Đồ án Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn Clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men Pichia pastoris

94 trang thiennha21 12/04/2022 5690

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn Clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men Pichia pastoris", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_tao_dong_plasmid_tai_to_hop_chua_gen_ma_hoa_enzyme_end.pdf

Nội dung text: Đồ án Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn Clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men Pichia pastoris

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP CHỨA GEN MÃ HÓA ENZYME ENDOGLUCANASE D (CelD) TỪ VI KHUẨN Clostridium thermocellum TRÊN HỆ THỐNG NẤM MEN Pichia pastoris Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Thạc sĩ Nguyễn Xuân Đồng Sinh viên thực hiện : Phan Vũ Hải Yến MSSV: 1051110247 Lớp: 10DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2014
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào trước đây. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện Phan Vũ Hải Yến
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy kiến thức và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt 4 năm đại học. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến T.S Nguyễn Thị Hai người cô kính mến đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Th.S Nguyễn Xuân Đồng và K.S Lê Thị Huỳnh Trâm đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi về kiến thức chuyên môn và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Công nghệ Vi sinh - Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện và hỗ trợ tôi về kinh phí cũng như thiết bị để tôi có thể thực hiện đề tài. Tôi cũng cảm ơn các bạn trong nhóm ESS đã luôn cổ vũ và động viên tôi những lúc khó khăn để có thể vượt qua và hoàn thành tốt luận văn này. Và cuối cùng, hơn ai hết, từ đáy lòng con cảm ơn ba mẹ đã sinh ra con, nuôi dạy con khôn lớn, luôn bên con và là nguồn động viên to lớn của con, tạo mọi điều kiện tốt nhất cả về tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 7 năm 2014 Phan Vũ Hải Yến
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC HÌNH vii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề: 1 1.2. Mục đích nghiên cứu đề tài 2 1.3. Nội dung nghiên cứuc 2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3 2.1. Cấu tạo lignocellulose 3 2.1.1. Cellulose 4 2.1.2. Hemicellulose 6 2.1.3. Lignin 7 2.2. Enzyme cellulase 8 2.2.1. Phân loại enzyme 8 2.2.2. Cơ chế tác dụng của cellulase 9 2.2.3. Vi sinh vật sản xuất cellulase 10 2.3. Phức hợp cellulosome trong vi khuẩn Clostridium thermocellum 11 2.3.1. Tổng quan về vi khuẩn Clostridium thermocellum 11 2.3.2. Đặc điểm của phức hệ cellulosome 12 2.4. Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris 14 2.4.1. Đặc điểm hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris 14 2.4.2. Tích hợp gen ngoại lai vào P. pastoris 14 2.4.3. Ưu điểm của hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris 15 i
Đồ án tốt nghiệp 2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tạo dòng các gen từ Clostridium thermocellum 16 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: 19 3.1.1. Địa điểm nghiên cứu: 19 3.1.2. Thời gian nghiên cứu: 19 3.2. Nguyên liệu 19 3.2.1. Chủng vi sinh vật 19 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ 19 3.2.3. Hóa chất 20 3.2.4. Môi trường 22 3.2.4.1. Môi trường LB (Luria-Bertani): 22 3.2.4.2. Môi trường MD (Minimal Dextrose): 22 3.2.4.3. Môi trường YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) 22 3.2.4.4. Môi trường BMGY (Buffered Glycerol-complex): 22 3.2.4.5. Môi trường BMMY (Buffered Methanol-complex) bổ sung CMC 23 3.2.5. Plasmid 23 3.2.5.1. Plasmid pJET1.2/blunt 23 3.2.5.2. Plasmid pPIC9K 24 3.2.6. Các cặp mồi sử dụng 25 3.3. Phương pháp nghiên cứu: 26 3.3.1. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD của Clostridium thermocellum 26 3.3.1.1. Thiết kế mồi 26 ii
Đồ án tốt nghiệp 3.3.1.2. Thu nhận gen CelD của vi khuẩn C. thermocellum bằng phản ứng PCR dựa vào cặp mồi đã thiết kế 27 3.3.1.3. Quy trình tinh sạch gen theo MEGAquick – spin Total Fragment DNA Purification Kit – INTRON Biotechnololy 28 3.3.1.4. Phương pháp ghép nối gen vào vector nhân dòng pJET1.2/ Blunt 28 3.3.1.5. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5α khả nạp 29 3.3.1.6. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp hóa biến nạp 30 3.3.1.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc 31 3.3.1.8. Phương pháp tách chiết plasmid từ tế bào E. coli 32 3.3.1.9. Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn 33 3.3.1.10. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự tương ứng trên GenBank 34 3.3.2.Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD 34 3.3.2.1 Chuẩn bị dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn 34 3.3.2.2. Quy trình tinh sạch gen và plasmid theo MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction System – INTRON 35 3.3.2.3. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD 36 3.3.2.4. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5α khả nạp 36 3.3.2.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD vào E. coli DH5α 36 3.3.2.6. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng PCR khuẩn lạc 37 3.3.2.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn 37 3.3.2.8. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự tương ứng trên GenBank 38 iii
Đồ án tốt nghiệp 3.3.3. Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 mang gen mã hóa enzyme endoglucanase D 38 3.3.3.1. Chuẩn bị tế bào Pichia pastoris GS115 khả nạp 39 3.3.3.2. Phương pháp điện biến nạp 39 3.3.3.3. Chọn lọc các dòng Pichia pastoris mang nhiều bản sao của gen CelD và có khả năng năng tiết enzyme ngoại bào Endoglucanase D 40 3.3.3.4. Phương pháp ly trích DNA tổng số 40 3.3.3.5. Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng phương pháp PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R 41 3.3.5. Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P. pastoris tái tổ hợp 42 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD của Clostridium thermocellum 43 4.1.1. Khuếch đại gen CelD bằng kĩ thuật PCR 43 4.1.2. Tạo dòng E. coli mang plasmid nhân dòng chứa gen CelD 44 4.1.3. Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc 45 4.1.4. Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR và enzyme cắt giới hạn 46 4.1.5. Kiểm tra dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2-CelD bằng giải trình tự 48 4.2.1. Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc 52 4.2.2. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR và bằng enzyme cắt giới hạn SnaBI và EcoRI 53 4.2.3. Kiểm tra dòng E. coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K – CelD bằng giải trình tự 55 iv
Đồ án tốt nghiệp 4.3. Tạo dòng Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen CelD 57 4.3.1. Biến nạp plasmid pPIC9K – CelD vào chủng Pichia pastoris GS115 58 4.3.2. Sàng lọc tế bào nấm men mang gen mã hóa cho endoglucanase D 59 4.3.3. Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng phương pháp PCR với mồi AOX1F/ AOX1R 60 4.3.4. Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P. pastoris tái tổ hợp 62 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63 5.1. Kết luận 65 5.2. Đề nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC v
Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT AOX Alcohol oxydase BMGY Buffered Glycerol-complex BMMY Buffered Methanol-complex bp Base pair CBD Cellulose binding domain CMC Carboxymethyl-cellulose dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid Kb kilo base LB Luria-Bertani MD Minimal Dextrose Mut Methanol Utilisation NCBI National Center for Biotechnology Information OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction Taq Thermus aquaticus TAE Tris – acetate – EDTA TE buffer Tris EDTA buffer YNB Yeast Nitrogen Base YPD Yeast Extract Peptone Dextrose vi
Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Tỉ lệ các thành phần trong lignocellulose. 3 Hình 2.2. Lignocellulose 4 Hình 2.3. Cấu trúc phân tử Cellulose 5 Hình 2.4. Cấu trúc cellulose 6 Hình 2.5. Hemicellulose. 7 Hình 2.6. Lignin 7 Hình 2.7. Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase. 9 Hình 2.8. Clostridium thermocellum 11 Hình 2.9. Cơ chế hoạt động của Cellulosome 12 Hình 3.1. Thang DNA 1 Kb 21 Hình 3.2. Plasmid pJET 1.2 24 Hình 3.3. Plasmid pPIC9K 25 Hình 3.4. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR 27 Hình 3.5. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R 32 Hình 3.6. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/ AOX1R 37 Hình 3.7. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R 41 Hình 4.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen CelD 43 Hình 4.2. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5훼 chứa plasmid tái tổ hợp pJET1.2- CelD trên môi trường LB/ Ampicillin (50 µg/ml) 444 Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli DH5α/pJET1.2-CelD với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R 45 Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm của cắt plasmid pJET1.2-CelD bằng enzyme SnaBI và EcoRI và sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR 46 Hình 4.5. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5훼 chứa pPIC9K-CelD bằng môi trường LB/ ampicillin (50 µg/ml). 51 vii
Đồ án tốt nghiệp Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli DH5α/pPIC9K-CelD với cặp mồi AOX1F/AOX1R. 52 Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD với mồi CelDF/ CelDR và sản phẩm cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI. 53 Hình 4.8. Kết quả blast trình tự protein của trình tự trong plasmid pPIC9K-CelD trên NCBI 56 Hình 4.9. Sàng lọc thể biến nạp P. pastoris GS115 chứa pPIC9K-CelD 58 Hình 4.10. Sàng lọc tế bào P. pastoris mang gen CelD trên môi trường YPD/ G418 60 Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự sát nhập của plasmid pPIC9K-CelD vào bộ gen P. pastoris GS115 61 Hình 4.12. Vòng phân giải CMC của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp khi nhuộm với thuốc đỏ Congo 63 viii
Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1. Các cặp mồi được sử dụng có trình tự như sau: 26 Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR 27 Bảng 3.3. Thành phần phản ứng nối gen CelD vào plasmid pJET1.2 29 Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R 31 Bảng 3.5. Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-CelD với SnaBI và EcoRI 33 Bảng 3.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid pPIC9K và pJET1.2-CelD với SnaBI và EcoRI 35 Bảng 3.7. Thành phần phản ứng nối CelD vào vector biểu hiện pPIC9K 36 Bảng 3.8. Thành phần phản ứng cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI 38 Bảng 4.1. Đường kính vòng phân giải CMC của các chủng P. pastoris tái tổ hợp 64 ix
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề: Ethanol là một trong những dung môi quan trọng trong công nghiệp hóa học và công nghệ sản xuất thực phẩm. Gần đây, ethanol được coi là một nhiên liệu sạch có khả năng tái tạo, có thể thay thế một phần cho các nguồn nhiên liệu hoá thạch đang ngày càng cạn kiệt như than đá, dầu mỏ trong tương lai. Hiện nay 98% ethanol được sản xuất từ ngũ cốc hoặc nguyên liệu thực phẩm. Điều này sẽ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến tình hình an ninh lương thực trên thế giới. Trong khi đó, sản xuất nông nghiệp hàng năm sinh ra một lượng lớn phụ phế phẩm như rơm rạ, cám mì, trấu, bã mía, Việc tận dụng được nguồn chất thải này để sản xuất ethanol sinh học không những giảm khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên đang dần cạn kiệt mà còn giảm ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên việc sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu tái sinh này vẫn còn gặp nhiều khó khăn khi sản xuất ở quy mô công nghiệp. Trong công nghệ sản xuất cồn sinh học, hai hướng chính để thủy phân cellulose là phương pháp hóa học và sinh học. Trong thủy phân hóa học, cellulose bị phân hủy thành đường đơn dưới tác dụng của H2SO4 ở nhiệt độ cao. Công nghệ này mặc dù có hiệu suất cao nhưng rất độc hại và phức tạp, ảnh hưởng xấu đến môi trường và con người. Chính vì vậy, hướng ứng dụng enzyme để thủy phân cellulose là một hướng nghiên cứu mới, hứa hẹn đem đến những đột phá về mặt công nghệ. Enzyme cellulase là enzyme ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thủy phân cellulose thành glucose – nguyên liệu chính trong sản xuất cồn sinh học. Tuy nhiên, việc sử dụng chúng vẫn còn hạn chế vì chi phí sản xuất enzyme cellulase cao và hiệu suất chuyển hóa cơ chất thấp. Nguyên nhân là do quá trình thu nhận enzyme trực tiếp từ vi sinh vật tốn nhiều thời gian và công sức, khó thực hiện ở quy mô công nghiệp, enzyme đôi khi không có đủ các đặc tính mong muốn. Chính vì thế, ứng dụng những tiến bộ của kỹ thuật di truyền vào việc sản xuất enzyme cellulase tái tổ hợp là một trong những hướng nghiên cứu tiềm năng để thu nhận enzyme với sản lượng lớn. 1
