng hưởng của chất chuẩn đó. Vì kết quả thu được (Hz/MHz) là rất nhỏ (phần triệu nên người ta dùng ppm để thể hiện giá trị cộng hưởng của các hạt nhân. Giá trị này thường được gọi là chuyển dịch hoá học. Giá trị chuyển dịch hoá học của các proton thường nằm trong khoảng 0-14 ppm, còn của carbon-13 là từ 0-240 ppm [16]. Như đã trình bày ở trên, tần số cộng hưởng của hạt nhân phụ thuộc vào từ trường của máy. Từ trường càng cao, dải tần số dùng để kích thích các hạt nhân càng rộng, phép đo càng nhạy và chính xác, độ phân giải ngày càng cao. Do vậy, ta thường gọi phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân 200 MHz, 300 MHz hay 500 MHz là theo tần số dùng để kích thích các proton [16]. Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ khác nhau. Xác định phổ của cùng một loại hạt nhân ( 1H hay 13 như trong các phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY) [16].  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều Phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hóa học của proton trong phân tử. ác proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ dịch chuyển hóa học khác nhau. Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùng môi trường hóa học thể hiện trên phổ có thể là 1 đỉnh. Đỉnh này có thể là đỉnh đơn, đôi, ba t ới 7 đỉnh thành phần. Diện tích mỗi đỉnh tỷ lệ với số lượng proton của đỉnh. Dựa vào diện tích của đỉnh có thể biết số proton của đỉnh đó [16]. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của carbon. Carbon lai hóa sp3 không liên kết với dị tố chuyển dịch trong khoảng 0-60 ppm. Carbon liên kết đơn với oxy (alcol, ether) chuyển dịch trong khoảng 45-85 ppm. Carbon lai hóa sp2 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
29. chuyển dịch trong khoảng 100-150 ppm, nếu có liên kết đôi với oxy có thể dịch chuyển tới 240 ppm. Với kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của carbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng với một carbon hơn 1 carbon nếu cũng có chung môi trường hóa học) của phân tử [16]. Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử. Kỹ thuật hiện thường sử dụng là DEPT (Detortionless Enhancement by Polarization Transfer) [16].  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Các kỹ thuật phổ hai chiều cho các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó, giữa các proton của carbon kế cận nhau (phổ COSY) hay phổ tương tác dị nhân (HETCOR) giữa proton và các carbon kế cận thường sử dụng hiện nay là kỹ thuật HSQC) hay xa hơn long-range H T OR, thường dùng hiện nay là HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY) [16]. Với các kỹ thuật phổ NMR, người ta có thể biết được mối liên hệ giữa các proton và carbon trong phân tử. Kết hợp với phổ khối và các thông tin khác ta có thể xây dựng và nhận dạng được cấu trúc phân tử của hợp chất [16]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
30. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả chiết xuất, phân lập hợp chất Mẫu lá cây Gan heo được chiết xuất như sau: Mẫu lá cây Gan heo được phơi khô, nghiền thành bột (6,5 kg), sau đó chiết trong ethanol 3 lần, mỗi lần dùng 8 lít dung môi. Sử dụng chiết bằng thiết bị chiết siêu âm (50°C, 3 giờ). Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gộp dịch chiết 3 lần lại và cất loại dung môi ở áp suất giảm thu được 630,0 g cặn chiết ethanol. Lấy 120 g cặn chiết này phân tán vào 1,2 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexan và ethyl acetat; mỗi dung môi được chiết lặp lại 3 lần, mỗi lần khoảng 1,5 lít dung môi, thu được các phân đoạn dịch chiết tương ứng. Các dịch chiết n-hexan, ethyl acetat được cất thu hồi dung môi thu được các cắn tương ứng n-hexan (H, 31,0 g) và ethyl acetat (E, 56,0 g) và lớp nước (N, 33,0 g). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
