›

Khóa luận Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây Cỏ rươi lá bắc (Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong)

pdf 78 trang thiennha21 18/04/2022 5000
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây Cỏ rươi lá bắc (Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_buoc_dau_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_cua_cay_co.pdf

Nội dung text: Khóa luận Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây Cỏ rươi lá bắc (Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  LÊ PHƯƠNG THẢO BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CỎ RƯƠI LÁ BẮC (Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2020
  2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt  (ppm)  (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học ALT Alanine transaminase AST Aspartate transaminase d doublet dd double doublet 13C Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR Resonance Spectroscopy cacbon-13 Distortionless Enhancement DEPT Phổ DEPT by Polarization Transfer D-GalN D-galactosamine N 1,2-di-O-α-linolenoyl-3-O-- dLGG galactopyranosyl-sn-glycerol Half Maximal Effective Nồng độ cho 50% tác dụng tối EC50 Concentration đa Electrospray Ionization Mass Khối phổ đo bằng phương pháp ESI-MS Spectrometry ion hóa phun điện tử EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol Fourier Transform Infrared Phổ hồng ngoại biến đổi FTIR Spectroscopy Fourier Gas Chromatography-Mass GC-MS Sắc ký khí ghép khối phổ Spectrometry Galactolipids-enriched Dịch chiết giàu galactolipid của GLE Extract of M. bracteata Murdannia bracteata
  3. Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt 1H Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR Resonance Spectroscopy proton Hexane Extract of M. Dịch chiết hexan của M. HE bracteata bracteata Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua HMBC Correlation nhiều liên kết High Performance Liquid HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography Heteronuclear Single Phổ tương tác dị hạt nhân qua HSQC Quantum Coherence một liên kết Half Maximal Inhibitory IC50 Nồng độ ức chế tối đa một nửa Concentration Inducible Nitric Oxide iNOS NO synthase cảm ứng Synthase IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại J (Hz) J coupling constant Hằng số ghép LPS Lipopolysaccharide Methanol Extract of Dịch chiết methanol của M. ME Murdannia bracteata bracteata MeOH Methanol Minimun Inhibitory Nồng độ ức chế tối thiểu của MIC Concentration chất có hoạt tính kháng sinh s singlet SI Selective Index Hệ số chọn lọc Ultra Performance Liquid UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu năng Chromatography
  4. DANH MỤC HÌNH ẢNH STT Tên hình Trang Đặc điểm thực vật một số loài thuộc chi Murdannia ở Hình 1.1. 5 - 6 Việt Nam Hình 1.2. Hoa của một số loài thuộc chi Murdannia 7 Hình 1.3. Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng của Murdannia bracteata 8 Hình 1.4. Đặc điểm cơ quan sinh sản của Murdannia bracteata 9 Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Cỏ rươi lá bắc 26 Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hai hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat 27 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất CT1 29 Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất CT2 30 DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Tên bảng Trang Bảng 1.1. Phân bố các loài thuộc chi Murdannia ở Việt Nam 4 - 5 Bảng 1.2. Một số hợp chất phân lập được từ Murdannia bracteata 11 - 12 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phương Bảng 3.1. 24 - 25 pháp hóa học Số liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của CT1 và chất Bảng 3.2. 28 tham khảo đo trong DMSO Số liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của CT2 và chất Bảng 3.3. 29 - 30 tham khảo đo trong DMSO
  5. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về chi Murdannia 3 1.1.1. Vị trí phân loại của chi Murdannia 3 1.1.2. Số lượng loài và sự phân bố các loài thuộc chi Murdannia 3 1.1.3. Đặc điểm thực vật chi Murdannia 5 1.2. Tổng quan về loài Murdannia bracteata 7 1.2.1. Đặc điểm hình thái loài Murdannia bracteata 7 1.2.2. Đặc điểm phân bố loài Murdannia bracteata 9 1.2.3. Thành phần hóa học của Murdannia bracteata 9 1.2.4. Tác dụng sinh học của Murdannia bracteata 13 1.2.5. Công dụng của Murdannia bracteata theo y học cổ truyền 16 1.2.6. Sản phẩm có thành phần Murdannia bracteata trên thị trường 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.1. Nguyên liệu 17 2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1. Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá cây Cỏ rươi lá bắc 18 2.2.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có trong lá cây Cỏ rươi lá bắc 22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất bằng phương pháp hóa học 24 3.2. Kết quả chiết xuất, phân lập một số hợp chất trong lá cây Cỏ rươi lá bắc 25 3.2.1. Chiết các phân đoạn từ lá cây Cỏ rươi lá bắc 25 3.2.2. Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột 26 3.2.3. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được 27
  6. 3.3. Bàn luận 31 3.3.1. Về định tính các nhóm chất 31 3.3.2. Về chiết xuất và phân lập 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36
  7. MỞ ĐẦU Nhờ có vị trí địa lý thuận lợi, khí hậu nhiệt đới cùng độ ẩm cao, Việt Nam sở hữu một hệ sinh thái vô cùng phong phú và đa dạng. Cây cối sinh trưởng, phát triển mạnh, là nguồn tài nguyên quan trọng cho tiềm năng về dược liệu. Theo ước tính nước ta có trên 12000 loài thực vật bậc cao, trong số đó có khoảng 4000 loài được sử dụng làm thuốc [5]. Ngày nay, khi nhu cầu về thuốc có nguồn gốc dược liệu ngày càng tăng, việc đi sâu vào nghiên cứu, xác minh các kinh nghiệm của y học cổ truyền và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao đang rất được thế giới quan tâm [1]. Đặc biệt đối với Việt Nam, một đất nước giàu tài nguyên dược liệu, thì xu hướng phát triển các sản phẩm từ tự nhiên là một hướng đi đúng đắn. Thảo dược là đối tượng lý tưởng để các nhà khoa học sàng lọc và tìm ra các hoạt chất mới cho tác dụng mạnh, độc tính thấp, giảm thiểu chi phí nghiên cứu phát triển so với tổng hợp hóa học. Mỗi cây thuốc có chứa một hỗn hợp các hợp chất khác nhau, tuy nhiên trong mọi trường hợp hầu hết chưa xác định rõ hợp chất nào cho tác dụng điều trị. Chính vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học của các loài cây đem lại ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn cao. Những tiến bộ trong định tính và định lượng các phân tử thuốc từ thực vật giúp chúng ta hiểu rõ hơn về mối quan hệ giữa các thành phần và tác dụng của chúng. Cây Cỏ rươi lá bắc thuộc chi Murdannia, một trong những chi lớn nhất của họ Thài lài (Commelinaceae). Chi này phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và ôn đới ấm [18], thích hợp với khí hậu nóng ẩm; ở Việt Nam có 16 loài, trong đó 7 loài được sử dụng làm thuốc [2]. Cỏ rươi lá bắc, tên khoa học Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong, tìm thấy ở Trung Quốc, Lào, Thái Lan, Việt Nam [48]. Một số nghiên cứu trên thế giới ghi nhận loài cây này có tác dụng kháng khuẩn [47], chống viêm [46], bảo vệ gan [49], hỗ trợ điều trị ung thư gan và tiểu đường [39]. Trong y học cổ truyền một số nước, Murdannia bracteata được dùng để trị ho [30], kháng viêm [2], chữa các bệnh về gan, thận [39]. Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu cụ thể về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Cỏ rươi lá bắc ở Việt Nam còn rất hạn chế. Để góp phần xây dựng cơ sở khoa học cho việc ứng dụng Cỏ 1
  8. rươi lá bắc trong điều trị bệnh, chúng tôi đã lựa chọn và thực hiện đề tài: “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây Cỏ rươi lá bắc (Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong)” với những mục tiêu sau: 1. Định tính sơ bộ thành phần hóa học của lá cây Cỏ rươi lá bắc. 2. Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của 02 hợp chất từ lá cây Cỏ rươi lá bắc. 2
  9. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chi Murdannia 1.1.1. Vị trí phân loại của chi Murdannia Theo hệ thống phân loại thực vật có hoa APG IV (2016) [12], vị trí phân loại của chi Murdannia như sau: Giới Thực vật (Plantae) Thực vật có hoa (Angiosperms) Thực vật một lá mầm (Monocots) Nhánh Thài lài (Commenlinids) Bộ Thài lài (Commelinales) Họ Thài lài (Commelinaceae) Chi: Murdannia 1.1.2. Số lượng loài và sự phân bố các loài thuộc chi Murdannia 1.1.2.1. Trên thế giới Chi Murdannia là một trong những chi lớn nhất thuộc họ Commelinaceae, gồm khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu ở những vùng nhiệt đới và ôn đới ấm; đặc biệt là Châu Á với hơn 50% số lượng loài [18]. Các nghiên cứu được thực hiện nhiều nhất ở Ấn Độ ghi nhận riêng nước này có đến 29 loài [35]. Ngoài ra, ở Châu Phi có 11 loài [19], Trung và Nam Mỹ có 6 loài [18]. 1.1.2.2. Ở Việt Nam Theo GS.TS. Phạm Hoàng Hộ, chi Murdannia ở Việt Nam có 15 loài, phân bố một số nơi như Bảng 1.1 [2, 3]. World Checklist of Selected Plant Families (2004) có ghi nhận thêm 01 loài là Murdannia graminea [22]. Trong đó, các loài được sử dụng làm thuốc là M. bracteata, M. divergens, M. edulis, M. medica, M. nudiflora, M. simplex, M. triquetra [2]. 3
