Đồ án Sử dụng vi khuẩn Bacillus Subtilis và Lactobacillus để tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón dạng lỏng

125 trang thiennha21 13/04/2022 2600

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Sử dụng vi khuẩn Bacillus Subtilis và Lactobacillus để tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón dạng lỏng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_su_dung_vi_khuan_bacillus_subtilis_va_lactobacillus_de.pdf

Nội dung text: Đồ án Sử dụng vi khuẩn Bacillus Subtilis và Lactobacillus để tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón dạng lỏng

New Text Document.txt Sử dụng vi khuẩn Bacillus Subtilis và Lactobacillus để tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón dạng lỏng Hồ Thị Thảo Ly Nguyễn Thị Hai (giảng viên hướng dẫn) Tp.HCM, 2017 Page 1
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Công Nghệ Tp. HồChí Minh. Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp là hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án của mình. TP. HCM, ngày 20 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện Hồ Thị Thảo Ly i
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn,chỉ bảo em trong suốt thời gian xấy dựng đề cương, thực hiện và hoàn thành đồ án này. Em xin cảm ơn đến thầy Dũng đa giúp đỡ, hỗ trợ tạo điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình em thực hiện đồ án. Em xin gửi lời cảm ơn đến quý Thầy, Cô khóa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường đã tận tình chỉ bảo truyền đạt kiến thức cho em suốt quá trình học tập để vận dụng kiến thức nền tảng ấy vào thực hiện đồ án này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình đã chăm sóc, dạy dỗ và làm chỗ dựa tinh thần động viên, hỗ trợ kinh tế cho em trong suốt những năm vừa qua và trong quá trình thực hiện đồ án này. Em cũng xin cảm ơn đến các bạn cùng thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm đã quan tâm, hỗ trợ em làm đồ án tốt nghiệp này. Cuối cùng em xin cảm ơn các Thầy Cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý Thầy Cô. Tp. HCM, ngày 27 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Hồ Thị Thảo Ly ii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 3. Mục đích nghiên cứu 3 4. Mục tiêu cụ thể 3 5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3 5.1. Nội dung 3 5.2. Phương pháp nghiên cứu 4 6. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp 4 1.1. TỔNG QUAN VỀ RÁC THẢI HỮU CƠ 5 1.1.1. Khái niệm về rác thải hữu cơ 5 1.1.2. Nguồn gốc phát sinh rác thải hữu cơ 5 1.1.3. Đặc điểm rác thải hữu cơ 5 1.1.4. Phân loại rác thải 5 1.1.5. Các phương thức xử lý rác thải 5 1.2. TỔNG QUAN VỀ PHÂN BÓN LÁ 6 1.2.1. ịch sử phát triển 6 1.2.2. Mục tiêu chính khi sử dụng phân bón lá 7 1.2.4. Con đường hấp thu phân bón lá 7 1.2.5. ưu ý khi sử dụng phân bón lá 8 1.2.6. Các loại chất dinh dưỡng cung cấp cho cây từ phân bón 9 1.3. Phân bón vi sinh 9 ii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.3.1. iới thiệu chung về phân bón vi sinh vật 9 1.3.2. Phân vi sinh vật cố định nitơ 11 1.3.3. Phân lân vi sinh 12 1.3.4. Các loại phân bón vi sinh khác 12 1.4. GIỚI THIỆU VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS VÀ LACTOBACILLUS 14 1.4.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis 14 1.4.2. Phân loại 15 1.4.3. Đặc điểm của Bacillus subtilis 16 1.4.4. Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên 16 1.4.5. Đặc điểm hình thái 17 1.4.6. Đặc điểm sinh hóa 17 1.4.7. Đặc điểm nuôi cấy 18 1.4.8. Bộ gen của Bacillus subtilis 18 1.4.9. Bào tử và khả năng tạo bào tử 19 1.4.10. Tính đối kháng và khả năng sinh bacteriocin 19 1.4.11. Ứng dụng của Bacillus subtilis trong sản xuất và đời sống 20 1.5. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus spp 20 1.5.1. Lịch sử nghiên cứu về Lactobacillus spp 20 1.5.2. Phân loại vi khuẩn Lactobacillus 21 1.5.3. Đặc điểm phân bố 21 1.5.4. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus spp 21 1.5.5. Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus spp 22 1.5.6. Khả năng phân giả protein của vi khuẩn Lactobacillus spp 22 iii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.5.7. Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh 22 1.6. TỔNG QUAN VỀ ĐẠM TỔNG 23 1.6.1. Phương pháp lấy mẫu 23 1.6.2. Các phương pháp phân tích Protein nhằm xác định nito tổng 24 1.7. TỔNG QUAN VỀ AMINO ACID 25 1.7.1. Cấu trúc tổng quát 27 1.7.2. Các dạng đồng phân 27 1.7.3. Amino acid thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất 27 1.7.4. Tác dụng của amino acid đối với cây trồng 28 1.7.5. Đối với sự ra hoa và đậu trái 28 1.7.6. Tăng tính hữu hiệu sinh học của nguyên tố vi lượng 29 1.7.7. àm tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật 29 1.7.8. Hiệu lực của Amino acids phụ thuộc công nghệ sản xuất 29 1.8. TỔNG QUAN TỶ LỆ C/N 30 1.9. ƯU ĐIỂM CỦA PHÂN BÓN VI SINH 31 Ưu điểm 31 CHƯƠN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠN PHÁP N HIÊN CỨU 33 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 33 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu 33 2.1.2. Thời gian nghiên cứu 33 2.2. Vật liệu nghiên cứu 33 2.2.1. Nguồn mẫu thức ăn thừa 33 2.2.2. Hóa chất và môi trường 33 iv
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.2.3. Thiết bị và dụng cụ 34 2.3. Bố trí thí nghiệm 34 2.3.1. Bố trí thí nghiệm chung 35 2.3.2. Bố trí thí nghiệm chi tiết 35 2.3.3. Đánh giá ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn của chủng vi sinh vật Bacillus subtilis và Lactobacillus 40 2.3.4. Định lượng Salmonella 49 2.3.4.3. Sơ đồ tóm tắt quy trình 50 Báo cáo kết quả 52 2.3.5. Khả năng nảy mầm hạt đậu xanh 56 2.3.6. Hiệu quả chế phẩm phân bón trên cây rau mầm 65 CHƯƠN : K T UẢ VÀ THẢO UẬN 67 3.1. Tình hình thức ăn thừa tại TP.HCM: 67 3.1.1. Đặc điểm cả nguồn thức ăn thừa 68 3.1.2. Xác định tỷ lệ vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus thích hợp để tăng cường quá trình phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón 68 3.1.3. Hàm lượng Nitơ tổng số ở các công thức 69 3.2. Hàm lượng đạm formol các công thức khảo sát theo ngày 71 3.3. Hàm lượng đạm tổng số và đạm formol ở từng công thức ngày 20 72 3.4. Đánh giá chất lượng của dịch thủy phân ở các công thức bổ sung vi khuẩn khác nhau 74 3.4.1. Định tính sự có mặt Coliform 74 3.4.2. Định tính sự có mặt của Salmonella 76 3.5. Hiệu quả của phân bón hữu cơ vi sinh vật từ thức ăn thừa đến sinh trưởng của thực vật 87 v
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.5.1. Ảnh hưởng của chế phẩm đến khả năng nảy mầm của đậu xanh 87 3.5.2. Thử nghiệm phun trên rau mầm 89 Kết quả cân sinh khối 93 CHƯƠN 4: K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ 94 4.1. Kết luận 94 1.10. Đề nghị 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 vi
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis 17 Bảng 1.2: Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất. . 30 Bảng 2.1: Biểu hiện đặc trưng của Salmonella trong test sinh hóa. 53 Bảng 2.2: Tỷ lệ phối trộn sinh khối vi sinh vật. 54 Bảng 2. : Tỷ lệ pha loãng chế phẩm phun thử trên đậu xanh. 57 Bảng 2.4: Tỷ lệ pha loãng chế phẩm phun trên rau mầm 65 Bảng .1. Tình hình thức ăn thừa thải ra tại một số nhà hàng ở thành phố Hồ Chí Minh 67 Bảng .2: Đặc điểm nguyên liệu đầu vào. 68 Bảng 3.3 : Bảng biểu kết quả hàm lượng đạm tổng số theo thời gian. 69 Bảng 3.4: Hàm lượng đạm formol theo thời gian của 4 chế phẩm 71 Bảng .5. Hàm lượng đạm tổng số và đạm formol ở từng công thức sau ngày 20 bổ sung chế phẩm 72 Bảng .6: Kết quả thử nghiệm sinh hóa 86 vii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH n 1 1 c lo i p n b n l t n t t n 6 n 1 2 c c lo i p n u c i sin an c t n t t n 10 n 1 3 Tế bào Bacillus subtilis 16 Loài (Species): Lactobacillus spp. n 1 4 Tế bào Lactosebacilus 21 n 2 1 s u t n t o c ế p m p n b n l 35 n 2 2 tủ sấ mẫu ở 105° n 2 3 b n út m Silica en 37 n 2 4 Tiến àn nun mẫu t on tủ nun 550° 39 Hình 2.5: Bình c Kjelda l n 2 6 b n ứn N 3 42 n 2 7 B n ứn t ớc c u n ộ n 2 8 b n ứn sau c u n ộ 43 n 2 9 nito fo mol t ớc c u n ộ n 2 10 nito fo mol sau c u n ộ 45 n 2 11 S u t n n l ợn colifo m 48 n 2 12 S u t n n tín Salmonella 51 n 2 12 n l ợn colifo m 55 n 2 13 mẫu ậu xan ợc t u lấ 57 n 2 14 s o s t ộ n m m sau i p un c ế p m 59 n 2 15 K o s t tỷ lệ n m m t ậu xan 64 n 3 1 àm l ợn m tổn số t eo t i ian của 4 c ế p m 70 n 3 2 àm l ợn m fo mol t eo t i ian của 4 c ế p m. 71 n 3 3 L ợn m tổn số ở c c côn t ức n à t ứ 20 73 n 3 4 L ợn m fo mol c t on c c côn t ức n à t ứ 20 73 n 3 5 K u n l c n i n là colifo m ở T Đ 74 n 3 6 K u n l c n i n là colifo m ở CT2 75 n 3 7 K u n l c n i n là colifo m ở T3 75 n 3 8 T o í t on ốn du am ở l n l ợt c c côn t ức Đ , T2, T3 76 n 3 9 Kết u nuôi ủ u n l c t n môi t n XLD 79 n 3 10 Kết u nuôi ủ u n l c t n môi t n TSA ở T Đ 80 n 3 11 Kết u nuôi ủ u n l c t n môi t n TSA ở T2 80 n 3 12 Kết u nuôi ủ u n l c t n môi t n T3 81 viii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP n 3 13 ết u t ử n iệm sin hóa LDC. 82 n 3 14 ết u t ử n iệm sin a VP 83 n 3 15 ết u t ử n iệm sin a mannitol 84 n 3 16 ết u t ửu n iệm sin a u ea 85 n 3 17 Kết u t ử n iệm sin a TSI 86 n 3 18 Tỷ lệ n m m t ậu xan từn côn t ức ở n n ộ p a loãn 20 l n 88 n 3 19 Tỷ lệ n m m t ậu xan từn côn t ức ở ộ p a loãn 50 l n 88 n 3 19 Tỷ lệ n m m t ậu xan từn côn t ức ở ộ p a loãn 50 l n 89 n 3 20 Kết u p un t ử n iệm c c côn t ức ở n n ộ p a loãn 20 l n so ới mẫu t ắn 89 n 3 21 Kết u p un t ử n iệm c c côn t ức ở n n ộ p a loãn 50 l n so ới mẫu t ắn 90 n 3 22 Kết u o c iều dài t n c au m m ở t ử n iệm p un c ế p m p a loãn ở 20 l n 90 n 3 23 Kết u o c iều dài t n c au m m ở t ử n iệm p un c ế p m . 91 Kết u o c iều dài ễ c 91 n 3 24 Kết u o c iều dài ễ c c côn t ức ở n n ộ p a loãn 20 l n 92 n 3 25 Kết u o c iều dài ễ c au m m ở c c côn t ức ới ộ p a loãn 50 l n 92 n 3 26 Kết u o sin ối c au m m ở từn côn t ức ới ộ p a loãn 20 l n 93 ix
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT TSA Trypic Soy Agar BPW Buffered peptone water RV Rappaport – Vassiliadis soya peptone LDC Lysine decarboxylase TSI Triple sugar iron XLD Xylose lysine desoxycholate PCA Plate count agar VP Voges Progkauer VRB Violet red bile agar BGBL Brilliant green bile lactose borth MT Mẫu trắng ĐC Đối chứng x
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Xã hội ngày càng phát triển, những tiến bộ về khoa học và kĩ thuật làm cho cuộc sống con người có những thay đổi lớn. Ngành công nghiệp dịch vụ ăn uống mở rộng, nhà cửa và nhà hàng tạo ra lượng thực phẩm thừa. Một số thực phẩm còn sót lại được sử dụng làm thức ăn gia súc, nhưng do khó khăn trong việc chứa đựng, vận chuyển hoặc xử lý thực phẩm còn sót lại có mùi khó chịu và chứa nhiều côn trùng có hại đến sứa khỏe con người, (Jayathilakan và ctv, 2012). Các phương pháp xử lí thường tạo ra mùi hôi do các hợp chất nitơ và lưu huỳnh thoát ra trong quá trình xử lí. Phần lớn chi phí cho việc xử lí chất thải của thành phố dao động từ 75% đến 80% ngân sách của thành phố và thêm 0% chi phí cho việc đổ rác (Arvanitoyannis, 2008 ). Dữ liệu gần đây cho thấy năm 2012 có khoảng 9.278 tấn chất thải rắn đô thị đã được xử lý tại các bãi rác mỗi ngày, trong đó khoảng . 7 tấn là chất thải thực phẩm. ần 809 tấn chất thải thực phẩm được tạo ra từ nhà hàng, khách sạn, chợ ướt, sản xuất và chế biến thực phẩm. Chất thải thực phẩm có hàm lượng chất hữu cơ cao, nhưng thực tiễn cho thấy việc xử lý rác thải thực phẩm ở bãi chôn lấp không thân thiện và bền vững, làm giảm diện tích đất, tạo ra mùi khó chịu (Birdie và ctv, 2014). Tại EU, ước tính khoảng 88 triệu tấn thực phẩm bị lãng phí hàng năm, khoảng 20% lương thực,thực phẩm được sản xuất và 95-115 kilogam thực phẩm / người mỗi năm. EU đang nỗ lực để giảm tác động đến môi trường của chất thải thông qua chiến lược kinh tế bằng cách duy trì giá trị của nguyên vật liệu trong nền kinh tế càng lâu càng tốt và để giảm lượng rác thải đặc biệt là chất thải thực phẩm thừa ( Stoknes và ctv, 2016). Sự sản xuất thực phẩm ở Mỹ sử dụng khoảng 50% diện tích đất của họ, và sử dụng 80% tổng lượng nước sạch được tiêu thụ. Tuy nhiên, khoảng 40% tổng sản lượng lương thực là chất thải tương đương với 165 tỷ USD mỗi năm ( unders, 2012). Ngược lại, hiện nay hơn một tỷ người bị suy dinh dưỡng mãn tính (Foley và 1
