Đồ án Phân lập các loài vi nấm kí sinh trên nấm linh chi và đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh hại cây trồng của những loài có triển vọng

91 trang thiennha21 12/04/2022 6700

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập các loài vi nấm kí sinh trên nấm linh chi và đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh hại cây trồng của những loài có triển vọng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_phan_lap_cac_loai_vi_nam_ki_sinh_tren_nam_linh_chi_va.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập các loài vi nấm kí sinh trên nấm linh chi và đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh hại cây trồng của những loài có triển vọng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP CÁC LỒI VI NẤM KÍ SINH TRÊN NẤM LINH CHI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG CỦA NHỮNG LỒI CĨ TRIỂN VỌNG Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THÁI MINH HIẾU MSSV: 1051110073 Lớp: 10DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi. Các số liệu và kết quả trong Đồ án là trung thực. Mọi thơng tin trích dẫn trong Đồ án đều được ghi rõ nguồn gốc. Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thái Minh Hiếu
LỜI CÁM ƠN Xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Cơng Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hồn thành tốt khĩa học 2010 – 2014. Xin cảm ơn các thầy cơ trong khoa Cơng nghệ sinh học, Thực phẩm và Mơi trường đã giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quan trọng tạo nền tảng kiến thức vững chắc để hồn thành tốt Đồ án và sau này cĩ thể ứng dụng vào cơng việc thực tiễn. Xin chân thành cám ơn TS. Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện để em hồn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này. Và em cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khĩa và đặc biệt là em Huỳnh Nhi đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ, động viên khích lệ tinh thần, cùng em trải qua những khĩ khăn trong suốt quá trình thực hiện Đồ án tốt nghiệp. Cuối cùng, con xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã luơn bên cạnh, cổ vũ, động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để con cĩ thể hồn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này. Tp. HCM, Ngày 31 tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thái Minh Hiếu
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC  MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Mục tiêu nghiên cứu 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi 3 1.1.1. Phân loại (Sissi Wachtel-Galor và Iris F.F.Benzie, 2011) 3 1.1.2. Hình thái quả thể nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2001) 4 1.1.3. Thành phần hĩa học và giá trị dược liệu của nấm Linh chi đỏ 5 1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm Linh chi trên thế giới và Việt Nam 6 1.1.5. Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm (Lê Duy Thắng, 2005) 7 1.2. Giới thiệu về nấm Trichoderma 12 1.2.1. Phân loại 12 1.2.2. Đặc điểm hình thái 12 1.2.3. Đặc điểm sinh lí, sinh hĩa (Gary J. Samuels, 2004) 13 1.2.4. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma trong phịng trừ nấm gây bệnh cây trồng (Gary J. Samuels, 2004; Gary E. Harman và cộng sự, 2005) 14 1.2.5. Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma trên thế giới và ở Việt Nam 18 - i -
Đồ án tốt nghiệp 1.3. Giới thiệu với nấm Aspergillus 20 1.3.1. Phân loại 20 1.3.2. Đặc điểm hình thái 20 1.3.3. Đặc điểm sinh lý, hĩa sinh 21 1.3.4. Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Aspergillus trên thế giới và ở Việt Nam 22 1.4. Bệnh do nấm Rhizoctonia spp. gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas, 2005) 23 1.5. Bệnh do nấm Fusarium spp. gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas, 2005) 25 1.6. Bệnh do nấm Colletotrichum spp. gây ra 28 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 31 2.2. Vật liệu 31 2.2.1. Nguồn mẫu phân lập 31 2.2.2. Nguồn nấm bệnh 31 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị 31 2.2.4. Hĩa chất 32 2.2.5. Các loại mơi trường 33 2.3. Nội dung nghiên cứu 33 2.4. Phương pháp nghiên cứu 34 2.4.1.Phương pháp phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi (Agrios, 2005) 34 2.4.2. Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005) 35 - ii -
Đồ án tốt nghiệp 2.4.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo kiểm chứng tác nhân gây bệnh (Agrios, 2005) 36 2.4.4. Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh (Tơ Duy Khương, 2007) 37 2.4.5. Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đối với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro (Laila Naher và cộng sự, 2012) 38 2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu thí nghiệm 39 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1. Kết quả phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi 40 3.1.1. Kết quả phân lập nấm kí sinh trên nấm Linh chi 40 3.1.2. Đặc điểm hình thái của 3 chủng nấm T1, T2, A1 41 3.1.3. Kết quả định danh đến lồi của 3 chủng nấm T1, T2 và A1 44 3.1.4. Kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch ở điều kiện in vitro 47 3.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase và chitinase) của hai lồi Trichoderma virens và Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi 51 3.3. Khảo sát khả năng đối kháng của 2 lồi nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi đối với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro 52 3.3.1. Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp. 53 3.3.2. Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia sp. 55 3.3.3. Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp1. 57 3.3.4. Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp2. 59 3.3.5. Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp3. 61 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64 - iii -
Đồ án tốt nghiệp 4.1. Kết luận 64 4.2. Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC - iv -
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT  1. CMC: Carboxymethyl cellulose 2. ĐC: Đối chứng 3. MSM: Minimal Synthetic Medium 4. PGA: Potato D-Glucose Agar 5. TN: Thí nghiệm 6. VSV: Vi sinh vật - v -
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG  Bảng Trang Bảng 1.1. Một số lồi nấm mốc thường gặp trong nuơi trồng nấm 10 Bảng 2.1. Nguồn nấm Linh chi bị bệnh 31 Bảng 3.1. Tần suất xuất hiện các chủng nấm phân lập được trên nấm Linh chi bệnh 41 Bảng 3.2. Tỷ lệ tai nấm Linh chi bị nhễm bệnh sau khi lây bệnh nhân tạo 48 Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái của T. virens và T. harzianum phân lập ban đầu 50 Bảng 3.4. Đường kính vịng phân giải của hai lồi nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum sau 2 ngày nuơi cấy 52 Bảng 3.5. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Fusarium 54 Bảng 3.6. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Rhizoctonia sp. 56 Bảng 3.7. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Colletotrichum sp1. 58 Bảng 3.8. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Colletotrichum sp2. 60 Bảng 3.9. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Colletotrichum sp3. 62 - vi -
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH  Hình Trang Hình 1.1. Nấm Linh chi (Gerdonama luciadum). 3 24 Hình 1.2. Hình thái quả thể nấm Linh chi đỏ. 5 Hình 1.3. Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm. 9 Hình 1.4. Hình thái nấm Trichoderma harzianum 12 Hình 1.5. Trichoderma kí sinh trên nấm Pythium gây bệnh ở cây họ đậu (Nấm Trichoderma (màu vàng) tấn cơng nấm Pythium (màu xanh)) 15 Hình 1.6. Trichoderma tiết enzyme chitinase và kháng sinh peptaibols phân hủy vách tế bào nấm bệnh. 16 Hình 1.7. Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh được tiết ra từ Trichoderma hazianum. 17 Hình 1.8. Hệ bào tử đính của giống nấm sợi Aspergillus 21 Hình 1.9. Biểu hiện bệnh do Rhizoctonia gây ra. 25 Hình 1.10. Héo Fusarium trên cây chuối do F. oxysporum f.sp.cubense. 26 Hình 1.11. Biểu hiện bệnh héo vàng do nấm Fuasarium spp. gây ra trên cây cà chua 27 Hình 1.12. Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra trên các loại trái cây nhiệt đới. 28 Hình 1.13. Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum acutatum gây ra trên trái ớt và lá ớt 29 Hình 1.14. Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra trên trái thanh long và cành thanh long 30 Hình 2.1. Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp 40 Hình 3.1. Hình thái đại thể chủng nấm T1 nuơi cấy trên mơi trường PGA 42 Hình 3.2. Hình thái vi thể chủng nấm T1 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X 42 Hình 3.3. Hình thái đại thể chủng nấm T2 nuơi cấy trên mơi trường PGA 43 - vii -
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.4. Hình thái vi thể chủng nấm T2 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X 43 Hình 3.5. Hình thái đại thể chủng nấm A1 nuơi cấy trên mơi trường PGA 44 Hình 3.6. Hình thái vi thể chủng nấm A1 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X 44 Hình 3.7. Kết quả giải trình tự 28S rRNA vả tra cứu trên BLAST SEARCH của chủng nấm T1 45 Hình 3.8. Kết quả giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH của chủng nấm T2 46 Hình 3.9. Kết quả giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH của chủng nấm A1 47 Hình 3.10. Biểu hiện nhiễm bệnh trên nấm Linh chi sau 15 ngày lây bệnh nhân tạo 49 Hình 3.11. Vịng phân giải chitin và CMC của 2 lồi nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum sau 2 ngày nuơi cấy 53 Hình 3.12. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Fusarium sp. 55 Hình 3.13. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Rhizoctonia sp. 57 Hình 3.14. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Colletotrichum sp1. 59 Hình 3.15. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Colletotrichum sp2. 61 Hình 3.16. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Colletotrichum sp3. 63 - viii -
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Nấm Linh chi hiện đã được biết đến là lồi nấm cĩ giá trị sử dụng cao để làm dược liệu và được sản xuất phổ biến ở nhiều nước trên thế giới. Beta glucan và chitine là thành phần chính cấu tạo nên thành tế bào của nấm Linh chi (Pai-Feng Kao và cộng sự, 2012). Tuy nhiên, Kumar và cộng sự (2011) cho biết, trong quá trình sinh trưởng, phát triển, nấm Linh chi bị kí sinh bởi nhiều lồi nấm, trong đĩ cĩ các lồi nấm Trichoderma. Tác giả cũng đánh giá đây là nhĩm nấm cĩ triển vọng trong quản lý bệnh hại cây trồng. Enzyme là nhân tố quan trọng giúp Trichoderma cĩ khả năng tấn cơng trực tiếp lên nấm Linh chi các lồi nấm khác. Trong số các enzyme được tiết ra từ nấm Trichoderma spp. thì Endochitinase và Glucanase 1,3- beta-glucosidase đĩng vai trị rất quan trọng trong hoạt động kí sinh của nấm Trichoderma spp. (Margolles Clark và cộng sự, 1995). Hầu hết vách tế bào nấm bệnh đều cĩ cấu bởi chitin và glucan (Agrios, 2005). Vì vậy, các lồi nấm kí sinh trên nấm Linh chi sẽ cĩ khả năng đối kháng với các lồi nấm bệnh khác. Một số chủng Trichoderma cũng đã được thơng báo cĩ khả năng phịng trừ được nấm Colletotrichum (Stanley Freeman và cộng sự, 2004). Đây là lồi nấm nguy hiểm cho sản xuất nơng nghiệp vì gây hại trên rất nhiều loại cây trồng và trong bảo quản sau thu hoạch nhiều lồi hoa quả (Agrios, 2005). Cũng như trên thế giới, nấm Linh chi đang được trồng khá phổ biến ở nhiều tỉnh thành của Việt Nam. Theo Lê Duy Thắng (2001), nấm Linh chi bị một số lồi nấm kí sinh gây hại. Trong số này cĩ nấm Trichoderma là lồi gây hại nghiêm trọng nhất, nhĩm mốc này tấn cơng trên bịch đã cĩ tơ ăn đầy, thậm chí trên cả tai nấm Linh chi và ức chế mạnh lên sự phát triển của tơ nấm. Nấm Trichoderma đã được nghiên cứu và sử dụng nhiều ở Việt Nam nhưng chủ yếu được phân lập từ đất và để phịng trừ nấm gây hại cây trồng cĩ trong đất (Dương Minh và cộng sự, 2005). Việc phân lập nấm Trichoderma từ nấm Linh chi và lợi dụng chúng để phịng trừ bệnh hại cây trồng chưa được quan tâm. Bên cạnh đĩ, biện pháp quản lý nấm gây hại trên lá và quả các lồi cây trồng chủ yếu nhờ vào các loại thuốc hĩa học và chưa cĩ tác - 1 -
Đồ án tốt nghiệp nhân sinh học nào tỏ ra cĩ hiệu quả đối kháng với lồi nấm bệnh này. Vì vậy, việc phân lập và lợi dụng các chủng nấm kí sinh trên nấm Linh chi để quản lý một số bệnh hại cây trồng trên mặt đất là khả thi và rất cần thiết. Xuất phát từ lý do trên, sinh viên tiến hành đề tài “ Phân lập các lồi vi nấm kí sinh trên nấm Linh chi và đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh gây hại cây trồng của những lồi cĩ triển vọng”. 2. Mục đích nghiên cứu Phân lập và định danh đến lồi các vi nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi. Tuyển chọn các lồi vi nấm cĩ triển vọng ứng dụng kháng nấm bệnh hại cây trồng. 3. Mục tiêu nghiên cứu − Phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi và định danh đến lồi các chủng nấm phân lập được. − Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh. − Khảo sát khả năng đối kháng của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh cĩ tiềm năng với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro. - 2 -