  10. Bảng 1.1. Phân bố các loài thuộc chi Murdannia ở Việt Nam Loài Tên gọi khác Phân bố Murdannia bracteata Các tỉnh phía Bắc (Ninh Bình, J.K.Morton ex Trai lá hoa Nam Định, ) đến Thừa Thiên – D.Y.Hong Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng Murdannia divergens Từ Lâm Đồng đến các tỉnh Nam Trai rẽ (C.B.Clarke) Bruckner Bộ Murdannia edulis Lâm Đồng, Phú Yên, Ninh (Stokes) Faden Lõa trai ngọt Thuận, Bình Phước, TP. Hồ Chí Minh Murdannia gigantea Hoang nguyên 1 – 1500m (Vahl.) Bruckner Murdannia japonica Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình, Trai Nhật (Thurnb.) Faden Đồng Nai Murdannia keisak Hoàng Liên Sơn, Phú Yên, Khánh Trai sắc (Hassk.) Handel-Mazz Hòa Murdannia medica Thừa Thiên – Huế, Khánh Hòa, Trai thuốc (Lour.) D.Y.Hong Lâm Đồng, Đồng Nai Murdannia nudiflora Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, (L.) Brenan Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Hà Nội, Hà Nam, Nghệ An, Lõa trai trần Quảng Trị, Thừa Thiên – Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Lâm Đồng, Khánh Hòa, TP. Hồ Chí Minh Murdannia semiteres Trai suôn Phan Rang (Dalz.) Santapau Murdannia simplex Khánh Hòa, Ninh Thuận, Lâm Trai đơn giản (Vahl.) Brenan Đồng Murdannia spectabilis Trai lông lẩy Từ Huế đến Đà Lạt, Đồng Nai (Kurz) Faden 4
  11. Loài Tên gọi khác Phân bố Murdannia spirata (L.) Lõa trai xoăn Quảng Nam, Thừa Thiên – Huế Bruckner Murdannia triquetra Bà Rịa – Vũng Tàu, TP. Hồ Chí (Wall.) Bruckner Minh Murdannia vaginata Thảo nguyên trên vùng cát: Huế, (L.) Bruckner Lõa trai dao Đà Nẵng, Nha Trang, Biên Hòa, Vũng Tàu, Phú Quốc Murdannia vescicolor Lõa trai đổi màu Ruộng, dựa lộ, bình nguyên (Dalz.) Bruckner 1.1.3. Đặc điểm thực vật chi Murdannia Chi Murdannia, họ Thài lài (Commelinaceae): Cây thân thảo, sống lâu năm, một số loài hàng năm. Rễ thường phình lên ở giữa. Thân cây leo hoặc mọc đứng. Lá mọc cách hoặc mọc vòng ở gốc. Cụm hoa kiểu chùm xim, được bao bọc trong các lá bắc. Ở mỗi lá bắc có 2 – 5 xim hoa. Hoa lưỡng tính, thường có vòi nhụy lệch về 1 phía so với trục hoa. Các lá đài rời, hình thuyền từ nông đến sâu. Cánh hoa rời, màu tím, xanh dương, hồng, vàng hoặc hơi trắng, hình tròn hoặc hình trứng. 3 nhị sinh sản đối diện các lá đài (một trong số đó đôi khi không có khả năng sinh sản), 3 nhị lép đối diện các cánh hoa. Quả hình trứng, hình nang hoặc hình cầu, mở thành 3 ô. Mỗi ô có 1 hoặc 2 hạt, rốn hạt tròn. [18, 41, 48] Dưới đây là hình ảnh một số loài Murdannia tìm thấy ở Việt Nam: Murdannia bracteata Murdannia divergens 5
  12. Murdannia keisak Murdannia edulis Murdannia simplex Murdannia nudiflora Murdannia medica Murdannia triquetra Hình 1.1. Đặc điểm thực vật một số loài thuộc chi Murdannia ở Việt Nam 6
  13. Đặc điểm thực vật giữa các loài khác nhau không nhiều. Chính vì vậy, khi phân tích hình thái một mẫu cây, cần chọn cây có cơ bản đầy đủ các bộ phận, đặc biệt là hoa. Đây là bộ phận ít bị thay đổi bởi điều kiện tự nhiên và khá đặc trưng cho loài. Hoa của các loài thuộc chi Murdannia có thể khác nhau về màu sắc, hình dạng tràng hoa, kích thước nhị, nhụy hoa (Hình 1.2). Murdannia bracteata Murdannia divergens Murdannia edulis Murdannia keisak Murdannia nudiflora Murdannia loriformis Hình 1.2. Hoa của một số loài thuộc chi Murdannia 1.2. Tổng quan về loài Murdannia bracteata - Tên khoa học: Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong, họ Thài lài (Commelinaceae). - Tên tiếng Việt: Cỏ rươi lá bắc, Trai lá hoa, Bao tử. 1.2.1. Đặc điểm hình thái loài Murdannia bracteata Cây thân thảo, sống lâu năm. Rễ sợi, dài, đường kính 0,15 – 0,4 mm. Thân hình trụ, có khía dọc, chia đốt dài 3 – 10 cm, màu xanh đậm; lông phủ dày đặc, màu trắng. Lá đơn, mọc so le; bẹ lá dài 0,7 – 1,3 cm; phiến thon hẹp, 7
  14. dài 3 – 7 cm, rộng 0,6 – 1 cm, đầu nhọn; gốc lá màu trắng, ôm lấy thân; gân lá chạy thẳng song song từ gốc, gân giữa rõ. Hình 1.3. Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng của Murdannia bracteata Chú thích: 1. Toàn cây; 2. Rễ cây; 3. Thân cây; 4. Hình thái lá; 5. Bẹ lá; 6. Mép lá. Cụm hoa mọc ở nách lá hay tận cùng của ngọn, cuống dài 3,5 – 11 cm. Hoa tập hợp thành bông, mỗi bông có 3 – 8 hoa, mỗi hoa có một lá bắc riêng hình bầu dục, rộng 0,6 cm, dài 0,4 cm. Hoa đều, lưỡng tính; cuống hình trụ dài 0,3 – 0,4 cm, màu xanh, nhẵn; đài 3, rời, hình lòng thuyền, rộng 0,2 – 0,3 cm, dài 0,4 cm, màu xanh nhạt, có lông ngắn thưa ở mặt ngoài; tràng 3, rời, hình cánh hoa, rộng 0,7 – 0,9 cm, dài bằng đài, màu tím; nhị 6 cái xếp thành 2 vòng, 3 nhị vòng ngoài bất thụ có chỉ nhị hình sợi, màu tím, dài 0,4 – 0,5 cm, mang bao phấn bất thụ có 3 thùy, 3 nhị hữu thụ có kích thước khác nhau, chỉ nhị mập, màu tím, dài 0,2 – 0,7 cm, các lông dài màu tím tập trung ở phần chân của chỉ nhị, bao phấn 2 ô, hình bầu dục, màu trắng; bầu nhụy hình elip thuôn, dài 0,3 cm, đường kính 0,15 cm, màu xanh, bầu 3 lá noãn liền nhau tạo thành 3 ô; vòi nhụy hình sợi dài 0,6 cm, màu tím nhạt. Quả nhỏ, 3 cạnh, có vỏ cứng. Mùa hoa tháng 5 – tháng 11. [2, 48] 8
  15. Hình 1.4. Đặc điểm cơ quan sinh sản của Murdannia bracteata Chú thích: 1. Cụm hoa; 2a. Hoa nguyên vẹn nhìn từ trên xuống; 2b. Hoa nguyên vẹn nhìn từ dưới dưới lên; 3. Lá bắc; 4. Đài; 5. Tràng; 6a. Nhị bất thụ; 6b. Nhị hữu thụ; 7. Bầu; 8. Bầu cắt ngang. 1.2.2. Đặc điểm phân bố loài Murdannia bracteata Cây Cỏ rươi lá bắc phân bố ở các tỉnh phía Nam Trung Quốc và một số nước Đông Nam Á bao gồm Lào, Thái Lan, Việt Nam [22, 48]. Ở nước ta, loài này được tìm thấy ở những nơi đất ẩm ven đường, bờ kênh rạch, ven rừng, trên nương rẫy các tỉnh phía Bắc đến Thừa Thiên – Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng [2]. 1.2.3. Thành phần hóa học của Murdannia bracteata Năm 2006, từ phân đoạn ethyl acetat của dịch chiết methanol toàn cây Murdannia bracteata, Wang Guei Jane cùng các cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc 4 hợp chất: - bracteanolide A (1) - bracteanolide B (2) - acid (+)-(R)-p-hydroxyphenyllactic (3) - isovitexin (4) 9
  16. Trong đó, 1 và 2 là hai hợp chất mới, 3 đã từng được phân lập từ chất chuyển hóa của một số loài thuộc chi Ceratocysis, 4 đã từng được phân lập từ loài Terminalia catappa. [46] Năm 2009, Yam Mun Fei và cộng sự xác định được hàm lượng các hợp chất có chứa nhóm phenol trong M. bracteata là khoảng 10%. [49] Năm 2014, Ooi Kheng Leong cùng các cộng sự đã phân lập một số hợp chất từ dịch chiết hexan của cây này, sử dụng 2 phương pháp GC-MS và UPLC. GC-MS cho thấy sự có mặt của 15 hợp chất bay hơi: - phytol (5) - acid octadecanoic, butyl ester (6) - tetracosan (7) - 2,2-dimethyl-3-(3,7,16,20-tetramethyl-heneicosa-3,7,11,15,19- pentaenyl)-oxiran (8) - tetrapentacontan (9) - α-tocopherol (10) - (3,5α)-cholest-7-en-3-ol (11) - (3)-ergost-5-en-3-ol (12) - stigmasterol (13) - hexacontan (14) - (3,5α)-ergost-7-en-3-ol (15) - 9,19-cyclocholestan-3-ol, 14-methyl, (3,5α)- (16) - -sitosterol (17) - (3)-stigmasta-5,24(28)-dien-3-ol (18) - 9,19-cyclo-25,26-epoxyergostan-3-ol, 4,4,14-trimethyl-, acetat (19) Trong số đó, α-tocopherol (10) được xác định là thành phần chính của dịch chiết hexan (16,89%), tiếp đến là -sitosterol (15,19%) và stigmasterol (10,58%), các hợp chất còn lại chiếm tỷ lệ không nhiều. Các hợp chất không bay hơi được xác định bằng UPLC, cho kết quả là sự có mặt 2 dẫn xuất của apigenin (20) và acid caffeic (21). [39] 10
  17. Theo nghiên cứu của Ch’ng Yung Sing và cộng sự năm 2016, phổ IR của M. bracteata cho thấy loài này có chứa hàm lượng lớn các hợp chất saccharid hay đường [13]. Năm 2019, Shyur Lie Fen cùng các cộng sự xác định được tất cả 7 hợp chất monogalatosyldiacylglycerol có trong phân đoạn dịch chiết giàu galactolipid của M. bracteata. Trong đó, 1,2-di-O-α-linolenoyl-3-O-- galactopyranosyl-sn-glycerol (dLGG) (22) là thành phần chính (78,9%). Các gốc acyl cấu tạo nên 6 galactolipid còn lại là: - α-stearidonoyl / α-stearidonoyl (23) - α-linolenoyl / α-stearidonoyl (24) - α-linoleoyl / α-linolenoyl (25) - palmitoyl / α-linolenoyl (26) - oleoyl / α-linolenoyl (27) - palmitoyl / α-linoleoyl (28) Vị trí của 2 gốc acyl trong các hợp chất 24, 25, 26, 27, 28 chưa được xác định (R1, R2 có thể hoán vị cho nhau). [45] Cấu trúc của một số hợp chất được biểu diễn ở Bảng 1.2. Bảng 1.2. Một số hợp chất phân lập được từ Murdannia bracteata Cấu trúc hợp chất Phân lập từ Phân đoạn ethyl acetat 1: R = H của dịch chiết 4 2: R = CH3 methanol [46] 3 Dịch chiết hexan [39] 10 11
  18. Cấu trúc hợp chất Phân lập từ Dịch chiết hexan [39] 13 17 22: R1 = R2 = 23: R1 = R2 = 24: R1 = R2 = Phân đoạn ethyl acetat 25: R1 = của dịch chiết R2 = ethanol [45] 26: R1 = R2 = 27: R1 = R2 = 28: R1 = R = 2 12