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ctv 2011). Về lý thuyết, tổng lượng chất thải thực phẩm sản xuất ở Bắc Mỹ và Châu Âu có thể có khả năng giảm tình trạng đói nghèo trên thế giới ba lần (Stuart, 2009). Đứng trước những thực trạng trên, đòi hỏi cần có những giải pháp lâu dài, hiệu quả, mang tính công nghệ và đặc biệt là an toàn cho môi trường để xử lý rác thải. Ngày nay, sự phát triển của công nghệ sinh học đặc biệt là công nghệ vi sinh vật ngày càng đóng một vai trò quan trọng trong lĩnh vực bảo vệ môi trường. Nhiều quy trình công nghệ xử lý ô nhiễm môi trường hiện tại được xây dựng trên cơ sở tham gia tích cực của vi sinh vật (Tăng thị Chính, 2001; ê ia Hy, 2010; Ngô Kế Sương và Nguyễn ân Dũng, 1997). Các quy trình xử lý chất thải hữu cơ như các quá trình ủ phân compost (ủ windrow,ủ vermicomposting ) (VermiCo, 201 , Purkayastha, 2012; Munnoli và cộng sự, 2010; Shivakumar và cộng sự, 2009) và các quá trình phân hủy kị khí là những công nghệ đầy triển vọng (Shin et. Al, 2010, uiroga và cộng sự, 2014, Dai và cộng sự, 201 , Bernstad và cộng sự, 201 , Rounsefell và cộng sự, 201 ). Ayalon và ctv (2001) đã gợi ý rằng các biện pháp hiệu quả nhất để xử lý thành phần hữu cơ có khả năng phân huỷ để tránh làm giảm CO2 là ủ hiếu khí. Việc lựa chọn các vi sinh vật xử lý rác thải cần lựa chọn các chủng vi sinh vật phải có hoạt tính sinh học cao như khả năng sinh phức hệ enzyme ngoại bào cao và ổn định, khả năng trưởng và phát triển tốt trong điều kiện thực tế của đóng ủ. Có tác dụng cải tạo đất và có lợi cho thực vật khi sản xuất được phân ủ bón vào đất, không độc cho người, cây trồng, động vật và vi sinh vật hữu ích trong đất, nuôi cấy dễ dàng, sinh trưởng tốt trên môi trường tự nhiên, thuận lợi cho quá trình xử lý (Tăng thị Chính, 2001; ê ia Hy, 2010; Ngô Kế Sương và Nguyễn ân Dũng, 1997). Hiện nay, hầu hết các sản phẩm vi sinh đều được sản xuất từ một loại vi sinh vật, hay phối hợp nhiều chủng vi sinh vật với nhau có tác dụng hỗ trợ cho nhau cùng phát huy tác dụng chuyên biệt của chúng như: (cố định đạm cộng sinh – Nitragin, Rhizoda; Cố định đạm hội sinh, tự do – Azogin, Rhizolu; Phân giải hợp chất photpho khó tan – Phosphobacterein, phân giải lân, kích thích sinh trưởng hoặc 2
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP kết hợp với chủng vi sinh có khả năng hạn chế bệnh trong đất hại cây trồng) (Nguyễn Văn Ninh, 2011) .Trong số các chủng vi sinh vật được dùng để phối trộn vào thức ăn thừa để chế tạo phân bón vi sinh thì có hai chủng được biết đến nhiều là Bacillus subtilis và Lactobacillus (Ieshita và ctv 2011). Xuất phát từ lí do trên nên sinh viên chọn đề tài “ Sử dụn i u n Bacillus Subtillis à Lactobacillus t ủ p n t ức ăn t ừa t o p n b n d n lỏn ” 2. Tính cấp thiết đề tài Hằng năm, nước ta phải nhập khẩu phân bón lá từ nước ngoài về để phục vụ trong sản xuất nông nghiệp. Trong khi nguồn rác thải hữu cơ trong nước ( chủ yếu từ các nhà hàng, khách sạn và các chợ) rất nhiều gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe của người dân. Việc tận dụng nguồn rác thải này để sản xuất phân bón nhằm hạn chế việc nhập khẩu và hạn chế nguồn rác thải rất cần thiết. 3. Mục đích nghiên cứu Sử dụng các chế phẩm Vi sinh hữu hiệu để phân hủy bã phụ phẩm thừa tạo thành sản phẩm phân bón hữu cơ sinh học phục vụ nông nghiệp. óp phần tái sử dụng các phế phụ liệu, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và nâng cao chất lượng nông sản. 4. Mục tiêu cụ thể Sử dụng một số vi sinh vật để phân hủy bã phụ phẩm thừa trong điều kiện thiếu khí. Xác định được loại chế phẩm phù hợp cho hiệu quả phân hủy cao trong điều kiện hiếu khí. Xây dựng qui trình chế biến bã phụ phẩm thừa thành phân bón hữu cơ sinh học chất lượng cao phục vụ canh tác cây trồng. 5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 5.1. Nội dung - Nội dung 1: Đánh giá ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn của chủng vi sinh vật Bacillus subtilis và Lactobacillus. - Nội dung 2: Định lượng TPC và định lượng coliform trong mẫu. 3
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Nội dung : Đánh giá hiệu quả của phân bón trên cây rau cải mầm 5.2. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thu thập thông tin: Thu thập các nguồn tài liệu từ sách, báo, internet, thư viện, từ các cơ quan, đơn vị có lưu trữ các nguồn tài liệu có liên quan đến đề tài nghiên cứu. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu: Kết quả thực nghiệm thu được sẽ được xử lý nhờ vào các phần mềm tin học như SAS, Microsoft word, Excel và cho ra các bảng biểu, đồ thị, bản vẽ với kết quả nghiên cứu tin cậy và tối ưu. Phương pháp thực nghiệm: Nghiên cứu thực nghiệm từ phòng thí nghiệm có đủ các dụng cụ, thiết bị thí nghiệm và hóa chất cần thiết. 6. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp - Phần mở đầu - Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu. - Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án. - Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được. - Chương 4: kết luận và kiến nghị, nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài. 4
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ RÁC THẢI HỮU CƠ 1.1.1. Khái niệm về rác thải hữu cơ Rác thải hữu cơ là loại rác thải có nguồn gốc từ thiên và có thành phần chính là C, H, O. Ngoài thành phần chính này, rác thải hữu cơ còn có thêm các thành phần khác như S, N, P Nói một cách khái quát, dễ hiểu hơn thì đó là các chất thải được loại bỏ từ nguyên liệu thực phẩm. thức ăn thừa, vỏ và hoa quả, bánh kẹo, hoa lá trang trí trong nhà đã bị héo mà con người không dung được nữa, vứt bỏ vào môi trường sống. 1.1.2. Nguồn gốc phát sinh rác thải hữu cơ Từ các hoạt động sản xuất nông nghiệp: Nguồn chất thải chủ yếu từ các cánh đồng sau mùa vụ, các trang trại, các vườn cây, Rác thải chủ yếu thực phẩm dư thừa, phân gia súc, rác nông nghiệp, các chất thải ra từ trồng trọt, từ quá trình thu hoạch sản phẩm, chế biến các sản phẩm nông nghiệp. Từ các động thương mại: uầy hàng, nhà hàng, chợ, văn phòng cơ quan, khách sạn, Các nguồn thải có thành phần tương tự như đối với các khu dân cư. Từ khu dân cư: Bao gồm các khu dân cư tập trung, những hộ dân cư tách rời. Nguồn rác thải chủ yếu là: thực phẩm dư thừa. 1.1.3. Đặc điểm rác thải hữu cơ Rác hữu cơ dễ phân hủy (thực vật, chất thải động vật, giấy ) có thể đem chế biến thành phân bón, ủ kín phân hủy nhờ vi sinh vật, tạo khí thiên nhiên làm nhiên liệu 1.1.4. Phân loại rác thải Phân loại rác thải theo nguồn gốc phát sinh. Chất thải từ các hộ gia đình hay còn gọi là rác thải sinh hoạt. Chất thải từ các hoạt động sản xuất, kinh doanh, thương mại: là những chất thải có nguồn gốc phát sinh từ các ngành như công nghiệp, nông nghiệp, dịch vụ. 1.1.5. Các phương thức xử lý rác thải - Ủ sinh học: Đối với các loại rác thải chứa các chất hữu cơ. 5
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Chôn lấp: Đối với các loại rác thải không thể chế biến được nữa. - Thiêu đốt: Đối với một số loại rác thải độc hại. 1.2. TỔNG QUAN VỀ PHÂN BÓN LÁ 1.2.1. Lịch sử phát triển n 1 1. c lo i p n b n l t n t t n . Phân bón lá được sử dụng ở Việt Nam từ đầu những năm 1980 của thế kỷ trước, tuy nhiên phải đến năm 2000, thuật ngữ phân bón lá mới được chính thức đề cập trong các văn bản pháp qui của Nhà nước (Nghị định số 11 /200 /NĐ-CP ngày 07/10/200 và các thông tư, quyết định của Bộ Nông nghiệp và PTNT). Vai trò của phân bón lá ngày càng tăng do việc sử dụng lâu dài các nguyên tố dinh dưỡng đa trung lượng mà không có bổ sung các chất vi lượng. Hơn nữa, nhiều nguyên tố, nhất là vi lượng dễ bị kết tủa khi thay đổi môi trường đất, rửa trôi nên việc đưa các nguyên tố này vào cây trồng thông qua lá là phương pháp hiệu quả. Hầu hết phân bón lá cho hiệu lực nhanh, kinh tế hơn bón vào đất do cây sử dụng đến 95% lượng dinh dưỡng bón vào, trong khi hệ số sử dụng phân bón tương tự khi bón vào đất chỉ đạt 45-50%, thậm chí thấp hơn. Một trong những nguyên nhân cơ bản là cây trồng tiếp nhận dinh dưỡng do bón qua lá với diện tích bằng 15-20 lần diện tích đất ở tán cây che phủ. Phân bón lá được cây trồng hấp thu qua bề mặt lá thông qua hệ thống khí khổng. Phân bón lá được ví như một loại phân cung cấp vitamin hay thuốc bổ nhằm 6
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP hỗ trợ cho cây trồng vào những thời điểm đặc biệt như ra lá, ra hoa, ra trái, tăng sức đề kháng khi cây gặp thời tiết bất lợi hay cây mau phục hồi khi bị sâu bệnh tấn công , phân bón lá là phân ở dạng hòa tan trong nước như vitamin, humat, vi lượng, hay các thành phần khoáng đa lượng trung lượng khác. Người ta kết hợp sử dụng phân bón lá với một số chất kích thích để điều khiển quá trình sản xuất của cây trồng. 1.2.2. Mục tiêu chính khi sử dụng phân bón lá Bổ sung thêm các chất dinh dưỡng còn thiếu mà đất và phân bón đa lượng không thể cung cấp đủ. iúp cây trồng khắc phục các hạn chế khi việc cung cấp dinh dưỡng qua đất bị ảnh hưởng của nhiệt độ, cường độ chiếu sáng, phản ứng của đất, hoặc xuất hiện các yếu tố dinh dưỡng đối kháng. Cung cấp các chất dinh dưỡng theo hướng tăng cường chức năng, nhất là trong các giai đoạn sinh trưởng sinh thực của cây trồng (hình thành quả, củ, chỉ tiêu chất lượng ). Hạn chế mất chất dinh dưỡng trong đất do bị cố định hoặc bị rửa trôi. Một số nguyên tố dinh dưỡng, thậm chí được khuyến cáo chỉ nên bón qua lá như bón sắt vào đất kiềm, bón các nguyên tố vi lượng 1.2.3. Phân loại phân bón lá Có thể chia phân bón lá thành các nhóm theo: Dạng, thành phần dinh dưỡng và theo cơ chế liên kết các nguyên tố dinh dưỡng. Theo dạng thì phân bón lá được chia thành: Dạng rắn và dạng lỏng. Theo thành phần có thể chia phân bón lá thành nhóm: Chỉ có các yếu tố dinh dưỡng vô cơ riêng rẽ hoặc phối hợp (đa lượng, trung lượng và vi lượng). Có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (kích thích, ức chế ) và có thuốc bảo vệ thực vật. Theo cơ chế liên kết các nguyên tố dinh dưỡng thì phân bón lá được chia thành 2 nhóm: dạng vô cơ, dạng hữu cơ (trong đó có xelat) và hữu cơ-khoáng. 1.2.4. Con đường hấp thu phân bón lá 7
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Ngoài con đường đi qua khe hở của lớp sáp, còn con đường khác chất tan có thể đi vào tế bào biểu bì lá là đi qua khí khổng trên bề mặt lá. Khí khổng trên lá rất nhiều tùy theo loài. Có những loài khoảng 100 khí khổng/ 1mm2 lá, có loài vài ngàn khí khổng/1 mm2 . Vai trò của khí khổng giúp cây trồng thoát hơi nước tốt để ổn định nhiệt độ của cây. Đồng thời khi khí khổng mở khí CO2 đi vào giúp cho cây quang hợp. Chất tan khi phun qua lá sẽ đi qua khí khổng tuy nhiên khí khổng rất nhỏ nên trong phân bón lá có những phụ gia để làm giảm áp suất hơi từ trong ra. Sự xâm nhập của chất lỏng xuyên qua bề mặt có sức căng cao và các khí khổng có thể xảy ra dưới một số điều kiện. Một trong những điều kiện này là tạo các giọt nhỏ liên kết với sự bốc hơi. Khi sự bốc hơi xảy ra, mức độ xâm nhập đạt cao nhất và sự hấp thu liên tục xảy ra với các phần chất rắn còn lại. Sự xâm nhập chất dinh dưỡng còn vào các không bào bên trong lá cây. Các không bào rất quan trọng để chứa các chất dinh dưỡng trước khi chúng được hấp thu vào bên trong từng tế bào. Các chất dinh dưỡng sẽ vào những không bào này sau khi xâm nhập từ bên ngoài qua lớp biểu bì lá cũng như được hấp thu từ rễ qua các mao mạch trong thân cây. Những nguyên tắc chung về việc hấp thu chất dinh dưỡng khoáng từ các không bào bên trong từng tế bào lá cũng giống như sự hấp thu từ bộ rễ. Sự hấp thu qua các tế bào lá có thể được điều khiển qua tình trạng dinh dưỡng của cây trồng, nhưng đây không phải là quy luật chung mặc dù hiện tượng này đã được khám phá đối với sự hấp thu lân. Việc hấp thu lân qua lá và vận chuyển xuống rễ xảy ra nhanh hơn đối với cây đang thiếu lân. Kế tiếp phân bón lá xâm nhập vào màng tế bào. Đây là thành phần sống của tế bào cấu tạo bởi phospholipid và trên đó có gắn những protein giữa những protein có những khoảng hở để cho các chất tan chui qua. 1.2.5. Lưu ý khi sử dụng phân bón lá Bón qua lá tốt nhất khi bón bổ sung hoặc bón thúc nhằm đáp ứng nhanh yêu cầu dinh dưỡng của cây, hòa loãng phân theo đúng tỷ lệ trên bao bì; nhiệt độ quá cao, đất bị khô hạn nặng không nên dùng phân bón lá vì dễ làm rụng lá. Không sử 8