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi 1.1.1. Phân loại (Sissi Wachtel-Galor và Iris F.F.Benzie, 2011) Nấm Linh chi cĩ trên khoa học là Ganoderma lucidum, thường được tìm thấy ở các nước Á Đơng. Từ xưa đến nay, ở Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước châu Á khác đã sử dụng nấm Linh chi như một loại thảo dược để giúp tăng cường sức khỏe và kéo dài tuổi thọ của con người. Đây là một loại nấm lớn, màu tối, vỏ ngồi nhẵn bĩng và nhìn giống như một khúc gỗ Ở mỗi nơi nấm Linh chi được gọi bằng nhiều tên khác nhau như Reishi (Nhật Bản), Lingzhi (Trung Quốc), Yeongji (Hàn Quốc) và Ling-Chih (Đài Loan). Ngồi ra cịn một số tên gọi khác như nấm vạn niên (Nhật bản) hay nấm trường sinh (Trung Quốc). Theo 2 cuốn sách rất nổi tiếng mơ tả về các loại dược thảo của Trung Quốc, “Shen Nong Ben Cao Jing” (25- 220 trước Cơng nguyên, thuộc triều đại Đơng Hán) và “Ben Cao Gang Mil” của Li Shi Zhen (1590 trước Cơng nguyên, thuộc triều đại nhà Minh), cĩ 6 chủng nấm được biết đến tại thời điểm lúc bấy giờ. Trong đĩ cĩ hơn 250 loại nấm Linh chi được đề cập. Nấm Linh chi xuất thân từ lồi nấm gỗ mọc hoang trong thiên nhiên, cĩ hàng trăm lồi khác nhau cùng họ nấm gỗ (Ganodermataceae). Trong đĩ, chi Ganoderma cĩ đến 80 lồi cĩ màu sắc khác nhau thay đổi từ vàng, cam, đỏ tía . . .rất đa dạng.Vị trí phân loại của nấm Linh chi như sau: – Giới: Fungi – Ngành: Basidiomycota – Lớp: Agaricomycetes – Bộ: Polyporales – Họ : Ganodermataceae – Chi: Ganoderma – Lồi: Ganoderma lucidum Hình 1.1. Nấm Linh chi (Gerdonama luciadum) - 3 -
Đồ án tốt nghiệp 1.1.2. Hình thái quả thể nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2001) Nấm Linh chi là một loại nấm hĩa mộc, cứng khi khơ nhưng khi tiếp xúc với nước trở nên hơi mềm. Quả thể nấm Linh chi gồm: Mũ nấm: mặt trên thường cĩ một lớp bĩng màu nâu đỏ, mặt dưới nấm cĩ nhiều lổ nhỏ li ti, là cơ quan sinh bào tử nếu cắt ngang cĩ dạng tổ ong. Ngồi thiên nhiên, nấm luơn cĩ dạng bất đối xứng, tức là cuống nấm thường ở một bên như vị trí tay quạt. Đối với nấm trồng, mũ nấm trịn và gần như đối xứng, cuống nấm ở giữa trung tâm do được trồng theo từng đơn vị, khơng cĩ sự chèn ép và ảnh hưởng mơi trường bên ngồi. Bào tử: hình thuẩn cĩ gai lõm. Một đầu trịn lớn, một đầu nhỏ cĩ lỗ, nơi đây bào tử sẽ nảy mầm cho ra khuẩn ty ăn luồn vào thân cây. Bào tử nấm tương tự như một loại phấn hoặc hạt mầm, cĩ thể phát triển thành một cây nấm hồn chỉnh, nhưng khác ở chỗ nĩ được cấu tạo từ một tế bào duy nhất. Đường kính của bào tử nấm Linh chi chỉ từ 5 – 8 µm. So sánh cùng trọng lượng, bào tử nấm Linh chi cĩ dược tính mạnh hơn quả thể 75 lần, gồm các dược chất thiên nhiên như triterpenoids, polysaccharides (β - D - glucans), germannium và các hoạt chất khác. Cuống nấm: cuống nấm đặc và cứng, sậm màu, bám vào đài vật như thân cây. Chân nấm cĩ thể dài cũng cĩ thể ngắn, là bộ phận giúp nấm lấy chất dinh dưỡng. A B - 4 -
Đồ án tốt nghiệp C D Hình 1.2. Hình thái quả thể nấm Linh chi đỏ: A: Nấm mọc tự nhiên; B: Nấm trồng nhân tạo; C: Bào tử nấm; D: Hình thái cấu trúc giải phẫu nấm. 1.1.3. Thành phần hĩa học và giá trị dược liệu của nấm Linh chi đỏ Thành phần trong nấm Linh chi tươi thì nước là chủ yếu, chiếm 90% khối lượng. Trong 10% cịn lại thì protein chiếm 10 - 40%, chất béo chiếm từ 2 - 8%, carbohydrate chiếm 3 - 28%, chất xơ chiếm 3 - 32%, hàm lượng tro chiếm 8 - 10%. Ngồi ra, nấm Linh chi cịn cĩ các thành phần vi lượng như một số loại vitamin và các khống chất khác nhau như là kali, can-xi, phốt pho, magiê, selen, sắt, kẽm (Borchers và cộng sự, 1999). Trong một nghiên cứu của các thành phần khơng bay hơi của Linh chi cho thấy rằng nấm chứa tro 1,8%, 26 - 28% carbohydrate, 3 - 5% chất béo thơ, 59% chất xơ thơ, và 7 - 8% protein thơ (Mau và cộng sự, 2001). Hàm lượng của protein trong nấm Linh chi khoảng 7 - 8%, thấp hơn so với nhiều loại nấm khác (Chang và cộng sự, 1996; Mau và cộng sự, 2001). Đặc biệt thành phần protein của nấm Linh chi cĩ rất nhiều các amino acid thiết yếu nhất là lysine và leucine. Hàm lượng chất béo tổng thấp nhưng chứa nhiều acid béo khơng bão hịa nhiều nối đơi, đây là các hợp chất rất cĩ lợi cho sức khỏe của con người (Chang và cộng sự, 1996 ; Borchers và cộng sự, 1999). Nhiều cơng trình nghiên cứu trên thế giới đã định danh được các hoạt chất sinh học cĩ tác dụng dược lý trong nấm Linh chi bao gồm các nhĩm chính: polysaccharides, triterpenoids, protein, peptide, adenosine và nucleoside ( Zhou và - 5 -
Đồ án tốt nghiệp cộng sự, 2007; Zhang W và cộng sự, 2008). Đến nay, hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào nhĩm polysaccharides và nhĩm triterpenoids. Hơn 200 polysaccharides đã được phân lập từ quả thể và sợi nấm của loại nấm này, trong số đĩ β - 1 - 3 và β - 1 - 6 D - glucans là những thành phần cĩ hoạt tính sinh học chính (Bao X và cộng sự, 2002). Nhiều tác dụng dược lý của chúng chẳng hạn như điều hồ miễn dịch, chống oxy hĩa, hoạt động kháng u đã được chứng minh trong nhiều mơ hình động vật (Gou L và cộng sự, 2009; Chang KC và cộng sự, 2007). Cho đến nay, hơn 130 triterpenes đã được phân lập từ G. lucidum và các hợp chất này được chú ý do tác dụng bảo vệ gan, ức chế sự tăng trưởng khối u (Kimura Y và cộng sự, 2002). Đặc biệt trong nấm Linh chi, cĩ hàm lượng germanium cao hơn trong nhân sâm đến 5 – 8 lần) (Boh B và cộng sự, 2007). Ngồi ra, nấm Linh chi cũng cĩ chứa một mạng lưới chitin, đây là thành phần mà cơ thể người khơng tiêu hĩa được và đĩng vai trị tạo nên độ cứng cáp cho nấm Linh chi (Upton và cộng sự, 2000). 1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm Linh chi trên thế giới và Việt Nam Linh chi đã được dùng cách đây hàng ngàn năm và đã được chọn lọc thành những chủng thương phẩm, trồng nhiều ở các nước Châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Việt Nam Năm 1997 sản lượng Linh chi được thống kê trên thế giới như sau: 4.300 tấn trong đĩ Trung Quốc sản xuất đã là 3.000 tấn. Hàn Quốc là nước sản xuất Linh chi nhiều thứ hai trên thế giới sau Trung Quốc, sản lượng của Hàn Quốc năm 1998 là 1307 tấn. Hơn 90 thương hiệu của các sản phẩm Gerdonama lucidum đã được đăng kí và bán trên thị trường quốc tế (Lin S, 2000). Tiêu thụ trên tồn thế giới hiện nay ước tính khoảng vài ngàn tấn và thị trường đang phát triển nhanh chĩng. Mặc dù khơng cĩ những dữ liệu gần đây cơng bố liên quan đến tổng giá trị các sản phẩm Linh chi trên thế giới nhưng năm 1995, tổng giá trị ước tính hàng năm được đưa ra bởi các nguồn thương mại khác nhau là 1628 triệu USD (Chang và Buswell, 1999). Nhiều sản phẩm - 6 -
Đồ án tốt nghiệp Gerdonama lucidum được sản xuất từ các bộ phận khác nhau của nấm, hiện đang cĩ sẵn trên thị trường (Chang và Buswell, 2008). Tại Việt Nam, nấm Linh chi thương phẩm được trồng đầu tiên năm 1987 tại “Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu Tp.HCM”. Sau đĩ, phong trào trồng nấm Linh chi dần dần lan rộng khắp cả nước. Sau 25 năm, sản lượng Linh chi của cả nước ước chừng 50 tấn/ năm. Trong đĩ, Trung tâm đã là 30 tấn, cịn 20 tấn cịn lại là do các trang trại hoặc các hộ nơng dân của các tỉnh trồng. Hiện nay trên thị trường cả nước và nhất là thành phố Hồ Chí Minh bày bán các sản phẩm được chế biến từ Linh chi và nhiều nhất là tai nấm Linh chi. Linh chi cĩ nhiều chủng loại, giá bán thị trường tùy thuộc vào chất lượng và giá trị sử dụng của nấm, hiện nay giá nấm cao nhất là nấm cĩ nguồn gốc Hàn Quốc. Bên cạnh đĩ, việc tiêu thụ Linh chi ở Việt Nam tương đối khĩ do phải bảo đảm chất lượng và giá thành cịn cao so với thu nhập kinh tế của người dân Việt Nam nên phong trào trồng Linh chi ở Việt Nam khơng được mạnh so với các nước trong khu vực. 1.1.5. Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm (Lê Duy Thắng, 2005) Tương tự như bất kì loại vật nuơi hay cây trồng nào khác, nấm cũng cĩ thể bị rất nhiều bệnh. Trong hầu hết các trường hợp, bệnh làm giảm sản lượng và chất lượng nấm, nghiêm trọng hơn là gây thất thu cho người trồng. Bệnh cĩ thể xảy ra ở bất kì giai đoạn nào của quá trình nuơi trồng nấm và cĩ 2 dạng chủ yếu là bệnh sinh lý và bệnh nhiễm. Bệnh sinh lý là do sợi tơ nấm rất mỏng manh và yếu ớt nên dễ bị tác động của các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, pH, oxy và cả độ ẩm của mơi trường. Thường tơ yếu dần đến khi sức đề kháng giảm, dễ nhiễm bệnh và chết. Bệnh nhiễm với yếu tố gây bệnh rất đa dạng đa số là các nhĩm vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc, nấm nhầy Trong đĩ, vi khuẩn và nấm mốc cĩ tốc độ sinh sản nhanh, đặc biệt bào tử nấm mốc phát tán rộng nên khả năng lây nhiễm của chúng thường nhiều hơn. Các tác nhân này ảnh hưởng gián tiếp đến sinh trưởng và phát triển của nấm, bằng cách cạnh tranh dinh dưỡng, sống kí sinh hút dinh dưỡng hay thay đổi pH của mơi trường Hậu quả là tai nấm mọc chậm, thưa, thậm chí ngừng lại. Quả thể - 7 -
Đồ án tốt nghiệp khơng tạo thành hoặc dị dạng, năng suất giảm. Bên cạnh đĩ, cơ chất dùng nuơi cấy hoặc trồng nấm cũng cĩ thể là thức ăn cho nhiều loại vi sinh vật khác. Đối với nhiễm bịch phơi cĩ thể gặp mốc cam Neuroora.sp, đây là mốc hoại sinh, xuất hiện giai đoạn đầu sau cấy giống. Mốc tăng trưởng nhanh sinh tơ ăn đầy bịch phơi, tơ cĩ màu vàng hoặc hồng. Sau đĩ xuất hiện khối thịt nấm màu cam qua miệng bịch hoặc vết rách trên bịch. Bệnh lây lan nhanh nên cần cơ lập và dập ngay nguồn bệnh. Tác nhân gây bệnh khác cĩ thể gặp trong nuơi trồng là nấm nhầy Exomycetes. Nguyên nhân do vệ sinh kém, nơi trồng ẩm ướt, nhà trồng hoặc dàn kệ bằng gỗ hay nguyên liệu xử lý khơng tốt. Bệnh biểu hiện dạng bọt trắng hay đục sữa, nhưng phổ biến vẫn là những vết lan thành hình rễ cây màu trắng hoặc vàng. Thể sinh sản gồm các túi mang bào tử. Bệnh làm giảm chất lượng nấm và cạnh tranh một phần thức ăn, nhưng nấm vẫn cĩ thể tạo tai và phát triển bình thường. Ngồi ra, nấm cĩ thể bị bệnh mốc xanh gây ra bởi lồi Trichoderma, là một vấn đề nghiêm trọng cho những người trồng nấm trên tồn thế giới, bao gồm Croatia (Hatvani L và cộng sự, 2012). Nhiều chủng nấm Trichoderma được phân lập xem như là tác nhân kí sinh gây bệnh trên nấm nút trắng (Agaricus biorus sp.) và nấm sị (Pleurotus ostreatus) nhiễm mốc xanh ở Croatia. Một nghiên cứu cơng bố lồi Trichoderma longibrachiatum là tác nhân gây bệnh nấm mốc xanh làm thiệt hại đáng kể trong sản xuất nấm trồng, bao gồm nấm nút trắng (Agaricus biorus sp.) và nấm sị (Pleurotus ostreatus) (Kredics và cộng sự, 2010). Đây là nấm mốc kí sinh và khả năng gây hại rất lớn, thậm chí trên cả tai nấm (Linh chi) (Lê Duy Thắng, 2005). Theo A. K. Mukherjee và cộng sự (2014) khi nghiên cứu tiềm năng kiểm sốt sinh học của các chủng Trichoderma phân lập trên nấm hoang dã và vỏ cây cũng cho thấy chủng Trichoderma harzianum CICR-G được phân lập và xem là một tác nhân kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi ngồi tự nhiên. - 8 -
Đồ án tốt nghiệp A B C Hình 1.3. Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm: A: Nấm mốc cam Neurospora sp. nhiễm trên miệng bọc phơi trồng nấm; B: Nấm nhầy Exomycetes sp. nhiễm trên phơi trổng nấm tạo; C: Nấm Trichoderma sp. kí sinh trên tai nấm Linh chi. Trong nuơi trồng, nhiều khi xuất hiện những nấm ngồi ý muốn, gọi là nấm dại. Nấm dại thực ra là một trong những lồi nấm lớn. Chúng cĩ sẵn trong nguyên liệu, do khơng khử trùng hoặc khử trùng khơng đúng quy cách, bào tử của những nấm này tồn tại và phát sinh trở lại trên cơ chất trồng nấm. Bào tử nấm dại cũng cĩ thể xâm nhập vào qui trình trồng nấm ở một giai đoạn nào đĩ. Chúng phát triển và cạnh tranh thức ăn với nấm trồng, kết quả làm sản lượng giảm và đơi khi cản trở sự phát sinh quả thể của nấm trồng. Thường gặp nhất là lồi Coprinus (nấm đậu ). Quả thể nấm tương tự nấm rơm, tai nấm lúc non dạng búp, trưởng thành cĩ dạng dù, nhưng mau tàn, mũ nhanh chĩng chảy rữa ra thành dịch nước đen, nên cịn cĩ tên gọi nấm mực hoặc hắc thủ Nấm phát triển tốt trên cơ chất cĩ nhiều urê, pH thấp và độ ẩm cao, là một trong những đối tượng cạnh tranh với nấm rơm và một số lồi nấm trồng khác. Ngồi Coprinus, nhiều lồi nấm phá hoại gỗ khác, như Schizophyllum commun, Trametes sp., Poria sp., Hypoxylon sp. . Các lồi này chủ yếu cạnh tranh về thức ăn với nấm trồng và thường xuất hiện khi trồng với gỗ khúc - 9 -