31. Dược liệu (6,5 kg) Chiết với EtOH (3 lần × 8 lít) Dịch chiết EtOH (120 g) Thu hồi dung môi, h a tan thành nhũ dich trong H₂O. Lắc phân đoạn với n-hexan (3 lần × 1,5 lít) Thu hồi dung môi Phân đoạn H₂O Phân đoạn n -hexan Lắc phân đoạn với (H: 31 g) EtOAc (3 lần × 1,5 lít) Thu hồi dung môi Phân đoạn H₂O Phân đoạn EtOAc Sắc kí cột (E: 56 g) Diaion Hp-20 Rửa giải bằng EtOH 96% Thu hồi dung môi Phân đoạn EtOH Phân đoạn H₂O Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn lá cây Gan heo @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
32. Phân đoạn ethyl acetat từ lá cây Gan heo được phân lập thô bằng cột silica gel như sau:  Giai đoạn phân lập 1. Sử dụng phương pháp sắc kí cột - Chuẩn bị cột: + Cặn chiết ethyl acetat (50,0 g được triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, trộn cặn với lượng tối thiểu silicagel, sấy khô và nghiền mịn. + Cột được rửa sạch, đáy cột được lót 1 lớp bông mỏng. Đổ vào cột 40ml chloroform mở khóa cho dung môi chảy từ từ để đẩy hết bọt khí trong lớp bông ra ngoài. Khi lớp dung môi còn khoảng 3 cm thì khóa cột. + Cột được nhồi bằng phương pháp nhồi cột ướt: trộn silica gel với một lượng vừa đủ dung môi chloroform thành hỗn dịch rồi đổ lên cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ quanh cột để hạt nén, thoát hết bọt khí trong cột và phân bố đều, bằng mặt, rửa thành cột bằng chloroform. + Ổn định cột: Sau khi luyện cột, ta kiểm tra cột xem có thẳng, và không còn bọt khí thì ta đậy nắp cột và ổn định cột trong vòng 24h. - Tiến hành sắc kí cột hấp thụ + Mở khóa cột cho dung môi chloroform chảy đến sát bề mặt silica gel, khóa cột lại. + Đưa chất lên cột: Đổ phần cặn đã được trộn với silica gel lên trên, vừa dội vừa gõ nhẹ để phần cặn sát bề mặt silica gel, lót 1 lớp bông mỏng lên bề mặt silica gel. + Sau đó rửa giải bằng dung môi và bắt đầu chạy cột. Hệ dung môi rửa giải là chloroform/methanol, tỉ lệ thay đổi từ 30:1 đến 1:1. + Điều chỉnh tốc độ rửa giải là 1ml/1 phút. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
33. + Mỗi ống nghiệm hứng khoảng 10ml dung dịch. Kiểm tra các dịch rửa giải bằng sắc kí lớp mỏng và thu các phân đoạn giống nhau. Thu được 4 phân đoạn E1 (6,0 g), E2 (14,2 g), E3 (6,3 g), E4 (8,4 g).  Giai đoạn phân lập 2. + Phân đoạn E4 tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hỗn hợp chloroform/ aceton/ nước (3:4:0,1), thu được 5 phân đoạn nhỏ là E4.1 (1,6 g), E4.2 (1,4 g) và E4.3 (1,2 g), E4.4 (0,8 g) và E4.5 (0,6 g). + Tinh chế phân đoạn E4.1 bằng cột sắc ký pha đảo RP-18 với hệ dung môi rửa giải aceton/nước 3:2, v/v thu được hợp chất 1 (23 mg). Phân tách phân đoạn E4.3 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi hexan/ aceton 7:3, v/v thu được hợp chất 2 (11 mg). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