  19. 1.2.4. Tác dụng sinh học của Murdannia bracteata ➢ Tác dụng kháng Helicobacter pylori Năm 2005, Wang Yuan Chuen cùng cộng sự đã thử nghiệm và sàng lọc tác dụng kháng Helicobacter pylori của dịch chiết 50 loài thảo dược Đài Loan. Dung môi chiết được sử dụng là ethanol 95%. Thử nghiệm thực hiện trên 10 chủng Hp: BCRC 17021, BCRC 17023, BCRC 17026, BCRC 17027, BCRC 15415, QU 108, QU 141, QU 144, QU 150 và QU 181. Theo đó, dịch chiết của M. bracteata cho hoạt tính kháng Hp trung bình với khả năng ức chế 8/10 chủng thử nghiệm. [47] ➢ Tác dụng chống viêm Khi các đại thực bào được hoạt hóa, việc sản sinh quá mức nitơ oxit (NO) thông qua NO synthase cảm ứng (iNOS) là một trong những yếu tố gây viêm. Để làm sáng tỏ tác dụng chống viêm của M. bracteata, năm 2006, Wang Guei Jane cùng các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân lập các hoạt chất và thử tác dụng trên iNOS ở các đại thực bào được hoạt hóa bởi lipopolysaccharid (LPS). Dịch chiết methanol của M. bracteata được phân đoạn bằng chiết lỏng- lỏng, sử dụng các dung môi n-hexan, ethyl acetat, n-butanol và H2O. Trong đó, phân đoạn ethyl acetat cho hoạt tính ức chế mạnh nhất trên iNOS. Phân đoạn này sau đó được sắc ký bằng cột Sephadex LH-20 và HPLC, phân lập được 4 hợp chất (1 – 4). Hai hydroxybutenolid và isovitexin cho thấy tác dụng ức chế tổng hợp NO ở các đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bởi LPS. Trong số đó, hoạt tính của bracteanolid A (1) là mạnh nhất. Tác dụng ức chế tổng hợp NO có liên quan đến giảm hoạt động của protein iNOS. Tác dụng điều hòa hoạt động iNOS là chọn lọc, vì nó không ảnh hưởng đến quá trình giãn mạch do giải phóng NO nội mạc khi bị kích thích bởi acetylcholin, đặc trưng cho hoạt động của NO synthase nội mạc (eNOS). Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng khoa học cho việc sử dụng M. bracteata với tác dụng chống viêm trong y học cổ truyền. Ngoài ra, hoạt tính ức chế chọn lọc iNOS của bracteanolid A có tiềm năng để phát triển thành thuốc ức chế chọn lọc iNOS phục vụ điều trị trong tương lai. [46] 13
  20. ➢ Tác dụng bảo vệ gan Năm 2010, Yam Mun Fei cùng các cộng sự đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết methanol toàn cây M. bracteata. Dịch chiết methanol của M. bracteata (ME) có tác dụng bảo vệ gan có thể do các đặc tính chống oxy hóa và dọn gốc tự do. [49] Thử nghiệm in vitro cho thấy ME có khả năng ức chế hình thành gốc tự do 2,2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) với EC50 = 2,82 ± 0,009 mg/mL. Ngoài ra, khi cho chuột uống ME (liều 500mg/kg hoặc 1000mg/kg) trước khi gây nhiễm độc gan bằng CCl4, quan sát thấy hoại tử mô ở gan giảm. Sự tăng hoạt độ men gan (AST và ALT huyết thanh) và nồng độ malondialdehyd (MDA) trong huyết tương cũng bị ức chế đáng kể. ME còn ức chế peroxid hóa lipid trong mô gan với EC50 = 1,785 mg/mL 0,01 mg/mL. Tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết có thể được giải thích do hàm lượng 10% các hợp chất chứa nhóm phenol, bởi nhiều hợp chất trong nhóm này đã được chứng minh về hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan. ➢ Tác dụng gây độc tế bào ung thư gan và ức chế α-glucosidase Nghiên cứu của Ooi Kheng Leong và các cộng sự năm 2014 được thực hiện nhằm đưa ra cơ sở khoa học cho việc sử dụng M. bracteata điều trị ung thư gan và tiểu đường trong y học cổ truyền Malaysia. Dược liệu sau khi phơi khô và xay được chiết bằng các dung môi hexan, chloroform và methanol, sau đó thử độc tính từng dịch chiết trên tế bào ung thư biểu mô gan HepG2 và hoạt tính ức chế α-glucosidase. [39] Sàng lọc sơ bộ các dịch chiết cho thấy tác dụng ức chế tế bào HepG2 chỉ có ở dịch chiết hexan (HE), với EC50 = 37,17 1,00 μg/mL. α-tocopherol, thành phần chính của HE, đã được ghi nhận có tác dụng gây độc tế bào đối với nhiều dòng tế bào ung thư ở chuột và người [9, 10, 23]. Chất này còn có khả năng khuếch đại quá trình apoptosis bằng cách làm tăng biểu hiện caspase 3 ở một số dòng tế bào ung thư của người [34]. Hoạt tính khuếch đại apoptosis có thể giải thích do nhóm methyl, đuôi hydrocarbon, cấu trúc vòng và tính thân dầu của α-tocopherol, làm nó dễ đi vào huyết tương hoặc màng ty thể để kích hoạt biểu hiện caspase 3 [8, 11]. Bên cạnh đó, apigenin cũng đã 14
  21. được ghi nhận tác dụng kích hoạt apoptosis thông qua hoạt hóa caspase 3, 7, 9, 10 trong các tế bào HepG2 [26]. Do đó, α-tocopherol (10) và dẫn xuất của apigenin (20) có thể là tác nhân chính gây độc tế bào và kích hoạt quá trình apoptosis của các tế bào HepG2. HE không chỉ gây độc tế bào ung thư biểu mô gan mà còn ức chế α- glucosidase, với EC50 = 117,04 ± 2,34 g/mL. Việc ức chế enzym làm giảm hấp thu carbohydrat ở ruột non, do đó làm giảm đường huyết sau ăn. Theo nghiên cứu so sánh một số hợp chất chứa nhóm phenol của Kwon Young In và cộng sự (2008), acid caffeic là chất có khả năng ức chế α-glucosidase mạnh [29]. Do đó, hoạt tính ức chế α-glucosidase của dịch chiết hexan của M. bracteata có thể do sự có mặt của dẫn xuất acid caffeic (21). ➢ Tác dụng giãn mạch Năm 2016, Ch’ng Yung Sing và cộng sự đã sàng lọc tác dụng giãn mạch của 6 loài thảo dược Malaysia, trong đó có M. bracteata. Dược liệu được chiết bằng 3 loại dung môi: nước, ethanol 50% và ethanol 95%, thử tác dụng trên động mạch chủ chuột đã tách ra và cắt thành các vòng. Nồng độ cần thiết để làm giãn 50% các vòng động mạch chủ (EC50) của mỗi dịch chiết với dung môi khác nhau là khác nhau. EC50 của dịch chiết ethanol 95% và 50% tương ứng là 31,98 ± 11,42 và 20,61 ± 10,27 mg/mL. EC50 của dịch chiết nước cao hơn hẳn (166,91 ± 14,07mg/mL). Qua phân tích phổ FTIR, các nhà khoa học cho rằng hàm lượng flavonoid ảnh hưởng đến hoạt tính giãn mạch của dược liệu. M. bracteata có tác dụng giãn mạch nhưng không quá mạnh. [13] ➢ Tác dụng điều trị tổn thương gan Năm 2019, trong nghiên cứu của Shyur Lie Fen cùng các cộng sự, phân đoạn chiết giàu galactolipid của M. bracteata và dLGG (22) – hoạt chất phân lập từ phân đoạn này của MB được đánh giá tác dụng điều trị tổn thương gan. Phân đoạn giàu galactolipid (GLE) thu được bằng quy trình: chiết dược liệu tươi bằng ethanol 95%, sau đó phân tách bằng ethyl acetat, sử dụng hệ dung môi CH2Cl2 : CH3OH (12 : 1) để rửa giải sắc ký cột thu được 10 phân đoạn 15
  22. nhỏ, cuối cùng tinh chế phân đoạn nhỏ 6 bằng dung môi ethanol 95% rửa giải qua cột Diaion HP-20. Thử nghiệm thực hiện trên chuột bị gây tổn thương gan bằng LPS và D-galactosamin N (D-GalN). GLE và dLGG làm giảm đáng kể sự tăng hoạt độ AST, ALT huyết thanh ở chuột tiếp nhận LPS/D-GalN, do đó hiệu quả trong điều trị tổn thương gan và viêm gan cấp do LPS/D-GalN. Sự xâm nhập của các tế bào miễn dịch, hoại tử mô và hồng cầu trong mô gan, cũng giảm đáng kể. Ngoài ra, dLGG còn có tác dụng bảo vệ gan nếu dùng với liều 1 hoặc 10mg/kg trước khi tiêm LPS/D-GalN cho chuột. Các kết quả cho thấy dLGG có cả tác dụng bảo vệ gan và điều trị viêm gan cấp do LPS/D-GalN. [45] 1.2.5. Công dụng của Murdannia bracteata theo y học cổ truyền Theo y học cổ truyền, Murdannia bracteata có tác dụng hóa đàm tán kết, có thể dùng để trị ho, cảm lạnh [30]. Ở Trung Quốc, người ta dùng toàn cây làm thuốc chữa viêm hạch lympho, tiểu đục, tiểu buốt, ghẻ lở [2]. Ở Malaysia, dịch chiết toàn cây tươi và dược liệu khô được dùng để điều trị các bệnh về gan, ung thư và tiểu đường [39]. 1.2.6. Sản phẩm có thành phần Murdannia bracteata trên thị trường Ở Trung Quốc, M. bracteata được bào chế dưới dạng trà với công dụng tiêu đàm tán kết, giải nhiệt, giảm chứng tiểu buốt. Có thể dùng cho người bị viêm gan, ho, cảm sốt và ung thư. Trà Rumput Beijing Tea – Thành phần chính: Murdannia bracteata 16
  23. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu Cây Cỏ rươi lá bắc có hoa được thu hái tại huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định tháng 11 năm 2018. Mẫu thực vật đã được ThS. Nghiêm Đức Trọng, giảng viên Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội giám định tên khoa học là Murdannia bracteata (Tiêu bản số hiệu: 13/2019, số hiệu phòng tiêu bản: HNIP/18552/19, chi tiết ở Phụ lục 1). Mẫu lá được thu hái, phơi sấy, bảo quản trong túi nilon kín, làm nguyên liệu cho các phản ứng định tính thành phần hóa học và chiết xuất, phân lập hợp chất. 2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất - Các dung môi dùng để chiết xuất và phân lập: ethanol (EtOH), n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), chloroform (CHCl3), methanol (MeOH), nước cất đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết. - Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột: silica gel pha thường (Merck) cỡ hạt 0,063 – 0,200 mm và cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm, pha đảo RP-18 (Merck) cỡ hạt 0,03 – 0,05 mm. - Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm, pha thường silica gel 60 F254 (Merck), độ dày 0,2 mm; pha đảo silica gel 60 RP-18 F254s (Merck), độ dày 0,25 mm; hoạt hóa ở 1100C trong 1h. - Các hóa chất dùng để định tính: H2SO4 1N, NH3, NaOH 10%, Mg, HCl, FeCl3 5%, Na2CO3, thuốc thử Liebermann, Baljet, Legal, Mayer, Bouchardat, Dragendorff, Fehling A, B, 2.1.2.2. Trang thiết bị - Sắc ký cột: Sử dụng các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau tại Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. - Nhiệt độ nóng chảy: Đo trên máy SMP10 BioCote tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN. 17
