Đồ án Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus (CS1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản

97 trang thiennha21 12/04/2022 7240

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus (CS1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_khao_sat_kha_nang_khang_nam_sinh_aflatoxin_cua_bacillu.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus (CS1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM SINH AFLATOXIN CỦA BACILLUS (CS1b) VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN NÔNG SẢN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện : Trịnh Thị Cẩm Tú MSSV: 1211100227 Lớp: 12DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2016
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu , kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đồ án này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Đồ án đã được chỉ rõ nguồn gốc. Học viên thực hiện đồ án Trịnh Thị Cẩm Tú i
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hoàn thành tốt khóa học 2012 – 2016. Em xin cảm ơn thầy cô trong Khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quan trọng tạo nền tảng kiến thức vững chắc để hoàn thành tốt Đồ án và sau này có thể ứng dụng vào công việc thực tiễn. Em xin cảm ơn thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp cho em thực hiện và hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoài Hương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện để em hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này. Và em cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khóa đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ, động viên khích lệ tinh thần , cùng trải qua những khó khăn trong suốt quá trình thực hiện Đồ án tốt nghiệp của mình. Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, gia đình đã luôn bên cạnh, cỗ vũ động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để con có thể hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này. TP. HCM, Ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thục hiện Trịnh Thị Cẩm Tú ii
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1 Các nấm gây hại trên hạt 4 1.1.1 Tình trạng nhiễm nấm gây hại trên hạt ngũ cốc 4 1.1.2 Tình trạng nhiễm nấm trước thu hoạch 5 1.1.3 Tình trạng nhiễm nấm sau thu hoạch 5 1.1.4 Độc tố của nấm 6 1.2 Các phương pháp kháng nấm gây bệnh cho nông sản 11 1.2.1 Kháng nấm bằng phương pháp hóa học 11 1.2.2 Kháng nấm bằng phương pháp sinh học: 12 1.3 Một số vi sinh vật điển hình có khả năng đối kháng nấm gây bệnh trong nông sản. 15 1.3.1 Nấm Trichoderma spp 15 1.3.2 Lactobacillus spp. 17 1.3.3 Bacillus subtilis spp 19 1.4 Cơ chế kháng nấm của vi khuẩn 21 1.4.1 Cấu tạo thành tế bào của một số nấm gây hại nông sản 21 1.4.2 Cơ chế tác động của một số enzyme ngoại bào. 23 1.4.3 Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất. 25 1.4.4 Một số phương pháp thu enzyme và hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy vi khuẩn 26 1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng màng bao trong bảo quản hạt 30 1.6 Một số nghiên cứu nước ngoài ứng dụng hợp chất thứ cấp của Bacillus spp 31 1.7 Một số nghiên cứu trong nước ứng dụng hợp chất thứ cấp của Bacillus spp 32 iii
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 33 2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất 33 2.2.1 Vật liệu 33 2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 33 2.2.3 Môi trường - Hóa chất 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu 35 2.3.1 Mục đích 35 2.3.2 Mục tiêu 35 2.3.3 Nội dung 35 2.4 Bố trí thí nghiêm và phương pháp 36 2.4.1 Khảo sát khả năng đối kháng nấm. 36 2.4.2 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của VK có hoạt tính kháng nấm trong bảo quản hạt 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp. CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng nấm cho vi khuẩn Bacillus sp. CS1b 50 3.2 Xác định thời gian nuôi cấy để khả năng đối kháng nấm CĐP1 cực đại 51 3.2.1 Dịch nuôi cấy sau ly tâm 51 3.2.2 Dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý nhiệt 53 3.2.3 So sánh khả năng đối kháng dịch nuôi cấy sau ly tâm với nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b ở từng thời gian nuôi cấy và điều kiện xử lý nhiệt 53 3.3 Khảo sát khả năng đối kháng nấm của protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b sau ly tâm. 55 3.3.1 Quy trình thu hồi protein kết tủa có hoạt tính sinh học 55 3.3.2 Định tính enzyme protease, chitinase, 휷- glucanase của protein kết tủa. 56 3.3.3Khảo sát khả năng đối protein kết tủa với CĐb1 59 3.4 Khảo sát khả năng đối kháng cao ethyl acetate với CĐb1. 60 3.4.1 Quá trình thu cao EA 60 iv
Đồ án tốt nghiệp 3.4.2 Khảo sát sự ức chế của cao EA với nấm CĐP1 61 3.5 Khảo sát thành phần hóa học của các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Bacillus sp. CS1b có hoat tính kháng nấm. 64 3.6 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của VK có hoạt tính kháng nấm trong bảo quản hạt. 66 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76 4.1 Kết luận 76 4.2 Kiến nghị 76 TÀI LIỆU KHAM KHẢO VÀ PHỤ LỤC 78 TÀI LIỆU KHAM KHẢO 78 PHỤ LỤC 1 v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIẾT TẮT AFPA: Aspergillus flavus and parasiticus agar EA: ethyl acetate NA: Nutrient agar NB: Nutrient broth MT: Môi trường PDA: Potato dextrose agar HPLC: High pressure liquid chromatography TLC: Thin layer chromatography UV: Ultraviolet VK: vi khuẩn vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Ảnh hưởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý ở vật nuôi 9 Bảng 1.2: Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học 13 Bảng 1.3: Các thành phần chính của thành tế bào ở một số nấm 22 Bảng 1.4: Cơ chế tác động của mộ số hợp chất thứ cấp 26 Bảng 2.1: Bố trí các thí nghiệm tạo màng bao hạt đậu phộng 47 Bảng 3.1: Tỷ lệ đối kháng (%) của dịch nuôi cấy VK CS1b với nấm CĐP1. 53 Bảng 3.2: Đường kính phân giải của enzyme của protein kết tủa bằng ethanol 56 Bảng 3.3: Khả năng đối kháng với CĐP1 của protein kết tủa bằng ethanol 58 Bảng 3.4: Tỷ lệ đối kháng (%) theo từng nồng độ của cao ethyl acetate với nấm CĐP1 .63 Bảng 3.5: Định tính một số chất có trong dịch sau ly tâm, protein kết tủa và cao ethyl acetate 63 Bảng 3.6: Khả năng ức chế nấm mốc và vi khuẩn phát triển trên hạt đậu phộng được bao màng chitosan và sản phẩm trao đổi chất CS1b 66 Bảng 3.7:Kết quả ứng dụng hợp chất thứ cấp bảo quản đậu phộng . 71 vii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH Hình 2.1: Sơ đồ khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm. 36 Hình 2.2: Sơ đồ thu sinh khối nấm CĐP1. 37 Hình 2.3: Quy trình thu hồi protein kết tủa bằng ethanol 960 40 Hình 2.4: Quy trình thu hồi cao EA 42 Hình 2.5: Sơ đồ ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng bằng màng bao chitosan 46 Hình 3.1: Nấm CĐP1 trong môi trường PDB 49 Hình 3.2: Kết quả đối kháng của dịch sau ly tâm của VK CS1b với nấm CĐP1 51 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b ở từng thời gian nuôi cấy và từng điều kiện xử lý dịch sau ly tâm 54 Hình 3.4: Khả năng phân giải chitin của protein kết tủa. 56 Hình 3.5: Khả năng phân giải casein của protein kết tủa. 57 Hình 3.6 Khả năng phân giải 훽 − 푛 của protein kết tủa 57 Hình 3.7: Khả năng ức chế nấm mốc CĐP1 của dung dịch protein kết tủa 59 Hình 3.8: Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của cao EA .61 Hình 3.9: : Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của cao EA, 62 Hình 3.10: Định tính một số chất có trong dịch nuôi cấy ly tâm (i), protein kết tủa (ii), 64 Hình 3.11: Định tính lipid. 65 Hình 3.12: Sơ đồ chuẩn bị sinh khối nấm CĐP1 72 Hình 3.13: Quy trình công nghệ sản xuất cao EA .73 viii
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Lương thực, thực phẩm đặc biệt là các nông sản chính như thóc, gạo, ngô, khoai, sắn, đậu, đỗ và lạc là nguồn năng lượng chính nuôi sống loài người. Vì thế, việc nghiên cứu để nâng cao chất lượng nông sản là vấn đề được các tổ chức quốc tế cũng như các cơ quan khoa học về lương thực, thực phẩm của thế giới đặc biệt quan tâm. Việc nâng cao chất lượng nông sản bao gồm các kỹ thuật bảo quản gìn giữ các giá trị dinh dưỡng, ngăn chặn các chất độc hại nhiễm trên các nông sản đó, đồng thời chế biến nông sản thành những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao là một trong những phần cần thiết đối với ngành nông nghiệp nước ta. Độc tố aflatoxin chủ yếu do loài vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus tạo ra, là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc cho người và gia súc, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan ), gây quái thai, gây đột biến, thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong. Trong rất nhiều loại aflatoxin trong tự nhiên thì aflatoxin B1 được coi là chất độc nguy hiểm nhất. Mặc dù sự hiện diện của Aspergillus flavus không phải lúc nào cũng gắn liền với việc tồn tại aflatoxin với hàm lượng gây độc, nhưng nó cũng thể hiện nguy cơ lớn về việc có thể nhiễm aflatoxin. Ở nước ta với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí thường cao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa, trong khi các phương tiện thu hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khô ráo, thoáng mát là điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc cho thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Khi phát triển trên lương thực nấm mốc đã sử dụng các chất dinh dưỡng gây ra tổn thất về lượng cũng như về chất của hạt. Không những thế, một số loài nấm mốc khi phát triển sinh ra các loại độc tố khác nhau và được gọi chung là mycotoxin. 1
Đồ án tốt nghiệp Nguy hiểm hơn những độc tố này có khả năng theo thức ăn vào cơ thể, gây ra độc cho con người và động vật, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan ), gây quái thai, gây đột biến, thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong. Việc sử dụng các biện pháp phòng trừ độc tố nấm mốc đã được khuyến cáo sử dụng. Tuy nhiên, sự nhiễm nấm mốc và các độc tố nấm mốc nói chung và sự nhiễm aflatoxin trên nông sản ở mức độ cao quá giới hạn cho phép là không thể tránh được. Chính vì vậy cần phải có những biện pháp khử nhiễm độc tố nấm mốc bởi độc tính và nguy cơ gây ung thư của nó. Bảo quản nông sản bằng áp dụng các chất chống mốc hóa học có giá thành cao,thường có mùi khó chịu cho nông sản bị xử lý và có thể ảnh hưởng xấu lên sức khỏe người tiêu dùng. Để áp dụng “ bảo quản sinh học” trong việc bảo quản các hạt nông sản, các sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật thường được áp dụng. Đó là lý do chúng tôi đã chọn nghiên cứu về: “ Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của Bacillus spp. (CS1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản”. 2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1 Mục tiêu Khảo sát khả năng đối kháng nấm sinh aflatoxin của sản phẩm trao đổi chất dịch nuôi cấy vi khuẩn Baccillus sp. CS1b và ứng dụng trong việc bảo quản hạt đậu phộng. 2.2 Nội dung 1. Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp. CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng nấm cho vi khuẩn Bacillus sp. CS1b 2. Xác định thời gian nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp. CS1b để khả năng đối kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b đạt khả năng kháng nấm Aspergillus sp. CĐP1 cực đại. 3. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b sau ly tâm. 2
Đồ án tốt nghiệp 4. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi cấy sau ly tâm. 5. Khảo sát thành phần hóa học của các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Bacillus sp. CS1b có hoạt tính kháng nấm. 6. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn trong việc bảo vệ hạt đậu phộng. 3. Kết cấu đồ án Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung này đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu. Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án. Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được. Chương 4: Kết luận và kiến nghị - nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài. 3
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các nấm gây hại trên hạt 1.1.1 Tình trạng nhiễm nấm gây hại trên hạt ngũ cốc Thế giới Sự nhiễm nấm mốc trong nông sản đã trở thành vấn đề toàn cầu. Ví dụ: Ở Đức có 84% trên 1000 mẫu nông sản thực phẩm kiểm tra có nhiễm Tricothecene, 13 % số mẫu lương thực như lúa mì, lúa mạch, yến mạch bị nhiễm ochratoxin. Ở Đan Mạch 19 trên 33 mẫu ngũ cốc kiểm tra có nhiễm ochratoxin. Ở Ấn Độ có 8 % số mẫu bánh dầu hướng dương kiểm tra có nhiễm đồng thời cả hai loại độc tố T-2 và ochratoxin. Ở Mỹ có rất nhiều mẫu bắp kiểm tra cho thấy sự nhiễm vomitoxin ( DON) ở mức 1000 ppb. Ở Úc kiểm tra trên bắp thấy có cả 3 loại mycotoxin như: aflatoxin, fumonisin và zearalenon. Theo Tiến sĩ Bangalore ( Ấn Độ) thì các loại mycotoxin khác nhau có ưu thế ở những vùng khác nhau trên thế giới: Ở Bắc Âu có ochratoxin và vomitoxin ( DON) là vấn đề đang được quan tâm nhất. Còn ở Nam Mỹ thì mycotoxin có ưu thế lại là aflatoxin và fumonisin. Việt Nam Ở Việt Nam nhiều nơi ép dầu phộng bằng bọng thủ công, độ ẩm còn cao, sau đó xếp thành chồng. Giữa các lớp bánh dầu có độ ẩm cao là môi tường thích hợp cho nấm phát triển. Nếu kho trữ thức ăn lâu ngày không làm vệ sinh, diệt nấm thì trong không khí sẽ có rất nhiều bào tử nấm tấn công nhanh các nguyên liệu này sinh ra nhiều độc tố trong thức ăn. Nấm sinh ra trong kho dự trữ phổ biến nhất là Aspergillus và Penicillium. Độc tố của chúng sinh ra chủ yếu là aflatoxin, sau đó là ochratoxin, rubratoxin và citrinin. Nó gây tổn hại nặng trên động vật, làm hư gan, thận, tạo ra màng bọc ống tiêu hóa do tế bào niêm mạc bị chết bong ra giảm hấp thu dưỡng chất, có thể gây tử vong trên số lớn gia cầm con và heo con. 4