34. Cao Ethyl acetat 50 g Silica gel pha thuận Cloroform/ methanol (30:1 đến 1:1) E1 (6 g) E2 (14,2 g) E3 (6,3 g) E4 (8,4 g) Silica gel pha thuận Cloroform/aceton/H₂O (3:4:0.1) E4.1 (1,6 g) E4.2 (1,4 g) E4.3(1,2 g) E4.4 (0,8 g) E4.5 ( 0,6 g) Pha đảo RP18 Silica gel pha thuận Aceton/H₂O ( tỉ lệ 3:2) Hexan/ aceton ( tỉ lệ 7:3) Hợp chất 1 (23 mg) Hợp chất 2 (11 mg) Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat 3.2. Xác định cấu trúc một số hợp chất từ cây Gan heo 3.2.1. Hợp ch t 1 Tính chất: Chất bột màu trắng, vô định hình. Độ quay cực: [α 25D = -64,2(c =0,1, MeOH). Phổ ESI-MS: m/z 277,0 [M+H]+ Khối lượng phân tử: 276. Công thức phân tử: C16H22O4 Phổ NMR trình bày ở Bảng 3.1. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
35. Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp ch t C16H22O4 và ch t so sánh L Vị trí DEPT C(1) 훿C(L) H (1) ppm J: Hz H(L)ppm J:Hz C OCH₃ 50,6 50,6 3,21s 3,2s 2 C 168,9 168,9 3 CH 118,7 118,7 5,91s 5,92s 3a C 171,0 171,0 4 C 38,6 38,6 4a CH 47,1 47,1 2,25(dt; J=4,6; 2,26(dt, 4,15Hz) J = 4,5;14,5 Hz) 5 CH₂ 35,0 35,0 2,06 (dd, J=14,5, 2,05 (dd, J = 17,5Hz); 2,45 (dd, 14,5, 17,5 Hz); J=14,5, 17,5Hz) 2,46 (dd,J = 14,5, 17,5 Hz) 6 C 198,0 198,0 7 C 135,8 135,8 8 CH 146,5 146,5 6,75 (d,J=6,5Hz) 6,74(d, J = 6,5Hz) 8a CH 31,0 31,0 3,06m 3,08m 9 CH₂ 37,6 37,7 1,65 1,64 (dd, J=13,5, (dd, J = 13,5, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
36. 13,5Hz) 13,5Hz) 2,48m 2,48 m 9a C 106,8 106,9 10 CH₃ 24,9 25,0 1,41s 1,4s 11 CH₃ 27,1 27,1 1,23s 1,22s 12 CH₃ 15,6 15,6 1,78s 1,77s Hợp chất 1 thu được dưới dạng bột màu trắng. Phổ ESI-MS của hợp chất 1 xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 277,0 [M+H]+, tương ứng với M= 276 1 và có thể có công thức phân tử C16H20O4. Phổ H-NMR của hợp chất 1 thấy có tín hiệu của 2 proton olefin ; 1 nhóm methoxy và 3 nhóm methyl. Phổ 13C- NMR và DEPT của hợp chất 1 xuất hiện 16 carbon trong đó có: 1 carbonyl, 4 carbon không liên kết với hydro, 4 carbon methin, 3 carbon methylen và 4 carbon methyl. Trên phổ HMBC của hợp chất 1 xuất hiện tương tác HM giữa H-10 δH 1,41)/H-11 δH 1,23) với C-3a δC 171,0)/C-4 δC 38,6)/C-4a δC 47,1); giữa H-3 δH 5,912) với C-2 δC168,9)/C-3a δC 171,0)/C-9a δC 106,8 đã xác định vị trí của 2 nhóm methyl tại C-4, liên kết đôi tại C-3/C-3a. Tương tác HM giữa nhóm methoxy δH 3,20) và C-9a δC 106,8 đã xác định vị trí nhóm methoxy gắn trực tiếp tại C-9a. Dựa vào dữ liệu phổ của hợp chất 1 và so sánh với số liệu đã công bố của hợp chất O-methyl-6- oxofurodysinin lacton [22] thấy trùng khớp các vị trí tương ứng. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
37. Vì vậy, xác định hợp chất 1 là O-methyl-6-oxofurodysinin lacton. Hình 3.3. C u trúc phân t 1 3.2.2. Hợp ch t 2 Tính chất: Hợp chất 2 có dạng tinh thể không màu, tan trong CHCl3. 1 Phổ H-NMR (500MHz, CDCl3 δ ppm có kết quả như sau: 7,59 (1H, d, J = 15,8 Hz, H-3′ , 7,09 1H, dd, J = 8,1, 1,8 Hz, H-9′ , 7,05 1H, d, J = 1,8 Hz, H-5′ , 6,93 1H, d, J = 8,1 Hz, H-8′ , 6,30 1H, d, J = 16,1 Hz, H-2′ , 5,85 (1H, br s, OH-7′ , 4,72 1H, d, J = 8,8 Hz, H-3), 5,10 (1H, br t, J = 6,6 Hz, H- 24), 3,94 (3H, s, OCH3-6′ , 1,68 3H, s, H3-26), 1,62 (3H, s, CH3-27), 0,98 (3H, s, CH3-29), 0,97 (3H, s, CH3-18), 0,91 (3H, s, CH3-30), 0,90 (3H, s, CH3-28), 0,89 (3H, d, J = 6,2 Hz, CH3-21), 0,60 (1H, d, J = 4,0 Hz, CH2-19), 0,38 (1H, d, J = 4,4 Hz, CH2-19). Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 cho thấy đây là hợp chất triterpenoid có dạng khung cycloartane. Các tín hiệu của cyclopropane methylene tại δH 0,38 (1H, d, J =4,4 Hz, CH2-19) và 0,60 (1H, d, J = 4,0 Hz, CH2-19); bốn nhóm methyl bậc ba tại δH 0,98 (3H, s, CH3-29), 0,97 (3H, s, CH3-18), 0,91 (3H, s, CH3-30), 0,90 (3H, s, CH3-28); một nhóm methyl bậc hai tại δH 0,89 (3H, d, J = 6,2 Hz, CH3-21); một nhóm methylene tại δH 5,10 (1H, br t, J = 6,6 Hz, H-24). Một nhóm feruloyl được xác định dựa trên tín hiệu proton tại [δH 7,59 (1H, d, J =15,8 Hz, H-3′ , 7,08 1H, dd, J = 8,1, 1,8 Hz, H-9′ , 7,04 1H, d, J = 1,8 Hz, H-5′ , 6,92 1H, d, J = 8,1 Hz, H-8′ , 6,30 1H, d, J = 16,1 Hz, H-2′ , 5,85 (1H, br s, OH-7′ ; và 3,94 3H, @ s, OSchool H3-6′ liên of k ếMedicinet với C-3 đượ cand xác Pharmacy, VNU 30
38. định dựa vào độ chuyển dịch hóa học ở trường thấp của H-3 δH 4,72 được so sánh với cycloartenol δH-3 4,72) trong tài liệu [29]. Nhóm feruloyl được xác định định hướng β dựa trên hằng số ghép cặp proton-proton giữa H-2ax và H- 3ax (J = 8,8 Hz). Dựa vào dữ liệu phổ của hợp chất 3 và so sánh với dữ liệu phổ đã công bố của hợp chất cycloartanyl ferulat [37 , xác định hợp chất 2 là Cycloartenyl ferulat. Hình 3.4. C u trúc phân t 3.3. Bàn luận Đề tài đã chiết xuất cao toàn phần từ phần trên mặt đất lá cây Gan heo bằng phương pháp ngâm tại nhiệt độ 50oC với dung môi cồn 96°. Phương pháp có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền thu được khối lượng cắn toàn phần đạt 9,69% so với lượng dược liệu ban đầu. Cắn toàn phần sau đó được chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần là nhexan, ethyl acetat , thu được lần lượt các cắn phân đoạn với khối lượng đạt 0,48% ; 0,86% ; so với nguyên liệu khô ban đầu. Đề tài đã phân lập 02 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của mẫu nghiên cứu. Dựa theo đặc điểm lý hóa (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy), phổ khối (APCI-MS, ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (1H-NMR, 13C- NMR, D PT và qua đối chiếu với các tài liệu đã công bố, 2 hợp chất này @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
39. được xác định lần lượt là: O-methyl-6-oxofurodysinin lacton (1) và Cycloartenyl ferulat (2). Cả 2 hợp chất này đều chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào trước đây về lá Gan heo. Vì vậy, đây là đóng góp mới của đề tài, làm phong phú hơn tri thức về thành phần hóa học của cây Gan heo. Hợp chất o-methyl-6-oxofurodysinin lacton Hợp chất o-methyl-6-oxofurodysinin lacton được tìm thấy ở hai loài Hải miên Dysidea Fragilis và Haliclona Oculata [5] và trong da của loài Cadlina Luteomarginata [23]. Hợp chất o-methyl-6-oxofurodysinin lacton được chứng minh là có tác dụng : chống hoạt tính gây độc tế bào ung thư. ác hợp chất phân lập từ loài hải miên Dysidea fragilis được đánh giá sàng lọc sơ bộ ở nồng độ 100 g/mL có hoạt tính gây độc tế bào trên 8 dòng tế bào ung thư KB, LU-1, HL-60, LnCaP, SK-MeI2, HepG2, MCF-7, PC-3. Kết quả cho thấy, hợp chất có khả năng ức chế >50% sự phát triển tế bào ung thư [5]. Hợp chất cycloartenyl ferulat Hợp chất cycloartenyl ferulat được tìm thấy trong dầu cám. Là một loại -Oryzanol, một hợp chất được tạo thành từ : este axit ferulic và rượu triterpene với phytosterols. Chúng có nhiều lợi ích sức khoẻ đã khảo sát từ gạo và các sản phẩm gạo. Nhóm chất đã được chứng minh khoa học có chất chống oxy hoá, chống viêm, chống khối u, và làm giảm kali máu, đã được được chấp thuận để điều trị mất cân bằng thần kinh và rối loạn mãn kinh [37]. Cụ thể hơn, hợp chất cycloartenyl ferulate, một thành phần của gamma- oryzanol có nguồn gốc từ dầu cám gạo làm suy giảm sự phân huỷ của tế bào Mast. Trong nghiên cứu này, các nhà khoa học kiểm tra ảnh hưởng của cycloartenyl ferulate (cycloartenolferulic axit este; CAF) về phản ứng dị ứng. Khi CAF và gamma-oryzanol được tiêm dưới da với DNP (phức DNA và @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