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1. Một số lồi nấm mốc thường gặp trong nuơi trồng nấm (Lê Duy Thắng, 2001) STT Tên nấm mốc Đặc điểm biểu hiện Hậu quả trên nấm Tơ nấm màu hung xuất hiện vài Tai nấm bệnh khơng ngày sau khi quả thể rỉ các giọt bị biến dạng nhưng Cephalosporium spp. nước màu nâu. Đơi khi thành nơi vết bệnh chuyển 1 (Bệnh gợn sĩng lớp màng mỏng bao lấy phiến sang đen, chất lượng màu hung) nấm. Bào tử sinh ra hom trong giảm. các dịch nhày. Sống kí sinh hoặc hoại sinh. Tơ phủ lên quả thể như mạng Tai nấm, đặc biệt là nhện ban đầu màu trắng sau đĩ phiến, bị mềm nhũn, Dactylium dendroides chuyển sang hơi hồng rồi vàng. đơi khi trở nên cứng. 2 (Bệnh mạng nhện) Đỉnh bào tử hình trứng và sinh Thịt nấm chuyển theo dạng chùm. Một số kí sinh sang nâu. nấm lớn. Tơ mọc dày, màu trắng chuyển Ức chế sự tăng sang vàng hoặc cam. Cơ quan trưởng của tơ nấm, Monilia spp. sinh sản dạng khối màu cam làm tơ khơng mọc 3 (Neurospora spp.) (cĩ khi đục thủng cả túi nhựa). được. Nguyên liệu (Bệnh mốc cam) Hoại sinh. phủ trắng sau chuyển sang vàng và cam. Tơ ngắn cuộn đầu, màu trắng Quả thể chết non. Tai quanh tai nấm. Hậu bào tử hình nấm mềm nhũn.Bề Mycogone permiciosa thành sau vài ngày, màu sẫm mặt tai nấm cĩ 4 (Bệnh nối ruồi) (làm vết bệnh cĩ màu nâu). những giọt màu nâu Bệnh lan truyền bằng đính bào do nhiễm trùng tạo tử. Kí sinh trên nấm lớn. mùi hơi khĩ chịu. - 10 -
Đồ án tốt nghiệp Tơ mảnh, mọc sát cơ chất và co Ức chế sự tăng Penicillium spp. cụm lại. Vết bệnh lúc đầu cĩ trưởng của tơ, nhất là 5 (Bệnh mốc xanh) màu trắng chuyển sang màu lục bào ngư. Làm giảm tối, sống hoại sinh. sản lượng nấm. Tơ mảnh, mọc bung dạng bong Ức chế mạnh lên sự trên cơ chất. Vết bệnh trải rộng tăng trưởng của tơ. nhanh, bào tử thành dễ, mịn, Trichoderma spp. 6 lúc đầu cĩ màu trắng chuyển (Bệnh mốc xanh) sang lục lam. Nấm sống hoại sinh, một số kí sinh trên nấm lớn. Bệnh lan do bào tử. 7 Tơ phát triển trên bề mặt tại Tai nấm biến dạng và nấm, tạp nhiều lỗ hang và các ngừng tăng trưởng, vết nứt. Hiện tượng bệnh khác phẩm chất kém. Verticillium fungicola với vi khuẩn là nhầy nhớt và hơi thối. Sống kí sinh trên nấm lớn, bệnh lan do ruồi và người hái nấm. - 11 -
Đồ án tốt nghiệp 1.2. Giới thiệu về nấm Trichoderma 1.2.1. Phân loại Trichoderma là một trong những nhĩm vi nấm gây nhiều khĩ khăn cho việc định danh, phân loại do cịn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc định danh, phân loại vẫn chưa được biết đầy đủ. Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường dựa vào sự khác biệt về đặc trưng hình thái, đặc điểm bào tử, cành bào tử và quá trình sinh sản bào tử vơ tính. Năm 1801, Persoon đã xác định Trichoderma thuộc phân loại: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Chi: Trichoderma Hình 1.4. Hình thái nấm Trichoderma harzianum ( 1.2.2. Đặc điểm hình thái Sợi nấm của Trichoderma cĩ tốc độ phát triển rất nhanh, chúng cĩ thể đạt đường kính khuẩn lạc từ 2 – 9 cm sau 4 ngày nuơi cấy. Trên mơi trường PGA ban đầu cĩ màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng. Ở một số lồi cịn cĩ khả năng tiết ra một số chất làm thạch - 12 -
Đồ án tốt nghiệp của mơi trường PGA hĩa vàng (Bùi Xuân Đồng, 1982). Sợi nấm Trichoderma khơng màu, cĩ vách ngăn, cành bào tử khơng màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối trịn mang các bào tử đính ở đỉnh. Bào tử thường cĩ màu xanh, hình trịn, elip hoặc hình oval tùy từng lồi. Đa số các bào tử trơn láng, kích thước khơng quá 5 µm. Nhờ cĩ khả năng tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà Trichoderma harzianum cĩ thể tồn tại 110 – 130 ngày dù khơng được cung cấp chất dinh dưỡng. Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sĩt của Trichoderma trong mơi trường khơng được cung cấp chất dinh dưỡng nên Chlamydospores cĩ thể được dùng để tạo chế phẩm phịng trừ sinh học (Gary J. Samuels, 2004). 1.2.3. Đặc điểm sinh lí, sinh hĩa (Gary J. Samuels, 2004) Nấm Trichoderma phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, chúng hiện diện trong đất, trên rễ cây hay sống trên xác bã hữu cơ hay kí sinh trên những loại nấm khác. Đa số các dịng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất cĩ độ pH từ 2,5 đến 9,5. Phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5. Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ưu thường là 25 – 300C. Một vài dịng phát triển tốt ở 350C. Một số ít phát triển được ở 400C. Hình thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau. Ở 350C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường, ở 370C khơng tạo ra bào tử sau 7 ngày nuơi cấy. Trichoderma là lồi sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme như chitinolytic (enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là 2 enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối kháng với Trichoderma. Một vài lồi Trichoderma cĩ tác động làm tăng tỉ lệ nẩy mầm. Tuy nhiên cơ chế của tác động này chưa được nghiên cứu nhiều. - 13 -
Đồ án tốt nghiệp 1.2.4. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma trong phịng trừ nấm gây bệnh cây trồng (Gary J. Samuels, 2004; Gary E. Harman và cộng sự, 2005) Nấm Trichoderma đã được biết đến từ những năm 1920 là yếu tố kiểm sốt chống lại mậm bệnh gây hại cây trồng. Chi Trichoderma cĩ khả năng đối kháng nhiều loại nấm gây bệnh thực vật. Các cơ chế chính để kiểm sốt nấm hại được biết đến bao gồm tính kí sinh nấm (giao thao sợi nấm, tiết enzyme phân hủy vách tế bào), tiết kháng sinh kháng nấm, cạnh tranh về dinh dưỡng và khơng gian sống. Cho đến nay, nấm Trichoderma được sử dụng để bảo vệ cây trồng chống lại nấm Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp., Botrytis spp. và Fusarium spp. gây bệnh khơ vằn ở lúa; bệnh thối gốc chảy mủ ở cam quýt, sầu riêng; bệnh thối gốc trên các loại cây trồng như lúa, hồ tiêu, bắp, đậu, cà rốt, cà chua (Susanne Zeilinger và Markus Omann, 2007). a. Kí sinh nấm Sự đối kháng của nấm Trichoderma thơng qua nhiều cơ chế. Weidling (1932) đã mơ tả hiện tượng nấm Trichoderma kí sinh nấm gây bệnh và đặt tên cho hiện tượng đĩ là “giao thoa sợi nấm”. Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” là hiện tượng tấn cơng trực tiếp của nấm này lên một nấm khác. Nĩ là một quá trình rất phức tạp bao gồm các bước chính sau: đầu tiên là nhận biết sự cĩ mặt của nấm bệnh, sau đĩ là quá trình tấn cơng, xuyên qua thành tế bào và cuối cùng giết chết nấm bệnh. Một số chi tiết của cơ chế này ở Trichoderma đã được nghiên cứu và làm sáng tỏ. Để giải thích rõ hiện tượng “giao thoa sợi nấm” chúng ta cĩ thể chia quá trình tấn cơng của nấm Trichoderma đối với nấm bệnh làm 3 giai đoạn. Giai đoạn 1: Bước đầu tấn cơng nấm bệnh Tương tác đầu tiên là tơ nấm Trichoderma hướng về tơ nấm kí chủ. Hiện tượng này là đặc tính hướng hĩa của Trichoderma (Elad và cộng sự, 1983). Sau khi tơ nấm Trichoderma đã đến tơ nấm kí chủ, chúng cĩ xu hướng tiếp xúc và cuộn quanh tơ nấm kí chủ, ép chặt sợi nấm và phát triển song song với nấm kí chủ. Kết thúc giai đoạn đầu, nấm Trichoderma bước qua giai đoạn 2 là tiết enzyme. - 14 -
Đồ án tốt nghiệp Giai đoạn 2: Giai đoạn tiết enzyme phá hủy vách tế bào Trichoderma cĩ thể kí sinh trên các lồi nấm khác nhau, mọc trên sợi nấm nhờ tiết ra các enzyme phân giải (như enzyme cellulase, chitinase, Glucanase ) biến, phá huỷ thành tế bào nấm bệnh (Elad và cộng sự, 1983). Kết quả của những hoạt động phối hợp nhiều nhân tố này đã tạo thành những lỗ thủng tại vị trí giác bám trên sợi nấm bệnh. Giai đoạn 3: Tấn cơng vào tế bào chất và tiêu diệt nấm bệnh Các sợi nấm Trichoderma xuyên qua lỗ thủng vào khoang trong của nấm bệnh, phá huỷ chất nguyên sinh nấm chủ và sinh trưởng trong đĩ.Sự phá hủy các chất nguyên sinh của nấm bệnh làm cho chúng bị teo lại và chết đi. Hình 1.5. Trichoderma kí sinh trên nấm Pythium gây bệnh ở cây họ đậu (Nấm Trichoderma (màu vàng) tấn cơng nấm Pythium (màu xanh)) (Hubbard và cộng sự, 1983) b. Tiết kháng sinh Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy những vị trí mà nấm Trichoderma tiếp xúc và kí sinh đã làm cho nấm bệnh chết. Tuy nhiên, ở những điểm khơng cĩ sự tiếp xúc của nấm Trichoderma nhưng nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là do tác động của chất kháng sinh peptaibols từ nấm Trichoderma sinh ra - 15 -
Đồ án tốt nghiệp gây độc cho nấm gây bệnh (Susanne Zeilinger và Markus Omann, 2007) Hình 1.6. Trichoderma tiết enzyme chitinase và kháng sinh peptaibols phân hủy vách tế bào nấm bệnh (Susanne Zeilinger và cộng sự) Mendoza-Mendoza (2003) chỉ ra rằng những chủng T. virens đột biến mất khả năng kí sinh nhưng vẫn giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh cho hiệu quả kiểm sốt sinh học chống lại R. solani và hạch nấm của S. sclerotiorum tương đương với chủng tự nhiên. Kết quả này đã chỉ ra rằng kí sinh khơng là cơ chế chính yếu trong phịng trừ sinh học một bệnh cụ thể. Sự sinh kháng sinh cũng là một trong những đặc tính quen thuộc của chi Trichoderma. Nĩ là một trong những cơ chế chính đối với điều khiển sinh học. Những kháng sinh này cĩ thể ức chế mạnh sự sinh trưởng của những vi sinh vật khác. Chất kháng sinh peptaibols là một chuỗi các oligopeptides của 12-22 amino acid cĩ chứa nhiều α -aminoisobutyric acid, N-acetylated tại N-terminus và chứa một amino alcohol (Phenol hoặc Trypol) tại C-terminus do T. polysporum , hazianum, koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh, và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh (Francesco Vinale và cộng sự, 2008) Francesco Vinale và cộng sự (2008), đã khảo sát khả năng đối kháng của Trichoderma từ việc tiết kháng sinh để ức chế sự phát triển của các chủng nấm bệnh. Ơng sử dụng chất kháng sinh được tiết ra từ T. hazianum bổ sung vào - 16 -
Đồ án tốt nghiệp mơi trường nuơi cấy của chủng Penicilium ultimum. Kết quả cho thấy ở đĩa (1) mơi trường cĩ chứa kháng sinh thì nấm Pythium ultimum bị ức chế khơng phát triển được. Trong khi đĩ đĩa (2) mơi trường khơng chứa kháng sinh thì nấm Pythium ultimum phát triển rất mạnh và khơng bị ức chế. Hình 1.7. Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh được tiết ra từ Trichoderma hazianum ( Francesco Vinale và cộng sự, 2008) c. Cạnh tranh dinh dưỡng và khơng gian sống: Khơng chỉ cĩ cơ chế kí sinh, sự sinh kháng sinh hay tiết enzyme là hiệu quả trong kiểm sốt sinh học mà cơ chế cạnh tranh cũng được coi là cơ chế cĩ ý nghĩa hết sức quan trọng vì sự thiếu dinh dưỡng là nguyên nhân gây chết phổ biến đối với vi sinh vật. Cơ chế này cĩ thể được xem là sự đối kháng gián tiếp, được ứng dụng nhiều và hiệu quả trong kiểm sốt sinh học các bệnh do nấm (Gary E. Harman và cộng sự, 2005). Trichoderma cĩ thể cạnh tranh nguồn cacbon, nitơ và yếu tố tăng trưởng khác với nấm bệnh Nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. gây bệnh cho cây bằng cách xâm nhập vào những mơ già hoặc mơ chết, sử dụng chúng làm nền tảng để từ đĩ xâm nhập vào những mơ khỏe. Nấm Trichoderma cĩ khả năng cạnh tranh, cũng sử dụng những mơ già và mơ chết của cây làm nguồn dinh dưỡng, bằng cách đĩ nấm Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. Sivan và Chet (1989), đã chứng minh rằng sự cạnh tranh chất dinh dưỡng là cơ chế chính được T. hazianum sử dụng - 17 -
Đồ án tốt nghiệp đế kiểm sốt nấm bệnh Fusarium oxysporum. Khơng những thế, Trichoderma cịn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Pythium spp. do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào tử Pythium spp. (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây. Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Pythium spp. bằng cách sử dụng dịch tiết đĩ vì thế mà các bào tử Pythium spp. khơng thể nảy mầm. Trichoderma cịn đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đĩ ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh. Bên cạnh đĩ, Trichoderma cũng tác động trực tiếp lên vùng rễ như loại bỏ mầm bệnh, làm tăng sự sinh trưởng và phát triển của rễ hoặc từ những điểm mà Trichoderma tác động đến sẽ kích thích cây trồng tăng sản xuất các enzym bảo vệ và các hợp chất kháng sinh nhờ đĩ giúp cây đề kháng tốt với mầm bệnh. 1.2.5. Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma trên thế giới và ở Việt Nam Trên thế giới, những sản phẩm cĩ chứa Trichoderma rất được quan tâm đưa vào ứng dụng đối kháng với nấm bệnh gây hại trên một số cây trồng. Một số sản phẩm thương mại của nấm Trichoderma được sản xuất ở các thị trường Châu Á, Châu Âu, và Hoa Kỳ để sử dụng trên một loạt các loại cây trồng. Các dạng được sử dụng hiệu quả như bào tử, sợi nấm và bào tử vách dày (bào tử hậu) được sản xuất dưới một trong hai trạng thái rắn hoặc chất lỏng lên men.(Harman và Cs, 2004). Sản phẩm Trichoderma 2000 (Israel) chứa nấm Trichoderma harzianum sử dụng trong phịng chống nấm Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfssi, Pythium spp. Sản phẩm T22 và T22HB, Bio-Trek (USA) chứa nấm Trichoderma Harzianum trong phịng chống nấm Rhizoctonia spp., Sclerotium spp., Fusarium spp. và một số loại nấm khác. Sản phẩm Ecofit (Ấn Độ) chứa nấm Trichoderma viride trong phịng chống nấm Fusarium, Pythium , Rhizoctonia, Phytophthora spp. trên cây bơng vải, cây hướng dương, thuốc lá và nhiều loại cây rau. Sản phẩm BINAB-T WP ( Thụy Điển) chứa 2 loại nấm Trichoderma harzianum và Trichoderma polysporum trong phịng chống nấm - 18 -