  24. - Phổ khối ESI-MS: Đo trên máy Agilent 1100 LC/MSD tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR: Được ghi trên máy Bruker AVANCE 500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Dụng cụ thí nghiệm: cốc có mỏ, bình nón, bình chiết, pipet, ống đong, ống nghiệm, thuộc Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, ĐHQGHN. - Các thiết bị khác: cân phân tích, máy cô quay chân không, tủ sấy, tủ hút, đèn soi UV, tại Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Bộ môn Bào chế và Công nghệ Dược phẩm, Khoa Y Dược, ĐHQGHN. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá cây Cỏ rươi lá bắc Nguyên liệu nghiên cứu là lá cây Cỏ rươi lá bắc đã được phơi sấy khô và bảo quản. Các phương pháp định tính tham khảo trong các tài liệu [6], [4]. ➢ Định tính glycosid tim Lấy 3 g dược liệu, chiết soxhlet với n-hexan trong 1 giờ. Bã dược liệu sấy khô, cho vào bình cầu, đun hồi lưu với EtOH 40% trong 1 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm khoảng 3 mL chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc loại tủa, thử dịch lọc nếu vẫn còn tủa với chì acetat, cho thêm 1 mL chì acetat vào, khuấy và lọc lại. Tiếp tục thử đến khi dịch chiết không còn tủa với chì acetat. Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và lắc kỹ với hỗn hợp CHCl3 : EtOH tỷ lệ 4:1 (3 lần, mỗi lần 5 mL), gạn lấy lớp chloroform vào cốc có mỏ khô sạch, loại nước bằng natri sulfat khan. Chia dịch chiết vào các ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi trên nồi cách thuỷ cho đến khô. Cắn còn lại dùng để làm các phản ứng định tính: • Phản ứng Liebermann: Hòa tan cắn trong ống nghiệm 1 bằng 1 mL anhydrid acetic, lắc đều. Nghiêng ống 450, cho từ từ theo thành ống 18
  25. 1 mL H2SO4 đặc. Quan sát, nếu thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp xuất hiện vòng màu đỏ tím thì phản ứng dương tính. • Phản ứng Baljet: Hòa tan cắn trong ống nghiệm 2 bằng khoảng 1 mL EtOH 90%. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%), nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính. • Phản ứng Legal: Hòa tan cắn trong 0,5 mL EtOH 90%. Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprusiat 1% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều, nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính alcaloid Lấy 2 g dược liệu đã làm nhỏ, cho vào bình nón dung tích 50 mL. Thêm 15 mL dung dịch thấm ẩm H2SO4 1N. Đun đến sôi, để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 mL. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH 9 – 10. Chiết alcaloid base bằng chloroform (3 lần, mỗi lần 5 mL). Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng natri sulfat khan, sau đó đem lắc với H2SO4 1N (2 lần, mỗi lần 5 mL). Gộp các dịch chiết nước chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 mL để làm các phản ứng: • Phản ứng với thuốc thử Mayer: Thêm 2 – 3 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy xuất hiện tủa trắng thì phản ứng dương tính. • Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: Thêm 2 – 3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dương tính. • Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: Thêm 2 – 3 giọt thuốc thử Dragendorff, nếu thấy xuất hiện kết tủa cam thì phản ứng dương tính. Chuẩn bị: Lấy dược liệu đã làm nhỏ, cho nước ngập dược liệu (cách bề mặt dược liệu khoảng 2cm), đun sôi trong 30 phút. Sau 30 phút, lấy dịch chiết ra, lọc nóng thu được dịch lọc. Dịch lọc lại đem cô đến cắn (cắn toàn phần). 19
  26. ➢ Định tính saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt: Hòa tan một ít cắn vào khoảng 5 mL nước cất. Đun cách thủy 10 phút, lọc qua bông lấy dịch chiết vào ống nghiệm to. Thêm nước cất đến khoảng 10 mL, bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút. Để yên và quan sát cột bọt, thấy cột bọt bền sau 15 phút thì dương tính. ➢ Định tính flavonoid Hòa tan cắn vào EtOH 90%, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc để làm các phản ứng: • Phản ứng với hơi amoniac (NH3): Nhỏ vài giọt dịch lọc lên miếng giấy lọc, để khô rồi hơ lên miệng lọ amoniac đặc, quan sát nếu thấy vết chất chuyển sang màu vàng thì phản ứng dương tính. • Phản ứng với dung dịch kiềm loãng: Cho dịch lọc vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch NaOH 10%, nếu thấy dịch vẩn đục màu vàng thì phản ứng dương tính. • Phản ứng Cyanidin: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống khoảng 1 mL dịch lọc, 1 ống thêm ít bột Mg kim loại rồi nhỏ từ từ vài giọt HCl đậm đặc, ống còn lại để đối chiếu. Khi phản ứng xong quan sát nếu thấy ống phản ứng xuất hiện màu đỏ cam đậm hơn ống đối chiếu thì phản ứng dương tính. • Phản ứng với dung dịch sắt (III) chlorid: Cho khoảng 1mL dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Lắc đều, nếu thấy xuất hiện màu xanh đen thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính coumarin Chuẩn bị dịch lọc như phần định tính flavonoid để làm phản ứng mở đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 mL dịch lọc: + Ống 1: thêm 0,5 mL NaOH 10%. + Ống 2: để nguyên. 20
  27. Đun cả 2 ống trong 2 phút, để nguội, nếu thấy hiện tượng + Ống 1: có tủa đục màu vàng. + Ống 2: trong suốt. Thêm từ từ nước cất vào cả 2 ống đến 4 mL: + Ống 1: trong suốt. + Ống 2: có tủa đục. Thêm vài giọt HCl đặc vào ống 1, ống 1 trở lại đục như ống 2 thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính anthranoid Phản ứng Borntraeger: Hòa tan một ít cắn vào 10 mL H2SO4 1N. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc cho vào bình gạn. Chiết bằng 10 mL chloroform, gạn lấy lớp chloroform vào ống nghiệm, cô bớt dung môi còn khoảng 1 mL, thêm 1 mL NaOH 10% vào, lắc nhẹ, nếu xuất hiện màu đỏ sim thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính acid hữu cơ Hòa tan cắn trong nước nóng, để nguội rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp. Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2 mL dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3 nếu thấy có bọt khí bay lên thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính tanin Hòa tan cắn trong nước nóng. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 2 mL dịch lọc. + Ống 1: Thêm vài giọt sắt (III) chlorid 5% nếu thấy xuất hiện tủa màu xanh đen thì phản ứng dương tính. + Ống 2: Thêm vài giọt chì acetat 10% nếu thấy xuất hiện tủa bông thì phản ứng dương tính. + Ống 3: Thêm vài giọt gelatin 1% nếu thấy xuất hiện tủa bông trắng thì phản ứng dương tính. 21
  28. ➢ Định tính đường khử Hòa tan cắn vào 1 mL nước nóng, đem lọc thu được dịch lọc. Thêm vào đó 1 mL dung dịch thuốc thử Fehling A và 1 mL dung dịch thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy sôi vài phút nếu thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính acid amin Hòa tan cắn vào 2 mL nước nóng. Lọc nóng, lấy dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 5 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thủy 2 phút, nếu thấy xuất hiện màu tím thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính chất béo Hòa tan cắn vào 2 mL nước nóng, lọc nóng. Nhỏ 1 giọt dịch chiết trên lên miếng giấy lọc, hơ nóng cho bay hết hơi dung môi, nếu để lại vết mờ trên giấy lọc thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính caroten Cho vào ống nghiệm nhỏ một ít cắn khô, nhỏ vài giọt H2SO4 đặc vào cắn nếu thấy xuất hiện màu xanh lá thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính sterol Cho vào ống nghiệm một ít cắn khô, hòa tan trong 2 mL chloroform và 0 1 mL anhydrid acetic. Để ống nghiệm nghiêng 45 , thêm từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm, nếu thấy mặt phân cách có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá thì phản ứng dương tính. 2.2.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có trong lá cây Cỏ rươi lá bắc 2.2.2.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất Lá cây Cỏ rươi lá bắc được thu hái, rửa sạch, phơi khô, ngâm chiết 3 lần bằng dung môi EtOH 80%, sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40oC trong vòng 30 phút. Lọc các dịch chiết EtOH qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu cao chiết tổng ethanol. 22
  29. Phân tán cao chiết này trong nước cất và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc (mỗi dung môi 3 lần). Các dịch chiết n-hexan, EtOAc được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng. 2.2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất Sử dụng các phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng (dùng để khảo sát) và sắc ký cột để phân lập các hợp chất. - Sắc ký lớp mỏng: được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254, độ dày 0,2 mm và RP-18 F254s (Merck), độ dày 0,25 mm; hoạt hóa ở 1100C trong 1h. Sau khi triển khai sắc ký, phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ đến khi hiện màu. - Sắc ký cột: được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường cỡ hạt 0,063 – 0,200 mm và 0,040 – 0,063 mm (Merck) và pha đảo RP-18 cỡ hạt 0,03 – 0,05 mm (Merck). 2.2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và so sánh các số liệu thu được từ thực nghiệm với các số liệu đã công bố [7], [32]. 23
  30. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất bằng phương pháp hóa học Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá cây Cỏ rươi lá bắc bằng phản ứng đặc trưng được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phương pháp hóa học STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Nhận xét 1 Saponin Hiện tượng tạo bọt ++ Có Thuốc thử Mayer ++ 2 Alcaloid Thuốc thử Dragendorff + Có Thuốc thử Bouchardat + 3 Anthranoid Phản ứng Borntrager - Không có Phản ứng Liebermann - 4 Glycosid tim Phản ứng Baljet - Không có Phản ứng Legal - Phản ứng với Cyanidin + Phản ứng với NH3 ++ 5 Flavonoid Có Phản ứng với NaOH 10% +++ Phản ứng với FeCl3 +++ 6 Coumarin Phản ứng đóng mở vòng lacton - Không có Phản ứng với FeCl3 5% +++ 7 Tanin Phản ứng với gelatin 1% +++ Có Phản ứng với chì acetat 10% +++ 8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 ++ Có Phản ứng với thuốc thử 9 Acid amin - Không có Ninhydrin 24