Đồ án tốt nghiệp Riêng ở các trại gà giống độc tố nấm còn gây ra chết phôi hàng loạt, tỷ lệ ấp nở giảm rất thấp. Theo kết quả kiểm tra 29 mẫu bánh dầu đậu phộng và 25 mẫu bắp thì mức aflatoxin trong bánh dầu phộng 1200 ppb ( tối đa 5000 ppb), trong bắp 205 ppb ( tối đa 600 ppb). Các nguyên liệu còn lại như đậu nành hạt khô và bánh đầu công nghiệp của nó, bánh dầu mè công nghiệp, khô dầu dừa công nghiệp, cám 50 ppb. 1.1.2 Tình trạng nhiễm nấm trước thu hoạch Trong khi cây lương thực đang phát triển ngoài đồng hay sau khi thu hoạch nhưng trước khi hạt được đập tuốt bị các nấm mốc này xâm nhập. Tùy từng loại ngũ cốc, vùng địa lý, thời tiết mà các nấm mốc này phát triển nhiều hay ít. Các loại lúa mì, lúa gạo, đại mạch, kiều mạch, và ngô thường nhiễm các loại nấm ngoài đồng như Alternaria, Cladosporium, Helininthosporium và Furarium. Tất cả các nấm ngoài đồng đòi hỏi độ ẩm cao ở hạt để phát triển. Độ ẩm ở trạng thái cân bằng với độ ẩm tương đối 90% hay hơn nữa là điều kiện cho nấm phát triển. Các nấm mốc ngoài đồng có thể sống qua nhiều năm ở hạt khô, nhưng chết tương đối nhanh ở các hạt có độ ẩm ở trạng thái cân bằng với độ ẩm tương đối trên 70%, ở các hạt ngũ cốc giàu tinh bột, điều này có nghĩa độ ẩm trên 14%. Tóm lại, các nấm mốc ngoài đồng có thể ảnh hưởng đến bề ngoài và chất lượng của hạt. Thông thường, tổn thất gây nên do nấm mốc ngoài đồng xảy ra trước thu hoạch có thể phát hiện bằng phương pháp giám định thông thường và nó không tiếp tục tăng lên trong quá trình bảo quản. 1.1.3 Tình trạng nhiễm nấm sau thu hoạch Theo Christensen [1] các nấm mốc bảo quản gồm mười hai loài Aspergillus, trong đó có năm loài phổ biến. Một số loài Penicillium, các loài riêng lẻ của Sporendonema và một số loài nấm men cũng có thể có ở giai đoạn này. Những loài này có khả năng phát triển ở các hạt lương thực có độ ẩm cân bằng với độ ẩm tương đối 70% - 90%. Đa 5
Đồ án tốt nghiệp số các nấm này thường ở trên các nguyên liệu giàu các chất hữu cơ và vô cơ, đặc biệt trên các rau quả thối rữa, các sản phẩm thực phẩm. Chúng xuất hiện ở khắp mọi nơi trên thế giới và nhiễm trên tất cả các hạt lương thực và hạt giống. Các nấm mốc bảo quản phát triển nhanh trên hạt ở khoảng 300C - 320C và tốc độ phát triển của chúng giảm khi nhiệt độ giảm. Một vài chủng của nhóm A.glaucus phát triển chậm ở nhiệt độ 100C – 150C. Một vài loài Aspergillus đề kháng với khô cạn, nó có thể phát triển ở vài độ dưới điểm đóng băng. 1.1.4 Độc tố của nấm Một số loại độc tố của nấm Độc tố nấm còn gọi là mycototoxin là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi chất thứ cấp của các nấm mốc và gây ngộ độc với động vật có vú, cá, gia cầm. Sự sinh trưởng và phát triển của nó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh thái ( Morrau 1974) [2]. Những điều kiện đó là vùng sinh thái, khí hậu nhiệt độ, độ ẩm của không khí, lượng nước có trong cơ chất Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả của tác động qua lại của kiểu gen ( genotype) và điều kiện phát triển của chúng ( Scheoedes và Ashworth). Độc tố nấm là sản phẩm phụ tiết ra trong quá trình chuyển hóa. Cho đến nay, trên 300 loại độc tố nấm đã được phát hiện và nghiên cứu. Một loại độc tố có thể do nhiều loài nấm khác nhau sản sinh và một loại nấm có thể đồng thời sản sinh ra nhiều loại độc tố. Điều đáng chú ý là có 20 loại mycotoxin có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng thường liên quan đến an toàn thực phẩm và được tạo bởi năm chi nấm: Aspergillus, Penicillium, Furarium, Alternaria, Claviceps. ❖ Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), sterimatocystin, acid cyclopianzoic. 6
Đồ án tốt nghiệp ❖ Các độc tố của Penicillium: patulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A, acid cyclopianzoic toxin, diacetocyscirpenol, fumonisin, moniliformin. ❖ Các độc tố của Furarium: deoxynivalenol, nivalenol, zearalenon, T-2 toxin. ❖ Các độc tố của Alternaria: acid tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion. ❖ Các độc tố của Claviceps: các alkaloid Ergot.[1] Những số liệu có giá trị về mycotoxin và các bệnh do mycotoxin đã thu nhận từ lĩnh vực thú y học. Các nghiên cứu trên độc vật thực nghiệm cho thấy độc tính của mycotoxin rất lớn. Hầu hết các sản phẩm thực vật có thể là cơ chất cho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo. Vì thế nó tạo khả năng không những cho sự nhiễm trực tiếp mà còn là nguồn mang mycotoxin vào nguồn sữa, thịt. Độc tố Aflatoxin: Cơ chế gây độc của Aflatoxin Aflatoxin có khả năng liên kết với DNA trong nhân tế bào. Sự liên kết này gây ức chế enzym polymerase của RNA. Nó gây tác dụng hạn chế trong tổng hợp RNA và ức chế polymerase t-RNA. Đây là nguyên nhân gây hạn chế sự tổng hợp protein trong tế bào. Người ta cũng đã chứng minh rằng vòng α, β -lacton không bão hòa có trong phân tử aflatoxin làm cho hợp chất này có hoạt tính gây ung thư và cũng chính vòng lacton này gây ức chế tổng hợp DNA trong nhân tế bào, do đó nó làm rối loạn tăng trưởng bình thường của tế bào. Để có thể gây độc với tế bào gan cũng như tạo khối u, aflatoxin phải trải qua một quá trình biến đổi sinh học phức tạp, tạo thành dạng 2,3 – dihydrodiol (aflatoxin B1 – dhd) ở trong gan, hợp chất này là nguyên nhân gây hủy hoại gan rất nhanh. Nhóm 7
Đồ án tốt nghiệp dialdehyd phản ứng với nhóm amin của protein để tạo thành kiềm ship (Shiff’s base), gây ức chế sinh sinh tổng hợp DNA và gây nhiễm độc cấp tính. Độc tính của Aflatoxin Theo Dương Thanh Liêm (2002) [1], aflatoxin gây ra những tác hại rất lớn cho cơ thể con người và động vật. Những tác hại đó như sau: Gây tổn thương tế bào gan: tất cả các trường hợp xác nhận sự ngộ độc aflatoxin đều có bệnh tích giống nhau là gan của động vật bị nhiễm đều hư hại nặng. Tùy theo mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà bệnh tích trên gan có khác nhau. Biểu hiện chung là: ban đầu gan biến thành màu vàng tươi, mật sưng. Sau đó gan sưng to lên, mật căng phồng và bắt đầu nổi mụt nhỏ trên bề mặt gan làm cho nó gồ ghề đôi khi có những nốt hoại tử màu trắng. Sau cùng do nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở, dễ bể. Thận cũng bị sưng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên khó khăn. Từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng. Bào mòn ống tiêu hóa nên làm giảm khả năng tiêu hóa các chất dinh dưỡng trong thức ăn. Đôi khi cũng thấy tổn thương ở miệng, làm cho thú khó lấy thức ăn. Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể. Do đó khi nhiễm aflatoxin cơ thể rất mẫn cảm với các bệnh thông thường, có thể gây tử vong cho thú. Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường, gây rối loạn sinh sản. Làm giảm sự thèm ăn đối với thức ăn do sự phát triển của nấm mốc làm mất mùi thức ăn. Làm thay đổi thành phần dinh dưỡng có trong thức ăn, giá trị dinh dưỡng bị hạ thấp, làm vật nuôi chậm phát triển. Làm giảm thấp sự sinh trưởng và giá trị kinh tế của vật nuôi. Hậu quả cuối cùng là có thể gây chết cho vật nuôi. 8
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1: Ảnh hưởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý ở vật nuôi. (Allcroff, 1969 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003). [2] Loại gia súc Lượng Thời kỳ nuôi Tổn thương Ảnh hưởng tới aflatoxin trong dưỡng (tuần) gan phát triển và thức ăn hàng hiệu quả thức ngày (mg/kg) ăn. Lợn 0.14 12 Trung bình Bình thường (20 – 70 kg) 0.28 12 Nhẹ Giảm sút 0.41 12 Nhẹ Giảm sút Lợn 0.28 20 Nhẹ Giảm sút (40 – 100 kg) 0.41 20 Nhẹ Giảm sút Lợn 0.69 7 Trung bình Bình thường (70 – 100 kg) Lợn nái 0.3 4 Rõ Suy giảm và (có chửa) 0.55 4 một số con chết Gà tây 0.25 4 Rõ Chậm phát (1 ngày tuổi) triển và giảm trọng lượng Gà tây 0.2 7 Nhẹ Giảm trọng (1 ngày tuổi) 0.42 7 Nhẹ lượng trong 3 0.5 7 Nặng tuần. Vịt 0.03 4 Đặc điểm điển Giảm trọng (7 ngày tuổi) hình nhiễm lượng, chết aflatoxin 50% Bê 0.2 16 Trung bình Giảm trọng 9
Đồ án tốt nghiệp (4 ngày tuổi) lượng từ 0 – 3 tháng Bò sữa 15 4 Trung bình Giảm lượng sữa Aflatoxin M1 có mặt trong sữa. Tình hình nhiễm độc Aflatoxin: Aflatoxin có mặt trong rất nhiều sản phẩm nông nghiệp, đặc biệt là các loại hạt có dầu như lạc, đậu tương và ngô (Blaney, 1985 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) [2]. Ở vùng Đông Nam Á và ở Úc, tỷ lệ nhiễm aflatoxin trong sản phẩm nông nghiệp là rất đáng kể. Nhiễm aflatoxin là do điều kiện bảo quản kém, việc xâm nhập của sâu mọt trong bảo quản cũng tạo điều kiện thuận lợi cho sự lây lan và phát triển nhanh chóng của Aspergillus flavus. Trong điều kiện thuận lợi, Asp. Flavus có thể tăng nhanh chỉ sau 3 – 7 ngày bảo quản. Nhiễm độc aflatoxin ở lợn là một vấn đề quan trọng, gây thiệt hại khá lớn cho ngành chăn nuôi. Tại miền Bắc Carolina – Mỹ, theo nghiên cứu của Smith (1976) trong số 94 trường hợp phát hiện aflatoxin có trong thức ăn chăn nuôi thì có đến 83 trường hợp gây ngộ độc ở lợn, 7 trường hợp ở bò và 4 trường hợp ở gia cầm. Hàm lượng aflatoxin trung bình có trong thức ăn chăn nuôi là 389 ppb và ở ngô nguyên liệu làm thức ăn là 518 ppb. (Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc Diệp, 2003) [2] Ở khu vực Đông Nam Á, theo nhận xét của Ginting (1985) và Widiastut (1988), ngô và thức ăn cho gia cầm nhiễm aflatoxin với hàm lượng lên tới 200 ppb. Ở Úc, theo Barry J. Balaney, trong 161 mẫu thức ăn cho gia cầm được phân tích thì có 13 mẫu 10
Đồ án tốt nghiệp chứa aflatoxin, trong đó có 4 mẫu nhiễm aflatoxin với hàm lượng lên đến 50 ppb. (Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc Diệp, 2003) [2]. 1.2 Các phương pháp kháng nấm gây bệnh cho nông sản 1.2.1 Kháng nấm bằng phương pháp hóa học Tình trạng sử dụng thuốc diệt nấm hóa học và tác hại Hiện nay khi sử dụng thuốc Bảo vệ thực vật nói chung cũng như thuốc trừ nấm bệnh hại cây trồng nói riêng, phần lớn bà con chúng ta vẫn làm theo cảm tính, cẩu thả, không khoa học, việc bà con nông dân sử dụng không hợp lý thậm chí lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật trong sản xuất nông nghiệp đã và đang gây những hậu quả nghiêm trọng. Thuốc diệt nấm có thể gián tiếp có hại cho sức khỏe con người do các loại lương thực, rau quả thu được từ các loại cây trồng được con người sử dụng và nó có thể gây ra dị ứng cũng như nhiều triệu chứng khác như đau đầu, tiêu chảy, các tổn hại cho các cơ quan cũng như gây ra các rối loạn nghiêm trọng và các loại bệnh tật liên quan đến hệ thần kinh. Nó cũng có thể là nguy hiểm cho các hệ sinh thái do nó có thể thoát đi và gây ô nhiễm môi trường nước và đất cũng như tích lũy sinh học và làm gia tăng độc tính đối với các cơ thể sống trong hệ sinh thái. Một số loại chất diệt nấm hóa học Amphotericin B (fungizon). Nystatin (fungicidin, mycostatin, monoral, nystan). Candicidin. Ketoconazol. Econazol. Thuốc dẫn chất Imidazol. 11
Đồ án tốt nghiệp 1.2.2 Kháng nấm bằng phương pháp sinh học: Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao quá giới hạn là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất. Màng bao chitosan có khả năng kháng nấm gây bệnh cho nông sản. Chitosan là một polime sinh học có hoạt tính cao, đa dạng, dễ hòa hợp với cơ thể sinh học có tính kháng nấm và dễ phân hủy khi tạo thành màng mỏng có tính bán thấm, chống thấm nên được ứng dụng trong kinh tế kỹ thuật khác nhau như y học, cộng nghiệp dệt, giấy, mỹ phẩm, đặt biệt trong công nghệ bảo vệ rau quả tươi. Ứng dụng trong xử lý hạt Hạt giống xử lý bằng cách nhúng vào dung dịch chitosan loãng, bao phủ bề mặt hạt bằng một màng chitin hay chitosan mỏng trước khi gieo trồng sẽ thúc đẩy và nâng cao độ tăng trưởng. Bổ sung chitin trong bầu đất sẽ dẫn đến giảm đáng kể sâu hại rễ, vi khuẩn gây bệnh và nấm mốc. Ứng dụng của màng chitosan trong tồn trữ và bảo quản chất lượng rau quả tươi Chitosan cũng có tiềm năng là một loại màng bảo quản trái cây. NOCC ( N,O- Carboxymethyl chitosan) một dẫn xuất được tạo ra bởi phản ứng của chitosan với acid monochloroacetic. Lớp phim được tạo ra bằng cách phun dung dịch NOCC hòa tan lên trái cây hoặc bằng cách nhúng trái cây vào trong dung dịch. Kết quả tạo ra màng bán 12
Đồ án tốt nghiệp thấm, màng chitosan có thể làm giảm khí quyển bên trong tốt như việc làm giảm sự mất hơi nước thoát ra và làm trì hoãn quá trình chín của trái. Ứng dụng chống vi sinh vật của chitin, chitosan Chitosan có thể ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn do có khả năng lấy đi các ion kim loại quan trọng như Cu2+, Co2+, Cd+ của tế bào vi khuẩn nhờ hoạt động của các nhóm amino trong chitosan có thể tác dụng với các nhóm amino của bề mặt thành tế bào. Như vậy vi sinh vật sẽ bị ức chế phát triển do sự mất cân bằng liên quan đến ion quan trọng. Ứng dụng các vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm gây bệnh cho nông sản Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa như sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc trực tiếp nhờ vi sinh vật. Một số vi sinh vật có khả năng đối kháng với các nấm gây bệnh cho nông sản và cơ chế khử nhiễm bằng con đường sinh học được trình bày ở bảng 1.2. Bảng 1.2: Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học [3] Tên vi khuẩn Đối tượng Cơ chế khử nhiễm Tác giả Bacillus pumilus Aspergillus Sử dụng các sản phẩm C. Munimbazi parasiticus trao đổi chất ngoại và bào, sinh ra trong quá LB.Bullerman, trình nuôi cấy B. 1997 pumilus, ức chế sự phát triển và quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm Asp.parasiticus. 13
Đồ án tốt nghiệp Streptomyces sp. Aspergillus Streptomyces sp. tổng M. Ono và ctv parasiticus hợp được aflastatin A, ,1996. T. là hợp chất có bản Kondo và ctv, chất là protein, ức chế 2001 1 số enzyme esterase tham gia quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm Asp. Parasiticus Achromobacter Aspergillus A. xylosoxidan tổng PS. Yan và ctv, xylosoxidans parasiticus hợp Cyclo (Lleucyl- 2004. L-prolyl), là 1 cyclodipeptide, ức chế sự phát triển và sự tổng hợp aflatoxin của nấm Asp. parasiticus. Lactobacillus Aspergillus flavus Sử dụng các sản phẩm I. Chang và casei trao đổi chất ngoại JD. Kim, 2007. bào, sinh ra trong quá trình nuôi cấy L. casei, ức chế sự phát triển và quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm Asp. flavus. Bacillus subtilis Aspergillus flavus Hợp chất thứ cấp Ting Zhang và 14
Đồ án tốt nghiệp BFS06 ctv, 2007 Bacillus subtilis Aspergillus flavus B. subtilis tổng hợp R. Thakaew và các enzyme ngoại bào ctv, 2013. như protease, chitinase, β-1,3- glucanase làm ức chế sự phát triển của nấm Asp. Flavus Serratia Aspergillus Sinh khối tổng hợp Kai Wang và marcescens parasiticus và enzyme chitinase ctv, 2013 Strain JPP1 Aflatoxin 1.3 Một số vi sinh vật điển hình có khả năng đối kháng nấm gây bệnh trong nông sản. 1.3.1 Nấm Trichoderma spp Cơ chế đối kháng Theo Harman (1996), nấm Trichoderma spp. có nhiều cơ chế đối kháng, cơ chế ký sinh lên nấm bệnh, cơ chế tiết kháng sinh (antibiosis), cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống. Theo Kredics (2003), quá trình đối kháng của nấm Trichoderma spp. với nấm bệnh chủ yếu bằng 2 cơ chế: Thứ nhất: Nấm Trichoderma spp. bao quanh và cuộn lấy nấm bệnh. Thứ hai: Nấm Trichoderma spp. tiết ra các loại enzyme thủy phân. ( Trích dẫn bởi Huỳnh Văn Phục, 2006) [4]. 15