Đồ án tốt nghiệp bệnh gây hại trên rễ cây trồng trong nhà kính. Ngồi ra, cịn cĩ rất nhiều sản phẩm chứa nấm Trichoderma ở nhiều nước trên Thế giới được ứng dụng trong phịng chống nhiều loại bệnh do nấm gây ra trên cây trồng (CABI, 2001). Ở Việt Nam, nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma của nhiều đơn vị khác nhau đã và đang gĩp phần hạn chế các loại nấm bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau như hồ tiêu, ca cao, cà chua, dưa hấu dưa leo, cam quýt Các kết quả nghiên cứu và ứng dụng sử dụng nấm Trichoderma chủ yếu là dạng rải (thành phẩm sau khi đã trộn nấm Trichoderma với phân hữu cơ, ủ với xác bã thực vật) hoặc tưới, phun xịt (dạng lỏng, bào tử nấm) để phịng và trừ một số bệnh trên cây trồng do nấm gây ra. Năm 2005, Đinh Mạnh Hiệp và cộng sự bước đầu đã hồn tất việc khảo sát sự phân bố các chủng nấm Trichoderma tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh miền Đơng Nam Bộ. Đồng thời nhĩm nghiên cứu này cũng đã nghiên cứu sâu về hoạt tính đối kháng của vi nấm Trichoderma đã phân lập đối với các lồi nấm gây bệnh cây trồng phổ biến như Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfssi, Phytophthora primulae và thử nghiệm ứng dụng chế phẩm Trichoderma tại một số nơi như xã Bầu Lâm (Huyện Xuyên Mộc, Tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu), trạm bảo vệ thực vật Long Khánh đã thu được một số kết quả ban đầu khá tốt. Trung tâm Cơng nghệ sinh học Tp. HCM đưa ra thị trường sản phẩm phân bĩn BIMA dạng rải và dạng phun chứa nấm đối kháng Trichoderma trong phịng trị bệnh trên cây cà phê, hồ tiêu, cây ăn trái, rau mau và ủ chất hữu cơ, phụ phẩm nơng nghiệp như rơm rạ, vỏ cà phê đạt những hiệu quả nhất định. Nhĩm nghiên cứu Đại học Cần Thơ đã phối hợp các chủng nấm Trichoderma thành các sản phẩm phịng trị hiệu quả theo từng nhĩm đối tượng gây bệnh như: Tricơ - ĐHCT cĩ khả năng phịng trị hiệu quả bệnh thối rễ trên cây ăn trái, rau màu do Rizhoctonia spp. và Fusarium spp. gây ra; Tricơ - Lúa Von phịng trị bệnh lúa Von do F. moniliforme; Tri cơ - Phytoph trị bệnh do Phytophthora spp. trên cây sầu riêng, hồ tiêu, cao su ; Tri cơ - Khĩm trị được bệnh do nấm Phytopphthora spp. - 19 -
Đồ án tốt nghiệp và Fusarium spp. gây hại trên khĩm ( Dương Minh và Cs, 2010). Sử dụng nấm Trichoderma bảo vệ cây trồng khỏi các tác nhân gây bệnh sẽ giảm thiểu việc sử dụng thuốc hĩa học để tiêu diệt nấm gây bệnh, giảm thiểu sử dụng phân bĩn hĩa học, gĩp phần giảm thiểu ơ nhiễm mơi trường.Việc sử dụng nấm đối kháng đĩng vai trị là một tác nhân sinh học bảo vệ cây trồng cịn là biện pháp an tồn và hiệu quả, làm tăng năng xuất cây trồng, giữ được phẩm chất nơng sản. 1.3. Giới thiệu với nấm Aspergillus 1.3.1. Phân loại Aspergillus cĩ khoảng 200 lồi phân bố khắp nơi trong tự nhiên, trong đĩ cĩ các lồi Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, cĩ giá trị sử dụng trong sản xuất enzyme, rượu, axit hữu cơ, Vị trí phân loại : Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Aspergillus 1.3.2. Đặc điểm hình thái Sợi nấm cĩ vách ngăn, phân nhánh, khơng màu, màu nhạt, một số trường hợp trở nên nâu hay màu sẫm. Bào tử trần khơng cĩ vách ngăn, khác nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc ở các lồi khác nhau. Giống nấm này rất đặc biệt do chúng cĩ hệ bào tử đính. Bào tử đính phát triển từ thành tế bào dày ở bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc. Nĩ tạo thành sợi cuống dài và kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là túi. Xung quanh túi là một hoặc hai bộ cuống để đính bào tử gọi là cuống đính bào tử hay thể bình. Từ bộ cuống đính bào tử ngồi cùng, bào tử được sinh ra, gọi là bào tử đính. Khơng cĩ một giống nấm sợi nào khác ngồi giống nấm này cĩ hệ bào tử đính - 20 -
Đồ án tốt nghiệp tương tự (Nguyễn Đức Lượng, 2006). Hình 1.8. Hệ bào tử đính của giống nấm sợi Aspergillus A- Túi; B- Bộ cuống đính bào tử đầu tiên; C- Bộ cuống đính bào tử thứ hai; D- Bào tử đính; E- Sợi cuống; F- Tế bào gốc (Nguyễn Đức Lượng, 2006) Một đại diện là nhĩm Aspergillus niger khi nuơi cấy trên mơi trường thạch PDA ở 250C cho khuẩn lạc ban đầu màu trắng, sau nhanh chĩng chuyển sang màu đen với việc tạo vơ số bào tử đính, mặt trái khuẩn lạc màu hơi vàng nhạt và khi trưởng thành cĩ thể tạo đường rãnh phĩng xạ trên bề mặt thạch. Aspergillus niger cĩ bào tử đính trưởng thành hình cầu, phần lớn cĩ kích thước 4,0 - 5,0µm, màu nâu, hơi đen và cĩ gai. Túi và sợi cuống thường cĩ màu nâu bĩng (Bùi Xuân Đồng, 1984; Nguyễn Đức Lượng, 2006). 1.3.3. Đặc điểm sinh lý, hĩa sinh Nấm Aspergillus cĩ mặt khắp nơi trong tự nhiên, rất nhiều trong các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chúng phân bố rộng rãi và dễ thích nghi vì chúng cĩ thể hình thành khuẩn lạc trên nhiều nguồn cơ chất khác nhau. Nghiên cứu của Andrea Astoreca và cộng sự cho thấy nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của Aspergillus niger, Aspergillus awamori khoảng 25 - 300C. Wainwright và cộng sự đã chỉ ra rằng, pH thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm Aspergillus awamori là khoảng 5,0 – 7,0. Độ pH quá acid (khoảng 2 – 3) sẽ ngăn cản sự tạo thành bào tử, dẫn đến hệ sợi bị phân tán khi nuơi cấy chìm (Bùi Xuân Đồng, 1982). Đã cĩ nhiều nghiên cứu tìm hiểu về enzyme của nấm Aspergillus niger, gồm amylase, amyloglucosidase, cellulase, lactase, invertase, pectinase Ngồi ra - 21 -
Đồ án tốt nghiệp chitinase của nấm này cũng được đề cập đến trong Hội nghị Quốc tế về Aspergillus tại Nertheland vào tháng 3 năm 2010. Theo Takashi và cộng sự (2002), nhiệt độ thích hợp để Aspergillus sp. tổng hợp chitinase cĩ hoạt tính cao nhất là 370C. “Nguồn: The 7th International Aspergillus Meeting (2010)”. Vấn đề độc tố của Aspergillus niger cũng được đề cập đến, phần lớn chúng khơng cĩ hại, khơng tạo mycotoxin, nhưng một số cĩ thể tạo độc tố gây hại đến động vật và con người. Sự an tồn của Aspergillus niger được đề cập đến trong nhiều bài báo của các tác giả Schuster và cộng sự (2002), Van Dijck và cộng sự (2003), Blumenthal (2004), Olemsp.ka - Beer và cộng sự (2006), theo thơng tin tĩm tắt từ những bài báo của các tác giả này, khoảng 3 – 10% các chủng Aspergillus niger cĩ khả năng sinh ra độc tố ochratoxin A trong những điều kiện nuơi cấy xác định (Zofia Olempska - Beer, 2008). 1.3.4. Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Aspergillus trên thế giới và ở Việt Nam Các lồi nấm thuộc chi Aspergillus phân bố rộng rãi trên các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nơng cơng nghiệp, ở nhiều vùng địa lý trên thế giới, được nghiên cứu và ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau. Đặc biệt lồi Aspergillus oryzae đã được dùng rộng rãi trong cơng nghệ lên men truyền thống để chế biến thực phẩm ở nhiều nước Châu Á như Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản Hiện nay, cơng nghệ sinh học sử dụng một số lồi thuộc chi Aspergillus chủ yếu là các lồi Aspergillus niger, Aspergillus oryzae trong cơng nghiệp sản xuất enzyme (α-amylase, pectinase, protease, cellulase), trong cơng nghệ chế biến thực phẩm, trong cơng nghệ sản xuất một số acid hữu cơ như acid citric, acid gluconic Một số lồi cĩ khả năng tạo ra các chất kháng sinh như Aspergillus candidus tạo thành candidulin, Aspergillus oryzae, Aspergillus tamatti tạo thành acid kojic cĩ tác dụng ức chế đối với một số vi khuẩn. Trong đĩ đã thực sự được dùng trong cơng nghiệp dược phẩm chỉ cĩ lồi Aspergillus fumigatus để sản xuất - 22 -
Đồ án tốt nghiệp fumagilin làm thuốc chữa lị amip. Đặc biệt đáng chú ý là các lồi tạo thành các độc tố gây ung thư gan như các lồi Aspergillus flavus, Aspergillus paraticus tạo thành aflatoxin, Aspergillus versicolor tạo thành sterigmatocystin. Ở Việt Nam, nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc các lồi Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae cĩ hoạt tính α-amylase và glucoamylase cao để thủy phân tinh bột sắn (N.B.Ngà và N.L.Dũng, 1984); Nghiên cứu thu nhận và sử dụng enzyme protease từ Aspergillus oryzae trong sản xuất nước chấm (Q.V.Thịnh, 1977), để khử lơng da súc vật (L.V.Nhương và Cs., 1977); nghiên cứu sử dụng sinh khối một số chủng thuộc lồi Aspergillus niger để nâng cao chất lượng thức ăn chăn nuơi (N.L.Dũng và Cs, 1984); nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp acid citric của một số chủng thuộc lồi Aspergillus niger (N.T.Hương và N.L.Dũng, 1984); nghiên cứu hoạt tính phân giải phosphate khĩ tan và cellulose của Aspergillus japonicus (P.V.Ty và Đ.T.Lương, 1998); nghiên cứu hệ vi nấm đối kháng với các vi khuẩn kháng kháng sinh ở Việt Nam, trong đĩ cĩ 14 lồi thuộc chi Aspergillus cĩ hoạt tính này (Bùi Xuân Đồng và Cs, 1978) (Trích dẫn bởi Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn, 2000). 1.4. Bệnh do nấm Rhizoctonia spp. gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas, 2005) Ở Việt Nam cĩ nhiều bệnh do nấm Rhizoctonia gây ra. Một số lồi phát triển, xâm nhiễm, gây bệnh trên thân cây và bề mặt lá trong điều kiện thời tiết ấm, mưa hoặc ẩm độ cao. Nấm Rhizoctonia thường gây bệnh ở rễ, phần thân sát mặt đất ở cây non và trên bắp, thân và lá ở cây trưởng thành. Một số triệu chứng thường gặp do Rhizoctonia gây ra bao gồm: thối rễ, lở cổ rễ cây non, teo thắt thân, khơ vằn và thối nhũn. Vết bệnh ở cây con thường cĩ màu nâu, thối nhũn và teo thắt lại ở phần thân sát mặt đất và dẫn tới hiện tượng cây bị đổ rạp trên mặt đất được gọi là lở cổ rễ cây con. Trên những cây già hơn vết bệnh hĩa gỗ rắn chắc và thắt lại tại phần thân tiếp giáp với mặt đất gọi là hiện tượng teo thắt thân. Trên lúa và ngơ những vết chết loang lổ như hình vân mây trên phiến lá và - 23 -
Đồ án tốt nghiệp bẹ lá được gọi là bệnh khơ vằn. Bệnh thường xuất hiện khi cây đã lớn và đang đĩng bắp. Nấm này cịn gây bệnh trên cây cải bắp và xà lách gọi là bệnh thối ướt, vết bệnh lúc đầu là vết lá chết màu nâu vàng ở các lá ngồi, sau đĩ vết bệnh lan rất nhanh và gây thối tồn bắp. Nấm Rhizoctonia solani là một nấm cĩ thể kí sinh trên rất nhiều loại cây trồng. Nấm phát triển rất nhanh, hạch nấm và sợi nấm cĩ thể tồn tại trên các mơ cây sống hoặc tồn tại trong tàn dư cây trồng và trong đất trong thời gian dài vì chúng chứa một lượng lớn chất dự trữ. Sự xâm nhiễm của đất bắt đầu từ hạch nấm, nguồn hạch nấm cĩ thể từ đất, rễ, tàn dư cây trồng, hạt hay củ giống bị bệnh. Hạch nấm khi nảy nầm cĩ thể tạo thành sợi nấm, sợi nấm tiếp xúc với mơ cây, xâm nhiễm trực tiếp xuyên vào trong tế bào cây. Trong một số trường hợp, sợi nấm xâm nhiễm qua mơ chết hay qua các vết thương cơ giới trên cây. Quá trình xâm nhiễm làm cản trở quá trình hút nước và trao đổi chất dinh dưỡng, kết quả làm cho mơ cây bệnh chuyển màu nâu hoặc thối và cây bị đổ rạp xuống. Bên cạnh đĩ, nấm Rhizoctonia solani cịn sản sinh enzyme cellulilitic và pectinolitic và độc tố thực vật. Độc tố này giết chết mơ chủ, khi mơ chủ bị chết và bị phân hủy giải phĩng chất hữu cơ làm trăng sự sinh trưởng tiếp tục của nấm. Kết quả làm cho mơ cây bệnh chuyển màu nâu hoặc thối và cây bị đổ rạp xuống. Rhizoctonia cĩ thể gây hại trên cay rau màu quanh năm, nhưng phổ biến nhất là trong vụ Xuân. Tại Việt Nam, nấm thường xuất hiện trên bắp cải, ngơ và các loại cây rau màu. Thời tiết nĩng ẩm rất thích hợp cho nấm phát triển, triệu chứng bệnh cĩ thể xuất hiện từ 3 – 7 ngày sau khi diễn ra quá trình xâm nhiễm. - 24 -
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.9. Biểu hiện bệnh do Rhizoctonia gây ra: (a) triệu chứng nhọn như đầu mác ở rễ bệnh, (b) bệnh khơ vằn trên lúa, (c) hạch nấm trên bắp cải bị bệnh, (d) bệnh trên vỏ ngơ (Burgess LW và cộng sự, 2008) 1.5. Bệnh do nấm Fusarium spp. gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas, 2005) Nấm Fusarium là một trong những lồi nấm gây thiệt hại về kinh tế quan trọng nhất. Fusarium gồm nhiều lồi khác nhau cĩ khả năng gây bệnh trên nhiều cây trồng khác nhau. Nhiều lồi sản sinh ra độc tố cĩ độc tính cao, cĩ ảnh hưởng đến động vật hoang dã, thú nuơi và con người. Tuy nhiên cĩ nhiều lồi nấm Fusarium là nấm hoại sinh phổ biến trong đất. Nấm này phân bố khắp các nơi trên thế giới, một vài lồi cĩ xu hướng xuất hiện khắp nơi trong khi một số lồi chủ yếu xuất hiện ở nhiệt đới, bán nhiệt đới, ơn đới . Nấm Fusarium sp. tấn cơng chủ yếu vào bộ rễ. Đặc biệt, bệnh gây hại nặng nề trong diều kiện stress nước, dùng phân bĩn quá nhiều hay rễ cây bị tổn thương. - 25 -