  31. STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Nhận xét 10 Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling ++ Có 11 Chất béo Phát hiện vết trên giấy lọc - Không có Phản ứng với H2SO4/anhydrid 12 Sterol ++ Có acetic 13 Caroten Phản ứng với H2SO4 + Có Ghi chú: (-) âm tính, (+) dương tính, (+++) dương tính rõ Nhận xét: Bằng các phản ứng hóa học sơ bộ nhận thấy dược liệu Cỏ rươi lá bắc thu hái ở tỉnh Nam Định có các nhóm hợp chất: flavonoid, saponin, tanin, acid hữu cơ, alcaloid, đường khử, sterol và caroten. 3.2. Kết quả chiết xuất, phân lập một số hợp chất trong lá cây Cỏ rươi lá bắc 3.2.1. Chiết các phân đoạn từ lá cây Cỏ rươi lá bắc Mẫu lá cây Cỏ rươi lá bắc (2,0 kg) được ngâm chiết bằng dung môi EtOH 80% (3 lần, mỗi lần 10 L), sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40oC trong vòng 30 phút. Lọc các dịch chiết EtOH thu được qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 180 g cao chiết tổng ethanol. Lấy 120 g cao chiết phân tán trong nước cất (800 mL) và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 800 mL). Các dịch chiết n-hexan, EtOAc được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng n-hexan (34,6 g) và ethyl acetat (56,8 g). Sơ đồ chiết xuất lá cây Cỏ rươi lá bắc được trình bày theo Hình 3.1. 25
  32. Dược liệu 2,0 kg Chiết bằng ethanol 80% Dịch chiết ethanol C ất loại dung môi Cao tổng ethanol 180g Phân tán 120g cao vào nước Dịch nư ớc Chi ết phân đoạn bằng n-hexan Cất loại dung môi Phân đoạn n-hexan Phân đoạn nước 34,6g Chiết bằng ethyl acetat Cất loại dung môi Phân đoạn ethyl acetat Phân đoạn nước 56,8g Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Cỏ rươi lá bắc 3.2.2. Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột Tiến hành phân tách phân đoạn dịch chiết EtOAc (40,0 g) trên cột sắc ký silicagel (Φ85 mm × 90 mm) với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần bao gồm n-hexan : EtOAc (5:1 → 1:1, v/v, mỗi phân đoạn 600 mL) và tiếp sau là CHCl3 : MeOH (10:1 → 1:1, v/v, mỗi phân đoạn 500 mL) thu được 5 phân đoạn ký hiệu là B1 ~ B5. Từ phân đoạn B2 (8,6 g), chạy sắc ký cột silicagel (Φ45 mm × 350 mm) với hệ pha động CHCl3 : MeOH (4:1, v/v, 2,5 L) thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn là B2.1 ~ B2.3. Tinh chế phân đoạn nhỏ B2.1 (2,1g) bằng sắc ký cột 26
  33. pha đảo YMC C-18 sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOH : H2O (3:1, v/v, 1,5 L) thu được 1 hợp chất ký hiệu là CT1 (34 mg). Tinh chế phân đoạn nhỏ B2.2 (2,3g) bằng sắc ký cột với hệ dung môi CHCl3 : MeOH (5:1) thu được 1 hợp chất ký hiệu là CT2 (45 mg). Sơ đồ phân lập 2 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat được trình bày như Hình 3.2. Cắn ethyl acetat 40,0 g Hệ dung môi n-hexan : EtOAc (5:1 → 1:1) CHCl3 : MeOH (10:1 → 1:1) B1 B2 B3 B4 B5 8,6 g Pha thuận CHCl3 : MeOH (4:1) B2 B2.2 B2.3 8,6 g 2,3 g Pha đảo Pha thuận MeOH : H2O (3:1) CHCl3 : MeOH (5:1) CT1 CT2 34 mg 45 mg Hình 3.2. Sơ đồ phân lập 2 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat 3.2.3. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được 3.2.3.1. Hợp chất CT1: Apigenin 0 0 Chất bột màu vàng nhạt, tnc = 347,5 C. + Phổ ESI-MS: m/z 270,9 [M+H] → CTPT: C15H10O5 (M = 270). 27
  34. Bảng 3.2. Số liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của CT1 và chất tham khảo [7] đo trong DMSO CT1 Aa,b CT1 Aa,c δC δC δH (ppm) δH (ppm) Vị trí C DEPT ppm ppm (Mult, J=Hz) (Mult, J=Hz) 2 C 161,0 163,7 3 CH 102,8 102,8 6,76 (s) 6,78 (s) 4 C 180,9 181,7 5 C-OH 163,6 161,4 6 CH 98,8 98,8 6,19 (d; J = 2,0) 6,19 (d; J = 2,0) 7 C 164,0 164,2 8 CH 94,0 93,9 6,47 (d; J = 2,0) 6,48 (d; J = 2,0) 9 C 157,3 157,3 10 C 103,6 103,6 1’ C 120,9 121,1 2’ CH 127,9 128,4 7,92 (d; J = 9,0) 7,93 (d; J = 8,8) 3’ CH 115,9 115,9 6,82 (d; J = 9,0) 6,93 (d; J = 8,8) 4’ C 161,3 161,2 5’ CH 115,9 115,9 6,82 (d; J = 9,0) 6,93 (d; J = 8,8) 6’ CH 127,9 128,4 7,91 (d; J = 9,0) 7,93 (d; J = 8,8) a )đo trong DMSO, b) 125 MHz, c )500 MHz, A) của chất tham khảo apigenin Phổ ESI-MS của hợp chất CT1 cho pic ion phân tử ở m/z 270,9 [M+H]+ tương ứng với khối lượng phân tử M = 270, phù hợp với công thức phân tử C15H10O5. Ở phổ 1H-NMR của CT1, tín hiệu proton vòng thơm của 2 doublet ghép đôi ở δH 6,19 và 6,47 (J = 2,0 Hz) cho thấy tương quan HSQC với cộng hưởng cacbon tương ứng ở δC 98,8 (d) và 94,0 (d), được gán cho H-6 và H-8 của vòng A. Hai doublet ghép trực tiếp ở δH 7,92 và 6,82 (2H, J = 2,0 Hz) cho 13 thấy các liên kết xa với tín hiệu C-NMR ở δC 161,3 (C-4’). Do đó, được gán tương ứng H-2’/6’ và H-3’/5’ của vòng B. Ngoài ra, 1 singlet ở δH 6,76 được gán cho H-3. Việc gán H-3 được xác nhận bởi các mối tương quan xa với C-2 28
  35. 13 (δC 161,0) và C-1’ (δC 120,9). C-NMR ở δC 164,0 cho thấy mối tương quan của HMBC với H-6 và H-8, được gán cho C-7. Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy tín hiệu của 8 cacbon bậc 4 và 7 nhóm CH. Dựa vào số liệu đã phân tích ở trên và so sánh với phổ 1H-NMR, 13C-NMR trong tài liệu tham khảo [7], cấu trúc của hợp chất CT1 được xác định là apigenin. Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất CT1 3.2.3.2. Hợp chất CT2: Quercetin 0 Tinh thể hình kim, màu vàng, tnc = 313 – 314°C. + Phổ ESI-MS: m/z 302,8 [M+H] → CTPT: C15H10O7 (M = 302). Bảng 3.3. Số liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của CT2 và chất tham khảo [32] đo trong DMSO CT2 Qa,b CT2 Qa,c δC δC δH (ppm) δH (ppm) Vị trí C DEPT ppm ppm (Mult, J=Hz) (Mult, J=Hz) 2 C 146,7 147,9 3 C 135,6 135,9 4 C 175,7 176,0 5 C 160,6 160,9 6 CH 98,1 98,4 6,18 (d; J = 2,5) 6,17 (d; J = 2,0) 7 C 163,8 164,1 8 CH 93,3 93,5 6,40 (d; J = 2,5) 6,39 (d; J = 2,0) 9 C 156,1 156,3 10 C 102,9 103,2 1’ C 121,9 122,1 29
  36. 2’ CH 115,0 115,2 7,67 (d; J = 3,0) 7,66 (d; J = 2,0) 3’ C 145,0 145,2 4’ C 147,6 147,0 5’ CH 115,5 115,8 6,88 (d; J = 9,5) 6,87 (d; J = 8,5) 6’ CH 119,9 120,2 7,53 (dd; J = 8,5; 3,0) 7,53 (dd; J = 8,0; 2,0) a) đo trong DMSO, b) 125 MHz, c) 500 MHz, Q) của chất tham khảo quercetin Phổ ESI-MS của hợp chất CT2 cho pic ion phân tử ở m/z 302,8 [M+H]+ tương ứng với khối lượng phân tử M = 302, phù hợp với công thức phân tử C15H10O7. 1 Phổ H-NMR cho thấy 2 tín hiệu doublet của 2 proton thơm ở δH 6,18 (1H, d, J = 2,5 Hz; H-6) và 6,40 (1H, d, J = 2,5 Hz; H-8). Ngoài ra còn có 3 tín hiệu proton thơm ở 7,67 (1H, d, J = 3,0 Hz; H-2’); 6,88 (1H, d, J = 9,5 Hz; H-5’); 7,53 (1H, dd, J = 8,5; 3,0 Hz; H-6’) cho thấy tín hiệu kiểu ABX. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất CT2 cho thấy tín hiệu của 15 C của khung flavonoid ở giữa vùng δC 93,3 – 175,7 ppm, với 5 CH nhân thơm ở δC 98,1 (C-6); 93,3 (C-8); 115,0 (C-2’); 115,5 (C-5’) và 119,9 (C-6’); 10 C trong đó tín hiệu δC 175,7 ppm đặc trưng cho nhóm cacbonyl, 4 cacbon có độ chuyển dịch δC 145,0; 147,6; 160,6; 163,8 ppm đặc trưng cho dạng liên kết của nhân thơm với nhóm OH của các cacbon C-3’, C-4’, C-5, C-7. Ngoài ra, tín hiệu của cacbon ở δC 135,6 (C-3) đặc trưng cho cacbon của nối đôi liên kết với một nhóm hydroxyl. Dựa vào những phân tích ở trên kết hợp so sánh số liệu phổ của hợp chất CT2 với tài liệu [32] khẳng định hợp chất CT2 là quercetin. Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất CT2 30
  37. 3.3. Bàn luận 3.3.1. Về định tính các nhóm chất Thành phần hóa học của chi Murdannia khá phức tạp, gồm nhiều nhóm chất khác nhau. Giữa các loài khác nhau lại có những chất giống nhau. Trong cùng một loài nhưng tại các nước, các vùng khác nhau lại phát hiện có những hợp chất khác nhau. Do vậy, những nghiên cứu về thành phần hóa học rất quan trọng trong việc định hướng ứng dụng các loài thuộc chi Murdannia để phòng và chữa bệnh sao cho an toàn, hiệu quả. Những năm gần đây, các nhà khoa học vẫn tiếp tục nghiên cứu hóa thực vật đối với chi này và cũng đã tìm thêm được nhiều hợp chất mới. Cho đến nay, trên thế giới đã có một số công bố về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Murdannia. Nghiên cứu của Jiratchariyakul và cộng sự vào các năm 1996, 1998 và 2006 cho thấy sự có mặt của phytosteryl glucosid, glycosphingolipid, amino acid, flavonoid, lipid màng tế bào, acid syringic, và isovitexin trong thành phần loài Murdannia loriformis [28]. Năm 2014, bằng các phản ứng định tính, Patwari và cộng sự đã sàng lọc được trong dịch chiết ethanol của loài Murdannia nudiflora có các nhóm hợp chất tanin, phytosterol, alcaloid, flavonoid [42]. Năm 2016, Nandikar và cộng sự xác định cấu trúc một số hợp chất trong dịch chiết methanol của Murdannia lanuginosa và Murdannia simplex bằng phương pháp GC-MS. Trong đó, 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-on, hợp chất có mặt trong thành phần của cả 2 loài, là 1 flavonoid đã được nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn, chống viêm. [36] Để khảo sát thành phần hóa học của Murdannia bracteata, đề tài đã sử dụng phương pháp định tính bằng các phản ứng hóa học đặc trưng, là phương pháp hiện đang được áp dụng chủ yếu ở Việt Nam bởi tính thuận tiện, kinh tế và hiệu quả cao. Kết quả định tính được một số nhóm chất có trong lá cây Cỏ rươi lá bắc thu hái ở Nam Định là flavonoid, saponin, tanin, acid hữu cơ, đường khử, sterol và caroten, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về thành phần hóa học của chi và loài [28, 36, 39, 42, 46]. Điều này cho thấy các loài thuộc chi Murdannia có chứa các nhóm chất khá giống nhau. Vì vậy, khi nghiên cứu thành phần hóa học của một loài nào đó thuộc chi Murdannia có thể định hướng nghiên cứu dựa trên kết quả nghiên cứu của loài đã có công 31