Đồ án tốt nghiệp Ứng dụng trong nông nghiệp Theo Elad (2000), có nhiều cơ chế được ứng dụng trong phòng trừ sinh học của Trichoderma spp đối với nấm gây bệnh, nhưng chỉ có 3 cơ chế quan trọng là ký sinh, cạnh tranh và tiết ra kháng sinh. Okigbo và Ikediugw (2000), cho biết những loài Trichoderma spp. có hệ sợi nấm nhỏ, mảnh là một nhân tố có triển vọng trong phòng trừ sinh học chống bệnh thối hạt, thối rễ và quản lý bệnh hại sau thu hoạch. Nấm Trichoderma spp được sử dụng rộng rãi trong phòng trừ sinh học để quản lý bệnh hại do R.solani gây ra (Hardar và ctv, 1984). Nấm Trichoderma spp tấn công trực tiếp bằng cách cuộn quanh và tiết ra enzyme phân hủy chitin của nấm gây hại thành những phân tử nhỏ dễ hấp thu, đồng thời giúp cây trồng kháng lại bệnh (Klein và Eveleigh, 1998). Nấm Trichoderma spp sống ở rễ cây giúp biến đổi vật chất vô cơ, giúp tăng cường khả năng sản xuất hormone ở cây trồng, làm tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng. Bailey và Lumsden (1998) cho rằng khi dùng dịch huyền phù nấm Trichoderma hazianum vào trong đất làm tăng sự nảy mầm, tăng khả năng ra hoa, tăng sinh khối và chiều cao cây bắp, ớt, hoa cúc, cà chua, thuốc lá. Nòi T1290 của nấm Trichoderma hazianum còn làm tăng số chồi và rễ cây bắp ngọt trong nhà lưới 66% so với đối chứng (Harman, 2000). Một số loại enzyme do Trichoderma tiết ra bao gồm glucan 1,3-beta-glucosidase, endochitinase, chitobiosidase, N-acetyl-beta-D-glucosaminidase (NAGase), trypsin, chymotrypsin, cellulase, protease, lipase, khi kết hợp hai enzyme glucan 1,3-beta- glucosidase và endochitinase sẽ ngăn cản được quá trình tăng trưởng của nhiều loại 16
Đồ án tốt nghiệp Ascomycetes trong nuôi cấy, thêm vào đó sẽ có hiệu quả cao trong việc ngăn cản sự nảy mầm của bào tử hơn là từng loại enzyme đơn lẻ (Margolless – Clark, 1995). Trichoderma spp ký sinh lên sợi nấm R. solani và làm chết sợi nấm là do tác dụng của enzyme ngoại bào làm phá hủy màng tế bào của nấm bệnh (Phạm Văn Kim, 2000). Các chủng nấm Trichoderma spp. được phân lập từ những hệ thống canh tác khác trên nền đất lúa ở 4 tỉnh đồng bằng sông Cửu Long chúng đều có khả năng ký sinh trên nấm R. solani được ly trích từ lúa, đậu nành, đậu xanh. Nấm Trichoderma spp. có chỉ số phân hủy rơm (cellulose) cao hơn nấm R.solani (Lưu Hồng Mẫn và Noda, 1997). Lưu Hồng Mẫn và Noda (1997), nghiên cứu sự phân bố của quần thể nấm Trichoderma spp. trong những hệ thống canh tác trên nền đất lúa ở 4 tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, kết quả cho thấy quần thể nấm Trichoderma spp. trong hệ thống canh tác lúa – đậu – lúa ở huyện Ô Môn, Cần Thơ biến động từ 1,43 – 1,62 x 103 CFU/g trong điều kiện ẩm độ đất từ 30,3 – 30,7% và pH đất là 4,6 – 5,01 nhưng cùng hệ thống ở huyện Thốt Nốt, Cần Thơ thì quần thể Trichoderma spp. cao hơn từ 1,25 – 2,65 x 103 CFU/g, ẩm độ đất là 14,5 – 16,8%, pH đất là 4,36 – 4,6. ( Trích dẫn bởi Huỳnh Văn Phúc, 2006) [4]. 1.3.2 Lactobacillus spp. Cơ chế đối kháng Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn, nấm gây bệnh của Lactobacillus: Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với nhiều vi khuẩn Gram (+), Gram (-) và kể cả nấm. Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn bao gồm: các acid hữu cơ (acid lactic và acid acetic), hydrogen peroxit, cacbondioxit và diaxetyl cũng như 17
Đồ án tốt nghiệp bacterioxin và các hợp chất giống bacterioxin ( Mishra và Lambert, 1996; Ouwehand và cộng sự, 1999). Cả acid lactic và acid acetic đều có khả năng hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật khác bởi chúng làm giảm pH bên trong đường ruột và chính đều này đã ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của các sinh vật khác (Mishra và Lambert, 1996). Hydrogen peroxit ức chế được sự phát triển của cả Gram (+) và Gram (-) ( Hollang, Knapp, Shoesmith, 1987; Mishra và Lambert, 1996). Diacetyl tác động ức chế lên sự tăng trưởng bằng cách can thiệp sử dụng arginine ( Jay, 1986). Ngoài ra, Lactobacillus còn có khả năng sinh ra bacterioxin, một loại protein có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacterioxin còn có khả năng phân giải AND, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Bacterioxin sẽ tấn công các vi khuẩn gây bệnh và ức chế sự phát triển của chúng, trong đó có các vi khuẩn gây bệnh như: E.coli, Samonella, Vibrio, Clostridium, Candida albicans và một số virus khác nữa ( O’Sullivan và Kullen, 1998). ( Trích dẫn bởi Lê Thanh Huân, 2011) [5]. Ứng dụng trong nông nghiệp Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrat khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm. Khi ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ 18
Đồ án tốt nghiệp tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy, 2007). Vi khuẩn lactic còn sản sinh bacteriocin ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong bảo quản sinh học. Ngoài ra, chúng còn sản sinh các chất hay các phân tử nhỏ có hoạt tính kháng nấm như reuretin, acid lactic, 1.3.3 Bacillus subtilis spp. Cơ chế đối kháng Hình thức đối kháng chủ yếu của Bacillus subtilis đối với vi sinh vật gây bệnh là cạnh tranh dinh dưỡng và tiết kháng sinh. Tác dụng chủ yếu của kháng sinh đối với vi khuẩn có thể biểu hiện ở 3 hướng chủ yếu sau: Làm ngừng tổng hợp thành (màng) tế bào hay làm tan màng tế bào vi khuẩn và do đó phá hủy tính chất thẩm thấu của tế bào, các ion Mg++, Na+, Ca++ thoát ra ngoài, tế bào chết. Ảnh hưởng quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Chất kháng sinh có thể ngăn cản quá trình tổng hợp protein bằng cách ngăn cản ribosome tổng hợp chuỗi polypeptid hay đưa đến tổng protein bất thường. Ảnh hưởng đối với acid acetic cụ thể là phá hủy sự trao đổi của ADN và ARN bằng cách ức chế men RNA polymerase hay gắn vào các base làm đứt đoạn chuỗi xoắn kép AND. Thực tế khi nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn 19
Đồ án tốt nghiệp chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận, 1976, trích dẫn bởi Lý Kim Hữu). Các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết: khi chất dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang tình trạng “ngủ đông”, hay nghỉ ngơi trong một thời gian dài. Bacillus subtilis thực hiện điều đó bằng cách tạo ra bào tử, có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm, thậm chí hàng thế kỉ. Tuy nhiên trong thí nghiệm của mình, nhóm nghiên cứu nhận thấy ở giai đoạn rất sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào Bacillus đã tạo ra kháng sinh để giết chết những tế bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này. Chất kháng sinh sẽ phá vỡ màng tế bào vi khuẩn bị tấn công, giải phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang hình thành bào tử tiêu thụ. Theo các nhà nghiên cứu trên, quá trình tạo bào tử tiêu tốn một lượng lớn năng lượng, phải mất vài giờ và khi đã bắt đầu thì không thể đảo ngược. Do đó, vi khuẩn sẽ cố gắng tránh thời điểm đó càng lâu càng tốt. Đặc biệt, khi dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt, vi khuẩn sẽ tiêu diệt những kẻ xung quanh để hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến khi phải chuyển sang sống tiềm sinh (Nguyễn Thị Công Dung, 2004). [6] Ứng dụng trong nông nghiệp Bacillus subtilis ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Pylicularia oryzae, ngoài ra còn ứng dụng nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch. [6] Công ty TNHH Sinh phẩm số 1 Khánh Hòa đặt tại QL1- KCN Suối Dầu-Khánh Hòa đã nghiên cứu và sản xuất chế phẩm có chứa Bacillus Pumilus là vi khuẩn gram 20
Đồ án tốt nghiệp dương hình que di động có khả năng hình thành bào tử và sống hiếu khí; tùy tiện có khả năng sinh ra nhiều enzyme amylase và protease, có khả năng ức chế được nhiều loại nấm mốc trong quá trình bảo quản nông sản, đặc biệt các nấm mốc sinh độc tố. Bacillus pumilus hoạt động ngăn ngừa sự phát triển bào tử nấm trên cây trồng, đặt biệt tốt cho hệ rễ cây trồng. 1.4 Cơ chế kháng nấm của vi khuẩn 1.4.1 Cấu tạo thành tế bào của một số nấm gây hại nông sản Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên trong chứa chất nguyên sinh có thể lưu động. Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạn nhưng về đường kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30 µm (thông thường là 5-10 µm). Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone). Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh mẽ đây là vùng thành tế bào phát triển nhanh chóng, vùng này có thể dài đến 30 µm. Dưới phần này thành tế bào dày lên và không sinh trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào thành tế bào. Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có kế cấu gấp nếp hay xoắn lại, người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome). Nhiều khi chúng có tác dụng chiết xuất các chất nào đó. Thành tế bào (cell wall) của nấm có thành phần hóa học khác nhau. Đây là một tiêu chí quan trọng khi định loại nấm. 21
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.3: Các thành phần chính của thành tế bào ở một số nấm Chú thích: 1- Allomyces, 2- Phytophthora, 3- Mucor, 4- Aspergillus, 5- Saccharomyces, 6- Schizophyllum Ngoài các thành phần trên thì trong màng nấm có ergosterol là một trong thành phần hóa học cơ bản trong tế bào sợ nấm. Chúng là các sterol chiếm ưu thế ở hầu hết các loại nấm (nghiên cứu tách chiết ergosterol từ sinh khối các chủng nấm cordyceps sp. phân lập tại Việt Nam Đoàn Minh Quân 2013 luận văn tốt nghiệp trường đại học khoa học tự nhiên). Sợi nấm không ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nảy mầm trên một môi trường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi, sau 3-5 ngày có thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc (colony). Vào giai đoạn cuối của sự phát triển khuẩn lạc sẽ xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau, làm cho cả khuẩn lạc là một hệ thống liên thông mật thiết với nhau, thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm. Hiện tượng kết mạng thường gặp ở nấm bậc cao nhưng 22
Đồ án tốt nghiệp lại ít gặp ở các sợi nấm dinh dưỡng của nấm bậc thấp. Hình thái, kích thước màu sắc, bề mặt của khuẩn lạc có ý nghĩa nhất định trong việc định tên nấm. Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm sợi nấm mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài môi trường và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt khuẩn lạc. Vì bào tử của nấm thường cũng có màu nên cả khuẩn lạc thường có màu. 1.4.2 Cơ chế tác động của một số enzyme ngoại bào. Do các nấm Aspergillus spp. có cấu tạo vách tế bào chủ yếu là chitin, beta-glucan, protein nên khả năng tiết các enzyme ngoại bào chitinase, beta – glucanase và protease giúp vi khuẩn đối kháng nấm mốc dễ dàng hơn. Các enzyme này tác động lên vách tế bào của nấm làm phá vỡ hay làm thủng vách tế bào của nấm làm cho chúng mất căng bằng nội bào, ức chế được sự phát triển của chúng. Chitinase Hệ enzyme thủy phân chitin (chitinolytic enzymes) hay thường được gọi là chitinase [poly  -1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucosid glucanohydrolase] thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 - -glucosid giữa C1 và C4 của hai monomer N-acetyl-D-glucosamine liên tiếp nhau trong mạch chitin. Cơ chế xúc tác Chitinase xúc tác cho phản ứng thủy giải liên kết 1,4 – β - glucosid trong chitin. Nó phân cắt dọc theo mạch carbon của chitin và sản phẩm tạo thành chủ yếu là chitobiose và chitotriose. Những chất này sau đó được tiếp tục phân cắt thành các monomer là các N-acetyl – D - glucosamine. 23
Đồ án tốt nghiệp Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitotiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa. Hầu hết chitinase thuộc loại này. Chitin 1,4 – chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)2 với n≥3] từ đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2. β-N-acetylhexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liên tục từ đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl-glucosamine. Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl- chitooligosaccharide làm cơ chất. Các oligosaccharide thường được thủy phân bên trong trên một vài vị trí xác định hoặc một cách ngẫu nhiên. Một số loại chitinase có khả năng thủy phân trisaccharide, một số thì không. Cũng có hai dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: một loại phân cắt bên trong tạo disaccharide và trisaccharide, một loại phân cắt bên ngoài tạo các monosaccharide và tetrasaccharide. Tóm lại, chitinase thực chất là enzyme cắt ngẫu nhiên. Protease Cơ chế xúc tác Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptide (-CO – NH-) của phân tử protein và peptide thành các acid amin tự do, một ít peptide ngắn, pepton. 24
Đồ án tốt nghiệp Beta – glucanase Beta glucanase là một enzyme giúp tiêu hóa chất xơ. Nó giúp khắc phục các vấn đề về tiêu hóa như kém hấp thu và rối loạn dinh dưỡng. Beta – glucanase là một enzyme rất quan trọng vì cơ thể động vật không thể tự sản xuất được. Cơ chế xúc tác [5] β-1,3-glucanase xúc tác sự thủy phân liên kết β-1,3-glucosidic hiện trong β-1,3- glucan, là thành phần chính của thành tế bào của nấm men và nấm sợi. Có rất nhiều β-1,3-glucanases đã được tịnh hóa và đặc trưng từ các loài vi khuẩn khác nhau, bao gồm cả vi khuẩn Bacillus, Paenibacillus, Micromonospora, Streptomyces và Cellulosimicrobium. 1.4.3 Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất. Các VK tiết ra các kháng sinh là các hợp chất thứ cấp có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm bệnh gây hại. Nghiên cứu của Stein (2005) cho thấy tiềm năng chất kháng sinh từ Bacillus subtilis được ghi nhận từ 50 năm qua. Có khoảng vài trăm dòng VK Bacillus subtilis có khả năng tiết ra khoảng 20 chất kháng sinh với cấu trúc khác nhau. Hầu hết các chất này được tiết ra trong ruột, trên bề mặt cơ thể vật chủ hay ra môi trường nước làm rào cản sự nhân lên của các vi sinh vật cơ hội gây ức chế các vi sinh vật gây bệnh. Các chất diệt khuẩn này có thể có tác dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau. Hay một số hợp chất ức chế khả năng sinh tổng hợp nên các vách tế bào nấm chitin, beta – glucan, protease. Cơ chế tác động ức chế sự hình thành các thành phần hình thành nên vách trong đó có ergosterol là một thành phần cơ bản trong màng của nấm, tạo ra các kênh ( channel) ở màng tế bào, làm tăng tính thấm màng tế bào, làm cho các 25