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP dụng phân bón lá lúc cây đang ra hoa, lúc trời nắng vì sẽ làm rụng hoa quả và làm giảm hiệu lực phân. Không nên nhầm lẫn giữa phân bón lá và chất kích thích sinh trưởng, nếu trong phân bón lá có chất kích thích sinh trưởng thì trong phân này đã có chất dinh dưỡng, nếu chỉ dùng kích thích sinh trưỏng thì phải bổ sung thêm dinh dưỡng để cây tăng trưởng tương ứng với sự kích thích đó. 1.2.6. Các loại chất dinh dư ng cung cấp cho cây t phân bón Các loại phân bón thường cung cấp, theo các thành phần tỷ lệ khác nhau: Ba chất dinh dưỡng cơ bản: Nitơ (N) , Photpho (P) và Kali (K). Ba chất dinh dưỡng hàng hai như: Canxi (Ca), Sulfur (S), Magie (Mg). Và vi chất dinh dưỡng hay vi lượng khoáng: Boron (Bo), Clo (Cl), Mangan (Mn), sắt (Fe), kẽm (Zn), đồng (Cu), . Các chất dinh dưỡng được tiêu thụ với những số lượng lớn và hiện diện trong mô cây với các số lượng từ 0.2% đến 4.0% (theo cơ sở trọng lượng khô). Các vi chất dinh dưỡng được thiêu thụ với số lượng ít và hiện diện trong mô cây với các số lượng được đo đạc là vài phần triệu (ppm), trong khoảng từ 5 tới 200 ppm, hay chưa tới 0.02% trọng lượng khô. 1.3. Phân bón vi sinh 1.3.1. Gi i thiệu chung về phân bón vi sinh v t Vi sinh vật (vsv) là một thành phần của hệ thống sinh học đất. Cùng với chất hữu cơ, vi sinh vật sống trong đất, nước và vùng rễ cây có vai trò quan trọng trong các mối quan hệ giữa cây và đất trồng. Hầu như mọi quá trình xảy ra trong đất đều có sự tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp của vi sinh vật (quá trình mùn hóa, khoáng hóa hợp chất chất hữu cơ, quá trình phân giải hoặc cố định hợp chất vô cơ v.v ). Vi sinh vật là một yếu tố sinh học có ý nghĩa của hệ thống dinh dưỡng cây trồng. 9
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP H nh 1.2: c c lo i p n u c i sin an c t n t t n . Tại nhiều quốc gia trên thế giới, phân bón vi sinh vật được hiểu là các sản phẩm chứa các vi sinh vật tồn tại dưới dạng tế bào sinh dưỡng hoặc tiềm sinh thuộc các nhóm vi sinh vật có khả năng cố định nitơ; phân giải hợp chất photpho khó tan, sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật v.v sử dụng để chủng vào đất và cây trồng; (Tiêu chuẩn Việt Nam năm 1996 (TCVN6169-1996) định nghĩa: "Phân vi sinh vật (phân vi sinh) là sản phẩm chứa các vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn có mật độ phù hợp với tiêu chuẩn ban hành, thông qua các hoạt động sống của chúng tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng được (N, P, K, S, Fe ) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất và (hoặc) chất lượng nông sản. Phân vi sinh vật phải bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến người, động, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản". Theo công nghệ sản xuất có thể chia phân vi sinh thành hai loại như sau: Phân vi sinh trên nền chất mang khử trùng có mật độ vi sinh hữu ích > 109 CFU/g(ml) và mật độ vi sinh vật tạp nhiễm thấp hơn 1/1.000 so với vi sinh vật hữu ích. Phân bón dạng này tạo thành trên cơ sở chủng sinh khối vi sinh vật sống đã qua tuyển chọn vào cơ chất đã được xử lý vô trùng bằng các phương 10
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP pháp khác nhau. Phân bón vi sinh vật trên nền chất mang khử trùng được sử dụng dưới dạng chủng hạt, hồ rễ hoặc tưới phủ với liều lượng 1 - 1,5 kg hoặc lít/ha canh tác. Phân vi sinh trên nền chất mang không khử trùng được sản xuất bằng cách tẩm nhiễm trực tiếp sinh khối vi sinh vật sống đã qua tuyển chọn vào cơ chất không thông qua công đoạn khử trùng. Phân bón dạng này có mật độ vi sinh vật hữu ích > 106 CFU/g(ml) và được sử dụng với số lượng từ vài trăm đến hàng ngàn kg (lít)/ha. Đối với phân bón vi sinh vật trên nền chất mang không khử trùng, tùy theo thành phần các chất chứa trong chất mang mà phân bón vi sinh vật dạng này được phân biệt thành phân hữu cơ vi sinh vật (phân hữu cơ có chứa các vi sinh vật sống) hoặc phân hữu cơ khoáng vi sinh vật (một dạng của phân hữu cơ vi sinh vật có chứa một lượng nhất định các dinh dưỡng khoáng). Dựa trên cơ sở tính năng tác dụng của các vi sinh vật chứa trong phân bón, phân bón vi sinh vật còn được gọi dưới các tên: Phân vi sinh vật cố định nitơ (phân đạm vi sinh); phân vi sinh vật phân giải hợp chất phosphor khó tan (phân lân vi sinh); phân vi sinh vật kích thích, điều hòa sinh trưởng thực vật và phân vi sinh vật chức năng. oại phân bón vi sinh vật chính đang được sử dụng rộng rãi trong sản xuất hiện nay là phân vi sinh vật cố định nitơ (phân đạm sinh học) và phân vi sinh vật phân giải phosphate khó tan (phân lân vi sinh). 1.3.2. Phân vi sinh v t cố định nitơ Nitơ là nguyên tố trơ khó liên kết hóa học với các nguyên tố khác, nếu không có chất xúc tác và các điều kiện đặc biệt khác. Nitơ không ngừng bị chuyển hoá trong một chu trình khép kín do các tác động sinh học hay hoá học khác nhau. Dưới tác động của các hoạt động hoá học hoặc sinh học, nitơ phân tử được chuyển hoá thành đạm vô cơ, sau chuyển hoá thành đạm thực vật hoặc động vật thông qua quá trình đồng hoá. Một phần đạm thực vật dưới dạng tàn dư thực vật và một phần khác được người, động vật thải ra dưới dạng phân bã được trả lại cho đất. Đạm trong đất, 11
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP một phần được cây trồng sử dụng, số còn lại bị mất do thẩm lậu, rửa trôi hoặc bay hơi do hoạt động của các vi sinh vật đất có khả năng phân giải đạm. uá trình đất mất đạm chịu ảnh hưởng rất lớn bởi chế độ canh tác. Trong tự nhiên, nitơ phân tử tồn tại dưới dạng khí chiếm tới 78,16% thể tích không khí, song hợp chất nitơ này lại không sử dụng được làm nguồn dinh dưỡng cho sinh vật. Để cây trồng có thể sử dụng nguồn tài nguyên này làm chất dinh dưỡng, nitơ không khí phải được chuyển hoá thông qua quá trình cố định nitơ (cố định đạm), trong đó nitơ phân tử được chuyển hoá thành amôn. uá trình cố định nitơ có thể xảy ra nhờ các tác nhân vật lý, hóa học hoặc sinh học, trong đó quá trình cố định đạm sinh học được quan tâm nhiều đến vì hiệu quả và tính an toàn đối với môi trường. Cố định đạm sinh học là quá trình khử N2 thành NH3 dưới xúc tác của enzym nitrogenase khi có mặt của ATP theo sơ đồ phản ứng như sau: N= N NH = NH H2N - NH2 NH3 + - Nitrogenase N2 +8H +8e +16 Mg.ATP +16 O 2 NH3 +H2 +16 Mg.ADP +16 P Căn cứ vào đặc điểm của các loại vi sinh vật và mối quan hệ của chúng đối với cây trồng, vi sinh vật cố định nitơ được chia thành các loại cố định nitơ cộng sinh, cố định nitơ tự do và cố định ni tơ hội sinh. 1.3.3. Phân lân vi sinh Vi sinh vật phân giải lân - vi sinh vật chuyển hóa lân (Phosphate Solubilizing Microorganisms - PSM) hay còn được gọi là vi sinh vật huy động lân (Phosphate mobilizing Microorganisms) là các vi sinh vật có khả năng chuyển hoá hợp chất phosphor khó tan thành dạng dễ tiêu cho cây trồng sử dụng. Các vi sinh vật phân giải hợp chất phosphor khó tan được biết đến nay gồm cả vi khuẩn, nấm mốc và nấm men. Vi sinh vật phân giải lân không chỉ là các vi sinh vật chuyển hoá phosphate vô cơ, mà bao gồm cả các vi sinh vật có khả năng khoáng hóa các hợp chất lân hữu cơ tạo nguồn lân dễ tiêu cung cấp cho đất và cây trồng. 1.3.4. Các loại phân bón vi sinh khác 12
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân bón vi sinh phân giải silicat: có chứa vi sinh vật tiết ra các hợp chất có khả năng hòa tan các khoáng vật chứa silicat trong đất, đá để giải phóng ion kali, silic vào môi trường. Các chủng vi sinh được dùng bao gồm: Bacillus megaterium var. phosphaticum, Bacillus subtilis, Bacillus circulans, Bacillus mucilaginous, Pseudomonas striata. Phân bón vi sinh tăng cường hấp thu phốt pho, kali, sắt, mangan cho thực vật: có chứa vi sinh vật (chủ yếu là nhóm nấm rễ, vi khuẩn, xạ khuẩn ) trong quá trình sinh trưởng, phát triển, thông qua hệ sợi cũng như những thể dự trữ, có khả năng tăng cường hấp thu các ion khoáng của cây. Các chủng vi sinh được dùng bao gồm: Arbuscular mycorrhiza, Ectomycorrhiza, Ericoid mycorrhizae, Rhizoctonia solani, Bacillus sp, Pseudomonas putida, P. fluorescens Chao và P. fluorescens Tabriz. oại PBVS này chưa được thương mại nhiều, vẫn còn đang trong giai đoạn nghiên cứu. Phân bón vi sinh ức chế vi sinh vật gây bệnh: chứa vi sinh vật tiết ra các hợp chất kháng sinh hoặc phức chất siderophore có tác dụng kìm hãm, ức chế nhóm vi sinh vật gây bệnh khác. Các chủng vi sinh được dùng bao gồm Bacillus sp., Enterobacter agglomerans, Pseudomonas sp., Lactobacillus sp. Phân bón vi sinh tăng cường hấp thu phốt pho, kali, sắt, mangan cho thực vật: chứa vi sinh vật (chủ yếu là nhóm nấm rễ, vi khuẩn, xạ khuẩn ), trong quá trình sinh trưởng, phát triển, thông qua hệ sợi cũng như những thể dự trữ, có khả năng tăng cường hấp thu các ion khoáng của cây. Các chủng vi sinh được dùng bao gồm: Arbuscular mycorrhiza, Ectomycorrhiza, Ericoid mycorrhizae, Rhizoctonia solani, Bacillus sp, Pseudomonas putida, P. fluorescens Chao và P. fluorescens Tabriz. Phân bón vi sinh sinh chất giữ ẩm polysacarit: có chứa vi sinh vật tiết ra các polysacarit có tác dụng tăng cường liên kết các hạt khoáng, sét, limon trong đất. oại này có ích trong thời điểm khô hạn. Các chủng vi sinh được dùng bao gồm Lipomyces sp. oại này chưa có sản phẩm thương mại tại Việt Nam. Phân bón vi sinh phân giải hợp chất hữu cơ (phân giải xenlulo): có chứa vi sinh vật tiết ra các enzym có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ như: xenlulo, hemixenlulo, lighin, kitin Các chủng vi 13
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP sinh được dùng bao gồm: Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Trichoderma, Penicillium, Aspergillus. Phân bón vi sinh sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật: có chứa VSV tiết ra các hocmoon sinh trưởng thực vật thuộc nhóm: IAA, Auxin, iberrillin vào môi trường. Các chủng vi sinh được dùng bao gồm: Azotobacter chroococcum, Azotobacter vinelandii, Azotobacter bejerinckii, Pseudomonas fluorescens, Gibberella fujikuroi. Thời gian gần đây, cùng với những tiến bộ của khoa học và công nghệ, các nhà khoa học đã sử dụng công nghệ gen để tạo ra các chủng vi sinh có nhiều đặc điểm tốt, cạnh tranh cao với các loài vi sinh vật trong đất. Các chủng biến đổi gen có thể kể đến như: Pseudomonas putida strain CBI, Pseudomonas putida strain TVA8, Alcaligenes xylosoxidans subspecies denitrificans strain AL6.1 Do sự quan trọng của các giống vi sinh vật nên đã có bảo tàng giống vi sinh vật sử dụng cho nông nghiệp để tàng trữ các loại vi sinh hữu ích này. Trên thế giới có thể kể đến Bộ thu thập vi sinh vật nông nghiệp Trung uốc (ACCC), Bộ thu thập Rhizobium tại Úc, Colombia (CIAT), Malayxia (UPMR), Thái Lan (CISM), Anh (WPBS), Bộ thu thập Cyanobacteria tại Baxin (BCCUSP), Bộ thu thập vi sinh vật nông nghiệp Hàn uốc (KACC), Bộ thu thập vi sinh vật môi trường tại Hàn uốc (KEMC), Bộ thu thập vi sinh vật nông nghiệp tại Nga (RCAM), Nguồn gen VSV tại Mỹ (NRR ), v.v Ở Việt Nam, cũng có các bảo tàng giống vi sinh vật như Bộ Sưu tập vi sinh vật Công nghiệp - Viện Công nghiệp thực phẩm Hà Nội, lưu giữ 1.100 chủng vi sinh vật, Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) lưu giữ 8.000 chủng vi sinh vật, uĩ gen vi sinh vật trồng trọt (đất, phân bón) thuộc viện Thổ nhưỡng Nông hóa lưu giữ gần 700 chủng vi sinh vật. 1.4. GIỚI THIỆU VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS VÀ LACTOBACILLUS 1.4.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis Lịch sử Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 18 5 do Christion Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. ần 0 năm sau, Casimir 14
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis. Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học Nazi của Đức. úc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. ần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời. Bacillus subtilis được sử dụng ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường 1.4.2. Phân loại Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc: iới (Kingdom): Bacteria. Nghành (Division): Firmicute. ớp (Class): Bacilli. Bộ (Order): Bacillales. Họ (Family): Bacillaceae. iống ( enus): Bacillus. Loài (Species): Bacillus subtilis 15
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.3: Tế bào Bacillus subtilis. 1.4.3. Đặc điểm của Bacillus subtilis 1.4.4. Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có 6 7 khoảng 10 -10 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì (trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79 % vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương, chao Bacillus subtilis đóng vai trò đáng kể về mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học. Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ là vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như Bacillus popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB). Năm 199 , giáo sư Richard osik và cộng sự thuộc Đại học Havard ở Boston (Mỹ) và Jose Gonzalez-Pastor của Trung tâm công nghệ sinh học quốc gia ở Madrid (Tây Ban Nha) đã chứng minh được loài Bacillus subtilis có tập tính ăn thịt đồng loại. Chúng dùng cách này như một phương pháp đơn giản để thoát khỏi những trường hợp có đời sống giới hạn như dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt. Một cách đơn giản là các cá thể khỏe mạnh sinh tổng hợp kháng sinh tiêu diệt những cá thể xung quanh cả khác loài lẫn cùng loài, để thu lấy chất dinh dưỡng bên trong, giúp chúng sống sót chờ đến khi môi trường thuận lợi hơn. Ngoài ra, để tránh những ảnh hưởng của môi trường khắc nghiệt, chúng thường tạo ra bào tử, nhưng cách này tiêu hao khá nhiều năng lượng. 16
