›

Đồ án Phân lập định danh chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay thế giai đoạn lên men chao truyền thống hiện nay

pdf 68 trang thiennha21 13/04/2022 3090
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập định danh chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay thế giai đoạn lên men chao truyền thống hiện nay", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_phan_lap_dinh_danh_chon_loc_chung_nam_va_ung_dung_san.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập định danh chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay thế giai đoạn lên men chao truyền thống hiện nay

  1. tên đề tài.txt Phân lập định danh chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay thế giai đoạn lên men chao truyền thống hiện nay Giảng viên hướng dẫn: TS. Hoàng Quốc Khánh Lớp: 13DSH06 MSSV: 1311100548 Page 1
  2. LỜI CAM ĐOAN Người thực hiện đề tài xin cam đoan những nội dung trong đồ án tốt nghiệp này là do người thực hiện đề tài làm tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM, dưới sự hướng dẫn của TS.Hoàng Quốc Khánh, HVCH.Ngô Đức Duy. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là trung thực, không sao chép từ bất cứ bài báo cáo nào đã được công bố trước đây. Mọi sự tham khảo sử dụng trong đồ án đều được trích dẫn các nguồn tài liệu trong báo cáo và tài liệu tham khảo. Mọi sao chép không hợp lệ, không trung thực và vi phạm quy chế nhà trường, người thực hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trước ban giám hiệu trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Như Trương Bích Như
  3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo nhiệt tình của các thầy cô, gia đình và bạn bè. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành của mình đến: Các thầy cô bộ môn trong khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường cùng các thầy cô trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, đã trực tiếp giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em khi còn học ở trường, giúp em có được cơ sở lý thuyết vững vàng và tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập . Thầy Ngô Đức Duy, phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM, một người thầy luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và động viên em trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Thầy Hoàng Quốc Khánh và thầy Nguyễn Hoàng Dũng, phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện để em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp. Chị Lê Quỳnh Loan đã luôn bên cạnh giúp đỡ, chia sẽ kiến thức, kinh nghiệm và tất cả các anh chị, các bạn đang nghiên cứu ở phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ dạy cho em nhiều điều trong suốt quá trình nghiên cứu. Các bạn lớp 13DSH06, trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM đã sát cánh bên em trong suốt những năm tháng trên giảng đường đại học . Cuối cùng, con xin cám ơn Ba Mẹ, đã nuôi nấng chăm sóc và tạo mọi điều kiện cho con ăn học thành người có ích cho xã hội. Trương Bích Như
  4. Đồ Án Tốt Nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Tình hình nghiên cứu 1 3. Mục đích nghiên cứu 3 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 3 5. Phương pháp nghiên cứu 3 6. Các kết quả đạt được của đề tài 3 7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp 4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1 Cây đậu nành 5 1.1.1 Nguồn gốc 5 1.1.2 Gía trị kinh tế của cây đậu nành 6 1.1.3 Thành phần hóa học trong hạt đậu nành [8]. 8 1.2 Tổng quan về đậu phụ 11 1.3 Tổng quan về chao [8] 11 1.4 Nấm mốc thường gặp trong chao 12 1.5 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 13 1.5.1 Các phương pháp ly trích DNA 13 1.5.2 PCR trong định danh vi sinh vật 14 1.5.3 Xây dựng cây phát sinh loài 16 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 i
  5. Đồ Án Tốt Nghiệp 2.1 Thời gian và địa điểm 18 2.2 Vật liệu, thiết bị và hóa chất 18 2.2.1 Dụng cụ và thiết bị 18 2.2.2 Nguồn mẫu 18 2.2.3 Hóa chất 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phân lập chủng nấm 20 2.3.2 Phương pháp phòng ẩm 21 2.3.3 Định danh bằng sinh học phân tử 21 2.3.4 Khảo sát khả năng sinh enzym protease 26 2.3.5 Khảo sát khả năng sinh enzyme lipase 26 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 28 3.1 Kết quả đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử 28 3.2 Định danh các chủng nấm bằng vùng gen ITS 35 3.2.1 Kết quả ly trích thu nhận bộ gen DNA 36 3.2.2 Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS của nấm mốc 36 3.3 Kết quả so sánh vùng gen ITS của 3 chủng CM1, CDN và CSG và thiết lập cây phát sinh loài dựa trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI 37 3.3.1 Trình tự vùng gen ITS của các chủng CM1, CDN VÀ CSG 37 3.3.2 Thiết lập cây phát sinh loài 38 3.3.3 Kết quả khảo sát protease 40 3.3.4 Kết quả khảo sát lipase 41 3.3.5 Khả năng lên men chao của 3 chủng nấm CM1,CDN và CSG 42 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 ii
  6. Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường 1 PHỤ LỤC B: Kết quả cấy phân lập nấm ban đầu 2 PHỤ LỤC C: Kết quả vùng gen bảo tồn ITS 3 PHỤ LỤC D: Kết quả trình tự vùng gen của các chủng so sánh trên NCBI 6 iii
  7. Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleotide Acid EDTA Ethylene- diamine-Tetraacetic-Acid ITS Internal transcribed spacer PCR Polymerase Chain Reation PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth TAE Tris-Acetic acid- Ethylenediamine- Tetraacetae LB Luria – Bertani dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate iv
  8. Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học hạt đậu nành 8 Bảng 1.2 Thành phần acid amin trong protein của đậu nành 9 Bảng 1.3 Thành phần hydratcacbon trong đậu nành 9 Bảng 1.4 Thành phần khoáng trong đậu nành 10 Bảng 1.5 Thành phần vitamin trong đậu nành 10 Bảng 1.6 Thành phần hóa học của chao 11 Bảng 2.1 Danh sách các mẫu chao được thu tại TP.HCM, Long An và Đồng Nai 18 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 25 v
  9. Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Sơ đồ của các gen ribosome nằm trong vùng gen ITS 16 Hình 3.1 Khuẩn lạc, tế bào của chủng CTP trên môi trường PDA trong 72 giờ 28 Hình 3.2 Chủng CM2 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ 29 Hình 3.3 Chủng CVP2 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng ở 72 giờ 30 Hình 3.4 Chủng CVP1 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ 31 Hình 3.5 Mẫu CM1 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ. 32 Hình 3.6 Mẫu CDN trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ 33 Hình 3.7 Mẫu CSG trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ 34 Hình 3.8 Kết quả ly trích bộ gen DNA của 3 chủng CM1,CDN và CSG trên gel agarose 1,5%. 36 Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 3 chủng CM1, CDN và CSG trên gel agarose 1,5% 37 Hình 3.10 Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS các chủng CM1, CDN và SGN với các chủng nấm trên ngân hàng gen NCBI 40 Hình 3.11 Khả năng sinh caseinase của 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG 41 Hình 3.12 Kết quả sinh enzyme lipase của 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG 42 Hình 3.13 Khảo sát khả năng lên mốc chao của 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG 42 vi
  10. Đồ Án Tốt Nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay nhu cầu thực phẩm của con người ngày càng tăng cao, không chỉ dừng lại việc ăn ngon mà thực phẩm phải an toàn và có giá trị dinh dưỡng. Do vậy tìm ra các phương pháp sản xuất thực phẩm an toàn và có giá trị dinh dưỡng cao là vấn đề thiết yếu hiện nay. Chao truyền thống có vai trò khá quan trọng trong đời sống tâm linh của người dân Việt Nam. Sản phẩm chao hiện nay sản xuất theo lối thủ công và chất lượng của sản phẩm phụ thuộc vào nhiều yếu tố khách quan và chủ quan trong quá trình sản xuất trong đó đáng kể nhất là chủng nấm mốc. Chao là sản phẩm được dùng phổ biến như gia vị trong bữa ăn. Chao bổ sung thêm phần protein và các acid amine quan trọng, cung cấp đáng kể nguồn năng lượng, khoáng và vitamin, trong bữa ăn của người dân Châu Á nói chung và người dân Việt Nam nói riêng. Tuy nhiên ở Việt Nam các cơ sở sản xuất chao hiện nay chủ yếu sử dụng mốc chao tự nhiên, thời gian bảo quản và chất lượng sản phẩm khó kiểm soát và không ổn định, làm khả năng nhiễm vi sinh vật và nguy cơ hư hỏng cao làm thay đổi giá trị dinh dưỡng và hương vị sản phẩm, thậm chí nhiễm cả nấm mốc gây độc như Aspergillus Flavus và Aspergillus Parasiticus sinh ra độc tố aflatoxin có thể gây ung thư cho người dùng[4]. Để có thể chọn được chủng nấm thích hợp hạn chế được hư hỏng nhanh của chao và tăng hương vị chao. Chính vì vậy việc: “ phân lập định danh, chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay thế giai đoạn lên men chao truyền thống hiện nay ” góp phần đưa chao đến gần với người tiêu dùng hơn cũng như nâng cao chất lượng và hương vị sản phẩm. 2. Tình hình nghiên cứu Một số công trình nghiên cứu về các chủng nấm mốc ứng dụng sản xuất chao đã được công bố. Năm 1929, Wai là người đầu tiên đã phân lập một loại mốc thuộc dòng 1