Đồ án tốt nghiệp dòng ion dịch chuyển (kali, glucoza đi ra, natri đi vào ) gây mất căng bằng nội chất, ức chế sự phát triển của sợ nấm và khả năng sinh độc tố của chúng. Bảng 1.4: Cơ chế tác động của mộ số hợp chất thứ cấp [3],[4] Hợp chất Cơ chế tác động Đối tượng Surfactin ức chế sự vận chuyển các ion qua A. flavus màng lipid kép. Fengycin Ức chế sự hình thành sợi nấm Aspergillus niger, A. flavus Iturins Làm thủng màng tế bào làm rò rỉ ion Aspergillus niger K+ và một số ion quan trọng khác. Thay đổi tính thấm của màng Nikkomycins Ức chế sự tổng hợp chitin C. albicans Polyoxins Ức chế sự tổng hợp chitin C.immitis Echinocandin Ức chế sự tổng hợp glucan Candida, Aspergillus 1.4.4 Một số phương pháp thu enzyme và hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Thu nhận enzyme (E) dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực. Hỗn hợp chứa E sẽ phải trải qua nhiều công đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên đặc tính nhất định để thu được một E tinh sạch. Sau mỗi bước thu nhận ta đều phải tiến 26
Đồ án tốt nghiệp hành xác định hoạt tính và nồng độ E để đảm bảo hiệu quả tinh sạch. Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: tủa, màng bán dẫn, sắc ký. Có nhiều phương pháp khác nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa protein/E, dùng nhiệt. Trong đó tủa bằng muối được sử dụng nhiều nhất. Tủa bằng muối Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out), mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ nhất định. Lượng muối có thể được loại bỏ thông qua bước thẩm tách. Khả năng tủa protein phụ thuộc vào chức năng của protein và nồng độ muối, không phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngoài ra, nếu trọng lượng phân tử của protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống. Hiệu quả tủa protein/E của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate. Để tủa E từ dịch chiết thô ta có thể dùng một số muối trung tính, thường dùng nhất là ammonium sulfatese (NH4)2SO4, do nó có độ hoà tan rất cao trong nước (720 g/l, nhiệt độ 25 oC), ít làm mất tác dụng E thậm chí còn có tác dụng làm bền E. Ngoài ra ammonium sulfatese có khả năng tủa chọn lọc protein, do đó giúp loại một số protein không mong muốn ra khỏi dịch chiết. Thường dùng hai dạng bột hoặc bão hòa . Dạng bột: 27
Đồ án tốt nghiệp Người ta cho từng ít một vào dịch chiết E, cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của E. Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối. Dịch bão hòa: Cho dung dịch (NH4)2SO4 vào dịch chiết E thì độ (NH4)2SO4 không tăng đột ngột. Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2 giờ để qua đêm, mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn (ở phương pháp dùng dung môi hữu cơ thì không cần để lâu). Kết được lấy ra bằng cách ly tâm hoặc lọc qua phễu Buckner. Khi hòa tan kết tủa lại người + ta thường thêm ion Ca làm bền (CaCl2 hoặc Ca(COOH)2). Ở giai đoạn loại muối, người ta dùng phương pháp thẩm tích. Thời gian thẩm tích thường là 24 – 28 giờ, nước thay càng nhiều càng nhanh càng tốt. Có thể loại muối bằng cách lọc qua gel sephadex G25 là dẫn suất của dextran. Ưu thế của phương pháp này là tiến hành với thời gian ngắn (khoảng 30 '), nên không làm mất hoạt độ E. Muối có trọng lượng phân tử bé bị giữ lại, các E có trọng lượng phân tử lớn xuống trước. Giai đoạn tiếp theo là làm đông khô thành bột trắng. Chuyển trạng thái từ dịch nước đá sang trạng thái khí mà không qua trạng thái lỏng. Ví dụ: Protease của nấm mốc dễ bị kết tủa ở 70% của (NH4)2SO4 bão hòa hoàn toàn, còn amylase của mầm lúa bị kết tủa ở 50% độ bão hòa của dung dịch muối này. Ðiều đó nói lên tính kết tủa lựa chọn của (NH4)2SO4 cao hơn các muối khác. * Lưu ý khi sử dụng muối ammonium sulfate Cho muối vào dung dịch E một cách từ từ, đồng thời khuấy đều để tránh tăng nhanh cục bộ nồng độ muối dẫn đến mất tính kết tủa chọn lọc, thậm chí làm mất hoạt tính E. Sử dụng muối ammonium sulfatese mất nhiều thời gian và cần phải ly tâm tốc độ cao và ở nhiệt độ thấp để tách protein tủa. 28
Đồ án tốt nghiệp Tủa bằng các dung môi hữu cơ Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung môi hữu cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Do đó, khi tủa chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp, trừ một số dung môi như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl sulfoxide (DMSO) và ethanol có thể được sử dụng ở nồng độ cao. Ethanol hay aceton thường được dùng để tủa protein cho mục đích tinh sạch. Sự kết tủa có thể có tính chọn lọc một phần, nghĩa là các protein khác nhau có thể được tủa bằng các nồng độ khác nhau của dung môi (nồng độ dung môi thường chiếm 80 % (v/v) trở lên). Sau đó dung môi được loại bằng cách cho bay hơi trong chân không hay thậm chí trong không khí. Phương pháp này cũng tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5 0C trở xuống). Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 0o C và có thể đến – 20 oC, như vậy nó có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein E. Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng tách dùng máy ly tâm. Phương pháp này có lợi thế là không cần loại muối, nhưng có nhược điểm là hay có màu. Tủa bằng phương pháp điểm đẳng điện Khi pH của môi trường thay đổi, mức độ tủa của protein cũng thay đổi. pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton). pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất H+). 29
Đồ án tốt nghiệp Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không tích điện. Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn khả năng tương tác với môi trường, khi đó, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường. Phương pháp này thường dùng cho các protein đậu nành (có pI= 4.6). Dùng nhiệt Ngoài ra có thể dùng nhiệt để loại bỏ các protein E tạp ra khỏi dịch chiết E. Tuy nhiên phương pháp này ít được dùng vì hiếm E bền với nhiệt. 1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng màng bao trong bảo quản hạt Chitosan được sử dụng để bọc các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt. Một trong những hoạt tính sinh học quan trọng của chitosan trên thực vật đó là sự kích thích nảy mầm. Trong đậu phộng hạt giống được bao lớp màng chitosan sẽ làm tăng cường khả năng nảy mầm của hạt giống ( Zhou và cộng sự, 2002 trích dẫn bởi Batool Mahdavi và Asghar Rahimi, 2013). Chitosan có thể thúc đẩy sự tăng trưởng và làm tăng năng suất đậu tương ( Dũng và Thắng, 2002). Viện Khoa học nông nghiệp Miền Nam và Trung tâm công nghệ sinh học Thủy sản cùng tham gia nghiên cứu tác dụng của chitosan lên một số loại hạt dễ mất khả năng nảy mầm và góp phần thúc đẩy tăng trưởng, phát triển cây trồng ngoài đồng. Kết quả là có khả năng kéo dài thời gian sống và duy trì khả năng nảy mầm tốt của hạt giống cà chua và hạt đậu cô ve sau thời gian bảo quản 9 – 12 tháng trong điều kiện bình thường. Năm 1987, Bentech đã được cấp bằng sáng chế nhờ nghiên cứu dùng chitosan trong việc bọc nang hạt giống để ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất. Trong những vùng mà cây trồng thường bị nấm tấn công vào hệ rễ, nếu hạt giống được bọc nang bằng chitosan sẽ nâng cao được hiệu suất thu hoạch lên 20 % so với không dùng chitosan. 30
Đồ án tốt nghiệp 1.6 Một số nghiên cứu nước ngoài ứng dụng hợp chất thứ cấp của Bacillus spp Ting Zhang và ctv (2007) [5] đã nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp kháng nấm từ vi khuẩn Bacillus subtilis B-FS06 ức chế sự phát triển của Aspergillus flavus. Hợp chất bacillomycin D là một nhóm của iturin có hoạt tính kháng nấm mạnh. Nghiên cứu này đã ứng dụng các hợp chất này vào in vivo trên đậu phộng có bổ sung 104 bào tử A.flavus và cho kết quả tốt ở 200 µg/g đến 250 µg/g hợp chất thứ cấp/ đậu phộng làm ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng sợi nấm, và sự tăng trưởng của A. flavus là ở 200 và 250 lg / g của các hợp chất Md. Rezuanul Islam và ctv (2012) [6] đã phân lập và xác định các hợp chất chống nấm từ Bacillus subtilis C9 ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh cho cây. Nghiên cứu này đã sử dụng ethyl acetate để tách các hợp chất kháng sinh từ dịch nuôi cấy C9 và cao chiết này có kết quả ức chế đáng kể sự tăng trưởng cợ nấm của các nấm gây bệnh khác nhau. Trong nghiên cứu đã xác định được hợp chất có trong cao ethyl acetate thu được từ dịch nuôi cấy C9 là DG4 (3,4 – dihydroxy – 3 – methyl – 2 – pentanone) có khả năng kích hoạt kháng hệ thống và bảo vệ cây Arabidopsis khỏi mầm bệnh ngoài ra chúng còn ức chế Rhizoctonia và tăng cường sức khỏe của cây trong nhà kính. Các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi của vi sinh vật có vai trò thay đổi sinh hóa của quá trình chuyển hóa hợp chất thứ cấp ở thực vật và cũng ức chế khả năng tổng hợp protein của các mầm bệnh. Các hợp chất này có khả năng ức chế bào tử nảy mầm, hoặc tổng hợp β- (1, 3) -D-glucan, hoặc ức chế một phần không thể thiếu của thành tế bào nấm, dẫn đến sự thay đổi của tính thấm của màng tế bào nấm. Các enzyme chitinolytic sản xuất bởi cô lập C9 có thể tham gia trong kiểm soát sinh học của nấm gây bệnh, đặc biệt là R. solani AG2-2 (IV). Mohsen Farzaneh và ctv (2016) [7] đã nghiên cứu sự ức chế sự tăng trưởng Aspergillus flavus và Aflatoxin B1 nhiễm trên hạt dẻ bằng fengycin và surfactin từ Bacillus subtilis UTBSP1. Trong nghiên cứu này, B. subtilis UTBSP1 có khả năng sản xuất surfactin và fengycin có thể giảm A. flavus tăng trưởng và độc tố AFB1 trong các 31
Đồ án tốt nghiệp loại hạt hồ dẻ. Ngoài ra, B. subtilis UTBSP1 là tác nhân hạ AFB1 ( Farzaneh et al., 2012 ) và có thể sử dụng để giảm AFB1-nội dung trong thực phẩm, thức ăn và các loại cây trồng nông nghiệp. 1.7 Một số nghiên cứu trong nước ứng dụng hợp chất thứ cấp của Bacillus spp Luận văn tốt nghiệp “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. ứng dụng bảo quản nông sản” [3]. của hai sinh viên Đỗ Tuyết Mai và Nguyễn Văn Hương. Nghiên cứu đã phân lập Bacillus sp. CS1b có hoạt tính kháng nấm mạnh và nấm CĐP1 có khả năng sinh aflatocxin mạnh. Tiến hành cho đối kháng in vitro CS1b với CĐP1 cho kết quả CS1b kháng CĐP1 lên đến 59 %. Với kết quả in vitro khả quan họ tiếp tục thí nghiệm in vivo trên hạt đậu phộng, sử dụng hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy VK khuẩn CS1b trong môi trường có bổ sung tơ nấm CĐP1 làm chất cảm ứng kết hợp với chitosan và trong thí nghiệm cũng bổ sung 102 bào tử CĐP1. Kết quả đậu phộng có thể bảo quản đến 30 ngày. 32
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian Từ tháng 16 - 05 - 2016 đến 07 - 08 - 2016. Địa điểm Phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Công Nghệ TP.HCM 2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất 2.2.1 Vật liệu Nguồn mẫu phân lập nấm: Mẫu nấm Aspergillus sp. CĐP1 do hai sinh viên Đỗ Tuyết Mai và Nguyễn Vân Hương phân lập từ hạt đậu phộng được mua từ chợ Tân Bình, quân Tân Bình, TP.HCM. Nguồn mẫu phân lập VK: là các chủng VK Baccillus sp. CS1b do sinh viên Trần Chí Phúc phân lập từ đất. 2.2.2 Thiết bị và dụng cụ Thiết bị: tủ ủ, tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), máy li tâm, cân phân tích, máy soi UV, máy nước cất, bếp từ, 33
Đồ án tốt nghiệp Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, cốc thủy tinh (bacher), bình tam giác (erlen), ống đong, pipet thủy tinh, micropipette, đầu típ, que cấy, đèn cồn, bông không thấm, ống li tâm Eppendorf, 2.2.3 Môi trường - Hóa chất Môi trường (xem phụ lục A) Môi trường Potato Dextrose (PDB) Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) Môi trường tăng sinh nutrient Broth (NB) Môi trường tăng sinh nutrient Broth 1 - NB1 (bổ sung tơ nấm) Môi trường β – glucan 1% Môi trường Casein 1 % Môi trường Chitin 1 % Hóa chất Dịch chiết khoai tây Dịch tơ nấm D – glucose Peptone Cao thịt (meat extract) Cao nấm men (yeast extract) Casein Chitin, huyền phù chitin Chiosan thương mại của công ty Hùng Tiến, Cần Thơ (đặc điểm hóa lý trình bày trong phụ lục A) NaCl 34
Đồ án tốt nghiệp Agar Chloramphenicol Nystatin Phenol red Nynhydrin HCl NaNO3 Đệm phosphate pH = 7 Glycerol Cồn 960, 700 Nước cất Moslich 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Mục đích Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học bảo quản hạt . 2.3.2 Mục tiêu Khảo sát khả năng đối kháng nấm sinh aflatoxin của sản phẩm trao đổi chất dịch nuôi cấy vi khuẩn Baccillus sp. CS1b và ứng dụng trong việc bảo quản hạt đậu phộng. 2.3.3 Nội dung 1. Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp. CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng nấm cho vi khuẩn Bacillus sp. CS1b 2. Xác định thời gian nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp. CS1b để khả năng đối kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b đạt khả năng kháng nấm Aspergillus sp. CĐP1 cực đại. 35
Đồ án tốt nghiệp 3. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b sau ly tâm. 4. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi cấy sau ly tâm. 5. Khảo sát thành phần hóa học của các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Bacillus sp. CS1b có hoạt tính kháng nấm. 6. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn trong việc bảo vệ hạt đậu phộng. 2.4 Bố trí thí nghiêm và phương pháp 2.4.1 Khảo sát khả năng đối kháng nấm. Hoạt hóa vi khuẩn CSb1 Nuôi cấy vi khuẩn trong NB1có chất cảm ứng trong từng thời gian 24h, 48h, 72h Ly tâm Bã Xử lý nhiệt Kết tủa enzyme Trích ly canh trường nuôi cấy (1000C/15p) bằng ethanol sau ly tâm (Ở từng thời gian nuôi cấy) bằng ethyl acetate Khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus sp. CĐP1 của vi khuẩn Bacillus sp. 36 Khảo sát thành phần hóa học của các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Bacillus sp. CS1b có hoat tính kháng nấm.