Đồ án tốt nghiệp Hiện nay trên thế giới đã có những nghiên cứu về hệ enzyme phân hủy cellulose của cellulosome ở vi khuẩn kỵ khí ưa nhiệt Clostridium thermocellum. Hướng biểu hiện hệ cellulosome tái tổ hợp để thu nhận được số lượng lớn cellulosome có chức năng phân giải cellulose được coi là hướng có tiềm năng nhất trong công nghệ sản xuất cồn từ cellulose. Trên cơ sở đó đề tài: “Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn Clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men Pichia pastoris” được tiến hành. Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu tạo hỗn hợp enzyme cellulase phân hủy cellulose từ các nguồn phụ phế phẩm nông – lâm nghiệp và ứng dụng để sản xuất cồn sinh học với giá thành hợp lý. 1.2. Mục đích nghiên cứu đề tài Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris mang gen mã hóa enzyme endoglucanase D từ vi khuẩn Clostridium thermocellum. 1.3. Nội dung nghiên cứu: - Thu nhận gen mã hóa endoglucanase D (CelD) từ Clostridium thermocellum bằng phản ứng PCR. - Tạo dòng tế bào E. coli DH5훼 mang plasmid nhân dòng tái tổ hợp chứa gen CelD - Tạo dòng E. coli DH5훼 mang vector biểu hiện pPIC9K chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D. - Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris mang gen mã hóa enzyme endoglucanase D. 2
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Cấu tạo lignocellulose Lignocellulose là một hợp chất hữu cơ phổ biến trong tự nhiên. Hàng năm sản lượng sinh khối thực vật trên Trái Đất khoảng 200 tỉ tấn, trong đó 90% là lignocellulose (Himmel và cộng sự, 2007). Việc chuyển hóa lignocellulose không chỉ quan trọng đối với vòng tuần hoàn vật chất mà còn ảnh hưởng đến việc tái hồi dinh dưỡng cho cây. Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và một số thực vật khác như cỏ, lúa, ngô Trong tự nhiên, lignocellulose chủ yếu có trong phụ phế phẩm nông nghiệp, sản phẩm phụ của công nghiệp sản xuất giấy và các chất thải rắn, Về thành phần cấu tạo, lignocellulose gồm cellulose, hemicellulose và lignin. Số lượng mỗi loại polymer thay đổi tùy loài, tuổi và từng bộ phận khác nhau của cây. Hình 2.1. Tỉ lệ các thành phần trong lignocellulose Nguồn: Pérez và cộng sự (2002) Với thành phần chính là cellulose, lignocellulose là một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất cồn sinh học. Tuy nhiên đây là một hợp chất khó phân hủy trong điều kiện tự nhiên vì nó có cấu trúc đa dạng và phức tạp, bao gồm các thành phần có độ polymer hóa cao và liên kết với nhau một cách chặt chẽ. Do đó muốn phân hủy được chúng, cần phải có một hệ enzyme chuyên biệt, đòi hỏi một hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp hệ enzyme để phân hủy chúng. (Himmel và cộng sự, 2007). 3
Đồ án tốt nghiệp Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản, các sợi này gắn lại với nhau nhờ hemicellulose, tạo thành cấu trúc vi sợi. Hemicellulose và lignin bao bọc xung quanh các vi sợi, tạo nên một cấu trúc vững chắc, bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công của enzyme cũng như các hóa chất khác trong quá trình thủy phân (Charles E. Wyman, 1996). Hình 2.2. Lignocellulose Nguồn: Joseleau và cộng sự (1992) 2.1.1. Cellulose Cellulose là thành phần polymer phổ biến nhất trong tự nhiên, chiếm 50% lượng sinh khối thực vật, giúp mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi. Thành phần cellulose thường không đều ở các cơ quan khác nhau trong thực vật. Người ta thấy rằng, lượng cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất ở thân cây. Cellulose chiếm đến 90% trong sợi bông, 50% trong gỗ, 40 – 50% trong bã mía, 35 – 40% trong rơm lúa mỳ và lúa gạo (Sloneker, J. H., 1971; Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2012). Cellulose là chất rắn màu trắng, không mùi vị, có độ bền nhiệt cao, không tan trong nước và các dung môi thông thường (rượu, ete, benzen, ) nhưng tan trong dung dịch Schweitzer (dung dịch Cu(OH)2 trong NH3). Cellulose bị phân hủy mạnh dưới tác dụng của một số dung dịch axit vô cơ mạnh như: HCl, H2SO4, và tương đối yếu với các axit hữu cơ (axit acetic, axit formic, ) nhưng bền vững dưới tác dụng của kiềm (Nguyễn Văn Lân, 2004). 4
Đồ án tốt nghiệp Cellulose là polysaccharide có công thức cấu tạo (C6H10O5)n, trọng lượng phân tử khoảng từ 50.103 đến 2,5.106 Da, gồm từ 5000 đến 14000 gốc β - D glucose nối lại với nhau bằng liên kết 훽 – 1,4 glucoside tạo thành dạng chuỗi. Các phân tử cellulose liên kết với nhau nhờ lực hút Van der Waals và liên kết hidro tạo thành cấu trúc dạng sợi bền vững. Hình 2.3. Cấu trúc phân tử Cellulose Nguồn: Gardner và cộng sự (1974) Cellulose có cấu trúc sợi dài, đường kính khoảng 3 nm. Nhiều sợi liên kết song song với nhau thành chùm nhờ liên kết hidro giữa các nhóm OH, tạo thành vi sợi. Trong tự nhiên, các vi sợi không đồng nhất, chúng thường tồn tại ở 2 vùng: - Vùng kết tinh: có cấu trúc trật tự rất cao, chặt chẽ như tinh thể, chiếm khoảng ¾ cấu trúc cellulose (Taiz và cộng sự, 2006). Các mạch cellulose liên kết với nhau nhờ liên kết hidro giữa nhóm hydroxyl của mạch này với nhóm hydroxyl của mạch khác, tạo thành một mạng lưới liên kết hydro dày đặc, ngăn cản sự tác động của enzyme ở điều kiện bình thường. - Vùng vô định hình: các mạch liên kết với nhau nhờ lực Van der Waals do đó vùng này có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài (Charles E. Wyman, 1996). Khi gặp nước, chúng dễ bị trương lên, tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme cellulase tấn công dễ dàng, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng. Tuy vậy việc thủy phân cellulose chỉ có thể đạt hiệu quả cao khi tách cellulose khỏi các thành phần khác cùng cấu tạo nên màng tế bào thực vật (Tô Kim Anh và cộng sự, 2010). 5
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4. Cấu trúc cellulose Nguồn: Hsu và cộng sự (1980) 2.1.2. Hemicellulose Hemicellulose là hợp chất polysaccharide chiếm tỷ lệ lớn trên thế giới sau cellulose. Đây là polysaccharide phức tạp, có phân tử khối nhỏ hơn nhiều so với cellulose. Chúng được cấu tạo từ các gốc đường khác nhau như arabinose, galactose, glucose, mannose và xylose. Các gốc đường này liên kết với nhau thông qua các liên kết 훽 – 1,4 glucoside, 훽 – 1,3 glucoside và 훽 – 1,6 glucoside tạo thành cấu trúc dạng mạch nhánh. Sự phân nhánh trong cấu trúc của hemicellulose cũng tạo điều kiện thuận lợi cho dung môi và các chất hóa học tấn công. Cấu trúc của hemicellulose không bền, dễ bị phân hủy bởi acid loãng hoặc kiềm. Khi bị phân hủy, hemicellulose tạo thành các monosaccharide (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2012). 6
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.5. Hemicellulose Nguồn: Fengel và Wegener (1989) 2.1.3. Lignin Lignin là hợp chất cao phân tử có nhiều ở thực vật bậc cao (cả thực vật hạt trần và thực vật hạt kín). Hàm lượng và thành phần lignin thay đổi theo tế bào, mô và theo nhóm thực vật, ở cây gỗ, lignin chiếm từ 20 – 30% Lignin có nhiệm vụ kết dính và tăng độ bền cơ học cho tế bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn chặn các độc tố và sự xâm nhiễm của các vi sinh vật đồng thời cản trở sự tiếp xúc của enzyme cellulase với cellulose (Odier và cộng sự, 1992; Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2012). Do vậy phân hủy lignin sẽ tạo điều kiện cho thủy phân hiệu quả cellulose. Các nghiên cứu đã cho thấy có sự tỉ lệ thuận giữa mức độ lignin bị phân hủy và mức độ thủy phân cellulose ( Kim và cộng sự, 2006). Hình 2.6. Lignin Nguồn: J. Pérez và cộng sự (2002) 7
Đồ án tốt nghiệp Lignin có cấu tạo vô định hình, kị nước và bền với các tác nhân phân giải hóa học và sinh học. Dưới tác dụng của bisulfite natri và H2SO4, lignin bị phân giải tạo ra các hợp chất thơm. Đây là hợp chất được tạo thành từ sự ngưng tụ của các loại rượu khác nhau, trong đó có ba loại rượu cơ bản là conyferylic, synafilic và courmarylic. Các loại rượu này liên kết với nhau bằng liên kết C – C và C – O. 2.2. Enzyme cellulase 2.2.1. Phân loại enzyme Cellulase là enzyme được sinh ra từ nhiều sinh vật khác nhau như nấm mốc, vi khuẩn, thực vật, có khả năng thủy phân cellulose. Cellulase có thể tồn tại dưới dạng enzyme đơn hoặc phức hệ enzyme còn gọi là cellulosome. Dựa vào cơ chế thủy phân cellulose, enzyme cellulase được Wood và Mc. Cral (1979) chia làm 3 nhóm chủ yếu : endoglucanase, exoglucanase và 훽 – glucosidase. - Endoglucanase hay 1,4 훽 – D – glucanohydrolase (EC 3.2.1.4): là enzyme tham gia phân giải liên kết 훽-1.4 glucoside trong cellulose. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose. Chúng tham gia tác động mạnh đến cấu trúc cellulose vô định hình và tác dụng yếu đến cấu trúc cellulose kết tinh. - Exoglucanase hay 1,4 훽 – D – glucan – cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91): cắt đầu không khử của chuỗi cellulose và giải phóng ra các cellobiose. Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose ở dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endoglucanase phân giải chúng. - 훽 – D – glucoside glucohydrolase hay 훽 – glucosidase (EC 3.2.1.21): enzyme này có tác dụng thủy phân cellobiose và cellodextrine tan tạo thành D – glucose. Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy. Ba enzym này xúc tác cho các giai đoạn nối tiếp nhau nhưng phụ thuộc lẫn nhau của quá trình thủy phân cellulose thành glucose (Cullen và cộng sự, 1992). 8
Đồ án tốt nghiệp 2.2.2. Cơ chế tác dụng của cellulase Trong thiên nhiên, quá trình thủy phân cellulose có sự tham gia của cả ba loại enzyme là endoglucanase, exoglucanase và 훽 – glucosidase. Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định, xúc tác cho các giai đoạn nối tiếp nhau nhưng phụ thuộc lẫn nhau trong quá trình thủy phân từ cellulose thành glucose (Cullen và cộng sự, 1992). Nhờ vào sự phối hợp hoạt động của các enzyme này mà cơ chất được thủy phân hoàn toàn. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng enzyme endoglucanase có tác dụng phân cắt tốt trên vùng vô định hình, đặc biệt trên các cellulose biến tính như carboxymethyl- cellulose (CMC), hydroxyethyl cellulose (HEC). Ngược lại, enzyme exoglucanase tác động trên vùng cellulose kết tinh, ít trên vùng cellulose vô định hình và hầu như không có tác dụng phân cắt cellulose biến tính (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2012) Dưới tác dụng của exocellulase và endocellulase, mạch cellulose tách thành các mạch nhỏ (oligosaccharide), sau đó tiếp tục bị phân cắt thành đường glucose nhờ enzyme β-glucosidase. . Hình 2.7. Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase 9
Đồ án tốt nghiệp 2.2.3. Vi sinh vật sản xuất cellulase Trong tự nhiên, hệ vi sinh vật có khả năng cellulose vô cùng đa dạng và phong phú. Nhiều loài nấm hoặc vi khuẩn có phân giải cellulose mạnh ở điều kiện hiếu khí và kị khí và ở các nhiệt độ khác nhau. Nấm sợi là nhóm có khả năng tiết một lượng lớn enzyme cellulase có cấu trúc hoàn chỉnh ra ngoài môi trường nên phân hủy cellulose khá mạnh. Đại diện có các loài như Trichoderma reesei, T. viridae, Aspergillus niger, Fusarium solani, Penicillium pinophinum, Sporotrichum pulverulentum. Các loài nấm ưa nhiệt cũng được chú ý vì chúng có thể sinh các enzyme bền nhiệt, sinh trưởng và phân giải nhanh cellulose. Nhưng thông thường các chủng nấm sợi phân giải cellulose điển hình thường thiếu enzyme 훽 − glucosidase, vì vậy để hệ này hoạt động hiệu quả cần phải bổ sung 훽 − glucosidase (Lee và cộng sự, 1996). Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đặc biệt, đa số sống trong đất và phát triển trong điều kiện hiếu khí, một số ít loài có thể sống trong điều kiện kị khí. Một số xạ khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose là: Streptomyces, Streptosporagium, Actinomyces nocardia, Micromonospora (Schimz và cộng sự, 1983). Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật phân giải cellulose mạnh nhưng cường độ không bằng nấm do lượng enzyme tiết ra ít hơn. Vi khuẩn hiếu khí và kị khí đều có thể phân giải cellulose. Các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng phân giải cellulose khá mạnh như Cellulomonas, Vibrio, Trong điều kiện yếm khí, các loài vi khuẩn ưa ấm và ưa nhiệt cũng có khả năng phân giải cellulose. Đại diện điển hình cho các vi khuẩn ưa ấm phân giải cellulose ở nhiệt độ 30 – 400C là loài Clostridium omelanskii, vi khuẩn ưa nóng là loài Clostridium thermocellum, nhiệt độ tốt nhất cho sự phát triển của chúng là 60 – 650C. Các vi khuẩn ưa ấm, ưa nóng phát triển tốt trên môi trường chứa đường đơn. Khi phân giải cellulose thành glucose và cellubiose, chúng sử dụng đường này như nguồn năng lượng (Schwarz WH và cộng sự, 1986; Schwarz, 2001). 10