  11. Đồ Án Tốt Nghiệp Mucor và đặt tên là Mucor sufu (mốc chao)[17]. Năm 2011, Nguyễn Văn Thành và Trần Nguyễn Ngọc Quỳnh đã nghiên cứu về sản xuất tối ưu bột bào tử nấm Actinomucor elegans để ứng dụng vào quy trình sản xuất chao. Kết quả cho thấy mật độ bào tử nấm đạt cao nhất (1010 bào tử /g cơ chất khô) với nghiệm thức 17 sử dụng cơ chất tấm cám (2:1), chủng 105 bào tử/ gck thu hoạch sau 7 ngày ủ 300C. Sau 5 tháng bảo quản mật độ bào tử duy trì sức sống cao ở nhiệt độ 40C (trong tủ lạnh). Trong khi đó các nghiệm thức trong phòng hoặc trong bình hút ẩm 250C duy trì sức sống thấp hơn và tương đương nhau [11]. Năm 2012, Lê Minh Nguyệt và Phan Thị Phương Thảo đã tiến hành xác định được các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tạo thành bào tử và sinh tổng hợp enzyme protease của nấm mốc Mucor elegans để xây dựng quy trình sản xuất giống khởi động từ loại nấm mốc này phục vụ cho sản xuất chao. Kết quả cho thấy đã xác định được loại nguyên liệu thích hợp là bột đậu tương, tỷ lệ phối trộn với gạo là 50/50.[10] Wang và Hesseltine (1975) sản xuất lượng lớn bào tử Rhizopus oligosporus trên cơ chất tấm gạo và lúa mì kết quả cho thấy đạt sản lượng 109 bào tử/gck dùng sản xuất tempeh, và khi trữ ở 40C thì có thể bảo quản được trong 6 tháng [38]. Thanh và Nout (2004) đã xác định số lượng bào tử tổng số, số bào tử nấm mốc Rhizopus oligosporus sống bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu. Xác định số lượng bào tử sống, chết và miên trạng bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang mẫu trước và sau xử lý [36]. Thanh và Nout (2002) đã nghiên cứu bảo quản bào tử của Rhizopus oligosporus khả năng sống của bào tử đã giảm đi nhiều sau 1 tháng bảo quản ở 250C cũng như 50C và tiếp tục giảm ít đi sau đó [37]. Shambuyi et al. (1992) đã nghiên cứu bảo quản bào tử nấm mốc cho kết quả sức sống bào tử vẫn duy trì ở mức cao sau 30 tuần bảo quản ở 50C, 250C và 370C nhưng tốt nhất ở 50C [35]. 2
  12. Đồ Án Tốt Nghiệp 3. Mục đích nghiên cứu Phân lập định danh chủng nấm mốc. Chọn lọc chủng nấm ứng dụng sản xuất thay thế lên men tự nhiên tránh sự tránh sự tạp nhiễm gây hư hỏng chao. Mục đích của đề tài là xác định được chủng nấm trên sản phẩm chao, sau khi xác định được chủng nấm mốc, sẽ dựa vào đặc điểm và những nghiên cứu về nấm mốc trên chao để xây dựng quy trình lên men đạt chất lượng cao nhất. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập và làm thuần chủng nấm từ các mẫu chao. Quan sát hình thái học ( khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử). Định danh bằng sinh học phân tử. Khảo sát khả năng sinh protease, lipase. Khảo sát khả năng lên men trên đậu hủ. 5. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp phân lập và làm thuần chủng nấm. Phương pháp phòng ẩm (xem khuẩn ty và bào tử). Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA (theo phương pháp CTAB). Phương pháp PCR dựa trên đoạn mồi ITS1F và ITS4R. Phương pháp sinh tin học dựa trên các phần mềm (Chromaspro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seview4 4.32.0.0). Phương pháp thử hoạt tính protease, lipase(trên môi trường đĩa thạch). 6. Các kết quả đạt được của đề tài Qua kết quả nghiên cứu, đề tài đã đạt được các kết quả như sau: Kết quả phân lập và làm thuần chủng nấm trên các sản phẩm chao. Kết quả thu nhận được bộ gen DNA. Kết quả nhân bản được vùng gen ITS bằng phương pháp PCR. Kết quả có hoạt tính protease, phân giải protein tạo vòng trong suốt. 3
  13. Đồ Án Tốt Nghiệp Kết quả lên mốc tốt. 7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Nội dung của đồ án tốt nghiệp này gồm có 4 chương: Chương I: Tổng quan tài liệu giới thiệu chi tiết về cây và hạt đậu nành, thành phần hóa học trong hạt đậu nành, giới thiệu về đậu nành, chao và các chủng nấm mốc thường có trong chao, một số nghiên cứu các chủng nấm mốc ứng dụng sản xuất các sản phẩm chao truyền thống. Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (bao gồm các nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu sử dụng trong đề tài). Chương III: Kết quả và biện luận đưa ra kết quả các thí nghiệm tiến hành trong đề tài và phân tích các số liệu cụ thể. Chương IV: Kết luận và kiến nghị đưa ra các kết luận thí nghiệm trong đề tài đã đạt được và những vấn đề cần phải làm tiếp trong thời gian tới. 4
  14. Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây đậu nành 1.1.1 Nguồn gốc Đậu nành hay còn gọi là đậu tương, là một trong những loại cây trồng có lịch sử sử dụng và trồng trọt từ lâu đời. Đậu nành thuộc chi Glycine, họ đậu Leguminosae, họ phụ cánh bướm Papilionoideae và Phaseoleae. Đậu tương có tên khoa học là Glycine Max (L) Merr. Là loại cây trồng quan trọng bậc nhất trên thế giới đứng hàng thứ tư sau lúa mì, lúa nước và ngô. Dựa vào sự đa dạng về hình thái, Fukuda (1993) và về sau nhiều nhà khoa học khác, cũng đã thống nhất rằng, đậu nành có nguồn gốc từ Mãn Châu (Trung Quốc). Từ Trung Quốc, đậu nành đã lan truyền khắp thế giới. Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản vào khoảng 200 năm trước công nguyên, đậu nành đã được đưa vào Triều Tiên và sau đó được chuyển sang Nhật. Đến giữa thế kỷ XVII, đậu nành mới được nhà thực vật học người Đức Engelbert Caempfer đưa về châu âu và đến năm 1954 đậu nành mới du nhập vào Mỹ. Một số tài liệu cho rằng đậu nành được đưa vào nước ta từ thời vua Hùng và xác định rằng nhân dân ta trồng cây đậu nành trước cây đậu xanh và đậu đen [5]. Mặc dù được trồng từ rất sớm nhưng chỉ trong vài chục năm gần đây cây mới được quan tâm, phát triển và ngày nay nó được xem là giống cây trồng có giá trị dinh dưỡng cao, chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế. Nhưng diện tích trồng và sản lượng vẫn còn thấp so với các nước trên thế giới, hiện nay nước ta còn phải nhập khẩu đậu tương từ Mỹ, Trung Quốc và một số quốc gia khác. Các nước trồng đậu nành đứng hàng đầu trên thế giới về diện tích gieo trồng và sản lượng là: Mỹ, Braxin và Trung Quốc. 5
  15. Đồ Án Tốt Nghiệp Ở nước ta đậu nành được trồng tập trung ở các tỉnh miền núi và trung du: Sơn La, Cao Bằng, 1.1.2 Gía trị kinh tế của cây đậu nành 1.1.2.1 Gía trị về mặt thực phẩm Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình khoảng từ (35,5 - 40%). Trong khi đó hàm lượng protein trong gạo chỉ (6,2 - 12%), ngô (9,8 - 13,2%), thịt bò (21%), thịt gà (20%), cá (17 - 20%) và trứng (13 - 14,8%), lipit từ (15 - 20%), hydratcacbon từ (15-16%) và nhiều loại sinh tố và muối khoáng quan trọng cho sự sống [14]. Protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong số các protein có nguồn gốc thực vật. Hàm lượng protein trong hạt đậu tương cao hơn cả hàm lượng prôtein có trong cá, thịt và cao gấp 2 lần so với các loại đậu đỗ khác. Hàm lượng axit quan trọng có chứa lưu huỳnh như methionin và sixtin của đậu tương cao gần bằng hàm lượng các chất này có trong trứng gà. Hàm lượng cazein, đặc biệt lisin cao gần gấp rưỡi lần chất này có trong trứng. Vì thế mà khi nói về giá trị của protein trong hạt đậu tương là nói đến hàm lượng protein cao và sự cân đối của các loại axit amin cần thiết. Protein của đậu tương dễ tiêu hoá hơn thịt và không có các thành phần tạo colesteron. Ngày nay người ta mới biết thêm hạt đậu tương có chứa lexithin, có tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, tăng thêm trí nhớ, tái tạo các mô, làm cứng xương và tăng sức đề kháng của cơ thể. Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác nên được coi là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng. Lipit của đậu tương chứa một tỉ lệ cao các axít béo chưa no (khoảng 60-70%) có hệ số đồng hoá cao, mùi vị thơm như axit linoleic chiếm (52-65%), oleic từ (25-36%), linolenolic khoảng (2-3%) [1]. Dùng dầu đậu tương thay mỡ động vật có thể tránh được xơ mỡ động mạch. Trong hạt đậu tương có khá nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm lượng vitamin B1 và B2 ngoài ra còn có các loại vitamin PP, A, E, K, D, C, Đặc biệt trong hạt đậu tương đang nảy mầm hàm lượng vitamin tăng lên nhiều, đặc biệt là vitamin C. Phân tích thành phần sinh hoá cho thấy trong hạt đậu tương đang nảy mầm, ngoài hàm 6
  16. Đồ Án Tốt Nghiệp lượng vitamin C cao, còn có các thành phần khác như: vitamin PP, và nhiều chất khoáng khác như Ca, P, Fe Chính vì thành phần dinh dưỡng cao như vậy nên đậu tương có khả năng cung cấp năng lượng khá cao khoảng 4700 cal/kg [3]. Hiện nay, từ hạt đậu tương người ta đã chế biến ra được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có hơn 300 loại làm thực phẩm được chế biến bằng cả phương pháp cổ truyền, thủ công và hiện đại dưới dạng tươi, khô và lên men như làm giá, đậu phụ, tương, xì dầu đến các sản phẩm cao cấp khác như cà phê đậu tương, bánh kẹo và thịt nhân tạo Đậu tương còn là vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt là đậu tương hạt đen, có tác dụng tốt cho tim, gan, thận, dạ dày và ruột. Đậu tương là thức ăn tốt cho những người bị bệnh đái đường, thấp khớp, thần kinh suy nhược và suy dinh dưỡng. 1.1.2.2 Gía trị về mặt công nghiệp Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tương được dùng để ép dầu. Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật. Đặc điểm của dầu đậu tương: khô chậm, chỉ số iốt cao : 120 - 127 ; ngưng tụ ở nhiệt độ -(15 – 18)0C. Từ dầu này người ta chế ra hàng trăm sản phẩm công nghiệp khác như: làm nến, xà phòng, ni long 1.1.2.3 Gía trị về mặt nông nghiệp Làm thức ăn cho gia súc: Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc 1kg hạt đậu tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi. Toàn cây đậu tương (thân, lá, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể làm thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc. Sản phẩm phụ công nghiệp như khô dầu có thành phần dinh dưỡng khá cao: N(6,2%), P2O5(0,7%), K2O(2,4%), vì thế làm thức ăn cho gia súc rất tốt [5]. Cải tạo đất: Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt. 1ha trồng đậu tương nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60kgN. Trong hệ thống luân canh, nếu 7