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1: Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus sp. CĐP1 của vi khuẩn Bacillus sp. CS1b 2.4.1.1 Tăng sinh nấm CĐP1 Chuẩn bị môi trường PDB Hấp khử trùng (1210C, 15phút) Làm nguội (300C) Giống nấm Nuôi cấy (150 vòng/ CĐP1 phút,48 giờ,t0 phòng) Thu sinh khối tế bào nấm 37 Sấy khô ở 850C
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2: Sơ đồ thu sinh khối nấm CĐP1. - Chuẩn bị 500ml môi trường PDB, có bổ sung chloramphenicol (0.2%) cho vào bình erlen 2000 ml. Sau đó, hấp khử trùng môi trường ở 1210C trong 15 phút. - Hoạt hóa giống trên đĩa Petri PDA đến khi nấm có màu xanh đậm. Cắt thạch chứa bào tử nấm mốc cho vào môi trường PDA lỏng đã được làm nguội (300C), lắc tăng sinh 150 vòng / phút trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng. - Sau đó, lọc dịch nuôi cấy thu sinh khối, phần sinh khối tế bào được làm khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 850C đến khi khối lượng không đổi (khoảng 4 giờ). - Phân tích hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl. 2.4.1.2 Nhân giống vi khuẩn VK giữ giống trong Eppendorf (glycerol tủ đông) cấy chuyển 0,1 ml sang chai 100 ml chứa 10 ml MT NB (đã hấp khử trùng), hoạt hóa bằng cách nuôi cấy nhiệt độ phòng, máy lắc 150 vòng/ phút (máy lắc vòng) thời gian 24 giờ. Canh trường được pha loãng 10-6, 10-7 rồi cấy trang trên đĩa NA, ủ to phòng 24 giờ. Cấy 1 khuẩn lạc từ đĩa Petri vào 10 ml môi trường NB (chai 100 ml) đã được hấp khử trùng 121oC 1 atm trong 15 phút, nuôi cấy nhiệt độ phòng, máy lắc 150 vòng/ phút (máy lắc vòng) thời gian 24 giờ. 2.4.1.3 Lên men vi khuẩn thu sản phẩm trao đổi chất kháng nấm (môi trường có bổ sung tơ nấm làm chất cảm ứng) Chuẩn bị 3 bình môi trường mỗi bình chứa 100 ml NB1 có bổ sung tơ nấm làm chất cảm ứng tỷ lệ 1% (1 g/ 100 ml MT) sau đó hấp tiệt trùng. Cấy 1% giống đã được tăng 38
Đồ án tốt nghiệp sinh trước đó vào rồi đem lắc 150 vòng / phút trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ (sử dụng bình 500 ml). Từ 100 ml canh trường vi khuẩn được đem ly tâm 4000 vòng / phút trong 15 phút thu 90 ml dịch nổi sau ly tâm. 2.4.1.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm Chuẩn bị môi trường: PDA được hấp khử trùng 1210C, 1atm trong 15 phút, đổ đĩa petri đường kính 9 cm. Nấm đã được chuẩn bị trước bằng cách cấy điểm 1 bào tử ở tâm đĩa petri trên môi trường PDA, ủ từ 3 đến 5 ngày. Cắt miếng thạch có chứa bào tử nấm đặt vào tâm đĩa chuẩn bị đối kháng. Đục 4 lỗ thạch đường kính 0.8 cm trên đĩa thạch PDA. Mỗi đĩa cách đều tâm 1,5 cm. Dịch nổi sau ly tâm ở từng thời gian nuôi cấy 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ sẽ lần lượt được bơm và 4 giếng thạch mỗi giếng 0,1 ml dịch, đối chứng sử dụng môi trường NB1 thay thế cho dịch nổi sau ly tâm. Đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày. (Thí nghiệm lặp lại 3 lần). 2.4.1.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm đã qua xử lý nhiệt 100 0 C Chuẩn bị môi trường: môi trường được chuẩn bị như phần khảo sát chưa qua xử lý nhiệt. Sau khi ly tâm thu dịch nổi ở từng thời gian nuôi cấy 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ. Lấy 50 ml dịch ở mỗi thời gian nuôi cấy rồi đem đi đun cách thủy ở 100 0 C trong 10 phút. Sau đó bơm lần vào giếng thạch mỗi giếng 0,1 ml dịch, đối chứng sử dụng môi trường 39
Đồ án tốt nghiệp NB1 cũng đã được xử lý nhiệt thay thế cho dịch nổi sau ly tâm. Đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày. (Thí nghiệm lặp lại 3 lần). Sau thời gian ủ 5 ngày, đo đường kính nấm mốc ở đĩa đối chứng và đĩa thí nghiệm ở 2 thí nghiệm dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm và dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm đã qua xử lý nhiệt 100 0 C. Tỷ lệ ức chế được tính như sau: I% = ( DĐC – DTN)/DĐC × 100 2.4.1.6 Khảo sát khả năng đối kháng của protein kết tủa từ canh trường nuôi cấy vi khuẩn Hình 2.3: Quy trình thu hồi protein kết tủa bằng ethanol 960 40
Đồ án tốt nghiệp Canh trường lên men 24 giờ được ly tâm 4000 vòng/phút x 20 phút. Kết tủa protein từ 20 ml dịch nổi canh trường nuôi cấy vi khuẩn với tỉ lệ ethanol : dịch ly tâm = 1:1- 32:1 ở nhiệt độ 4 o C (làm lạnh ethanol và dịch nổi sau ly tâm trước khi kết tủa), để qua đêm, sau đó ly tâm thu tủa ở 4000 vòng/phút x 20 phút (hấp khử trùng ống ly tâm). Kết tủa được hòa tan vào 4 ml đệm phosphate pH = 7,0 (đã được hấp khử trùng) và cho vào ống nghiệm có nắp đã được hấp khử trùng. Định tính enzyme protease, chitinase, 훃- glucanase của protein kết tủa. Chuẩn bị đĩa thạch chứa cơ chất khảo sát: Môi trường casein: 1% casein, 2% agar Môi trường chitin: 1% huyền phù chitin, 2% agar Môi trường 훽- glucan: 1% 훽- glucan, 2 % agar Tất cả môi trường đều hòa vào dung dịch đệm photphate pH = 7. Bơm protein kết tủa được ở từng nồng độ ethanol vào đĩa thạch như khảo sát enzyme của dịch nuôi cấy sau ly tâm. Sử dụng đối chứng đệm phosphate pH = 7,0 thay cho kết tủa protein. Đem ủ ở 37 o C trong 48 giờ. (Thí nghiệm lặp lại 3 lần). Hoạt tính protease dương tính khi môi trường xung quanh đĩa tạo vùng trong suốt, có thể tăng độ tương phản nhờ nhỏ Lugol trên bề mặt thạch. Hoạt tính chitinase dương tính khi môi trường xung quanh đĩa tạo vùng trong suốt, có thể tăng độ tương phản nhờ nhỏ Lugol trên bề mặt thạch. Hoạt tính 훽- glucanase dương tính khi môi trường xung quanh đĩa tạo vùng trong suốt, có thể tăng độ tương phản nhờ nhỏ Lugol trên bề mặt thạch. Chuẩn bị đĩa thạch chứa cơ chất khảo sát như khảo sát enzyme của dịch nuôi cấy sau ly tâm. 41
Đồ án tốt nghiệp Khảo sát khả năng đối protein kết tủa với CĐb1. Chuẩn bị môi trường: môi trường được chuẩn bị như phần khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy sau ly tâm với nấm CĐP1. Bơm protein kết tủa được ở từng nồng độ ethanol vào đĩa thạch như khảo sát enzyme của dịch nuôi cấy sau ly tâm. Sử dụng đối chứng đệm phosphate pH = 7,0 thay cho kết tủa protein. Đem ủ ở 30 o C trong 5 ngày. (Thí nghiệm lặp lại 3 lần). Khảo sát khả năng đối kháng của dung dịch protein kết tủa tương tự như mô tả trong quy trình đối kháng dịch ly tâm canh trường nuôi cấy vi khuẩn, ngoài đối chứng nấm mọc trên đĩa không bổ sung dịch vào giếng thạch, còn có thêm đối chứng đệm phosphate để khảo sát ảnh hưởng của đệm phosphate lên sự phát triển nấm mốc. 2.4.1.7 Trích li canh trường nuôi cấy sau li tâm bằng ethyl acetate 42
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4: Quy trình thu hồi cao EA Lấy 20 ml dịch nuôi cấy sau li tâm cho vào bình trích ly, sau đó thêm 20 ml ethyl acetate lắc đều, để yên cho đến khi phân pha. Thu lấy pha hữu cơ (phần dịch nổi phía trên). Pha nước (phần dịch ở dưới) sẽ đem trích li với ethyl acetate lần thứ 2 và 3 với tỷ lệ 1:1. Tiến hành trích ly đối với dịch sau ly tâm thu được sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ nuôi cấy. Pha hữu cơ (gom 3 lần trích ly) được làm khô với Na2SO4, lọc loại bỏ Na2SO4, sau 0 đó cô quay để bay hơi ở nhiệt độ 50 C. Thu hồi cặn rắn và đem cân (17 mg), sau đó hòa tan trong DMSO 5 % với nồng độ mg/ml thu được cao EA. 43
Đồ án tốt nghiệp Cao EA sau khi thu được đem thanh trùng 70 0C trong 15 phút sau đó tiến hành khảo sát khả năng đối kháng với nấm CĐP1. Khảo sát khả năng đối kháng cao ethyl acetate với CĐP1. Khảo sát khả năng đồi kháng nấm của cao chiết bằng ethyl acetate từ dịch nuôi cấy sau ly tâm ở từng thời gian nuôi cấy 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ Chuẩn bị môi trường Bơm vào đĩa petri đã được vô trùng 1 ml cao ethyl acetate sau đó cho 9 ml môi trường PDA được hấp khử trùng 1210C, 1atm trong 15 phút, lắc nhẹ. Đĩa đối chứng thay cao ethyl acetate bằng DMSO 5%. Nấm đã được chuẩn bị trước bằng cách cấy điểm 1 bào tử ở tâm đĩa petri trên môi trường PDA, ủ từ 3 đến 5 ngày. Tiến hành đối kháng Cắt miếng thạch có chứa bào tử nấm đặt vào giữa đĩa môi trường đã chuẩn bị sẵn. Đem ủ ở 30 0C trong 5 ngày. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của cao chiết bằng ethyl acetate từ dịch nuôi cấy sau ly tâm ở từng nồng độ cao khác nhau Chuẩn bị môi trường Từ kết quả đối kháng nấm của cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi cấy sau ly tâm ở từng thời gian nuôi cấy, biết được thời gian nuôi cấy nào tốt nhất. Bơm vào đĩa petri đã được vô trùng cao ethyl acetate và môi trường PDA được hấp khử trùng 1210C, 1atm trong 15 phút với nồng độ 0,5 ml cao ethyl acetate + 0,5 ml DMSO 5 % + 9 ml PDA, 1 ml cao ethyl acetate + 9 ml PDA, 1,5 ml cao ethyl acetate + 8,5 ml PDA, 2 ml cao ethyl acetate + 8 ml PDA. Sau đó lắc nhẹ. Đĩa đối chứng thay cao ethyl acetate bằng DMSO 5%. Nấm đã được chuẩn bị trước bằng cách cấy điểm 1 bào tử ở tâm đĩa petri trên môi trường PDA, ủ từ 3 đến 5 ngày. Tiến hành đối kháng 44
Đồ án tốt nghiệp Cắt miếng thạch có chứa bào tử nấm đặt vào giữa đĩa môi trường đã chuẩn bị sẵn. Đem ủ ở 37 0C trong 5 ngày. Khảo sát thành phần hóa học dịch nuôi cấy, dịch kết tủa bằng cồn và cao ethyl acetate. Để xác định tác nhân đối kháng nấm mốc, canh trường sau khi loại bỏ tế bào được sử dụng để kết tủa protein và trích ly các hợp chất khác protein bằng dung môi kị nước chủ yếu nhằm vào các hợp chất thứ cấp VK. Bằng các phương pháp định tính các hợp chất hóa học truyền thống như thuốc thử molisch cho carbohydrate, thuốc thử biuret cho liên kết peptide, thuốc thử ninhydrin cho nhóm NH2- tự do, coomasie blue cho lipid, Dragendorff cho alkaloid. Định tính carbohydrate Thử nghiệm Molisch: Hút một ít dịch cho vào ống nghiệm, sau đó cho vài giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ từ từ 2 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào và đọc kết quả. Kết quả được xem là dương tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ - tím. Định tính alkaloid Thử nghiệm Dragendorff: Hút một ít dịch cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng cam. Định tính amino acid Thử nghiệm Ninhydrin: Hút một ít dịch cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin, đun sôi 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi thấy xuất hiện màu tím (Yadav và ctv, 2013). Định tính protein 45
Đồ án tốt nghiệp Thử nghiệm Biuret: Hút một ít dịch cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Biuret, lắc đều sau đó để yên. Kết quả dương tính khi thấy xuất hiện màu tím hoặc màu hồng tím. Định tính lipid Thử nghiêm thực hiện trên bản mỏng. Chấm dịch trên bảng mỏng sau đó sử dụng thuốc thử coomasie blue phun hiện màu. Kết quả dương tính là xuất hiện màu xanh ở điểm chấm dịch. 46