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.4.5. Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím ram (+), kích thước 0,5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8 µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong 200 – 00 năm. 1.4.6. Đặc điểm sinh hóa ên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose và arabinose. Thử nghiệm indol (-), VP (+), nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein, (+), citrate (+), có khả năng di động (+) và hiếu khí (+). Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis STT Phản ứng sinh hóa Kết quả 1 Hoạt tính catalase + 2 Sinh indol - 3 MR (Metyl red) + 4 VP (Voges – Proskauer) + 5 Sử dụng Citrate + 6 Khử Nitrate + 7 Tan chảy gelatin + 8 Di động + 9 Phân giải tinh bột + 10 Arabinose + 17
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 11 Xylose + 12 Saccharose + 13 Manitol + 14 Glucose + 15 Lactose - 16 Maltose + (T eo olt,1992)(T íc Lý Kim u, 2005) 1.4.7. Đặc điểm nuôi cấy Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát triển được trong môi trường thiếu oxy. Nhiệt độ tối ưu là 7°C, pH thích hợp khoãng 7.0 – 7.4. Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ bản: - Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. - Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều. - Trên môi trường giá đậu – peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi khi lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính – 4 cm sau 72 giờ nuôi cấy. Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vi lượng khác. Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (như glucose) và nitơ (như peptone). 1.4.8. Bộ gen của Bacillus subtilis 18
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Năm 1997, người ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của Bacillus subtilis và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn này. Bộ gen chứa 4,2 mega - base, xấp xỉ 4.110 gen. Trong số đó, chỉ có 192 gen không thể thiếu được, 79 gen được dự đoán là thiết yếu. Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào. 1.4.9. Bào tử và khả năng tạo bào tử Bào tử - Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và có thêm một số thành phần mới. - Bào tử Bacillus subtilis có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 – 0,9 µm x 1,0 – 1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein, peptidoglycan Bào tử của chúng có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày, tiến đến ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non. Đây là đặc điểm quan trọng trong ứng dụng sản xuất probiotic từ Bacillus subtilis (Nguyễn Duy Khánh, 2006). Khả năng tạo bào tử Nhờ khả năng tạo bào tử mà vi khuẩn có thể tồn tại được trong các điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, môi trường tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại và nhiệt độ cao ). uá trình hình thành bào tử gồm các bước sau: Hình thành những búi chất nhiễm sắc. Tạo tiền bào tử Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính bức xạ Tổng hợp các lớp vỏ bào tử iải phóng bào tử Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử sẻ nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng mới ( Nguyễn ân Dũng và cộng sự, 200 ). 1.4.10. Tính đối kháng và khả năng sinh bacteriocin 19
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trong mỗi môi trường và điều kiện môi trường khác nhau, mỗi chủng loài vi khuẩn lại có khả năng sinh trưởng và phát triển khác nhau. Khi thay đổi môi trường sống của chúng hay các yếu tố môi trường bất lợi làm điều kiện môi trường sống thay đổi theo chiều hướng bất lợi cho vi sinh vật sẽ làm chúng sinh trưởng và phát triển kém đi hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Theo Bùi Thị Phi, nếu môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với số lượng lớn sẽ cạnh tranh sinh dưỡng và không gian sống giữa vi khuẩn và nấm. Bacillus phát triển khá nhanh nên sẽ phát triển trước so với nấm nên sẽ sử dụng phần lớn chất dinh dưỡng và sinh ra một số chất ức chế sự phát triển của nấm bệnh. 1.4.11. Ứng dụng của Bacillus subtilis trong sản xuất và đời sống Trong nông nghiệp, Nhật Bản có sản phẩm EM dùng sản xuất phân bón hữu cơ. 198 viện vaxcin cơ sở 2 Đà ạt đã sản xuất Biosubtyl dạng bột khô rất thuận tiện cho người sử dụng. Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội đã sản xuất chế phẩm subtin từ Bacillus subtilis để phòng trừ nấm bệnh Ostriniaa furnacalis trên bắp. 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Kumura từ Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm Aspergillus Flavus, A. paraciticus. 1977, Nguyễn Vĩnh Phước, Bacillus subtilis tạo kháng sinh subtilin và Bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn r+ và r-. 1.5. Gi i thiệu về vi khuẩn Lactobacillus spp 1.5.1. Lịch sử nghiên cứu về Lactobacillus spp Trong suốt 15 năm qua, các nhà nghiên cứu đã tìm ra được gần hơn 25 loài khác nhau từ các chi Lactobacillus trong đó phải kể đến các chủng tiêu biểu như Lactobacillus acidop ilus (L.acidophilus), Lactobacillus casei (L.casei), 20
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Lactobacillus fe mentum (L.fermentum), Lactobacillus planta um (L.plantarum), Lactobacillus brevis (L.brevis) hayLactobacillus bul a icus (L bul a icus), Phần lớn các chủng Lactobacillus có nguồn gốc từ dạ dày – ruột người và trong âm đạo. Hầu hết chúng đều có khả năng chuyển đường thành acid lactic, ngoài ra nó còn có thể tiết ra Bacteriocin – một loại hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn có phổ ức chế vi sinh vật khá rộng và không gây ra tính kháng kháng sinh ở các vi khuẩn gây bệnh. Hiện nay chúng là đối tượng nghiên cứu chính về probiotic cho con người vì có tiềm năng trong việc điều trị các bệnh viêm nhiễm, kháng các vi khuẩn gây bệnh, khử cholesterol huyết thanh, chống ung thư, mang nhiều lợi ích đối với sức khỏe con người. Ngoài ra Lactobacillus còn điều hòa các miễn dịch không đặc hiệu bằng cách kích thích hoạt động của lympho bào, các đại thực bào và giảm cytokine. 1.5.2. Phân loại vi khuẩn Lactobacillus Theo khóa phân loại của vi khuẩn của Bergey’s, Lactobacillus được phân loại như sau : iới (Kingdom): Bacte ia Ngành (Phylum): Fi micutes ớp (Class): Bacilli Bộ (Order): Lactobacillales Họ (Family): Lactobacillaceae Chi ( enus): Lactobacillus Loài (Species): Lactobacillus spp. Hình 1.4: Tế bào Lactosebacilus 1.5.3. Đặc điểm phân bố Phần lớn các loại Lactobacillus là nhóm vi khuẩn có nguồn gốc từ dạ dày – ruột người, âm đạo. Chúng thường phân bố tương đối rộng rãi trong tự nhiên, có nhiều ở các môi trường sống chứa nhiều cacbohydrate và trông hầu hết các thực phẩm lên men như kim chi, sữa chua, phô mai, trong đường ruột của động vật, thủy sản và trong đường ruột, đường tiết niệu, đường sinh dục của người. 1.5.4. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus spp 21
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Lactobacillus là một nhóm gồm đa dạng các loài vi sinh vật. Chúng là những vi khuẩn ram dương, kích thước lớn 0,5 – 1,2 μm × 1 - 10 μm, đại bộ phận các loài không di động, không sinh bào tử, hình dạng thay đổi: Dạng que thẳng dài, que hơi cong như hình lưỡi liềm cho đến hình cầu có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng rẽ. 1.5.5. Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus spp Vi khuẩn Lactobacillus là vi khuẩn kị khí tùy nghi, chịu môi trường acid, có nhu cầu về dinh dưỡng phức tạp, phát triển trong điều kiện kị khí và sinh acid lactic. Nhiệt độ phát triển tối ưu thường là 0 – 450 C, pH tối ưu là 5,5 – 6,8. Lactobacillus được đặc trưng bởi khả năng sản xuất acid lactic là một sản phẩm của quá trình chuyển hóa glucose. Dựa trên các sản phẩm của quá trình biến dưỡng để phân chia các loài Lactobacillus thành 2 nhóm: Các loài lên men đồng hình và lên men dị hình.Khuẩn lạc của Lactobacillus thường có hình tròn, màu trắng đục hoặc trắng sữa có bờ đều, láng và lồi, mờ đục. Chúng không tạo mùi đặc trưng trên môi trường nuôi cấy thông thường. 1.5.6. Khả năng phân giả protein của vi khuẩn Lactobacillus spp Đa số các loài Lactobacillus có khả năng sản sinh enzyme phân giải protein. Phổ biến trong số đó là các chủng Lactobacillus bul a icus, L casein, L pa acasein, L fe mentum và L planta um. Hệ enzyme phân giải protein của nhiều loài Lactobacillus mang tính đặc hiệu cao tuy nhiên ở enzyme của một số loài lại có tính đặc hiệu ở phổ rộng dẫn đến có nhiều vùng cắt đặc hiệu cho một cơ chất. Hoạt tính này giúp cho các chế phẩm lên men từ Lactobacillus trở thành nguồn dinh dưỡng có giá trị cao cho con người, động vật hoặc trong phân bón. 1.5.7. Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng v i các vi khuẩn gây bệnh - Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn như các acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic), hydrogen peroxide, carbondioxide và diacetyl và đặc biệt là bacteriocin. Nhiều vi khuẩn ram (+), ram (-) bị ức chế bởi hydrogen peroxide. 22
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Acid lactic do vi khuẩn Lactobacillus sinh ra cùng với các cơ chất khác sẽ tạo một môi trường bất lợi cho vi sinh vật gây thối trong đường tiêu hóa phát triển do đó lượng urase trong ruột giảm, hơn nữa pH thấp do acid lactic tạo ra gây trở ngại cho NH hấp thu từ ruột vào mô và thúc đẩy việc bài tiết NH từ máu vào ruột. Những vi khuẩn gây thối rửa ở ruột kết tạo các enzyme β-glucuronidase, azoreductase và nitroreductase thành carcinogen (chất có vai trò trong việc hình thành và phát triển khối u), bằng các ức chế cạnh tranh và tạo môi trường acid không thuận lợi . Lactobacillus đã kiềm hãm sự trao đổi chất của vi khuẩn trong ruột điều này làm giảm sự hình thành carcinogen ở ruột già. 1.6. TỔNG QUAN VỀ ĐẠM TỔNG Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số. Nitơ có trong thành phần axit amin của protein là N protein. Nitơ không có trong thành phần protein như các muối đạm vô cơ, axit nitric, các axit amin tự do, ure và các dẫn xuất của ure, các alcaloit, các bazơ purin và pyrimidin là các nitơ phi protein. Nitơ tổng số = nitơ protein + nitơ phi protein 1.6.1. Phương pháp lấy mẫu Lấy mẫu sản phẩm để kiểm nghiệm là khâu đầu tiên và rất quan trọng trong công tác kiểm nghiệm. Việc lấy mẫu đúng quy cách sẽ góp phần cho kết quả kiểm nghiệm và xử lý sau này đúng đắn. Vì trong thực tế, người dùng phương pháp xác định nito tổng chỉ lấy một lượng mẫu rất nhỏ để kiểm nghiệm mà kết quả lại được dùng để đánh giá một cách khách quan chất lượng sản phẩm có khối lượng rất lớn. Vì vậy khi lấy mẫu chúng ta cần thực hiện các quy định dưới đây: Mẫu thực phẩm phải có đủ tính chất đại diện cho cả lô hàng thực phẩm đồng nhất. Trước khi lấy mẫu cần kiểm tra tính đồng nhất của lô hàng, xem xét các giấy tờ kèm theo, đối chiếu nhãn trên bao bì, để riêng các sản phẩm có bao bì không còn 23
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP nguyên vẹn (rách, thủng, vỡ, mất nhãn, ) phân chia số còn lại thành lô hàng đồng nhất. Đối với sản phẩm ở thể rắn: Cần chú ý đến sự không đồng đều về kích thước của sản phẩm, phải lấy cả sản phẩm có kích thước lớn và kích thước bé. Thường ta tiến hành chia điểm để lấy mẫu tuỳ theo hình dạng của đơn vị chứa sản phẩm. Đối với sản phẩm vừa ở thể rắn, vừa ở thể lỏng không đồng nhất khi lấy mẫu, lấy ở các vị trí khác nhau nhưng phải lấy cả phần rắn, cả phần lỏng theo đúng tỉ lệ của chúng ở trong sản phẩm. Đối với sản phẩm dạng sệt đồng nhất, khuấy kỹ và lấy mẫu đều ở các vị trí khác nhau. 1.6.2. Các phương pháp phân tích Protein nhằm xác định nito tổng Phương pháp xác định nito tổng (Protein) bằng phương pháp Lowry Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng màu của protein và thuốc thử Folin, cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ protein, và dựa vào đường chuẩn của protein, có thể tính được hàm lượng protein của mẫu nghiên cứu. Phương pháp xác định nito tổng (Protein) bằng phương pháp Coomassie Brilliant Blue G – 250 Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi Coomassie Brilliant Blue G – 250 liên kết với protein trong dung dịch axit. Dạng proton hoá của thuốc nhuộm Coomassie Blue có màu đỏ da cam. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Trong môi trường của các gốc mang điện tích dương, sự proton hoá không xảy ra và có màu xanh xuất hiện. Phương pháp xác định nito tổng (Protein) bằng phương pháp quang phổ Nguyên tắc: Phát hiện và đo protein: Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch là độ hấp thụ tia cực tím của nó. Nếu protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối của nó được tính theo giá trị được đo. Nếu protein không tinh sạch thì nồng độ của protein tổng số được tính tương đối từ độ hấp phụ. 24