  17. Đồ Án Tốt Nghiệp bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho việc bón N. Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lượng N trong thân chiếm (0,05%), trong lá (0,19%) [3]. 1.1.3 Thành phần hóa học trong hạt đậu nành [8]. Đậu nành có nhiều màu sắc khác nhau, trong đó đậu nành có màu vàng là loại tốt nhất nên được trồng và sử dụng nhiều. Hạt đậu nành có 3 bộ phận. Vỏ hạt chiếm 8% trọng lượng hạt. Phôi chiếm 2%. Tử diệp chiếm 90%. Hạt đậu nành có thành phần hóa học như sau: Bảng 1.1 Thành phần hóa học hạt đậu nành. Thành phần Tỷ lệ Protein Dầu (%) Tro (%) Hydratcacbon (%) Hạt đậu nành nguyên 100 40 21 4,9 34 Tử diệp 90,3 43 23 5 29 Vỏ hạt 8 8,8 1 4,3 86 Phôi 2,4 41,1 11 4,4 43 (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng) Trong thành phần hóa học của đậu nành, thành phần protein chiếm một tỷ lượng rất lớn. Thành phần acid amin trong protein của đậu nành ngoài hai thành phần methionin và tryptophan ra còn có các acid amin khác, có số lượng khá cao tương đương lượng acid amin có trong thịt . 8
  18. Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 1.2 Thành phần acid amin trong protein của đậu nành. Lzolozin 1,1 % Loxin 7,7 % Lyzin 5,9 % Methionin 1,6 % Xystin 1,3 % Phenilalanin 5 % Treonin 4,3 % Triptophan 1,3 % Valin 5,4 % Histidin 2,6 % (Nguồn:Nguyễn Đức Lượng) Trong protein đậu nành glubolin chiếm (85 – 95)%. Ngoài ra còn có một lượng nhỏ anbumin, một lượng không đáng kể prolamin và glutelin. Hydratcacbon chiếm khoảng 34% hạt đậu nành. Phần hydratcacbon có thể chia làm 2 loại: loại tan trong nước và loại không tan trong nước. Loại tan trong nước chỉ chiếm khoảng 10% toàn bộ hydratcacbon. Bảng 1.3 Thành phần hydratcacbon trong đậu nành. Xenluloza 4 % Hemixenluloza 15,4 % Stachyoza 3,8 % Rafinoza 1,1 % Saxaroza 5,0 % Các loại đường khác 5,1 % (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng) 9
  19. Đồ Án Tốt Nghiệp Thành phần khoáng chiếm khoảng 5% trọng lượng khô của hạt đậu nành. Trong đó đáng chú ý nhất là canxi, photpho, mangan, kẽm và sắt. Bảng 1.4 Thành phần khoáng trong đậu nành. Canxi 0,16 – 0,47 % Photpho 0,41 – 0,82 % Mangan 0,22 – 0,24 % Kẽm 37 mg/kg Sắt 90 – 150 mg/kg (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng) Ngoài ra đậu nành còn chứa nhiều vitamin khác nhau. Bảng 1.5 Thành phần vitamin trong đậu nành. Thiamin 11,0 – 17,5 mg/lg Riboflavin 3,4 – 3,6 Niaxin 21,4 – 23,0 Pyridoxin 7,1 – 12,0 Biotin 0,8 Acid tantothenic 13,0 – 21,5 Acid folic 1,9 Inoxiton 2300 Vitamin A 0,18 – 2,43 Vitamin E 1,4 Vitamin K 1,9 (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng) Đậu nành là một loại hạt giàu chất dinh dưỡng như protein, lipit, gluxit, muối khoáng và vitamin. Chính vì thế, đậu nành là một nguồn thực phẩm quan trọng. Trong công nghiệp thực phẩm đậu nành được coi là một nguyên liệu quan trọng để sản xuất dầu thực phẩm và các sản phẩm lên men. 10
  20. Đồ Án Tốt Nghiệp 1.2 Tổng quan về đậu phụ Đậu phụ là một sản phẩm được sản xuất từ đậu nành. Đậu phụ không chỉ được sản xuất ở Việt Nam mà còn được sản xuất nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, các nước Đông Nam Á và cả các nước Châu Âu như Hà Lan, Pháp, [8]. Đậu phụ là thực phẩm phổ biến ở các nước Đông Nam Á, có hàm lượng protein rất cao [34]. Đậu phụ chứa khoảng (6,0 – 8,4) % protein và (79 – 87)% nước, pH trung tính (5,2 – 6,2). 1.3 Tổng quan về chao [8] Chao là sản phẩm lên men được sản xuất từ đậu nành. Vì qua quá trình lên men chao có hệ số tiêu hóa cao hơn nhiều so với đậu phụ. Chao có nhiều sản phẩm khác nhau như chao nước, chao bánh, chao đặc và chao bột . Bảng 1.6 Thành phần hóa học của chao Thành phần Các loại sản phẩm chao Chao nước Chao bánh (%) Phần cái (%) Phần nước (%) Hàm ẩm 73 – 75 - 65 – 70 Đạm toàn phần 2 – 2,9 12,5 – 13 2,3 – 2,6 Đạm phocmon 0,7 – 0,85 7,5 – 7,8 0,8 – 0,9 Đạm ammoniac 0,3 – 0,4 2,5 – 3,0 0,3 – 0,4 Muối ăn 4,5 – 5,0 6,0 – 6,2 6,0 – 6,5 Chất béo 8,0 – 8,5 - 9,0 – 10 Độ chua 110,0 – 120 mg NaOH 0,1 N/100 Các acid amin không thay thế (g/kg) Lizin 2,84 – 2,9 5,3 – 5,5 11
  21. Đồ Án Tốt Nghiệp Treonin 3,3 – 3,5 2,8 – 2,9 Valin 1,7 – 1,75 1,5 – 1,6 Triptophan 0,15 – 0,2 0,4 – 0,45 Fenilalanin 1,55 – 1,60 2,5 – 2,70 Lzolozin Lozin 1,8 – 1,9 0,8 – 0,9 Metionin 0,4 – 0,5 0,4 – 0,5 (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng) Do quá trình lên men các enzyme của vi sinh vật tham gia thủy phân protein thành các acid amin, lipit thành các este thơm nên chao có giá trị dinh dưỡng cao và có mùi vị rất đặc trưng. 1.4 Nấm mốc thường gặp trong chao Để sản xuất chao thường sử dụng giống khởi động từ giống nấm mốc: Mucor spp, Rhizopus spp, Actinomucor spp. Đây là các giống nấm có màu trắng đục, trắng ngà không làm ảnh hưởng tới màu sắc của sản phẩm, hệ sợi nấm mảnh nhưng dài có khả năng tạo thành một lớp màng mỏng xung quanh miếng chao, có tác dụng giữ hình dáng cho chao được ổn định [9]. Tuy nhiên, hầu hết các chủng nấm Actinomucor spp chỉ thích hợp với nhiệt độ môi trường tương đối thấp 18-200C đó chỉ sử dụng được các loài nấm mốc này ở những khoảng thời gian nhất định trong năm. Rhizopus spp rất nhanh hình thành bào tử, bào tử lại có màu đen đậm do đó ít nhiều ảnh hưởng tới màu sắc sản phẩm, do đó có ngưỡng nhiệt độ thích hợp rất rộng 20-350C người ta chỉ sử dụng các loài nấm mốc Rhizopus spp vào mùa hè. Giống nấm mốc Mucor spp thường được lựa chọn hơn cả vì nó khắc phục được nhược điểm của cả hai giống trên. Các loài nấm mốc Mucor spp thường sử dụng trong 12
  22. Đồ Án Tốt Nghiệp sản xuất chao là Mucor elegans, Mucor sivaticus, Mucor subtilis, trong đó Mucor elegans thường được sử dụng nhất [18]. 1.5 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 1.5.1 Các phương pháp ly trích DNA 1.5.1.1 Nguyên tắc Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (desoxyribonuclease - DNase và ribonuclease - RNase). 1.5.1.2 Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay đổi theo từng môi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn hoặc là những quần thể vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh vật được đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt của những bộ gen hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá. Do đó, việc tách chiết DNA vi sinh vật để phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng là rất cần thiết. Quá trình ly trích DNA cần phải đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc để có thể thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo. Có rất nhiều phương pháp ly trích DNA tổng số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp. Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên thường được sử dụng: 13
  23. Đồ Án Tốt Nghiệp - Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): được xem là phương pháp thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật với hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo. Phương pháp ly trích sử dụng nồng độ muối cao 11 (1,5 M NaCl) và ủ mẫu trong 2 - 3 giờ trong sự hiện diện của SDS, hexadecyltrimethylammonium bromide, và proteinase K. - Phương pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là phương pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB là một dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic. Ly trích DNA cần phải có cả hai yếu tố là hiệu suất và độ tinh khiết. - Phương pháp Benzyl chloride: Đây là phương pháp ly trích DNA tương đối hiệu quả, có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia nhiệt đến 650C. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, nhanh chóng và mang lại kết quả khá cao. - Phương pháp đóng băng và tan băng: Phương pháp này sử dụng kỹ thuật đóng băng và tan băng ở - 65oC trong ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ vách tế bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên. 1.5.2 PCR trong định danh vi sinh vật 1.5.2.1 Kỹ thuật PCR Đây là một kĩ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống. Hiện nay, PCR đã trở thành một kĩ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược để phát hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gen. PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của 14
  24. Đồ Án Tốt Nghiệp khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược . 1.5.2.2 Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS - rDNA Gen rDNA (ribosomal DNA) là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosome, có nhiều bản sao và vùng không mã hóa cho bất kì protein nào. Đây là vùng gene bảo tồn nên được xem là cơ sở chính xác để tìm ra sự tương đồng và khác biệt của các sinh vật cùng loài hay khác loài, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quá trình tiến hóa, phát sinh loài, phân loại nấm và xác định tính đa dạng di truyền của vi sinh vật cũng như các dòng nấm do việc phân loại nấm dựa vào đặc điểm hình thái, cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein có kết quả phân loại thường không chính xác và cần khoảng thời gian dài[16]. Gen rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gen, khuếch đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên cứu liên quan đến rDNA. Các nghiên cứu sinh học phân tử nhằm phân loại nấm trên cơ sở rDNA được phát triển những năm đầu của thập niên 90 đã tìm được quan hệ di truyền của nhiều loài nấm sợi. Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) – rDNA là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù chúng thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa 15