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.10. Héo Fusarium trên cây chuối do F. oxysporum f. cubense sp.: (a) các triệu chứng héo trầm trọng, (b) triệu trứng nứt thân, (c) hĩa nâu mạch dẫn. Héo Fusarium trên cẩm chướng do F.oxysporum f. callistephi sp.: (d) héo trầm trọng gây chết cây, (e) thân héo với nhiều khối bào tử phân sinh màu trắng trên bề mặt. (Burgess LW và cộng sự, 2008) Bệnh héo vàng là một trong những bệnh nguy hiểm gây thiệt hại cho cây trồng ở nước ta, bệnh phổ biến ở hầu hết các vùng trồng cây khoai tây, cà chua, đậu đỗ. Hầu hết các lồi gây héo nằm trong nhĩm Fusarium oxysporum complex. Nhĩm Fusarium oxysporum complex cĩ rất nhiều dạng chuyên hĩa khác nhau, mỗi nhĩm gây hại trên một nhĩm kí chủ nhất định. Bệnh gây hại ở vị trí gốc thân, cổ rễ của cây khoai tây và cà chua. Ở gốc cây, vết bệnh màu nâu hoặc xám nhạt bao quanh gốc, gây hiện tượng thối khơ tĩp lại, cắt ngang phần thân cây bệnh thấy cĩ đường bĩ mạch trịn quanh thân màu nâu xám. Triệu chứng ban đầu là cĩ một vài lá khơ héo vàng loang lổ và rụng xuống, sau đĩ tồn bộ lá héo rũ vàng dẫn đến chết cây. Lúc đầu trên ruộng chỉ cĩ một vài cây héo vàng, nếu bị nặng cĩ thể cả ruộng bị héo vàng và chết. - 26 -
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.11. Biểu hiện bệnh héo vàng do nấm Fusarium spp. gây ra trên cây cà chua (Steve Bost, 2013) Các yếu tố khách quan làm tăng sự phát triển của nấm Fusarium sp. là: bĩn phân đạm quá nhiều, các yếu tố về hệ vi sinh vật trong đất, ẩm độ của đất, nhiệt độ tối ưu cho nấm Fusarium sp. Nấm phát triển và gây hại nặng trong điều kiện ấm và ẩm, khi nhiệt độ đất ở 25 - 300C và độ ẩm cao kết hợp với điều kiện cây sinh trưởng yếu thì nấm dễ dàng gây bệnh. Nấm xâm nhiễm vào cây trồng qua vết thương cơ giới trên rễ cây. Nấm gây bệnh cĩ thể tồn tại trong đất trong thời gian rất dài. Chúng lan truyền từ vùng này sang vùng khác thơng qua hạt giống, cây giống, nguồn nước tưới - 27 -
Đồ án tốt nghiệp 1.6. Bệnh do nấm Colletotrichum spp. gây ra Nhiều nhà nghiên cứu bệnh cây thường dùng từ “thán thư” để chỉ các bệnh do Colletotrichum gây ra. Triệu chứng của bệnh là việc hình thành các vết đốm hoại tử màu đậm, lõm xuống, vết bệnh thường cĩ vịng trịn. Nấm Colletotrichum spp. cĩ khả năng tấn cơng lên hầu hết những cây trồng vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, là nguyên nhân gây ra thiệt hại to lớn đối với sự tạo trái hoặc quả của cây trồng do sự ra hoa của cây giảm khi nấm tấn cơng lên lá, chồi, hoa, trái của nhiều loại cây: ca cao, tiêu, cà phê, cà chua,thanh long, chuối, xồi, táo, nho, đu đủ, dâu tây và một số loại cây trồng khác (Holliday, 1980; Agrios, 2005). Bên cạnh đĩ, bệnh này khơng chỉ gây hại ngồi đồng mà cịn gây hại trên quả sau khi thu hoạch (Hadden và Black, 1989). A B C D E Hình 1.12. Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra trên các loại trái cây nhiệt đới: A. Cam; B. Ổi; C. Xồi; D.Đu đủ; E. Mận (Phoulivong S, 2012) - 28 -
Đồ án tốt nghiệp Nấm Colletotrichum coffeanum gây bệnh trên cây cà phê làm trái cịn non bị hư hỏng, hạt cà phê hư hỏng từ 20 – 80%. Khi bệnh mới xuất hiện trên lá, cành, thân làm rụng lá, cành trơ trụi khơ đen. Bệnh thường phát sinh gây hại từ giai đoạn cà phê ra hoa đến khi quả già, nhất là trong thời tiết ẩm thấp, mưa nhiều. Bệnh thán thư trên cây tiêu do nấm Colletotrichum gloeosporiodies. Bệnh thường gây hại ở đầu mép lá tiêu, làm lá bị cháy, trường hợp nhiễm nặng lá sẽ bị rụng, cĩ thể gây hại thân, nhánh cây tiêu làm tháo đốt, khơ cành. Bệnh xuất hiện quanh năm nhưng thường phát triển vào mùa mưa. Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum lagenarium là bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất ớt trên tồn cầu (Kim, 2007). Bệnh tấn cơng lên lá, thân và quả làm giảm năng suất. Hình 1.13. Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum acutatum gây ra trên trái ớt và lá ớt (Jaw-Fen Wang, 2010) Năm 2009, Masanto Masyahit được xem là người đầu tiên ở Malaysia báo cáo bệnh thán thư trên thanh long do tác nhân chính là Colletotrichum gloeosporioides. Theo kết luận của báo cáo thì bệnh chịu tác động của yếu tố điều kiện mơi trường và kỹ thuật canh tác hơn là những yếu tố khí hậu. - 29 -
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.14. Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra trên trái thanh long và cành thanh long (Masanto Masyahit, 2009). - 30 -
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu − Thời gian: tháng 4/2014 đến tháng 7/2014 − Địa điểm: phịng thí nghiệm vi sinh khoa Cơng nghệ sinh học, Thực phẩm và Mơi trường thuộc trường Đại học Cơng nghệ Tp.HCM 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguồn mẫu phân lập Nấm Linh chi bị bệnh được thu nhận tại các cơ sở trồng nấm. Bảng 2.1. Nguồn nấm Linh chi bị bệnh Đợt Ngày thu Nơi thu Số lượng (tai nấm) 1 15/4/2014 Bình Dương 20 2 25/4/2014 Bình Dương 20 3 5/5/2014 Bình Dương 20 2.2.2. Nguồn nấm bệnh ❖ Trung tâm kiểm dịch thực vật thuộc Chi cục bảo vệ thực vật Tp.HCM cung cấp: – Fusarium sp. gây bệnh héo thân cây bắp. – Rhizoctonia sp. gây bệnh thối lở cổ rễ cây bắp. – Colletotrichum sp1. gây bệnh thán thư trên gấc. ❖ Nhĩm sinh viên thực hiện đề tài bảo vệ thực vật phân lập: − Colletotrichum sp2. gây bệnh thán thư trên ớt. ❖ Sinh viên tự phân lập: − Colletotrichum sp3. gây bệnh thán thư trên thanh long. 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị 2.2.3.1. Dụng cụ – Ống nghiệm – Đĩa petri – Que cấy – Đũa thủy tinh - 31 -
Đồ án tốt nghiệp – Khoan thạch hình trụ – Cốc thủy tinh – Ống đong – Đèn cồn 2.2.3.2. Thiết bị − Tủ cấy − Máy hấp Autoclave − Tủ lạnh − Máy đĩ pH − Kính hiển vi − Cân phân tích − Máy cất nước − Bếp từ 2.2.4. Hĩa chất − D-Glucose − CMC − Chitin huyền phù − Casein − NaNO3 − K2HPO4 − MgSO4 − MgSO4.7H2O − NH4NO3 − MnSO4 − ZnSO4 − KCl − FeSO4 − Agar − Đệm phosphate pH = 6,3 - 32 -
Đồ án tốt nghiệp − Nước cất − Cồn 700, 960 2.2.5. Các loại mơi trường – Mơi trường phân lập: Mơi trường½ Potato D-Glucose Agar (½ PGA) ❖ Mơi trường nuơi cấy: Mơi trường Potato D-Glucose Agar (PGA) ❖ Mơi trường khảo sát hoạt tính sinh enzyme ngoại bào: Mơi trường Minimal Synthetic Medium (MSM) 2.3. Nội dung nghiên cứu − Phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi và định danh đến lồi các chủng nấm phân lập được. − Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase ) của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh. − Khảo sát khả năng đối kháng của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh cĩ tiềm năng với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro - 33 -
Đồ án tốt nghiệp 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1.Phương pháp phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi (Agrios, 2005) ❖ Các bước thu mẫu Chọn các mẫu mới bị bệnh để phân lập. Mẫu được đựng trong các túi nilon đã hấp khử trùng. Mỗi mẫu bệnh được cho vào từng túi riêng, ghi nhãn nơi lấy, ngày lấy. Mẫu lấy về, phân lập sớm nhất trong thời gian cĩ thể hoặc bảo quản trong tủ mát để tránh bị các loại nấm và vi khuẩn hoại sinh lây nhiễm, phát triển và lan nhanh. ❖ Các bước phân lập, cấy truyền và làm thuần mẫu nấm bệnh Khử trùng mẫu cấy: Rửa mẫu bệnh bằng nước để loại bỏ bụi bẩn. Dùng dao mổ đã khử trùng cắt những mẫu cấy nhỏ từ phần ranh giới giữa mơ khơng cĩ dấu hiệu bệnh và mơ mới bị bệnh. Khử trùng mẫu bệnh bằng cách nhúng nhanh vào cồn 700 trong 30 giây, rửa lại nhiều lần trong nước vơ trùng và để khơ trên giấy thấm vơ trùng. Dùng kẹp đã khử trùng gấp giữ và ấn nhẹ những mẫu cấy lên mặt thạch gần mép đĩa mơi trường phân lập ½ PGA. Đặt ngược đĩa cấy để tránh đọng hơi nước trên bề mặt mơi trường ở nhiệt độ phịng. Kiểm tra đĩa cấy hàng ngày, khi các tản nấm phát triển từ những mẫu cấy, dùng que cấy đã khử trùng cấy truyền bằng cách cấy đỉnh đầu sợi nấm sang đĩa mơi trường PGA để tách rời các chủng nấm. Tiến hành làm thuần các mẫu nấm qua nhiều lần cấy truyền. Các thao tác đều được tiến hành trong tủ cấy vi sinh dưới ngọn lửa đèn cồn. ❖ Tần suất xuất hiện (%) của chủng nấm phân lập được tính theo cơng thức: Tần suất bắt gặp = A/B x 100 Trong đĩ: A là số lần xuất hiện của chủng nấm. B là tổng số mẫu phân lập. - 34 -
Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005) ❖ Quan sát đại thể nấm sợi Quan sát hình thái đại thể các chủng nấm bằng việc mơ tả đặc điểm tản nấm của chúng khi nuơi cấy trên mơi trường dinh dưỡng. Các chủng nấm phân lập được sẽ được cấy điểm trên tâm đĩa mơi trường PGA và được ủ 1 tuần. Quan sát mơ tả các đặc điểm: Kích thước tản nấm để biết tốc độ phát triển; Dạng sợi nấm, màu sắc tản nấm mặt trước và mặt sau; Màu sắc của mơi trường do sắc tố nấm sợi tạo ra; thời gian hình thành bào tử trong thời gian nuơi ủ. ❖ Quan sát hình thái vi thể nấm sợi dưới kính hiển vi Quan sát hình thái vi thể các chủng nấm phân lập được bằng phương pháp tiêu bản phịng ẩm. Chuẩn bị một đĩa mơi trường PGA và một đĩa petri vơ trùng nuơi cấy chứa: mảnh giấy lọc, hai thanh đũa tre đặt trên giấy lọc, lame và lamelle đặt lên trên hai thanh đũa tre. Sử dụng dao mổ vơ trùng cắt một khối thạch (1 cm2) từ đĩa mơi trường PGA chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuơi cấy. Dùng dây cấy đã khử trùng, lấy sinh khối nấm thí nghiệm cấy vào 4 mặt bên của khối thạch.Sau đĩ đậy lamelle lên trên khối thạch. Nhỏ nước cất vơ trùng cho ướt tồn bộ giấy thấm trong đĩa. Ủ đĩa ở nhiệt độ phịng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử xảy ra (thường là 4 – 5 ngày). Mẫu quan sát được chuẩn bị bằng cách lấy lamelle ra khỏi khối thạch đặt lên một lame sạch cĩ sẵn một giọt Methylene blue. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở độ phĩng đại 400 lần và mơ tả đặc điểm: Sợi nấm cĩ hay khơng cĩ sự phân nhánh và vách ngăn; Hình dạng cuống bào tử; Đặc điểm hình dạng. màu sắc, kích thước bào tử - 35 -
Đồ án tốt nghiệp 2.4.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo kiểm chứng tác nhân gây bệnh (Agrios, 2005) Nguyên tắc: Để thực hiện quá trình lây bệnh nhân tạo, các tai nấm khỏe được trồng trong các điều kiện cĩ kiểm sốt và được cấy vi sinh vật nghi là gây bệnh. Khi chọn lựa những tai nấm khỏe mạnh để lây bệnh nhân tạo, nên lưu ý dùng cùng một giống với nấm bị bệnh mà từ đĩ tác nhân gây bệnh được phân lập. Bệnh cĩ thể được tái tạo bằng cách cấy tác nhân gây bệnh theo cơ chế xâm nhiễm của tác nhân đĩ. Chọn phương pháp nào là tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh được thí nghiệm. Luơn luơn bố trí cơng thức đối chứng (bao gồm các cây khơng được lây bệnh). Tiến hành: ❖ Lây bệnh nhân tạo Sử dụng các mẫu nấm thuần mới phân lập được để chuẩn bị nguồn lây bệnh. Lây bệnh lên các nấm Linh chi bằng cách phun trực tiếp dịch bào tử của chúng lên tai nấm khỏe, khơng cĩ dấu hiệu bệnh. Chuẩn bị dịch bào tử lây bệnh: Một cách đơn giản là cạo các bào tử và sợi nấm ra khỏi đĩa cấy được nuơi ủ 1 tuần ở nhiệt độ phịng và cho bình tam giác cĩ chứa nước cất vơ trùng, chú ý để nút bình vẫn trong điều kiện vơ trùng, thao tác này được thực hiện trong tủ cấy vi sinh dưới ngọn lữa đèn cồn. Lắc bình tam giác sau khi cấy để đảm bảo nguồn bệnh được phân bố đều trong dịch. Bố trí lây bệnh tương ứng với mỗi chủng nấm là 10 tai nấm Linh chi thí nghiệm phun dịch bào tử và 10 tai nấm Linh chi dùng làm đối chứng phun nước vơ trùng. Đặt các tai nấm thí nghiệm và đối chứng trong cùng điều kiện nhiệt độ phịng với điều kiện sáng và tối xen kẽ để hồn thành quá trình lây bệnh. Kiểm tra và so sánh những tai nấm được lây bệnh với những tai nấm đối chứng. Quan sát và ghi nhận các triệu chứng và so sánh các triệu chứng biểu hiện khi lây bệnh nhân tạo với các triệu chứng bệnh ban đầu. - 36 -
Đồ án tốt nghiệp ❖ Tỷ lệ xuất hiện bệnh (%) sau khi lây bệnh nhân tạo tính theo cơng thức: Tần lệ xuất hiện = A/B x 100 Trong đĩ: A là số mẫu bị nhiễm bệnh. B là tổng số mẫu lây nhiễm. ❖ Kiểm chứng tác nhân gây bệnh Các tai nấm thí nghiệm sau khi lây bệnh cĩ biểu hiện bệnh giống tương tự như quan sát lúc ban đầu trước khi phân lập được phân lập lại nhằm khẳng định tác nhân gây bệnh. Phân lập lại từ các tai nấm mới bị bệnh. Tiến hành quan sát kiểm tra và đối chiếu hình thái đại thể và vi thể của chúng .Mẫu nấm phân lập lại cĩ đặc điểm hình thái phải giống như mẫu nấm được làm thuần ban đầu. 2.4.4. Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh (Tơ Duy Khương, 2007) Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự phân giải cơ chất chitin và cellulose bởi enzyme chitinase và cellulase. Cơ chất bị phân giải tạo ra các đường khử. Các đường này khơng cho phản ứng màu với lugol. Vì vậy cĩ thể khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase và cellulase của các chủng nấm khi nuơi cấy chúng trên mơi trường cĩ nguồn cơ chất cacbon duy nhất lần lượt là CMC và huyền phù chitin. Khả năng sinh enzyme chitinase và cellulase của các chủng nấm được đánh giá tỷ lệ thuận với đường kính vịng phân giải chitin và cellulose sau khi nhuộm màu với thuốc thử lugol. Tiến hành: Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm: Cấy điểm các chủng nấm thí nghiệm lên mơi trường PGA và ủ tại nhiệt độ phịng trong thời gian 7 ngày. Dùng khoan thạch hình trụ đục một miếng thạch (từ đĩa mơi trường PGA đã nuơi cấy nấm thí nghiệm) đặt lên tâm đĩa mơi trường cảm ứng MSM cĩ chứa 1% cơ chất (CMC, huyền phù chitin) và ủ trong thời gian 2 ngày. - 37 -