Đồ án tốt nghiệp Trong tự nhiên, đa số các loài không có khả năng cùng một lúc sinh tổng hợp tất cả các loại enzyme có trong phức hệ cellulase. Có loài này có khả năng sinh tổng hợp mạnh loại enzyme này, loài khác lại tổng hợp loại enzyme khác. Chính vì vậy, sự phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên thường rất chậm và không triệt để (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2012). Tuy nhiên có một loại vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose nhanh hơn nhờ vào hệ thống phức hợp đa enzyme. Đó chính là vi khuẩn Clostridium thermocellum. 2.3. Phức hợp cellulosome trong vi khuẩn Clostridium thermocellum 2.3.1. Tổng quan về vi khuẩn Clostridium thermocellum Hệ thống phân loại: Giới: Vi khuẩn Ngành: Firmicutes Lớp: Clostridia Bộ: Clostridiales Họ: Clostridiaceae Chi: Clostridium Loài: Clostridium thermocellum Hình 2.8. Clostridium thermocellum Clostridium thermocellum là trực khuẩn gram dương, kỵ khí bắt buộc, ưa nhiệt, sinh bào tử, phát triển tốt ở nhiệt độ từ 600C – 650C và pH từ 6,1 – 7,5 (Freier và cộng sự, 1988). Đây là một vi sinh vật tiềm năng trong công nghiệp sản xuất cồn sinh học vì nó có khả năng phân hủy cellulose. Quá trình phân giải cellulose bởi Clostridium thermocellum là các phản ứng được thực hiện bởi 1 phức hệ enzyme gắn kết với nhau gọi là cellulosome (Bayer và cộng sự, 1998). Tuy nhiên đây là vi sinh vật kị khí bắt buộc nên quá trình nuôi cấy đạt hiệu quả không cao, lượng enzyme tạo ra thấp, khó áp dụng vào quy mô công nghiệp. 11
Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Đặc điểm của phức hệ cellulosome Cellulosome là phức hệ đặc biệt gồm nhiều enzyme liên kết với nhau. Phức hệ này có khả năng phân huỷ cơ chất phức tạp như cellulose vì có chứa đầy đủ các thành phần enzyme để thuỷ phân triệt để cơ chất này. Vì vậy, cellulosome có thể thủy phân cả vùng vô định hình và vùng tinh thể của cellulose trong khi các enzyme đơn lẻ không thể thực hiện được chức năng này. Cấu trúc quan trọng của cellulosome bao gồm scaffoldin cùng dạng enzyme hoạt động cho phép thủy phân cellulose một cách có hiệu quả. Hình 2.9. Cơ chế hoạt động của Cellulosome Nguồn: Shoham Y và cộng sự (1999) Scaffoldin là thành phần quan trọng của hệ cellulosome có các vùng chức năng : - Kết nối các enzyme thủy phân thuộc phức hợp cellulsome thông qua tương tác cohesin (scaffoldin) và dockerin (enzyme). 12
Đồ án tốt nghiệp - Kết nối phức hợp và các nguồn cơ chất, cellulose nhờ vùng CBD (cellulose- binding domain). - Kết nối bề mặt tế bào và phức hợp enzyme nhờ các protein dính kết với bề mặt tế bào, nhờ đó mà tế bào thuận tiện trong việc sử dụng sản phẩm phân giải cho quá trình đồng hóa. Trong cấu tạo của scaffoldin thì cohesin luôn có mặt và là thành phần dính kết với các dockerin của enzyme. Số lượng các cohesin là khác nhau trong các scaffoldin khác nhau và có tính đặc trưng cho tương tác của chúng với dockerin trong các enzyme có nguồn gốc cùng loài. Ví dụ trong Clostridium thermocellum, scaffoldin bao gồm 9 cohesin loại I nối với các enzyme phân giải qua các dockerin loại I, các dockerin này không tương tác với các cohesin được tìm thấy trong scaffoldin của Clostridium cellulolyticum. Bên cạnh đó, một dockerin loại II nối với các protein bề mặt tế bào qua các cohensin loại II. Tương tác này sẽ gắn chặt cấu trúc cellulosome lên bề mặt tế bào, giúp quá trình thủy phân cellulose hiệu quả hơn (Doi và cộng sự, 2004). CBD (Carbonhydrate binding domain) là một thành phần của scaffoldin, có chức năng gắn hệ cellulosome vào cơ chất cellulose. Scaffoldin của Clostridium thermocellum chứa CBD IIIa liên kết rất mạnh với cellulose kết tinh. Ngoài ra nó còn làm yếu các liên kết giữa các sợi của cellulose kết tinh, thúc đẩy cho quá trình phân giải tiếp theo (Bayer và cộng sự, 1998). Ở C. thermocellum có một hệ thống enzyme endoglucanase rất đa dạng bao gồm: CelA, CelB, CelC, CelD, CelE, CelF, CelG, CelH, CelJ, CelK, CelN, CelO, CelP, CelQ (Roy H. Doi và Akihiko Kosugi, 2004). Trong đó, endoglucanase CelD có hoạt tính rất cao được nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu. Enzyme này hoạt động tối ưu ở pH 6,3 và nhiệt độ 600C. Hoạt tính riêng của enzyme này đạt 428 IU/ mg cao hơn nhiều so với các enzyme endoglucanase khác của C. thermocellum (Gwennael và cộng sự, 2000). 13
Đồ án tốt nghiệp Do đó, khi tương tác với scaffoldin thì hoạt tính của enzyme tăng lên nhiều so với enzyme tự do, giúp cho enzyme gắn chặt với cơ chất hơn và nâng cao hiệu quả thủy phân. 2.4. Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris 2.4.1. Đặc điểm hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris Pichia pastoris là sinh vật eukaryote thuộc họ Saccharomycetaceae. Chúng sinh trưởng ở nhiệt độ từ 28 – 320C. Nếu nhiệt độ môi trường nuôi cấy cao hơn 320C sẽ ảnh hưởng đến quá trình tiết protein của nấm men này. Pichia pastoris là một trong số không nhiều nấm men có khả năng sử dụng methanol như nguồn cacbon duy nhất. P. pastoris có hai gen mã hóa enzyme alcohol oxydase (AOX) là AOX1 và AOX2. Ứng dụng của P. pastoris trong biểu hiện xuất phát từ việc khai thác promoter AOX, promoter liên quan đến quá trình đồng hóa methanol. Thông thường gen biểu hiện protein mong muốn đặt dưới sự kiểm soát của promoter AOX1. Promoter AOX1 có vai trò quan trọng trong việc điều khiển sự phiên mã của gen nhân dòng và việc sản xuất lượng lớn protein tái tổ hợp. Promoter AOX2 cũng mã hóa alcohol oxydase nhưng hoạt tính thấp hơn khoảng 10 – 20 lần so với AOX1 (Daly R, Hearn MT, 2005). Gen ngoại lai chứa trong plasmid tái tổ hợp có khả năng tích hợp vào hệ gen của P. pastoris nhờ quá trình tiếp hợp và trao đổi chéo, qua đó làm tăng tính ổn định của gen này trong tế bào chủ (Thân Văn Minh, 2012). Tất cả các chủng biểu hiện của hệ biểu hiện P. pastoris đều có nguồn gốc từ chủng dại NRRL-Y 11430. P. pastoris GS115 và KM71 là các chủng đột biến gen histidinol dehydrogenase (his4) mất khả năng tổng hợp histidine nên các thể biến nạp có thể được chọn lọc bằng môi trường khuyết dưỡng histidine. 2.4.2. Tích hợp gen ngoại lai vào P. pastoris Các vector biểu hiện trong P. pastoris được thiết kế tương đồng với locus AOX1 hay locus his4. Giống như ở S. cerevisiae, DNA dạng thẳng giúp ổn định 14
Đồ án tốt nghiệp quá trình biến nạp vào P. pastoris nhờ sát nhập hay tái tổ hợp với trình tự tương đồng trong bộ gen nấm men. DNA tái tổ hợp có thể tồn tại ổn định với dạng đa bản sao trong bộ gen tế bào chủ. Ở chủng Mut+ hoặc MutS, gen sát nhập tại locus his4 do sự trao đổi chéo giữa locus his4 của nhiễm sắc thể nấm men và vector biểu hiện. Kết quả có thể cho một hoặc nhiều bản sao của vector tại vị trí his4 và có kiểu hình His+. Làm thẳng vector bằng enzyme cắt giới hạn tại vị trí his4, kiểu hình Mut+ hay MutS tùy thuộc vào chủng chủ sử dụng. Các dòng nấm men tái tổ hợp đa bản sao của vector biểu hiện chiếm 1-10% các chủng His+ biến nạp (Thân Văn Minh, 2012). 2.4.3. Ưu điểm của hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris Một số hệ thống biểu hiện phổ biến hiện nay bao gồm: E. coli, B. subtilis, S. cerevisae, P. pastoris, A. niger và tế bào động vật. Mỗi hệ biểu hiện có những ưu điểm có những ưu điểm và hạn chế riêng, tùy thuộc sản phẩm protein mà cần lựa chọn hệ biểu hiện phù hợp. Nấm men đang là hệ biểu hiện đang được sử dụng rộng rãi hiện nay do có nhiều ưu điểm. Chúng là các sinh vật nhân chuẩn có khả năng tích hợp gen lạ của các sinh vật khác vào genome của mình. Ngoài ra chúng là sinh vật nhân chuẩn duy nhất có khả năng thực hiện các thao tác kĩ thuật di truyền phân tử dễ dàng như khi thực hiện ở E. coli và có khả năng phát triển rất mạnh trong môi trường nuôi cấy. Đặc biệt ở nấm men có quá trình sửa đổi sau dịch mã hoàn thiện để trở thành dạng protein hoạt động và có khả năng tiết protein mạnh với cơ chế điều hòa nghiêm ngặt, thao tác dễ dàng (R. Daly, M. T. Hearn, 2005). Pichia pastoris có thể sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy liên tục và có khả năng lên men với mật độ tế bào cao. Chúng có thể sinh trưởng trên môi trường pH tương đối thấp từ 3 đến 7 do đó có thể điều chỉnh được pH để giảm thiểu tối đa hoạt động của protease đối với protein được tiết ra. Có khả năng sử dụng methanol là nguồn cacbon chính nên môi trường nuôi cấy chứa nhiều methanol, hạn chế được sự nhiễm của các loài sinh vật khác. Do vậy nuôi cấy P. pastoris ít bị tạp nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài. Đồng thời methanol là chất rẻ tiền hơn so với IPTG, chất cảm ứng của hệ thống biểu hiện E. coli. 15
Đồ án tốt nghiệp Nấm men P. pastoris tổng hợp protein ngoại lai trong peroxisome, thuận tiện cho việc vận chuyển và tiết protein. Hệ thống P. pastoris có khả năng sản xuất lượng lớn protein tái tổ hợp với hàm lượng lên đến gram trên lít. Vector biểu hiện pPIC9K có trình tự nhân tố α giúp protein mục tiêu được tiết ra ngoài môi trường nên dễ thu nhận hơn so với các hệ thống biểu hiện khác, đồng thời protein của bản thân P. pastoris được tiết ra với hàm lượng rất thấp nên quá trình tinh sạch và thu nhận protein mục tiêu về sau rất dễ dàng. Quá trình lên men được thực hiện nhanh chóng, dễ dàng thu được sản phẩm ở dạng gấp cuộn có hoạt tính, mỗi mẻ từ 5-6 ngày, đáp ứng được nhu cầu sản xuất protein số lượng lớn, các thông số pH, độ thông khí, lượng CO2 có thể được kiểm soát chặt chẽ. Ngoài ra P. pastoris không là tác nhân gây bệnh, không chứa virus trong tế bào và còn có một promoter mạnh có thể kiểm soát chặt chẽ bằng nguồn cacbon. Với các thuận lợi trên, P. pastoris thu hút được nhiều sự quan tâm và là đối tượng được lựa chọn để biểu hiện nhiều loại protein, nâng cao được hiệu quả và tiết kiệm được chi phí sản xuất so với các hệ thống biểu hiện khác. 2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tạo dòng các gen từ Clostridium thermocellum Khởi đầu cho những nghiên cứu về hệ enzyme cellulase ở Clostridium thermocellum là T.Kobayashi và cộng sự (1990). Nhóm nghiên cứu đã tạo hệ minicellulosome và tiến hành khảo sát hoạt tính phân giải cellulose. Hoạt tính của hệ cellulosome này cao hơn 8 lần trên Avicel (microcrystalline cellulose powder) (pH 5,5 – 7; 700C) và hơn 15 lần trên CMC ( (pH 5,5 – 7; 650C) so với dịch cellulase ngoại bào thô đã được phân tách từ hệ cellulase của C. thermocellum. Năm 1993, Wang và cộng sự đã nhân dòng và phân tích trình tự gen CelS từ Clostridium thermocellum ATCC 27405 vào DH1OB. E. coli XL-1 Blue bằng plasmid pBluescript SK. Đến năm 1994, Wang và các cộng sự của mình tiếp tục tạo dòng tế bào E. coli DH5훼 mang vector biểu hiện pRSET chứa gen mã hóa CelS. Thông qua phân tích bằng phương pháp Western blot đã phát hiện được protein tái 16
Đồ án tốt nghiệp tổ hợp với kích thước tương tự protein từ CelS. Tiến hành kiểm tra định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng E. coli tái tổ hợp, kết quả cho thấy các dòng này phân hủy rất ít trên môi trường cacboxymethyl cellulose nhưng có khả năng phân hủy mạnh trên môi trường cellulose tinh thể. Năm 1996, Mohammad Mainul Ahsan và cộng sự cũng nghiên cứu tạo dòng, giải trình tự và biểu hiện gen mã hóa cellulase CelJ trong tế bào E. coli JM109. Kết quả điện di SDS - PAGE cho thấy gen CelJ có khả năng biểu hiện cao trong tế bào này. Shen-Long Tsai và cộng sự (2009) đã thiết kế một hệ minicellulosme ba chức năng từ các enzyme endoglucanase CelA, β-glucosidase BglA của Clostridium thermocellum, exoglucanase CelE và endoglucanase CelG từ C. cellulolyticum với hướng biểu hiện bề mặt scaffoldin trên hệ thống biểu hiện Saccharomyces cerevisiae. Kết quả lên men ethanol với hiệu quả gấp 2,6 lần so với việc sử dụng các enzyme tinh sạch trên phối hợp với nhau, mặc dù hàm lượng đo được là giống nhau. Vào năm 2011, Jian-Ming Liu và cộng sự đã tạo dòng và biểu hiện năm gen mã hóa enzyme cellobiohydrolase và một gen mã hóa enzyme endoglucanase của Clostridium thermocellum DSM 1237 là CbhA, CelK, CelO, Cel48Y, Cel48S và CelA vào hai dòng tế bào Bacillus subtilis WB600 và WB800. Các enzyme cellulase từ các dòng B. subtilis tái tổ hợp trên có khả năng tiết enzyme hiệu quả trong môi trường nuôi cấy, có hoạt tính khá tốt trên chất nền photphoric acid swollen cellulose (PASC). Kết quả cụ thể cho thấy khi khi nghiên cứu biểu hiện cellobiohydrolase của CbhA, Cel48S, Cel48Y cho hàm lượng enzyme lần lượt là 304, 110 và 153 mg/l, nhưng khi có sự phối hợp CbhA – Cel48S và CbhA – Cel48Y thì hàm lượng enzyme thu được của mỗi phức hợp lần lượt là 532 mg/l và 611 mg/l. Bên cạnh đó sự phối hợp giữa CelA với các tỉ lệ CbhA khác nhau cũng cho hàm lượng từ 761 – 905 mg/l trên chất nền phosphoric acid swollen cellulose (PASC). 17