  25. Đồ Án Tốt Nghiệp của vi sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này thường để xác định các biệt hóa trong cùng loài để lập phổ hệ di truyền [18]. Cặp mồi được sử dụng trong đề tài này là mồi xuôi ITS1-F (CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A) [40] . Và mồi ngược ITS4-R (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)[40]. ITS1-F ITS86F ITS1 ITS2 18S 5.8S 28S ITS86R ITS4 Hình 1.1. Sơ đồ của các gen ribosome nằm trong vùng ITS Vùng ITS cũng có một số ứng dụng như: tính toán các đột biến điểm trong quá trình hình thành loài, đo lường sự giống nhau bên trong trình tự DNA, dùng các phần mềm chuyên dụng tạo ra cây tiến hóa loài không chỉ bao gồm các loài giống nhau mà còn phân biệt sự khác nhau giữa các loài. Cụ thể, người ta đã dựa vào vùng gene ITS của các loài nấm rễ ngoài Tricholoma matsutake và một số loài có quan hệ. Hay mô tả sự phong phú và đa dạng của nấm trong hỗn hợp mẫu, các nhà nghiên cứu đã dùng kỹ thuật qPCR sử dụng các đoạn mồi ITS, ITS1F và ITS4R[14]. 1.5.3 Xây dựng cây phát sinh loài Các phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S - rDNA và việc xây dựng cây phát sinh loài hiện nay đã trở nên khá phổ biến và được xây dựng trên cơ sở dữ liệu của sinh học và tin học (sinh tin học). Những trình tự mới này sẽ được so sánh với những trình tự trong ngân hàng dữ liệu gen bằng cách sử dụng chương trình BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) cho kết quả những loài nào có số trình tự tương đồng cao nhất với chủng đang khảo sát. Sau đó sử dụng các phần mềm sinh tin học như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 để xây dựng cây phát sinh loài, tập hợp 16
  26. Đồ Án Tốt Nghiệp những thông tin có liên quan đến tiến hóa. Một cây phát sinh loài gồm các thành phần như sau: - Một nhánh (một đơn vị huyết thống) là một nhóm vi sinh vật hay nhóm gen bắt nguồn từ tổ tiên chung. Trong phân tích cây phát sinh loài, chiều dài nhánh phát sinh diễn tả mức độ phân hóa giữa các loài. - Nút giao điểm của các nhánh. - Hệ thống phát sinh loài dựa trên các phân tử mà đặc biệt là trình tự gen được sử dụng phổ biến trong định danh phân loại. 17
  27. Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm Đề tài được thực hiện từ 21/2/2017 – 14/7/2017 tại phòng thí nghiệm vi sinh thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh. 2.2 Vật liệu, thiết bị và hóa chất 2.2.1 Dụng cụ và thiết bị Dụng cụ: Pipet, pipetman, đầu tip, Erlen, Lame, Lamelle, que cấy, cân phân tích, máy chụp hình, ống đong, eppendorf Thiết bị: Kính hiển vi quang học, tủ lạnh, máy ly tâm lạnh, nồi hấp khử trùng, máy PCR 2.2.2 Nguồn mẫu Sản phẩm chao thu mua từ các chợ và siêu thị quận Bình Thạnh, Thủ Đức Thành Phố Hồ Chí Minh và Tỉnh Long An, Đồng Nai. Các mẫu thu được ký hiệu dưới bảng sau: Bảng 2.1: Danh sách các mẫu chao được thu tại TP.HCM, Long An và Đồng Nai. Ký Tên mẫu Địa điểm Thời gian hiệu CM Chao Mộc Co.opmart Xa Lộ Hà Nội 21/2/2017 191 Quang Trung, phường Hiệp Phú, quận 9, TP.HCM CBM Chao Bông Mai Co.opmart Văn Thánh 23/2/2017 Tòa nhà Pearl Plaza, 561A Điện Biên Phủ, P.25, quận Bình Thạnh CVP Chao Vĩnh Phong Chợ P.25 quận Bình Thạnh 25/2/2017 CVH Chao Vĩnh Hưng Chợ Tỉnh Long An 26/2/2017 18
  28. Đồ Án Tốt Nghiệp CNH Chao Ngọc Hạnh Chợ Thủ Đức 27/2/2017 CPBD Chao Phúc Bình Dương Chợ tỉnh Đồng Nai 28/2/2017 CTP Chao Thuận Phát Siêu thị Lotte Mart quận Gò Vấp 28/2/2017 CDN Chao Dương Nhi TP.HCM 28/2/2017 CSG Chao Sài Gòn TP.HCM 28/2/2017 2.2.3 Hóa chất 2.2.3.1 Môi trường Môi trường phân lập và nuôi cấy. Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar). Khoai tây 200g Glucose 20g Agar 20g Nước cất 1000ml Môi trường khảo sát caseinase. Môi trường LB (Luria – Bertani) – bổ sung 1% sữa gầy. Peptone 10g Cao nấm men 5g NaCl 5g Nước cất 1000ml Agar 2% Môi trường khảo sát lipase – với Tween 80. Peptone 10g NaCl 5g CaCl2.2H2O 0,1g Agar 9g pH 7,4 H2O 1000ml 19
  29. Đồ Án Tốt Nghiệp 2.2.3.2 Hóa chất định danh Đệm CTAB (0,2 M Tris-Cl pH 7,5, 2 M NaCl, 0,05M EDTA, 2 % CTAB). Chloroform Isoamyl alchol (24:1). Isopropanol, Etanol 70 %. 6X LB Loading dye. TAE 1X. Agarose. Ethidium bromide. Thang DNA 1kb. 2.2.3.3 Hóa chất phản ứng PCR Nước khử ion. Master Mix (2x My taq MixP). Mồi xuôi ITS1F: TCCGTAGGTGAACCTGCGG. Mồi ngược ITS4R :TCCTCCGCTTATTGATATGC. 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phân lập chủng nấm Có nhiều phương pháp phân lập nấm trong đó người ta có thể dùng các chất kháng khuẩn để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và thu nhận nấm, cụ thể trong đề tài này sử dụng chất kháng khuẩn Chloramphenicol. Các bước phân lập Chuẩn bị dụng và môi trường. Môi trường PDA, đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng, nước cất . Các dụng cụ và môi trường trên được hấp khử trùng trong nồi áp suất 1210C, 1atm trong 90 phút. Phân lập Mẫu chao sau khi thu mua về sẽ tiến hành phương pháp pha loãng. 20
  30. Đồ Án Tốt Nghiệp Cân 1g chao cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng được nồng độ pha loãng 10-1. Hút 0.1ml dịch pha loãng ở nồng độ trên cho vào đĩa petri chứa môi trường PDA sau đó trang đều bằng que cấy trang, mỗi mẫu trang 2 đĩa petri đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Làm thuần và giữ giống Sau 24 giờ dùng que cấy thao tác vô trùng chấm nhẹ vào khuẩn lạc riêng lẻ có đặc trưng khác với khuẩn lạc còn lại, cấy điểm trên đĩa petri khác, và đem ủ để tạo khuẩn lạc đơn. Lặp lại việc cấy điểm để có được giống thuần. Kiểm tra tính thuần và giữ giống trên môi trường PDA thạch nghiêng trong ngăn mát tủ lạnh. 2.3.2 Phương pháp phòng ẩm Cách tiến hành: Chuẩn bị lame, lamelle, đĩa petri có giấy lọc ở dưới và thanh thủy tinh chữ “u” bên trên, cùng với nước cất và môi trường PDA đem hấp khử trùng. Dùng pipetman hút môi trường nhỏ vào lame sao cho môi trường trang mỏng để môi trường đông tự nhiên. Dùng que cấy vòng ria tế bào nấm theo dấu “-“ rồi đậy lamelle lại. Nhỏ nước cất vô trùng cho thấm đều giấy lọc . Đậy nắp đĩa lại và gói cẩn thận ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày. Quan sát dưới kính hiển vi. 2.3.3 Định danh bằng sinh học phân tử 2.3.3.1 Phương pháp tách chiết bộ gen DNA bằng CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) [31] Các bước thực hiện: 21
  31. Đồ Án Tốt Nghiệp Hút 1ml dịch nuôi cấy nấm trong môi trường PDB sau 2 ngày vào eppendorf 1ml. Hút 800µl đệm CTAB. Vortex 30 giây, sau đó shot sprins. Ủ -800C trong 30-60 phút. Sau khi ủ đem đi đun sôi 15 phút. Vortex, ly tâm 14000 rpm/ 5 phút / 40C. Sau khi ly tâm thu dịch nổi. Hút 600µl dịch nổi vào eppendorf mới. Thêm một thể tích phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) tương đương với thể tích phần dịch lấy ra (600µl). Đem vortex, ly tâm 14000 rpm/ 5 phút/ 40C. Thu dịch nổi vào eppendorf mới. Thêm 500µl isopropanol lạnh (tỷ lệ thể tích 1:1). Vortex nhẹ, ly tâm 14000 rpm/15 phút/ 40C. Thu tủa . Rửa tủa DNA với 500µl etanol lạnh 100%, vortex nhẹ. Hút bỏ etanol (thật sạch). Mở nắp eppendorf cho etanol bay hơi . Thu tủa . Hòa tan tủa trong 30µl nước cất tinh khiết Bảo quản lạnh. 2.3.3.2 Kiểm tra và thu nhận bộ gene DNA Điện di ở bước này nhằm mục đích xem sản phẩm ly trích DNA có bị gãy hay không và sản phẩm có tinh sạch không, tiến hành điện di sản phẩm ly trích trên gel agarose 1,5%. Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5%, cân 1,5g agarose vào 100ml TAE1X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đun nóng trong microwave ở 650W trong 2 phút. Để 22
  32. Đồ Án Tốt Nghiệp chai nguội khoảng 600C, đổ nhẹ dung dịch vào khay điện di, khoảng 45 phút thì gel đông lại, gel có màu trắng đục. Bước 2: Tiến hành điện di. Trộn dung dịch gồm 4µl DNA sau ly trích và 2µl loading dye 6X. Bơm dung dịch này vào giếng trên gel. Khởi động nguồn điện, chọn 90 voltage, nhấn nút run.Sau khi DNA chạy được khoảng 30 phút thì ấn nút stop. Bước 3: Nhuộm gel. Bảng gel được chuyển vào khay chứa thuốc nhuộm ethidium bromide trong khoảng 15 phút. Bước 4: Quan sát kết quả điện di.Kết quả điện di được quan sát dưới đèn UV Nếu sản phẩm ly trích có DNA thì trên gel điện di sẽ có band DNA phát sáng dưới dạng vạch. Mức độ tập trung và độ đậm nhạt của bảng điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA. 2.3.3.3 Phản ứng PCR [41] Tất cả các DNA polymerase cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho nấm. Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung cho một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nhận biết và kéo dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR và ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại tạo nên số lượng lớn các bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và điện di trên gel agarose. Chu trình phản ứng Thông thường, PCR kéo dài 20 - 35 chu kì, hầu hết các phản ứng PCR bao gồm 3 bước: Bước 1 (biến tính DNA): Đầu tiên, phản ứng PCR thường được gia nhiệt đến nhiệt độ 94 - 96oC, nhiệt độ này được giữ 1 - 9 phút nhằm đảm bảo tất cả DNA mục 23