Đồ án tốt nghiệp Sau 2 ngày, nhuộm màu mơi trường bằng cách đổ dung dịch lugol vào đĩa thí nghiệm để yên 5 phút và tiến hành đo đường kính vịng phân giải. Các thí nghiệm được lặp lại 6 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri. 2.4.5. Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đối với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro (Laila Naher và cộng sự, 2012) Nguyên tắc: Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Trichoderma với các nấm bệnh khi nuơi cấy đồng thời trên mơi trường thạch đĩa PGA. Tiến hành: ❖ Chuẩn bị nguồn nấm Đĩa nấm Trichoderma gốc: Cấy điểm các chủng Trichoderma cần khảo sát vào giữa đĩa thạch PGA ủ ở nhiệt độ phịng (7 ngày) làm nguồn đối kháng nấm bệnh. Đĩa nấm bệnh gốc: Cấy điểm các chủng nấm bệnh cần khảo sát vào giữa đĩa thạch PGA ủ ở nhiệt độ phịng (7 ngày) làm nguồn thử khả năng bị ức chế bởi nấm Trichoderma. ❖ Thí nghiệm đối kháng trực tiếp Đĩa đối kháng: Dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch cĩ chứa nấm bệnh từ đĩa nuơi cấy nấm bệnh gốc, đặt khoanh thạch cách mép đĩa mơi trường PGA là 1cm. Sau 2 ngày cấy nấm bệnh, tiến hành tương tự khoan lấy 1 khoanh thạch cĩ chứa nấm Trichoderma trên đĩa Trichoderma gốc, đặt vào đĩa cĩ chứa nấm bệnh, cách mép đĩa petri 1cm nhưng ở phía đối xứng với nấm bệnh qua tâm đĩa thạch. Đĩa đối chứng: khoanh thạch nấm bệnh, đường kính 5mm đặt tương tự trên đĩa mơi trường PGA cách mép đĩa petri 1cm và khơng cấy nấm Trichoderma sp. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 3 đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phịng. Quan sát ghi nhận kết quả sau 3, 5 và 7 ngày nuơi cấy. Chỉ tiêu theo dõi − Hiệu quả ức chế (% )sự phát triển nấm bệnh - 38 -
Đồ án tốt nghiệp − Sự phát triển của nấm Trichoderma đối kháng lại nấm bệnh. ❖ Tính tốn số liệu Phần trăm ức chế nấm bệnh được tính theo cơng thức: PIMG = (R1 – R2)/ R1 . 100 (%) Chú thích: R1: đường kính tản nấm bệnh phát triển trong đĩa đối chứng khi khơng cĩ cấy Trichoderma (mm). R2: đường kính tản nấm bệnh phát triển trong đĩa đối kháng khi cĩ cấy Trichoderma (mm). R2 R1 T Đĩa đối chứng Đĩa đối kháng Hình 2.1. Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp: R1: tản nấm bệnh trên đĩa đối chứng; R2: tản nấm bệnh trên đĩa đối kháng cấy chung với nấm Trichoderma; T: tản nấm Trichoderma trên đĩa đối kháng. 2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu thí nghiệm Số liệu của các thí nghiệm được lấy giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD và xử lý số liệu bằng phần mềm Excel và Statgraphics. - 39 -
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi 3.1.1. Kết quả phân lập nấm kí sinh trên nấm Linh chi Từ mẫu nấm Linh chi bị bệnh thu ở các sơ sở sản xuất, sinh viên đã phân lập và thu được 4 chủng nấm cĩ đặc điểm hình thái khác nhau được kí hiệu lần lượt là T1, T2, A1 và A2 với tần suất xuất hiện được trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1. Tần suất xuất hiện các chủng nấm phân lập được trên nấm Linh chi bệnh Tần suất xuất hiện qua 3 đợt phân lập (%) Chủng nấm Trung bình 1 2 3 T2 80 65 75 73,33 T1 55 70 60 61,67 A1 55 50 55 53,33 A2 10 20 0 10 Kết quả trình bày ở bảng 3.1 cho thấy chủng nấm T2 cĩ tần suất xuất hiện cao nhất là 73,33%, chủng nấm T1 với tần suất xuất hiện đứng thứ hai là 61,67%, đứng thứ ba với tần suất xuất hiện 53,33% là chủng nấm A1 và cuối cùng là chủng nấm A2 với tần suất xuất hiện chỉ cĩ 10%. Ba chủng nấm T1, T2 và A1 với tần suất xuất hiện trên 50% và đều xuất hiện trong cả 3 đợt phân lập nên chọn để tiếp tục nghiên cứu. Chủng A2 khơng được chọn để tiếp tục nghiên cứu vì với tần suất xuất hiện 10% là rất nhỏ và chỉ xuất hiện hai trên ba đợt phân lập nên chủng nấm này cĩ thể chỉ là nấm hoại sinh nhiễm tạp vào các mẫu bệnh cũ. - 40 -
Đồ án tốt nghiệp 3.1.2. Đặc điểm hình thái của 3 chủng nấm T1, T2, A1 3.1.2.1. Đặc điểm hình thái chủng nấm T1 ❖ Đại thể: Sợi tơ nấm mảnh, mọc sát mặt thạch, lúc đầu màu trắng nhạt sau chuyển sang xanh, hướng tia ra ngồi mép đĩa. Tản nấm mọc thành những vịng trịn đồng tâm, đường kính sau 5 ngày nuơi cấy đạt 90 mm (hình 3.1). Mặt trước Mặt sau 3 ngày sau cấy 5 ngày sau cấy 7 ngày sau cấy Hình 3.1. Hình thái đại thể chủng nấm T1 nuơi cấy trên mơi trường PGA ❖ Vi thể: Sợi nấm cĩ vách ngăn. Cánh bào tử phân nhánh nhiều. Bào tử đính cĩ hình cầu méo đến hình oval, màu xanh lục, vách trơn láng (hình 3.2). A B C Hình 3.2. Hình thái vi thể chủng nấm T1 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X: (A) Sợi nấm, (B) Cành bào tử, (C) Bào tử. - 41 -
Đồ án tốt nghiệp 3.1.2.2. Đặc điểm hình thái chủng nấm T2 ❖ Đại thể:. Sợi tơ nấm dạng bơng, màu trắng, đan xen nhau dày đặc hướng dạng tia từ tâm đến ra ngồi mép đĩa. Bào tử màu xanh xuất hiện đan xen trong lớp tơ dày vào ngày thứ 5. Đường kính tản nấm sau 3 ngày đạt 90 mm (hình 3.3). Mặt trước Mặt sau 3 ngày sau cấy 5 ngày sau cấy 7 ngày sau cấy Hình 3.3. Hình thái đại thể chủng nấm T2 nuơi cấy trên mơi trường PGA ❖ Vi thể: Sợi nấm cĩ vách ngăn. Cành bào tử phân nhánh nhiều. Bào tử đính cĩ hình cầu, màu xanh, vách trơn láng (hình 3.4). A B C Hình 3.4. Hình thái vi thể chủng nấm T2 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X: (A) Sợi nấm, (B) Cành bào tử, (C) Bào tử. - 42 -
Đồ án tốt nghiệp 3.1.2.3. Đặc điểm hình thái chủng nấm A1 ❖ Đại thể: Sợi tơ nấm mảnh, lúc đầu màu trắng vàng nhạt nhanh chĩng tạo bào tử chuyển sang màu đen. Mặt trái tản nấm cĩ màu vàng nhạt. Tản nấm sau 3 ngày nuơi cấy đạt 45 mm (hình 3.5). Mặt trước Mặt sau 3 ngày sau cấy 5 ngày sau cấy 7 ngày sau cấy Hình 3.5. Hình thái đại thể chủng nấm A1 nuơi cấy trên mơi trường PGA ❖ Vi thể: Cuống sinh túi bào tử. Bào tử đính hình cầu, khơng cĩ vách ngăn, màu nâu nhạt. A B C Hình 3.6. Hình thái vi thể chủng nấm A1 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X: (A) Cuống sinh bào tử, (B) Túi bào tử, (C) Bào tử. - 43 -
Đồ án tốt nghiệp Dựa trên mơ tả đặc điểm hình thái chi nấm Trichoderma của Gary J. Samuels (2004), so sánh đối chiếu với đặc điểm hình thái của 2 chủng nấm T1 và T2 cĩ thể nhận định sơ bộ 2 chủng nấm T1 và T2 thuộc chi Trichoderma. Tương tự, từ các đặc điểm hình thái của chủng nấm A1 cho thấy nấm cĩ những đặc điểm đặc trưng của chi Aspergillus như Nguyễn Đức Lượng và cộng sự (2006) mơ tả, cĩ thể nhận định sơ bộ chủng nấm A1 thuộc chi Aspergillus. 3.1.3. Kết quả định danh đến lồi của 3 chủng nấm T1, T2 và A1 Định danh 3 chủng nấm T1, T2 và A1 xác định chính xác đến lồi bằng phương pháp giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH. Quá trình giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH được thực hiện tại cơng ty Nam Khoa Biotek. Kết quả định danh được trình bày như sau: ❖ Giải trình tự gen 28S rRNA của chủng nấm T1 và thực hiện BLAST SEARCH từ Ngân hàng gen trên NCBI cho thấy chuỗi rRNA này tương đồng với nấm Trichoderma virens đến 98% (hình 3.7). Hình 3.7. Kết quả giải trình tự 28S rRNA vả tra cứu trên BLAST SEARCH của chủng nấm T1 - 44 -
Đồ án tốt nghiệp ❖ Giải trình tự gen 28S rRNA của chủng nấm T2 và thực hiện BLAST SEARCH từ Ngân hàng gen trên NCBI cho thấy chuỗi rRNA này tương đồng với nấm Trichoderma harzianum đến 99% (hình 3.8). Hình 3.8. Kết quả giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH của chủng nấm T2 - 45 -
Đồ án tốt nghiệp ❖ Giải trình tự gen 28S rRNA của chủng nấm Á và thực hiện BLAST SEARCH từ Ngân hàng gen trên NCBI cho thấy chuỗi rRNA này tương đồng với nấm Aspergillus niger đến 100% (hình 3.9). Hình 3.9. Kết quả giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH của chủng nấm A1 Kết quả sau khi giải trình tự gen 28S rRNA và và thực hiện BLAST SEARCH từ Ngân hàng gen trên NCBI được thực hiện tại cơng ty Nam Khoa Biotek đã định danh được T1 thuộc lồi Trichoderma virens; T2 thuộc lồi Trichoderma harzianum và A1 thuộc lồi Aspergillus niger. Các mẫu nấm này được cấy lưu giữ và tiến hành kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch trong điều kiện in vitro. - 46 -
Đồ án tốt nghiệp 3.1.4. Kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch ở điều kiện in vitro Từ kết quả phân lập nêu trên các mẫu nấm được lưu giữ và sử dụng lây bệnh lại trên nấm Linh chi khỏe để khẳng định tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch. Do điều kiện thời gian và kinh phí cĩ hạn nên việc lây bệnh lại chỉ được thực hiện với 2 lồi nấm cĩ tần suất xuất hiện nhiều nhất là Trichoderma virens và Trichoderma harzianum. Kết quả sau khi lây bệnh nhân tạo được ghi nhận như sau: 3.1.4.1. Tỷ lệ xuất hiện bệnh Bảng 3.2. Tỷ lệ tai nấm Linh chi bị nhễm bệnh sau khi lây bệnh nhân tạo Tai nấm Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Nhiễm nấm Trichoderma virens 90 Nhiễm nấm Trichoderma harzianum 100 Khơng nhiễm (Đối chứng) 0 Kết quả trình bày ở bảng 3.2 cho thấy tỷ lệ tai nấm Linh chi bị nhễm bệnh sau khi lây bệnh nhân tạo với chủng T. virens là 90% và chủng T. harzianum là 100%. Trong khi đĩ, tỷ lệ nhiễm bệnh ở đối chứng là 0%. 3.1.4.2. Biểu hiện bệnh sau khi lây bệnh lại theo quy tắc Koch ❖ Đối với tai nấm nhiễm nấm T. virens: Triệu chứng nhiễm bệnh xuất hiện ở ngày thứ 15 sau nhiễm, mốc xanh mọc ở phần rìa mặt trên tai nấm và những lổ nhỏ li ti là cơ quan sinh bào tử ở mặt dưới tai nấm, cuống nấm và cả trong bịch phơi nuơi nấm. Triệu chứng này tương tự như triệu chứng nấm Linh chi bệnh lúc ban đầu (hình 3.10). ❖ Đối với tai nấm nhiễm nấm T. harzianum: Triệu chứng nhiễm bệnh xuất hiện ở ngày thứ 10 sau nhiễm, mốc xanh mọc ở phần rìa mặt trên tai nấm và dày đặc trên những lổ nhỏ li ti là cơ quan sinh bào tử ở mặt dưới tai nấm, cuống nấm và cả trong bịch phơi nuơi nấm, tương tự như triệu chứng được ghi nhận ở nấm Linh chi bệnh lúc ban đầu (hình 3.10). ❖ Đối với tai nấm khơng nhiễm (đối chứng): Khơng xuất hiện bất kì triệu chứng nhiễm bệnh nào (hình 3.10). - 47 -
Đồ án tốt nghiệp Đối chứng T. virens T. harzianum Bệnh ban đầu Mặt trên tai nấm Mặt dưới tai nấm Cuống nấm Phơi nuơi nấm Hình 3.10. Biểu hiện nhiễm bệnh trên nấm Linh chi sau 15 ngày lây bệnh nhân tạo - 48 -
Đồ án tốt nghiệp 3.1.4.3.Kết quả phân lập sau khi lây bệnh theo quy tắc Kock Tái phân lập lại tác nhân gây bệnh từ các tai nấm bị nhiễm bệnh, kết quả đặc điểm hình thái mẫu nấm phân lập lại so sánh với đặc điểm mẫu nấm được phân lập ban đầu được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái của T. virens và T. harzianum phân lập ban đầu và sau lây bệnh nhân tạo Nấm lây Đặc điểm hình thái sau 7 ngày nuơi cấy bệnh Nấm phân lập lại sau lây bệnh Nấm phân lập ban đầu Sợi tơ nấm mảnh, mọc sát mặt Sợi tơ nấm mảnh, mọc sát mặt thạch. Tản nấm mọc thành những thạch. Tản nấm mọc thành những vịng trịn đồng tâm. Cuống bào tử vịng trịn đồng tâm. Cuống bào tử phân nhánh nhiều, bào tử đính phân nhánh nhiều, bào tử đính hình T. hình oval. cầu méo và oval. virens Sợi tơ nấm dạng bơng. Tản nấm Sợi tơ nấm dạng bơng. Sợi nấm đan mọc dạng tia từ tâm đến ra ngồi xen nhau mọc dày đặc hướng dạng mép đĩa. Cuống bào tử phân nhánh tia từ tâm đến ra ngồi mép đĩa. nhiều, bào tử đính hình cầu. Cuống bào tử phân nhánh nhiều, T. bào tử đính hình cầu. harzianum - 49 -
Đồ án tốt nghiệp Kết quả trình bày ở bảng 3.3 cho thấy đặc điểm đặc trưng về hình thái tản nấm, sợi nấm, cuống sinh bào tử và bào tử của 2 chủng nấm phân lập lại được sau lây bệnh nhân tạo hồn tồn tương đồng với đặc điểm hình thái của Trichoderma virens và Trichoderma harzianum phân lập ban đầu. Như vậy, từ kết quả khảo sát đặc điểm hình thái, kết quả giải trình tự gen và kết quả kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch cho thấy nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum là tác nhân kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi. Kết quả này cũng tương đồng với kết quả trong đề tài "Nghiên cứu tiềm năng kiểm sốt sinh học của các chủng Trichoderma phân lập trên nấm Linh chi hoang dã và vỏ cây” của Mukherjee và cộng sự (2013). Theo tác giả, Trichoderma harzianum kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi ngồi tự nhiên cĩ hiệu quả đối kháng với nấm Sclerotium delphinii gây bệnh thối rễ trên cây bơng tốt hơn hẵn so với các lồi nấm phân lập trên vỏ cây. Từ lâu, đất và vùng rễ được xem như là nơi cư trú chính của Trichoderma, mặc dù sự đa dạng tối đa của lồi này cĩ cả ở trên mặt đất như trên vỏ cây và nấm hoang dã, và khả năng kiểm sốt sinh học được xem như là đặc điểm đặc trưng của chi nấm này (Druzhinina và cộng sự, 2011). Bên cạnh đĩ chỉ cĩ một vài dịng được phân lập từ đất và vùng rễ được sử dụng như thuốc trừ nấm sinh học thương mại và các nguồn nấm Trichoderma trên mặt đất phần lớn vẫn chưa được khai thác trong nơng nghiệp (Mukherjee và cộng sự, 2013). Khai thác các chủng Trichoderma kí sinh trên nấm Linh chi và vỏ cây mục là hướng khai thác mới và cĩ triển vọng vì các chủng này cĩ khả năng đối kháng cao với các lồi nấm gây bệnh (Mukherjee và cộng sự, 2013). Đây cũng là định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo của đồ án này. - 50 -