Đồ án tốt nghiệp Tuy nhiên hai gen mã hóa cho CelO và CelK thì chưa được biểu hiện thành công trên Bacillus subtilis. Tại Việt Nam, các nghiên cứu về tạo dòng gen mã hóa enzyme cellulase từ Clostridium thermocellum chưa nhiều và chủ yếu được thực hiện trên hệ thống Bacillus subtilis. Phạm Lương Thắng và cộng sự (2012) đã nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện endoglucanase A (CelA) từ Clostridium thermocellum vào các chủng Bacillus subtilis 1012 và WB800N. Nguyễn Hoàng Ngọc Phương cũng đã nghiên cứu đề tài tạo mini – cellulosome từ các protein tái tổ hợp của Clostridium thermocellum và biểu hiện trên hệ thống Bacillus subtilis. Hiện nay các nghiên cứu chỉ mới tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa enzyme cellulase từ Clostridium thermocellum trên các hệ thống E. coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae nhưng chưa có nghiên cứu nào sử dụng hệ thống biểu hiện Pichia pastoris. Vì thế, nghiên cứu dòng hóa và biểu hiện gen mã hóa cellulase từ Clostridium thermocellum trên hệ thống Pichia pastoris là một hướng nghiên cứu tiềm năng ở Việt Nam và trên thế giới. 18
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: 3.1.1. Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM. 3.1.2. Thời gian nghiên cứu: Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2014 đến tháng 7/2014. 3.2. Nguyên liệu 3.2.1. Chủng vi sinh vật Chủng vi khuẩn Clostridium thermocellum JCM 9322 có nguồn gốc từ hãng Riken, Nhật Bản. Chủng vi khuẩn Escherichia coli DH5훼 có nguồn gốc từ hãng Invitrogen, Hoa Kỳ được sử dụng làm thể nhận trong thí nghiệm biến nạp, chọn dòng và nhân dòng plasmid tái tổ hợp. Chủng nấm men Pichia pastoris GS115 có nguồn gốc từ hãng Invitrogen, Hoa Kỳ được dùng để biểu hiện gen mục tiêu. 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị: Máy Gel doc (BioRrad), máy li tâm lạnh Centrifuge 5810R (Eppendorf), máy luân nhiệt (BioRad), bộ điện di DNA (BioRad), máy đo quang phổ Biomate3 (Thermo EC), tủ ấm (Memmet), máy lắc ổn nhiệt, tủ lạnh -200C (Sanyo), tủ lạnh sâu -800C (Sanyo), tủ mát 40C (Alaska), cân phân tích (Prescisa), bộ điện biến nạp ECM399, tủ cấy cấp II. Dụng cụ: - Eppendorf 200 µl - Eppendorf 1500 µl - Pippetman với đầu típ tương ứng (1000 µl, 100 µl, 10 µl) - Đĩa petri nhựa, que cấy trang, đèn cồn - Falcon 50 ml 19
Đồ án tốt nghiệp 3.2.3. Hóa chất Hóa chất nhân dòng trong vector pJET1.2: Kit nhân dòng CloneJET™ PCR Cloning Kit. Hóa chất tách chiết plasmid: Kit tách chiết plasmid (Plasmid Mini Kit - Bioline). Hóa chất tinh sạch DNA từ gel agarose và sản phẩm PCR: Kit tinh sạch DNA từ gel agarose và sản phẩm PCR (MEGAquick – spin Total Fragment DNA Purification Kit – INTRON Biotechnololy). Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn: Các loại enzyme cắt giới hạn (New England BioLabs) được sử dụng : SnaBI với trình tự nhận biết: EcoRI với trình tự nhận biết: SacI với trình tự nhận biết: Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Các thành phần cần thiết cho phản ứng PCR được cung cấp bởi Thermo Scientific : Taq polymerase, dNTP, Taq buffer 10X. Hóa chất điện di DNA: - Agarose - TAE 1X: Tris acetate 40 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0. - Dung dịch nạp mẫu (loading dye): 0,25% bromophenol blue; 40% glycerol trong TAE 1X. - Ethium bromide 10 mg/ml. - Thang DNA 1 Kb: được cung cấp bởi Invitrogen. 20
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.1. Thang DNA 1 Kb (Nguồn: Invitrogen) Hóa chất tách chiết bộ gen nấm men - Nitơ lỏng - Lysis buffer (50 mM Tris HCl, 50 mM EDTA, 1% 훽-mercaptoethanol, 3% SDS, pH 8,0) - Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 : 1) - Isopropanol 100% - Ethanol 70% - Dung dịch TE (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) Hóa chất kiểm tra định tính hoạt tính enzyme endoglucanase - Tris – HCl 0,1M - Congo Red 1% - NaCl 1M - Acid acetic 5%. 21
Đồ án tốt nghiệp 3.2.4. Môi trường 3.2.4.1. Môi trường LB (Luria-Bertani): Tryptone 10 g Yeast extract 5 g NaCl 5 g Nước cất vừa đủ 1000 ml. Môi trường thạch có thành phần như môi trường lỏng, bổ sung thêm 2% agar. Kháng sinh dùng để chọn lọc là ampicillin được bổ sung vào môi trường với nồng độ cuối là 50 µg/ml. 3.2.4.2. Môi trường MD (Minimal Dextrose): Sorbitol 182 g Agar 20 g Bổ sung 800 ml nước. Hấp khử trùng ở 1210C, 15 phút. Sau đó bổ sung thêm các thành phần sau: YNB 10X 100 ml Biotin 500X 2 ml D – Glucose 10X 100 ml 3.2.4.3. Môi trường YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) Yeast extract 10 g Pepton 20 g Nước cất vừa đủ 900 ml. Hấp khử trùng 1210C, 15 phút. Bổ sung 100 ml D – Glucose 10X rồi lọc lại với màng lọc 0,2 µm. 3.2.4.4. Môi trường BMGY (Buffered Glycerol-complex): Yeast extract 10 g Peptone 20 g Nước cất 700 ml Hấp khử trùng ở 1210C. Bổ sung thêm các thành phần sau: 22
Đồ án tốt nghiệp Potassium photphate buffer 1M 100 ml YNB 10X 100 ml Glycerol 10X 100 ml Biotin 500X 2 ml 3.2.4.5. Môi trường BMMY (Buffered Methanol-complex) bổ sung CMC Yeast extract 10 g Peptone 20 g CMC 0,5% 5 g Agar 20 g Thêm 700 ml nước cất. Hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Bổ sung thêm các thành phần sau: Potassium photphate buffer 1M 100 ml YNB 10X 100 ml Methanol 10X 100 ml Biotin 500X 2 ml 3.2.5. Plasmid 3.2.5.1. Plasmid pJET1.2/blunt - Kích thước 2974 bp. - Mang gen kháng ampicillin dùng để chọn lọc tế bào tái tổ hợp - Mang gen gây độc eco47IR giúp chọn lọc khuẩn lạc mang gen chèn - Plasmid cho phép gắn chèn đoạn DNA ở dạng đầu bằng - Plasmid pJET1.2/blunt được sử dụng để nhân dòng. 23
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2. Plasmid pJET 1.2 (Nguồn : CloneJET™ PCR Cloning Kit #K1231, Fermentas) 3.2.5.2. Plasmid pPIC9K Plasmid pPIC9K (Invitrogen) dùng biểu hiện gen trong Pichia pastoris GS 115 có những đặc điểm sau: - Có trình tự tiết nhân tố 훼 giúp hỗ trợ tiết protein mục tiêu ra ngoài môi trường nên dễ thu nhận hơn so với các hệ thống biểu hiện khác protein của Pichia pastoris được tiết ra với hàm lượng rất thấp nên quá trình tinh sạch và thu nhận protein mục tiêu về sau rất dễ dàng. - Có gen mã hóa cho histidinol dehydrogenase giúp Pichia pastoris GS115 có khả năng tự tổng hợp histidine. - Có trình tự promoter AOX1 tương đồng với trình tự của AOX1 trong bộ gen của Pichia giúp chuyển trình tự gen mục tiêu vào bộ gen của tế bào. - Có chứa trình tự gen HIS4 để chọn lọc thể biến nạp ở P. pastoris khi sử dụng các chủng khuyết dưỡng histidine. - Có trình tự gen kháng ampicillin dùng để sang lọc tế bào E. coli tái tổ hợp. - Có gen kháng Kanamycin giúp Pichia pastoris kháng lại Geneticin dùng để chọn lọc tế bào P.pastoris tái tổ hợp, đồng thời xác định tương đối số bản sao của gen được chèn vào bộ gen tế bào dựa vào nồng độ Geneticin tế bào có khả năng kháng được (4 mg/ml tương ứng 7 – 12 bản sao). 24
Đồ án tốt nghiệp - Không có điểm khởi đầu sao chép của nấm men nên khi biến nạp vào trong tế bào mà plasmid không chèn vào bộ gen sẽ không tồn tại độc lập được trong tế bào. Đặc điểm này giúp bước sàng lọc tế bào mang gen mục tiêu đơn giản hơn. Khuẩn lạc nào mọc được trên môi trường có kháng sinh tức là đã có mang trình tự gen mục tiêu trong bộ gen tế bào. - Trình tự cắt duy nhất của NotI, BgIII, SacI và SalI dùng để làm thẳng vector trước khi chuyển vào tế bào Pichia và tạo dạng tái tổ hợp Mut+ (sử dụng methanol mạnh nên tăng sinh tốt trên môi trường có methanol) hoặc MutS (sử dụng methanol ít nên tăng sinh chậm trên môi trường có methanol). Hình 3.3. Plasmid pPIC9K (Nguồn: Invitrogen) 3.2.6. Các cặp mồi sử dụng Cặp mồi pJET1.2F và pJET1.2R được dùng để khuếch đại vùng trình tự có mang gen đã được nối vào plasmid pJET1.2. Cặp mồi CelDF và CelDR được sử dụng để khuếch đại đoạn DNA mã hóa cho đoạn gen CelD dựa trên trình tự gốc từ Genbank. Hai đoạn mồi này được thiết kế thêm vị trí cắt của hai enzyme cắt giới hạn là EcoRIvà SnaBI phù hợp với vị trí cắt của plasmid pPIC9K. Cặp mồi AOX1F và AOX1R được dùng để khuếch đại vùng trình tự có mang gen đã được nối vào của plasmid pPIC9K. 25
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Trình tự các cặp mồi được sử dụng ĐỘ TÊN MỒI TRÌNH TỰ MỒI (5’ – 3’) DÀI (NU) pJET1.2F CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC 23 pJET1.2R AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG 24 ATACGTAGCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTG CelDF 35 SnaBI AGAATTCTATTGGTAATTTCTCGATTACC CelDR 29 EcoRI AOX1F GACTGGTTCCAATTGACAAGC 21 AOX1R GCAAATGGCATTCTGACATCC 21 3.3. Phương pháp nghiên cứu: 3.3.1. Tạo dòng tế bào E. coli DH5휶 chứa plasmid mang gen CelD của Clostridium thermocellum 3.3.1.1. Thiết kế mồi Dựa vào trình tự gen CelD của Clostridium thermocellum từ ngân hàng gen NCBI, thiết kế cặp mồi CelDF/ CelDR để khuếch đại gen CelD kích thước 1824 bp. Hai đoạn mồi này được thiết kế thêm vị trí cắt của hai enzyme cắt giới hạn là EcoRI và SnaBI phù hợp với vị trí cắt của plasmid pPIC9K. Cặp mồi CelDF/ CelDR có trình tự như sau: CelDF: 5’- ATACGTAGCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTG-3’ SnaBI CelDR : 5’- AGAATTCTATTGGTAATTTCTCGATTACC-3’ EcoRI Sau khi thiết kế cặp mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR để khuếch đại đoạn gen CelD, tiến hành phản ứng PCR để thu nhận đoạn gen. 26
Đồ án tốt nghiệp 3.3.1.2. Thu nhận gen CelD của vi khuẩn C. thermocellum bằng phản ứng PCR dựa vào cặp mồi đã thiết kế Sử dụng DNA tổng số của C. thermocellum làm mạch khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại gen CelD với cặp mồi đặc hiệu CelDF và CelDR. Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl) Taq Buffer 10X 1X 2,5 dNTP 10 mM 0,2 mM 0,5 Mồi xuôi 10 µM 0,2 µM 0,5 Mồi ngược 10 µM 0,2 µM 0,5 DNA mạch khuôn - 0,5 Taq polymerase 5 U/µl 1 U 0,25 H2O - 20,25 Tổng thể tích 25 µl Thiết lập chu trình nhiệt độ: 950C 950C 720C 720C 5’ 30’’ 0 52 C 2’ 10’ 0 30’’ 4 C 30 chu kỳ ∞ Hình 3.4. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR 27
Đồ án tốt nghiệp Sản phẩm PCR sau khi kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2% sẽ được tinh sạch qua cột bằng bộ kit của INTRON để thu nhận đoạn gen CelD. 3.3.1.3. Quy trình tinh sạch gen theo MEGAquick – spin Total Fragment DNA Purification Kit – INTRON Biotechnololy - Cho mẫu vào eppendorf 1,5 ml. Thêm BNL Buffer theo tỉ lệ Buffer : mẫu là 5 : 1, vortex để hòa tan toàn bộ mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. - Chuyển mẫu vào màng lọc được đặt trong eppendorf mới, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng. - Thêm 700 μl dung dịch rửa vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng, tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để làm khô màng. Thực hiện bước này hai lần nếu sau đó sản phẩm được dùng cho phản ứng nối. - Chuyển màng lọc vào eppendorf mới. Thêm 40 μl Elution Buffer vào giữa màng, để yên 1 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút thu sản phẩm tinh sạch. Sau khi được tinh sạch, gen CelD được nối vào vector nhân dòng pJET1.2 để tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD. 3.3.1.4. Phương pháp ghép nối gen vào vector nhân dòng pJET1.2/ Blunt Đoạn gen CelD thu nhận từ phản ứng PCR được nối với plasmid nhân dòng đầu bằng pJET1.2 để tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD. Thực hiện phản ứng nối với thành phần trong bảng 3.3 và ủ ở nhiệt độ 220C trong 30 phút. 28
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3. Thành phần phản ứng nối gen CelD vào plasmid pJET1.2 Thành phần Thể tích (µl) 2X Reaction Buffer 10 DNA 1 (75 – 100 ng) DNA Blunting Enzyme 1 H2O 6 Vortex nhẹ rồi ủ ở 700C trong vòng 5 – 10 phút pJET1.2/blunt Cloning Vector (50 ng/µl) 1 T4 DNA Ligase (20000 U/ml) 1 Tổng thể tích 20 µl Sản phẩm nối CelD và plasmid pJET1.2 được biến nạp vào tế bào E. coli DH5훼 bằng phương pháp hóa biến nạp. 3.3.1.5. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5훼 khả nạp Thu tế bào E. coli phát triển ở pha log, ly tâm và huyền phù tế bào trong CaCl2. Màng tế bào vi khuẩn dưới tác động của hoá chất sẽ bị thay đổi trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ giúp cho các phân tử DNA có thể chui vào. Sau đó, các tế bào được phục hồi lại trên môi trường nuôi cấy và các thể biến nạp sẽ được phát hiện trên môi trường chọn lọc. Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp được tiến hành như sau: - Cấy một khuẩn lạc E. coli DH5α vào 3 ml môi trường LB, lắc 250 vòng/phút ở 370C qua đêm. 29