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phương pháp xác định nito tổng (Protein) bằng phương pháp Dumasphương pháp xác định nito tổng Nguyên tắc: Phương pháp đốt cháy Dumas để xác định protein thô. uy trình dùng một thiết bị lò điện đun nóng mẫu phân tích lên đến 600oC trong một lò phản ứng được bịt kín với sự hiện diện của oxy. Hàm lượng nitơ của khí đốt sau đó được đo bằng cách dùng máy dò dẫn nhiệt. Mỗi lần xác định chỉ cần khoảng 2 phút. Phương pháp xác định nito tổng (Protein) bằng phương pháp kjeldahl Nguyên tắc: Mẫu được vô cơ hoá bằng H2SO4đđ ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác. Oxy tạo thành trong phản ứng lại oxy hoá các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Các protein bị thuỷ phân thành axit amin. Cacbon và hydro của axit amin tạo thành CO2 và H2O, còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với axit H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch. 1.7. TỔNG QUAN VỀ AMINO ACID Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein. Chúng tạo thành các xích polymer ngắn gọi là peptide hay polypeptides để rồi tạo thành cấu trúc gọi là protein. uá trình tạo thành từ mARN làm mẫu gọi là dịch mã, là một phần của tổng hợp protein. Phenylalanine là một trong amino acid chuẩn. Có 20 loại amino acid được mã hóa bởi mã di truyền chuẩn và được gọi là proteinogenic hay amino acid chuẩn. Việc kết hợp các amino acid này tạo ra protein thiết yếu cho việc cấu thành cơ thể người. Có ít nhất hai loại khác được mã hóa bởi DNA theo một cách khác (không chuẩn): Selenocysteine kết hợp với một vài protein ở U A codon, thường gọi là stop codon. Pyrrolysine được sử dụng bởi một vài methanogen trong các enzyme mà được dùng để sản xuất ra methane. Nó được mã hóa giống với của selenocysteine nhưng mà bằng codon UA . 25
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các loại amino acid khác chứa trong protein thường được tạo thành bởi bằng cách chỉnh sửa sau khi dịch mã. Việc chỉnh sửa này thường rất cần thiết cho chức năng của protein. Trong proline chỉ có proteinogenic amino acid là có các nhóm cyclizes nằm trên khung xương: nó liên kết với nhóm α-amino, vì thế cũng chỉ có proteinogenic amino acid là có chứa amin thứ cấp ở vị trí này. Đôi khi proline còn được gọi là imino acid, nhưng mà acid này không tuân theo các quy tắc nomenclature. Có hơn 100 amino acid đã được tìm thấy trong tự nhiên. Một trong số chúng đã được tìm thấy trong các thiên thạch, đặc biệt trong các dạng được biết nhiều như carbonaceous chondrite. Vi sinh vật và thực vật có thể sản xuất ra các amino acid bất thường mà thường được tìm thấy trong các peptide kháng thể (ví dụ như nisin hoặc alamethicin). anthionine là một alanine dimer có cầu nối sulfide, thường được tìm thấy chung với các unsaturated amino acid trong lantibiotics (là các peptide kháng thể của microbial origin). 1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) là một disubstituted cyclic amino acid nhỏ và là một chất trung gian quan trọng trong việc tạo ra các hormone ethylene thực vật. Ngoài việc tổng hợp protein, các amino acid còn có các vai trò sinh học quan trọng khác. lycine và glutamate là các chất truyền dẫn thần kinh cũng như các amino acid chuẩn mực khác trong các protein. Nhiều amino acid được dùng để tổng hợp các phân tử khác, ví dụ như: tryptophan là tiền chất của chất truyền thần kinh serotonin, glycine là một trong số các chất phản ứng trong quá trình tổng hợp porphyrins như heme arginine được dùng để tổng hợp hormone nitric oxide. Phần lớn các amino acid không chuẩn mực cũng có một số chức năng sinh học quan trọng: amma-aminobutyric acid là một chất truyền thần kinh khác nữa, carnitine được sử dụng trong việc chuyển lipid vào bên trong cell, ornithine, citrulline, homocysteine, hydroxyproline, hydroxylysine, và sarcosine. Một vài trong số 20 amino acid tiêu chuẩn được gọi là các amino acid thiết yếu do chúng không thể được tổng hợp bởi cơ thể từ các hợp chất khác thông qua các phản ứng hóa học, mà nằm trong gỗ. Ở người, các amino acid thiết yếu là 26
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP lysine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine. Histidine và arginine nói chung được xem như là cần thiết ở trẻ con, do ở cơ thể trẻ con không có khả năng tổng hợp ra chúng. 1.7.1. Cấu trúc tổng quát Cấu trúc tổng quát của proteinogenic alpha amino acid: H2N-CH(R)-COOH Trong đó R là trục đặc biệt quan trọng đối với mỗi amino acid. Các amino acid thường được phân loại dựa theo đặc tính hóa học của trục (R) thành 4 nhóm. Chuỗi bên có thể xem giống như một axit yếu, base yếu, một hydrophile nếu chúng là cực, và hydrophobe nếu chúng là không cực. 1.7.2. Các dạng đồng phân Hầu hết các amino acid đều có 2 dạng đồng phân lập thể đồng phân lập thể, là D và L. Dạng L gồm những amino acid có vai trò quan trọng có trong các protein. Còn dạng D chỉ gồm một số amino acid trong các protein có trong các sinh vật sống dưới nước, ví dụ ốc hình nón. Chúng cũng có nhiều các thành phần vách tế bào proteoglycan của bacteria. Đồng phân dạng D của aspartic acid có trong một số protein là kết quả của quá trình biến đổi sau dịch mã tự phát kết hợp với sự hóa già protein hoặc giống như là sản phẩm phụ của quá trình biến đổi enzyme được xúc tác bởi protein L-isoaspartyl methyltransferase. 1.7.3. Amino acid thúc đẩy quá tr nh sinh tổng hợp trao đổi chất Các Amino Acid là hợp phần cấu tạo nên protein và enzim (men sinh học). Chúng là yếu tố cơ bản của tất cả các cơ thể sống và có vai trò quan trọng trong hoạt động trao đổi chất của tế bào. Cây trồng có khả năng tổng hợp Amino Acid từ sự đồng hóa đạm, nhưng quá trình này bị ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố môi trường và sức khỏe của cây. Đạm hữu cơ từ glutamate và glutamin thường được dùng để sinh tổng hợp nên các Amino Acid. Các Amino Acid đơn kết hợp lại với nhau sẽ tạo thành các liên kết Peptide nhờ các phản ứng ngưng tụ. Protein là các chuỗi polypeptide được tạo thành từ trên 100 Amino Acid đơn và trọng lượng phân tử của chúng thường lớn hơn 10.000 Dalton. 27
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bón trực tiếp Amino Acid cho cây sẽ giúp giảm được công đoạn tổng hợp Amino Acid từ đạm cây hút và giúp cây trồng tăng trưởng một cách mạnh mẽ, tạo năng suất cao và chất lượng tốt. Hiệu quả và lợi ích của Amino Acids là khắc phục sự khủng hoảng sinh lý của cây trồng hoặc ảnh hưởng bất lợi của môi trường (hạn, nhiệt độ cao, quá nắng, sốc khi cây chuyển giai đoạn sinh trưởng ) đã được chứng minh qua nhiều kết quả nghiên cứu. Từ các kết quả nghiên cứu này, Amino Acid đã trở thành các sản phẩm dùng phổ biến như là phân bón sinh học ở nhiều quốc gia tiên tiến trên thế giới. Cùng với vai trò là hợp phần của protein và quá trình sinh tổng hợp trong cây, các Amino Acid còn thực thi nhiều vai trò khác và đem lại rất nhiều ích lợi cho cây trồng. 1.7.4. Tác dụng của amino acid đối với cây trồng Đối với cây trồng: Nhiều năm nay các Amino Acid đã được biết đến có thể làm giảm rõ ràng tác hại của sâu bệnh hại trên cây trồng. Bao quanh các mạch tạo thành của một số Amino Acid có chứa lưu huỳnh. Đây là yếu tố góp phần làm tăng sức đề kháng sâu bệnh ở cây trồng. Nhiều báo cáo chỉ rõ hiệu quả của các Amino Acid đối với bệnh sưng vàng rễ khoai tây do tuyến trùng gây ra (Kovacs). Cung cấp Amino Acid cho cây có tác dụng giảm tác động của ấu trùng và trứng tuyến trùng so với đối chứng. Cung cấp Amino Acid cho cây cũng đã ghi nhận sự giảm có nghĩa tình trạng sần hư trái do vi rút (plum pox virus) gây ra sau khi phun vài lần Amino Acid. Các Amino Acid cũng làm giảm rụng trái ở các cây ăn trái dạng quả hạch nhờ ảnh hưởng của chúng như là các hormon dinh dưỡng trong cây. 1.7.5. Đối với sự ra hoa và đậu trái Các kết quả nghiên cứu ở ý trên cây oliu cho thấy amino acid nâng cao khả năng thụ phấn và kéo dài thời gian sống của hạt phấn. Các công thức sử dụng chế phẩm kết hợp amino acid với vi lượng Bo đã tăng cao hiệu quả của sự thụ phấn. Sự thụ phấn là cơ sở quan trọng của tiến trình đậu trái, vì thế cung cấp amino acid cho cây giúp làm tăng tỷ lệ đậu trái, đặc biệt đối với các cây tự thụ phấn như cà phê, tiêu 28
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.7.6. Tăng tính hữu hiệu sinh học của nguyên tố vi lượng Các amino acid có khả năng liên kết với các kim loại như mangan, sắt và kẽm tốt giống như với canxi và magiê. Các nguyên tố trung vi lượng này hiện diện tự nhiên trong nước dùng để phun hoặc được bổ sung ngay trong phân bón. Các dạng phức amino acid – Kim loại được hấp thụ bởi cây trồng một cách nhanh chóng và hiệu quả cao. Nó cũng gia tăng hiệu quả trong việc vận chuyển qua một “Chặng đường” dài từ rễ, lá đến các bộ phận khác trong cây. 1.7.7. Làm tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật Sự kết hợp amino acid với thuốc bảo vệ thực vật sẽ làm gia tăng hiệu quả của sản phẩm so với dùng riêng rẽ. Theo eandri và đồng sự 1986, amino acid làm tăng hiệu quả của thuốc trị nấm Viclozonlin (Ronilan) trị bệnh Botrytis (thối trái) trên cây nho và dây tây. Amino acid làm tăng hiệu lực thuốc bảo vệ thực vật như thế nào? Khả năng bám dính đặc biệt của amino acid giúp giữ được thuốc trên bề mặt lá tốt hơn ngay cả trong điều kiện gặp mưa. Hoàn thiện tính chất thấm và cân bằng pH của dịch phun là những bổ sung giúp gia tăng hiệu quả của thuốc so với không có amino acid. 1.7.8. Hiệu lực của Amino acids phụ thuộc công nghệ sản xuất Hiệu lực của phân amino acid phụ thuộc vào sự điều khiển quá trình thủy phân để tách phân tử protein. uá trình thủy phân sẽ tạo ra một phần là các dạng amino acid tự do và một phần là các chuỗi amino acid phân tử thấp được biết đến như là các peptide. Trong cây trồng có chứa đến 200 amino acid khác nhau, song chỉ có khoảng 20 trong số đó có khả năng được sử dụng để tổng hợp thành protein trong cây (protein-genic amino acid). “Collagen protein được tìm thấy trong sương, răng, móng, da và lông của động vật có vú. Chúng ta đã biết collagen protein có thành phần chính là lycin (khoảng 0%), Proline và Hydroxyproline (khoảng 0%). Các amino acid này rất quan trọng đối với cây trồng. Chính thành phần và nguồn gốc của các Amino Acid 29
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ở dạng tự do và liên kết (Peptide) trong các chế phẩm phân bón sẽ quyết định hiệu lực của nó với cây trồng. Hàm lượng Amino Acid tự do và Amino Acid tổng số trong chế phẩm Protifert. Bảng 1.2: Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất. Amino Acid Hoạt động sinh hóa Glycine - à tiền chất của cholorophyll Proline & - Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước Hydroxyproline - Cấu tạo nên thành tế bào (nematostatic action) - Thiết yếu để tạo phấn hoa (tốt cho đậu trái) Glutamic & Glutamine - Đạm hữu cơ dự trữ để tạo thành các amino acid khác và protein thông qua phản ứng trao đổi Serine - Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước, rất quan trọng cho quá trình tổng hợp cholorophyll Arginine - à tiền chất của polyamine, rất quan trọng để để phân chia tế bào Phenylalanine - à tiền chất cấu tạo nên lignine, tạo các chồi gỗ khỏe hơn Alanine - Vai trò rất quan trọng trong việc tạo hoocmon trao đổi chất và kháng virut Tryptophan - Tiền tố của indol-acetic acid, các chất kích thích sinh trưởng tự nhiên. Cả lycin và Proline đều là những amino acid trung tính và không cực. Trọng lượng phân tử nhỏ và kích thước bé. Phân bón Protifert bao gồm các dạng olygopeptide hoặc polypeptide, chúng ở dạng mạch ngắn và các amino acid tự do. Đây là những điểm quyết định đến hiệu quả của amino acid với cây trồng. Bởi vì nếu trọng lượng phân tử của amino acid lớn hơn 5.000 Dalton thì rất khó vận chuyển trong cây. Những amino acid lớn hơn sẽ không có vai trò sinh học trong cây. 1.8. TỔNG QUAN TỶ LỆ C/N Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đén quá trình phân hủy do vi sinh vật trong đó carbon và nito là cần thiết nhất, tỷ lệ C/N là thông số dinh dưỡng quan trọng nhất, 30