  33. Đồ Án Tốt Nghiệp tiêu và mồi bị biến tính , DNA được làm tách mạch bởi sự phá vỡ liên kết hydrogen giữa các base bổ sung của chuỗi DNA, tạo thành các chuỗi DNA mạch đơn. Sau đó, chu trình bắt đầu với một bước có nhiệt độ 94 - 980C khoảng 20 - 30 giây. Bước 2 (bước lai): Nhiệt độ phản ứng được làm thấp để mồi có thể bắt cặp với mạch khuôn DNA đơn. Liên kết hydrogen giữa mạch khuôn và mồi bắt đầu được hình thành. Liên kết này chỉ được bền vững khi mồi bắt cặp chính xác với mạch khuôn và đoạn ngắn DNA mạch đôi này là nơi DNA polymerase gắn vào và bắt đầu tổng hợp DNA. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi và thông thường khoảng 50-64oC trong thời gian 20 - 40 giây. Bước 3 (bước kéo dài): DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới bổ sung đối với DNA mạch khuôn. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ hoạt động tối ưu của DNA polymerase. Taq DNA polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu 70 - 74oC, trong hầu hết trường hợp nhiệt độ thường được dùng là 72oC. Nối hydrogen giữa đoạn mồi và DNA khuôn phải đủ bền để chịu đựng được nhiệt độ cao. Mồi đã lai với vùng DNA có nhiều base sai sẽ bị tách ra từ khuôn mẫu và không được kéo dài. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào DNA polymerase được sử dụng và chiều dài đoạn DNA mục tiêu cần được khuếch đại. Bước kéo dài cuối cùng kéo dài khoảng 5 - 15 phút (phụ thuộc vào chiều dài mỗi đoạn DNA mẫu), chu kì cuối cùng này được dùng để chắc chắn phần còn lại của chuỗi DNA có thể được kéo dài hoàn toàn. Để kiểm tra có hay không phản ứng PCR tạo ra đoạn DNA cần khuếch đại, điện di trên gel agarose có thể được sử dụng cho sự phân tách các sản phẩm PCR. Kích thước của sản phẩm PCR được xác định bởi thang DNA, chứa đựng những đoạn DNA có kích thước đã được biết chạy dọc trên gel cùng với sản phẩm PCR. Các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy dưới tia UV (bước sóng 312 nm). Phương pháp PCR có độ nhạy rất cao, thao tác lại đơn giản nhưng mức độ ngoại nhiễm cao, sự kém trung thực trong quá trình tổng hợp của Taq polymerase Vì vậy, cần cẩn trọng khi tiến hành thí nghiệm cũng như phân tích kết quả. 24
  34. Đồ Án Tốt Nghiệp 2.3.3.4 Dùng PCR để khuyếch đại đoạn gen ITS Phương pháp PCR do Karl Mullis và ctv phát minh vào năm 1985, là một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Đây là kỹ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuyếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống. Hiện nay, PCR đã trở thành một kỹ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y học để phát hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gene, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gene. Sử dụng cặp mồi ITS1-F và ITS4 để khuếch đại trình tự vùng gene ITS. Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR Mater mix (2x Mytaq HSMix) 12 µl ITS1F ( mồi xuôi) 1 µl ITS4R (mồi ngược) 1 µl DNA 1 µl H2O 10 µl Tổng 25 µl Chu trình nhiệt phản ứng PCR Chu kì phản ứng PCR như sau: 950C trong 5 phút, 35 chu kỳ (940C trong 45 giây, 580C trong 50 giây, 720C trong 1 phút), 720C trong 10 phút, sản phẩm PCR được giữ ở 40C. Sản phẩm PCR được điện di 100V, 30 phút trên gel agarose 1,5%, nhuộm bằng ethidium bromide, quan sát và chụp hình dưới đèn UV. 2.3.3.5 Giải trình tự và định danh Sản phẩm PCR được gửi đi giải trình tự tại công ty Nam Khoa Biotek Company. Công ty Nam Khoa, địa chỉ: 793/58 Trần Xuân Soạn - Phường Tân Hưng Quận 7 - Thành phố HCM - Việt Nam. 25
  35. Đồ Án Tốt Nghiệp Sau khi giải trình tự thì kết quả sẽ được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng để định danh loài và xây dựng cây phân loài. Chromas Pro, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 và Ngân hàng gen 2.3.4 Khảo sát khả năng sinh enzym protease 2.3.4.1 Nguyên tắc Chủng nấm khảo sát được nuôi trên môi trường có bổ sung sữa gầy 1%, chủng nấm có khả năng tiết protease sẽ xuất hiện vòng xung quanh khuẩn lạc. Vì protein trong sữa gầy bị phân hủy [ 2]. 2.3.4.2 Cách thức thực hiện Chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Dùng que cấy vô trùng cấy chủng tuyển chọn lên môi trường LB có bổ sung sữa gầy 1%. Ủ 370C, trong 24 giờ. Quan sát vòng tan xung quanh khuẩn lạc tiết protease. 2.3.5 Khảo sát khả năng sinh enzyme lipase 2.3.5.1 Nguyên tắc Chủng nấm khảo sát được nuôi trên môi trường có bổ sung Tween 80 1%, chủng nấm có khả năng tiết lipase sẽ xuất hiện vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc.Vì lipid bị thủy phân bởi enzyme lipase hình thành glycerol và acid béo. 2.3.5.2 Cách thức thực hiện Chủng nấm được hoạt hóa trong môi trường lỏng, dùng khoan đục lỗ sau đó hút dịch ly tâm 10000rpm/10 phút thu dịch, hút 0,05µl. Ủ tủ ấm trong vòng 7 ngày. Đọc kết quả: Dương tính: xuất hiện vòng trong quang giếng. 26
  36. Đồ Án Tốt Nghiệp Âm tính : không xuất hiện vòng trong quanh giếng . 2.3.6 Khả năng lên mốc chao Nuôi mốc là giai đoạn quan trọng quyết định phẩm chất của sản phẩm chao. Mốc phát triển tốt, hoạt lực thủy phân protease cao hiệu suất thủy phân đạm cao. Đậu hủ sau khi thu mua cắt thành từng miếng nhỏ đều nhau, cho dịch nấm vào sau đó xếp vào khay ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ. 27
  37. Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Kết quả đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử Từ 8 sản phẩm chao được tiến hành phân lập trên môi trường PDA và lựa chọn các khuẩn lạc đặc trưng. Sau nhiều lần phân lập các khuẩn lạc phân lập từ các mẫu chao trên môi trường thạch PDA, người thực hiện đề tài thu được 7 khuẩn lạc có đặc điểm khác nhau được ký hiệu là: Sau đó tiến hành quan sát hình thái dưới kính hiển vi. Hình thái của các khuẩn lạc CM1, CM2, CTP,CVP1, CVP2, CDN và CSG. A B Hình 3.1. Khuẩn lạc, tế bào của chủng CTP trên môi trường PDA trong 72 giờ . A: khuẩn lạc B: tế bào 28
  38. Đồ Án Tốt Nghiệp Kết quả phân lập làm thuần chủng CTP trong sản phẩm chao truyền thống, chủng CTP có khuẩn lạc tròn, màu trắng kem, bề mặt trơn bóng, rìa răng cưa. Hình thái của khuẩn lạc được quan sát dưới kính hiển vi không có khuẩn ty và bào tử, khuẩn lạc có dạng giống hạt cát nhỏ ly ty màu hồng nâu . Kết quả nghiên cứu về đặc điểm nuôi cấy, đặc điểm hình thái và cấu trúc vi học của chủng CTP, có thể kết luận sơ bộ chủng CTP có khả năng là vi khuẩn. A B Hình 3.2. Chủng CM2 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ. A: khuẩn lạc B: khuẩn ty 29
  39. Đồ Án Tốt Nghiệp Kết quả phân lập và làm thuần mẫu CM đạt được 2 khuẩn lạc đặc trưng ký hiệu là CM1 VÀ CM2 . Chủng CM2 có khuẩn lạc màu trắng sữa , bề mặt mịn, phát triển nhanh khắp mặt thạch, có rìa dạng răng cưa. Đặc điểm hình thái được quan sát dưới kính hiển vi chủng CM2 có khuẩn ty nhưng không sinh bào tử, sợi khuẩn ty phân nhánh dạng ống. Dựa vào đặc điểm và hình thái khuẩn lạc có thể nhận định sơ bộ chủng CM2 thuộc chủng nấm . Mặt trước Mặt sau A B Hình 3.3. Chủng CVP2 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng ở 72 giờ. A: khuẩn lạc B: tế bào 30
  40. Đồ Án Tốt Nghiệp Qua kết quả phân lập và làm thuần mẫu CVP đạt được 2 khuẩn lạc ký hiệu là: CVP1 và CVP2. Chủng CVP2 có khuẩn lạc màu trắng kem, bề mặt mịn có vòng tròn đồng tâm ở giữa cả mặt trước và mặt sau, mọc lan khắp đĩa thạch, rìa có dạng răng cưa. Đặc điểm hình thái được quan sát dưới kính hiển vi cho thấy có những đốm nâu không rõ hình dạng.Có thể nhận định rằng chủng CM2 có khả năng thuộc chủng vi khuẩn. Mặt trước Mặt sau A B Hình 3.4. Chủng CVP1 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ A: khuẩn lạc B: tế bào 31
  41. Đồ Án Tốt Nghiệp Chủng nấm CVP1 có khuẩn lạc màu trắng sữa , bề mặt mịn, phát triển nhanh mọc lan khắp đĩa thạch, rìa dạng răng cưa . Hình thái khuẩn lạc được quan sát dưới kính hiển vi nhận thấy rằng có những đường sọc mà nâu đen và những chấm đen . Có thể kết luận sơ bộ chủng CVP1 có khả năng thuộc chủng vi khuẩn. Mặt trước Mặt sau A B C Hình 3.5. Mẫu CM1 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ. A: khuẩn lạc B: khuẩn ty C: bào tử 32
  42. Đồ Án Tốt Nghiệp Khuẩn lạc sau 72 giờ nuôi cấy khuẩn lạc mọc kín đĩa thạch, bề mặt khuẩn lạc xốp, có dạng sợi bông,mép mỏng màu vàng nhạt ở mặt trước, mặt sau có màu vàng cam.Khi bào tử chin chuyển sang màu nâu đen. Dựa vào hình thái sự hình thành sợi khuẩn ty của chủng CM1 cho thấy khuẩn ty có dạng ống, phân chia thành nhiều nhánh, cuốn ngắn và không có vách ngăn trên cuốn khuẩn ty có các bào tử nhỏ hình tròn. Hình thành bào tử 5 – 300C, tối ưu nhất 20 – 250C. Túi bào tử màu nâu đen, bào tử nang hình cầu, hình ovan. Mặt trước Mặt sau A B Hình 3.6. Mẫu CDN trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ. A:khuẩn lạc B: khuẩn ty, bào tử 33
  43. Đồ Án Tốt Nghiệp Đặc điểm của khuẩn lạc sau 48 giờ, khuẩn lạc tròn, mịn, mép dày cả mặt trước và mặt sau đều có màu vàng nhạt mọc nhô cao lên môi trường, sợi nấm ăn sâu vào môi trường . Hình thái của khuẩn lạc được quan sát dưới kính hiển vi khuẩn ty không có vách ngăn túi bào tử hình bầu dục Mặt trước Mặt sau A B Hình 3.7. Mẫu CSG trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. A: khuẩn lạc B: khuẩn ty và bào tử 34