Đồ án tốt nghiệp - Chuyển 1 ml dịch nuôi cấy qua đêm vào 100 ml LB trong erlen 500 ml, ủ ở 0 37 C, lắc với tốc độ 250 vòng/phút cho tới khi OD600 của dịch nuôi cấy đạt khoảng 0,375 (không được để OD600 quá 0,4). - Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50 ml lạnh. Ngâm trong đá 5 – 10 phút. - Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 1600xg trong 7 phút ở 40C. Bỏ dịch nổi. - Hoà tan nhẹ nhàng tế bào thu được trong 10 ml CaCl2 100 mM lạnh. - Ly tâm 1100xg, 5 phút, 40C. Bỏ dịch nổi. Hòa tan tủa nhẹ nhàng trong 10 ml CaCl2 lạnh. Giữ phần tế bào đã hòa tan trong đá 30 phút. - Ly tâm 1100xg, 5 phút, 40C. Bỏ dịch nổi, hoà tan tủa trong 1,5 ml dung dịch CaCl2 100 mM lạnh, bổ sung thêm 0,75 ml glycerol 50%. - Chia 100 µl tế bào vào các tube 1,5 ml đã trữ lạnh trước. Bảo quản tế bào khả nạp trong tủ -800C, khi sử dụng rã đông các eppendorf chứa tế bào khả nạp trong bể đá. 3.3.1.6. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp hóa biến nạp Sản phẩm nối pJET1.2-CelD được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp. Quy trình hóa biến nạp: - 5 µl plasmid pJET1.2-CelD được trộn đều với 100 µl tế bào E. coli DH5α khả nạp. Ủ trong đá 30 phút, sau đó sốc nhiệt ở 420C trong 2 phút, tiếp tục ủ đá 10 phút. - Thêm vào 1 ml môi trường LB lỏng và tiến hành lắc 250 vòng/phút ở 370C trong 30 phút để phục hồi các tế bào E. coli DH5α. - Hút 100 µl dịch biến nạp trải trên đĩa petri chứa môi trường thạch LB có bổ sung kháng sinh ampicillin nồng độ 50 µg/ml. - Ly tâm 900 µl dịch còn lại ở 4000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi, thêm vào 100 µl nước vào hòa tan phần sinh khối kết tủa. 30
Đồ án tốt nghiệp - Hút toàn bộ dịch hòa tan trải trên đĩa petri chứa môi trường LB có bổ sung kháng sinh ampicillin nồng độ 50 µg/ml. Ủ đĩa ở 370C trong 14 – 16 giờ. Kiểm tra các khuẩn lạc phát triển trên đĩa. Thí nghiệm được thực hiện song song với đối chứng âm là tế bào E. coli DH5α không mang plasmid tái tổ hợp các gen mục tiêu. 3.3.1.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc Chọn ngẫu nhiên các dòng E. coli DH5α từ các khuẩn lạc mọc được trên môi trường kháng sinh, sau đó kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R để xác định các khuẩn lạc đó có chứa plasmid tái tổ hợp quan tâm. Nguyên tắc của kĩ thuật này dựa trên kĩ thuật PCR, trong đó plasmid tái tổ hợp từ khuẩn lạc sẽ dùng làm khuôn cho phản ứng PCR. Thực hiện phản ứng PCR theo chu trình nhiệt độ đã tối ưu trong hình 3.5 với các thành phần trong bảng 3.4. Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl) Buffer 10X 1X 2,5 dNTP 10 mM 0,2 mM 0,5 Mồi xuôi 10 µM 0,2 µM 0,5 Mồi ngược 10 µM 0,2 µM 0,5 Dịch huyền phù khuẩn lạc - 0,5 Taq polymerase 5 U/µl 1 U 0,25 H2O - 20,25 Tổng thể tích 25 µl 31
Đồ án tốt nghiệp 950C 950C 0 720C 720C 5’ 9530’’C 0 60 C 0 2’ 7210’C 40C 30’’ 30’’ 0 30 chu kỳ 4∞C Hình 3.5. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2 Kiểm tra sản phẩm PCR khuẩn lạc bằng điện di trên gel agarose 1,2%. Từ kết quả PCR, chọn những dòng có khả năng mang plasmid tái tổ hợp để tách plasmid và cắt kiểm tra với hai enzyme EcoRI và SnaBI. Sau khi kiểm tra các dòng E. coli DH5α tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn, chọn một số dòng cho sản phẩm cắt phù hợp để giải trình tự với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R. 3.3.1.8. Phương pháp tách chiết plasmid từ tế bào E. coli Sử dụng bộ kit Plasmid Mini Kit của Bioline để tách plasmid. Quy trình tách chiết như sau: - Nuôi cấy khuẩn lạc trong trong 5 ml môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút 0 ở 37 C cho đến khi OD600 đạt 1 – 1,5. - Dịch huyền phù được ly tâm 13000 vòng/phút ở 160C trong 30 giây, thu sinh khối, loại bỏ dịch nổi. - Thêm vào 420 μl Resuspension Buffer, vortex mạnh để hòa tan sinh khối. Chuyển toàn bộ dịch vào eppendorf 1,5 ml. - Thêm 420 μl Lysis Buffer để ly giải tế bào. Đóng nắp và đảo eppendorf nhiều lần. Chú ý không được vortex, thời gian thực hiện bước này không được quá 5 phút. - Thêm 500 μl Neutralization buffer và đảo eppendorf nhiều lần. Dung dịch sẽ trở nên đục và kết tủa. Sau đó ủ trong đá lạnh 5 phút. 32
Đồ án tốt nghiệp - Ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút, thu dịch nổi chuyển vào màng lọc được đặt trong eppendorf mới. - Ly tâm 13000 vòng/phút trong 60 giây, bỏ dịch, thu phần phía trên màng lọc. Thêm 700 μl Washing buffer và ly tâm 13000 vòng/phút trong 60 giây. Đổ bỏ dịch bên dưới, thu phần trên màng. - Làm khô màng bằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 60 giây. Chuyển màng lọc vào eppendorf mới và ủ ở 500C, thêm 30 – 50 μl Elution buffer vào giữa màng, để yên 1 phút. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 60 giây để thu plasmid. 3.3.1.9. Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn Để xác định chính xác DNA ngoại lai đã được chèn vào vector mong muốn, plasmid mang gen tái tổ hợp được cắt bằng enzyme giới hạn để kiểm tra Các vị trí cắt giới hạn của hai enzyme cắt SnaBI và EcoRI được thiết kế ở hai đầu các cặp mồi khuếch đại gen CelD nên phản ứng cắt plasmid tổng số với hai enzyme cắt vừa được sử dụng trong quá trình sàng lọc dòng E. coli DH5α tái tổ hợp vừa được sử dụng trong quá trình tạo vector biểu hiện mang gen mục tiêu. Phản ứng cắt DNA bằng enzyme SnaBI và EcoRI để kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen CelD gồm các thành phần trong bảng 3.5. Bảng 3.5. Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-CelD với SnaBI và EcoRI Thành phần Thể tích (µl) Buffer CutSmart 10X 2 pJET1.2-CelD 1 µg SnaBI (5000 U/ml) 0,4 EcoRI (20000 U/ml) 0,5 H2O vừa đủ 20 µl 33
Đồ án tốt nghiệp Phản ứng cắt được thực hiện ở 370C trong 3 giờ. Bất hoạt enzyme ở 800C trong 20 phút. Sau đó tiến hành kiểm tra sản phẩm cắt bằng điện di trên gel agarose. Chọn lọc dòng E. coli DH5α mang plasmid pJET1.2-CelD tiến hành giải trình tự kiểm tra trình tự gen mục tiêu. 3.3.1.10. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự tương ứng trên ngân hàng Gen Plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD sau khi được kiểm tra bằng phản ứng PCR và phản ứng cắt sẽ được giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R. Kết quả giải trình tự gen được phân tích trên máy tính bằng phần mềm Genetyx, blast trên NCBI để so sánh và phân tích sự tương đồng của trình tự này với trình tự gen CelD đã được công bố trên ngân hàng Gen. 3.3.2. Tạo dòng tế bào E. coli DH5휶 chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD Gen mã hóa CelD thu nhận từ vector nhân dòng pJET1.2-CelD bằng phản ứng cắt giới hạn với hai enzyme EcoRI và SnaBI. Sản phẩm cắt được điện di và tinh sạch từ gel agarose 0,8% để tiến hành thu nhận gen, chuẩn bị cho giai đoạn gắn chèn vào vector biểu hiện pPIC9K. Plasmid pPIC9K cũng được cắt bởi enzyme EcoRI và SnaBI, sau đó được nối với gen CelD bằng T4 DNA ligase để thu được plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD. Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp tương tự như đối với vector pJET1.2. 3.3.2.1 Chuẩn bị dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn Plasmid pJET1.2-CelD được cắt với hai enzyme EcoRI và SnaBI để thu nhận đoạn gen CelD, vector biểu hiện pPIC9K được cắt mở vòng cũng với hai enzyme trên. 34
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid pPIC9K và pJET1.2-CelD với SnaBI và EcoRI Thành phần pPIC9K CelD Buffer CutSmart 10X 20 µl 20 µl pPIC9K 10 µg - Plasmid pJET1.2-CelD - 10 µg SnaBI (5000 U/ml) 4 µl 4 µl EcoRI (20000 U/ml) 5 µl 5 µl H2O vừa đủ 200 µl vừa đủ 200 µl Phản ứng cắt được thực hiện ở 370C trong 3 giờ. Bất hoạt enzyme ở 800C trong 20 phút. Sản phẩm cắt được tinh sạch qua cột. Sau đó, nối gen CelD vào plasmid biểu hiện pPIC9K đã cắt mở vòng để tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD. 3.3.2.2. Quy trình tinh sạch gen và plasmid theo MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction System – INTRON - Cho mẫu vào eppendorf 1,5 ml. Thêm BNL Buffer theo tỉ lệ Buffer : mẫu là 5:1, vortex để hòa tan toàn bộ mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. - Chuyển mẫu vào màng lọc được đặt trong eppendorf mới, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng. - Thêm 700 μl Washing Buffer vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng, tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để làm khô màng. Thực hiện bước này hai lần nếu sau đó sản phẩm được dùng cho phản ứng nối. 35
Đồ án tốt nghiệp - Chuyển màng lọc vào eppendorf mới. Thêm 40 μl Elution Buffer vào giữa màng, để yên 1 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút thu sản phẩm tinh sạch 3.3.2.3. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD Sau khi tinh sạch, đoạn gen CelD được nối vào vector biểu hiện pPIC9K đã mở vòng bằng T4 DNA ligase. Nồng độ của đoạn DNA cần nối và vector đã cắt mở vòng tương ứng theo tỷ lệ 3:1 để tạo thành plasmid tái tổ hợp. Hỗn hợp phản ứng nối được ủ ở 220C trong 2 giờ. Sau khi nối, tiến hành biến nạp plasmid mang gen mục tiêu vào tế bào E. coli DH5α khả nạp bằng phương pháp hóa biến nạp. Bảng 3.7. Thành phần phản ứng nối gen CelD vào vector biểu hiện pPIC9K Thành phần phản ứng Nồng độ phản ứng Thể tích (µl) T4 DNA ligase buffer 10X 1X 2 T4 DNA ligase (20000 U/ml) 20 U 1 pPIC9K 200 ng - CelD 118 ng - H2O - vừa đủ 20 µl 3.3.2.4. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5훼 khả nạp Tế bào khả nạp được chuẩn bị như trong mục 3.3.1.5. 3.3.2.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD vào E. coli DH5훼 Biến nạp được thực hiện như mục 3.3.1.6. Thí nghiệm được thực hiện song song với đối chứng âm là tế bào E. coli DH5α không mang plasmid tái tổ hợp các gen mục tiêu. Mẫu đối chứng dương là tế bào E. coli DH5α chứa vector pPIC9K và không có đoạn chèn CelD. Tế bào sau khi biến nạp được trải trên môi trường đĩa thạch LB chứa 50 µg/ml ampicillin và ủ ở 370C trong 16 giờ. 36
Đồ án tốt nghiệp 3.3.2.6. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng PCR khuẩn lạc Chọn lọc ngẫu nhiên các khuẩn lạc sinh trưởng được trên môi trường kháng sinh và kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/AOX1R. Cặp mồi AOX1F/AOX1R cho phép xác định vector biểu hiện pPIC9K có mang đoạn gen chèn CelD. Thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc tương tự mục 3.3.1.7 với chu trình nhiệt độ như hình 3.6. 950C 950C 0 720C 720C 5’ 9530’’C 0 54 C 0 2’30’’ 7210’C 40C 30’’ 30’’ ∞0 30 chu kỳ 4 C Hình 3.6. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc vớ i cặp mồi AOX1F/ AOX1R 3.3.2.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn Các khuẩn lạc cho kết quả dương tính khi thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/ AOX1R được nuôi cấy để tách plasmid như mục 3.3.1.8. và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn với SnaBI và EcoRI. Sau đó chọn ra một dòng E. coli DH5α mang plasmid pPIC9K-CelD để giải trình tự kiểm tra trình tự gen mục tiêu. 37
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.8. Thành phần phản ứng cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI Thành phần Thể tích (µl) Buffer CutSmart 10X 2 pPIC9K-CelD 1 µg SnaBI (5000 U/ml) 0,4 EcoRI (20000 U/ml) 0,5 H2O vừa đủ 20 µl 3.3.2.8. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự tương ứng trên ngân hàng Gen Plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD sau khi được kiểm tra bằng phản ứng PCR khuẩn lạc và phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn sẽ chọn ra một dòng E. coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD gửi đi giải trình tự để kiểm tra trình tự gen mục tiêu đồng thời chuẩn bị cho thí nghiệm biến nạp vector biểu hiện vào Pichia pastoris. 3.3.3. Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 mang gen mã hóa enzyme endoglucanase D Plasmid pPIC9K-CelD được thu nhận từ các dòng E. coli DH5α tái tổ hợp đã qua kiểm tra được làm thẳng bằng enzyme cắt giới hạn SacI để tăng khả năng trao đổi chéo giữa plasmid và bộ gen của tế bào nấm men, cũng như để tạo được chủng P. pastoris tái tổ hợp dạng Mut+. Plasmid pPIC9K-CelD dạng thẳng được chuyển vào tế bào P. pastoris GS115 bằng phương pháp điện biến nạp. Do có sự tương đồng giữa trình tự gen mã hóa cho histidinol dehydrogenase trên bộ gen của tế bào P. pastoris và trên plasmid nên xảy ra tái tổ hợp tương đồng, dẫn đến việc gen mục tiêu từ plasmid được chuyển nạp vào trong bộ gen của tế bào Pichia pastoris. 38