  38. bố. Riêng nhóm flavonoid những năm gần đây được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm do có các tác dụng quan trọng như chống oxy hóa, chống viêm, bảo vệ gan, vì thế cần có nghiên cứu sâu về cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học của nhóm chất này, tạo tiền đề cho những nghiên cứu phát triển sản phẩm về sau. 3.3.2. Về chiết xuất và phân lập Phương pháp chiết bằng dung môi EtOH 80%, sử dụng thiết bị chiết siêu âm là một phương pháp tiết kiệm thời gian, cho hiệu suất chiết cao. Để phân lập các hợp chất từ lá cây Cỏ rươi lá bắc, sử dụng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel pha thường và pha đảo, cùng các hệ dung môi khác nhau. Kết quả phân lập được 2 hợp chất thuộc nhóm flavonoid là apigenin và quercetin. Đây là 2 flavonoid rất phổ biến ở thực vật và đều đã được nghiên cứu rộng rãi. Dựa vào cấu trúc hóa học, apigenin được phân loại thuộc nhóm flavon trong khi quercetin thuộc nhóm flavonol. ➢ Hợp chất 1: Apigenin (5,7,4’-trihydroxyflavon) Apigenin có trong thành phần của rất nhiều loài cây, điển hình là các loài họ Cúc (Asteraceae), thuộc chi Artemisia, Achillea, Matricaria và Tanacetum [43]. Apigenin phân lập từ các loài khác nhau được thử nghiệm cho các tác dụng sinh học các nhau. Năm 1999, Yoichi Sato và cộng sự phân lập được hợp chất này từ Scutellaria barbata D. Don (Lamiaceae) và ghi nhận tác dụng ức chế chọn lọc Staphylococcus aureus, bao gồm cả các chủng S. aureus kháng methicillin, với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 3,9 – 15,6 g/mL [44]. Năm 2013, trong nghiên cứu của Nayaka và cộng sự, apigenin phân lập từ Portulaca oleracea L. cho hoạt tính kháng khuẩn trên 5 chủng vi khuẩn gây bệnh Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae và Enterobacter aerogenes với MIC đối với cả 5 chủng > 4 mg/mL [37]. Năm 2004, apigenin được Chiang Lien Chai và cộng sự phân lập từ Ocimum basilicum cho thấy hoạt tính kháng virus trên đa dạng chủng: Herpes simplex HSV-2 (EC50 = 9,7 mg/L; chỉ số chọn lọc SI = 6,2), adenovirus ADV- 3 (EC50 = 11,1 mg/L; SI = 5,4), kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B 32
  39. HBsAg (EC50 = 7,1 mg/L; SI = 2,3) và kháng nguyên nội sinh virus viêm gan B HBeAg (EC50 = 12,8 mg/L; SI = 1,3) [14]. Ở một nghiên cứu khác do Ping Ji và cộng sự thực hiện năm 2014, apigenin phân lập từ Paulownia tomentosa cho tác dụng ức chế Enterovirus 71 gây bệnh chân – tay – miệng với EC50 = 11,0 M; SI 9,3. Cơ chế phân tử được giải thích là do hợp chất này có khả năng phá vỡ liên kết giữa các protein của vật chủ với RNA của virus [25]. Năm 2008, Ye Yin cùng các cộng sự báo cáo hoạt tính ức chế miễn dịch của apigenin phân lập từ Artemisia vestita thông qua ức chế tăng sinh và hoạt hóa lympho T, từ đó cho tác dụng chống viêm [50]. Cơ chế chống viêm được giải thích rõ hơn trong nghiên cứu của Kumar và cộng sự năm 2018, apigenin phân lập từ Justicia gendarussa làm giảm nồng độ TLR4, MyD88, TRIF, TRAF6, NF-B, COX-2, PGE2, IL-1 và TNF-α tham gia vào quá trình gây viêm và tăng nồng độ cytokin chống viêm, IL-10 [27]. Apigenin phân lập từ các loài khác nhau cũng cho tác dụng chống ung thư trên đa dạng các dòng tế bào. Chẳng hạn, apigenin phân lập từ Lycopodium clavatum hoạt hóa quá trình apoptosis trên các tế bào ung thư da A375 và ung thư biểu mô phổi A549 ở người, chủ yếu qua cơ chế kích thích tạo gốc tự do, làm rối loạn chức năng ty thể và hoạt hóa caspase [16]; apigenin phân lập từ Macaranga gigantifolia gây độc tế bào leukemia P-388 của chuột với IC50 14,13 g/mL [20]; apigenin phân lập từ Eriocephalus africanus ức chế sự sinh trưởng của các tế bào ung thư gan HepG2 với EC50 = 11,93 g/mL [33]. Trong nghiên cứu của Osigwe và cộng sự năm 2017, apigenin phân lập từ Newbouldia laevis còn có tác dụng hạ đường huyết, tăng dự trữ glycogen ở gan và cơ, cho tiềm năng điều trị tiểu đường [40]. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đó về hoạt tính in vitro, in vivo liên quan đến chống tiểu đường của apigenin. Ngoài ra, apigenin trong các loài thực vật còn cho tác dụng chống oxy hóa, chống co thắt, giải tỏa lo âu, an thần, , là một hợp chất có tiềm năng cao trong phòng và điều trị bệnh. 33
  40. ➢ Hợp chất 2: Quercetin (3,5,7,3’,4’-pentahydroxyflavon) Tương tự apigenin, quercetin cũng được phân lập từ rất nhiều loài cây khác nhau và thể hiện đa dạng các tác dụng sinh học. Năm 2007, Fang Xian Kang và cộng sự phân lập hợp chất này từ loài Euonymus alatus. Qua thử nghiệm, quercetin có tác dụng làm tăng hấp thu glucose ở các tế bào mô mỡ 3T3-L1, ngoài ra còn là chất chủ vận một phần receptor PPAR, làm tăng độ nhạy của insulin [21]. Năm 2011, quercetin được Barman Nickavar và cộng sự phân lập từ Vaccinium arctostaphylos cho hoạt tính ức chế α-amylase tuyến tụy với IC50 = 0,16 – 0,17 mM [38]. Kết quả 2 nghiên cứu trên cho thấy quercetin có khả năng ứng dụng trong điều trị tiểu đường thông qua nhiều cơ chế. Theo nghiên cứu của Choi So Jin và cộng sự năm 2012, quercetin phân lập từ Cratoxylum formosum có khả năng ức chế sản sinh NO trong các tế bào RAW 264.7 được kích thích bởi LPS, thông qua điều hòa biểu hiện iNOS [15]. Đó là cơ chế cho tác dụng chống viêm, tương tự cơ chế chống viêm của dịch chiết Murdannia bracteata đã được báo cáo trong nghiên cứu của Wang Guei Jane và cộng sự năm 2006 [46]. Năm 2007, trong nghiên cứu của Mingyu Li và Zhuting Xu, quercetin phân lập từ lá sen Nelumbo nucifera được xác định là thành phần có hoạt tính kháng khuẩn mạnh trên một số chủng vi khuẩn gây viêm miệng như Actinobacillus actinomycetemcomitans, Actinomyces viscosus, Porphyromonas gingivalis, [31] Năm 2017, R. Jarial và cộng sự phân lập được quercetin từ loài dương xỉ Cheilanthes tenuifolia. Hợp chất này cho hoạt tính kháng khuẩn trên Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterobacter sp, Salmonella paratyphi, Streptococcus mutans, tác dụng mạnh nhất trên S. aureus và Enterobacter sp với MIC 2,25 g/mL; ngoài ra còn gây độc tế bào ung thư gan HepG2 và HeLa của người với tỷ lệ 78,16 0,04% và 80,91 1,93% tương ứng. [24] Bên cạnh những tác dụng kể trên, quercetin cũng có nhiều hoạt tính khác như chống oxy hóa, bảo vệ tim mạch, chống tăng huyết áp, kháng virus, điều hòa miễn dịch, [17] 34
  41. Các nghiên cứu cho thấy apigenin và quercetin đều có tiềm năng lớn ứng dụng trong điều trị. Tuy nhiên, hiện chưa có nghiên cứu phân lập và thử nghiệm tác dụng của 2 hợp chất này từ các loài thuộc chi Murdannia. Đây là lần đầu tiên apigenin và quercetin được phân lập từ Murdannia bracteata. Các tác dụng điển hình như kháng khuẩn, chống viêm, ức chế tăng sinh các tế bào ung thư, hoạt tính liên quan đến chống tiểu đường, của 2 thành phần trên phù hợp với công dụng điều trị các chứng viêm, các bệnh về gan, ung thư và tiểu đường trong y học cổ truyền của M. bracteata. Tuy nhiên, trong tương lai cần thêm các nghiên cứu xác minh tác dụng sinh học của apigenin và quercetin có trong loài này, nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho phát triển thuốc từ M. bracteata. 35
  42. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khóa luận đã thu được một số kết quả như sau: - Đã định tính được các nhóm chất có trong lá cây Cỏ rươi lá bắc (Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong) bao gồm flavonoid, saponin, tanin, acid hữu cơ, alcaloid, đường khử, sterol và caroten. - Đã sử dụng phương pháp chiết siêu âm với dung môi EtOH 80% và sắc ký cột để chiết xuất, phân lập được 02 hợp chất từ lá cây Cỏ rươi lá bắc. - Đã xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được: Dựa vào kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân, xác định được cấu trúc 2 hợp chất vừa phân lập được là apigenin (5,7,4’- trihydroxyflavon) và quercetin (3,5,7,3’,4’-pentahydroxyflavon). Kiến nghị: - Tiếp tục nghiên cứu, phân lập các hợp chất khác từ các bộ phận của cây Cỏ rươi lá bắc. - Nghiên cứu đánh giá thêm về tác dụng sinh học của các phân đoạn dịch chiết, đặc biệt là hoạt tính kháng khuẩn, chống viêm, ức chế tế bào ung thư và chống tiểu đường. 36