  44. Đồ Án Tốt Nghiệp Khuẩn lạc trên môi trường PDA sau 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng khuẩn lạc phát triển rất nhanh, sợi nấm màu vàng, ở giữa có dạng vân màu trắng cả mặt trên và mặt dưới có màu vàng nhạt, mép mỏng. Hình thái khuẩn lạc được quan sát dưới kính hiển vi khuẩn ty không phân nhánh, không có vách ngăn, bào tử hình tròn, hình cầu, màu nâu đen. Qua kết quả phân lập, làm thuần và quan sát đặc điểm hình thái học có thể kết luận sơ bộ cả 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG thuộc chủng nấm Mucor. Đối chiếu với hệ thống phân loại Mucor [41] [42] [43] và kết quả nghiên cứu về đặc điểm và hình thái của Mucor [12].Từ đó khẳng định rằng cả 3 chủng CM1, CDN và CSG đều thuộc chủng Mucor. Các khuẩn lạc CTP, CM2, CVP2, CVP1 qua kết quả phân lập và quan sát hình thái dưới kính hiển vi có thể nhận định rằng cả 4 khuẩn lạc này có thể là vi khuẩn, nấm men. Đối chiếu với kết quả nghiên cứu vi sinh vật trong chao [17]. Vì chao được lên men tự nhiên nên có sự xâm nhập của nhiều vi sinh vật có cả vi sinh vật bất lợi gây hư hỏng trên chao, có cả vi khuẩn gây bênh trên thực phẩm B.cereus [33]. Chao được lên men từ đậu hủ chủ yếu nhờ vào nấm mốc Mucoracea : Actinomucor, Mucor và Rhizopus [38]. Từ đó tiến hành chọn lọc, chỉ có 3 chủng nấm CM1, CDN và SGN là phù hợp, được tiếp tục nghiên cứu về sinh học phân tử dựa trên vùng gen bảo tồn loài là vùng ITS với cặp mồi là ITS1-F và ITS4-R. Việc lên men chao truyền thống do quá trình sản xuất thủ công được ủ ở điều kiện tự nhiên vì thế chất lượng chao rất dễ nhiễm các vi sinh vật có hại thậm chí nhiễm cả nấm mốc gây độc như Aspergillus Flavus và Aspergillus Parasiticus sinh ra độc tố aflatoxin có thể gây ung thư cho người dùng. 3.2 Định danh các chủng nấm bằng vùng gen ITS Sau khi phân lập và quan sát các đặc điểm hình thái học, các chủng CM1, CDN và CSG được tăng sinh trong môi trường PDB để thu sinh khối và sau đó tiến hành quá trình ly trích và thu nhận DNA bộ gen. 35
  45. Đồ Án Tốt Nghiệp Quá trình định danh bao gồm các bước tách chiết DNA, khuếch đại đoạn DNA bằng phản ứng PCR, điện di kiểm tra sản phẩm PCR, giải trình tự gen và so sánh đoạn trình tự với trình tự gen của các loài cơ sở dữ liệu. NCBI. 3.2.1 Kết quả ly trích thu nhận bộ gen DNA Ly trích DNA là bước rất quan trọng vì nó là yếu tố quyết định đến sự thành công cho phản ứng PCR. Nếu sản phẩm ly trích có quá nhiều tạp chất hoặc DNA bị đứt gãy thì khi thực hiện các phản ứng sẽ không có sản phẩm hoặc có them sản phẩm không mong muốn. CM1 CDN CSG Hình 3.8. Kết quả ly trích bộ gen DNA của 3 chủng CM1,CDN và CSG trên gel agarose 1,5%. Từ hình 3.8 cho thấy kết quả ly trích bộ gen của 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG đều cho kết quả tốt, DNA được ly trích bằng phương pháp CTAB với kết quả này tiếp tục cho phép sử dụng sản phẩm ly trích dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen ITS. 3.2.2 Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS của nấm mốc 36
  46. Đồ Án Tốt Nghiệp Sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen ITS với cặp mồi ITS1-F và ITS4-R cho kết quả trên gel agarose 1,5% kích thước gen từ 600-700 (hình 3.9), chỉ có mẫu CSG cho chiều dài vùng gen khoảng 1000bp. CM1 CDN CSG Thang 1000 bp 600 bp Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 3 chủng CM1, CDN và CSG trên gel agarose 1,5% Kết quả điện di sản phẩm PCR cho kết quả khá tốt, các band sang, rõ và không xuất hiện band phụ . hình 3.9 cho thấy các mẫu nấm đều cho vạch tương đương ở vị trí khoảng 600-700bp, ngoại trừ chủng CSG cho band có kích thước nằm ở khoảng 1000bp. 3.3 Kết quả so sánh vùng gen ITS của 3 chủng CM1, CDN và CSG và thiết lập cây phát sinh loài dựa trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI Sau khi gửi sản phẩm PCR để giải trình tự DNA tại công ty Nam Khoa thì kết quả được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng như phần mềm ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 và Ngân hàng gen dựng cây phát sinh loài. 3.3.1 Trình tự vùng gen ITS của các chủng CM1, CDN VÀ CSG 37
  47. Đồ Án Tốt Nghiệp ChủngCM1:GGGAGAAGTTAATACGATCGGAGGACTGCGGAAGGATCATTAAATAATCAATAATTTTGGCTT GTCCATTATTATCTATTTACTGTGAACTGTATTATTACTTGACGCTTGAGGGATGCTCCACTGCTATAAGGATAG GCGATGGAGATGCTAACCGAGTCATAATCAAGCTTAGGCTTGGTATCCTATTATTATTTACCAAAAGAATTCAG AATTAATATTGTAACATAGACCTAAAAAATCTATAAAACAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCG ATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAAC TTGCGCTCATTGGTATTCCAATGAGCACGCCTGTTTCAGTATCAAAACAAACCCTCTATCCAACATTTTGTTGAA TAGGAATACTGAGAGTCTCTTGATCTATTCTGATCTCGAACCTCTTGAAATGTACAAAGGCCTGATCTTGTTTGA ATGCCTGAACTTTTTTTTAATATAAAGAGAAGCTCTTGCGGTAAACTGTGCTGGGGCCTCCCAAATAATACTTTT TTTAAATTTGATCTGAAATCAGGCGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA. ChủngCDN:CCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAATCCCACCTGATTTCAGATCAAGTTTAAAAGA AGATTTATTTGGGAGGCCCCCAAGACAGTCTTAATAACTAGAGCATTCCTTTATATTAAAAAAATGTTCAGGCT AAAAGAACAATAGTTCAGGCCTAATAATTTTAAAGAATTCAGCGCAAGTCCGAAATTCTCACTTCCATTCACAA CAAAATTGTGGATGTGGGTTGTTGTTGATACTGAAACAGGCGTGCTCAATGGAATACCATTGAGCGCAAGATGC GTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACGTTCTTCATCGATGC GAGAACCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTGTTTTATAAGTTTTTTACGCTTATGTTACAATATTAATTCTGAATT CTTTTGGTAAATAATGAATTAGGATACCAGGCCTAAGCCTGACTTTAGCTAGGTTAACATCCTAAAGACCTATC CCTATAGTCTCCAGGCATCCCTCAAAACGCTAAACAGTAAAACAGTTCACAGTAAATTAGAAATATGCATAA ChủngCSG:TGATGGTTATAGTGAGCATATGGGATCCGGTGGATCGAGCTGGCAACAGCTCTTTCCTGCGGAG AACTATGGCAAACTAGGCTATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGG ATCATTAAATAATCTGATAATTCAATAATTATCTTATTTACTGTGAACTGTTTTTATTTATGACGTAAAAGGGGA TGTCTTTAGGCTATAAGGGTAGGCCTATGGAATGTTAACCTACTCATAGTCTACCTTGATGCTTGGTACCCGATT ATTACTTACCAAAAGAATTCAGTTTAAAATATTGTAACATAGACCTAAAAAATCTATAAAACAACTTTTAACAG TGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAACAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCATGGA ATCATCAAGTCTTTGAACGCATCTTGCACTCAATGGTATTCCATTGAGAACGCCTGTTTCACTATCGAAAACAAC CCTTATTCCCAATTCTTTTTTTGAATACATATGAGTGTACCATCCTTACAAGTTGAGACATTTTAAATAGAGTCA GGCCATATCGTGGATTGAGTGCCGATACTTTTTTAATTTTGAAAAGGTAAAGCATGTTGATGTCCGCTTTTTGGG CCTCACAAATAACTTTTTAAACTTGATCTGACATCAAGTGCGATTACCCGCTGAACTGAAGCATATCAATAACC GGAGGAAAAGAAAATAACAATGATTTCCCCAGTATCGGCGAGTGAAGCAGGAAAGAGCTCAAAGTTGGAACC TGTTTGGCTTAGCTAAACCGGATTGTAAACTGTAGAAACGTTTTCCTGGCACGCCAGATAAATAAGTCCTTTGG AACATGGCATCATTTAGGAG 3.3.2 Thiết lập cây phát sinh loài Sau đó sản phẩn PCR được gửi giải trình tự tại công ty Nam Khoa Bioteck Company. Sử dụng các phần mềm Chromaspro, Seaview4, MEGA5 và website www.ncbi.nlm.nih.gov để phân tích dữ liệu đoạn gen và thiết lập cây phát sinh loài. 38
  48. Đồ Án Tốt Nghiệp Rhizomucor Variabilis Mucor Racemosus CM1 Mucor Circinelloides Penicillium Crustosum CSG Mucor Indicus Mucor Lilianae Mucor Rudolphii Mucor Irregularis CDN Rhizomucor Variabilis Leaf LiterAscomycete Ambomucor Seriatoinflatus Hình 3.10. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS các chủng CM1, CDN và CSG với các chủng nấm trên ngân hàng gen NCBI Từ kết quả sản phẩm nhân bản vùng gen ITS, các mẫu DNA được gửi giải trình tự gen tại công ty Nam Khoa, sau đó trình tự gen được sử dụng các phần mềm sinh tin học và BLAST các dữ liệu gen khác có trên ngân hàng gen NCBI. Kết quả thu được cây phát sinh loài (hình 3.10). Tiến hành so sánh vùng gen của các mẫu phân lập với vùng gen bảo tồn ITS của các chủng nấm trên ngân hàng gen NCBI, các đặc điểm hình thái học của các chủng tương đồng và các nghiên cứu đã được công bố, có được kết quả như sau: Chủng CM1 có mối quan hệ gần nhất với loài Mucor circinelloides KU899095.1, Mucor racemosus JQ683250.1, Penicillium crustosum JN226961.1 và Rhizomucor variabilis KM205636.1 đều có mức tương đồng 100% , dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và đặc điểm hình thái học thì chủng CM1 là loài Mucor racemosus. 39
  49. Đồ Án Tốt Nghiệp Trong công bố cải tiến bánh men thuốc bắc M.racemosus đã được phân lập và đạt hiệu suất lên men cao[7]. Chủng CDN có mối quan hệ gần nhất với loài Mucor irregularis KY425732.1 có mức tương đồng 99% và Rhizomucor variabilis HQ908494.1 có mức tương đồng 100%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và đặc điểm hình thái học thì chủng CDN là loài Rhizomucor variabilis Chủng CSG có mối quan hệ gần nhất với loài Mucor indicus KT359356.1 có mức tương đồng 96% và so sánh đặc điểm hình thái thì có thể kết luận chính là loài Mucor indicus. Các loài Mucor góp phần rất lớn vào kết cấu hương vị và đặc điểm dinh dưỡng của nhiều sản phẩm lên men[15]. Các loài Mucor được sử dụng cho các thực phẩm lên men, đặc biệt đối với các sản phẩm lên men truyền thống của Châu Á và Châu Phi như sufu, ragi, tempeh, furu và mureha. Đặc biệt Mucor thường gặp nhất trong pho mát . Mucor còn có trong xúc xích và được tìm thấy trong các loại xúc xích truyền thống được sản xuất ở Hy Lạp [30] và Ý [13]. Mucor có trong các sản phẩm có nguồn gốc từ đậu nành cụ thể là Douchi, Sufu (Trung Quốc).[25] Một số nghiên cứu báo cáo sự hiện diện của nhiều loài Mucor trong Marcha hoặc các sản phẩm lên men của nó [27] Ngoài ra Mucor còn đóng góp vào quá trình tạo ra mùi thơm đặc trưng của cồn[23] [26]. Mucor spp đã được báo cáo trong salad Châu Phi (Abacha) một món ăn truyền thống của Nigeria [29]. 3.3.3 Kết quả khảo sát protease Từ 7 chủng phân lập qua kết quả sàng lọc thuộc chủng Mucor tiến hành thử nghiệm khả năng sinh enzyme protease. 40