Đồ án tốt nghiệp 3.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase và chitinase) của hai lồi Trichoderma virens và Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào chitinase, cellulase của hai lồi Trichoderma virens và Trichoderma harzianum trên mơi trường cảm ứng sinh enzyme MSM cĩ bổ sung 1% cơ chất (Huyền phù chitin và CMC). Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.11: Bảng 3.4. Đường kính vịng phân giải của hai lồi nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum sau 2 ngày nuơi cấy Đường kính vịng phân giải (mm) trên cơ chất Nấm thí nghiệm Chitin CMC Trichoderma harzianum 52,3 ± 1,4 28,6 ± 0,8 Trichoderma virens 48,2 ± 1,2 22,8 ± 1,7 Ghi chú: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy, cả hai lồi nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum đều cĩ khả năng sinh enzyme chitinase và cellulase ngoại bào tạo vịng phân giải. Theo Gary J. Samuels (2004) đây là các enzyme phân giải vách tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối kháng với nấm Trichoderma. Dựa vào kích thước vịng phân giải chitin và CMC sau 2 ngày nuơi cấy cho thấy nấm Trichoderma harzianum cĩ khả năng sinh enzyme cellulase và chitinase mạnh hơn nấm Trichoderma virens và khả năng sinh enzyme chitinase ở cả hai chủng đều cao hơn khả năng sinh enzyme cellulase. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng trong phịng trừ nấm bệnh gây hại cây trồng của 2 lồi nấm này. Do đĩ, sinh viên tiếp tục sử dụng 2 lồi nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum để nghiên cứu khảo sát khả năng đối kháng với một số nấm bệnh gây hại cây trồng. - 51 -
Đồ án tốt nghiệp Vịng phân giải chitin Vịng phân giải CMC Trichoderma harzianum Trichoderma virens Hình 3.11. Vịng phân giải chitin và CMC của 2 lồi nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum sau 2 ngày nuơi cấy 3.3. Khảo sát khả năng đối kháng của 2 lồi nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi đối với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro Thí nghiệm đối kháng trực tiếp hai lồi Trichoderma virens và Trichoderma harzianum (2 lồi cĩ hoạt tính sinh enzyme chitinase mạnh) với các nấm gây bệnh trên cây trồng: Fusarium sp., Rhizoctonia sp., Colletotrichum sp1., Colletotrichum sp2. và Colletotrichum sp3. trên mơi trường PGA, kết quả được trình bày như sau: - 52 -
Đồ án tốt nghiệp 3.3.1. Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp. Bảng 3.5. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Fusarium sp. Ngày Tỷ lệ Nấm Mơ tả nấm bệnh Fusarium sp. sau đối kháng Trichoderma bị ức chế (đĩa đối kháng) cấy (%) Nấm T. virens phát triển nhanh tiếp xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn chặn 3 7,96 ± 2,84 nấm bệnh phát triển lấn sang vùng chúng đã mọc. T.virens Nấm T. virens mọc lan bao phủ một 5 42,28 ± 1,78 phần nấm bệnh Nấm T. virens mọc lan sang bao phủ 7 tồn bộ bề mặt nấm bệnh. Hệ sợi nấm 54,32 ± 1,41 bệnh co lại và yếu dần. Nấm T. harzianum phát triển nhanh tiếp xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn 3 8,96 ± 2,24 chặn nấm bệnh phát triển lấn sang vùng chúng đã mọc. Nấm T. harzianum phát triển mạnh, T. harzianum 5 42,9 ± 1,4 mọc lan bao phủ hết nấm bệnh. Nấm bệnh bị bao phủ lụi tàn. Nấm T. 7 harzianum sinh bào tử trên trên hệ sợi 54,81 ± 1,11 nấm bệnh bị lụi tàn và cĩ dấu hiệu bị tiêu diệt hồn tồn. Ghi chú: Tỷ lệ (%) đối kháng được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD - 53 -
Đồ án tốt nghiệp Fusarium sp. - Fusarium sp. - Fusarium sp. - Đối chứng T. virens T. harzianum 5 ngày sau cấy 7 ngày sau cấy Hình 3.12. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Fusarium sp. Như vậy, cả T. virens và T. harzianum đều cĩ khả năng ức chế và tiêu diệt nấm Fusarium sp. với tỷ lệ ức chế nấm Fusarium sp. của cả 2 lồi đều ở khoảng 54% sau 7 ngày đối kháng . Trong đĩ, nấm T. harzianum thể hiện hiệu quả đối kháng và tiêu diệt mạnh hơn so với nấm T. virens. Khi quan sát từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 7 cho thấy, T. virens chỉ mọc lan sang và đan bao phủ kìm hãm nấm bệnh phát triển, sợi nấm bệnh co lại và yếu dần . Trong khi đĩ, T. harzianum mọc phủ kín hệ sợi nấm Rhizoctonia sp. làm hệ sợi nấm teo lại và hình thành bào tử phủ kín trên tản nấm Rhizoctonia sp. - 54 -
Đồ án tốt nghiệp 3.3.2. Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia sp. Bảng 3.6. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Rhizoctonia sp. Ngày Tỷ lệ Nấm Mơ tả nấm bệnh Rhizoctonia sp. sau đối kháng Trichoderma bị ức chế (đĩa đối kháng) cấy (%) Nấm T. virens phát triển nhanh tiếp xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn chặn 3 13,2 ± 2,23 nấm bệnh phát triển lấn sang vùng chúng đã mọc. T. virens Nấm T. virens mọc lan sang và đan 5 50,56 ± 1,27 xen vào hệ sợi nấm bệnh. Nấm T. virens phát triển bao phủ hết 7 hệ sợi nấm bệnh. Hệ sợi nấm bệnh co 56,17 ± 1,12 lại và nằm rụi. Nấm T. harzianum phát triển nhanh tiếp xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn 3 7,58 ± 3,48 chặn khơng cho nấm gây bệnh phát triển lấn sang vùng chúng đã mọc. Nấm T. harzianum mọc lan đan xen, 5 47,25 ± 1,98 T. harzianum bao phủ hết hệ sợi nấm bệnh. Nấm T. harzianum phát triển mạnh và nấm bệnh bị lụi tàn hồn tồn. Nấm T. 7 53,33 ± 1,76 harzianum sinh bào tử dày đặc trên hệ sợi nấm bệnh bị lụi tàn và cĩ dấu hiệu bị tiêu diệt hồn tồn. Ghi chú: Tỷ lệ (%) đối kháng được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD - 55 -
Đồ án tốt nghiệp Rhizoctonia sp. - Rhizoctonia sp. - Rhizoctoni sp. - Đối chứng T. virens T. harzianum 5 Ngày sau cấy 7 Ngày sau cấy Hình 3.13. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Rhizoctonia sp. Tương tự như nấm Fusarium sp., nấm Rhizoctonia sp. cũng bị ức chế và tiêu diệt bởi cả T. virens và T. harzianum với tỷ lệ ức chế nấm Rizhoctonia sp. của T. virens ở khoảng 56% và T. harzianum ở khoảng 53% sau 7 ngày đối kháng. Tuy tỷ lệ đối kháng của T. harzianum thấp hơn so với T. virens nhưng hiệu quả đối kháng lại cho kết quả tốt hơn hẳn. Từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 7, T. virens chỉ mọc lan sang và đan xen vào hệ sợi nấm Rhizoctonia sp., kìm hãm nấm bệnh phát triển, sợi nấm bệnh yếu dần và co lại. Trong khi đĩ, T. harzianum thể hiện tính đối kháng mạnh hơn, mọc phủ kín hệ sợi nấm Rhizoctonia sp. Tiêu diệt hệ sợi nấm và hình thành bào tử phủ kín trên tản nấm Rhizoctonia sp Như vậy, nấm T. harzianum cĩ mức độ đối kháng và tiêu diệt nấm Rihzoctonia sp. mạnh hơn so với nấm T. virens. - 56 -
Đồ án tốt nghiệp 3.3.3. Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp1. Bảng 3.7. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Colletotrichum sp1. Ngày Tỷ lệ Nấm Mơ tả nấm bệnh Colletotrichum sp1. sau đối kháng Trichoderma bị ức chế (đĩa đối kháng) cấy (%) Nấm T. virens phát triển nhanh tiếp xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn chặn 3 0,50 ± 2,53 khơng cho nấm bệnh phát triển lấn sang vùng chúng đã mọc. Nấm T. virens mọc lan sang và ức T.virens 5 37 ± 1,60 chế hệ sợi nấm bệnh. Nấm T. virens bao phủ hết hệ sợi 7 nấm bệnh. Nấm T. virens phát triển 50,62 ± 1,26 trên bề mặt nấm bệnh. Nấm bệnh co lại và lụi tàn. Nấm T. harzianum phát triển nhanh tiếp xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn 3 10,95 ± 3,84 chặn nấm bệnh phát triển lấn sang vùng chúng đã mọc. 5 Nấm bệnh bị lụi tàn nơi tiếp xúc. 43,62 ± 2,43 T. harzianum Nấm T. harzianum mọc lan sang bao phủ nấm bệnh và nấm bệnh teo lại. 7 Nấm T. harzianum sinh bào tử trên hệ 55,80 ± 1,91 sợi nấm bệnh bị lụi tàn và cĩ dấu hiệu bị tiêu diệt hồn tồn. Ghi chú: Tỷ lệ (%) đối kháng được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD - 57 -
Đồ án tốt nghiệp Colletotrichum sp1.- Colletotrichum sp1.- Colletotrichum sp1.- Đối chứng T. virens T. harzianum 5 Ngày sau cấy 7 ngày sau cấy Hình 3.14. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Colletotrichum sp1. Sau 3 ngày nuơi cấy, nấm Colletotrichum sp1. và Trichoderma bắt đầu tiếp xúc nhau. Ở ngày thứ 4 và ngày thứ 5, Trichoderma phát triển mạnh chiếm hết chỗ trên mơi trường, mọc dày đặc quanh tản nấm Colletotrichum sp1. Khi tiếp xúc với Trichoderma, hệ sơi nấm Colletotrichum sp1. khơng phát triển được nữa. Từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 7, cả T. virens và T. harzianum đều mọc lan, bảo phủ phủ kín hết bề mặt nấm Colletotrichum sp1., làm hệ sợi nấm co lại và yếu dần và hình thành bào tử trên tản nấm Colletotrichum sp1. bị bao phủ. Tỷ lệ ức chế nấm Colletotrichum sp1. của T. virens ở khoảng 50% và T. harzianum thì cao hơn ở khoảng 55% sau 7 ngày đối kháng, Như vậy, cả 2 nấm T. virens và T. harzianum đều cĩ khả năng ức chế và tiêu diệt nấm Colletotrichum sp1. sau 7 ngày đối kháng. - 58 -
Đồ án tốt nghiệp 3.3.4. Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp2. Bảng 3.8. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Colletotrichum sp2. Ngày Tỷ lệ Nấm Mơ tả nấm bệnh Colletotrichum sp2. sau đối kháng Trichoderma bị ức chế (đĩa đối kháng) cấy (%) Nấm T. virens phát triển nhanh tiếp xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn chặn 3 8,57 ± 4,12 khơng cho nấm bệnh phát triển lấn sang vùng chúng đã mọc. T. virens Nấm T. virens mọc lan sang và bao 5 39,73 ± 2,72 phủ một phần hệ sợi nấm bệnh. Nấm T. virens phát triển bao phủ hết 7 hệ sợi nấm bệnh. Hệ sợi nấm bệnh teo 54,17 ± 2,07 lại và nằm rụi . Nấm T. harzianum phát triển nhanh tiếp xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn 3 18,7 ± 3,46 chặn nấm bệnh phát triển lấn sang vùng chúng đã mọc. Nấm T. harzianum mọc lan đan xen, T. harzianum 5 46,4 ± 2,28 bao phủ một phần hệ sợi nấm bệnh. Nấm T. harzianum phát triển và nấm bệnh bị bao phủ teo lại và lụi tàn. Nấm 7 59,24 ± 1,74 T. harzianum sinh bào tử trên phần hệ sợi nấm bệnh bị bao phủ. Ghi chú: Tỷ lệ (%) đối kháng được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD - 59 -
Đồ án tốt nghiệp Colletotrichum sp2.- Colletotrichum sp2.- Colletotrichum sp2.- Đối chứng T. virens T. harzianum 5 ngày sau cấy 7 ngày sau cấy Hình 3.15. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Colletotrichum sp2. Tương tự đối kháng với nấm Colletotrichum sp1.,từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 7, chủng T virens bắt đấu mọc lan qua và bảo phủ nấm bệnh, kìm hãm hệ sợi nấm bệnh co lại hồn tồn khơng thể phát triển được nữa. Trong khi đĩ chủng T. harzianum tuy chỉ mọc lan qua một phần, khơng mọc phủ kín nấm bệnh nhưng lại tiêu diệt hình thành bào tử trên tản nấm bệnh bị bao phủ. Sau 7 ngày nuơi cấy, tỷ lệ đối kháng nấm Colletotrichum sp2. của T. harzianum ở khoảng 59% và của T. virens ở khoảng 53%. Như vậy, cả 2 nấm T. virens và T. harzianum đều cĩ khả năng ức chế và tiêu diệt nấm Colletotrichum sp2. - 60 -
Đồ án tốt nghiệp 3.3.5. Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp3. Bảng 3.9. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Colletotrichum sp3. Ngày Tỷ lệ Nấm Mơ tả nấm bệnh Colletotrichum sp3. sau đối kháng Trichoderma bị ức chế (đĩa đối kháng) cấy (%) Nấm T. virens phát triển nhanh tiếp xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn chặn 3 9,64 ± 2,38 khơng cho nấm bệnh phát triển lấn sang vùng chúng đã mọc. T. virens Nấm T. virens mọc lan, đan xen vào 5 43 ± 1,50 hệ sợi nấm bệnh. Nấm T. virens phát triển bao phủ một 7 phần hệ sợi nấm bệnh. Hệ sợi nấm 55,45 ± 1,17 bệnh bị bao phủ tàn lụi Nấm T. harzianum phát triển nhanh 3 7,29 ± 2,65 tiếp xúc với hệ sợi nấm bệnh. Nấm T. harzianum ngăn chặn nấm 5 bệnh phát triển lấn sang vùng chúng 41,25 ± 1,67 đã mọc. T. harzianum Nấm T. harzianum phát triển mạnh mọc lan sang và bao phủ hết hệ sợi nấm bệnh. Nấm T. harzianum sinh 7 56,05 ± 1,26 bào tử dày đặc trên hệ sợi nấm bệnh bị bao phủ và cĩ dấu hiệu bị tiêu diệt hồn tồn Ghi chú: Tỷ lệ (%) đối kháng được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD - 61 -
Đồ án tốt nghiệp Colletotrichum sp3. - Colletotrichum sp3. - Colletotrichum sp3. - Đối chứng T. virens T. harzianum 5 ngày sau cấy 7 ngày sau cấy Hình 3.16. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Colletotrichum sp3. Như vậy, cả 2 nấm T. virens và T. harzianum đều cĩ khả năng ức chế và tiêu diệt nấm Colletotrichum sp3. với tỷ lệ đối kháng của nấm T. virens ở khoảng 55% và T. harzianum ở khoảng 56% sau 7 ngày đối kháng. Trong đĩ, chủng T. harzianum cĩ hiệu quả đối kháng và tiêu diệt mạnh hơn so với T. virens. Quan sát sau 3 ngày nuơi cấy cho thấy tản nấm bệnh và Trichoderma bắt đầu tiếp xúc nhau. Ở ngày thứ 4 và ngày thứ 5, Trichoderma phát triển mạnh chiếm hết chỗ trên mơi trường, mọc dày đặc quanh tản nấm bệnh. Khi tiếp xúc với Trichoderma, hệ sợi nấm bệnh khơng phát triển được nữa. Từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 7, chủng T. virens chỉ kìm hãm, ức chế nấm bệnh khơng phát triển được nữa. Trong khi đĩ chủng T. harzianum mọc lan và phủ kín nấm bệnh và hình thành bào tử dày đặc hết tản nấm bệnh bị lụi tàn. - 62 -