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Photpho (P) là nguyên tố quan trọng kế tiếp, lưu huỳnh (S), canxi (Ca) và các nguyên tố vi lượng khác cũng đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất của tế bào. Khoảng 20% - 40% C của chất thải hữu cơ cần thiết cho quá trình đồng hoá thành tế bào mới, phần còn lại chuyển hoá thành CO2. Carbon cung cấp năng lượng và sinh khối cơ bản để tạo ra khoảng 50% khối lượng tế bào vi sinh vật. Nito là thành phần chủ yếu của protein, acid nucleic, acid amin, enzyme, co-enzyme cần thiết cho sự phát triển và hoạt động của tế bào. Tỷ lệ này vào khoảng 20 : 1 đến 25 : 1. Theo kinh nghiệm chung, nếu tỷ lệ C/N vượt quá giới hạn vừa nêu, tốc độ phân hủy sẽ bị chậm lại. Ngược lại, nếu tỷ lệ thấp hơn 20 : 1, Nito có khả năng bị thất thoát. Bởi vì, N dư chuyển hóa thành N trong NH3. 1.9. ƯU ĐIỂM CỦA PHÂN BÓN VI SINH Ưu điểm - Phân bón được bán rộng rãi trên thị trường thế giới. - Có thể tăng năng suất cây trồng lên rất nhiều. - Sử dụng phân bón vi sinh giúp trả lại độ phì nhiêu cho đất bằng cách làm tăng hàm lượng phosphor và kali dễ tan trong đất canh tác. Các nhà khoa học đã kết luận: sử dụng phân hữu cơ vi sinh làm tăng năng suất cây trồng, chất lượng sản phẩm tốt hơn, giảm ô nhiễm của hàm lượng NO3. Điều này cũng có nghĩa phân hữu cơ vi sinh đã góp phần quan trong trong việc cải tạo đất, đáp ứng cho một nền nông nghiệp hữu cơ bền vững, xanh sạch và an toàn. - iá thành hạ. - Có thể sản xuất được tại địa phương và giải quyết được việc làm cho một số lao động, ngoài ra cũng giảm được một phần chi phí ngoại tệ nhập khẩu phân hóa học. - Sản phẩm chứa nhiều vi sinh vật rất tốt cho cây. - iảm thiểu ô nhiễm cho nguồn nước, đất, không khí, các chất hữu cơ biến đổi thành các chất vô cơ. 31
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - iảm thiểu sự rửa trôi khoáng chất do các thành phần vô cơ không hòa tan trong phân như NO. - Các vi sinh sẽ phân giải những chất ở dạng khó tiêu (rắn) thành dạng dễ tiêu (mềm). Để tạo ra các chất dinh dưỡng cực kì tốt hỗ trợ trong quá trình sinh trưởng và phát triển đồng thời chống lại các mầm bệnh ảnh hưởng từ môi trường. - Vi khuẩn kháng nấm chống thối rễ cây, héo úa: đa số các nhóm Bacillus subtilis là các vi khuẩn đối kháng, chống lại các loại nấm như Fusarium; Rhizoctonia kiểm soát, ngăn chặn được nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cho cây. - Công dụng của Bacillus subtilis: . ợi khuẩn đường ruột, chữa viêm ruột. . Tổng hợp một số kháng sinh có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các vi khuẩn và nấm gây bệnh. . Sản sinh enzyme amylase có tác dụng phân giải đường, biến đổi chất hữu cơ thành CO2, làm giảm lượng hợp chất hữu cơ và khí độc. . Tổng hợp enzyme và các acid amin trong tự nhiên. - Công dụng của Lactobacillus: . Có thể tổng hợp các vitamin, đây là vai trò sinh lý quan trọng của sự sống. . Có khả năng tiết kháng sinh kháng lại vi khuẩn. 32
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công Nghệ TP. HCM. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài này được thực hiện từ tháng 4/2017 đến tháng 7/2017. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Nguồn mẫu thức ăn th a Mẫu thức ăn thừa được thu tại các nhà hàng trong khu khu vực TP.HCM và một số các quán ăn bình dân khu vực phường 25, 26 quận Bình Thạnh, TP.HCM. 2.2.2. Hóa chất và môi trường Hóa chất H2SO4 đậm đặc Disodium phosphate NaOH 0,1 N Potassium dihydogen phosphate H2SO4 0,1 N NaCl Phenolphthalein Tryptone Formaldehyd Yeast extract Thuốc thử Tasiro Glucose Nước cất Bacteriolgical agar Cồn Na2HPO4 NaCl KH2PO4 Peptone Môi trường Môi trường Trypic Soy Agar Môi trường Rappaport – ( TSA) Vassiliadis Soya Peptone Môi trường Buffered Peptone (RV) Water (BPW) Môi trường Triple Sugar Iron 33
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP (TSI) Canh Tryptone Môi trường Xylose ysine Canh Sucrose Desoxycholate (XLD) Môi rường Plate Count Agar Môi trường Urea Broth ( PCA) Môi trường MR – VP Broth Môi trường Violet Red Bile Môi trường Mannittol Phenol agar ( VRB) Red Broth base Brilliant Green Bile Lactose Canh Lysine Decarboxylase broth (BGBL). 2.2.3. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị Tủ cấy vi sinh Tủ hút Tủ nung Thiết bị phá mẫu Tủ sấy Bình phá mẫu Cân phân tích Máy kjeldahl Tủ lạnh Bình kjeldahl Nổi hấp Autoclave Microquay Tủ nung Bếp từ Dụng cụ ng nghiệm Giấy đo pH Đĩa petri Máy đo pH Đũa thủy tinh Pipette thủy tinh Giấy đo pH Erlen Chai thủy tinh Chai đun môi trường Đèn cồn Micropipette ng đong các loại Bông thấm Cốc chiệu nhiệt Buret Bông không thấm Bình hút ẩm chứa silicagen 2.3. Bố trí thí nghiệm 34
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.1. Bố trí thí nghiệm chung Bacillus subtilis Lactobacilus iống cấp I iống cấp I Xác định Cơm C/N đầu thừa vào iống cấp II iống cấp II Thủy phân Xác định C/N đầu ra Dịch thủy Bã Định lượng đạm phân amin Xác định mật độ TPC và coliform Chế phẩm phân bón lá Thử nghiệm Theo dõi chiều cao, trên rau ăn lá màu sắc, sinh khối Hình 2.1: s u t n t o c ế p m p n b n l 2.3.2. Bố trí thí nghiệm chi tiết 2.3.2.1. Đánh giá m u đầu vào Xác định pH mẫu đầu vào, mẫu đã được đồng nhất. 35
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dụng cụ: Máy đo pH Cốc Nước cất Tiến hành pha loãng mẫu 20 lần bằng cách cân 2g mẫu ban đầu vào cốc bổ sung 8ml nước cất để đồng nhất, ta được mẫu pha loãng 20 lần. Nhúng đầu dò pH vào nước cất sau đó lau khô, tiếp tục đưa đầu dò vào mẫu đã pha loãng 20 lần và đọc số hiện trên máy. 2.3.2.2. ác định độ ẩm - Nguyên tắc Dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nước trong mẫ. Độ ẩm được xác định bởi sự chênh lệch về khối lượng mẫu tươi trước khi sấy và sau khi say ở 105 2 C đến khối lượng không đổi. - H a chất – thiết bị Cân phân tích có độ ẩm chính xác 0,1 mg Bình hút ẩm chứa silicagen Chén nhôm có nắp, đường kính 4cm Tủ sấy Cốc sứ - uy tr nh phân tích Mở nắp chén sấy và để chúng trong tủ sấy sấy ở nhiệt độ 105 2 C trong một giờ, lấy ra để nguội ở bình hút ẩm 0 phút, cân khối lượng cốc ( . Cân chính xác 5g mẫu (m) đã nghiền nhỏ vào chén sấy. Mở nắp chén sấy có chứa mẫu và để chúng trong tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 105 2 C trong 4 giờ kể từ lúc nhiệt độ tủ sấy đạt 105 C. Đậy nắp ( không kín) lại và để nguội ở bình hút ẩm 0 phút. 36
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đậy nắp thật kín lấy ra khỏi bình hút ẩm và cân xác định khối lượng. ặp lại quá trình từ bước đến bước 5 cho tới khi xác định được khôi lượng không đổi ). (Chênh lệch giữa hai lần cân liên tiếp không quá 0,1%). n 2 2 tủ sấ mẫu ở 105°C n 2 3 b n út m Silicagen - Tính kết quả Ẩm độ x 100 Trong đ - m: khôi lượng mẫu tươi đem sấy (g) - : khối lượng cốc khô (g) - : khối lượng chén và mẫu sau khi sấy (g) Kết quả là giá trị trung bình của hai lần thử song song và được biểu diễn một 37
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP số lẻ sau dấu phẩy. Mục đích xác định độ ẩm là để xem có ủ compost được hay không. 2.3.2.3. ác định độ tro - Nguyên tắc Xác định lượng tro tổng hoặc tro không tan trong acid bằng cách nung mẫu ở nhiệt độ 550 C đến khối lượng không đổi. - H a chất – thiết bị Cốc sứ chịu nhiệt Tủ nung Cân phân tích Dung dịch 30% Xác định tro không tan trong acid HCl N - uy tr nh xác định độ tro tổng Nung cốc sứ 1h ở 550 C, để nguội trong bình hút ẩm 0 phút. Cân khối lượng cốc với độ chính xác 0,1 m ( ). Cân chính xác 5g mẫu (m) đã được nghiền và đồng nhất vào cốc. Đặt cốc lên bếp điện và đốt cho đến khi hết khói. Đưa cốc vào tủ nung ở 550 C trong 4h. Sau khi nung nếu mẫu chưa hóa tro hoàn toàn thì làm nguội tro và them vài giọt . Đặt cốc nung lên bếp và đun cho đến khi hết sủi bọt, tiếp tuc đốt cho đến khô. Đưa chén nung trở lại tủ nung, tiếp tục nung cho đến khi tro hóa hoàn toàn. àm nguội trong bình hút ẩm. ặp lại quá trình nà đến khi đạt khối lượng không đổi ( ). 38
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP n 2 4 Tiến àn nun mẫu t on tủ nun 550° - Kết quả phân tích Hàm lượng tro được tính bằng số gam tro còn lại sau khi đốt trên 100g mẫu. Hàm lư ng tro x 100 Trong đ - m: khối lượng mẫu đã sấy khô (g) - : khối lượng cốc (g) - : khối lượng cốc có chứa tro sau khi nung (g) - Kết quả giữa hai phép thử song song trên cùng một mẫu thử không khác nhau: - 0, g tro trên 100g mẫu đối với mẫu có hàm lượng tro dưới % - 1% trên hàm lượng tro đối với mẫu có hàm lượng tro từ % - 5% - 0,5g mẫu tro trên 100g mẫu đối với mẫu có hàm lượng từ 5 – 20% - 2,5% trên hàm lượng tro đối với mẫu có hàm lượng tro từ 20 – 40% - 1g tro trên 100g mẫu đối với mẫu có hàm lượng tro trên 40% 39
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song và được biểu diễn một số lẻ sau dấu phẩy. 2.3.2.4. ác định hàm lượng cacbon Hàm lượng cacbon có thể xác định theo phương trình sau %C = 2.3.2.5. ác định t lệ C N m u đầu vào Tỷ lệ C/N là hệ số dinh dưỡng chính. Trong thực tiễn sảm xuất phân hữu cơ, tỷ lệ này vào khoãng 20 : 1 đến 25 : 1. Nếu tỷ lệ C/N vượt quá giới hạn vừa nêu, tốc độ phân hủy sẽ bị chậm lại. Ngược lại, nếu tỷ lệ thấp hơn 20 : 1, N có khả năng bị thất thoát. Bởi vì, N dư chuyển hóa thành N trong NH3. iai đoạn chuyển hóa tích cực (active stage) trong sản xuất phân hữu cơ có đặc điểm là nồng độ và pH khá cao đặc điểm này có thể gây ra sự bay hơi của NH3. 2.3.3. Đánh giá ảnh hưởng t lệ phối trộn của chủng vi sinh vật Bacillus subtilis và Lactobacillus Tiến hành cân 100g mẫu thức ăn thừa cho vào mỗi hộp và tiến hành bổ sung các chủng vi sinh vật vào theo tỷ lệ sau: - ĐC: 100g mẫu không bổ sung vi sinh vật - CT1: Bổ sung 10% sinh khối Bacillus subitlis theo thể tích. - CT2: : Bổ sung sinh khối vsv theo tỷ lệ Bacillus subtilis và Lactosbacillus là 3,5:6,5 - CT3: Bổ sung sinh khối vsv theo tỷ lệ Bacillus subtilis và Lactosbacillus là 6,5:3,5 - CT4: Bổ sung sinh khối vsv theo tỷ lệ Bacillus subtilis và Lactosbacillus là 5:5. - Tiến hành lặp lại mỗi CT lần. 2.3.3.1. Khảo sát t lệ C N đầu vào của m i công thức Tiến hành khảo sát tỷ lệ C/N đầu vào theo các ngày sau khi phối trộn sinh khối vi sinh vật: 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày, 15 ngày, 20 ngày, 25 ngày, 0 ngày. Mỗi công thức lặp lại lần. 40
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.3.2. ác định Nito tổng số - Nguyên tắc Mẫu được vô cơ hóa bằng đđ ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác (K2SO4 và CuSO4). Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa mẫu xảy ra như sau: 2 O + 2 + Oxy tạo thành trong phản ứng lại oxy hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nito dưới tác dụng của tạo thành N . Các protein bị thủy phân thành acid amin. Carbon và hydro của acid amin tạo thành C và O, còn nito được giải phóng dưới dạng N kết hợp với acid dư tạo thành (N )2S tan trong dung dịch. N + (N )2S - Phương pháp lấy m u Đối với mẫu ở thể rắn: phải lấy cả sản phẩm có kích thước lớn và kích thước bé. Đối với mẫu vừa ở thể rắn vừa ở thể lỏng không đồng nhất khi lấy mẫu, thì lấy ở các vị trí khác nhau nhưng phải lấy cả phần rắn cả phần lỏng theo đúng tỉ lệ của chúng ở trong mẫu. Đối với sản phẩm dạng sệt đồng nhất: khuấy kỹ và lấy mẫu đều ở các vị trí khác nhau. - Cách tiến hành 41
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2.5 B n c Kjelda l Hình 2.6 b n ứn N 3 Đốt đạm Cho 1g mẫu và 0,5g xúc tác và 5ml dung dịch đđ vào bình K eldahl và đun trên bếp từ từ cho đến khi thu được dung dịch trong suốt không màu hoặc có màu xanh lơ của CuSO4 để nguội. Chú ý: trong quá trình vô cơ hóa mẫu trong bình K eldahl giải phóng khí nên phải tiến hành trong tủ hút. Trong quá trình đốt nên đặt bình nằm hơi nghiêng trên bếp. Cất đạm Sau khi vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, cho một ít nước cất vào bình K eldahl để tráng rồi cho vào bình định mức 800ml, tráng rửa bình K eldahl và phễu vài lần rồi cho vào bình định mức, nhỏ giọt thuốc thử Tasiro và khoãng 10 – 15 ml dung dịch NaOH 45% cho đến khi đổi màu dung dịch thành màu xanh lơ. Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng N : dùng pipet cho vào bình hứng khoãng 20ml acid 0,1N sau đó lắp vào hệ thống sao cho đầu ống sinh hàn ngập trong 42
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP dung dịch acid 0,1N. Bắt đầu quá trình cất đạm cho đến khi thử giấy quỳ tím không đổi màu ở ống sinh hàn nhỏ ra. Chuẩn độ ấy bình hứng ra và đem đi chuẩn độ bằng NaOH 0,1N. n 2 7 B n ứn t ớc c u n ộ n 2 8 b n ứn sau c u n ộ - Tính kết quả N tổng x Trong đó : là thể tích cho vào bình hứng : là thể tích chuẩn độ a: là khối lượng mẫu đem vô cơ hóa 2.3.3.3. ác định đạm ormol bằng phương pháp orensen - Định ngh a 43