  50. Đồ Án Tốt Nghiệp Việc khảo sát sơ bộ khả năng sinh enzyme casein của các chủng Mucor được xác định thông qua đường kính phân giải casein (Hình 3.11). CDN CM1 CSG Hình 3.11. Khả năng sinh caseinase của 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG. Kết quả thử nghiệm khả năng sinh enzyme caseinase cho thấy các chủng phân lập được chỉ có mẫu CDN có khả năng sinh caseinase thể hiện bằng đường kính vòng phân giải casein xung quanh khuẩn lạc (hình 3.11). 3.3.4 Kết quả khảo sát lipase Khảo sát sơ bộ khả năng sinh enzyme lipase của các chủng nấm được xác định thông qua đường kính vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. 41
  51. Đồ Án Tốt Nghiệp CM1 CDN CSG Hình 3.12. Kết quả sinh enzyme lipase của 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG. Kết quả thử nghiệm sinh enzyme lipase cho thấy các chủng phân lập không có khả năng sinh lipase, không xuất hiện vòng phân giải sau 7 ngày nuôi cấy. 3.3.5 Khả năng lên men chao của 3 chủng nấm CM1,CDN và CSG TH1 CDN CSG Hình 3.13. Khảo sát khả năng lên mốc chao của 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG. 42
  52. Đồ Án Tốt Nghiệp Dựa vào kết quả thí nghiệm (hình 3.13) được thực hiện cho dịch nuôi cấy nấm lên đậu hũ cắt nhỏ đều nhau , xếp vào khay ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ. Kết quả cho thấy đậu hủ ngã sang màu vàng nhạt mịn , mọc khuẩn ty không có mốc xanh, mốc đen phát triển, không có mùi khó ngửi, đạt tiêu chuẩn lên men chao tốt. 43
  53. Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Từ 9 mẫu chao ban đầu đã phân lập được 7 khuẩn lạc, qua sàng lọc sơ bộ hình thái học chọn lọc được 3 chủng nấm.Kết quả hình thái học của khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử cho thấy rằng cả 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG có khả năng thuộc chi Mucor Sau đó tiến hành định danh bằng sinh học phân tử trên vùng gene bảo tồn ITS. Sau khi tiến hành giải trình tự các gene dựa trên đoạn mồi ITS so sánh dữ liệu gene với mức tương đồng giữ chủng phân lập với chủng nấm trên ngân hàng dữ liệu gene NCBI và cùng với kết hợp hình thái khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử giúp khẳng định lại kết quả nêu trên . Theo đó chủng chủng CM1 là loài Mucor racemosus với mức tương đồng 100% JQ683250.1, CDN có thể là loài Rhizomucor Variabilis HQ908494.1có mức tương đồng 100%, CSG có thể là loài Mucor indicus KT359356.1 có mức tương đồng 96%. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme protease cho thấy không có tác dụng với chủng CSG và CM1, CDN tạo vòng phân giải. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme lipase không có tác dụng với cả 3 chủng nấm. Kết quả khảo sát khả năng lên mốc chao cho thấy đạt khả năng lên men tốt, đậu hủ chuyển sang màu ngả vàng, mịn. Không bị tạp nhiễm. Từ kết quả cho thấy chao được lên men truyền thống, ủ ở điều kiện tự nhiên vì thế rất dễ nhiễm các vi sinh vật gây hại giảm chất lượng hương vị của chao. Điều đó cũng cho thấy rằng mức độ chao bị nhiễm tạp khuẩn là rất lớn thậm chí có những vi sinh vật có nguy cơ gây độc ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng . Hiện nay kết quả phân lập các chủng nấm CM1, CSG và CDN đã được công ty TNHH Thực Phẩm Dương Nhi đang sử dụng trong sản xuất chao. 4.2 Kiến nghị 44
  54. Đồ Án Tốt Nghiệp Khảo sát các đặc tính sinh hóa của các chủng nấm . Cải tiến quy trình sản xuất chao truyền thống. Tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng của nấm. Nâng cao chất lượng của mốc giống để đạt độ ổn định cao. 45
  55. Đồ Án Tốt Nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Ngô Thế Dân và cộng sự (1999). Cây đậu tương. Nhà xuất bản Nông Nghiệp,TP.HCM. [2] Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại Học và Trung Học Chuyên Nghiệp, Hà Nội. [3] Nguyễn Danh Đông (1982). Trồng cây đậu tương. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP.HCM. [4] Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Đỗ Thị Luyn, Lê Tấn Hưng, Trần Thị Thanh (2001). Nghiên cứu sản xuất bào tử nấm mốc Aspergillus oryzae.Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học công nghệ (1999 – 2000). [5] Nguyễn Thị Hiền và Vũ Thy Thư (2004). Hóa sinh học, nhà xuất bản đại học sư pham, Hà Nội. [6] Nguyễn Thị Hiền ( 2006). Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia, TPHCM. [7]Nguyễn Thị Thanh Hồng (2008). Khảo sát đặc điểm lên men giống sử dụng trong sản xuất bánh men thuốc bắc tại Phong Điền, Cần Thơ. Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại Học Cần Thơ, Cần Thơ. [8] Nguyễn Đức Lượng (2006). Thực phẩm lên men truyền thống tập 3.Đại học Quốc Gia, TPHCM . [9] Nguyễn Hữu Phúc (1998). Các phương pháp lên men thực phẩm truyền thống ở Việt Nam và các nước trong vùng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP.HCM. [10] Lê Minh Nguyệt và Phan Thị Phương Thảo (2012). Xây dựng quy trình sản xuất giống khởi động cho sản xuất chao từ nấm mốc Mucor elegans. Tạp chí khoa học và phát triển 2012, tập 10 (số 5), 771 - 778. 46
  56. Đồ Án Tốt Nghiệp [11] Nguyễn Văn Thành và Trần Nguyễn Ngọc Quỳnh (2011). Nghiên cứu sản xuất starter Actinomucor elegans có mật số và sức sống cao dùng cải tiến chất lượng chao truyền thống. Tạp chí khoa học trường đại học Cần Thơ, số 19(a), 194-203. Tài liệu nước ngoài [12] A.Botha and A.Botes (2014). Encyclopedia Of Food Microbiology, Stellenbosch Matieland, South Africa. [13] Cocolin, L., Urso, R., Rantsiou, K., Cantoni, C., Comi, G., (2006). Dynamics and characterization of yeasts during natural fermentation of Italian sausages. FEMS Yeast Res. 6, 692 - 701. [14] Daniel K.Manter, Jorge M.Vivanco, 2007.Use of the ITS primer, ITS1F and ITS4, to characterize fungal abundance and diversity in mixed – template samples by qPCR and length heterogeneity analysis. Journal of Microbiological Methods, Vol 7.,No.1.,pp:7 – 14 [15]Fox, P.F., McSweeney, P.,(2004).Cheese: an overview. In: Fox, P.F., McSweeney, P.L.H., Cogan, T.M., Guinee, T.P. (Eds.), Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. Academic Press, New York, pp1-18. [16] Guarro Josep, Gené Josepa and Stchigel Alberto M.,(1999). Developments in fungal taxonomy. Clinical Microbiology Reviews, Vol.12, No.3.,pp:454 – 500 [17]Han, B-Z., Beumer, R.R ., Rombouts, F.M and Nout, M.J.R (2001a). Microbiologial safely and quality of commercical sufu – a Chinese fermented soybean food. Food control, 12, 541 – 547. [18] Han B-Z, Rombouts, F.M., Nout, M.J.R. (2001). A chinese fermented soybean food. International Journal of Food Microbiology 65, p 1-10. [19] Han B-Z (2003). Charecterization and product Innovation Of Sufu – A Chinese Fermented Soybean Food, University Wageningen, Nertherland 47
  57. Đồ Án Tốt Nghiệp [20] Han, B.-Z., Kuijpers, A.F.A., Thanh, N.V., Nout, M.J.R., (2004). Mucoraceous moulds involved in the commercial fermentation of Sufu Pehtze. Antonie Van Leeuwenhoek 85, 253 – 257 [21] Hayaloglu, A.A., Kirbag, S., (2007). Microbial quality and presence of moulds in Kuflu cheese. Int. J. Food Microbiol. 115, 376 – 380 [22] Hermet, A., Meheust, D., Mounier, J., Barbier, G., jany, J.-L., (2012). Molecular systematics in the genus Mucor with special regards to species encountered in cheese. Fungal Biol. 116, 692 - 705. [23] Hesseltine, C.W., 1992. Food fermentations: mucorales in ragi and related products. In: Leatham, G.F. (Ed.), Frontiers in Industrial Mycology. Chapman and Hall, New York, pp. 24 - 39. [24] Huang, H.T., Dooley, J.G., 1976. Enhancement of cheese flavors with microbial esterases. Biotechnol. Bioeng. 18, 909 - 919. [25] Kang, M.G., 2001. Handbook of Technology for Chinese and Foreign Fermented Foods. Chemical Industrial Press, Beijing, China, pp. 99 - 111. [26] Karimi, K., Zamani, A., 2013. Mucor indicus: biology and industrial application perspectives: a review. Biotechnol. Adv. 31, 466 - 481. [27] Lv, X.-C., Chen, Z.-C., Jia, R.-B., Liu, Z.-B., Zhang, W., Chen, S.-J., Rao, P.-F., Ni, L., 2015. Microbial community structure and dynamics during the traditional brewing of Fuzhou Hong Qu glutinous rice wine as determined by culture-dependent and culture-independent techniques. Food Control. 57, 216 - 224. [28] Nout, M., Aidoo, K.E., 2002. Asian fungal fermented food. In: Hoffrichter, M. (Ed.), Industrial Applications. Springer Berlin, pp. 23 - 47. The Mycota X. [29] Oranusi, S.U., Braide, W., Eze, U.C., Chinakwe, E., 2013. Quality aspects of African salad. J. Emerg. Trends Eng. Appl. Sci. 4, 287 - 292. 48