Đồ án tốt nghiệp 3.3.3.1. Chuẩn bị tế bào Pichia pastoris GS115 khả nạp - Tăng sinh một khuẩn lạc Pichia pastoris trong 5 ml môi trường YPD, lắc 250 vòng/phút ở 280C qua đêm. - Lấy 0,1 – 0,5 ml dịch tế bào cho vào 50 ml môi trường YPD trong erlen 2 lít. Nuôi cấy như trên với điều kiện qua đêm cho đến khi OD600 nm = 1,3 – 1,5. - Ly tâm 1500xg trong 5 phút và ở 40C để thu tế bào. Sau đó huyền phù cặn tế bào với 50 ml nước lạnh vô trùng. - Ly tâm tương tự bước trên. Bỏ dịch nổi .Sau đó huyền phù cặn tế bào với 25 ml nước lạnh vô trùng. - Ly tâm 1500xg trong 5 phút. Bỏ dịch nổi. Huyền phù tế bào trong 20 ml sorbitol 1M lạnh. - Ly tâm như trên, huyền phù cặn tế bào trong 1 ml sorbitol 1M lạnh cho 1,5 ml. Sau đó hút 80 µl dịch tế bào nấm men khả nạp ra các eppendorf. Nên dùng ngay vì hiệu suất sẽ giảm đáng kể khi giữ ở -800C. 3.3.3.2. Phương pháp điện biến nạp Quy trình điện biến nạp: - Trộn 80 µl tế bào P. pastoris khả nạp với 10 – 15 µg plasmid đã được làm thẳng bằng enzyme cắt giới hạn (trong 5 – 10 µl buffer TE). Chuyển vào cuvette 0,2 cm đã được giữ trong đá lạnh trước. Tiếp tục ủ trong đá lạnh 5 phút. - Thực hiện điện biến nạp ở hiệu điện thế 1500V trong 5 giây bằng bộ điện biến nạp ECM399. - Thêm nhanh chóng 1 ml sorbitol 1M vào cuvette biến nạp. Chuyển dịch tế bào sang một eppendorf mới vô trùng. - Trải 200 µl dịch tế bào đã biến nạp trên môi trường MD. Ủ đĩa ở 280C cho đến khi khuẩn lạc xuất hiện. (khoảng từ 3 – 5 ngày). - Các plasmid dạng vòng (phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn chưa hoàn toàn) sẽ không tồn tại được trong tế bào nấm men do plasmid pPIC9K được thiết kế không có trình tự khởi đầu sao chép của nấm men. Ngoài ra chỉ có những tế bào 39
Đồ án tốt nghiệp nấm men P. pastoris biến nạp thành công mới có khả năng tự tổng hợp histidine vả phát triển trên môi trường MD. Vì vậy chỉ có những tế bào có sự sáp nhập thành công giữa plasmid và bộ gen của nấm men thì gen mục tiêu mới tồn tại ổn định trong tế bào, đồng thời có khả năng kháng lại kháng sinh geneticin (G418). 3.3.3.3. Chọn lọc các dòng Pichia pastoris mang nhiều bản sao của gen CelD và có khả năng năng tiết enzyme ngoại bào Endoglucanase D Do vector pPIC9K có chứa gen kháng G418 nên các dòng tế bào P. patoris có mang gen CelD sẽ phát triển được trên môi trường YPD có kháng sinh G418. Các khuẩn lạc thu nhận được trên môi trường YPD có nồng độ kháng sinh G418 là 4 mg/ml tương ứng có khoảng 7 – 12 bản sao của gen mục tiêu. Tiến hành sàng lọc các dòng P. pastoris tái tổ hợp trên các nồng độ kháng sinh 0,25 – 4 mg/ml. Chọn một số dòng P. pastoris có thể mọc trên môi trường chứa nồng độ kháng sinh cao nhất, tách chiết DNA và kiểm tra sự sát nhập gen CelD vào bộ gen của nấm men bằng PCR với cặp mồi AOX1F/AOX1R, đồng thời phân tích định tính khả năng phân hủy cellulose của các P. pastoris tái tổ hợp trong thí nghiệm tiếp theo. 3.3.3.4. Phương pháp ly trích DNA tổng số Quy trình ly trích DNA dựa trên quy trình ly trích của Lee và Taylor (1990). - Chọn lọc 1 số dòng Pichia pastoris phát triển được trên môi trường YPD chứa 4 mg/ ml G418 tăng sinh trong BMGY lỏng qua đêm ở 280C để ly trích DNA tổng số. - Sinh khối nấm men được nghiền trong eppendorf với nitơ lỏng đến khi mịn. Đối với những ống chưa sử dụng ngay được giữ ở -800C. - Cho 600 µl Lysis buffer 2X vào eppendorf có chứa sinh khối nấm, vortex mạnh cho đến khi tạo huyền phù đồng nhất, giúp cho việc phá vỡ tế bào được tốt hơn. - Ủ ở 650C trong 1 giờ, cứ 20 phút đảo mẫu một lần. 40
Đồ án tốt nghiệp - Cho 450 µl Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 : 1) vào đảo đều, để 5 phút ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 rpm ở 40C trong 5 phút. - Thu dịch nổi (300 – 400 µl) cho vào eppedorf mới. Cho 180 – 240 µl isopropanol lạnh vào (nồng độ 100%, đảm bảo thể tích isopropanol gấp 0,6 lần dịch nổi), lắc mạnh rồi ủ ở tủ -200C trong 20 phút. Ly tâm 13000 rpm, 7 phút ở 40C. Tiến hành thu tủa, bỏ dịch nổi. - Cho 300 – 400 µl ethanol 70% vào eppendorf rửa tủa. Vortex nhẹ và ly tâm 13000 rpm , 7 phút ở 40C. Tiến hành rửa tủa lặp lại 2 lần. - Để khô tự nhiên, cho khoảng 30 – 50 µl TE buffer vào, trộn nhẹ và bảo quản ở -200C. - Sản phẩm DNA tổng số được kiểm tra kết quả bằng cách điện di trên gel 0,8%. 3.3.3.5. Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng phương pháp PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R Nhằm kiểm tra khả năng sát nhập của vector tái tổ hợp chứa gen CelD vào bộ gen của nấm men, các dòng nấm men tái tổ hợp mọc trên môi trường YPD có nồng độ kháng sinh G418 là 4 mg/ml được tăng sinh trong môi trường BMGY ở 280C qua đêm để tách chiết DNA bộ gen, sau đó thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi AOX1F/AOX1 theo thành phần trong bảng 3.2 và chu trình nhiệt độ đã tối ưu trong hình 3.7. 950C 950C 720C 720C 5’ 30’’ 0 54 C 2’30’’ 10’ 0 30’’ 4 C ∞ 30 chu kỳ Hình 3.7. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R 41
Đồ án tốt nghiệp 3.3.5. Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P. pastoris tái tổ hợp Các dòng nấm men tái tổ hợp phát triển trên nồng độ kháng sinh cao nhất được tăng sinh trong môi trường BMGY. Sau đó các dòng tế bào này được sàng lọc biểu hiện trên đĩa thạch môi trường BMMY có bổ sung 0,5% cơ chất Carboxymethyl Cellulose (CMC), ủ ở 280C trong 72 giờ. Các dòng có khả năng sinh enzyme cellulase sẽ phân hủy được CMC và tạo vòng phân giải khi nhuộm với thuốc nhuộm đỏ Congo. So sánh vòng phân giải của các chủng Pichia pastoris tái tổ hợp. Quy trình nhuộm thuốc đỏ Congo theo Nakazawa, H. và cộng sự (2008): - Các đĩa nuôi cấy được rửa bằng 2 – 3 ml Tris – HCl 0,1M, pH 8,0. - Nhỏ 2 ml thuốc nhuộm đỏ Congo 1% lên đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. - Rửa thuốc nhuộm bằng 5 – 7 ml NaCl 1M. - Rửa lần cuối bằng dung dịch acid acetic 5% và quan sát vòng phân giải. Những đĩa có xuất hiện vòng phân giải chứng tỏ dòng đó có tiết endoglucanase có hoạt tính. - Đối chứng âm là chủng Pichia pastoris không chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD. Từ kết quả so sánh đường kính vòng phân giải, chọn ra những chủng có khả năng tiết enzyme cellulase ngoại bào mạnh để nghiên cứu biểu hiện và xác định hoạt tính endoglucanase của các dòng này. Xử lí số liệu: các dữ liệu được xử lý thống kê ANOVA với mức ý nghĩa 95% bằng phầm mềm Statgraphic 7.0. 42
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tạo dòng tế bào E. coli DH5휶 chứa plasmid mang gen CelD của Clostridium thermocellum 4.1.1. Khuếch đại gen CelD bằng kĩ thuật PCR Dựa vào trình tự gen CelD trên ngân hàng gen, thiết kế cặp mồi đặc hiệu CelDF và CelDR để khuếch đại đoạn gen. Cặp mồi được thiết kế thêm vào trình tự cắt đặc hiệu của hai enzyme giới hạn là SnaBI và EcoRI nên khi xử lý bằng hai enzyme này sẽ cho ra đoạn DNA một đầu bằng và một đầu so le. Đây là cơ sở tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình ghép nối và tạo khung dịch mã đúng trong quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp sau này. DNA tổng số được sử dụng làm mạch khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR dùng cho gen CelD. Hình 4.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen CelD Giếng 1 – 3: sản phẩm khuếch đại đoạn gen CelD bằng phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR; N: đối chứng âm; M: thang DNA 1 Kb 43
Đồ án tốt nghiệp Theo NCBI, gen mã hóa cho CelD của Clostridium thermocellum có kích thước 2286 bp (mã số GenBank là X04584.1). Tuy nhiên, cặp mồi được thiết kế chỉ để khuếch đại đoạn gen có kích thước 1824 bp (từ vị trí 324 đến 2147) mã hóa peptide có hoạt tính. Kết quả điện di sản phẩm PCR ở hình 4.1 cho thấy giếng 1, 2, 3 hiện các vạch có kích thước khoảng 1800 bp, phù hợp với kích thước của gen mục tiêu tại vị trí mồi bắt cặp, đồng thời đối chứng âm không hiện vạch. Như vậy đoạn gen CelD đã được khuếch đại thành công bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR này hoàn toàn đạt yêu cầu làm nguyên liệu cho thí nghiệm nhân dòng gen tiếp theo. 4.1.2. Tạo dòng E. coli mang plasmid nhân dòng chứa gen CelD Đoạn gen CelD sau khi tinh sạch qua cột sẽ được nối với vector nhân dòng pJET1.2 nhờ enzyme nối T4 DNA ligase. Sản phẩm nối pJET1.2-CelD được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5훼 bằng phương pháp hóa biến nạp. Các chủng biến nạp mang gen mục tiêu được sàng lọc trên môi trường thạch LB có bổ sung ampicillin (50 µg/ml) ở 370C qua đêm. Thí nghiệm được thực hiện song song với đối chứng âm là tế bào E. coli DH5α không mang plasmid tái tổ hợp. Kết quả thu nhận được trên đĩa biến nạp các khuẩn lạc như hình 4.2. A B Hình 4.2. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5훼 chứa plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD trên môi trường LB/ Ampicillin (50µg/ml) A: Đĩa đối chứng âm; B: Đĩa biến nạp 44
Đồ án tốt nghiệp Do plasmid pJET1.2 có chứa gen kháng kháng sinh ampicillin nên chỉ tế bào E. coli DH5훼 mang vector này mới có thể sinh trưởng trên môi trường LB có bổ sung ampicillin. Bên cạnh đó, vector pJET1.2/blunt mang gen gây độc eco47IR nên nếu tự đóng vòng sẽ biểu hiện enzyme giới hạn gây chết sau khi biến nạp và không nhân lên được. Vì vậy chỉ có các dòng tế bào E. coli DH5훼 chứa plasmid tái tổ hợp mới sinh trưởng trên đĩa môi trường LB có bổ sung ampicillin. 4.1.3. Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc Đoạn gen CelD sau khi chèn vào plasmid pJET1.2 được biến nạp vào E. coli DH5훼. Để khẳng định các thể biến nạp thu được chứa plasmid tái tổ hợp, tiến hành chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc sinh trưởng trên môi trường đĩa thạch LB/ampicillin và thực hiện phản ứng PCR các khuẩn lạc bằng cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R. Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli DH5α/pJET1.2-CelD với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R Giếng 1 – 6: E. coli DH5α /pJET1.2-CelD (E1 – E6); M: thang DNA;N: Đối chứng âm 45
Đồ án tốt nghiệp Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R cho thấy từ giếng 1 đến giếng 6 đều cho vạch có kích thước khoảng 2000 bp. Kích thước này tương ứng với tổng kích thước lý thuyết của gen CelD khi chèn vào plasmid pJET1.2. Để chắc chắn, chọn lọc ngẫu nhiên một số dòng E. coli DH5α tách chiết plasmid, kiểm tra bằng phương pháp PCR, enzyme cắt giới hạn và giải trình tự. 4.1.4. Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR và enzyme cắt giới hạn Ba dòng tế bào E. coli DH5α cho đúng kích thước mục tiêu ở trên được chọn ngẫu nhiên và tăng sinh qua đêm trong môi trường LB lỏng để tách chiết plasmid và thực hiện kiểm tra bằng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR, cắt với hai enzyme cắt giới hạn SnaBI và EcoRI nhằm xác định các dòng E. coli DH5α mang gen CelD. Vị trí cắt của hai enzyme này được thiết kế ở đầu 5’ của hai cặp mồi khuếch đại các gen mục tiêu. Những dòng tế bào có plasmid pJET1.2-CelD sẽ bị cắt thành hai đoạn có kích thước tương ứng với kích thước của plasmid pJET1.2 (2974 bp) và của gen CelD (1824 bp). Chọn một dòng gửi giải trình tự và tiến hành chuyển gen mục tiêu sang vector biểu hiện. 46
Đồ án tốt nghiệp Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm của cắt plasmid pJET1.2 – CelD bằng enzyme SnaBI và EcoRI và sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR Giếng 1 - 3: plasmid pJET1.2-CelD cắt bằng SnaBI vả EcoRI (E1 – E3); giếng 4 – 6: sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi CelDF/ CelDR; 7: sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi pJET1.2F/ pJET1.2R; M: thang chuẩn DNA 1 Kb; N: đối chứng âm. Kết quả điện di sản phẩm cắt các plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD bằng enzyme SnaBI và EcoRI ở giếng 1, 2, 3 tương ứng với các dòng E. coli DH5α E1, E2, E3 đều cho hai vạch rõ nét. Một vạch có kích thước khoảng 3000 bp tương ứng với kích thước lý thuyết của plasmid pJET1.2 khi mở vòng (2974 bp) và một vạch có kích thước khoảng 1800 bp tương ứng với kích thước của gen CelD là 1824 bp. Bên cạnh đó giếng 4, 5, 6 là sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với cặp mồi đặc hiệu của đoạn gen, cho các cho vạch có kích thước khoảng 1800 bp so với thang chuẩn tương ứng với kích thước của đoạn gen CelD là 1824 bp. Vạch này thấp hơn vạch điện di sản phẩm PCR plasmid pJET1.2-CelD với cặp mồi pJET1.2R/ pJET1.2R là 2000 bp ở giếng 7. Dựa vào kết quả điện di, nhận thấy phản 47