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP . Đạm formol chủ yếu bao gồm đạm của amino acid và đạm của muối ammonium. . Nếu trong mẫu cần phân tích chỉ có amino thì đạm formol là đạm amino acid. . Nếu trong mẫu cần phân tích có cả amino acid lẫn muối ammonium thì đạm formol là tổng đạm amino acid và đạm ammonium. Muốn có đạm amino acid, ta phải lấy đạm formol trừ đi đạm ammonium. - Nguyên tắc . Trong một hỗn hợp protein, peptid, amino acid, amin, ammoniac Để xác định gần đúng loại đạm phi proteim” người ta thường dùng phương pháp Sorensen. . Trong phân tử amino acid, peptide, protein có một đầu là chức carboxylic ( - COOH) như là một acid, đầu kia là chức amin (-NH3) xem như là một base; còn các amin tự do cũng như ammoniac khi hòa tan thường ở dưới dạng ammonium + NH4 kết hợp với một anion thường là chloride, sulfate, phosphate . Như vậy, khi ta cho tác dụng các phân tử “phi protein” nà với formol, formol sẽ tác dụng lên nhóm –NH2 để tạo thành phức chất methylene (mono, tri hoặc hexamethylene). HOOC – CH – NH2 + HOOC HOOC – CH – N = CH2 + H2O | | R R + R – NH3 Cl + HCNO R – N = CH2 + H2O + HCl . Do vậy, sản phẩm là hợp chất methylene và một chức –COOH tự do hoặc HCl có tính acid, nên ta có thể định phân bằng NaOH, từ đây cho phép ta xác định một cách gián tiếp lượng –NH2. - Nguyên liệu và h a chất Dung dịch formol ½ (pha formol : nước cất tỉ lệ 1:1 và chỉ chuẩn bị trước khi dùng). Mẫu ,nước cất. Dung dịch NaOH 0,1N. Thuốc thử Phenolphtalein %. - Cách tiến hành và kết quả . Hút 10 ml nguyên liệu đã pha loãng ( giả sử nguyên liệu là chất lỏng, độ pha loãng là 5, 10 hoặc 20 lần tùy theo nguyên liệu đậm đặc hoặc loãng) vào erlen. 44
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP . Them vào đó 10 ml dung dịch formol ½ đã trung hòa ( lấy 50 ml formol, them vào đó vài giọt phenolphthalein % cho NaOH N/10 từng giọt cho đến khi dung dịch chuyển màu hồng nhạt, ta được formol ½ đã trung hòa) và vài giọt phenolphthalein % lắc đều để phản ứng xảy ra hoàn toàn. . Định phân bằng NaOH có nồng độ là xN/10 cho đến khi dung dịch chuyển màu hồng nhạt. . Thực hiện sự thử thật và sử thử khồng (thay thế 10 ml nguyên liệu bằng nước cất vô đạm), lấy trị số trung bình. Hình 2.9: nito formol t ớc c u n ộ Hình 2.10: nito formol sau c u n ộ Lưu ý . Dung dịch nguyên liệu phải trung tính, nếu acid hoặc base thì phải trung hòa trước khi định phân. . Có một số trường hợp mẫu nguyên liệu có màu, vì vậy rất khó xác định được điểm trung hòa, trường hợp này có thể xử lý theo 2 cách: . Pha loãng nguyên liệu nhiều hơn để màu nhạt bớt. . Không dùng thuốc thử màu là phenolphthalein vvì khó xác định màu mà dùng pH kế trước hết trung hòa nguyên liệu đến pH 7, sau đó them formol vào, kế đó định phân bằng xN/10 đến pH 9,2. - Tính kết quả 45
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ọi V0 (ml): thể tích NaOH xN/10 trung bình của lần thử không. ọi V1 (ml): thể tích NaOH xN/10 trung bình của lần thử thật. Như thế hiệu số V = ( V1 – V0 ) là lượng NaOH cần để trung hòa nhóm – COOH. Số mol NaOH chính là số mol của amino acid, amine, ammonium Số mmol NaOH có trong V ml dung dịch NaOH xN/10 = V.x.10-4 mol Số mol NaOH tương đương với số mol hợp chất có nhóm – NH2 là: V.x.10-4 mol Số g đạm có trong 10 ml nguyên liệu đã pha loãng ( giả sử pha loãng 10 lần): 14 . V.x.10-4 g Số g đạm có trong 10 ml dung dịch chưa pha loãng: 14. V.x.10-4.10 = 14 . V.x.10-3 g Số g đạm có trong 1 lít nguyên liệu: 14 = 1,4 .x. V g 2.3.3.4. Đo pH Trộn nước vào nguyên liệu theo tỷ lệ 2 g mẫu : 8 ml nước cất, khuấy trộn đều và đo bằng pH kế. 2.3.3.5. Định lượng coli orm 2.3.3.6. Định ngh a Coliform là những vi khuẩn cho khuẩn lạc điển hình trên môi trường thach Violet Red Bile ở 7 oC trong 24 h. Trong trường hợp nghi ngờ, vi khuẩn sẽ được khẳng định trong môi trường canh Brilliant reen Bile Salt actose, Coliform sẽ sinh khí trong môi trường này trong 24 h ở 7 o. 2.3.3.7. Nguyên tắc Số lượng Coliform được xác định bằng cách cấy một lượng mẫu xác định vào một môi trường rắn chọn lọc thích hợp ( thạch Violet Red Bile) có chứa actose và một chất chỉ thị pH. Thực hiện ủ sơ bộ trên môi trường dinh dưỡng không chọn 46
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP lọc nếu vi khuẩn bị tổn thương trong quá trình chế biến. Đếm số khuẩn lạc lên men Lactose tiêu biểu sau khi ủ môi trường ở 7,0 oC ± 1,0 oC trong (24 ± ) h. Đếm các khuẩn lạc điển hình và khẳng định lại trong môi trường canh Brilliant reen Bile Salt actose, Coliform sẽ sinh khí trong môi trường này ở 7,0 oC ± 1,0 oC trong (24 ± )h. Kết quả được biểu thị bằng số Coliform trên 1g hoặc 1ml mẫu chưa pha loãng. 2.3.3.8. ơ đồ t m tắt quy tr nh 25g mẫu +225ml SPW đồng nhất trong 0s độ pha loãng 10 . Từ mỗi độ pha loãng hút 1ml vào 2 đĩa petri vô trùng. Sau đó đổ môi trường TSA đã được làm nguội đến 45 C và chờ trong 30 phút Đổ môi trường VRB lên trên môi trường TSA Ủ ở nhiệt độ 7 C/ 24h Chọn và đếm khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ sậm, có quần tủa muối mật, đường kính > 0.5mm Ở mỗi đĩa chọn -5 khuẩn lạc đặc trưng câý sang môi trường B B Ủ 7 C 0.5 / 24h 47
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 푠ố ℎ ẩ푛 푙ạ sinh ℎơ푖 푡 표푛 퐿 Tỷ lệ xác nhận R= 푆ố ℎ ẩ푛 푙ạ đã ấ Tổng số coliform (cfu/g) A= ×R 푛 ⋯ 푛푖 푖 n 2 11 S u t n n l ợn colifo m 2.3.3.9. Thuyết minh quy tr nh  Chuẩn bị m u uá trình chuẩn bị mẫu tương tự phần định lượng vi sinh vật hiếu khí. Nhưng quá trình pha loãng mẫu sao cho 1ml dung dịch pha loãn mẫu chứa khoảng 0.5mm, xung quanh khuần lạc có vùng tủa muối mật.  Kh ng định kết quả 48
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ui trình khẳng định thực hiện như sau: Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa đã đếm được với các hình dạng khác nhau cấy chuyển sang môi trường canh B B và ủ ở 7oC trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi vi sinh vật sinh khí trong ống Durnham. Tỷ lệ xác nhận là tỷ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả dương tính với số khuẩn lạc khẳng định.  Tính toán kết quả Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ xác định, tính mật độ của Coliforms theo công thức: ( ) × ⋯ Trong đó N: Tổng số khuẩn lạc đếm được. ni: Số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng. V: Thể tích cấy vào mỗi đĩa. fi: Độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm. R: Tỷ lệ xác nhận. ố ốn ơn nh R = n số ốn h n hi Kết quả Coliforms được làm tròn chẳng chục và biểu diễn ở dạng số mủ có cơ số thập phân. 2.3.4. Định lượng almonella 2.3.4.1. Định ngh a Salmonella là trực khuẩn kỵ khí tùy nghi, gram âm, di động bằng tiên mao (Salmonella galinarum-pullorum luôn luôn không di động). Chủng Salmonella sinh acid từ glucose và manitol nhưng không lên men sinh acid từ lactose, saccharose. Chúng không sinh indol và không phân giải urea. Phần lớn các chủng sinh Hydrogen sulfide (H2S) và tách de-carboxylate từ ornithine và lysine. 2.3.4.2. Nguyên tắc 49
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phương pháp này dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện Salmonella trên một lượng mẫu xác định. uy trình kiểm tra Salmonella buộc phải trai qua 4 giai đoạn và phải sử dụng chủng chứng trong toàn bộ quá trình phân tích. - Tiền tăng sinh: mẫu được tiền tăng sinh trong môi trường tăng sinh không chọn lọc ( peptone đệm) ủ trong 7°C trong 18 – 24h. - Tăng sinh: mẫu sau khi tiền tăng sinh chuyển qua tăng sinh trong môi trường chọn lọc (Rappartport Vassiliadis soy peptone), ủ ở 7°C trong 24h. - Phân l p và nh n diện: từ môi trường tăng sinh chọn lọc, cấy ria sang môi trường rắn chọn lọc (X D agar), ủ ở 7°C trong 24h. - Khẳng định: cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella sang môi trường thích hợp, tiến hành các thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh. 2.3.4.3. ơ đồ t m tắt quy tr nh 25 g mẫu + 225 ml BPW đồng nhất trong 0 giây độ pha loãng 10- 1 ủ ở nhiệt độ 7°C trong 24h Hút 0,1 ml mẫu sau tăng sinh cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường RV ủ ở nhiệt độ 42°C trong 24h Phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường chọn lọc phân biệt X D ủ ở nhiệt độ 7°C trong 24h Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy sang TSA ủ ở nhiệt độ 37°C trong 24h 50
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tiến hành các thử nghiệm sinh hóa Đọc kết quả n 2 12 S u t n n tín Salmonella. 2.3.4.4. Thuyết m nh quy tr nh - Tiền tăng sinh các loại mẫu thông thường: cân 25 g mẫu cho vào túi PE vô trùng. Thêm 225 ml dung dịch đệm và đồng nhất mẫu. Thời gian đồng nhất mẫu có thể là 15 giây hoặc 0 giây tùy theo từng loại mẫu. Sau đó ủ ở 7°C trong 24h. - Tăng sinh chọn lọc: cấy 0,1 ml dịch mẫu đã tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10 ml canh RV, ủ ở 42°C trong 24 h. - Phân lập: dùng que cấy vòng lấy một vòng sinh khối vi sinh vật từ môi trường tăng sinh chọn lọc RV cấy ria lên môi trường chọn lọc cho Salmonella như X D. Cường độ chọn lọc, mức độ đặc trưng và hình thái biểu hiện của khuẩn lạc Salmonella trên môi trường X D như: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số dòng có thể có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn lạc. Môi trường X D chuyển sang màu hồng. Tất cả các đĩa môi trường sau cấy được ủ ở 7°C trong 24 h. Sau ủ, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella đề khẳng định bằng các thửu nghiệm sinh hóa. - Khẳng định: khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella phải được kiểm tra sinh hóa và kháng huyết thanh. Từ mỗi môi trường phân lập, cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc TSA, ủ ở 7°C trong 24 h, các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng để thửu nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh. 51
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Khẳng định bằng thử nghiệm sinh hóa: các thử nghiệm sinh hóa chính được sử dụng cho Salmonella là lên men glucose, lactose, saccharose, H2S, urea, indol, VP, ODC, DC, mannitol. Các chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm như sau: Thử nghiệm trên môi trường KIA hoặc TSI: Salmonella chỉ lên men glucose trong các môi trường nói trên vì thế phần nghiêng có màu đỏ, phần sau có màu vàng. Đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện màu đen trên môi trường. Có thể có hiện tượng sinh hơi làm vỡ thạch môi trường này hoặc môi trường bị đẩy lên tạo ra một khoảng trống bên dưới ống nghiệm. Thử nghiệm trên môi trường DC (+): sau khi nuôi cấy, môi trường chuyển thành kiềm, màu môi trường được chuyển sang màu ban đầu. Thử nghiệm urea (-): Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường; sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng cam. Lên men mannitol (+): môi trường sau khi nuôi cấy bị acid hóa chuyển sang màu vàng. Thử nghiệm Indol (-): phát hiện khả năng oxi hóa tryptophan thành các dạng của indol. Âm tính cho kết quả màu vàng của thuốc thử Kovacs’s. Thử nghiệm VP (-): xác định khả năng sinh aceton trong quá trình lên men glucose của một số vi sinh vật. Âm tính cho kết quả màu vàng trên bề mặt môi trường. Khẳng định bằng thử nghiệm kháng huyết thanh: thử nghiệm kháng huyết thanh phải được thực hiện song song với mẫu trắng nhằm loại trừ khả năng ngưng kết giả. Dùng kháng huyết thanh Salmonella polyvalent O và Salmonella polyvalent H. Phản ứng dươn tính khi vi sinh vật thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh nhưng không có hiện tượng ngưng kết với nước muối sinh lý. Báo cáo kết quả Kết luận có hay không có Salmonella hiện diện trong 25 g mẫu. 52
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ưu ý: Salmonella à nhóm có chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm do vậy cần tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Salmonella dùng àm đối chứng (+) cũng như thao tác trên các chủng phân lập được. Các môi trường hay mẫu vật sau nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa. Bảng 2.1: Biểu hiện đặc trưng của Salmonella trong test sinh hóa. Thử nghiệm Môi trường Biểu hiện đặc trưng Phần nghiêng đỏ, sâu vàng, H2S TSI/KIA nứt thạch, xuất hiện vạch đên, sinh khí. Không đổi màu LDC LDC Không đổi màu Ủrea Urea Bị acid hóa, ôi trường Manitol, sorbitol Manitol, sorbitol chuyển sang màu vàng Khôn xuất hiện vòng đỏ khi Ìndol Trypton nhỏ thuốc thử Kovac’s Không đổi màu khi nhỏ α – VP VP napthol 5% và KOH 40% 2.3.4.5. Bố trí thí nghiệm 2.3.4.5.1. Thí nghiệm 1: xác định khả năng chuyển h a của nguyyên liệu trong đi u kiện thường dưới tác động của vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus. - Mục đích Nhằm xác định khả năng phân hủy mạnh thành phần chất hữu cơ trong thức ăn thừa ở nhiệt độ thường 28 - 30 . - Tiến hành Nguyên liệu 53