Đồ án tốt nghiệp 2.4.2 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của VK có hoạt tính kháng nấm trong bảo quản hạt Hạt đậu phộng Khử trùng Coating trong 3 giờ Để khô ở nhiệt độ phòng Phối 12 g đậu phộng vào chai 100 ml Bào tử nấm được pha Cấy bào tử nấm vào loãng tới 10-6 chai chứa đậu phộng Ủ ở nhiệt độ phòng Quan sát thời gian từ 3 – 10 ngày Hình 2.5: Sơ đồ ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng bằng màng bao kháng nấm 47
Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.1: Bố trí các thí nghiệm tạo màng bao hạt đậu phộng Thí nghiệm Dung dịch Tỷ lệ % Đậu phộng (g) ĐC1 Nước cất 100% 12 ĐC2 Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 100% 12 Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% ĐC3 12 DMSO 5% 50% Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% ĐC4 12 Niystatin 0.4% 50% Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% NT1 12 Canh trường trong môi trường NB1 50% TN1 Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% NT2 12 Canh trường trong môi trường NB 50% Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% NT1 12 Sinh khối NB1 + nước muối sinh lý 50% TN2 Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% NT2 12 Sinh khối NB + nước muối sinh lý 50% Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% NT1 12 Dịch nuôi cấy sau ly tâm. 50% TN3 Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% NT2 12 Dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý 1000C 50% Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% TN4 12 cao EA trong DMSO 5% 50% Điều chỉnh các dung dịch về pH 5 48
Đồ án tốt nghiệp Khử trùng hạt đậu phộng Hạt đậu phộng được khử trùng bằng cồn 700 và rửa lại bằng nước cất. Ngâm hạt trong dung dịch màng bao trong 3 giờ. Ngâm mẫu hạt đậu phộng đã khử trùng trong 3 giờ lần lượt trong các dung dịch được chuẩn bị theo như bảng 2.1. Làm khô hạt Sau đó, đậu phộng đã ngâm được làm khô ở nhiệt độ phòng và phân phối vào chai 100ml. Cấy bào tử nấm Bào tử nấm chỉ thị aflatroxin được chuẩn bị trước bằng cách cấy điểm 1 bào tử ở tâm đĩa petri đường kính 9 cm đổ môi trường PDA, ủ từ 3-5 ngày. Tiến hành cắt 1 miếng thạch kích thước 1x1 (cm) có chứa bào tử nấm cho vào ống nước muối sinh lý đã hấp khử trùng. Sau đó, pha loãng đến nồng độ 10-6. Hút 0.1 ml dịch pha loãng nồng độ 10-6 vào các chai 100ml chứa 12 g đậu phộng. Lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần. Lắc đều chai đậu phộng và ủ ở nhiệt độ phòng. Quan sát kết quả theo thời gian 3, 5, 7, 12 ngày. 49
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp. CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng nấm cho vi khuẩn Bacillus sp. CS1b Theo nghiên cứu ĐATN Nguyễn Vân Hương (K2011) [3], chủng Bacillus sp. CS1b chỉ thể hiện khả năng kháng nấm khi được đối kháng trực tiếp hoặc thu dịch nuôi cấy trong môi trường có tơ nấm làm cảm ứng. Vì vậy để tiếp tục nghiên cứu sản xuất hợp chất kháng nấm từ Bacilus sp. CS1b, việc đầu tiên là sản xuất sinh khối tơ nấm từ nấm chỉ thị Aspergillus sp. CĐP1. Sau khi tăng sinh được 48 giờ tiến hành thu sinh khối nấm, sinh khối nấm màu vàng nhạt và lơ lửng trong môi trường nuôi cấy (hình 3.1) a) b) Hình 3.1: Sản xuất sinh khối tơ nấm CĐP1 trong môi trường PDB a) Dịch nuôi cấy, b) Sinh khối tơ nấm sau khi sấy. Tính toán hàm lượng % nitơ tổng số có trong sinh khối nấm CĐP1 sấy khô. 1.42 × ( 1− 2) × 100 1.42 × (20 −18) × 100 N% = × = × 1 = 2,84 % ×1000 0.1×1000 50
Đồ án tốt nghiệp Trong đó: V1: số ml H2SO4 0,1N cho vào bình hứng. V2: số ml NaOH 0,1N ddax chuẩn độ. m: số g mẫu. 1,42: hệ số, cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42 mg Nitơ. 1000: hệ số chuyển đổi mg sang g. f: hệ số pha loãng ( = với v: thể tích dung dịch đem cất đạm, a: thể tích bình 푣 định mức chứa mẫu sau vô cơ hóa) Hàm lượng % protein tổng số được tính theo công thức: P(%) = N × 6.25 = 2,84 x 6,25 = 17,75 % Trong đó: N: hàm lượng % Nitơ tổng số 6.25: hệ số chuyển đổi. 3.2 Xác định thời gian nuôi cấy để khả năng đối kháng nấm CĐP1 cực đại Trong môi trường nuôi cấy có bổ sung tơ nấm làm chất cảm ứng, các hợp chất kháng nấm có thể được sinh ra đồng thời với tăng trưởng tức là sau 24 giờ nuôi cấy hoặc trễ hơn. Vì vậy, vi khuẩn được nuôi cấy theo từng thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và khảo sát khả năng đối kháng nấm mốc của dịch nuôi cấy sau ly tâm loại bỏ tế bào và dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý nhiệt. 3.2.1 Dịch nuôi cấy sau ly tâm Tiến hành khảo sát khả năng đối kháng của dịch sau ly tâm với nấm CĐP1 bằng phương pháp khuếch tán trong giếng thạch nhằm chọn ra thời gian nuôi cấy để vi khuẩn tiết ra hợp chất có khả năng kháng nấm CĐP1 tốt. Sau 5 ngày đọc kết quả xác định tỷ lệ đối kháng. So với đối chứng chỉ cấy nấm, hình thái nấm mốc trong các đĩa 51
Đồ án tốt nghiệp cấy dịch nuôi cấy có tơ nấm CĐP1 làm chất cảm ứng thu ở từng thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ đều phát triển không bình thường, nấm bị khuyết tại các điểm bơm dịch nuôi cấy (hình 3.2 A, B, C). Hình 3.2: Kết quả đối kháng của dịch sau ly tâm của VK CS1b với nấm CĐP1, ĐC âm: sử dụng môi trường NB1, ĐC dương: sử dụng Nystatin, - Thí nghiệm không xử lý nhiệt: A: 24 giờ, B: 48 giờ, C: 72 giờ, - Thí nghiệm xử lý nhiệt 100 0 C: D: 24 giờ, E: 48 giờ, F: 72 giờ 52
Đồ án tốt nghiệp Kết quả đối kháng của dịch nuôi cấy sau ly tâm ở 24 giờ cho tỷ lệ đối kháng cao nhất 60,1 %. Ở thời điểm 24 giờ khả năng sinh trưởng và phát triển của Bacillus là cao nhất và có thể tiếp tục phát triển lên đến thời gian 72 giờ. Từ khảo sát trên thấy rằng ở thời điểm 24 giờ vi khuẩn sinh ra các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao nhất và hoạt tính giảm dần sau 48 giờ và 72 giờ. 3.2.2 Dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý nhiệt Nuôi cấy vi khuẩn CS1b trong môi trường có bổ sung tơ nấm, sau đó thu dịch nuôi cấy theo từng thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ rồi đem đi đun cách thủy ở nhiệt độ 1000C. Khảo sát khả năng đối kháng của dịch sau ly tâm với nấm CĐP1 bằng phương pháp khuếch tán trong giếng thạch. Sau 5 ngày đọc kết quả xác định tỷ lệ đối kháng. Đĩa thạch sử dụng môi trường NB1 làm đối chứng nấm phát triển mạnh mẽ, các đĩa cấy dịch nuôi cấy thu được ở từng thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ nấm phát triển chậm (hình 3.2 D, E, F). Kết quả đối kháng của dịch nuôi cây sau ly tâm ở 24 giờ cho tỷ lệ đối kháng cao nhất 50,4 %. Quá trình xử lý nhiệt 100 0 C nhằm phá hủy và ngăn chặn sự ảnh hưởng của các enzyme có mặt trong dịch nuôi cấy sau ly tâm của VK CS1b lên khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy VK CS1b sau ly tâm và nấm CĐP1, ngoài ra quá trình khảo sát này còn cho ta biết được trong trong quá trình Bacillus spp (CS1b) sinh trưởng và phát triển thì chúng đã tiết ra các hợp chất kháng sinh có hoạt tính sinh học có khả năng ức chế sự sinh trưởng của nấm. 3.2.3 So sánh khả năng đối kháng dịch nuôi cấy sau ly tâm với nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b ở từng thời gian nuôi cấy và điều kiện xử lý nhiệt Tỷ lệ đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b ở 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ với nấm CĐP1 được trình bày ở bảng 3.1. 53
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1: Tỷ lệ đối kháng (%) của dịch nuôi cấy VK CS1b với nấm CĐP1. TỶ LỆ ĐỐI KHÁNG CỦA DỊCH SAU LY TÂM VỚI CĐP1 Điều kiện 24 giờ 48 giờ 72 giờ ĐC NB ĐC Nystatin 0,4 % Nhiệt độ thường (%) 60,1 ± 0,7a 35,7 ± 1,3c 30,7 ± 3,6c 0,0 ± 0,7 64,3 ± 1,9a Xử lý 100 0C (%) 50,4 ± 2,9b 32,4 ± 1,9c 20,6 ± 2,5d 0,0 ± 0,7 64,3 ± 1,9a (Ghi chú : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α = 0,05 trong cùng một thí nghiệm) Ở điều kiện nhiệt độ thường khả năng đối kháng của dịch sau ly tâm có bổ sung tơ nấm ở thời gian nuôi cấy 24 giờ cho tỷ lệ kháng tốt nhất 60,1 % cùng hạng a với đối chứng dương Nystatin 64,3 %. Ở điều kiện xử lý nhiệt khả năng đối kháng của dịch sau ly tâm ở từng thời gian nuôi cấy thì ở 24 giờ cho tỷ lệ kháng tốt hơn 50,4 % xếp hạng b. Tỷ lệ kháng không có sự khác biệt ở dịch sau ly tâm không xử lý nhiệt ở thời gian 48 giờ tỷ lệ 35,7 %, 72 giờ tỷ lệ 30,7 % và dịch sau ly tâm xử lý nhiệt ở 48 giờ tỷ lệ 32,4 % cả 3 cùng xếp hạng c. Tỷ lệ kháng thấp nhất là dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý nhiệt 100 0 C ở 72 giờ nuôi cấy là 20,6 % xếp hạng d. Sau khi khảo sát khả năng đối kháng của dịch sau ly tâm ở từng thời gian nuôi cấy thì dịch nuôi cấy sau ly tâm ở 24 giờ nuôi cấy cho tỷ lệ đối kháng cao nhất 60,1 % (hình 3.3) xếp cũng hạng a với đối chứng dương Nystatin 64,3 %. Sự khác biệt có mức ý nghĩa α = 0,05 với độ tinh cậy 95 %. 54
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b ở từng thời gian nuôi cấy và từng điều kiện xử lý dịch sau ly tâm. 3.3 Khảo sát khả năng đối kháng nấm của protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b sau ly tâm. 3.3.1 Quy trình thu hồi protein kết tủa có hoạt tính sinh học Với các ưu điểm của ethanol trong việc sử dụng làm dung môi thu hồi enzyme như: Thu hồi được enzyme ở dạng tinh khiết với ít tạp chất gây nhiễm độc hay ức chế đối với enzyme Nhiệt độ bay hơi của enzyme thấp nên dễ dàng tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme bằng phương pháp sấy nhẹ bằng gió. Giá thành tương đối rẻ. Tuy nhiên bên cạnh đó thì tủa bằng ethanol cũng tồn tại một số hạn chế như: làm mất hoạt tính sinh học của enzyme, thời gian thu hồi quá lâu hay quá nhanh cũng làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, nhiệt độ thu hồi quá cao hay quá thấp cũng gây mất hoạt tính của chúng 55
Đồ án tốt nghiệp Với mục đích của bài là thu hồi enzyme có độ tinh khiết cao, hàm lượng nhiều, có thể ứng dụng vào sản xuất thì ethanol 960 được lựa chọn là dung môi thu hồi. Từ kết quả đối kháng dịch ly tâm của canh trường nuôi cấy VK CS1b với nấm CĐP1 cho ta biết đươc thời gian nuôi cấy VK ở 24 giờ thì dịch sau ly tâm cho tỷ lệ đối kháng cao nhất. Có thể trong thời gian này thì hoạt tính enzyme mạnh, vì vậy dịch ly tâm từ canh trường nuôi cấy VK CS1b sau 24 giờ sẽ được đem đi kết tủa protein có hoạt tính sinh học. Tiến hành tủa protein ở các nồng độ dịch : ethanol từ 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32. Hỗn hợp sẽ để trong tủ lạnh ngăn mát qua đêm rồi mới đem ly tâm thu tủa. Quá trình ly tâm cũng ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme. Khi ly tâm ở tốc độ lớn hay trong thời gian dài thì làm nhiệt độ trong hỗn hợp tăng lên có thể làm biến tính protein mất hoạt tính enzyme. Trong luận văn tốt nghiệp của hai sinh viên Văn Hương và Tuyết Mai (2015) đã thu dịch nổi từ ly tâm canh trường nuôi cấy ở 4000 vòng/phút trong hai 20 phút. Khi đem định tính enzyme thì chúng vẫn cho kết quả các enzyme protease, chitinase, β- glucanase dương tính. Vì vậy hỗn hợp dịch : ethanol sẽ ly được ly tâm ở 4000 vòng/phút trong hai 20 phút. Enzyme hoạt động tốt ở pH trung tính do đó đệm phosphate pH 7 sẽ được sử dụng để hòa tan protein kết tủa. 3.3.2 Định tính enzyme protease, chitinase, 휷- glucanase của protein kết tủa. Áp dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch để định tính enzyme protease, chitinase và β – glucanase có trong từng nồng độ ethanol dùng để kết tủa protein từ 1:1 – 1:32. Ghi lại kết quả sau 48 giờ ủ ở nhiệt độ 370C. Các tỷ lệ dịch : ethanol thu protein kết tủa đều có hoạt tính enzyme chitinase (hình 3.4 và bảng 3.2). Hoạt tính protease cũng được thấy rõ ở các tỷ lệ kết tủa protein (hình 3.5 và bảng 3.2). Riêng khi khảo sát enzyme β – glucanase sử dụng cơ chất β – glucan thì không thấy được các vòng phân 56