Đồ án tốt nghiệp ứng cắt hoàn toàn bình thường, hiệu suất cắt của cả hai enzyme đều tốt, tất cả các plasmid đã được cắt hoàn toàn và đưa về dạng mạch thẳng, di chuyển cùng với vị trí của thang tương ứng với kích thước của nó. Như vậy, các dòng E. coli DH5α E1, E2, E3 có khả năng chứa plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD. 4.1.5. Kiểm tra dòng tế bào E. coli DH5휶 chứa plasmid pJET1.2-CelD bằng giải trình tự Trong quá trình tiến hành kĩ thuật PCR, sai sót có thể xảy ra, đặc biệt là sự thay đổi nucleotide trong gen CelD. Những sai sót này có thể nhỏ nhưng lại ảnh hưởng lớn đến kết quả biểu hiện gen. Sự thay thế nucleotide không mong muốn có thể tạo ra một trình tự mã kết thúc. Sự mất hay thêm nucleotide dẫn đến sai cấu trúc dịch mã tạo ra protein không chính xác. Chính vì vậy, từ kết quả sàng lọc bằng PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R và kiểm tra bằng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR cũng như phản ứng cắt giới hạn với hai enzyme SnaBI và EcoRI, chọn ra dòng E. coli DH5α E2 gửi đi giải trình tự bằng cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R tại công ty Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả giải trình tự được xử lý bằng phần mềm Genetyx, xác định được khoảng 600 nucleotide của trình tự cần biết trong plasmid pJET1.2. Khi blast trình tự DNA này lên NCBI, nhận thấy trình tự này có sự tương đồng 99% với trình tự có mã số X04584.1 được công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen CelD trong plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với trình tự có mã số X04584.1 bằng công cụ BLAST của NCBI. Query 4 GCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTGATTCACGAATCCGTTTAAACTCAATAGGTTTT 63 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 324 GCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTGATTCACGAATCCGTTTAAACTCAATAGGTTTT 383 Query 64 ATACCGAACCACAGCAAAAAGGCGACTATAGCTGCAAATTGTTCAACCTTTTATGTTGTT 123 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 384 ATACCGAACCACAGCAAAAAGGCGACTATAGCTGCAAATTGTTCAACCTTTTATGTTGTT 443 Query 124 AAAGAAGACGGAACAATAGTGTATACCGGAACGGCAACTTCAATGTTTGACAATGATACA 183 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 444 AAAGAAGACGGAACAATAGTGTATACCGGAACGGCAACTTCAATGTTTGACAATGATACA 503 48
Đồ án tốt nghiệp Query 184 AAAGAAACTGTTTATATTGCTGATTT 209 |||||||||||||||||||||||||| Sbjct 504 AAAGAAACTGTTTATATTGCTGATTT 529 Query 1 AGACAGACTATGATACTTCAGGTTGCGAACAAGATTTCACCCAACAATGATTATGTAAAT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1593 AGACAGACTATGATACTTCAGGTTGCGAACAAGATTTCACCCAACAATGATTATGTAAAT 1652 Query 61 GCTGCTCTCGATGCGATTTCACATGTATTTGGAAGAAACTATTACAACAGGTCTTATGTA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1653 GCTGCTCTCGATGCGATTTCACATGTATTTGGAAGAAACTATTACAACAGGTCTTATGTA 1712 Query 121 ACAGGCCTTGGTATAAATCCTCCTATGAATCCTCATGACAGACGTTCAGGGGCTGACGGA 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1713 ACAGGCCTTGGTATAAATCCTCCTATGAATCCTCATGACAGACGTTCAGGGGCTGACGGA 1772 Query 181 ATATGGGAGCCGTGGCCCGGTTACCTTGTAGGAGGAGGATGGCCCGGACCGAAGGATTGG 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1773 ATATGGGAGCCGTGGCCCGGTTACCTTGTAGGAGGAGGATGGCCCGGACCGAAGGATTGG 1832 Query 241 GTGGATATTCAGGACAGTTATCAGACCAATGAAATTGCTATAAACTGGAATGCGGCATTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1833 GTGGATATTCAGGACAGTTATCAGACCAATGAAATTGCTATAAACTGGAATGCGGCATTG 1892 Query 301 ATTTATGCCCTTGCCGGATTTGTCAACTATAATTCTGCTCAAAATGAAGTACTGTACGGA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| Sbjct 1893 ATTTATGCCCTTGCCGGATTTGTCAACTATAATTCTCCTCAAAATGAAGTACTGTACGGA 1952 Query 361 GATGTGAATGATGACGGAAAAGTAAACTCCACTGACTTGACTTTGTTAAAAAGATATGTT 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1953 GATGTGAATGATGACGGAAAAGTAAACTCCACTGACTTGACTTTGTTAAAAAGATATGTT 2012 Query 421 CTTAAAGCCGTCTCA 435 ||||||||||||||| Sbjct 2013 CTTAAAGCCGTCTCA 2027 Trình tự thu nhận được của gen CelD trong plasmid pJET1.2 được xử lý bằng phần mềm DNAClub để chuyển từ trình tự nucleotide sang trình tự amino acid. Khi blast trình tự amio acid này lên NCBI, nhận thấy trình tự protein này tương đồng 100% với trình tự đã công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI. Query 2 AKITENYQFDSRIRLNSIGFIPNHSKKATIAANCSTFYVVKEDGTIVYTGTATSMFDNDT 61 Sbjct 42 AKITENYQFDSRIRLNSIGFIPNHSKKATIAANCSTFYVVKEDGTIVYTGTATSMFDNDT 101 Query 62 KETVYIAD 69 Sbjct 102 KETVYIAD 109 Query 1 RQTMILQVANKISPNNDYVNAALDAISHVFGRNYYNRSYVTGLGINPPMNPHDRRSGADG 60 Sbjct 465 RQTMILQVANKISPNNDYVNAALDAISHVFGRNYYNRSYVTGLGINPPMNPHDRRSGADG 524 Query 61 IWEPWPGYLVGGGWPGPKDWVDIQDSYQTNEIAINWNAALIYALAGFVNYNSAQNEVLYG 120 Sbjct 525 IWEPWPGYLVGGGWPGPKDWVDIQDSYQTNEIAINWNAALIYALAGFVNYNSAQNEVLYG 584 Query 121 DVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVS 145 Sbjct 585 DVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVS 609 49
Đồ án tốt nghiệp Do đoạn gen có kích thước 1824 bp trong khi giải trình tự chỉ có thể giải được khoảng 1200 bp nên không thể giải toàn bộ trình tự của đoạn gen CelD. Tuy nhiên, dựa vào trình tự đã biết có thể kết luận rằng đã thu nhận thành công đoạn gen mã hóa cho enzyme endoglucanase D từ Clostridium thermocellum và nhân dòng thành công gen CelD trong vector pJET1.2. Từ đó, tiến hành tạo dòng vào E. coli DH5α thông qua vector biểu hiện pPIC9K. 4.2. Tạo dòng tế bào E. coli DH5훂 chứa plasmid pPIC9K mang gen CelD Sau khi kiểm tra bằng phương pháp giải trình tự, plasmid pJET1.2 tái tổ hợp của dòng E2 và plasmid pPIC9K được cắt với enzyme cắt giới hạn là SnaBI và EcoRI. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó tiến hành thu nhận đoạn gen trực tiếp từ gel điện di để loại bỏ các sản phẩm phụ không mong muốn đồng thời để hạn chế sự thất thoát, tăng hiệu suất thu nhận gen. Tiến hành nối vector pPIC9K với gen mục tiêu bằng T4 DNA ligase ở 160C qua đêm để tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD. Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α khả nạp bằng phương pháp hóa biến nạp. 4.2.1. Sàng lọc các dòng E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp pPIC9K-CelD Các chủng biến nạp mang gen mục tiêu được sàng lọc trên môi trường LB đĩa thạch có chứa ampicillin (50 μg/ml). Do plasmid pPIC9K có mang gen kháng kháng sinh ampicillin nên chỉ những tế bào E. coli DH5α có mang plasmid này mới sinh trưởng được trên môi trường này. Thí nghiệm được thực hiện song song với mẫu đối chứng âm là tế bào E. coli DH5α không mang plasmid tái tổ hợp gen mục tiêu và mẫu đối chứng dương là tế bào E. coli DH5α chứa vector pPIC9K đã cắt mở vòng và không có đoạn gen chèn CelD. 50
Đồ án tốt nghiệp A B C Hình 4.5. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5훼 chứa pPIC9K – CelD bằng môi trường đĩa thạch LB/ ampicillin (50 µg/ml) A. Đĩa đối chứng âm; B. Đĩa đối chứng dương; C. Đĩa biến nạp Kết quả cho thấy, sau khoảng 16 giờ nuôi cấy trên đĩa thạch, đĩa đối chứng âm không xuất hiện khuẩn lạc vì đây là đĩa chứa các tế bào E. coli DH5훼 không được biến nạp vector pPIC9K nên không có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa ampicillin. Đĩa đối chứng dương xuất hiện một vài khuẩn lạc trên đĩa. Nguyên nhân là do phản ứng cắt vector pPIC9K bằng enzyme cắt giới hạn chưa hoàn toàn nên những tế bào E. coli DH5α chứa vector pPIC9K dạng vòng sẽ có khả năng kháng kháng sinh và phát triển được trên môi trường có ampicillin. Đĩa biến nạp chứa các tế bào E. coli DH5훼 đã được biến nạp sản phẩm nối pPIC9K-CelD nên có thể sinh trưởng trên môi trường chứa ampicillin. Chọn ngẫu nhiên 6 khuẩn lạc E. coli DH5훼 trên đĩa biến nạp và thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/AOX1R để chọn lọc những dòng mang plasmid tái tổ hợp gen mục tiêu. 51
Đồ án tốt nghiệp 4.2.2. Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc Để khẳng định các thể biến nạp chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD, tiến hành PCR khuẩn lạc các thể biến nạp với cặp mồi AOX1F/ AOX1R. Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli DH5α/pPIC9K-CelD với cặp mồi AOX1F/AOX1R. Giếng 1 – 6: sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli DH5α/pPIC9K- CelD (EP1 – EP6); M: Thang DNA 1Kb; N: đối chứng âm. Plasmid pPIC9K có hai vùng promoter AOX1F và AOX1R nằm ở hai đầu của MCS nên sản phẩm khuếch đại với cặp mồi AOX1F và AOX1R sẽ có kích thước 493 bp. Khi có gen mục tiêu chèn vào pPIC9K trong vùng này thì sản phẩm khuếch đại với cặp mồi trên sẽ cho ra kích thước 2330 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc cho thấy đối chứng âm không xuất hiện vạch, các giếng số 1, 3, 4, 5 tương ứng với các dòng E. coli DH5α EP1, EP3, EP4, EP5 chỉ xuất hiện vạch khoảng 500 bp so với thang chuẩn trùng với kích thước lý thuyết của vector pPIC9K là 493 bp. Điều này cho thấy rằng, các chủng này không chứa đoạn gen chèn CelD. 52
Đồ án tốt nghiệp Giếng số 2 và giếng số 6 tương ứng với dòng EP2 và EP6 xuất hiện vạch khoảng 2300 bp trùng với tổng kích thước lý thuyết của vector pPIC9K (493 bp) và đoạn gen CelD (1824 bp). Như vậy, chỉ có 2 dòng E. coli DH5α EP2 và EP 6 có khả năng chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD. 4.2.3. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR và bằng enzyme cắt giới hạn SnaBI và EcoRI Hai dòng tế bào E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp pPIC9K-CelD là EP2 và EP6 được tăng sinh trong môi trường LB lỏng để tách chiết plasmid, kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn bằng hai enzyme SnaBI và EcoRI đồng thời thực hiện phản ứng PCR với mồi CelDF và CelDR. Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD với mồi CelDF/ CelDR và cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI. Giếng 1: plasmid pPIC9K chưa cắt; giếng 2: plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD chưa cắt; giếng 3: sản phẩm cắt pPIC9K-CelD dòng EP2 với SnaBI; giếng 4: sản 53
Đồ án tốt nghiệp phẩm cắt pPIC9K-CelD dòng EP6 với SnaBI; giếng 5: sản phẩm cắt pPIC9K với SnaBI và EcoRI; giếng 6: sản phẩm cắt pPIC9K-CelD dòng EP2 với SnaBI và EcoRI; giếng 7: sản phẩm cắt pPIC9K-CelD dòng EP6 với SnaBI và EcoRI; giếng 8: Sản phẩm PCR dòng EP2 với mồi CelDF/ CelDR; giếng 9: Sản phẩm PCR dòng EP6 với mồi CelDF/ CelDR; M: Thang chuẩn DNA 1 Kb; N: đối chứng âm. Kết quả điện di ở hình 4.7 cho thấy khi so sánh sản phẩm cắt plasmid pPIC9K với SnaBI và EcoRI ở giếng 5 với pPIC9K chưa cắt ở giếng 1, nhận thấy có sự khác nhau rõ rệt. Hình điện di sản phẩm cắt của pPIC9K cho thấy một vạch duy nhất tại vị trí thấp hơn 10 kb của thang chuẩn, phù hợp với kích thước của pPIC9K là 9300 bp. Như vậy, tất cả plasmid pPIC9K đã được cắt hoàn toàn và đưa về dạng mạch thẳng. Dựa vào kết quả điện di, nhận thấy phản ứng cắt hoàn toàn bình thường, hiệu suất cắt của cả hai enzyme đều tốt. Giếng số 6 và giếng số 7 tương ứng với plasmid tái tổ hợp của hai dòng EP2 và EP6 sau khi cắt với hai enzyme SnaBI và EcoRI đều cho cho hai vạch rõ nét. Một vạch có kích thước lớn hơn 1636 bp, tương ứng với kích thước của lý thuyết của gen CelD là 1824 bp. Một vạch kích thước khoảng 9300 bp, tương ứng với kích thước lý thuyết của plasmid pPIC9K là 9276 bp. Vector tái tổ hợp pPIC9K-CelD của hai dòng EP2 và EP6 sau khi cắt bằng enzyme SnaBI (giếng số 3 và 4) cho vạch có kích thước hơn 10 kb, tương ứng với kích thước lý thuyết của plasmid pPIC9K sau khi chèn gen CelD là 11100 bp. Sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K- CelD với cặp mồi CelDF/ CelDR đặc trưng cho gen CelD của dòng EP2 và EP6 ở giếng 8 và 9 cũng cho vạch có kích thước bằng với kích thước gen đã được cắt ở giếng 6 và giếng 7. Plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD chưa cắt ở giếng 2 cũng cho kích thước lớn hơn plasmid pPIC9K chưa cắt ở giếng 1. Như vậy cả hai dòng EP2 và EP6 có khả năng mang plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD. Tuy nhiên, dựa vào sản phẩm cắt vẫn chưa thể khẳng định đã tạo dòng thành công tế bào E.coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD mà cần phải có thêm kết quả giải trình tự. 54
Đồ án tốt nghiệp 4.2.4. Kiểm tra dòng E. coli DH5휶 chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD bằng giải trình tự Plasmid tái tổ hợp của dòng EP2 được tiến hành giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) để kiểm tra lại trình tự của gen mục tiêu. Kết quả được xử lý bằng phần mềm Genetyx. Khi blast trình tự này lên NCBI, nhận thấy sự tương đồng là 99%. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen CelD trong plasmid pPIC9K- CelD với trình tự có mã số X04584.1 bằng công cụ BLAST của NCBI Query 239 GCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTGATTCACGAATCCGTTTAAACTCAATAGGTTTT 298 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 324 GCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTGATTCACGAATCCGTTTAAACTCAATAGGTTTT 383 Query 299 ATACCGAACCACAGCAAAAAGGCGACTATAGCTGCAAATTGTTCAACCTTTTATGTTGTT 358 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 384 ATACCGAACCACAGCAAAAAGGCGACTATAGCTGCAAATTGTTCAACCTTTTATGTTGTT 443 Query 359 AAAGAAGACGGAACAATAGTGTATACCGGAACGGCAACTTCAATGTTTGACAATGATACA 418 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 444 AAAGAAGACGGAACAATAGTGTATACCGGAACGGCAACTTCAATGTTTGACAATGATACA 503 Query 419 AAAGAAACTGTTTATATTGCTGATTTTTCATCCGTTAATGAAGAAGGAACGTACTATCTT 478 |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 504 AAAGAAACTGTTTATATTGCTGATTTTTCATCTGTTAATGAAGAAGGAACGTACTATCTT 563 Query 479 GCCGTGCCGGGAGTAGGAAAAAGCGTAAACTTTAAAATTGCAATGAATGTATATGAGGAT 538 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 564 GCCGTGCCGGGAGTAGGAAAAAGCGTAAACTTTAAAATTGCAATGAATGTATATGAGGAT 623 Query 539 GCTTTTAAAACAGCAATGCTGGGAATGTATTTGCTGCGCTGCGGCACCAGTGTGTCGGCC 598 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 624 GCTTTTAAAACAGCAATGCTGGGAATGTATTTGCTGCGCTGCGGCACCAGTGTGTCGGCC 683 Query 599 ACATACAACGGAATACACTATTCCCATGGACCGTGCCATACTAATGATGCATATCTTGAT 658 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 684 ACATACAACGGAATACACTATTCCCATGGACCGTGCCATACTAATGATGCATATCTTGAT 743 Query 659 TATATAAACGGACAGCATACTAAAAAAGACAGTACAAAAGGCTGGCATGATGCGGGCGAC 718 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 744 TATATAAACGGACAGCATACTAAAAAAGACAGTACAAAAGGCTGGCATGATGCGGGCGAC 803 Query 1 GGACCAGCCAAAACCATGGCTATGGCAGAACCCTTGGTACAACATATTACTGGGGATGCA 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1519 GGACCAGCCAAAACCATGGCTATGGCAGAACCCTTGGTACAACATATTACTGGGGATGCA 1578 Query 61 ACGGCACGGTTGTAAGACAGACTATGATACTTCAGGTTGCGAACAAGATTTCACCCAACA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1579 ACGGCACGGTTGTAAGACAGACTATGATACTTCAGGTTGCGAACAAGATTTCACCCAACA 1638 55