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Thức ăn thừa được nghiền nhỏ. Cân 100g mẫu thức ăn thừa + 10 ml sinh khối vi khuẩn ( Bacillus subtilis và Lactobacillus). Đem ủ ở nhiệt độ thường từ 28 - 30 . Theo dõi, xáo trộn và sau ngày ủ nhiệt độ thường tiến hành kiểm tra mẫu đã bắt đầu phân hủy chưa. Tiến hành phối trộn theo tỷ lệ sau: Bảng 2.2: T lệ phối trộn sinh khối vi sinh v t. Tỷ lệ Bacilus Công thức Thành phần phối trộn subtilis : Lactobacillus Đối chứng Không bổ sung vi sinh vật 0 Công thức 1 Bacilus subtilis 10% tính theo thể tích Công thức 2 Bacilus subtilis : Lactobacillus 1 : 2 Công thức Bacilus subtilis : Lactobacillus 1 : 0,5 Công thức 4 Bacilus subtilis : Lactobacillus 1 : 1 Ch tiêu theo d i Hàm lượng nito tổng số của các công thức theo ngày. Hàm lượng nito formol của các công thức theo ngày. Tỷ lệ C/N của từng công thức. Tỷ lệ Nformol / Ntổng số của các công thức. 2.3.4.5.2. Thí nghiệm 2: đánh giá chế phẩm - Mục đích Nhằm xác định khả năng đối kháng các vi khuẩn, nấm có hại khác của chế phẩm phân bón. Khả năng kháng khuẩn của chế phẩm. - Tiến hành Nguyên liệu: sử dụng chế phẩm tốt nhất để tiến hành nuôi cấy xác định khả năng kháng khuẩn của chế phẩm. 54
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Định lư ng coli orm Tiến hành Cân chính xác 10g, sau đó thêm vào 90ml dung dịch BPW pha loãng mẫu và tiến hành đồng nhất mẫu. Khi đó, ta sẽ có được dung dịch pha loãng 10 1. Tiếp tục dùng micropipette 1000µl, sử dụng pha loãng mẫu đến độ pha loãng 10 10. Sau đó, chọn ba nồng độ pha loãng 10 8, 10 9, 10 10 để cấy. Dùng micropipette với đầu tip vô trùng để chuyển 1000µl dịch pha loãng vào giữa đĩa petri vô trùng. Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy từ đĩa. Cho mỗi đĩa đã cấy mẫu 5ml môi trường TSA đã được hấp vô trùng vả làm nguội đến 45oC, trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri ngược chiều kim đồng hồ. Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 0 phút để phục hồi khả năng của Coliform. Đổ thêm 10 – 15ml môi trường VRB. Chờ môi trường đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 7oC ± 1oC trong 24h. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 10 – 100 khuẩn lạc Coliforms để tính. Khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm và đường kính >0.5mm, xung quanh khuần lạc có vùng tủa muối mật. Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa đã đếm được với các hình dạng khác nhau cấy chuyển sang môi trường canh B B và ủ ở 7oC trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi vi sinh vật sinh khí trong ống Durnham. Tỷ lệ xác nhận là tỷ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả dương tính với số khuẩn lạc khẳng định. n 2 12 n l ợn colifo m. 55
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Định tính Salmonella Tiến hành - Tiền tăng sinh các loại mẫu thông thường: cân 25 g mẫu cho vào túi PE vô trùng. Thêm 225 ml dung dịch đệm và đồng nhất mẫu. Thời gian đồng nhất mẫu có thể là 15 giây hoặc 0 giây tùy theo từng loại mẫu. Sau đó ủ ở 7°C trong 24h. - Tăng sinh chọn lọc: cấy 0,1 ml dịch mẫu đã tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10 ml canh RV, ủ ở 42°C trong 24 h. - Phân lập: dùng que cấy vòng lấy một vòng sinh khối vi sinh vật từ môi trường tăng sinh chọn lọc RV cấy ria lên môi trường chọn lọc cho Salmonella như X D. Cường độ chọn lọc, mức độ đặc trưng và hình thái biểu hiện của khuẩn lạc Salmonella trên môi trường X D như: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số dòng có thể có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn lạc. Môi trường X D chuyển sang màu hồng. Tất cả các đĩa môi trường sau cấy được ủ ở 7°C trong 24 h. Sau ủ, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella đề khẳng định bằng các thửu nghiệm sinh hóa. - Khẳng định: khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella phải được kiểm tra sinh hóa và kháng huyết thanh. Từ mỗi môi trường phân lập, cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc TSA, ủ ở 7°C trong 24 h, các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng để thửu nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh. 2.3.4.5.3. Thí nghiệm 3: đánh giá hiệu quả phân b n vi sinh trên đối tượng hạt đậu xanh và trên cây rau mầm - Mục đích Nhằm đánh giá hiệu quả chế phẩm hữu cơ vi sinh đối với khả năng nảy mầm cây và sinh trưởng của cây. 2.3.5. Khả năng nảy mầm hạt đậu xanh - Nguyên liệu Hạt đậu xanh được mua ở khu vực chợ phường 25, Ung Văn Khiêm, quận 56
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bình Thạnh, TP.HCM, hạt to đề nhau, trơn nhẵn, phôi không bị sẫm màu và có kích thước đồng đều. n 2 13 mẫu ậu xan ợc t u lấ . iá thể: bông gòn thấm nước được lấy từ phòng thí nghiệm khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường. Sử dụng chế phẩm phân bón đang nghiên cứu để phun thử và tạo độ ẩm. - Tiến hành Mô hình thí nghiệm: Sử dụng sản phẩm ở công thức tốt nhất để tiến hành ươm cây, ươm trong đĩa petri để trong bóng mát, hạn chế sự thất thoát nước. Cách bố trí thí nghiệm: Bảng 2.3: T lệ pha loãng chế phẩm phun thử trên đ u xanh. Công thức Tỷ lệ Nồng độ pha loãng 20 g : 380 ml nước cất vô trùng 20 lần Đối chứng 8 g : 392 ml nước cất vô trùng 50 lần Công thức 1 20 g : 380 ml nước cất vô trùng 20 lần 57
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 8 g : 392 ml nước cất vô trùng 50 lần Công thức 2 20 g : 380 ml nước cất vô trùng 20 lần 8 g : 92 ml nước cất vô trùng 50 lần Công thức 20 g : 380 ml nước cất vô trùng 20 lần 8 g : 392 ml nước cất vô trùng 50 lần Công thức 4 20 g : 380 ml nước cất vô trùng 20 lần 8 g : 392 ml nước cất vô trùng 50 lần - uy tr nh công nghệ Hạt đậu đem sau khi được lựa chọn loại bỏ những hạt hư không đạt tiêu chuẩn đem rửa với nước sạch để loại bỏ tạp chất, bụi và một phần vi sinh vật bám trên bề mặt hạt. Ngâm hạt với nước ấm 5 C trong thời gian 2h. Sau khi ngâm rứa với nước sạch để loại bỏ một phần nước chua trên bề mặt hạt tránh gây hư hỏng khi trồng. Để ráo nước trước khi gieo hạt để loại bỏ một phần nước bám trên bề mặt hạt tránh gây úng thối khi trồng. ieo hạt trên giá thể bông gòn thấm nước. Mật độ 20 hạt / 1 đĩa petri. Tiến hành pha loãng chế phẩm để tưới, mỗi nồng độ lặp lại lần. Tương tự, công thức đối chứng cũng pha loãng và lặp lại lần.Tiến hành ủ trong 2 – ngày để theo dõi khả năng nảy mầm của hạt. 58
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hạt đậu Chế phẩm xanh ưa chọn ngẫu Rửa 1 Pha loãng nhiên Nồng Nồng Ngâm nước ấm Rửa 2 độ 20 độ 50 Để ráo Gieo n 2 14 s o s t ộ n m m sau i p un c ế p m. Ch tiêu theo d i Theo dõi tỷ lệ nảy mầm Thời gian mọc mầm Sinh khối hạt nảy mầm 59
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đối chứng – 2 l n Đối chứng – l n 60
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CT1 – 2 l n CT1 – l n 61
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CT2 – 20 l n CT2 – 50 l n 62
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CT3 – 20 l n CT3 – 50 l n 63
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CT – 2 l n CT – l n n 2 15 K o s t tỷ lệ n m m t ậu xan . 64
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.6. Hiệu quả chế phẩm phân b n trên cây rau mầm - Nguyên liệu Hạt mầm rau cải được mua ở khu vực phường 11, Thành Thái, quận 10, tp.HCM. iá thể: mùn dừa được mua ở khu vực phường 11, Thành Thái, quận 10, tp.HCM. Sử dụng chế phẩm phân bón đang nghiên cứu để phun thử và tạo độ ẩm. - Tiến hành Mô hình thí nghiệm: Sử dụng sản phẩm ở công thức tốt nhất để tiến hành ươm cây, ươm trong đĩa petri để trong bóng mát, hạn chế sự thất thoát nước. Cách bố trí thí nghiệm: Bảng 2. : T lệ pha loãng chế phẩm phun trên rau m m Nồng độ Công thức T lệ pha loãng 20 g: 380 ml nước cất vô trùng 20 lần Đối chứng 8 g: 392 ml nước cất vô trùng 50 lần 20 g: 380 ml nước cất vô trùng 20 lần Công thức 1 8 g: 392 ml nước cất vô trùng 50 lần 20 g : 80 ml nước cất vô trùng 20 lần Công thức 2 8 g: 92 ml nước cất vô trùng 50 lần 20 g: 380 ml nước cất vô trùng 20 lần Công thức 3 8 g: 392 ml nước cất vô trùng 50 lần 20 g: 380 ml nước cất vô trùng 20 lần Công thức 8 g: 392 ml nước cất vô trùng 50 lần Quy trình Bư c 1: Ngâm hạt. 65
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hạt giống rửa sạch ngâm nước ấm 45 50 trong thời gian 2 - 5 h. Bư c 2: àm giá thể. Cho giá thể xơ dừa vào dày khoãng 2 – cm. àm cho bề mặt bằng phẳng để tránh bị dồn hạt khi gieo. Sau đó phun lần lượt các chế phẩm ở các nồng độ khác nhau cho ướt giá thể. Trải giấy thấm lên trên bề mặt giá thể và phun chế phẩm lần 2. Mục đích của việc trải giấy thấm là để giá thể không bám vào cây gây bẩn khi thu hoạch. Bư c 3: Gieo hạt. ieo hạt giống bằng tay đều lên bề mặt giá thể. Mật độ trung bình khoãng 10 gr hạt / 40 cm2 bề mặt giá thể. Tưới phun nhẹ chế phẩm bề mặt khay trong 2 ngày. Bư c : Chăm sóc cây Sau 2 – ngày hạt nảy mầm đều, chuyển khay ra nơi có nhiều ánh sáng hoặc nắng nhẹ, tránh ánh sáng trực tiếp và mưa trực tiếp. Phun chế phẩm mỗi ngày bằng bình phun, ngày 2 lần buổi sáng sớm và buổi chiều mát, tưới phun sương đều trên mặt khay. Mỗi nồng độ lặp lại lần. Ch tiêu theo d i: Khả năng nảy mầm hạt ở các công thức ở nồng độ khác nhau. Chiều dài thân cây. Chiều dài rễ cây. Sinh khối cây. 66
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tình hình thức ăn th a tại TP.HCM: Thức ăn thừa là nỗi lo của cả toàn cầu. Tại các nước EU, ước tính có khoảng 88 triệu tấn thức ăn thừa thải bỏ hàng năm, chiếm 20% lượng lương thực sản xuất ra. Tại Malaysia, khoảng 8000 tấn thức ăn thừa phát sinh mỗi ngày (Tan ih Min , 2015). Kết quả điều tra một số nhà hàng dịch vụ ăn uống tại thành phố Hồ Chí Minh cho thấy, mỗi ngày, bình quân một nhà hàng có khoảng 41,67kg thức ăn thừa/ ngày. Trong đó, lượng cơm thừa chiếm từ 20 – 50 %, cá thừa chiếm 20-50%, thịt chiếm 20 – 40%, rau củ chiếm 20-40% và dầu mõ chiếm 20- 0% tùy vào từng loại nhà hàng. Chỉ khoảng 0% lượng thức ăn thừa được thu hồi bởi những người chăn nuôi. Còn lại khoảng 70% lượng thức ăn thừa được bỏ theo rác thải sinh hoạt. Như vậy, với lượng lớn các nhà hàng dịch vụ ăn uống dày đặc tại thành phố Hồ Chí Minh, thì một ngày có hàng chục tấn thực phẩm thừa được đổ theo rác, gây ô nhiễm môi trường và lãng phí nguồn vật liệu hữu cơ. Bảng 3.1. Tình hình thức ăn th a thải ra tại một số nhà hàng ở thành phố Hồ Chí Minh Ch tiêu theo d i Số lư ng 1. ượng thức ăn thừa (kg/ngày) 41,67 ± 6,48 2. Thành phần trong thức ăn thừa Tinh bột 20- 50% Cá 20 – 50% Thịt 20 – 40% Rau, củ 20- 30% Dầu mở 20-30% . Biện pháp xử lý Thu hồi cho chăn nuôi 30% Đổ bỏ theo rác sinh hoạt 70% 67
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.1.1. Đặc điểm cả nguồn thức ăn th a Theo Syeda Azeem Unnisa (2015) thức ăn thừa là nguyên liệu tốt để chuyển hóa thành phân bón hữu cơ dạng lỏng. Phân bón phân tạo thành từ thức ăn thừa bị phân hủy sau ngày có hàm lượng N là 1.15 %, P là 0. 08%, K là 0.7% and trong phần bã có chứa N là 0. 9%, P là 0.159% và K là 0.51% được dùng để làm phân bón gốc. Cũng cùng nhận định này. Risse & Faucette (2014) cho biết, thức ăn thừa có ẩm độ cao và có cấu trúc vật lý đơn giản so với nhiều nguồn rác thải khác nên dễ phân hủy để tạo ra phân bón dạng. Kết quả phân tích chỉ tiêu đầu vào của nguyên liệu (thức ăn thừa) cho thấy, độ ẩm của thức ăn thừa khá cao, biến động từ 75 - 89% , trung bình là 79, 9%, Tỷ lệ C/N là 0,4 % và pH là 6, . Nguồn vật liệu này khá thích hợp để phân hủy tạo phân bón dạng lỏng, sử dụng cho sản xuất nông nghiệp (Syeda Azeem Unnisa , 2015; Stoknes et al, 2016). Bảng 3.2: Đặc điểm nguyên liệu đ u vào. Ch tiêu Nguồn nguyên liệu đ u vào Ẩm độ 79.39 % Hàm lư ng C/N 40.33 % Độ pH 6.3 Kết lu n Thức ăn thừa có độ ẩm cao (79. 9 %) và độ pH (6. ) là phù hợp để sử dụng phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón dạng lỏng. 3.1.2. Xác định t lệ vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus thích h p để tăng cường quá trình phân hủy thức ăn th a tạo phân bón Stoknes et al, 2016 cho rằng việc thủy phân thức ăn thừa tạo thành phân bón lá dùng trog nhà kính giảm 95% phát thải CO2. Theo các tác giả, thủy phân thức ăn thừa nhờ các vi sinh vật lên men trong điều kiện thiếu O2 là cách để tận dụng 68