Đồ án tốt nghiệp hủy β – glucan màu sáng (hình 3.6). Bảng 3.2 cho thấy đường kính vòng phân giải của chủng vi khuẩn trên đĩa thạch chứa cơ chất tương ứng. Do đây chỉ là phương pháp định tính nên cũng chưa thực sự chính xác. Để xác định rõ sự có mặt của các enzyme này ta cần tiến hành định lượng chúng vì cũng có thể do sự ảnh hưởng của cồn làm mất hoạt tính của 훽– glucanase. Bảng 3.2: Đường kính phân giải của enzyme của protein kết tủa bằng ethanol KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME CỦA PROTEIN KẾT TỦA (mm) Tỷ lệ dịch : ethanol 960 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Đường kính (chitinase) 18 23 27 27 21 20 Đường kính (protease) 15 20 24 23 22 20 Hình 3.4: Khả năng phân giải chitin của protein kết tủa, Protein kết tủa ở tỷ lệ dịch : ethanol: 1:1, 1:2 , 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 57
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5: Khả năng phân giải casein của protein kết tủa. Protein kết tủa ở tỷ lệ dịch : ethanol: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 Hình 3.6 Khả năng phân giải 훽– glucanase của protein kết tủa. Protein kết tủa ở tỷ lệ dịch : ethanol: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 58
Đồ án tốt nghiệp 3.3.3Khảo sát khả năng đối protein kết tủa với CĐb1 Sự ảnh hưởng của đệm phosphate lên sự phát triển nấm mốc là không đáng kể. Trong thí nghiệm, đối chứng có đệm có tỷ lệ đối kháng không đáng kể (12%) trong khi sử dụng enzyme thì đối kháng cao lên tới 58 % bảng 3.3. Tỷ lệ đối kháng với nấm CĐP1 của protein kết tủa thu được ở từng nồng độ kết tủa dịch : cồn không giống nhau và sự khác biệt này không có ý nghĩa. Mặc dù ethanol 960 là dung môi có ưu điểm thu được enzyme với độ tinh sạch cao tuy nhiên với nồng độ ethanol quá cao thì có thể gây biến tính enzyme làm cho enzyme mất hoạt tính. Ở tỷ lệ dịch : ethanol từ 1:1 (41 %) đến 1:2 (48 %) thì tỷ lệ đối kháng với nấm tăng lên và sau đó giảm ở ở tỷ lệ 1:4 (35 %). Điều này có thể cho thấy rằng ở tỷ lệ 1:2 ta thu được tủa protein có hoạt tính tương đối tốt và đến tỷ lệ 1:4 thì có thể do nồng độ ethanol cao làm biến tính protein làm khả năng đối kháng với nấm CĐP1 giảm xuống. Nhưng từ tỷ lệ 1:8 đến 1:32 thì tỷ lệ đối kháng này tăng lên đáng kể. Nguyên nhân dẫn đến sự tăng đột biến này có thể là do lượng ethanol dùng để kết tủa quá nhiều, quá trình thu hồi ethanol còn sót lại nên kết quả đối kháng có thể do ethanol. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA PROTEIN KẾT TỦA (mm) Tỷ lệ dịch : ethanol 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Đệm phosphate pH 7 Tỷ lệ đối kháng % 41 48 35 54 58 48 12 Bảng 3.3: Khả năng đối kháng với CĐP1 của protein kết tủa bằng ethanol 59
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.7: Khả năng ức chế nấm mốc CĐP1 của dung dịch protein kết tủa. Đối chứng âm: ĐC âm, Đệm phosphate pH 7: pH 7, Protein kết tủa ở tỷ lệ dịch : ethanol: 1:1, 1:2 , 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 3.4 Khảo sát khả năng đối kháng cao ethyl acetate với CĐb1. 3.4.1 Quá trình thu cao EA Khi sử dụng dung môi hữu cơ để trích ly cần chú ý đến tính ái lực của chúng đối với các bề mặt kỵ nước của hợp chất cần thu hồi. Nghiên cứu của Md. Rezuanul Islam và ctv (2012) [6] đã sử sử dụng ethyl acetate để thu hồi các hợp chất kháng sinh từ dịch nuôi cấy C9 và cao chiết này có kết quả ức chế đáng kể. 60
Đồ án tốt nghiệp Từ khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy sau ly tâm, ta thấy rằng tồn tại trong dịch nuôi cấy ngoài enzyme ngoại bào còn có các hợp chất thứ cấp, dịch sau ly tâm từ canh trường nuôi cấy VK CS1b ở 24 giờ cho đối kháng tốt hơn so với dịch ly tâm từ canh trường ở thời gian nuôi cấy 48 giờ, 72 giờ ở cùng điều kiện xử lý nhiệt. Vậy quá trình trích ly cao EA sẽ sử dụng dịch sau ly tâm từ canh trường nuôi cấy ở thời gian 24 giờ. Quá trình trích ly các hợp chất từ dịch sau ly tâm bằng ethyl acetate với tỷ lệ dịch ethyl acetate là 1:1. Sau khi thu được pha hữu cơ ở lần đầu tiên tiếp tục cho ethyl acetate vào với tỷ lệ pha nước thu lần 1: ethyl acetate 1:1 lập lại như vậy ở lần thứ 3. Điều này đảm bảo có thể thu tối ưu nhất các hợp chất thứ cấp có trong dịch sau ly tâm từ canh trường nuôi cấy vi khuẩn CS1b. Pha hữu cơ thu được từ 3 lần trích ly đem đi loại nước còn sót lại bằng muối 0 Na2SO4 sau đó bay hơi ở nhiệt độ 50 C, ở nhiệt độ này thì các hợp chất sẽ vẫn giữ được hoạt tính của chúng. Khi bay hết ethyl acetate thu được cặn, đem cặn đi cân xác định khối lượng (mg), cặn này gọi là cao EA. Sử dụng DMSO với nồng độ 5 % để hòa tan cao EA với nồng độ mg/ml. Với nồng độ này nhằm giảm thiểu khả năng ảnh hưởng của DMSO lên hoạt tính của các hợp chất thu được. 3.4.2 Khảo sát sự ức chế của cao EA với nấm CĐP1 3.4.2.1 Khảo sát khả năng đồi kháng nấm của cao chiết bằng ethyl acetate từ dịch nuôi cấy sau ly tâm ở từng thời gian nuôi cấy 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ Hình 3.8 cho thấy khả năng đối kháng của cao ethyl acetate trong DMSO 5% đối với nấm mốc CĐP1. 61
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8: Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của cao EA. A: đối chứng thạch PDA, B: Thạch chứa DMSO 5 %, C: Thạch chứa cao ethyl acetate từ dịch nuôi cấy 24 giờ, D: Thạch chứa cao ethyl acetate từ dịch nuôi cấy 48 giờ, E: Thạch chứa cao ethyl acetate từ dịch nuôi cấy 72 giờ. Cao ethyl acetate trong DMSO 5% có khả năng làm mất màu bào tử. DMSO là dung môi có thể hòa tan tốt các hợp chất kị nước như lipid tuy nhiên có thể ảnh hưởng lên tăng trưởng nấm mốc. Để loại trừ tác dụng của dung môi khi khảo sát khả năng đối kháng của hoạt chất, đối chứng DMSO 5% kháng nấm được tiến hành và cho kết quả làm mất màu nấm mốc, nhưng khi so sánh với màu các thí nghiệm cao ở từng thời gian thì thấy ở 24 giờ màu của bào tử nấm bị mất hoàn toàn, còn ở 48 giờ, 72 giờ và DMSO 5 % mất màu ít hơn (hình 3.8). Điều này chứng tỏ có tồn tại hợp chất ức chế nấm mốc trong cao EA thu hồi từ canh trường nuôi cấy Bacillus sp. Csb1 và hợp chất này được thu hồi nhiều nhất sau 24 giờ nuôi cấy. 62
Đồ án tốt nghiệp 3.4.2.2 . Khảo sát khả năng đối kháng nấm của cao chiết bằng ethyl acetate từ dịch nuôi cấy sau ly tâm ở từng nồng độ cao khác nhau Khi so sánh màu nấm mốc ở các thí nghiệm có nồng độ cao bổ sung vào đĩa thạch khác nhau thì màu bào tử nấm mất dần khi tăng nồng độ cao được bổ sung vào môi trường thạch (hình 3.9). Hình 3.9: Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của cao EA, A: đối chứng thạch PDA, B: Thạch chứa DMSO 5 %, C: Thạch chứa 5 % cao ethyl acetate + 0.5 ml DMSO 5 %, D: Thạch chứa 10% cao ethyl acetate, E: Thạch chứa 15 % cao ethyl acetate, F: Thạch chứa 20 % cao ethyl acetate. Theo kết quả bảng 3.4 xử lý thống kê cho thấy nồng độ cao EA 5 % trong DMSO 5% đủ đạt tỉ lệ đối kháng cao nhất đối với cao EA là 20-30 %. Tiếp tục tăng nồng độ cao EA, tỉ lệ đối kháng hầu như không tăng (sai khác không có ý nghĩa thống kê). 63
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4 Tỷ lệ đối kháng (%) theo từng nồng độ của cao ethyl acetate với nấm CĐP1: Các nồng độ cao EA Tỷ lệ đối kháng (%) từng nồng độ DMSO 5 % 5.4a ± 3,61 5 % cao ethyl acetate 20.3b ±1,53 10% cao ethyl acetate 30.6b ± 2,52 15 % cao ethyl acetate 30.3b ± 2,52 20 % cao ethyl acetate 31.4b ± 6,56 3.5 Khảo sát thành phần hóa học của các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Bacillus sp. CS1b có hoat tính kháng nấm. Bằng các phương pháp định tính các hợp chất hóa học truyền thống như thuốc thử Molisch cho carbonhydrat, thuốc thử biuret cho liên kết peptide, thuốc thử ninhydrin cho nhóm NH2- tự do, coomasie blue cho lipid, Dragendorff cho alkaloid, có thể xác định được trong dịch nuôi cấy chứa carbonhydrat, lipid, protein và amino acid, trong dịch kết tủa bằng cồn hòa tan trong đệm phosphate là carbonhydrat, protein và amino acid (bảng 3.5) Bảng 3.5: Định tính một số chất có trong dịch sau ly tâm, protein kết tủa và cao ethyl acetate Thử nghiệm Dịch sau ly tâm Protein kết tủa Cao Ethyl Acetate Carbonhydrat (thuốc + + - thử Molisch) Protein (thuốc thử + + - Biuret) Amino acid (thuốc + + - thử Nynhydrin) Alkaloid (thuốc thử - - - Dragendorff) Lipid (thuốc thử - - + Coomasie blue) 64
Đồ án tốt nghiệp Trong canh trường nuôi cấy và protein kết tủa có chứa amino acid, protein, carbohydrat là do trong dịch nuôi cấy có chứa các enzyme và bản thân protein kết tủa cũng là enzyme. Cao trích ly bằng ethyl acetate có chứa lipid, tuy nhiên lipid không được bổ sung vào môi trường vào kết quả kiểm tra từ dịch ly tâm cũng không có lipid có thể do trong dịch nuôi cấy nồng độ lipid quá thấp không phát hiện được. Bản chất hóa học của lipid này cần được tiếp tục khảo sát làm rõ. Trên thực tế hợp chất thứ cấp của Bacillus spp. rất đa dạng, Ting Zhang và ctv (2007) [5] đã tách chiếc và sử dụng phương pháp phân tích HPLC/MS để định danh các hợp chất có trong dịch nuôi cấy Bacillus subtilis UTBSP1 là các hợp chất thuộc nhóm lipopeptide như: surfactin và fengycin. Tuy nhiên có thể dự đoán rằng hợp chất lipid này không phải là glycolipid (phản ứng với thuốc thử Molisch âm tính), cũng không phải là lipopeptide (phản ứng với thuốc thử Biuret âm tính), nhưng chưa có cơ sở loại trừ là phospholipid. i) ii) iii) Hình 3.10: Định tính một số chất có trong dịch nuôi cấy ly tâm (i), protein kết tủa (ii), cao ethyl acetate (iii), A: định tính Amino acid (thuốc thử Nynhydrin), B: Alkaloid 65
Đồ án tốt nghiệp (thuốc thử Dragendorff), C: Protein (thuốc thử Biuret), D: Carbonhydrat (thuốc thử Molisch) i) A: dầu ăn, B: egg yolk, C: cao ethyl acetate D: dịch sau ly tâm, E: protein kết tủa ii) A B C D E A: dịch sau ly tâm, B: egg yolk, C: cao ethyl acetate D: dầu ăn, E: protein kết tủa Hình 3.11: Định tính lipid bằng thuốc thử coomasie blue i), sắc ký bản mỏng ii) 3.6 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của VK có hoạt tính kháng nấm trong bảo quản hạt. Chitosan là polymer sinh học có hoạt tính kháng vi sinh vật. Tuy nhiên với phân tử lớn > 100 kDa, khả năng kháng giảm mặc dù khả năng tạo màng lại thuận lợi hơn so với phân tử nhỏ. Thí nghiệm này nhằm thăm dò khả năng phối hợp chitosan và hoạt chất thu hồi từ CSb1 trong việc tạo màng bao kháng nấm. Thí nghiệm tương tự được Bin Zhang và cộng sự, 2009 thực hiện phối hợp chitosan 90 % deacetyl hóa hòa tan trong 1 % acetic acid kết hợp với chất ức chế enzyme trypsin từ đậu nành có khả năng 66