Đồ án tốt nghiệp Như vậy, cả 5 đối tượng nấm bệnh khảo sát bao gồm cả nấm gây bệnh ở đất (Fusarium sp., Rhizoctonia sp.) và nấm gây hại trên cây (3 chủng nấm Colletotrichum sp.) đều bị ức chế và tiêu diệt bởi cả 2 chủng nấm T. virens và T. harzianum với tỷ lệ ức chế đều trên 50% sau 7 ngày nuơi cấy. Trong đĩ, nấm T. harzianum thể hiện khả năng tiêu diệt mạnh hơn chủng T. virens. Điều này gĩp phần chứng minh mối tương quan thuận giữa khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase và khả năng đối kháng nấm bệnh của các chủng Trichoderma vì theo kết quả ở mục 3.3 thì chủng T.harzianum cĩ hoạt tính sinh enzyme chitinase cao hơn so với chủng T.virens. Kết luận này cũng trùng với nhận định của Silva và cộng sự (2004) khi các tác giả cho rằng, Trichoderma harzianum là một nhà máy sản xuất enzyme ngoại bào N-acetyl-beta-D-glucosaminidase (Nagase) khi được nuơi cấy trong mơi trường cĩ chứa chitin, đĩng vai trị quan trọng trong việc phá huỷ thành tế bào nấm bệnh. Bên cạnh đĩ, tuy cả 2 lồi nấm T. harzianum và T.virens kí sinh trên nấm Linh chi nhưng lại cĩ hiệu quả đối kháng khác nhau trên 5 lồi nấm bệnh khảo sát. Hiệu quả đối kháng nấm bệnh của 2 lồi nấm T. harzianum và T.virens kí sinh trên nấm Linh chi khơng chỉ dừng lại ở mức đối kháng mạnh với các lồi nấm bệnh trong đất (Rihzoctonia sp., Fusarium sp.) mà qua thử nghiệm đối kháng với 3 lồi nấm thán thư gây hại trên cây gấc, thanh long và ớt cịn cho thấy đối kháng ở mức cao, cĩ khả năng ức chế chúng phát triển mà theo những nghiên cứu trước đây về khả năng đối kháng của Trichoderma phân lập trong đất với các lồi nấm gây bệnh trên cây ở trong và ngồi nước thì ít đề cập đến. Điều này cho thấy 2 lồi T. harzianum và T.virens kí sinh trên nấm Linh chi cĩ phổ kháng nấm bệnh rộng hơn (cả ở cả hệ sinh thái dưới đất và trên mặt đất) so với các lồi nấm Trichoderma phân lập trong đất. Như vậy, nấm T. harzianum và T.virens phân lập từ nấm Linh chi cĩ khả năng đối kháng mạnh với cả 5 chủng nấm bệnh khảo sát, cả nấm gây bệnh trong đất và bệnh trên cây. Cần cĩ những nghiên cứu để sử dụng các tác nhân này trong phịng trừ nấm gây bệnh cây trồng. - 63 -
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Qua kết quả phân lập và định danh đến lồi các vi nấm kí sinh trên Linh chi cho thấy 3 lồi cĩ tần suất xuất hiện cao là Trichoderma harzianum, Trichoderma virens và Aspergillus niger. Trong đĩ, kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch đã xác định được 2 lồi nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum là tác nhân kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi. Hai lồi nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi đều cĩ khả năng sinh enzyme cellulase và chitinase. Trong đĩ, nấm Trichoderma harzianum cĩ khả năng enzyme cellulase và chitinase mạnh hơn nấm Trichoderma virens và khả năng sinh enzyme chitinase ở cả hai lồi đều cao hơn khả năng sinh enzyme cellulase. Khảo sát khả năng đối kháng của 2 lồi nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi với nấm bệnh gây hại cây trồng cả hai đều cĩ khả năng đối kháng mạnh với cả 5 chủng nấm bệnh khảo sát: Fusarium sp. gây bệnh héo thân cây bắp; Rhizoctonia sp. gây bệnh thối lở cổ rễ cây bắp; Colletotrichum sp1. gây bệnh thán thư trên gấc; Colletotrichum sp2. gây bệnh thán thư trên ớt và Colletotrichum sp3. gây bệnh thán thư trên thanh long. Tỷ lệ ức chế đều trên 50% sau 7 ngày nuơi cấy. Trong đĩ, nấm T. harzianum thể hiện khả năng tiêu diệt mạnh hơn chủng T. virens. 4.2. Kiến nghị Tiếp tục kiểm chứng xác định Aspergillus niger là tác nhân kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi. Khảo sát khả năng đối kháng của hai lồi nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum trên nhiều chủng nấm bệnh khác: Pythium, Phytophthora, Sclerotium Khảo sát khả năng đối kháng của 2 lồi nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum với các lồi nấm bệnh hại cây trồng trong điều kiện in vivo. - 64 -
Đồ án tốt nghiệp Nghiên cứu kết hợp giữa 2 lồi Trichoderma virens và Trichoderma harzianum với các chủng vi sinh khác tạo ra chế phẩm đa chức năng giúp tăng hiệu quả phịng trừ các bệnh hại khác nhau trên cây trồng. - 65 -
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Xuân Đồng (1982). Nhĩm nấm Hyphomycetes ở Việt Nam, ,tập 1, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Bùi Xuân Đồng (1984). Nhĩm nấm Hyphomycetes ở Việt Nam, ,tập 2, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2000). Vi nấm dùng trong cơng nghệ sinh học, NXB Khoa học và Kỹ Thuật, Hà Nội. Đinh Minh Hiệp (2007). Hệ chitinase của Trichoderma và vai trị trong kiểm sốt sinh học, Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh. Đinh Minh Hiệp, Lê Đình Đơn, Nguyễn Tiến Thắng, Ngơ Kế Sương (2007). Khảo sát hoạt tính các enzym chitinase, β-glucanase, cellulase, pectinase, amylase, protease của các chủng Trichoderma phân lập tại Việt Nam, Hội nghị khoa học tồn quốc "Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống", NXB Khoa học và Kỹ thuật, trang 708-710. Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng và cộng sự (2005). Điều tra khảo sát sự phân bố của các chủng nấm Trichoderma tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh Đơng Nam Bộ, Đề tài cấp Bộ - Bộ Khoa học và Cơng Nghệ. Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng, Nguyễn Tiến Thắng, Ngơ Kế Sương (2008). Khảo sát khả năng đối kháng in vitro của các chủng nấm Trichoderma đối với 3 lồi nấm gây bệnh cây trồng (Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Phytophthora palmivora), Tạp chí Khoa học và Cơng nghệ, tập 46, số 4A, trang 93-99. Dương Minh, Lê Phước Thạnh và Đào Thị Hồng Xuyến (2010), Một số sản phẩm nghiên cứu từ nấm Trichoderma cĩ triển vọng của Đại học Cần Thơ, Tạp chí Khoa học 16: 173 – 179. Huỳnh Văn Phục (2006). Khảo sát tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúa và - 66 -
Đồ án tốt nghiệp bắp, Khĩa luận tốt nghiệp chuyên ngành Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. Lê Duy Thắng (2001). Kỹ thuật nuơi trồng nấm ăn, tập 1, NXB Nơng nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. Lê Duy Thắng (2005). Sổ tay hướng dẫn trồng nấm, NXB Nơng nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. Nguyễn Đức Lượng (2006). Thí nghiệm Cơng nghệ sinh học: Thí nghiệm vi sinh vật học, Tập 2, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. Nguyễn Lân Dũng (1983). Một số sản phẩm của vi nấm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Nguyễn Lân Dũng (2001), Cơng nghệ nuơi trồng nấm, tập 1 và 2. NXB Nơng nghiệp, Hà Nội. Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đinh Lương (1982).Vi nấm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Roger Shivas và Dr Dean Beasley (2005). Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật, Bảo tàng bệnh cây, Sở Nơng nghiệp và Thủy sản Queensland, Australia. Tơ Duy Khương (2007). Khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichoderma spp. và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh thực vật, Luận văn thạc sĩ sinh học chuyên ngành vi sinh, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí Minh. Vũ Triệu Mân (2007). Giáo trình Bệnh cây chuyên khoa, Chuyên ngành Bảo vệ thực vật, Trường Đại học Nơng Nghiệp I, Hà Nội. - 67 -
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU NƯỚC NGỒI A. K. Mukherjee, S. Kranthi, A. Sampath Kumar, P. K. Mukherjee (2014). Original article: Biocontrol potential of three novel Trichoderma strains: isolation, evaluation and formulation, This article is published with open access at Sp.ringerlink.com. Agrios G.N (2005). Plant pathology, 5th edition, Elsevier Academic Press: San Diego, California. Bao X, Wang X, Dong Q, Fang J, Li X (2002). Structural features of immunologically active polysaccharides from Ganoderma lucidum, Phytochemistry. Boh B, Berovic M, Zhang J, Zhi-Bin L (2007). Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds, Biotechnol Annu Rev. Borchers A. T, Stern J. S, Hackman R. M, Keen C. L, Gershwin M. E (1999). Minireview: Mushrooms, tumors and immunity, Proc Soc Exp Biol Med. Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. and Phan H.T (2008). Diagnostic manual for plant diseases in Vietnam, ACIAR Monograph No. 129, 210 pp. ACIAR: Canberra. Chang S. T, Buswell J. A (1996). Mushroom nutriceuticals, World J Microbiol Biotechnol. Chang S. T, Buswell J. A (1999). Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P. Karst. (Aphyllophoromycetideae): A mushrooming medicinal mushroom, Int J Med Mushrooms. Chang S. T, Buswell J. A (2008). Safety, quality control and regulational asp.ects relating to mushroom nutriceuticals, Mushroom Biology and Mushroom Products. Chet, L, G.E.Harman, and R.Baker (1981). Trichoderma hamatum: Its hyphal interactions with Rhizoctonia solani and Pythium spp., Microb. Ecol. 7, pp 28 – 29. Elad and Y., I.Chet, P.Boyle and Y.Hennis (1983). Parasitism of Trichoderma - 68 -
Đồ án tốt nghiệp spp. on Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii scaning electron microscopy and fluorescence microscopy, Phytopathology 73: pp 85 – 88. Elad Y, Chet I, Henuls Y (1982). Degradation of plant pathogenic fungi by Trichoderma harzianum, J. Can. J. Microbiol, 28: 719 – 725. Esp.osito .E, Silva .D.M (1998). Systematics and environmental application of the Genus Trichodema, Crical reviews in Microbiology 24 (2), pp. 89 – 98. Francesco Vinale (2008) Trichoderma–plant–pathogen interactions. Soil Biology & Biochemistry: p. 1-10. Gao Y, Zhou S (2009). Cancer prevention and treatment by Ganoderma, a mushroom with medicinal properties, Food Rev Int. Gary E. Harman, C. P. Kubicek (2005). Trichoderma And Gliocladium: Enzymes, Biological Control and commercial applications, Volume 2, This edition published in the Taylor & Francis e-Library. Gary J. Samuels (2004). Trichoderma aguide to identification and biology, United States Department of Agriculture Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA. Hadden J. F. and L. L. Black (1989). Anthranose of pepper caused by Collettotrichum spp. proceeding of the international symposium on integrated management practices: Tomato and pepper production in the tropics, Asian Vegetable Research and Development Centre, Taiwan, 189 – 199. Harman G. E., et al. (2004). Trichoderma sp.ecies opportunistic, avirulent plant symbionts, Nat Rev Microbiol, 2(1): p. 43-56. Hatvani L, et al (2012). Mushroom Green Mould Disease In Croatia, Arh Hig Rada Toksikol, 63:481-487 Holliday P (1980). Fungus diseases of tropical crops, Published by Cambrige University Press, England. Hubbard, et al (1983). Phytopathology ,73:655-659. Jaw-Fen Wang (2010). Characterization of Colletotrichum spp.Characterization - 69 -
Đồ án tốt nghiệp of Colletotrichum spp. causing pepper anthracnose and development of resistant pepper lines, Asian Seed Congress. Kim B. S. (2007). Country report of anthranose research in Korea, First international symposium on chi li anthranose, National hoticultural research institute, Rural development of administration republic of Korea. Kimura Y, Taniguchi M, Baba K (2002). Antitumor and antimetastatic effects on liver of triterpenoid fractions of Ganoderma lucidum: Mechanism of action and isolation of an active substance, Anticancer Res. L. Kredics, L. García Jimenez, S. Naeimi, D. Czifra, P. Urbán, L. Manczinger, L. Hatvani, C. Vágvưlgyi and L. Hatvani (2010). A challenge to mushroom growers: the green mould disease of cultivated champignons, Department of Microbiology, Faculty of Science and Informatics, University of Szeged, Kưzép fasor 52. H-6726 Szeged, Hungary. Laila Naher, Umi Kalsom Yusuf, Shafiquzzaman Siddiquee, Jannatul Ferdous and M. Aminur Rahman. Effect of media on growth and antagonistic activity of selected Trichoderma strains against Ganoderma, African Journal of Microbiology Research Vol. 6(48), pp. 7449-7453. Lin S. C (2000). Beijing, China: Chinese Agricultural Press, Medicinal Fungi of China-Production and Products Development. Masanto Masyahit, Kamaruzaman Sijam, Yahya Awang and Mohd Ghazali Mohd Satar (2009). The First Report of the Occurrence of Anthracnose Disease Caused by Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. on Dragon Fruit (Hylocereus spp.) in Peninsular Malaysia, American Journal of Applied Sciences 6 (5): 902-912. Mau J. L, Lin H. C, Chen C. C (2001). Non-volatile components of several medicinal mushrooms, Food Res Int. Mau J. L, Lin H. C, Chen C. C (2002). Antioxidant properties of several medicinal mushrooms, J Agric Food Chem. Mendoza-Mendoza A, Pozo MJ, Grzegorski D, Martínez P, García JM, Olmedo- - 70 -