  58. Đồ Án Tốt Nghiệp [30] Papagianni, M., Ambrosiadis, I., Filiousis, G., (2007). Mould growth on traditional greek sausages and penicillin production by Penicillium isolates. Meat Sci. 76, 653 – 657 [31] T. R. Prabha, K. Revathi1, M. S. Vinod, S. P. Shanthakumar and Paul Bernard (2013). A simple method for total genomic DNA extraction from water moulds. Current science. 104(3): 345-346. [32]Pontecorvo, A.J and Bourne, M.C (1978). Simple methods for extending the shelf life of soy curd (tofu) in tropical areas, Journal of Food Science, 43, 969 – 972. [33]Granum, P.E (1994).Bacillus cereus and its toxins, Journal of Applied Bacteriology Supplement, 76, S61 – S66. [34] Préstamo, G. and Fontecha, J. (2007). High pressure treatment on the tofu fatty acids and acylgycerols content, Innovative Food Science And Emerging Technologies, 8, 188 – 191. [35]Shambuyi,M.,.Beuchat,L.R,Hung, Y.C., and Nakayama,T (1992). Evaluation of subtrates and strorage conditions for preparing and maintaining stater cultures for tempeh fermentation. International Journal of Food Microbiology 15, 77-85. [36]Thanh, N.V., and Nout, M.J.R., 2004.Dormancy, activacation and viability of Rhizopus oligosporus sporangiospores. International Journal of Food Microbiology 92, 171-179 [37] Thanh, N.V., and Nout, M.J.R. (2002). Rhizopus oligosporus biomass, sporangiospores yield and viability as influenced by harvesting age and processing conditions. International Journal of Food Microbiology 19, 91-96. [38] Wang, H-L., and Hesseltine, C.W (1970). Sufu and Lao-Chao, Journal of Agricultural and Food chemistry, 18(4), 572 – 575. [39] Wang, H.L, Swain, E.W and Hesseltine, C.W(1975). Mass production of Rhizopus oligosporus spores and their application in tempeh fermentation, Journal of food science 40, 168-170 49
  59. Đồ Án Tốt Nghiệp Tài liệu từ Internet [40] [42] [43] [44] 50
  60. Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường Môi trường nuôi cấy : PDA (Potato Dextrose Agar) Dịch chiết khoai tây 20% Dextrose 2% Agar 2% Chloramphenycol 100 mg Sodium propionate 2 g pH 5.6 H2O 1000 ml Môi trường thử hoạt tính protease: LB (Luria Bertani) – bổ sung 1% sữa gầy Peptone 10g Agar 2% Cao nấm men 5g NaCl 5g H2O 1000ml Môi trường thử hoạt tính Lipase: với Tween 80 Peptone 10g NaCl 5g CaCl2.2H2O 0,1g Agar 9g pH 7,4 H2O 1000ml 1
  61. Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC B: Kết quả cấy phân lập nấm ban đầu 2
  62. Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC C: Kết quả vùng gen bảo tồn ITS Chủng CM1 CM1 3
  63. Đồ Án Tốt Nghiệp Chủng CDN 4
  64. Đồ Án Tốt Nghiệp Chủng CSG 5
  65. Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC D: Kết quả trình tự vùng gen của các chủng so sánh trên NCBI Mucor circinelloides KU899095.1 GATGGAGATGCTAACCGAGTCATAATCAAGCTTAGGCTTGGTATCCTATTATTATTTACCAAAAGAA TTCAGAATTAATATTGTAACATAGACCTAAAAAATCTATAAAACAACTTTTAACAACGGATCTCTTG GTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATC ATCGAGTCTTTGAACGCAACTTGCGCTCATTGGTATTCCAATGAGCACGCCTGTTTCAGTATCAAAA CAAACCCTCTATCCAACATTTTGTTGAATAGGAATACTGAGAGTCTCTTGATCTATTCTGATCTCGA ACCTCTTGAAATGTACAAAGGCCTGATCTTGTTTGAATGCCTGAACTTTTTTTTAATATAAAGAGAA GCTCTTGCGGTAAACTGTGCTGGGGCCTCCCAAATAATACTTTTTTTAAATTTGATCTGAAATCAGG CGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA Rhizomucor variabilis KM205636.1 GATGGAGATGCTAACCGAGTCATAGTCAAGCTTAGGCTTGGTATCCTATTATTATTTACCAAAAGAA TTCAGAATTAATATTGTAACATAGACCTAAAAAATCTATAAAACAACTTTTAACAACGGATCTCTTG GTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATC ATCGAGTCTTTGAACGCAACTTGCGCTCATTGGTATTCCAATGAGCACGCCTGTTTCAGTATCAAAA CAAACCCTCTATCCAACATTTTGTTGAATAGGAATACTGAGAGTCTCTTGATCTATTCTGATCTCGA ACCTCTTGAAATGTACAAAGGCCTGATCTTGTTTGAATGCCTGAACTTTTTTTTAATATAAAGAGAA GCTCTTGCGGTAAACTGTGCTGGGGCCTCCCAAATAATACTTTTTTTAAATTTGATCTGAAATCAGG CGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA Penicillium crustosum JN226961.1 GATGGAGATGCTAACCGAGTCATAATCAAGCTTAGGCTTGGTATCCTATTATTATTTACCAAAAGAA TTCAGAATTAATATTGTAACATAGACCTAAAAAATCTATAAAACAACTTTTAACAACGGATCTCTTG GTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATC ATCGAGTCTTTGAACGCAACTTGCGCTCATTGGTATTCCAATGAGCACGCCTGTTTCAGTATCAAAA CAAACCCTCTATCCAACATTTTGTTGAATAGGAATACTGAGAGTCTCTTGATCTATTCTGATCTCGA ACCTCTTGAAATGTACAAAGGCCTGATCTTGTTTGAATGCCTGAACTTTTTTTTAATATAAAGAGAA GCTCTTGCGGTAAACTGTGCTGGGGCCTCCCAAATAATACTTTTTTTAAATTTGATCTGAAATCAGG CGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATC Mucor racemosus JQ683250.1 GATGGAGATGCTAACCGAGTCATAGTCAAGCTTAGGCTTGGTATCCTATTATTATTTACCAAAAGAA TTCAGAATTAATATTGTAACATAGACCTAAAAAATCTATAAAACAACTTTTAACAACGGATCTCTTG GTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATC ATCGAGTCTTTGAACGCAACTTGCGCTCATTGGTATTCCAATGAGCACGCCTGTTTCAGTATCAAAA CAAACCCTCTATCCAACATTTTGTTGAATAGGAATACTGAGAGTCTCTTGATCTATTCTGATCTCGA ACCTCTTGAAATGTACAAAGGCCTGATCTTGTTTGAATGCCTGAACTTTTTTTTAATATAAAGAGAA GCTCTTGCGGTAAACTGTGCTGGGGCCTCCCAAATAATACTTTTTTTAAATTTGATCTGAAATCAGG CGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA 6
  66. Đồ Án Tốt Nghiệp Rhizomucor variabilis HQ908494.1 CCCCAAGACAGTCTTAATAACTAGAGCATTCCTTTATATTAAAAAAATGTTCAGGCTAAAAGAACA ATAGTTCAGGCCTAATAATTTTAAAGAATTCAGCGCAAGTCCGAAATTCTCACTTCCATTCACAACA AAATTGTGGATGTGGGTTGTTGTTGATACTGAAACAGGCGTGCTCAATGGAATACCATTGAGCGCA AGATGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACG TTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTGTTTTATAAGTTTTTTACGCTTATG TTACAATATTAATTCTGAATTCTTTTGGTAAATAATGAATTAGGATACCAGGCCTAAGCCTGACTTT AGCTAGGTTAACATCCTAAAGACCTATCCCTATAGTCTCCAGGCATCCCTCAAAACGCTAAACAGT AAAACAGTTCACAGTAAATTAGAAATATGCATAA Mucor irregularis KY425732.1 CCCCAAGACAGTCTTAATAACTAGAGCATTCCTTTATATTAAAAAAATGTTCAGGCTAAAAGAACA ATAGTTCAGGCCTAATAGTTTTAAAGAATTCAGCGCAAGTCCGAAATTCTCATTTCCATTCACAACA AAATTGTGGATGTGGGTTGTTGTTGATACTGAAACAGGCGTGCTCAATGGAATACCATTGAGCGCA AGATGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACG TTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTGTTTTATAAGTTTTTTACGCTTATG TTACAATATTAATTCTGAATTCTTTTGGTAAATAATGAATTAGGATACCAGGCCTAAGCCTGACTTT AGCTAGGTTAACATCCTAAAGACCTATCCCTATAGTCTTTAAGCATCCCTCAAAACGCTAAACAGTA AAACAGTTCACAGTAAATTAGAAATATGC Leaf litter ascomycete AF502720.1 AGTCTTAATAACTNGNNCATTCCTTTATATTAAAAAAATGTTCAGGCTAAAAGAACAATAGTTCAG GCCTAATANTTTTAAAGAATTCAGCGCAAGTCCGAAATTCTCATTTCCATTCACAACAAAATTGTGG ATGTGGGTTGTTGTTGATACTGAAACAGGCGTGCTCAATGGAATACCATTGAGCGCAAGATGCGTT CAAAGACTCGATGATTCACTGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACGTTCTTCATC GATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTGTTTTATAAGTTTTTTACGCTTATGTTACAATA TTAATTCTGAATTCTTTTGGTAAATAATGAATTAGGATACCAGGCCTAAGCCTGACTTTANNTAGGT TAACATCCTAAAGACCTATCCCTATAATCTTTAGGCAATCCCTCAAAACGCTAAACAGTAAAACAG TTCACAGTAAATTAGAAAT Mucor indicus KT359356.1 TATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAAATA ATCTGATAATTCAAAAATTATCTTATTTACTGTGAACTGTTTTTATTTATGACGTATAAGGGGATGTC TTTAGGCTATAAGGGTAGGCCTATGGAATGCTAACCTAGTCATAGTCAAGCTTGATGCTTGGTACCC GATTATTACTTACCAAAAGAATTCAGTTTAAAATATTGTAACATAGACCTAAAAAATCTATAAAAC AACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGT GTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCATCTTGCACTCAATGGTATTCCATTGA GTACGCCTGTTTCAGTATCAAAAACAACCCTTATTCAAAAATTTTTTTTGAGTAGATATGAGTGTAG CAACCTTACAAGTTGAGACATTTTAAATAAAGTCAGGCCATATCGTGGATTGAGTGCCGATACTTTT TTAATTTTGAAAAGGTAAAGCATGTTGATGTCCGCTTTTTGGGCCTCCCAAATAACTTTTTAAACTT GATCTGAAATCAGGTGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAAAT AACAATGATTTCCCCAGTAACGGCGAGTGAAGAGGAAAGAGCTCAAAGTTGGAACCTGTTTGGCTT 7
  67. Đồ Án Tốt Nghiệp AGCTAAACCGGATTGTAAACTGTAGAAACGTTTTCCTGGCACGCCAGATAAATAAGTCCTTTGGAA CAGGGCATCAT Mucor lilianae KT736106.1 TATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAAATA ATTTGATATTTTCCTTTGGGATAAATATTCTTATTTACTGTGAACTGTATTATTACTTGATGTTTGAG GGATGTTCAGTAGCCATAATGGGTAGGCAATTGAAATGTTAACCGAATCAAGGTCAAGCTTAGGCT TGGTACCCTATTATTATTTACCAAAAGAATTCAGTATAAATATTGTAACATAGACCTAAAAAATCTA TAAAACAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATA ACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCATCTTGCACTCATTGGTATTC CAATGAGTACGCCTGTTTCAGTATCAAAAACACCCCACATTTAAAACTTTGTTTTGAATGGAATTGA GGGCAAACGGCATTACTGCTGTTCCCTTTAAAACTATTAGGCCTGAATTTGTTTTTCTGCCTGAACTT TTTTTTAATATAAAGGAAAGTACTTGCTAAAGACTCTCTTGGGGCCTCCCAAATAAATCTTTCTTAA ACTTGATCTGAAATCAGGTGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAA AATAACAATGATTTCCCCAGTAACGGCGAGTGAAGAGGAAAGAGCTCAAAGTTGGAACCTGTTTGG CTTAGCTAAACCGGATTGTAAACTGTAGAAGTGTTTTCCAGGCACGCCAGGTAAAAAAGTCCTTTG GAACAGGGCATCAT Mucor rudolphii KT736105.1 TATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAAATA ATTTGATATTTTCCTTTGGGATAAATATTCTTATTTACTGTGAACTGTATTATTACTTGATGTTTGAG GGATGTTCAGTAGCCATAATGGGTAGGCAATTGAAATGTTAACCGAATCAAGGTCAAGCTTAGGCT TGGTACCCTATTATTATTTACCAAAAGAATTCAGTATAAATATTGTAACATAGACCTAAAAAATCTA TAAAAACAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGAT AACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCATCTTGCACTCATTGGTATT CCAATGAGTACGCCTGTTTCAGTATCAAAAACACCCCACATTTAAAACTTTGTTTTGAATGGAATTG AGGGCAAACGGCATTACTGCTGTTCCCTTTAAAACTATTAGGCCTGAATTTGTTTTTCTGCCTGAAC TTTTTTTTAATATAAAGGAAAGTACTTGCTAAAGACTCTCTTGGGGCCTCCCAAATGAATCTTTCTTA AACTTGATCTGAAATCAGGTGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGA AAATAACAATGATTTCCCCAGTAACGGCGAGTGAAGAGGAAAGAGCTCAAAGTTGGAACCTGTTTG GCTTAGCTAAACCGGATTGTAAACTGTAGAAGTGTTTTCCAGGCACGCCAGGTAAAAAAGTCCTTT GGAACAGGGCATCAT Ambomucor seriatoinflatus AY743664.1 TATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAAATA ATTTGATATTCTAGCTTCGGCTTAGCAATATTTTATTTACTGTGAACTGTATTATTATTTGACGCTTG AGGAATGTTTGCTGGCTATATGGGTAGGCCAGCAGAATGTTAACCGAGTCATAATCAAGCTTAGGC TTGGTATCCTATTATTATTTACCAAAAGAATTCAGTATTAATATTGTAACATAGACCTAAAAAATCT ATAAAAACAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGA TAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCATCTTGCACTCATTGGTAT TCCAATGAGTACGCCTGTTTCAGTATCAAAAACACCCCACACCCAAAACTTGCTTTTGAGTGGAACT GGGGGCAACAGTCTTTACGGCTGTTCCCCTTAAAAATATTAGGCCTGAACTTGTTTTGTCTGCCTGA ACTTTTTTTTAATATAAAGGAAAGCTCTTGCCAACTAAAACTTTATTGGGGCCTCCCAAATAAATCT 8
  68. Đồ Án Tốt Nghiệp ATCTTAAATTTGATCTGAAATCAGGTGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGG AAAAGAAAATAACAATGATTTCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGAGGAAAGAGCTCAAAGTTGGAAC CTGTTTGGCTTAGCTAAACCGGATTGTAAACTGTAGAAGTGTTTTCCAGGCACGCCAGGTAAAAAA GTCCTTTGGAACAGGGCATCAT 9