Đồ án tốt nghiệp Query 121 ATGATTATGTAAATGCTGCTCTCGATGCGATTTCACATGTATTTGGAAGAAACTATTACA 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1639 ATGATTATGTAAATGCTGCTCTCGATGCGATTTCACATGTATTTGGAAGAAACTATTACA 1698 Query 181 ACAGGTCTTATGTAACAGGCCTTGGTATAAATCCTCCTATGAATCCTCATGACAGACGTT 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1699 ACAGGTCTTATGTAACAGGCCTTGGTATAAATCCTCCTATGAATCCTCATGACAGACGTT 1758 Query 241 CAGGGGCTGACGGAATATGGGAGCCGTGGCCCGGTTACCTTGTAGGAGGAGGATGGCCCG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1759 CAGGGGCTGACGGAATATGGGAGCCGTGGCCCGGTTACCTTGTAGGAGGAGGATGGCCCG 1818 Query 301 GACCGAAGGATTGGGTGGATATTCAGGACAGTTATCAGACCAATGAAATTGCTATAAACT 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1819 GACCGAAGGATTGGGTGGATATTCAGGACAGTTATCAGACCAATGAAATTGCTATAAACT 1878 Query 361 GGAATGCGGCATTGATTTATGCCCTTGCCGGATTTGTCAACTATAATTCTGCTCAAAATG 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| Sbjct 1879 GGAATGCGGCATTGATTTATGCCCTTGCCGGATTTGTCAACTATAATTCTCCTCAAAATG 1938 Query 421 AAGTACTGTACGGAGATGTGAATGATGACGGAAAAGTAAACTCCACTGACTTGACTTTGT 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1939 AAGTACTGTACGGAGATGTGAATGATGACGGAAAAGTAAACTCCACTGACTTGACTTTGT 1998 Query 481 TAAAAAGATATGTTCTTAAAGCCGTCTCAACTCTGCCTTCTTCCAAAGCTGAAAAGAACG 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1999 TAAAAAGATATGTTCTTAAAGCCGTCTCAACTCTCCCTTCTTCCAAAGCTGAAAAGAACG 2058 Query 541 CAGATGTAAATCGTGACGGAAGAGTTAATTCCAGTGATGTCACAATACTTTCAAGATATT 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2059 CAGATGTAAATCGTGACGGAAGAGTTAATTCCAGTGATGTCACAATACTTTCAAGATATT 2118 Query 601 TGATAAGGGTAATCGAGAAATTACCAATA 629 ||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2119 TGATAAGGGTAATCGAGAAATTACCAATA 2147 Trình tự thu nhận được của gen CelD trong plasmid pPIC9K được xử lý bằng phần mềm DNAClub để chuyển từ trình tự nucleotide sang trình tự amino acid. Hình 4.8. Kết quả blast trình tự protein của trình tự trong plasmid pPIC9K-CelD trên NCBI Kết quả blast trình tự protein cho thấy hai chuỗi acid amin khác nhau. Chuỗi đầu tiên chính là trình tự tiết nhân tố α có trong plasmid biểu hiện pPIC9K. Chuỗi tiếp theo là trình tự protein mã hóa cho enzyme cellulase. 56
Đồ án tốt nghiệp Kết quả so sánh trình tự protein của gen CelD ban đầu với gen CelD trong plasmid pPIC9K bằng công cụ BLAST của NCBI Query 80 AKITENYQFDSRIRLNSIGFIPNHSKKATIAANCSTFYVVKEDGTIVYTGTATS 133 Sbjct 42 AKITENYQFDSRIRLNSIGFIPNHSKKATIAANCSTFYVVKEDGTIVYTGTATS 95 Query 134 MFDNDTKETVYIADFSSVNEEGTYYLAVPGVGKSVNFKIAMNVYEDAFKTAMLGMYLLRC 193 Sbjct 96 MFDNDTKETVYIADFSSVNEEGTYYLAVPGVGKSVNFKIAMNVYEDAFKTAMLGMYLLRC 155 Query 194 GTSVSATYNGIHYSHGPCHTNDAYLDYINGQHTKKDSTKGWHDAGD 239 Sbjct 156 GTSVSATYNGIHYSHGPCHTNDAYLDYINGQHTKKDSTKGWHDAGD 201 Query 1 TSQNHGYGRTLGTTYYWGCNGTVVRQTMILQVANKISPNNDYVNAALDAISHVFGRNYYN 60 Sbjct 441 TSQNHGYGRTLGTTYYWGCNGTVVRQTMILQVANKISPNNDYVNAALDAISHVFGRNYYN 500 Query 61 RSYVTGLGINPPMNPHDRRSGADGIWEPWPGYLVGGGWPGPKDWVDIQDSYQTNEIAINW 120 Sbjct 501 RSYVTGLGINPPMNPHDRRSGADGIWEPWPGYLVGGGWPGPKDWVDIQDSYQTNEIAINW 560 Query 121 NAALIYALAGFVNYNSAQNEVLYGDVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVSTLPSSKAEKNA 180 Sbjct 561 NAALIYALAGFVNYNSAQNEVLYGDVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVSTLPSSKAEKNA 620 Query 181 DVNRDGRVNSSDVTILSRYLIRVIEKLPI 209 Sbjct 621 DVNRDGRVNSSDVTILSRYLIRVIEKLPI 649 Tuy không giải được toàn bộ trình tự gen nhưng dựa vào trình tự đã biết, kết luận rằng gen được chèn vào plasmid biểu hiện pPIC9K chính là gen CelD và cũng đã được chèn vào đúng vị trí mục tiêu trên vector pPIC9K. Như vậy, đã tạo dòng thành công tế bào E. coli DH5훼 mang plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD. Từ đó tiến hành biến nạp plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD vào hệ thống Pichia pastoris nhằm nghiên cứu khả năng biểu hiện của enzyme endoglucanase. 4.3. Tạo dòng Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen CelD Các kết quả phân tích bằng giải trình tự cho phép khẳng định rằng gen CelD đã ghép nối thành công vào vector biểu hiện pPIC9K. Plasmid tái tổ hợp pPIC9K- CelD được cắt bằng enzyme cắt giới hạn SacI và biến nạp vào tế bào Pichia pastoris để nghiên cứu biểu hiện gen. 57
Đồ án tốt nghiệp 4.3.1. Biến nạp plasmid pPIC9K – CelD vào chủng Pichia pastoris GS115 Vector biểu hiện pPIC9K thuộc dạng plasmid sáp nhập, khi được biến nạp vào tế bào nấm men, một phần DNA trên plasmid sẽ sáp nhập vào bộ gen của tế bào chủ thông qua tái tổ hợp tương đồng. Sự tái tổ hợp tương đồng này thường có hiệu suất cao hơn khi plasmid ở dạng thẳng. Do vậy, plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD đã qua kiểm tra được cắt bằng enzyme cắt giới hạn SacI tại vị trí 5’ AOX1 để tăng khả năng trao đổi chéo giữa plasmid và bộ gen của tế bào nấm men, cũng như để tạo được chủng P. pastoris tái tổ hợp dạng Mut+. Plasmid pPIC9K-CelD dạng thẳng được biến nạp vào tế bào nấm men bằng phương pháp điện biến nạp. Trong tế bào, do có sự tương đồng giữa trình tự gen mã hóa cho histidinol dehydrogenase trên bộ gen của tế bào và trên plasmid nên xảy ra sự trao đổi chéo, dẫn đến việc gen mục tiêu từ plasmid được chuyển vào bộ gen của tế bào. Nhờ vậy gen mục tiêu có thể tồn tại ổn định trong tế bào. Thí nghiệm được thực hiện đồng thời với mẫu đối chứng âm là tế bào nấm men Pichia pastoris không được không được biến nạp vector pPIC9K. A B Hình 4.9. Sàng lọc thể biến nạp P. pastoris GS115 chứa pPIC9K-CelD A. Đĩa đối chứng âm; B. Đĩa biến nạp 58
Đồ án tốt nghiệp Tế bào sau khi biến nạp được trải trên môi trường MD và ủ ở 280C từ 3 – 5 ngày cho các khuẩn lạc phát triển. Môi trường MD là môi trường không chứa histidine nên chủng P. pastoris GS115 (chủng khuyết dưỡng histidine) không thể phát triển được, chỉ có những chủng Pichia pastoris GS115 nào có chứa plasmid pPIC9K được sáp nhập vào bộ gen nấm men mới phát triển được trên môi trường này. Vì vậy, đĩa đối chứng âm không xuất hiện các khuẩn lạc của nấm men. Trong khi đó các đĩa biến nạp pPIC9K-CelD xuất hiện nhiều khuẩn lạc do plasmid pPIC9K-CelD có chứa gen HIS4 nên có khả năng tổng hợp histine. Như vậy, bước đầu đã thu nhận được các thể biến nạp Pichia pastoris GS115 mang plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD sáp nhập vào bộ gen. Các khuẩn lạc này được tăng sinh, kiểm tra khả năng kháng G418 và cuối cùng thực hiện phản ứng PCR kiểm tra sự gắn chèn. 4.3.2. Sàng lọc tế bào nấm men mang gen mã hóa cho endoglucanase D Chỉ có những tế bào có sự sáp nhập thành công giữa plasmid và bộ gen của nấm men thì gen mục tiêu mới tồn tại ổn định trong tế bào đồng thời có khả năng kháng lại kháng sinh Geneticin (G418). Để sàng lọc các dòng nấm men mang nhiều bản sao gen CelD, chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển trên môi trường MD và cấy chuyền vào môi trường đĩa thạch YPD có bổ sung kháng sinh Geneticin (G418) với nồng độ là 2mg/ml và 4 mg/ml. Tế bào có mang gen mã hóa cho endoglucanase D sẽ phát triển được trên môi trường này. Bên cạnh đó, các tế bào có càng nhiều bản sao sẽ phát triển được trên môi trường có nồng độ G418 càng cao. 59
Đồ án tốt nghiệp A B Hình 4.10. Sàng lọc tế bào P. pastoris mang gen CelD trên môi trường YPD/ G418 A. Các dòng tế bào P. pastoris mang gen CelD trên môi trường YPD/ 2mg G418 B. Các dòng tế bào P. pastoris mang gen CelD trên môi trường YPD/ 4mg G418 Chọn một số dòng P. pastoris có thể mọc trên nồng độ kháng sinh cao nhất, tách chiết DNA và kiểm tra sự sát nhập gen CelD vào bộ gen của nấm men bằng PCR với cặp mồi AOX1F/AOX1R, đồng thời phân tích định tính khả năng phân hủy cellulose của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp này. 4.3.3. Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng phương pháp PCR với mồi AOX1F/ AOX1R Nhằm kiểm tra khả năng sát nhập của vector tái tổ hợp chứa gen CelD vào bộ gen của nấm men, các dòng nấm men tái tổ hợp phát triển trên môi trường YPD có chứa kháng sinh Geneticin G418 (4 mg/ml) được tăng sinh trong môi trường BMGY ở 280C qua đêm để tách chiết DNA tổng số, sau đó thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi AOX1F/AOX1R. 60
Đồ án tốt nghiệp Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự sát nhập của plasmid pPIC9K-CelD vào bộ gen P. pastoris GS115 Giếng 1: sản phẩm PCR plasmid pPIC9K với mồi AOX1F/ AOX1R; giếng 2: sản phẩm PCR đoạn gen CelD với mồi CelDF/ CelDR; giếng 3:sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD với mồi AOX1F/ AOX1R; giếng 4:sản phẩm PCR nấm men Pichia pastoris chưa chèn plasmid với mồi AOX1F/ AOX1R; giếng 5 – 9: sản phẩm PCR Pichia pastoris/ pPIC9K-CelD với mồi AOX1F/ AOX1R; N: đối chứng âm; M: thang chuẩn DNA 1Kb. Kết quả điện di trên hình 4.11 cho thấy ở giếng 1, khi thực hiện phản ứng PCR plasmid pPIC9K với cặp mồi AOX1F/ AOX1R sẽ xuất hiện một vạch có kích thước khoảng 500 bp, trùng với kích thước của vector này khi đóng vòng. Đoạn gen CelD được PCR với cặp mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR cho một vạch có kích thước khoảng 1800 bp (giếng 2) trùng với kích thước lý thuyết của đoạn gen CelD là 1824 bp. Giếng 3 là sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD bằng cặp mồi AOX1F/ AOX1R cho một vạch có kích thước khoảng 2300 bp, kích thước này 61
Đồ án tốt nghiệp tương ứng với tổng kích thước của vector pPIC9K (493 bp) và đoạn gen chèn CelD (1824 bp). Giếng 4 là sản phẩm PCR với khuôn là DNA bộ gen của chủng Pichia pastoris GS115 chưa biến nạp vector pPIC9K, vì vậy xuất hiện một vạch có kích thước trên 2 Kb tương đương với kích thước của gen AOX1 của Pichia pastoris. Giếng 5 đến giếng 9 là sản phẩm PCR của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp chứa gen CelD bằng cặp mồi AOX1F/AOX1R. Kết quả điện di cho thấy tất cả các dòng đều cho hai vạch đúng kích thước mục tiêu: một vạch có kích thước khoảng 2200 bp, tương ứng với kích thước của gen AOX1 có trong genome của Pichia pastoris; một vạch có kích thước khoảng 2300 bp, tương ứng với kích thước của gen CelD là 1824 bp cộng với trình tự trong plasmid pPIC9K là 493 bp. Như vậy, có thể kết luận đoạn gen CelD đã được biến nạp thành công vào bộ gen của nấm men P. pastoris với kiểu hình Mut+ (dòng P. pastoris có thể sử dụng methanol ở nồng độ cao). Các dòng Pichia pastoris này sẽ được kiểm tra khả năng sinh enzyme endoglucanase trên môi trường BMMY có bổ sung cơ chất CMC (Carboxymethyl-cellulose). 4.3.4. Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P. pastoris tái tổ hợp Dựa vào kết quả PCR, các dòng nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp có sự sáp nhập của plasmid pPIC9K-CelD vào bộ gen được tăng sinh trong môi trường BMGY ở 280C trong 24 giờ và sàng lọc biểu hiện trên đĩa thạch chứa môi trường BMMY có bổ sung cơ chất CMC (Carboxymethyl-cellulose) 0,5%. Đánh giá khả năng tiết enzyme endoglucanase của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp, đồng thời lựa chọn các chủng nấm men có hoạt tính enzyme cao nhất dựa vào đường kính vòng phân giải trên môi trường chứa CMC (Carboxymethyl-cellulose) sau khi nhuộm bằng thuốc nhuộm đỏ Congo sau 3 ngày nuôi cấy ở 280C. Thí nghiệm được thực hiện cùng với đối chứng âm là nấm men Pichia pastoris. Các nghiệm thức được lặp lại 6 lần. 62
Đồ án tốt nghiệp A B Hình 4.12. Vòng phân giải CMC của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp khi nhuộm với thuốc đỏ Congo Đĩa A: vòng phân giải CMC của dòng Pichia pastoris tái tổ hợp P8 Đĩa B: vòng phân giải CMC của dòng Pichia pastoris tái tổ hợp P9 Kết quả trên hình 4.12 cho thấy trên cả hai đĩa A và B, phần đối chứng âm không xuất hiện vòng sáng vì chủng P. pastoris không sử dụng được CMC (Carboxymethyl-cellulose) có trong môi trường BMMY nên không tạo được vòng phân giải, chỉ có những chủng Pichia pastoris GS115 có chứa plasmid pPIC9K- CelD được sáp nhập vào bộ gen nấm men mới tạo vòng phân giải trên môi trường này. Vì vậy, các dòng P. pastoris tái tổ hợp P8 và P9 tương ứng trên hai đĩa A, B đều có vòng phân giải cơ chất CMC. Đường kính vòng phân giải của các chủng Pichia pastoris tái tổ hợp trên môi trường BMMY có CMC 0,5% được thể hiện trong bảng 4.1. 63