40. protein) chống lại IgE vào da lưng của chuột, phản ứng quá mẫn da trên da do thụ thể kháng nguyên DNP-HSA giảm đi. F và gamma-oryzanol cũng ức chế sự giải phóng hạt của các tế bào Mast . IgE kết hợp với CAF không thể phát hiện được bằng kháng thể chống lại IgE trong phân tích ELISA. Mặc dù ủ IgE với CAF không làm giảm lượng Ig , nhưng có thể kết tủa IgE bằng cách ly tâm. Kết quả này chứng minh rằng CAF đã bắt giữ được Ig , ngăn cản nó gắn kết với FcepsilonRI, và giảm sự giải phóng hạt của tế bào Mast . Chính vì thế, chúng có tác dụng trong điều trị viêm dị ứng [27]. Một nghiên cứu khác chứng minh tác dụng đa dạng của hợp chất cycloartenyl ferulate. Chiết xuất methanol của cám gạo và gamma-oryzanol đã ngăn chặn tình trạng gây viêm do 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) ở chuột . Các thành phần hoạt tính của cám gạo, sitosterol ferulate , 24- methylcholesterol ferulate , cycloartenyl ferulate và 24- metylenecycloartanol ferulate ức chế rõ ràng viêm TPA gây ra ở chuột. Liều ức chế 50% của các hợp chất này đối với viêm do TPA gây ra là 0,2-0,3 mg / con. Hơn nữa, cycloartenyl ferulate đã ức chế đáng kể tác dụng thúc đẩy khối u của TPA trong chuột nhắt. Như vậy, chất được khẳng định có hoạt tính chống viêm và chống phát triển khối u ở chuột [33]. Nhận xét: 2 các hợp chất phân lập được đều được chứng minh là có tác dụng sinh học, đồng thời giúp ta định hướng được việc nghiên cứu thêm thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học của lá cây Gan heo @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
41. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Qua quá trình hoàn thành thực nghiệm, luận văn đã thu đươc kết quả sau đây: - Đã phân lập được 02 chất bằng phương pháp chiết bằng dung môi ethanol và sắc ký từ phân đoạn ethylacetat của dịch chiết lá Gan heo. - Đã xác định được cấu trúc hóa học là o-methyl-6- oxofurodysinin lacton (1) và cycloartenyl ferulat (2) dựa theo dữ liệu phổ thực nghiệm và so sánh với tài liều đã công bố. Cả 2 hợp chất này đều lần đầu tiên phân lập từ lá cây Gan heo. 2. Kiến nghị o Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học cây Gan heo cả thành phần lá và phần trên mặt đất của cây. o Dựa trên kết quả nghiên cứu thành phần hóa học , tiến hành nghiên cứu tác dụng sinh học của cây Gan heo trên người. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
42. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn á 2014 , điển ách h a thực vật h c iệt Nam, NX Giáo dục Việt Nam, tr 393. 2. Đỗ Huy ích, Đặng Quang hung, ùi Xuân hương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2011), Cây thuốc v động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập III, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr. 479-480. 3. Võ Văn hi, Trần Hợp 1999 , Câ c c ch ở iệt Nam,tập I, NX Giáo dục, tr 214-215. 4. Võ Văn hi 2003 , điển thực vật th ng dụng, tập I, NX Khoa học và kỹ thuật, tr. 957. 