  43. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương và các cộng sự (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 1, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật. 2. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Tập 2, NXB Y học. 3. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Tập 3, NXB Trẻ, tr. 376 - 380. 4. Phạm Thanh Kỳ (2015), Dược liệu học (Sách đào tạo Dược sĩ Đại học), Tập 2, NXB Y Học. 5. Vũ Đức Lợi, Nguyễn Tiến Vững, Lê Thị Thu Hường (2016), Tài nguyên cây thuốc (Sách dành cho đào tạo Dược sĩ Đại học), NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. 6. Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu học (Sách đào tạo Dược sĩ Đại học), Tập 1, NXB Y học. Tài liệu tiếng Anh 7. Alwahsh MAA, Khairuddean M, Chong WK (2015), "Chemical constituents and antioxidant activity of Teucrium barbeyanum Aschers", Record of Natural Product, 9(1), tr. 159-63. 8. Atkinson J, Epand RF, Epand RM (2008), "Tocopherols and tocotrienols in membranes: a critical review", Free radical biology and medicine, 44(5), tr. 739-764. 9. Bermudez Y, Ahmadi S, Lowell NE và các cộng sự (2007), "Vitamin E suppresses telomerase activity in ovarian cancer cells", Cancer Detection and Prevention, 31(2), tr. 119-128. 10. Betti M, Minelli A, Canonico B và các cộng sự (2006), "Antiproliferative effects of tocopherols (vitamin E) on murine glioma C6 cells: homologue-specific control of PKC/ERK and cyclin signaling", Free Radical Biology and Medicine, 41(3), tr. 464-472.
  44. 11. Birringer M, Lington D, Vertuani S và các cộng sự (2010), "Proapoptotic effects of long-chain vitamin E metabolites in HepG2 cells are mediated by oxidative stress", Free Radical Biology and Medicine, 49(8), tr. 1315-1322. 12. Byng JW, Smets EF, van Vugt R và các cộng sự (2018), "The phylogeny of angiosperms poster: a visual summary of APG IV family relationships and floral diversity", The Global Flora, 1. 13. Ch’ng YS, Tan CS, Loh YC và các cộng sự (2016), "Vasorelaxation study and tri-step infrared spectroscopy analysis of Malaysian local herbs", Journal of pharmacopuncture, 19(2), tr. 145. 14. Chiang LC, Ng LT, Cheng PW và các cộng sự (2005), "Antiviral activities of extracts and selected pure constituents of Ocimum basilicum", Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 32(10), tr. 811-816. 15. Choi SJ, Tai BH, Cuong NM và các cộng sự (2012), "Antioxidative and anti-inflammatory effect of quercetin and its glycosides isolated from mampat (Cratoxylum formosum)", Food Science and Biotechnology, 21(2), tr. 587-595. 16. Das S, Das J, Samadder A và các cộng sự (2012), "Apigenin-induced apoptosis in A375 and A549 cells through selective action and dysfunction of mitochondria", Experimental Biology and Medicine, 237(12), tr. 1433-1448. 17. David AVA, Arulmoli R, Parasuraman S (2016), "Overviews of biological importance of quercetin: A bioactive flavonoid", Pharmacognosy reviews, 10(20), tr. 84. 18. de Oliveira Pellegrini MO, Faden RB, de Almeida RF (2016), "Taxonomic revision of Neotropical Murdannia Royle (Commelinaceae)", PhytoKeys(74), tr. 35.
  45. 19. Faden RB, Inman KE (1996), "Leaf anatomy of the African genera of Commelinaceae: Anthericopsis and Murdannia", The biodiversity of African plants, Springer, tr. 464-471. 20. Fajriah S, Megawati M, Darmawan A (2016), "Apigenin, an Anticancer Active Compound Isolated from Macaranga gigantifolia Leaves", Journal of Tropical Life Science, 6(1), tr. 7-9. 21. Fang XK, Gao J, Zhu DN (2008), "Kaempferol and quercetin isolated from Euonymus alatus improve glucose uptake of 3T3-L1 cells without adipogenesis activity", Life sciences, 82(11-12), tr. 615-622. 22. Govaerts R (2004), "World Checklist of Monocotyledons Database in ACCESS: 1–54382", The Board of Trustees of the Royal Botanic Gardens, Kew. 23. Hao J, Zhang B, Liu B và các cộng sự (2009), "Effect of α‐tocopherol, N‐acetylcysteine and omeprazole on esophageal adenocarcinoma formation in a rat surgical model", International journal of cancer, 124(6), tr. 1270-1275. 24. Jarial R, Shard A, Thakur S và các cộng sự (2018), "Characterization of flavonoids from fern Cheilanthes tenuifolia and evaluation of antioxidant, antimicrobial and anticancer activities", Journal of King Saud University-Science, 30(4), tr. 425-432. 25. Ji P, Chen C, Hu Y và các cộng sự (2015), "Antiviral activity of Paulownia tomentosa against enterovirus 71 of hand, foot, and mouth disease", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 38(1), tr. 1-6. 26. Khan TH, Sultana S (2006), "Apigenin induces apoptosis in Hep G2 cells: possible role of TNF-α and IFN-γ", Toxicology, 217(2-3), tr. 206- 212. 27. Kumar KS, Sabu V, Sindhu G và các cộng sự (2018), "Isolation, identification and characterization of apigenin from Justicia gendarussa and its anti-inflammatory activity", International immunopharmacology, 59, tr. 157-167.
  46. 28. Kunnaja P, Chiranthanut N, Kunanusorn P và các cộng sự (2015), "Evaluation of gastroprotective potential of the ethanol extract from Murdannia loriformis in rats", International Journal of Applied Research in Natural Products, 8, tr. 34-41. 29. Kwon YI, Apostolidis E, Shetty K (2008), "Inhibitory potential of wine and tea against α‐Amylase and α‐Glucosidase for management of hyperglycemia linked to type 2 diabetes", Journal of Food Biochemistry, 32(1), tr. 15-31. 30. Li DL, Zheng XL, Duan L và các cộng sự (2017), "Ethnobotanical survey of herbal tea plants from the traditional markets in Chaoshan, China", Journal of ethnopharmacology, 205, tr. 195-206. 31. Li M, Xu Z (2008), "Quercetin in a lotus leaves extract may be responsible for antibacterial activity", Archives of pharmacal research, 31(5), tr. 640-644. 32. Liu H, Mou Y, Zhao J và các cộng sự (2010), "Flavonoids from Halostachys caspica and their antimicrobial and antioxidant activities", Molecules, 15(11), tr. 7933-7945. 33. Magura J, Moodley R, Maduray K và các cộng sự (2020), "Phytochemical constituents and in vitro anticancer screening of isolated compounds from Eriocephalus africanus", Natural Product Research, tr. 1-4. 34. Miyoshi N, Naniwa K, Kumagai T và các cộng sự (2005), "α- Tocopherol-mediated caspase-3 up-regulation enhances susceptibility to apoptotic stimuli", Biochemical and biophysical research communications, 334(2), tr. 466-473. 35. Naik MC, Rao BRP (2017), "A new species of dewflower Murdannia sanjappae (Commelinaceae) from Andaman Islands, India", Journal of Threatened Taxa, 9(11), tr. 10909-10913. 36. Nandikar MD, Kumbhalkar BB, Gurav RV (2018), "GC-MS analysis of phytochemical compounds in the crude methanolic extract of roots
  47. of Murdannia lanuginosa and M. simplex (Commelinaceae)", Indian Journal of Natural Products and Resources (IJNPR)[Formerly Natural Product Radiance (NPR)], 9(3), tr. 229-234. 37. Nayaka HB, Londonkar RL, Umesh MK và các cộng sự (2014), "Antibacterial attributes of apigenin, isolated from Portulaca oleracea L", International journal of bacteriology, 2014. 38. Nickavar B, Amin G (2011), "Enzyme assay guided isolation of an α- amylase inhibitor flavonoid from Vaccinium arctostaphylos leaves", Iranian journal of pharmaceutical research: IJPR, 10(4), tr. 849. 39. Ooi KL, Loh SI, Tan ML và các cộng sự (2015), "Growth inhibition of human liver carcinoma HepG2 cells and α-glucosidase inhibitory activity of Murdannia bracteata (CB Clarke) Kuntze ex JK Morton extracts", Journal of ethnopharmacology, 162, tr. 55-60. 40. Osigwe CC, Akah PA, Nworu CS và các cộng sự (2017), "Apigenin: A methanol fraction component of Newbouldia laevis leaf, as a potential antidiabetic agent", The Journal of Phytopharmacology, 6, tr. 38-44. 41. Panigo E, Ramos J, Lucero L và các cộng sự (2011), "The inflorescence in Commelinaceae", Flora-Morphology, Distribution, Functional Ecology of Plants, 206(4), tr. 294-299. 42. Patwari BN, Ahmed AB, Das T và các cộng sự (2014), "Phytochemical screening and analgesic effects of ethanolic extract of plant Murdania nudiflora (L) Brenan (Commelinaceae) in albino mice using hot plate method", International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 6, tr. 512-515. 43. Salehi B, Venditti A, Sharifi-Rad M và các cộng sự (2019), "The therapeutic potential of apigenin", International journal of molecular sciences, 20(6), tr. 1305. 44. Sato Y, Suzaki S, Nishikawa T và các cộng sự (2000), "Phytochemical flavones isolated from Scutellaria barbata and antibacterial activity
  48. against methicillin-resistant Staphylococcus aureus", Journal of ethnopharmacology, 72(3), tr. 483-488. 45. Shyur LF, Feng JH, Apaya MK (2019), Galactolipids-enriched plant extracts and the uses thereof, U.S. Patent Application Publication. 46. Wang GJ, Chen SM, Chen WC và các cộng sự (2007), "Selective inducible nitric oxide synthase suppression by new bracteanolides from Murdannia bracteata", Journal of ethnopharmacology, 112(2), tr. 221- 227. 47. Wang YC, Huang TL (2005), "Screening of anti-Helicobacter pylori herbs deriving from Taiwanese folk medicinal plants", FEMS Immunology & Medical Microbiology, 43(2), tr. 295-300. 48. Wu Z, Al-Shehbaz IA (2000), Flora of China. 24. Flagellariaceae through Marantaceae, Science Press, tr. 25-31. 49. Yam MF, Ang LF, Lim CP và các cộng sự (2010), "Antioxidant and hepatoprotective effects of Murdannia bracteata methanol extract", Journal of acupuncture and meridian studies, 3(3), tr. 197-202. 50. Yin Y, Gong FY, Wu XX và các cộng sự (2008), "Anti-inflammatory and immunosuppressive effect of flavones isolated from Artemisia vestita", Journal of ethnopharmacology, 120(1), tr. 1-6.