Đồ án tốt nghiệp ngăn ngừa bào từ Aspergillus flavus nảy mầm khi cảm nhiễm đậu phộng với mật độ 102 bào tử/g ). Trong thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm CĐP1 của chitosan thương mại là gần 40 % khi hòa tan chitosan 0,2 % vào 1 % acetic acid. Từ đó chitosan 0,2 % trong acid acetic 1 % được sử dụng để làm màng bao hạt đậu phộng. pH hoạt động tối ưu ở pH 5 theo khảo sát của sinh viên Thanh Nhật (2015) [8]. Theo dõi sự mọc của nấm CĐP1 cảm nhiễm với 102 bào từ /g đậu phộng và các vi sinh vật khác nhiễm từ môi trường cho kết quả như trình bày trên bảng 3.6. Thí nghiệm Dung dịch 1 3 5 7 12 ĐC1 NC _ + +++ +++ +++ ĐC2 C _ _ + ++ +++ ĐC3 C + DMSO 5% _ _ + ++ +++ ĐC4 C + Nystatin 0.4% _ _ _ _ _ Bảng 3.6: Khả năng ức chế nấm mốc và vi khuẩn phát triển trên hạt đậu phộng được bao màng chitosan và sản phẩm trao đổi chất CS1b 67
Đồ án tốt nghiệp NT1 C + CT NB1 _ _ + ++ +++ TN1 NT2 C + CT NB _ _ + ++ +++ NT1 C + SKNB1 + NaCl _ _ + ++ +++ TN2 NT2 C + SKNB + NaCl _ _ + ++ +++ NT1 C + SLTNB1 100 0C _ _ + ++ +++ TN3 NT2 C + SLTNB1 _ _ + + +++ TN4 C + CEA 70 0C _ _ _ _ + Chú thích: NC: nước cất; C: chitosan 0,2 % trong acid acetic 1 %, DMSO 5%, SKNB1: sinh khối VK trong môi trường NB1, SKNB: sinh khối VK trong môi trường NB, NaCl: nước muối sinh lý, SLT 100 0C: dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý 100 0C, , SLT: dịch nuôi cấy sau ly tâm ở môi trường NB1, CTNB: canh trường nuôi cấy trong môi trường NB, CTNB1: canh trường nuôi cấy trong môi trường NB1. ( - : không nhiễm; + nhiễm nấm mốc ít, ++ nhiễm mốc trung bình, +++ nhiễm mốc nhiều). Sau khi được khử trùng bề mặt bằng ethanol 700, hạt đậu phộng được ngâm trong dung dịch tạo màng bao gồm chitosan và các sản phẩm trao đổi chất của tế bào CS1b. Đối chứng - Nước cất (ĐC1): thí nghiệm này được bố trí để khảo sát trong môi trường tự nhiên thì đậu phộng có dễ dàng bị nhiễm nấm bệnh hay không và kết quả cho thấy rằng chỉ mới 3 ngày thì đã xuất hiện tượng nhiễm nấm và mức độ nhiễm ngày càng nặng ở các ngày sau đó. - Chitosan (0,2 % trong 1 % acetic acid) (ĐC2): Màng bao chitosan có khả năng bảo quản khá tốt vì vậy thí nghiệm này được bố trí nhằm xem khả năng bảo quản đậu phộng của chitosan được duy trì được trong bao nhiêu ngày. Kết quả 68
Đồ án tốt nghiệp khảo sát thì ngày thứ 5 đậu phộng bắt đầu bị nhiễm nấm và phát triển mạnh mẽ ở những ngày tiếp theo ngoài nấm xanh còn xuất hiện nấm đen và nấm trắng. - Đối chứng dung môi DMSO 5% (chitosan + DMSO 5 %) (ĐC3): DMSO 5% được dùng để hòa tan cao EA và DMSO 5 % cũng ảnh hưởng đến nấm làm biến đổi màu bào tử của nấm nên ta bố trí thí nghiệm này xem chỉ với DMSO 5 % thì có thể bảo quản tốt đậu phộng không. Cũng sau 5 ngày đậu phộng đã bị nhiễm nấm và những ngày sau đó thì nấm cũng phát triển bao phủ kín đậu phộng nhưng bào tử nấm bị mất màu hoàn toàn. - Chitosan + Nystatin 0,4 % (ĐC4): Nystatin là kháng sinh chống nấm được chiết xuất từ dịch nuôi cấy nấm Streptomyces noursei, Nystatin có tác dụng kìm hãm hoặc diệt nấm. Đây là hợp chất có khả năng kháng nấm rất tốt dùng để so sánh với các thí nghiệm. Với nồng độ Nystatin 0,4 % cho kết quả kháng nấm hoàn toàn trong 12 ngày theo dõi. Các thí nghiệm Thí nghiệm 1 (TN1): Kết hợp màng bao chitosan với canh trường nuôi cấy. Thí nghiệm này sử dụng hoàn toàn canh trường nuôi cấy VK CS1b để bảo quản đậu phộng. VK CS1b và dịch sau ly tâm đều có khả năng ức chế sự phát triển của nấm CĐP1 vậy nếu kết hợp cả hai có thể ức chế được nấm CĐP1 trong in vivo. Và ở môt trường có bổ sung sinh khối nấm làm chất cảm ứng thì có khả năng bảo quản đậu phộng tốt hơn môi trường không bổ sung không. Xây dựng hai nghiệm thức: Nghiệm thức 1 (NT1): Dung dịch chitosan 0,2 % hòa trong acid acetic 1 % + canh trường nuôi cấy môi trường NB1. Nấm có màu trắng và xanh phát triển sau 5 ngày. 69
Đồ án tốt nghiệp Nghiệm thức 2 (NT2): Dung dịch chitosan 0,2 % hòa trong acid acetic 1 % + canh trường nuôi cấy môi trường NB. Sau 5 ngày nấm xuất hiện và cũng phát triển mạnh mẽ nấm có màu trắng và xanh đậm. Khả năng ứng dụng của canh trường vào bảo quản đậu phộng chưa thực sự tốt. Thí nghiệm 2 (TN2): Kết hợp màng bao chitosan với sinh khối của VK CS1b hòa với nước muối sinh lý (sinh khối được thu từ 200 ml canh trường nuôi cấy sau đó bổ sung 200 ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng). Ứng dụng để bảo quản trong hai nghiệm thức: Nghiệm thức 1 (NT1): Dung dịch chitosan 0,2 % hòa trong acid acetic 1 % + sinh khối CS1b thu từ môi trường tăng sinh NB1 sau đó hòa với nước muối sinh lý. Trong nghiệm thức này chỉ duy trì được đến ngày thứ 5 thì bị nhiễm nấm, nấm phát triển rất mạnh phủ kín đậu phộng và có màu xanh đậm. VK CS1b chỉ duy trì bảo quản đậu phộng được 5 ngày bằng với thời gian bảo quản của chitosan ở ĐC2. Nghiệm thức 2 (NT2): Dung dịch chitosan 0,2 % hòa trong acid acetic 1 % + sinh khối CS1b thu từ môi trường tăng sinh NB sau đó hòa với nước muối sinh lý. Kết quả theo dõi tương tự như nghiệm thức 1. Nấm phát triển sau 5 ngày. Vậy VK CS1b mặc dù ức chế trong in vitro rất tốt nhưng in vivo thì chúng không có khả năng kháng nấm CĐP1 trên hạt đậu phộng vì bề mặt hạt đậu phộng khá khô vi khuẩn không phát triển để tổng hợp kịp hợp chất kháng nấm. Thí nghiệm 3 (TN3): Kết hợp màng bao chitosan với dịch sau ly tâm của canh trường nuôi cấy NB1. Khảo sát phần 3.2 cho thấy khả năng đối kháng của dịch sau ly tâm khá tốt vì vậy ta có thể ứng dụng để bảo quản và xây dựng hai nghiệm thức: Nghiệm thức 1 (NT1): Dung dịch chitosan 0,2 % hòa trong acid acetic 1 % + dịch sau ly tâm. Kết quả nấm phát triển sau 5 ngày, nấm có màu trắng và xanh. 70
Đồ án tốt nghiệp Nghiệm thức 2 (NT2): Dung dịch chitosan 0,2 % hòa trong acid acetic 1 % + dịch sau ly tâm xử lý 100 0C. Kết quả nấm phát triển sau 5 ngày và nấm cũng có màu xanh trắng tương tự nghiệm thức 1. Vậy kết quả đối kháng ở phần 3.2 rất tốt nhưng khi tiến hành thí nghiệm in vivo thì dịch sau ly tâm không có khả năng ức chế sự phát triển của nấm CĐP1. Khi sử dụng dịch nuôi cấy ly tâm, ngoài protein và cao ethyl acetate còn có thành phần dinh dưỡng khác còn dư trong môi trường, do đó tạo điều kiện cho nấm mốc CĐP1 cấy vào nhanh chóng nảy mầm và phát triển. Thí nghiệm 4 (TN4): Kết hợp màng bao chitosan với sinh khối của VK CS1b với Cao EA hòa trong DMSO 5 %. Trong kết quả khảo sát ở phần 3.4 cho thấy cao EA cũng có khả năng ức chế nấm CĐP1. Vậy tiến hành ứng dụng bảo vệ hạt đậu phộng thì kết quả nấm xuất hiện ở ngày thứ 12, nấm có màu trắng. Khả năng bảo quản của cao EA tương đối tốt. Vậy khi sử dụng sinh khối vi khuẩn CS1b trong in vivo thì chúng không có khả năng ức chế nấm CĐP1 và chúng trở thành nguồn dinh dưỡng cho nấm phát triển. Dịch nuôi cấy ly tâm có thành phần dinh dưỡng khác còn dư trong môi trường, do đó tạo điều kiện cho nấm mốc CĐP1 cấy vào nhanh chóng nảy mầm và phát triển. Từ kết quả trên có thể thấy cao ethyl acetate từ dịch nuôi cấy CS1b có khả năng ức chế nấm mốc CĐP1 in vitro và in vivo tốt nhất. Kết quả này phù hợp với nhiều báo cáo về hợp chất thứ cấp như polypeptide, biosurfactant từ chi Bacillus có hoạt tính kháng nấm (Sanket Joshi và cộng sự, 2008). 71
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7: Kết quả ứng dụng hợp chất thứ cấp bảo quản đậu phộng 72
Đồ án tốt nghiệp Nước cất nhiễm ĐC: chitosan nấm ĐC: C + DMSO 5 % nấm ở ngày thứ 3 mọc ở ngày thứ 5 nấm mọc ở ngày thứ 5 Sinh khối VK trong Sinh khối VK trong Dịch sau ly tâm mọc Dịch sau ly tâm t0 NB1 mọc nấm ngày NB mọc nấm ngày nấm ngày thứ 5 100 0C mọc nấm thứ 5 thứ 5 ngày thứ 5 Canh trường NB Canh trường NB Canh trường NB1 Cao EA nhiễm nhiễm nấm ngày nhiễm nấm ngày thứ nhiễm nấm ngày thứ nấm ngày thứ 12 thứ 5 7 5 Qua khảo sát khả năng ứng dụng của các hợp chất thứ cấp trong bảo quản đậu phộng ta thấy rằng kết quả ứng dụng cao EA trong bảo quản hạt đậu phộng tương đối khả quan. Nên đề nghị quy trình công nghệ để sản xuất cao EA nhằm thu hồi tốt hơn các hợp chất và có thể ứng dụng trong bảo quản nông sản. Nguồn nguyên liệu được sử dụng là sinh khối nấm CĐP1, VK CS1b. Quy trình công nghệ sản xuất cao trải qua hai Chuẩn bị môi trường PDB73 (500 ml) Hấp khử trùng (1210C, 15 phút)
Đồ án tốt nghiệp quá trình, chuẩn bị sinh khối nấm CĐP1 và trích ly dịch nuôi cấy sau ly tâm của VK CS1b. Hình 3.12: Sơ đồ chuẩn bị sinh khối nấm CĐP1 74
Đồ án tốt nghiệp Môi trường NB1(hấp khử Sinh khối 0 CĐP1 1% trùng 121 C, 15phút) 0 Làm nguội (30 C) Cấy giống Nuôi cấy (150 vòng/phút trong CS1b (1%) 24 giờ, 30 0C) Ly tâm (4000v/p, 20 phút) Dịch sau ly tâm Trích ly với ethyl acetate. Tỉ lệ 1:1 lập lại 3 lần Na2SO4 Pha hữu cơ còn nước Lọc Pha hữu cơ 0 DMSO 5 % Bay hơi ở 50 C thu cắn. Xác định khối lượng (mg) Cao EA trong DMSO 5% (mg/ml) 75
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Sau khi khảo sát khả năng đối kháng với nấm CĐP1 của dịch sau ly tâm từ canh trường nuôi cấy VK CS1b ở từng thời gian và điều kiện xử lý nhiệt thì ở thời gian 24 giờ nuôi cấy và không xử lý nhiệt cho kết quả đối kháng tốt nhất 60,1 %. Trong protein kết tủa từa dịch nuôi cấy sau ly tâm ở 24 giờ có hoạt tính enzyme protease, chitinase nhưng không còn beta – glucanase. Nhưng khả năng đối kháng với nấm CĐP1 chưa xác định được là do hoạt tính của các enzyme có trong protein kết tủa hay không. Khả năng đối kháng của cao EA với nấm CĐP1 bằng phương pháp đục lỗ thạch cho tỷ lệ gần bằng với đối chứng DMSO 5 %, nhưng phương pháp sử dụng cao EA đun 70 0 C và bổ sung 10 % vào trong môi trường PDA thì cho kết quả cao EA thu ở dịch nuôi cấy sau 24 giờ có khả năng làm mất màu bào tử CĐP1 rõ rệt nhất. Trong cao ethyl acetate là lipid, tuy nhiên lipid không được bổ sung vào môi trường nên đó là sản phẩm của vi khuẩn. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn lên sự phát triển của nấm trên hạt đậu phộng khi tạo màng bao với chitosan 0,2 % cho thấy có thể sử dụng cao ethyl acetate để ngăn sự nảy mầm của nấm CĐP1 cấy vào đậu phộng với mật độ 102 bào tử/g và ngăn nhiễm nấm mốc cũng như vi khuẩn từ ngoài môi trường đến sau 12 ngày bảo quản. 4.2 Kiến nghị Qua khảo sát thấy rằng cao EA thực sự có tiềm năng ức chế nấm mốc trong in vitro và cả in vivo. Nhưng các hợp chất có trong cao EA có khả ức chế nấm mốc thì chưa xác định được. Vì vậy chúng tôi kiến nghị: 76