5. Nguyễn Thị Cúc (2017) Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa h c và hoạt tính diệt tế ung thư của hai loài hải miên Dysidea fragilis và alicl na culata (tt)”, luận án Tiến sĩ hóa học, học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 6. Lưu Đàm ư (2005), “Nghiên cứu chiết tách nhuộm màu thực phẩm t kinh nghiệm s dụng thực vật của đồng bào dân tộc thiểu số”, Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu hâu , Đại học Quốc gia Hà Nội. 7. Nguyễn Thượng Dong (2006), Nghiên cứu thuốc t thả dược, NXB Khoa học và Kỹ thuật. 8. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1990), Phương pháp nghiên cứu hóa h c cây thuốc, NXB y học chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh, Khoa Dược. 9. Đỗ Văn Hải, Dương Đức Huyến (2011 , Đặc điểm hình thái các chi thuộc họ Ô Rô ( Acanthaceae Juss) ở Việt Nam. Hội nghị khoa h c @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
43. toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 4,Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, tr. 104-108. 10. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây c Việt Nam, tập III, Nhà xuất bản trẻ, tr.73-74. 11. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr.518-520. 12. Nguyễn hí Tôn 2015 , Đ ng Na ược- vị thuốc chữa ệnh, tập I, NX Y học, tr 542. 13. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc v động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr.432-438. 14. Viện Dược liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc t thả dược, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 139-141. 15. Phạm Kim Thoa (2017). Khóa luận “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa h c của cây Lá Diễn”, khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội. 16. Nguyễn Văn Thu và Trần Hùng (2011), ược liệu h c, I, NXB Y học. 17. Nguyễn Tiến Vững, Vũ Đức Lợi (2017), Một số hợp chất phân lập từ lá cây Gan Heo (Dicliptera chinensis (L.) Nees). Tạp ch ược h c, T. 57, Số 7, trang 54-57. Tài liệu Tiếng Anh 18. Abdullahi, S.M, Musa, A.M, Abdullahi, M.I, Sule M.Iand Sani, Y.M. 2013 , Isolation of Lupeol from the Stem-bark of Lonchocarpus sericeus Papilionaceae , Scholars Academic Journal of Biosciences (SAJB), 1(1):18-19. 19. hmad 1, Khan MR, Shah N , Khan R 2013 In vitro antioxidant potential of Dicliptera roxburghiana. BMC Complement Altern Med, 13:140. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
44. 20. Ankita Wal, Pranary Wal, A.K. Rai, Kanwal raj (2010), Isolation and modification of pseudohybrid plant Lupeol , J.Pharm. Sci. & Res. Vol.2(1),13-25. 21. Bibhu Prasad Sahu, Panchanan Gouda and Chakrapani Patnaik (2016), Pandanus Odaritissimus Linn Prasad Sahu, Panchanan Gouda and Chakrapani Patnaik (2016), Pandanus Odaritissimus Linn: Isolation of Stigmast-5, 22-dien-3-β-ol from ethanolic extra of stem bark and study of antimicrobial activity , Journal of Chemistry and chemical Sciences, Vol.6(6), 574-585. 22. Charoenchai P, Vajrodaya S, Somprasong W, Mahidol C, Ruchirawat S, Kittakoop P (2010), “Antiplasmodial, cytotoxic, radical scavenging and antioxidant activities of Thai plants in the family Acanthaceae , Planta Medical, 76(16), 1940-1943. 