  49. PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Phiếu giám định tên khoa học mẫu thực vật PHỤ LỤC 2: Phổ ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC của hợp chất CT1 PHỤ LỤC 3: Phổ ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC của hợp chất CT2
  50. Display Report - Selected Window Selected Analysis Analysis Name: CT1.d Instrument: LC-MSD-Trap-SL Print Date: 8/4/2020 1:51:50 PM Method: Cot150x3mm.m Operator: 2195410AE0000515 Acq. Date: 8/4/2020 1:51:10 PM Sample Name: CT1 Analysis Info: Column Eclipse XDB-C18, 4.6 x150mm MSD Trap Report v 4 (A4-Opt2) Page 1 of 1
  51. CT1-DMSO-1H 6 04 9 4 1 8 5 2 876 7 29 3 29 2 16 8 8 298 Current Data Parameters 12. 10. 10. 7.92 7.925 7.915 7.911 6. 6. 6.8 6.8 6.768 6.481 6.477 6.193 6.189 3. 2.50 2.50 2.501 2.496 2.49 NAME MAI_CT1 EXPNO 10 PROCNO 1 F2 - Acquisition Parameters Date_ 20200406 Time 16.00 INSTRUM spect PROBHD 5 mm PABBO BB/ PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 16 DS 2 SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2767999 sec RG 142.98 DW 50.000 usec DE 6.50 usec TE 304.3 K D1 1.00000000 sec TD0 1 === CHANNEL f1 === SFO1 500.1920889 MHz NUC1 1H P1 10.20 usec PLW1 22.00000000 W F2 - Processing parameters SI 65536 SF 500.1890048 MHz WDW EM SSB 0 LB 0.30 Hz GB 0 PC 1.00 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm 1.00 1.03 1.03 2.09 2.07 1.02 1.04 1.03
  52. 13.0 1.00 12.876 12.5 12.0 11.5 11.0 1.03 10.704 CT1 10.5 - 1.03 10.296 DMSO 10.0 - 1H 9.5 9.0 8.5 8.0 7.929 7.925 2.09 7.915 7.911 7.5 6.834 7.0 6.829 2.07 6.821 6.816 1.02 6.768 6.5 6.481 1.04 6.477 6.193 1.03 ppm 6.189
  53. CT1-DMSO-C13CPD 9 4 98 69 39 08 30 96 9 1 0 4 . . . 80 0 1 70 49 09 95 0 7 0 . . Current Data Parameters 4 8 NAME MAI_CT1 18 164.0 163. 161. 161. 157. 12 12 115.91 103.66 102.80 98. 9 40. 39.8 39. 39. 39.28 39. 3 EXPNO 2 PROCNO 1 F2 - Acquisition Parameters Date_ 20200407 Time 23.31 INSTRUM spect PROBHD 5 mm PABBO BB/ PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 512 DS 4 SWH 31250.000 Hz FIDRES 0.476837 Hz AQ 1.0485760 sec RG 198.57 DW 16.000 usec DE 6.50 usec TE 304.6 K D1 2.00000000 sec D11 0.03000000 sec TD0 1 === CHANNEL f1 === SFO1 125.7864591 MHz NUC1 13C P1 10.00 usec PLW1 88.00000000 W === CHANNEL f2 === SFO2 500.1910008 MHz NUC2 1H CPDPRG[2 waltz16 PCPD2 80.00 usec PLW2 22.00000000 W PLW12 0.35764000 W PLW13 0.17989001 W F2 - Processing parameters SI 32768 SF 125.7726905 MHz WDW EM SSB 0 LB 1.00 Hz GB 0 PC 1.40 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm
  54. 185 180 180.98 175 170 165 164.09 163.69 160 161.39 CT1 161.08 157.30 - 155 DMSO 150 - C13CPD 145 140 135 130 127.96 125 120 120.94 115 115.91 110 105 103.66 102.80 100 98.80 95 94.01 ppm
  55. CT1-DMSO-C13CPD&DEPT DEPT90 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm DEPT135 CH&CH3 CH2 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm C13CPD 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm
  56. CT1-DMSO-C13CPD&DEPT DEPT90 125 120 115 110 105 100 95 ppm DEPT135 CH&CH3 CH2 125 120 115 110 105 100 95 ppm C13CPD 125 120 115 110 105 100 95 ppm
  57. CT1-DMSO-HSQC ppm 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 8 7 6 5 4 3 ppm
  58. CT1-DMSO-HSQC ppm 95 100 105 110 115 120 125 130 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 7.0 6.8 6.6 6.4 6.2 ppm
  59. CT1-DMSO-HMBC ppm 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 ppm
  60. CT1-DMSO-HMBC ppm 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 13 12 11 10 9 8 7 6 ppm
  61. CT1-DMSO-HMBC ppm 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 7.0 6.8 6.6 6.4 6.2 ppm
  62. Display Report - Selected Window Selected Analysis Analysis Name: CT2.d Instrument: LC-MSD-Trap-SL Print Date: 14/4/2020 1:36:14 PM Method: Cot150x3mm.m Operator: 2195410AE0000515 Acq. Date: 14/4/2020 1:36:01 PM Sample Name: CT2 Analysis Info: Column Eclipse XDB-C18, 4.6 x150mm MSD Trap Report v 4 (A4-Opt2) Page 1 of 1
  63. CT2-DMSO-1H 6 9 2 4 6 3 7 8 2 501 39 05 29 Current Data Parameters 12. 10.802 9.5 9.3 7.67 7.670 7.54 7.543 7.53 7.526 6.89 6.875 6.40 6.401 6.188 6.18 3. 2.50 2.503 2.500 2.495 2.49 NAME MAI_CT2 EXPNO 10 PROCNO 1 F2 - Acquisition Parameters Date_ 20200409 Time 16.14 INSTRUM spect PROBHD 5 mm PABBO BB/ PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 16 DS 2 SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2767999 sec RG 111.09 DW 50.000 usec DE 6.50 usec TE 304.2 K D1 1.00000000 sec TD0 1 === CHANNEL f1 === SFO1 500.1920889 MHz NUC1 1H P1 10.20 usec PLW1 22.00000000 W F2 - Processing parameters SI 65536 SF 500.1890051 MHz WDW EM SSB 0 LB 0.30 Hz GB 0 PC 1.00 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm 1.00 0.81 0.94 2.00 1.00 1.03 1.02 1.04 1.02
  64. 7.8 7.7 7.676 1.00 7.670 7.6 7.549 7.543 1.03 7.5 7.532 7.526 7.4 7.3 7.2 CT2 7.1 - DMSO 7.0 - 1H 6.9 6.894 1.02 6.875 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.406 1.04 6.401 6.3 6.2 6.188 1.02 6.183 ppm
  65. CT2-DMSO-C13CPD Current Data Parameters NAME LOI_CT2 175.79 163.83 160.68 156.10 147.65 146.77 145.01 135.67 121.92 119.93 115.56 115.04 102.97 98.14 93.30 40.00 39.83 39.66 39.50 39.33 39.16 39.00 EXPNO 2 PROCNO 1 F2 - Acquisition Parameters Date_ 20200410 Time 6.19 INSTRUM spect PROBHD 5 mm PABBO BB/ PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 256 DS 4 SWH 31250.000 Hz FIDRES 0.476837 Hz AQ 1.0485760 sec RG 198.57 DW 16.000 usec DE 6.50 usec TE 304.7 K D1 2.00000000 sec D11 0.03000000 sec TD0 1 === CHANNEL f1 === SFO1 125.7864591 MHz NUC1 13C P1 10.00 usec PLW1 88.00000000 W === CHANNEL f2 === SFO2 500.1910008 MHz NUC2 1H CPDPRG[2 waltz16 PCPD2 80.00 usec PLW2 22.00000000 W PLW12 0.35764000 W PLW13 0.17989001 W F2 - Processing parameters SI 32768 SF 125.7726885 MHz WDW EM SSB 0 LB 1.00 Hz GB 0 PC 1.40 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm
  66. 175 175.79 170 165 163.83 160 160.68 155 156.10 CT2 - 150 DMSO 147.65 145 146.77 145.01 - C13CPD 140 135 135.67 130 125 121.92 120 119.93 115 115.56 115.04 110 105 102.97 100 98.14 95 ppm 93.30
  67. CT2-DMSO-C13CPD&DEPT DEPT90 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm DEPT135 CH&CH3 CH2 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm C13CPD 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm
  68. CT2-DMSO-C13CPD DEPT90 &DEPT 120 115 110 105 100 95 ppm DEPT135 CH&CH3 CH2 120 115 110 105 100 95 ppm C13CPD 120 115 110 105 100 95 ppm
  69. CT2-DMSO-HSQC ppm 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 8 7 6 5 4 3 ppm
  70. CT2-DMSO-HSQC ppm 92 94 96 98 100 102 104 106 108 110 112 114 116 118 120 7.6 7.4 7.2 7.0 6.8 6.6 6.4 6.2 ppm
  71. CT2-DMSO-HMBC ppm 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 ppm
  72. CT2-DMSO-HMBC ppm 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 12 11 10 9 8 7 6 ppm
  73. CT2-DMSO-HMBC ppm 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 7.8 7.6 7.4 7.2 7.0 6.8 6.6 6.4 6.2 6.0 ppm