23. Eric J. Dumdei, Julia Kubanek, John E. Coleman, Jana Pika, Raymond J. Andersen, Jorge Rios Steiner and Jon Clardy (1997), New terpenoid metabolits from the skin extracts, an egg mass, and dietary sponges of the Northeastern Pacific dorid nudibranch Cadlina luteomarginata", Canadian Journal of Chemistry, 75 (6):773-789. 24. Gao Ya, Zhong Mingli, Zhong Jialiang, Zhang Kefeng (2014) Oestrogenicity and effect on hepatic metabolism of the aqueous extract of the leaf mixture of Aloe buettneri, Dicliptera verticillata, Hibiscus macranthus and Justicia insularis , Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, 6, 953-956. 25. Gao YT, Yang X , i TM. 2006 , Studies on the chemical constituents in herbs of ethanolic extract from herbs of Dicliptera chinensis , Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 31(12), 985-987. 26. Gao YT1, Yang X , i TM 2007 Dicliptercerebroside, a novel cerebroside from Dicliptera chinensis.” Journal of Asian Natural Products Research, page 763-770. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
45. 27. Oka T, Fujimoto M, Nagaska R 2010 , ycloartenyl ferulate, a component of rice bran oil-derived gamma-oryzanol, attenuates mast cell degranulation , Phytomedicine, 17(2):152-6. 28. P.S. Jain, S. . ari 2010 , Isolation of lupeol, stigmatsterol and campesteron from petrolium ether extract of woody stem of Wrightia tinctoria , Asian Journal of plant Sciences, 9(3): 1-5. 29. Rita Aquino, Isabella Behar, Francesco de Simone, Cosimo Pizza,Mario d'Agostino (1985), "Dioscin and Gracillin from Tamus communis", Journal of Natural Products, 48 (3): 502–502. 30. Takhtajan A.L. (1997), Diversity and Classification of Flowering Plants, Columbia University Press, New York, USA. 31. Telefo PB1, Moundipa PF, Tchana AN, Tchouanguep Dzickotze C, Mbiapo FT 1998 , ffects of an aqueous extract of Aloe buettneri, Justicia insularis, Hibiscus macranthus, Dicliptera verticillata on some physiological and biochemical parameters of reproduction in immature female rats , J Ethnopharmacol, 63(3):193-200. 32. Telefo P 1, Moundipa PF, Tchouanguep FM 2002 , Oestrogenicity and effect on hepatic metabolism of the aqueous extract of the leaf mixture of Aloe buettneri, Dicliptera verticillata, Hibiscus macranthus and Justicia insularis , Fitoterapia, 73(6):472-8. 33. Yasukawa K, Akihisa, Kimura Y 1998 , Inhibitory effect of cycloartenol ferulate, a component of rice bran, on tumor promotion in two-stage carcinogenesis in mouse skin , Biological & Pharmaceutical Bulletin, 21(10):1072-6. 34. Zhang K, Gao Y, Zhong M, Xu Y, Li J, Chen Y, Duan X, Zhu H(2016), Hepatoprotective effects of Dicliptera chinensis polysaccharides on dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis rats and its underlying mechanism , Journal of Ethnopharmacol, 179, 38-44. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
46. 35. ZhangK, ZhuH, GaoY 2010 , Research on active extracts of Dicliptera chinensis on liver protection , ZhongguoZhong Yao ZaZhi, 35(4): 497-498. 36. Zhang X1, Zhang J2, Jia L3, Xiao S4 2016 , Dicliptera chinensis polysaccharides target TGF-β/Smad pathway and inhibit stellate cells activation in rats with dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis . Cell Mol Biol, ; 62(1):99-103. 37. Zhimin Xu, J. Samuel Godber (1999), "Purification and identification of components of gamma-oryzanol in rice bran oil , Journal of Agricultural Food Chemistry, 47(7): 2724-8. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU