Đồ án Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng cá Basa

pdf 95 trang thiennha21 12/04/2022 90
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng cá Basa", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_mot_so_yeu_to_anh_huong_den_qua_trinh_tach.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng cá Basa

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài : NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME PROTEASE TỪ NỘI TẠNG CÁ BASA. NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN : PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG CN ĐỖ THỊ TUYẾN SINH VIÊN THỰC HIỆN : TRẦN TÚ NHI MSSV : 107111115 LỚP : 07DSH3 TP. HỒ CHÍ MINH, 2011
  2. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến MỞ ĐẦU A. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI : Trong sản xuất và đời sống, các loại enzyme nói chung và protease nói riêng được sử dụng ngày càng phổ biến. Chế phẩm protease được sản xuất chủ yếu nhờ vi sinh vật, một số ít có nguồn gốc từ thực vật, mô động vật. Gần đây, do yêu cầu về vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng nghiêm ngặt, chi phí cho kiểm tra chất lượng ngày càng cao. Trong khi đó chế phẩm protease thu nhận từ mô động vật và thực vật được coi là tuyệt đối an toàn nên ngày càng thu hút được sự quan tâm của các phòng thí nghiệm cũng như các nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm protease thương mại. Nguồn nguyên liệu từ nội tạng động vật để thu chế phẩm protease ngày càng khan hiếm và không kinh tế do nội tạng động vật thường được dùng làm thực phẩm và dùng để ghép tạng cho những bệnh nhân đặc biệt. Protease trong cơ thể cá, đặc biệt là ở cơ quan tiêu hóa đã được biết đến từ lâu nhưng lại chưa được nghiên cứu đầy đủ và cũng chưa có công nghệ thu nhận, tinh chế protease từ nội tạng cá. Vì vậy, những công trình nghiên cứu về protease nội tạng và phương pháp chiết rút chúng đang được ráo riết tiến hành ở nhiều nước có nghề cá phát triển. Việt Nam là một trong những quốc gia có nghề cá phát triển, với trên 200 loài cá kinh tế, sản lượng 1,5 triệu tấn/năm. Tuy sản lượng lớn nhưng phần được sử dụng hữu ích từ cá chỉ chiếm khoảng gần 50%. Nghĩa là hàng năm có trên 700.000 tấn phế liệu, trong đó có trên 30.000 tấn nội tạng cá. Theo thói quen, nội tạng cá chỉ được sử dụng làm bột cá chăn nuôi, một phần được chế biến nước mắm, phần lớn bị thải bỏ vào môi trường vừa lãng phí vừa là nguồn gây ô nhiễm môi trường. Tình hình trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học là sử dụng hợp lý và hiệu quả lượng phế liệu cá rất lớn do các nhà máy chế biến cá tạo ra hàng ngày để sản xuất ra những sản phẩm mới, có giá trị cao. SVTH : Trần Tú Nhi 1 MSSV : 107111115
  3. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Với mong muốn góp phần giải quyết yêu cầu trên, em thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng cá Basa”. B. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU : Mục đích chung là nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzyme từ nội tạng cá, cũng như tính chất của enzyme này. C. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU : 1. Xác định quy trình tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng cá : - Xác định tỷ lệ dung môi chiết : mẫu. - Xác định dung môi chiết enzyme protease. - Xác định thời gian chiết enzyme protease. - Xác định tỷ lệ (nồng độ) tác nhân kết tủa thu chế phẩm enzyme thô. - Xác định tác nhân kết tủa thu chế phẩm enzyme thô. - Tinh sạch chế phẩm enzyme thô bằng sắc ký lọc gel. - Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS – PAGE. 2. Khảo sát một số tính chất của enzyme protease nội tạng cá : - Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo nhiệt độ. - Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease. - Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo pH. - Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo nồng độ muối ăn. - Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease khi có mặt một số ion kim loại, chất đặc hiệu nhóm. SVTH : Trần Tú Nhi 2 MSSV : 107111115
  4. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến D. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU : 1. Phương pháp tách chiết, thu nhận và tinh sạch enzyme protease : - Chiết rút thu dịch chiết. - Thu nhận chế phẩm enzyme protease. - Tinh sạch enzyme protease bằng sắc ký lọc gel. - Phân tách enzyme protease bằng điện di trên gel polyacrylamide. 2. Các phương pháp phân tích : - Xây dựng đường chuẩn albumin. - Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford. - Xây dựng đường chuẩn tyrosine. - Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano. E. KẾT CẤU ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP : Đồ án tốt nghiệp gồm : - Chương 1 : Tổng quan tài liệu - Chương 2 : Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - Chương 3 : Kết quả và thảo luận - Chương 4 : Kết luận và đề nghị SVTH : Trần Tú Nhi 3 MSSV : 107111115
  5. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH : Trần Tú Nhi 4 MSSV : 107111115
  6. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 1.1 MỘT SỐ KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ENZYME : 1.1.1 Giới thiệu chung về enzyme : Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme tham gia xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể với tốc độ nhịp nhàng, cân đối theo chiều hướng xác định. Do đó đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống. Hiện nay người ta đã khám phá hơn 2000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme thu được ở dạng tinh thể. Enzyme ngày nay được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong mọi lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp đặc biệt là công nghiệp chế biến thực phẩm : bia, rượu, bánh mì, tương chao, nước mắm 1.1.2 Bản chất, cấu trúc enzyme : 1.1.2.1 Bản chất của enzyme : Enzyme là protein có hoạt tính sinh học nên nó có đủ tính chất của protein. Giống với các protein hình hạt khác, enzyme có thể hòa tan trong nước, dung dịch đệm phosphate, dung dịch đệm Tris, dung dịch muối sinh lý Dung dịch enzyme có tính chất của dung dịch keo ưa nước. Enzyme trong dung dịch dễ dàng bị kết tủa dưới tác dụng của muối trung hòa như sulphatamon hoặc các dung môi hữu cơ như ethanol, acetone ở nhiệt độ thấp nhưng không bị mất hoạt tính xúc tác. Do đó, có thể dùng các tác nhân này để thu chế phẩm enzyme. Ngược lại dưới tác dụng của các yếu tố gây biến tính protein (nhiệt độ cao, acid hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng nồng độ cao) enzyme thường bị mất khả năng xúc tác. Và mức giảm hoạt tính tương ứng với mức độ biến tính của phân tử protein – enzyme. 1.1.2.2 Cấu trúc enzyme : Phân tử enzyme một thành phần cũng như hai thành phần đều chứa phần protein. Enzyme một cấu tử trong thành phần phân tử chỉ có protein. Enzyme hai cấu tử trong thành phần cấu tạo gồm : protein (“feron” hoặc “apoenzyme”) và phi protein (“agon” hoặc “coenzyme”). Trung tâm hoạt tính của enzyme chiếm phần rất SVTH : Trần Tú Nhi 5 MSSV : 107111115
  7. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến nhỏ với phân tử enzyme nhưng có vai trò quan trọng trong việc tham gia kết hợp đặc hiệu với cơ chất trong quá trình xúc tác. Ở các enzyme một cấu tử, trung tâm thường bao gồm một tổ hợp các nhóm chức acid amin liên kết lại với nhau. Nhờ có cấu trúc bậc 3,4 các nhóm này tuy nằm cách xa nhau trong mạch polypeptide, nhưng do xoắn cuộn mạch mà được gần nhau hơn. Với enzyme hai cấu tử, ngoài một số nhóm chức của acid amin còn có nhóm ngoại tham gia trung tâm hoạt tính enzyme. 1.1.3 Danh pháp và phân loại enzyme : Theo quy ước quốc tế, tên enzyme thường được gọi theo cơ chất đặc hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó tên enzyme thường có hai phần : phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân của phản ứng. Năm 1960, Hiệp hội hóa sinh quốc tế đã thống nhất phân loại enzyme ra làm 6 lớp sau : - Oxydoreductase : enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử. - Transpherase : enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị. - Hydrolase : enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân. - Liase : enzyme tham gia xúc tác cho phản ứng loại CO2 hay phản ứng tách thuận nghịch phân tử nước. - Isomerase : enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hỗ phức tạp giữa galactose và glucose. - Ligase : enzyme này xúc tác cho phản ứng carboxyl hóa pyruvic tạo thành oxaloacetic acid. 1.1.4 Cơ chế tác dụng của enzyme : Bản chất của phản ứng enzyme là khi có sự tham gia xúc tác của enzyme, các cơ chất sẽ được hoạt hóa mạnh, từ đó làm thay đổi tính chất hóa học của cơ chất, kết quả sau phản ứng sẽ tạo ra những sản phẩm của phản ứng. Do tác dụng của SVTH : Trần Tú Nhi 6 MSSV : 107111115
  8. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến enzyme cơ chất có thể có những thay đổi không chỉ về cấu trúc hóa học, mà còn thay đổi tính chất hóa học. Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra 3 giai đoạn : - Giai đoạn thứ nhất : enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất. Phức hệ này thường không bền. Phản ứng tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất thường xảy ra nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng. - Giai đoạn thứ hai : khi cơ chất tạo phức với enzyme thì sẽ bị thay đổi cả cấu hình không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết. Kết quả các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm. - Giai đoạn thứ ba : đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm được tạo thành và tách khỏi enzyme. Cơ chế xúc tác tổng quát của enzyme được trình bày như sau : E + S ES E + P E : enzyme ; S : cơ chất ; ES : Phức hệ enzyme – cơ chất ; P : Sản phẩm 1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme : Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như : bản chất và nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, pH môi trường phản ứng, nhiệt độ, các ion kim loại, các chất vô cơ và hữu cơ khác ( có tác dụng kìm hãm hay hoạt hóa enzyme). 1.1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất : Ở giai đoạn đầu của phản ứng, khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất. Khi nồng độ cơ chất đủ lớn sao cho tất cả nồng độ enzyme đều tham gia phản ứng để tạo ra phức hợp enzyme – cơ chất, phản ứng sẽ tạo ra được vận tốc cực đại. Nhưng đôi khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất lên thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng. 1.1.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme : Nói chung, trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, tốc độ phản ứng tăng chậm hoặc không tăng. SVTH : Trần Tú Nhi 7 MSSV : 107111115
  9. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 1.1.5.3 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hóa : Hoạt tính enzyme có thể thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơ và hữu cơ khác nhau. Các chất này có thể làm tăng, hoặc làm giảm hoạt tính enzyme. Tác dụng của chúng có thể là đặc hiệu hoặc không đặc hiệu và thay đổi tùy từng chất, từng enzyme khác nhau. Chất kìm hãm (chất ức chế) là các chất khi có mặt trong phản ứng enzyme sẽ làm cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hóa bởi enzyme. Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ kể cả protein, kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch, cạnh tranh hay không cạnh tranh. Khi biết được tác dụng ức chế của các chất này đối với từng loại enzyme trong từng phản ứng cụ thể ta có thể điều chỉnh được phản ứng. Chất hoạt hóa là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme. Các chất này thường có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại hoặc các chất hữu cơ. Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hồi hoạt tính của enzyme một cách trực tiếp hay gián tiếp. Cơ chế của sự kích hoạt này có các chất tác dụng trực tiếp với trung tâm hoạt tính của enzyme, làm thay đổi cấu hình không gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt tính xúc tác hoặc cho gián tiếp thông qua việc loại trừ các chất ức chế ra khỏi hỗn hợp phản ứng, nhưng không tác dụng trực tiếp với phân tử enzyme. 1.1.5.4 Ảnh hưởng của pH môi trường : pH môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến tốc độ phản ứng enzyme vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và độ bền của protein – enzyme. pH thích hợp của phần lớn enzyme là 7. pH thích hợp của enzyme còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như đặc tính và nồng độ cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ phản ứng 1.1.5.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ : Do bản chất hóa học của enzyme là protein nên khác với các phản ứng hóa học, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme. SVTH : Trần Tú Nhi 8 MSSV : 107111115
  10. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng enzyme cho thấy nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40 – 500C, trên 500C hoạt tính thường bị giảm mạnh do làm hỏng cấu trúc phân tử enzyme. Các enzyme có nguồn gốc thực vật và một số enzyme vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp cao hơn. Nhiệt độ thích hợp của enzyme còn phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau như : thời gian xác định hoạt tính, pH Ở nhiệt độ thấp dưới 00C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều, nhưng có thể hồi phục khi đưa về nhiệt độ bình thường. Ở nhiệt độ 700C, phần lớn enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính, gọi là nhiệt độ tới hạn. Ở nhiệt độ tới hạn, enzyme bị biến tính, hiếm khi được hồi phục hoạt tính trở lại. 1.1.5.6 Ảnh hưởng của các ion kim loại : Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa enzyme. Các ion kim loại nặng ở nồng độ gây biến tính protein, có tác dụng kìm hãm không thuận nghịch enzyme. Tác dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chúng, mức độ hoạt hóa chỉ tăng theo nồng độ ion kim loại ở những nồng độ thấp trong một giới hạn xác định, khi vượt quá nồng độ này lại có tác dụng kìm hãm enzyme. Giới hạn nồng độ có tác dụng hoạt hóa enzyme của mỗi ion kim loại có thể khác nhau, vì vậy ở cùng một nồng độ, cùng điều kiện phản ứng, đối với một enzyme, hai ion có thể có tác dụng trái ngược nhau. Hiện tượng này thường xảy ra giữa các ion cùng hóa trị. 1.2 ENZYME PROTEASE VÀ LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU : 1.2.1 Giới thiệu chung : Protease là một nhóm các enzyme có khả năng xúc tác cho quá trình thủy phân các liên kết peptide trong phân tử protein. Trong cơ thể cá còn sống các protease là tác nhân xúc tác quá trình trao đổi chất phục vụ hoạt tính sống của cá. Sau khi cá chết, khả năng xúc tác quá trình thủy phân của các enzyme này vẫn còn SVTH : Trần Tú Nhi 9 MSSV : 107111115
  11. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến và là nguyên nhân gây ra sự biến đổi thịt cá sau khi chết, khi tách ra khỏi cơ thể cá thì protease vẫn giữ được khả năng xúc tác quá trình thủy phân. Do đó, cần nghiên cứu các đặc tính của protease nội tạng nhằm sử dụng nguồn enzyme này từ phế liệu cá trong công nghiệp chế biến thủy sản, tạo ra các sản phẩm có giá trị cao từ thịt cá. 1.2.2 Phân loại enzyme protease : Theo Baret và Donald (1986) thì protease được chia thành hai nhóm lớn là endopeptiase (proteinase) và exopeptidase. Nhóm endopeptiase Là các enzyme phân giải các liên kết ở giữa chuỗi mạch polypeptide. Theo phân loại của Ủy ban enzyme thuộc Hội Hóa Sinh quốc tế, các enzyme nhóm này gồm 4 phân nhóm là : - Phân nhóm 1 : Proteinase – xerin : gồm các enzyme như tripsin, chimotripsin. - Phân nhóm 2 : proteinase – xistein hay proteinase – thiol : gồm các enzyme cathepsin. - Phân nhóm 3 : aspactic – protease hay protease acid : gồm các enzyme pepsin, gastricsin - Phân nhóm 4 : metalo – proteinase như colagenase, calpain Nhóm exopeptidase : Là các enzyme thủy phân liên kết peptide ở đầu mút của chuỗi mạch peptide. Các enzyme thuộc nhóm này gồm cacboxyl – peptidase, amino – peptidase, dipeptidase. Các exopeptidase không có khả năng thủy phân liên kết peptide ở trung tâm mà chỉ tác dụng thủy phân liên kết ngoài cùng của chuỗi polypeptide, hoặc đầu amin, hoặc đầu cacboxyl, tuần tự tách từng acid amin ra khỏi chuỗi polypeptide. 1.2.3 Protease nội tạng cá và các động vật thủy sản : Hệ tiêu hóa của cá gồm nhiều bộ phận khác nhau. Mỗi bộ phận có chức năng và các đặc điểm riêng của quá trình chuyển hóa, hấp thu thức ăn. Do đó, hệ enzyme SVTH : Trần Tú Nhi 10 MSSV : 107111115
  12. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến protease trong các bộ phận này cũng khác nhau. Tuy nhiên hoạt tính của enzyme chủ yếu diễn ra ở dạ dày và ruột cá. Enzyme dạ dày Dạ dày của cá là cơ quan duy nhất có pepsin xúc tác cho quá trình thủy phân protein trong môi trường acid mạnh. Trong dạ dày có cả hai loại enzyme chính là pepsin và parapepsin. Pepsin là enzyme chủ yếu tiêu hóa thức ăn có protein trong dạ dày, được sinh tổng hợp trong các tế bào màng nhày của dạ dày và tiết ra dưới dạng không hoạt tính gọi là pepsinogen. Pepsinogen có khối lượng phân tử 39.000 – 40.000 Da, bền trong môi trường trung tính và acid yếu, nhưng dưới tác dụng của acid clohydric và sự có mặt của một lượng nhỏ pepsin tự do trong dạ dày, sẽ chuyển hóa thành pepsin dạng hoạt tính là một chuỗi polypeptide có khối lượng 32.700 Da. Pepsin có tác dụng của một proteinase, transpeptidase và esterase nhưng chủ yếu có tác dụng của endopeptidase và thủy phân chủ yếu các liên kết peptide sát gốc Lα – acid amin thơm và dicacboxyl. Enzyme đường ruột Trong màng nhày ruột và trong dịch ruột, người ta xác định được có 22 enzyme tham gia vào quá trình tiêu hóa thức ăn. Trong đó các enzyme protease gồm : enterokinase, amino – peptidase, amino – tripeptidase, dipeptidase, cacboxylpeptidase.  Enterokinase Là enzyme hoạt hóa đặc hiệu tripsinogen và chymotripsinogen. Enterokinase được tổng hợp từ tế bào màng ruột, nhờ tác dụng của các muối mật mà xâm nhập vào khe ruột và hoạt hóa tripsinogen trên bề mặt màng nhày của ruột cũng như ở trong khoang ruột. Dưới tác dụng của enterokinase, phân tử tripsinogen bị cắt một đoạn 6 acid amin tại vùng giữa lysin và isoleusin và do đó chuyển thành dạng hoạt tính. Ngoài ra, tuyến tụy còn tiết ra một lượng enterokinase cân bằng với tripsin để hoạt hóa chymotripsinogen thành chymotripsin. SVTH : Trần Tú Nhi 11 MSSV : 107111115
  13. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến  Chymotripsin Là enzyme thuộc nhóm proteinase – serin, khối lượng phân tử khoảng 25.000 Da gồm 3 chuỗi polypeptide gắn với nhau bằng hai cầu nối sulfua. Chymotripsin xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết peptide trong đó có nhóm – CO - của các acid amin thơm hoặc methionin. Nó cũng xúc tác cho phản ứng thủy phân este của các acid amin này. Tripsin và chymotripsin có khả năng cắt đứt các liên kết ở giữa mạch polypeptide của phân tử protein, kết quả hoạt tính thủy phân protein của chúng tạo thành các đoạn polypeptide. Các đoạn này khi vào khoang ruột sẽ được các protease khác tiếp tục thủy phân tạo thành sản phẩm cuối cùng là các acid amin. 1.2.4 Lược sử nghiên cứu về protease : Loài người sử dụng enzyme protease trong sản xuất và đời sống từ lâu đời trước khi biết đến chúng. 5000 năm trước công nguyên, con người đã sử dụng renin có trong dạ dày bê như chất đông tụ để sản xuất phomat. Các thổ dân Nam Mỹ cổ đại đã sử dụng lá đu đủ để làm mềm thịt và phương pháp này đã được kế thừa, phát triển thành kỹ thuật làm mềm thịt nhân tạo bằng papain và các enzyme protease khác. Ở Việt Nam, từ lâu đời, ông cha ta đã chế biến nước mắm trên cơ sở quá trình tự phân giải thịt cá nhờ hệ enzyme có sẵn trong nội tạng và cơ thịt cá, trong điều kiện nồng độ muối cao. Đến thế kỷ 18, Reomur mới phát hiện dịch dạ dày của loài chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt. Năm 1836 Schwann nghiên cứu hoạt tính phân giải protease của dịch vị trong dạ dày chó. Năm 1857, Corvisart tách được chế phẩm thô tripsin từ dịch tụy. Năm 1862, Danilevxki tách được tripsin và amylaza từ tụy tạng. Từ những năm 50 của thế kỷ 20, các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu, thu nhận và ứng dụng enzyme protease từ vi sinh vật, đồng thời phát triển và hoàn thiện công nghệ thu nhận protease từ các mô động vật và thực vật. Từ đó đến nay, hàng loạt các protease từ vi sinh vật, từ động vật và thực vật đã được sản xuất và ứng dụng vào mọi lĩnh vực sản xuất và đời sống. Đặc biệt, những năm cuối thế kỷ 20, đầu thế kỷ SVTH : Trần Tú Nhi 12 MSSV : 107111115
  14. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 21, công nghệ enzyme phát triển vô cùng nhanh chóng, các loại protease được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực sản xuất, đời sống, y học và nghiên cứu khoa học. Nếu như năm 1980, cả thế giới sản xuất và tiêu thụ khoảng 1300 tấn enzyme các loại trong đó có protease chiếm 40,7% thì đến năm 1985, thị trường enzyme thế giới đã có sản lượng được mua bán là 45000 tấn, trị giá gần 650 triệu USD và đến năm 1990, doanh thu từ các enzyme công nghệ của thế giới đạt 1,5 tỷ USD, trong đó thị phần enzyme protease là 48%. Như vậy có khoảng 5 năm, lượng enzyme được sản xuất và tiêu thụ trên toàn thế giới tăng gấp đôi, trong đó lượng enzyme protease chiếm khoảng 50%. Các cường quốc về sản xuất và tiêu thụ enzyme protease công nghiệp là Mỹ, Pháp, Nhật, Đức, Ý, Thụy Điển, Hà Lan, Đan Mạch, Trung Quốc hầu hết thuộc các nước công nghiệp phát triển. Dự báo, trong thế kỷ 21, sản xuất và tiêu thụ enzyme của thế giới sẽ tăng với tốc độ hàng năm khoàng 20%. Tuy protease được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau nhưng cho đến những năm gần đây, các protease sử dụng trong công nghiệp chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật, các protease có nguồn gốc từ thực vật và động vật có vị trí thứ yếu. 1.3 ỨNG DỤNG PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA CÁ TRONG CHẾ BIẾN THỦY SẢN : 1.3.1 Giới thiệu chung : So với các protease có nguồn gốc từ vi sinh vật, thực vật và động vật trên cạn, protease của động vật thủy sinh nói chung, cá nói riêng ít được ở trong quy mô công nghiệp. Những nguyên nhân của tình trạng trên có thể là:  Nguồn nguyên liệu thủy sản mang tính mùa vụ lại không tập trung, cố định nên việc cung cấp nguồn thu enzyme không ổn định, khó tổ chức sản xuất chế phẩm enzyme ở quy mô công nghiệp.  Trong cơ thể động vật thủy sản, cơ quan tập trung enzyme lớn và có hoạt tính cao là nội tạng nên thường được sử dụng làm nguồn thu enzyme. Tuy SVTH : Trần Tú Nhi 13 MSSV : 107111115
  15. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến nhiên, nội tạng cá thường có mùi tanh hôi, không hấp dẫn đối với công nhân sản xuất, lại rất khó bảo quản ở điều kiện tự nhiên.  Protease của động vật thủy sản là một hệ gồm rất nhiều loại protease khác nhau. Để tách riêng và làm tinh sạch từng enzyme cần trải qua hàng chục bước khác nhau với kỹ thuật phức tạp. Chính vì vậy, cho đến nay, trên thị trường chưa có protease thương mại từ nguyên liệu thủy sản. Để phát triển sản xuất chế phẩm enzyme từ thủy sản phải nghiên cứu, hoàn thiện công nghệ và giảm giá thánh sản phẩm. Từ những năm 50 của thế kỷ trước, ở nhiều nước đã phát triển công nghệ sản xuất các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật. Hàng trăm loại chế phẩm protease từ các chủng vi sinh vật khác nhau đã được sản xuất và mua bán trên thị trường sản lượng các chế phẩm protease thương mại tăng nhanh, liên tục và tỷ trọng các protease từ vi sinh vật trong tổng doanh số enzyme trên thị trường thế giới luôn ở mức cao nhất với các protease từ các nguồn khác. Việc sản xuất các chế phẩm protease thương mại từ vi sinh vật có những ưu điểm như : - Có nhiều chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease, chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, có thể thu nhận enzyme hàng chục lần trong năm, có thể chủ động về nguyên liệu. - Có thể dễ dàng điều hòa, định hướng quá trình sinh tổng hợp enzyme cần thiết trên cơ sở tác động vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật, chọn lọc hoặc gây đột biến ở các chủng vi sinh vật. - Hiệu suất sinh tổng hợp enzyme trong môi trường nuôi cấy tổng hợp cao hơn việc thu nhận enzyme thuận lợi. - Môi trường nuôi cấy vi sinh vật dễ chế tạo, chi phí thấp, giá thành enzyme hạ. Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng các chủng vi sinh vật để sản xuất enzyme công nghiệp gặp phải một số trở ngại. Các chủng vi sinh vật protease phải được đánh giá, kiểm tra nghiêm ngặt về độc tính để bảo đảm an toàn, vệ sinh cho sản phẩm. Việc phân tích, kiểm tra phải tiến hành thường xuyên, liên tục với độ chính SVTH : Trần Tú Nhi 14 MSSV : 107111115
  16. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến xác cao nên cần phải có các phòng thí nghiệm, phân tích chuyên dùng, trang bị dụng cụ hiện đại, chi phí đầu tư lớn. Trong khi đó, các enzyme protease có nguồn gốc từ động vật và thực vật luôn được đánh giá an toàn, sau khi thu nhận có thể sử dụng ngay vào quá trình chế biến mà không cần kiểm tra độc tính. Với sản lượng 100 triệu tấn cá biển và 30 triệu tấn cá nước ngọt hằng năm, cả thế giới có tới 6,5 – 9 triệu tấn nội tạng và nếu đưa vào để thu nhận enzyme protease, nguồn lợi thu được là không nhỏ. 1.3.2 Nghiên cứu và ứng dụng protease trong chế biến thủy sản ở Việt Nam : Đến nay trong phạm vi quốc gia, ngành thủy sản chưa có một cơ quan, đơn vị chuyên nghiên cứu và ứng dụng enzyme trong chế biến thủy sản. Các Viện nghiên cứu, các trường đào tạo cán bộ khoa học công nghệ chuyên ngành thủy sản chưa có chương trình nghiên cứu và ứng dụng enzyme nói chung, enzyme thủy sản nói riêng. Chính vì vậy, có thể nói ở Việt Nam, kết quả nghiên cứu về enzyme của cá và động vật thủy sinh cũng như các hướng ứng dụng chúng vào sản xuất và đời sống, vào chế biến thủy sản hầu như chưa có gì. Những năm gần đây, một số nhà khoa học và công nghệ đã bắt đầu quan tâm đến vấn đề này, nhưng mới chỉ là những nỗ lực cá nhân, chưa được sự quan tâm của nhiều người, chưa được sự đầu tư về tài, lực cho nghiên cứu nên kết quả mới là bước đầu và còn rất khiêm tốn. Các tài liệu, số liệu về enzyme thủy sản và ứng dụng enzyme trong ngành thủy sản còn nghèo nàn, thiếu hệ thống. Tuy nhiên có một ngành chế biến có truyền thống lâu đời là chế biến nước mắm. Các công trình nghiên cứu về nước mắm đều đi đến kết luận là nước mắm là sản phẩm của quá trình thủy phân protein trong thịt cá dưới tác dụng của hệ enzyme protease của bản thân nguyên liệu. Quá trình thủy phân thịt cá bằng enzyme thực hiện trong điều kiện có muối ăn ở nồng độ cao, để ngăn hoạt tính của các vi khuẩn gây thối rữa, tạo thành các chất đạm hòa tan, chủ yếu là acid amin và peptide ngắt mạch. Do thủy phân thịt cá bằng hệ enzyme của bản thân nguyên liệu trong điều kiện muối mặn nên quá trình chế biến nước mắm trong điều kiện tự nhiên có thời SVTH : Trần Tú Nhi 15 MSSV : 107111115
  17. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến gian dài, từ trên 10 tháng tới 1 - 2 năm. Trong quá trình lâu dài ấy, đồng thời với quá trình thủy phân thịt cá còn có các quá trình lên men khác với sự tham gia của hệ vi sinh vật yếm khí hình thành các hợp chất bay hơi, các acid hữu cơ Làm cho nước mắm có hương vị, màu, mùi đặc trưng, có giá trị dinh dưỡng và cảm quan đặc biệt. Bên cạnh ứng dụng protease trong chế biến nước mắm, các nhà khoa học công nghệ nước ta cũng đã quan tâm mở rộng thêm nhiều lĩnh vực ứng dụng protease trong chế biến thủy sản. Các lĩnh vực sử dụng protease trong chế biến thủy sản chủ yếu tập trung vào lĩnh vực nâng cao hiệu quả sử dụng phế liệu thủy sản cũng như nguồn cá tạp, cá kém giá trị kinh tế. So với kết quả nghiên cứu về enzyme protease của thực vật, động vật máu nóng và vi sinh vật có lịch sử phát triển hàng trăm năm thì việc nghiên cứu, ứng dụng enzyme protease cá trong chế biến thủy sản mới chỉ tập trung vào việc tận dụng enzyme protease có sẵn trong nguyên liệu. Các lĩnh vực nghiên cứu, ứng dụng protease trong chế biến thủy sản còn hạn chế, chỉ mới dừng ở trong phòng thí nghiệm, chưa chuyển giao công nghệ để sản xuất công nghiệp. Yêu cầu sản xuất chế phẩm protease từ thủy sản để sử dụng trong chế biến cũng như cung cấp cho ngành khác đang đặt ra trực tiếp và cấp bách. Các công trình nghiên cứu về protease của cá và các lĩnh vực ứng dụng đang tăng lên nhanh chóng ở nhiều nước có nghề cá phát triển. Tiềm năng phát triển sản xuất chế phẩm protease từ thủy sản và ứng dụng để chế biến ra những sản phẩm mới rất là to lớn. Trong thời đại bùng nổ thông tin, sự hội nhập và trao đổi thông tin đang rất khẩn trương và thuận lợi, các nhà khoa học công nghệ nước ta cần nhanh chóng tiếp thu các thành tựu mới trong lĩnh vực này để áp dụng vào sản xuất, góp phần phát triển nhanh chóng công nghệ chế biến thủy sản ở đất nước. SVTH : Trần Tú Nhi 16 MSSV : 107111115
  18. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 1.3.3 Nguồn thu enzyme protease : Enzyme nói chung và enzyme protease nói riêng được thu nhận chủ yếu từ ba nguồn cơ bản : mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật. Enzyme được tách từ các mô như : tụy tạng, dạ dày, ruột của một số động vật thủy sản (mực , cá ) thường là trypsin, pepsin, chymotrypsin, cathepsin Từ thực vật có thể thu nhận được một số enzyme thủy phân như : papain từ nhựa đu đủ, bromelin từ thân, lá và vỏ dứa. Ngoài ra còn có thể thu nhận được một số enzyme khác như : amylase, urease, peroxydase 1.3.4 Ứng dụng enzyme protease : Enzyme nói chung và enzyme protease nói riêng có thể sử dụng theo hai hướng sau :  Hướng 1 : Sử dụng trong quá trình thủy phân trong cơ thể. Các enzyme này là các enzyme nội bào. Chúng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào sống, nhưng khi sinh vật chết quá trình thủy phân protein vẫn diễn ra. Như vậy, protease tham gia vào quá trình thủy phân protein của chính nguyên liệu chứa nó. Việc sử dụng enzyme theo hướng này rất đơn giản, có thể làm tăng hương vị, màu sắc của sản phẩm. Tuy vậy, chỉ có thể sử dụng enzyme loại này đối với quy trình chế biến nguyên liệu chứa nó.  Hướng 2 : Tách enzyme ra khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm và sử dụng chúng vào trong các quá trình sản xuất. Việc tách chiết enzyme dựa vào tính chất của chúng : enzyme tan được trong nước, trong dung dịch muối sinh lý, các dung dịch đệm. Dịch chiết thu được chứa enzyme, protein tạp, các chất hữu cơ và vô cơ nên phải tiến hành tinh sạch để thu chế phẩm. Các chế phẩm enzyme được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau. a. Trong công nghiệp thực phẩm : - Enzyme protease được sử dụng trong chế biến thịt, làm cải biến giá trị cảm quan, làm tăng giá trị sản phẩm. Người ta sử dụng protease từ dứa, đu đủ, nội SVTH : Trần Tú Nhi 17 MSSV : 107111115
  19. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến tạng động vật để thủy phân làm mềm nguyên liệu, hoặc thủy phân nguyên liệu tạo thành dịch dễ hấp thu, dễ tiêu hóa. - Trong chế biến nước giải khát, trong công nghiệp bia, các chế phẩm protease được sử dụng làm trong dịch quả, dịch bia. - Dùng protease trong công nghiệp chế biến sữa, làm pho mát. - Protease được dùng làm tăng giá trị sản phẩm về mặt thương mại của sản phẩm có giá trị thấp. Ví dụ như dùng protease để thủy phân protein trong phế liệu công nghiệp thực phẩm (xương, collagen ) thành các dạng hòa tan, thu dịch đạm thủy phân làm thức ăn cho người hoặc thức ăn chăn nuôi. - Dùng protease để thủy phân màng tế bào gan cá để trích ly dầu cá. b. Trong công nghiệp dệt : Dùng chế phẩm protease để sản xuất dung dịch hồ tơ làm tăng độ bóng, không ảnh hưởng đến độ bền của tơ. c. Trong công nghệ phim ảnh : Protease được sử dụng để sản xuất gellatin trên bề mặt phim ảnh, dùng để tái sinh ảnh, giấy ảnh và các phim chụp X – quang. d. Trong công nghiệp da : Sử dụng protease để tẩy sơ bộ da nguyên liệu, làm mềm da, tăng lượng lông thu hồi (tỷ lệ thu hồi tăng 25 – 30 % so với khi dùng phương pháp hóa học), và da có chất lượng cao. e. Trong công nghệ sản xuất xà phòng, chất tẩy rửa, công nghiệp mỹ phẩm : Protease được thêm vào để sản xuất xà phòng, kem đánh răng có tác dụng tẩy sạch các vết mủ, hay bổ sung protease vào kem bôi mặt để loại các lớp biểu bì chết, làm mịn da. f. Trong công nghiệp dược phẩm : Dùng protease để bổ sung vào thuốc chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hóa, thuốc tiêu mủ ở các vết thương, thuốc chữa nghẽn mạch máu để làm sạch vết thương và giảm đau cho người bệnh. SVTH : Trần Tú Nhi 18 MSSV : 107111115
  20. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến g. Trong chế biến thủy sản : Nước mắm được hình thành từ quá trình thủy phân protein trong thịt cá dưới tác dụng của hệ enzyme protease có sẵn trong nguyên liệu trong điều kiện muối mặn và thời gian dài. Người ta đã sử dụng chế phẩm protease để bổ sung trong quá trình sản xuất nước mắm với lượng nhất định nhằm rút ngắn thời gian chế biến. Nhờ vậy mà làm tăng hiệu quả kinh tế, tăng sự luân chuyển vốn. Ngoài ra, người ta còn sử dụng enzyme protease vào việc sản xuất bột đạm cá, bột đạm hòa tan, từ các loại cá có giá trị kinh tế thấp (như cá mối, cá tạp ). Sở dĩ làm như vậy vì hướng sản xuất này có thể tận dụng được các phế liệu trong quá trình chế biến, tiết kiệm nguyên liệu, tăng giá trị sản phẩm, đem lại hiệu quả kinh tế cao. 1.4 SƠ LƯỢC VỀ SẮC KÝ LỌC GEL : 1.4.1 Bản chất của phương pháp : Phương pháp được sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lượng phân tử và phân tích định lượng tương tác phân tử. Hình 1.1. Tách các phân tử bằng lọc gel SVTH : Trần Tú Nhi 19 MSSV : 107111115
  21. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Một số thông số vật lý của phương pháp: + Giới hạn tách (exclution limit) : Là trọng lượng phân tử (MW) của phân tử nhỏ nhất không chui vào bên trong hạt gel. Thí dụ giới hạn tách của G - 50 có FR từ 1.500 - 30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử lớn hơn đều không chui vào hạt gel. + Phạm vi tách (Fructionation range) : Thí dụ, sephadex G - 50 có FR từ 1.500 - 30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ được phân tách dễ dàng bởi G - 50. + Độ ngậm nước (water regain) : Là trọng lượng nước mà 1 gam bột gel khô hút nước. Thí dụ G - 50 có WR là 5,0 0,3g. Giá trị này chưa tính đến lượng nước bao quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích của cột. + Thể tích nền (bed volume) : Là thể tích cuối cùng mà 1 gam gel khô hấp thu khi trương nở trong nước. G - 50 có thể tích nền 9 - 11 ml/g gel khô. + Hạt gel (Gel particle) : Hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thước hạt xác định bằng mesh hoặc đường kính hạt (bead diameter) tính theo m. Hạt có kích thước lớn (50 - 100 mesh, 100 - 300 m) cho tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhưng kết quả tách thấp. Ngược lại những hạt mịn (400 mesh, 10 - 40 m) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thường người ta chọn hạt gel có kích thước 100 - 200 mesh (50 - 150 m). + Thể tích trống (void volume) : Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột. Xác định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Daltons. + Thể tích thổi (elution volume) : Là thể tích đệm cần thiết để rửa chất cần tách ra khỏi cột. 1.4.2. Đặc tính của gel : Có 4 loại gel thường được sử dụng. SVTH : Trần Tú Nhi 20 MSSV : 107111115
  22. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Dextran – có bản chất là polysaccharide tự nhiên do hãng Pharmacia – LKB (Thụy Điển) cung cấp với tên thương mại là Sephadex (bảng trang 84). Giới hạn tách của gel dextran - 600.000 Daltons, vì dextran tự nhiên chứa ít liên kết ngang nên khó giữ nguyên vẹn hạt nếu kích thước lỗ to hơn. Tuy nhiên nếu dextran được bổ sung thêm các liên kết ngang bởi N,N’-methylene bisacrylamide thì dextran có giới hạn tách gia tăng (xem sephacryl cũng do Pharmacia –LKB cung cấp). Gel polyacrylamide : Tạo bởi quá trình đồng hóa polymer của acrylamide và N,N’-methylene bisacrylamide (Bio-Rad cung cấp – Biogel –P là tên thương mại) Gel agarose : Là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo từ galactose và anhydrogalactose. Mạng gel được ổn định nhờ liên kết hydro nhiều hơn là do các liên kết ngang. Hãng Bio - Rad cung cấp agarose với tên thương mại là Bio - gel A, còn Pharmacia – cung cấp tên thương mại là sepharose và seperose. Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thương mại là ultragel, nó cho phép có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử dụng áp suất để tách. SVTH : Trần Tú Nhi 21 MSSV : 107111115
  23. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SVTH : Trần Tú Nhi 22 MSSV : 107111115
  24. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH : - Thời gian thực hiện bắt đầu từ tháng 10/2010 đến tháng 12/2011. - Quá trình nghiên cứu tại phòng “ Các chất có hoạt tính sinh học” thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh. 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU : Đối tượng nghiên cứu của đề tài này là nội tạng cá basa Giới thiệu chung về cá Basa : Hình 2.1 Cá Basa - Cá Basa còn có tên gọi là cá giáo, cá sát bụng là loài cá da trơn cá giá trị kinh tế cao, được nuôi tập trung nhiều nước trên thế giới. - Theo hệ thống phân loại Tyson Roberts phân loại cá basa như sau : Cá basa thuộc bộ cá nheo Silurifomes, họ cá tra Pangasiidae, giống cá basa Pangasius, loài cá basa Pangasius bocuorti (sau vage 1880). Họ Pangasiidae có 21 loài thuộc 2 giống : giống Pangasius có 19 loài và giống Helicophagus có 2 loài. Có một số loài sống trong nước lợ, và 2 loài sống ở biển. SVTH : Trần Tú Nhi 23 MSSV : 107111115
  25. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Trong họ Pangasiidae hai loài cá tra và basa là cá nuôi kinh tế của đồng bằng sông Cửu Long. - Đặc điểm hình thái, sinh lý cá Basa : Về ngoại hình, cá Basa rất dễ phân biệt với các loài cá khác trong họ cá tra. Thân ngắn hình thoi, hơi dẹp bên, lườn tròn, bụng to tích lũy nhiều mỡ, chiều dài tiêu chuẩn bằng 2,5 lần chiều cao bên thân. Đầu cá ngắn hơi tròn, dẹp đứng. Miệng hẹp, chiều rộng miệng ít hơn 10% chiều dài chuẩn. Dải răng trên to rộng có thể nhìn thấy được khi miệng khép lại, có hai đôi râu, râu hàm trên bằng ½ chiều dài đầu, râu hàm dưới bằng 1/3 chiều dài đầu. Có 40 - 60 lược mang trên cung mang thứ nhất, vây hậu môn có 31 - 36 tia vây, chiều cao của cuống đuôi hơn 7% chiều dài chuẩn, lưng dầy màu xám xanh và trắng. - Phân bố : Cá Basa chủ yếu phân bố ở khu vực sông Mê Công có mặt ở cả 4 nước Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan. Ở nước ta những năm trước đây khi chưa có sinh sản nhân tạo, cá bột và cá giống được vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Cá trưởng thành chỉ thấy trong ao nuôi, rất ít gặp trong địa phận Việt Nam. Do cá có tập tính di cư ngược dòng sông Mê Công để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên. Bãi đẻ của cá nằm khu vực ngã tư giao tiếp 2 con sông Mê Công và Tonlesap, nơi giáp Campuchia và Lào. Nhưng tập trung nhất từ Kampi đến hết Rongiev thuộc địa giới 2 tỉnh Kratie và Stung Treng. - Tỷ trọng : Cá Basa có tốc độ lớn khá nhanh, sau một năm nuôi lớn được 0,7-1,3kg/ con. Nuôi trong bè sau 2 năm đạt 2,5kg/ con. Trong tự nhiên gặp cỡ cá dài 0,5m. SVTH : Trần Tú Nhi 24 MSSV : 107111115
  26. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 2.3 THU THẬP VÀ BẢO QUẢN MẪU : Mẫu nghiên cứu là nội tạng cá Basa được thu gom tại chợ Thủ Đức vào sáng sớm ngay khi cá mới về. Mẫu sau khi thu thập được sẽ được xác định khối lượng ban đầu, đem bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh ở nhiệt độ - 40C. Khi cần sử dụng, mẫu được đem ra, cân chính xác lượng cần dùng trong thời gian nhanh chóng và vẫn trong điều kiện lạnh, và chuyển phần mẫu còn lại vào tủ lạnh để bảo quản ở nhiệt độ âm, tránh làm mất hoạt tính mẫu. 2.4 DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT : 2.4.1 Dụng cụ và thiết bị : - Ống nghiệm thủy tinh, pippet, cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, ống đong - Máy đo quang phổ UV – Vis - Máy sắc ký lọc gel - Cân điện tử - Máy khuấy từ - Máy đo pH - Máy ly tâm - Bể ủ nhiệt 2.4.2 Hóa chất : - Hóa chất dùng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích trong phòng thí nghiệm. - Cơ chất để xác định hoạt tính enzyme là casein. - Hóa chất dùng trong quá trình chiết : NaCl, Na2HPO4.12H2O, NaH2PO4.2H2O - Hóa chất dùng trong quá trình tủa : acetone, ethanol, sulphatamol. - Các thuốc thử hàm lượng, hoạt tính của protease. SVTH : Trần Tú Nhi 25 MSSV : 107111115
  27. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU : 2.5.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford : . Nguyên tắc : Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng hấp thu cực đại là 465nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dương và được hấp thu cực đại ở bước sóng 595nm. Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết được nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là bovine serum albumin. Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta được ODx, độ hấp thu sẽ tỷ lệ với protein trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với nước cất (OD0). Lấy giá trị OD = ODx – OD0. Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xác định bằng cách dựa vào đường chuẩn từ giá trị OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tương ứng trên trục hoành.  Dụng cụ - Hóa chất: a. Dụng cụ : - Máy đo quang phổ - Ống nghiệm - Pipette 5 ml, 1 ml - Giấy thấm - Giá để ống nghiệm - Bình tia đựng cồn SVTH : Trần Tú Nhi 26 MSSV : 107111115
  28. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến b. Hóa chất :  Dung dịch Albumine 0,1 mg/ml : Cân chính xác 10 mg albumine pha trong 100 ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 200C. Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch albumine có nồng độ 0,01 mg/ml.  Nước cất.  Dung dịch thuốc thử Bradford : dung dịch thuốc thử có thành phần trong 100 ml như sau : Coomassie Brilliant Blue : 0,001g. Ethanol tuyệt đối : 4,7g Phosphoric acid 85% : 8,5g Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được hòa tan trong ethanol trong một chai đựng màu tối có nắp, bổ sung phosphoric acid 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất.  Dựng đường chuẩn Albumine: Pha loãng dung dịch Albumine thành các nồng độ khác nhau: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 µg/ml SVTH : Trần Tú Nhi 27 MSSV : 107111115
  29. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Bảng 2.1 Xây dựng đường chuẩn Albumine Ống nghiệm Đối 1 2 3 4 5 6 7 8 9 chứng Nồng độ (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Dung dịch Albumine 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 (ml) Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Thuốc thử Bradford 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 (ml) Ống số 0 tương ứng với ống đối chứng chứa nước cất. Tất cả các ống sau khi pha đúng nồng độ, để khoảng 20 phút. Tiến hành đo mật độ quang dung dịch ở bước sóng 595nm. Dựng đường chuẩn. Định lượng protein trong mẫu ống nghiệm. Lấy 1ml mẫu thí nghiệm cho vào ống nghiệm, thêm vào 2ml thuốc thử Bradford. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 595nm. Từ đó suy ra hàm lượng protein có trong mẫu thí nghiệm. Mẫu được pha loãng sao cho mật độ quang đo được trong khoảng đường chuẩn. Kết quả tính toán: SVTH : Trần Tú Nhi 28 MSSV : 107111115
  30. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Từ phương trình đường chuẩn và mật độ quang của mẫu khảo sát ta suy ra hàm lượng protein của mẫu là X (µg/ml) có trong m (g) nguyên liệu. Vậy lượng protein có trong 1g nguyên liệu là: X Hàm lượng protein (mg/g) = 1 0 0 0xm 2.5.2 Phương pháp xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano :  Nguyên tắc : Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme. Hoạt tính của enzyme được biểu hiện bằng đơn vị hoạt tính thủy phân protein của enzyme.  Hóa chất và thiết bị :  Hóa chất : - Dung dịch HCl 0,1 M - Dung dịch Na2CO3 0,4 M - Dung dịch Cl3CCOOH 0,4 M - Tyrosine tinh khiết - Thuốc thử Folin (pha loãng 5 lần khi sử dụng ) - Đệm phosphate pH = 7 ; 0,1 M - Dung dịch casein 1% : cân 1 g casein từ sữa (hãng Merck) thêm vào vừa đủ 100ml dung dịch đệm phosphate pH = 7 ; 0,1 M.  Dụng cụ và thiết bị : - Ống nghiệm, pippet, bình định mức, giấy lọc. - Bể ổn nhiệt. - Máy đo quang phổ UV – Vis - Máy đo pH SVTH : Trần Tú Nhi 29 MSSV : 107111115
  31. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến  Các bước tiến hành :  Xây dựng đường chuẩn Tyrosine : Pha dung dịch Tyrosine ở các nồng độ khác nhau : 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90 μg tyrosine/ml HCl như Bảng 3.2 Bảng 2.2 Xây dựng đường chuẩn Tyrosine Ống nghiệm Nồng độ Dung dịch Dung dịch Na2CO3 Thuốc thử (μg/ml) Tyrosine HCl (μl) (ml) Folin (ml) chuẩn (μl) ĐC 0 0 1000 5 1 1 10 10 990 5 1 2 20 20 980 5 1 3 30 30 970 5 1 4 40 40 960 5 1 5 50 50 950 5 1 6 60 60 940 5 1 7 70 70 930 5 1 8 80 80 920 5 1 9 90 90 910 5 1 Thêm 5 ml dung dịch Na2CO3 0,4 M vào dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau và thêm 1 ml thuốc thử Folin vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi lắc đều, để SVTH : Trần Tú Nhi 30 MSSV : 107111115
  32. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến ổn định dung dịch ở 37 ± 0,50C trong 20 phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660 nm. Ghi nhận kết quả As10, As20, As30, As40, As50, As60, As70, As80, As90. Đối với ống đối chứng dùng 1 ml HCl 0,1 M thay cho tyrosine. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660 nm và ghi nhận kết quả này là As0. Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ được giá trị từ OD1 đến OD9. Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của OD theo nồng độ protein. Đồ thị này gọi là đường chuẩn tyrosine.  Xác định hoạt tính của enzyme protease : - Hoạt tính của enzyme được khảo sát ở 370C và pH = 7. - Cho 1 ml cơ chất casein 1% vào ống nghiệm ủ ở 37 ± 0,50C trong 10 - 15 phút. - Sau thời gian ủ cho 1 ml dịch chiết enzyme thô vào lắc đều. Đem ủ hỗn hợp ở 37 ± 0,50C trong 60 phút. - Cho vào 2 ml dung dịch Cl3CCOOH 0,4 M để ngừng phản ứng. - Để ổn định trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. - Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 0,4 M vào 1ml dịch lọc. - Thêm 1 ml thuốc thử Folin. - Lắc đều, để yên ở 37 ± 0,50C trong 20 phút. - Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả này là Am). Mẫu đối chứng : lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml enzyme và tiến hành các bước tương tự như mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả độ hấp thụ này là Ao. Hàm lượng tyrosine được giải phóng do protease thủy phân được tính bằng cách lấy Am – Ao rồi lấy kết quả so với đường chuẩn tyrosine để xác định hoạt tính protease theo tính toán sau : SVTH : Trần Tú Nhi 31 MSSV : 107111115
  33. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 μg tyrosine trong 1 ml dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm. F = (10/As10 + 20/ As10 + 30/ As10 + 40/ As10 + 50/ As10 + 60/ As10 + 70/ As10 + 80/ As10 + 90/ As10 ) / 9 Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = (Am – Ao).F.1/100.n Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) = (Am – Ao) . F. 1/100. n.V.1/m Trong đó : Am : Độ hấp thụ của mẫu Ao : Độ hấp thụ của ống đối chứng F : Hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosine và độ hấp thụ ở bước sóng 660 nm trên đường chuẩn. n : Hệ số pha loãng của enzyme 1/100 : Hệ số chuyển đổi V : Thể tích của dung dịch enzyme m : Khối lượng nội tạng Tính toán hoạt tính riêng (HTR) của enzyme protease : từ kết quả hàm lượng protein (mg/ml) và hoạt tính enzyme protease (U/ml) tính hoạt tính riêng của enzyme. HTR (U/mg) = Số đơn vị hoạt tính / mg protein enzyme. 2.5.3 Phương pháp tách chiết, thu nhận và tinh sạch enzyme protease : Tiến hành tách chiết và thu nhận enzyme protease từ các phần riêng khác nhau : nội tạng cá. Toàn bộ quá trình tách chiết thu enzyme được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp (0 – 40C) để hạn chế sự biến tính của protein – enzyme dưới tác động của môi trường. Nội tạng cá được nghiền mịn với cát thạch anh trong cối inox đặt trong một thau đá. 2.5.3.1 Chiết rút thu dịch chiết : SVTH : Trần Tú Nhi 32 MSSV : 107111115
  34. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Dùng một số dung môi có khả năng hòa tan enzyme (nước cất, dung dịch muối sinh lý, dung dịch đệm phosphate) với tỷ lệ và thời gian thích hợp để chiết rút thu enzyme. Nhiệt độ dung môi trước khi phối trộn là 0 – 40C. Trong quá trình chiết rút, ta khuấy liên tục (ở 0 – 40C), sau đó ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch chiết. Xác định hoạt tính enzyme dịch chiết theo phương pháp Amano, chọn tỷ lệ dung môi và thời gian thích hợp. 2.5.3.2 Thu nhận chế phẩm protease : Kết tủa protein – enzyme trong dịch chiết thu được từ nội tạng bằng các tác nhân : acetone, ethanol, (NH4)2SO4. Các hóa chất đã làm lạnh được cho từ từ vào dịch chiết với tỷ lệ và nồng độ thích hợp, để gây kết tủa protease. Quá trình kết tủa enzyme được tiến hành trong điều kiện lạnh 0 – 40C. Sau đó ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút thu chế phẩm thô. Chế phẩm thô được bảo quản trong dung dịch đệm phosphate 0,1 M ở pH = 7. Xác định hoạt tính enzyme chế phẩm thô theo phương pháp Amano, chọn tỷ lệ, tác nhân, thời gian tủa thích hợp. 2.5.3.3 Phương pháp tinh sạch enzyme bằng sắc lý lọc gel : Hình 2.2 Bộ máy chạy sắc ký lọc gel  Nguyên tắc : SVTH : Trần Tú Nhi 33 MSSV : 107111115
  35. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được thoát ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ chạy trong lỗ gel.  Hóa chất Gel Sephadex G - 50 có các đặc tính : Dạng hạt mịn, kích thước hạt 45 - 90m; khả năng ngậm nước : 12ml/1g gel khô; phạm vi phân tách : 4.000 - 150.000 daltons. Đệm Phosphate pH 7.0 : Dùng khử bọt khí trước khi dùng.  Các bước tiến hành  Chuẩn bị mẫu : Mẫu chạy sắc ký là enzyme hòa tan được hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm phosphate pH 7.  Chuẩn bị gel và chạy mẫu : Cân 5g gel “Sephadex G - 50” khô, cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm phosphate pH 7.0 đựng trong cốc. Dùng dung dịch đệm phosphate pH 7.0 nhiều gấp 2 lần so với thể tích lớp nền gel cần cho trong cột. Cụ thể dùng ít nhất 53 x 2 = 106ml dung dịch đệm. Để gel ổn định cho đến khi 90 - 95% số hạt ổn định. Gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại > 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel. Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột. Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bắn gel ra ngoài, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí. SVTH : Trần Tú Nhi 34 MSSV : 107111115
  36. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 - 5cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel (packed). Khi cột đã được nạp đầy gel, khóa đầu ra (outlet) của cột. Mở khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền (106ml) chảy qua cột khi điều khiển tốc độ chảy.  Nạp mẫu : Mẫu chạy sắc ký phải sạch (không bị nhiễm bẩn và không lẩn các vật rắn), hoàn toàn hòa tan trong dung dịch đệm. Cho mẫu quá nhiều vào cột làm giảm tốc độ phân tách, ít quá làm mẫu bị loãng. Để tách nhóm chất có thể cho nhiều mẫu vào cột tới 10 – 20% tổng thể tích cột. Để phân tích chỉ được phép đưa 1 lượng mẫu nhỏ vào 1/55 tổng thể tích cột (là thể tích nước tương đương chiều cao nền cột đã nhồi). Tốc độ dòng chảy nên điều chỉnh ở mức độ thấp hơn một chút so với dòng chảy tự do. Thông thường đối với gel có kích thước lỗ nhỏ, nên sử dụng tốc độ 8 – 12 ml/cm2 mặt cắt ngang (15 – 25 ml/h), còn đối với gel lỗ lớn 2 – 5 ml/cm2 (5 – 10 ml/h). Dòng chảy có thể theo cách chảy tự do hoặc nhờ bơm nén. Phương pháp lọc gel bằng cách cho chảy tự do rất phổ biến vì đơn giản và cho kết quả tốt đối với gel bằng lỗ nhỏ. Tuy nhiên gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dòng chảy ổn định nên phải dùng bơm nén. Khởi động cho máy chạy mẫu, mẫu tinh sạch sẽ hòa vào trong đệm phosphate pH 7.0 và đi ra các ống nghiệm đựng mẫu. Dựa vào sắc ký đồ hiển thị trên máy tính ta biết được những ống nghiệm nào chứa enzyme có cùng trọng lượng phân tử.  Thu và xác định mẫu tách được : Dịch ra khỏi cột được đo ở bước sóng 280 nm bằng bộ tách sóng trong hệ sắc ký và được thể hiện độ hấp thụ dưới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP data view SVTH : Trần Tú Nhi 35 MSSV : 107111115
  37. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến trên máy tính. Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector ), mỗi phân đoạn 2 ml. Dựa vào sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak sau đó phân tích hàm lượng protein và xác định hoạt tính. 2.5.4 Phân tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamide (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) : 2.5.4.1 Nguyên tắc : Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa được xúc tác bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS); N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED). Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích thước của lỗ gel. Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide : nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thước lớn và ngược lại. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kĩ thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường. SVTH : Trần Tú Nhi 36 MSSV : 107111115
  38. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết. Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous gel). Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp : + Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên) : các protein trong mẫu được dồn lại và tạo một lớp băng mỏng. + Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới) : tạo ra các băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu. Hai lớp gel này được phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide và vị trí. Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng lượng phân tử từ 10.000 - 200.000 Daltons. Những phân tử protein có trọng lượng lớn hơn 200.000 Daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2,5%. Ngoài kĩ thuật SDS-PAGE là phương pháp điện di trong điều kiện làm biến tính protein (Denaturing condition), người ta còn dùng một số kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khác nhằm phân tích protein trong điều kiện không biến tính (Nondenaturing condition) không có sự hiện diện của SDS hoặc để khắc phục một số vấn đề về SDS gây ra một số ảnh hưởng đến đặc tính của protein như tạo liên kết (cross-linked) giữa các protein với nhau. Một số protein không có sự tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng với những protein khác người ta sử dụng kĩ thuật điện di tập trung điểm đẳng điện (Isoelectric focussing gel electrophoresis). 2.5.4.2 Các bước tiến hành :  Đổ gel : SVTH : Trần Tú Nhi 37 MSSV : 107111115
  39. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến  Gel phân tách : Cho các thành phần theo thứ tự vào becher 50ml sạch 40% Acrylamide / Bis 29:1 2,5ml Tris – HCl 1.5M pH 8.8 – 0.4 % SDS 2,5ml Nước cất 4,445ml TEMED 5l Ammonium persulfate 10% 50l Sau khi cho Ammonium pesulfate 10% vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần (tránh tạo bọt khí). Dùng pipetteman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel sao cho mức dung dịch gel cao hơn 7cm (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau đó đặt một lớp nước cất trên lớp gel để mặt gel được phẳng. Chờ gel đông 20- 30 phút.  Gel gom : Tương tự cho các thành phần vào becher 50ml sau 40% Acrylamide / 0.8 % bisacrylamide 0,5ml Tris – HCl 0,5M pH 6,8 - 0,4 % SDS 1ml Nước cất 2,46 ml TEMED 4l Ammonium persulfate 10 % 20l Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn đổ hết lớp nước bên trên. Tiến hành dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đưa lược vào gel để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí). Sau khi đã trùng ngưng, tháo lược, lắp đĩa gel vào bộ phận diện di. Cho dung dịch điện di vào buồng điện di.  Chuẩn bị mẫu và chạy điện di : SVTH : Trần Tú Nhi 38 MSSV : 107111115
  40. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến  Xử lý mẫu : Hút 30l dung dịch nạp mẫu (2X treatment buffer ) và 30l dung dịch mẫu protein vào eppendorf sạch, đậy nắp và búng nhẹ cho đều, đun sôi cách thủy 5 - 10 phút. Ly tâm 10.000 v/p trong 1 – 5 giây. Đối với thang chuẩn protein (Bio – Rad) hút 2l vào eppendorf 1ml chứa 8l nước cất và 10l dung dịch nạp mẫu.  Tiến hành chạy điện di : Dùng pipetteman 10l nạp mẫu vào các giếng. Tiến hành chạy điện di ổn định dòng 100V. Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm đã chuẩn bị trước. Sau đó tiến hành nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho đến khi nền gel trong suốt không màu. Sau khi nhuộm xong, protein được phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt. 2.4.5.3 Xác định trọng lượng phân tử của protein : i. Đo khoảng cách di chuyển của các band protein từ gel phân tách tới các band protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng. ii. Tính giá trị Rf : Khoảng cách di chuyển của protein Rf = Khoảng cách di chuyển của vạch màu bromophenol Blue iii. Vẽ biểu đồ log10 của các giá trị trọng lượng phân tử của các protein chuẩn và các giá trị Rf của chúng. 2.5.5 Bố trí thí nghiệm : 2.5.5.1 Khảo sát lựa chọn dung môi và điều kiện chiết rút enzyme protease : SVTH : Trần Tú Nhi 39 MSSV : 107111115
  41. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Với mục đích chung của đề tài là nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến việc tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng cá ba sa. Quá trình nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ hình 2.3 Hình 2.3 Sơ đồ tổng quát quá trình nghiên cứu. Nội tạng cá Tỷ lệ dung môi : nội tạng Nghiền mịn Dung môi Chiết rút enzyme protease chiết Thời gian Ly tâm thu dịch chiết Tỷ lệ tác Dịch chiết nhân :d chiết Tác nhân Tủa enzyme protease tủa Thời gian Ly tâm thu chế phẩm thô Xác định hoạt tính pH và hàm lượng 0 Chế phẩm thô t Xác định các yếu Độ bền SVTH : Trần Tú Nhi 40 tố ảnh hưởng MSSVđến : 107111115 hoạt tính protease nhiệt Nồng
  42. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến SVTH : Trần Tú Nhi 41 MSSV : 107111115
  43. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến a. Xác định tỷ lệ dung môi chiết : mẫu Tỷ lệ dung môi là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của enzyme. Dựa trên khả năng hòa tan của enzyme, tiến hành chiết rút enzyme protease bằng các dung môi (nước cất, dung dịch muối sinh lý, dung dịch đệm phosphate) với các tỷ lệ khác nhau, thời gian 30 phút, ly tâm dịch chiết. Xác định hoạt tính enzyme protease của từng dịch chiết theo phương pháp Amano. Nội tạng (đã nghiền) Chiết bằng dung môi Tỷ lệ 1 Tỷ lệ 2 Tỷ lệ 3 Tỷ lệ 10 Xác định hoạt tính enzyme Chọn tỷ lệ dung môi chiết / mẫu thích hợp Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chiết rút enzyme protease theo ty lệ dung môi mẫu.  Nước cất : tiến hành chiết rút enzyme theo hình với tỷ lệ nước cất : mẫu (ml/g) 1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 7:1 8:1 9:1 10:1  Dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0,9 %) : tiến hành chiết rút enzyme protease theo hình với tỷ lệ dung dịch muối sinh lý : mẫu (ml/g) 1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 7:1 8:1 9:1 10:1 SVTH : Trần Tú Nhi 42 MSSV : 107111115
  44. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến  Dung dịch đệm phosphate 0,05 M ở pH7 : tiến hành chiết rút enzyme protease theo hình với tỷ lệ đệm phosphate : mẫu (ml/g) 1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 7:1 8:1 9:1 10:1 a. Lựa chọn dung môi chiết thích hợp : Với các dung môi khác nhau thì khả năng chiết rút thu enzyme khác nhau. Do vậy, sau khi xác định được các tỷ lệ dung môi chiết : mẫu thích hợp, ta so sánh hoạt tính protease trong dịch chiết từ nước cất, dung dịch muối sinh lý, dung dịch đệm phosphate để chọn dung môi chiết thích hợp. b. Xác định thời gian chiết : Hiệu suất của quá trình chiết còn phụ thuộc vào thời gian chiết. Sau khi xác định được tỷ lệ, dung môi chiết, tiến hành xác định thời gian chiết thích hợp của enzyme. Sau mỗi khoảng thời gian 10, 20, 30, , 70 phút, ly tâm thu dịch chiết, xác định hoạt tính enzyme, chọn thời gian thích hợp. Nội tạng (đã nghiền) Chiết rút với tỷ lệ, dung môi thích hợp trong thời gian (phút) 10 20 30 70 Xác định hoạt tính enzyme Chọn thời gian chiết thích hợp Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chiết rút enzyme protease theo thời gian chiết mẫu. SVTH : Trần Tú Nhi 43 MSSV : 107111115
  45. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 2.5.5.2 Khảo sát chọn tác nhân và điều kiện kết tủa enzyme protease : a. Xác định tỷ lệ (nồng độ) tác nhân tủa : dịch chiết Tỷ lệ tác nhân tủa là một trong những yếu tố có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Tiến hành kết tủa enzyme protease bằng các dung môi như acetone, ethanol, (NH4)2SO4 với các tỷ lệ (nồng độ) khác nhau, thời gian 60 phút, ly tâm thu sản phẩm. Xác định hoạt tính enzyme protease của từng chế phẩm thô theo phương pháp Amano. Dịch chiết nội tạng Kết tủa bằng các tác nhân Tỷ lệ 1 Tỷ lệ 2 Tỷ lệ 3 Tỷ lệ 10 Xác định hoạt tính enzyme Chọn tỷ lệ tác nhân tủa / dịch chiết thích hợp Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tủa enzyme protease theo tỷ lệ tác nhân tủa/dịch chiết.  Acetone : tiến hành kết tủa enzyme theo hình với tỷ lệ acetone : dịch chiết (ml/ml) 1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 7:1 8:1 SVTH : Trần Tú Nhi 44 MSSV : 107111115
  46. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến  Ethanol : tiến hành kết tủa enzyme theo hình với tỷ lệ ethanol : dịch chiết (ml/ml) 1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 7:1 8:1  (NH4)2SO4 : bổ sung muối (dạng hạt) vào dịch chiết để kết tủa enzyme protease theo hình với nồng độ muối bão hòa: dịch chiết (g/ml) 45% 50% 55% 60% 65% 70% Chế phẩm thô sau khi kết tủa bằng (NH4)2SO4 với các nồng độ được loại muối bằng phương pháp thẩm tích. Cho chế phẩm thô vào túi thẩm tích, đặt trong cốc thủy tinh chứa nước cất. Dung dịch nước cất này được thay thường xuyên (ít nhất là 3 lần). Thẩm tích thực hiện ở nhiệt độ thấp 0 – 40C, được khuấy nhẹ bằng máy khuấy từ trong 12 giờ. Sau đó xác định hoạt tính enzyme. b. Lựa chọn tác nhân tủa thích hợp : Với các tác nhân khác nhau, khả năng kết tủa thu protein – enzyme là khác nhau. Do vậy, sau khi xác định được các tỷ lệ (nồng độ) tác nhân tủa / dịch chiết thích hợp ta tiến hành so sánh hoạt tính enzyme của chế phẩm thô được kết tủa bằng acetone, ethanol, (NH4)2SO4 thẩm tích để chọn tác nhân tủa thích hợp. 2.5.5.3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease của dịch chiết và chế phẩm thô từ nội tạng cá Basa : a. Xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease dịch chiết và chế phẩm thô từ nội tạng cá Basa : pH là yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme. Mỗi enzyme có pH hoạt tính thích hợp nhất định. Việc nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease được thực hiện bằng cách : xác định hoạt tính protease dịch chiết và chế phẩm thô của nội tạng ở các giá trị pH = 6, 7, 8, , 11 SVTH : Trần Tú Nhi 45 MSSV : 107111115
  47. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Protease chế phẩm thô nội tạng Tác dụng với casein ở các pH 6 7 8 11 Xác định hoạt tính enzyme Chọn pH thích hợp Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease. b. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease dịch chiết và chế phẩm thô của nội tạng : Hoạt tính enzyme chịu ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ. Xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính protease của chế phẩm thô nội tạng bằng cách cho tác dụng với casein trong 60 phút. Sau đó nhanh chóng làm lạnh, tiến hành xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano. SVTH : Trần Tú Nhi 46 MSSV : 107111115
  48. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Protease chế phẩm thô nội tạng Tác dụng với casein ở các nhiệt độ (0C) 25 30 35 80 Xác định hoạt tính enzyme Chọn nhiệt độ thích hợp Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease. c. Xác định độ bền nhiệt của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease dịch chiết và chế phẩm thô nội tạng : Độ bền nhiệt đối với từng loại enzyme khác nhau thì khác nhau. Độ bền nhiệt của protease được xác định bằng cách giữ protease ở nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính enzyme trong các khoảng thời gian khác nhau : 0, 10, 20, , 70 phút. Sau đó nhanh chóng làm lạnh bằng nước máy trong 5 phút, đưa về cùng nhiệt độ là 370C và xác định hoạt tính enzyme. SVTH : Trần Tú Nhi 47 MSSV : 107111115
  49. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Protease chế phẩm thô Xử lý enzyme ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian (phút) 0 10 20 70 Xác định hoạt tính enzyme Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease. d. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hoạt tính enzyme proteae dịch chiết và chế phẩm thô từ nội tạng cá Basa : Tiến hành xác định hoạt tính enzyme chế phẩm thô của nội tạng ở các nồng độ muối : 1, 3, 5, ., 27, 29%. SVTH : Trần Tú Nhi 48 MSSV : 107111115
  50. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Protease chế phẩm thô nội tạng Tác dụng với casein + NaCl 1% 3% 5% 29% Xác định hoạt tính enzyme Hình 2.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hoạt tính enzyme protease. e. Khảo sát ảnh hưởng của một số ion kim loại, chất đặc hiệu nhóm đến hoạt tính enzyme protease dịch chiết và chế phẩm thô từ nội tạng cá Basa : Tiến hành bổ sung các ion kim loại : Mn2+, CN, Cu2+, Hg, Zn2+, Ba2+, Mo, Fe2+, Ca2+, EDTA, Pb2+, Mg sao cho nồng độ ion kim loại trong hỗn hợp là 10-3 M, ủ hỗn hợp 15 phút ở 300C. Xác định hoạt tính enzyme theo điều kiện tiêu chuẩn. SVTH : Trần Tú Nhi 49 MSSV : 107111115
  51. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Protease chế phẩm thô nội tạng Tác dụng với casein bổ sung EDTA Mn CN Cu Hg Zn Ba Mo Fe Ca Pb Mg Xác định hoạt tính enzyme Hình 2.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số kim loại, chất đặc hiệu nhóm đến hoạt tính enzyme protease. 2.6 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU : Mỗi thí nghiệm bố trí song song 3 mẫu, lấy kết quả trung bình cộng của 3 mẫu. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm. 2.7 TÍNH TOÁN KẾT QUẢ : a. Xác định hàm lượng protein trong mẫu theo phương pháp Braford đã trình bày ở mục 2.5.1 b. Xác định hoạt tính của enzyme protease theo phương pháp Amano đã trình bày ở mục 2.5.2 c. Xác định hoạt tính riêng của enzyme protease SVTH : Trần Tú Nhi 50 MSSV : 107111115
  52. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến  Hoạt tính riêng trước khi tinh sạch : ĐVHT/ ml dung dịch enzyme pha loãng HTR trước tinh sạch = Hàm lượng protein trong 1 ml dd pha loãng  Hoạt tính riêng sau khi tinh sạch : ĐVHT / ml dd E sau khi tinh sạch HTR sau tinh sạch = Hàm lượng protein trong 1 ml dd sau khi tinh sạch d. Xác định độ tinh sạch và hiệu suất tinh sạch enzyme :  Hiệu suất thu hồi enzyme : Hoạt tính E sau tinh sạch Hiệu suất thu hồi = Hoạt tính E trước tinh sạch  Độ tinh sạch của enzyme sau sắc ký : HTR của E sau tinh sạch HTR sau tinh sạch = HTR của E trước tinh sạch e. Xác định trọng lượng phân tử của protein . SVTH : Trần Tú Nhi 51 MSSV : 107111115
  53. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN SVTH : Trần Tú Nhi 52 MSSV : 107111115
  54. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 3.1 KHẢO SÁT, LỰA CHỌN DUNG MÔI VÀ ĐIỀU KIỆN CHIẾT RÚT ENZYME PROTEASE : 3.1.1 Xác định tỷ lệ dung môi chiết : mẫu Tỷ lệ dung môi / mẫu ảnh hưởng lớn đến quá trình chiết rút thu enzyme. Do vậy việc xác định tỷ lệ chiết là cần thiết. Căn cứ vào tính tan và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme của các loại dung môi khác nhau, tiến hành thử trên ba loại dung môi khác nhau là nước cất, dung dịch muối sinh lý và dung dịch đệm phosphate pH 7 để chiết rút enzyme. Dung môi và mẫu nội tạng được bố trí ở các tỷ lệ khác nhau để chiết rút enzyme trong điều kiện lạnh trong 30 phút. Sau đó đem ly tâm lạnh 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu phần dịch trong, đó là dịch chiết nội tạng, đem xác định hoạt tính protease. 3.1.1.1 Xác định tỷ lệ nước cất : mẫu Nội tạng được chiết rút bằng nước cất trong thời gian 30 phút. Kết quả xác định hoạt tính enzyme protease được trình bày ở Bảng 3.1 và Hình 3.1 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước cất : mẫu đến quá trình chiết protease. Tỷ lệ Hàm lượng Hoạt tính tương đối mẫu : Hoạt tính (U/g) (mg) (% so với cực đại) nước cất 1:1 34,95 48,69 32,12 1:2 51,07 56,41 37,22 1:3 83,43 103,02 67,97 1:4 93,17 105,52 69,62 SVTH : Trần Tú Nhi 53 MSSV : 107111115
  55. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 1:5 98,80 122,03 80,51 1:6 120,73 151,57 100,00 1:7 130,36 130.24 85,93 1:8 129,87 127,30 83,99 1:9 161,44 122,99 81,14 1:10 170,15 95,10 62,74 Hoạt tính (U/g) Hàm lượng (mg) 160 180 140 160 120 140 120 100 100 80 80 60 60 Hoạt tính enzyme Hoạtenzyme tính 40 40 protein lượng Hàm 20 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tỷ lệ nước cất : mẫu Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước cất / mẫu đến quá trình chiết protease. Kết quả khảo sát cho thấy : Với mỗi phần khác nhau, tỷ lệ nước cất / mẫu thích hợp cho việc tách chiết enzyme là khác nhau. Khi tăng dần lượng nước cất so với mẫu thì hoạt tính protease trong dịch chiết từ nội tạng tăng dần và đạt cực đại với tỷ lệ nước cất / nội tạng là 6 / 1, tương ứng với hoạt tính cực đại của enzyme là SVTH : Trần Tú Nhi 54 MSSV : 107111115
  56. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 151,57 U/g. Sau đó, hoạt tính enzyme trong dịch chiết sẽ giảm nhanh khi tăng lượng nước cất so với mẫu. Như vậy, tỷ lệ nước cất / mẫu thích hợp cho nội tạng là 6 / 1. 3.1.1.2 Xác định tỷ lệ dung dịch muối sinh lý : mẫu Nội tạng được chiết rút bằng dung dịch NaCl 0,9% trong thời gian 30 phút. Kết quả xác định hoạt tính enzyme protease được trình bày ở Bảng 3.2 và Hình 3.2 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch muối sinh lý : mẫu đến quá trình chiết protease. Tỷ lệ mẫu : Hoạt tính tương Hàm lượng muối sinh Hoạt tính (U/g) đối (% so với cực (mg) lý đại) 1:1 47,31 70,76 30,57 1:2 71,44 143,40 61,95 1:3 77,40 162,48 70,19 1:4 88,05 179,06 77,35 1:5 102,61 186,10 80,40 1:6 109,52 231,48 100,00 1:7 103,35 183,95 79,47 1:8 127,05 176,79 76,37 1:9 135,02 174,09 75,21 1:10 150,30 106,13 45,85 SVTH : Trần Tú Nhi 55 MSSV : 107111115
  57. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Hoạt tính (U/g) Hàm lượng (mg) 250 160 140 200 120 150 100 80 100 60 Hoạtenzyme tính 40 protein lượng Hàm 50 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tỷ lệ dd muối sinh lý : mẫu Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch muối sinh lý / mẫu đến quá trình chiết protease. Kết quả thực nghiệm cho thấy : Khi tăng dần lượng nuớc muối so với mẫu thì hoạt tính protease trong dịch chiết từ nội tạng tăng dần và cực đại ứng với tỷ lệ dung dịch NaCl 0,9 % / nội tạng là 6 / 1, tương ứng với hoạt tính cực đại của enzyme là 231,48 U/g. Sau đó, hoạt tính enzyme trong dịch chiết sẽ giảm nhanh khi tăng lượng dung môi chiết so với mẫu. Như vậy, tỷ lệ dung dịch NaCl 0,9 % : mẫu thích hợp cho nội tạng là 6 : 1. 3.1.1.3 Xác định tỷ lệ dung dịch đệm phosphate : mẫu Nội tạng được chiết rút bằng dung dịch đệm phosphate pH 7 trong thời gian 30 phút. Kết quả xác định hoạt tính enzyme protease được trình bày ở Bảng 3.3 và Hình 3.3 SVTH : Trần Tú Nhi 56 MSSV : 107111115
  58. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch đệm phosphate : mẫu đến quá trình chiết protease. Tỷ lệ mẫu Hoạt tính tương Hàm lượng : đệm Hoạt tính (U/g) đối (% so với (mg) phosphate cực đại) 1 : 1 49,92 33,52 18,36 1 : 2 58,97 94,55 51,79 1 : 3 93,17 182,55 100,00 1 : 4 101,07 153,54 84,11 1 : 5 116,54 142,38 78,00 1 : 6 140,06 102,63 56,22 1 : 7 106,93 84,95 46,54 1 : 8 149,71 84,21 46,13 1 : 9 171,29 82,67 45,29 1 : 10 196,89 62,37 34,17 SVTH : Trần Tú Nhi 57 MSSV : 107111115
  59. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Hoạt tính (U/g) Hàm lượng (mg) 200 250 180 160 200 140 120 150 100 80 100 60 Hoạt tính enzyme Hoạtenzyme tính Hàm lượng protein lượng Hàm 40 50 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tỷ lệ dd đệm phosphate : mẫu Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch đệm phosphate / mẫu đến quá trình chiết protease. Khi tăng lượng dung dịch đệm phosphate so với mẫu thì hoạt tính protease trong dịch chiết nội tạng tăng dần và đạt cực đại ứng với tỷ lệ dung dịch đệm phosphate / nội tạng là 3 /1, tương ứng với hoạt tính cực đại của enzyme là 182,55 U/g. Sau đó, hoạt tính enzyme trong dịch chiết sẽ giảm khi tăng lượng dung môi so với mẫu. Như vậy, tỷ lệ dung dịch đệm phosphate : mẫu thích hợp cho nội tạng là 3/1. 3.1.1.4 Nhận xét chung : Mối quan hệ tỷ lệ thuận khi tăng tỷ lệ dung môi và mẫu có thể lý giải là khi lượng dung môi tăng, hiệu suất chiết rút protein – enzyme tăng. Quá trình chiết rút là quá trình khuếch tán các chất tan trong nội tạng đã nghiền ủ vào dung môi. Quá trình khuếch tán tuân theo định luật Fick : “ Lượng chất khuếch tán tỷ lệ thuận với diện tích bề mặt tiếp xúc giữa dung môi và chất tan, với gradien nồng độ và thời gian khuếch tán”. SVTH : Trần Tú Nhi 58 MSSV : 107111115
  60. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Khi tỷ lệ dung môi : nội tạng tăng thì diện tích tiếp xúc giữa dung môi và mẫu tăng. Lượng dung môi tăng làm chênh lệch nồng độ chất tan giữa bề mặt tiếp xúc của mẫu với lớp các dung môi bên ngoài (gradien nồng độ) tăng. Cả hai tác nhân trên đã làm cho lượng chất tan chiết rút tăng khi tỷ lệ dung môi : mẫu tăng. Tuy nhiên, khi lượng dung môi đạt đến giới hạn thì nồng độ enzyme trong dịch chiết giảm, dẫn đến hoạt tính enzyme giảm. 3.1.2 Lựa chọn dung môi thích hợp : Với mỗi loại dung môi chiết khác nhau thì protease có hoạt tính khác nhau. Do vậy cần xác định dung môi chiết thích hợp cho enzyme bằng cách tiến hành thí nghiệm chiết rút enzyme ở 3 loại dung môi nước cất, dung dịch muối sinh lý, dung dịch đệm phosphate pH 7 ở cùng tỷ lệ 6 : 1 trong thời gian 30 phút. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.4 và Hình 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các loại dung môi đến quá trình tách chiết. Hoạt tính tương Loại Hàm lượng Hoạt tính (U/g) đối (% so với cực dung môi (mg) đại) Đệm 122,11 89,36 28,42 phosphate Muối 142,66 131,81 41,93 sinh lý Nước cất 151,71 314,39 100,00 SVTH : Trần Tú Nhi 59 MSSV : 107111115
  61. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Hoạt tính (U/g) Hàm lượng (mg) 350 160 300 140 120 250 100 200 80 150 60 100 Hoạtenzyme tính 40 Hàm lượng protein lượng Hàm 50 20 0 0 Đệm Muối sinh lý Nước cất phosphate Dung môi chiết mẫu Hình 3.4 Ảnh hưởng của các loại dung môi đến quá trình chiết protease. Từ số liệu thực nghiệm cho thấy : Các dung môi khác nhau có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme protease. Hoạt tính enzyme trong nội tạng khi chiết bằng nước cất là cao nhất, kế đến là muối sinh lý và đệm phosphate. Điều này có thể giải thích nuớc cất có khả năng hòa tan được nhiều protein – enzyme nhất. Do đó ta chọn nuớc cất là dung môi dùng để chiết rút thu enzyme protease. 3.1.3 Xác định thời gian chiết : Tiến hành chiết rút protease từ nội tạng trong nước cất với tỷ lệ dung môi mẫu là 6 : 1, khuấy đảo hỗn hợp bằng máy khuấy từ. Thời gian khuấy để chiết thay đổi lần lượt là 10, 20, , 70 phút. Sau đó ly tâm thu dịch chiết, xác định hoạt tính enzyme của dịch chiết thu được. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.5 và Hình 3.5 SVTH : Trần Tú Nhi 60 MSSV : 107111115
  62. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết rút protease. Thời Hoạt tính tương gian Hàm lượng Hoạt tính (U/g) đối (% so với cực chiết (mg) đại) ( phút) 10 159,15 123,61 63,21 20 134,10 125,95 64,40 30 109,45 157,45 80,51 40 133,80 188,13 96,20 50 119,41 195,56 100,00 60 117,49 159,02 81,32 70 136,84 157,73 80,66 SVTH : Trần Tú Nhi 61 MSSV : 107111115
  63. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Hoạt tính (U/g) Hàm lượng (mg) 250 180 160 200 140 120 150 100 80 100 60 Hoạtenzyme tính Hàm lượng protein lượng Hàm 50 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Thời gian chiết (phút) Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến quá trình chiết rút protease. Khi thời gian chiết tăng lên thì khả năng khuếch tán của enzyme protease vào dung môi tăng. Với thời gian chiết rút là 50 phút, dịch chiết từ nội tạng cho hoạt tính cao nhất là 195,56 U/g. Nếu ta kéo dài thời gian chiết thì hoạt tính protease thu được trong dịch chiết sẽ giảm. Điều này có thể giải thích rằng, khi thời gian chiết càng dài, lượng protein – enzyme hòa tan trong dịch chiết càng nhiều. Khi thời gian quá dài, hiệu suất chiết rút protein tăng nhưng không phải tăng lượng enzyme protease mà tăng lượng protein tạp nên hoạt tính enzyme của dịch chiết không tăng. Hơn nữa, khi thời gian chiết dài, các phân tử protease trong dịch chiết có thể thủy phân lẫn nhau, làm giảm hoạt tính chung của enzyme trong dịch chiết. Như vậy, thời gian chiết thích hợp cho enzyme từ nội tạng cá là 50 phút. SVTH : Trần Tú Nhi 62 MSSV : 107111115
  64. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 3.2 KHẢO SÁT, LỰA CHỌN TÁC NHÂN VÀ ĐIỀU KIỆN TỦA ENZYME PROTEASE : 3.2.1 Xác định tỷ lệ (nồng độ ) tác nhân tủa : dịch chiết Các loại dung môi hữu cơ và hoá chất thường dùng để kết tủa thuận nghịch protease trong dịch chiết mà không làm giảm hoạt tính của chúng là acetone, ethanol và muối sulphate amoni (NH4)2SO4. Quá trình kết tủa cần tiến hành trong điều kiện lạnh, nồng độ tác nhân và các điều kiện tủa thích hợp. 3.2.1.1 Xác định nồng độ (NH4)2SO4 bão hòa : dịch chiết (g/ml) Kết tủa protease dịch chiết bằng (NH4)2SO4 với các nồng độ khác nhau 45%, 50%, ,70% trong 40 phút. Sau khi kết tủa, ly tâm cặn tủa, hòa vào dung dịch đệm phosphate để bảo quản. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.6 và Hình 3.6 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến quá trình kết tủa protease. Nồng độ Hoạt tính tương Hàm lượng (NH4)2SO4 Hoạt tính (U/g) đối (% so với cực (mg) bão hòa đại) 45% 9,83 30,60 57,78 50% 15,02 33,35 62,97 55% 18,18 36,88 69,64 60% 11,04 52,96 100,00 65% 13,58 38,10 71,94 70% 12,69 37,22 70,28 SVTH : Trần Tú Nhi 63 MSSV : 107111115
  65. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Hoạt tính (U/g) Hàm lượng (mg) 60 20 18 50 16 14 40 12 30 10 8 20 6 Hoạtenzyme tính 4 protein lượng Hàm 10 2 0 0 45 50 55 60 65 70 Nồng độ muối bão hòa Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến quá trình kết tủa protease. Qua thực nghiệm, có thể thấy rằng khi tăng nồng độ (NH4)2SO4 thì hoạt tính enzyme trong chế phẩm thô từ nội tạng tăng dần và đạt giá trị cực đại là 52,96 U/g ứng với nồng độ (NH4)2SO4 bão hòa : dịch chiết là 60%. Và khi nồng độ (NH4)2SO4 quá cao thì hoạt tính enzyme giảm. Điều này có thể giải thích như sau : Các anion và cation của dung dịch muối có tác dụng loại bỏ vỏ hydrat hóa của các phân tử protein, tác dụng tương hỗ với các nhóm điện tích trái dấu, làm trung hòa điện tích tạo nên protein kết tủa. Với nồng độ (NH4)2SO4 thấp có nhiều phân tử protein và enzyme protein chưa được kết tủa, còn với nồng độ quá cao sẽ gây biến tính protein làm cho hoạt tính enzyme thấp. 3.2.1.2 Xác định tỷ lệ ethanol : dịch chiết (ml/ml) Dùng ethanol để kết tủa protease trong dịch chiết với các tỷ lệ khác nhau trong 40 phút. Sau khi kết tủa, ly tâm cặn tủa, hòa vào dung dịch đệm phosphate để bảo quản. Sau đó xác định hoạt tính. Kết quả thu được thể hiện ở Bảng 3.7 và Hình 3.7 SVTH : Trần Tú Nhi 64 MSSV : 107111115
  66. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol đến quá trình kết tủa protease. Tỷ lệ Hàm lượng Hoạt tính tương đối mẫu : Hoạt tính (U/g) (mg) (% so với cực đại) ethanol 1: 1 24,70 51,10 67,77 1: 2 26,49 61,80 81,95 1: 3 30,29 75,41 100,00 1: 4 28,80 64,66 85,75 1: 5 25,08 58,58 77,68 1: 6 25,03 49,39 65,50 1: 7 24,89 45,33 60,12 1: 8 24,74 41,78 55,41 SVTH : Trần Tú Nhi 65 MSSV : 107111115
  67. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Hoạt tính (U/g) Hàm lượng (mg) 80 35 70 30 60 25 50 20 40 15 30 10 Hoạtenzyme tính 20 protein lượng Hàm 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tỷ lệ ethanol : dịch chiết Hình 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol đến quá trình kết tủa protease Từ kết quả trên, ta nhận thấy : Khi tăng lượng cồn thì hoạt tính enzyme trong chế phẩm thô từ nội tạng tăng dần và đạt giá trị cực đại là 75,41 U/g ứng với tỷ lệ cồn / dịch chiết là 3 / 1. Nếu tiếp tục tăng tỷ lệ cồn thì hoạt tính protease trong chế phẩm thô sẽ giảm. Điều này sẽ giải thích như sau : Khi thể tích dung môi tăng dần thì hoạt tính enzyme tăng, vì khi đó phân tử dung môi trong hỗn hợp sẽ tách triệt để lớp phân tử nước bao quanh vỏ protein, làm giảm tính tan của protein và làm tăng khả năng kết tủa của chúng. Nếu tiếp tục tăng thể tích dung môi thì đến một giới hạn nhất định, hằng số điện môi sẽ giảm, các phân tử protein khi đó tự tháo gỡ và trở thành không hoạt động. Do đó, sẽ dẫn đến hoạt tính giảm. 3.2.1.3 Xác định tỷ lệ acetone : dịch chiết (ml/ml) Dùng acetone để kết tủa protease trong dịch chiết với các tỷ lệ khác nhau trong 40 phút. Sau khi kết tủa, ly tâm cặn tủa, hoà vào dung dịch đệm phosphate để bảo quản. Xác định hoạt tính, kết quả thu được thể hiện ở Bảng 3.8 và Hình 3.8 SVTH : Trần Tú Nhi 66 MSSV : 107111115
  68. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Bảng 3.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ acetone đến quá trình kết tủa protease. Tỷ lệ Hàm lượng Hoạt tính tương đối mẫu : Hoạt tính (U/g) (mg) (% so với cực đại) acetone 1 : 1 23,95 40,53 72,35 1 : 2 25,40 45,43 81,09 1 : 3 27,57 47,79 85,30 1 : 4 31,24 48,33 86,26 1 : 5 29,30 50,45 90,05 1 : 6 26,71 56,02 100,00 1: 7 27,56 54,56 97,39 1 : 8 28,29 52,70 94,07 SVTH : Trần Tú Nhi 67 MSSV : 107111115
  69. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Hoạt tính (U/g) Hàm lượng (mg) 60 35 50 30 25 40 20 30 15 20 10 Hoạtenzyme tính Hàm lượng protein lượng Hàm 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tỷ lệ acetone : dịch chiết Hình 3.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ acetone đến quá trình kết tủa protease Khi tăng lượng acetone thì hoạt tính enzyme trong chế phẩm thô từ nội tạng tăng dần và đạt giá trị cực đại là 56,02 U/g tương ứng với tỷ lệ acetone / dịch chiết là 6 / 1. Nếu tiếp tục tăng lượng acetone thì hoạt tính protease trong chế phẩm thô sẽ giảm. Kết quả thí nghiệm có thể được giải thích tương tự như khi tủa enzyme bằng dung môi cồn. 3.2.2 Lựa chọn tác nhân tủa thích hợp: Với mỗi loại tác nhân tủa khác nhau thì hoạt tính của chế phẩm thô protease khác nhau. Do vậy cần xác định tác nhân tủa thích hợp cho enzyme. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.9 và Hình 3.9 SVTH : Trần Tú Nhi 68 MSSV : 107111115
  70. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Bảng 3.9 Ảnh hưởng của các loại tác nhân lên quá trình tủa enzyme: Hoạt tính tương đối Loại tác nhân Hoạt tính enzyme (U/g) (% so với cực đại) (NH4)2SO4 52,96 70,23 Ethanol 75,41 100 Acetone 56,02 74,29 120 100 80 60 40 20 % hoạt tính enzyme 0 (NH4)2SO4 Ethanol Acetone Tác nhân tủa Hình 3.9 Ảnh hưởng của các loại tác nhân lên quá trình tủa enzyme Từ những kết quả ở trên, ta nhận thấy : Các tác nhân kết tủa protease đã được sử dụng đều cho hiệu suất thu hồi enzyme khá cao. Sử dụng ethanol để kết tủa protease trong dịch chiết enzyme thô cho chế phẩm protease có hoạt tính cao nhất là 75,41 U/g, sau đó là acetone 56,02 U/g và cuối cùng là muối (NH4)2SO4 cho hoạt tính enzyme là 52,96 U/g. SVTH : Trần Tú Nhi 69 MSSV : 107111115
  71. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Khi sử dụng các tác nhân tủa cần phải tiến hành trong điều kiện lạnh. Sử dụng acetone chi phí cho quá trình thu chế phẩm thô cao, nhưng có ưu điểm là sau khi kết tủa protein, quá trình thu chế phẩm thô đơn giản, nhanh, hoạt tính enzyme không giảm. Tiến hành thu hồi acetone trong khối dịch sau khi thu kết tủa để sử dụng lại nhiều lần, sẽ giảm đáng kể chi phí sản xuất. Với tác nhân (NH4)2SO4 ưu điểm là giá rẻ, không làm giảm hoạt tính enzyme, không gây mùi khó chịu nhưng có nhược điểm là trong chế phẩm thô có muối (NH4)2SO4, ta phải tiến hành loại bỏ muối. Phương pháp tinh sạch thường áp dụng là thẩm tích. Quá trình này kéo dài 14 – 20 giờ và phải tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp. Bên cạnh đó, ta có thể loại muối bằng phương pháp sắc ký. Phương pháp này nhanh hơn và được dùng trong sản xuất enzyme. Trong thực tế sản xuất, người ta không sử dụng tác nhân tủa là acetone hay cồn, mà hai loại tác nhân này thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm. 3.3 KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH PROTEASE CỦA CHẾ PHẨM THÔ : 3.3.1 Xác định ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme protease chế phẩm thô : pH là nhân tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính protease. Vì vậy, việc khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease chế phẩm thô từ nội tạng là cần thiết. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.10 và Hình 3.10 SVTH : Trần Tú Nhi 70 MSSV : 107111115
  72. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Bảng 3.10 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease chế phẩm thô. Hoạt tính (U/g) Hoạt tính tương đối (%) pH Tủa Tủa muối Tủa cồn Tủa muối Tủa cồn Tủa Acetone acetone 6 38,82 39,17 38,48 51,24 60,89 52,33 7 43,62 53,24 42,34 57,58 82,76 57,58 8 75,76 64,33 73,53 100,00 100,00 100,00 9 61,83 54,73 64,42 81,61 85,08 87,61 10 57,35 49,68 57,17 75,70 77,23 77,75 11 38,78 48,70 50,91 51,19 75,70 69,24 120 100 80 Tủa muối 60 Tủa cồn Tủa acetone 40 % hoạt tính enzymehoạt % tính 20 0 6 7 8 9 10 11 Giá trị pH Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease chế phẩm thô. SVTH : Trần Tú Nhi 71 MSSV : 107111115
  73. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Từ kết quả trên, ta có thể thấy rằng : Protease chế phẩm thô từ nội tạng có pH thích hợp ở trong vùng trung tính và vùng kiềm yếu, pH tối thích của chế phẩm thô là 8. Ở pH 9 hoạt tính của enzyme bắt đầu giảm đi. Tuy nhiên giới hạn pH hoạt động của enzyme khá rộng. Tuy bị giảm acid trong môi trường acid và kiềm mạnh nhưng hoạt tính của nó vẫn còn khá cao, vào khoảng hơn 40%. 3.3.2 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease chế phẩm thô : Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 3.11 và Hình 3.11 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease của chế phẩm thô. Nhiệt Hoạt tính (U/g) Hoạt tính tương đối (%) độ (0C) Tủa Tủa Tủa Tủa Tủa cồn Tủa cồn muối acetone muối Acetone 25 41,160 38,380 36,630 75,65 76,24 64,09 30 45,260 41,480 46,310 83,18 82,40 81,03 35 45,450 43,280 47,600 83,53 85,98 83,29 40 46,740 43,460 50,460 85,90 86,33 88,29 45 47,100 45,520 50,510 86,56 90,43 88,38 50 48,770 49,450 51,270 89,63 98,23 89,71 55 50,620 49,700 51,500 93,03 98,73 90,11 SVTH : Trần Tú Nhi 72 MSSV : 107111115
  74. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 60 54,410 50,340 57,150 100,00 100,00 100,00 65 43,49 48,610 52,290 79,93 96,56 91,50 70 42,53 47,210 48,990 78,17 93,78 85,72 75 40,68 44,110 48,610 74,77 87,62 85,06 80 36,28 39,240 14,050 66,68 77,95 24,58 120 100 80 Tủa muối 60 Tủa cồn Tủa acetone 40 % hoạtenzyme% tính 20 0 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Nhiệt độ Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease của chế phẩm thô. Thực nghiệm cho thấy : Enzyme protease chế phẩm thô từ nội tạng có nhiệt độ thích hợp rất cao (600C). Kết quả này so sánh với enzyme động vật thủy sản khác (nội tạng cá thu, đầu tôm và gan mực ống) thì kết quả này cũng tương đồng. Điều này rất có ý nghĩa trong chế biến cá vì để phát huy tối đa hoạt tính thủy phân protein của enzyme nội tạng cá Basa, cần duy trì nhiệt độ cao 600C. Nhiệt độ này không thích hợp cho hoạt tính của vi sinh vật gây thối rữa nên thịt, cá thủy phân SVTH : Trần Tú Nhi 73 MSSV : 107111115
  75. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến bằng enzyme nội tạng cá Basa ở nhiệt độ này ít bị hư hỏng trong thời gian ngắn dù không sử dụng chất chống thối, hoặc chỉ cần sử dụng với nồng độ thấp. Khi nhiệt độ cao hay thấp hơn nhiệt độ tối thích dù không lớn, sự giảm hay tăng nhiệt độ đều làm giảm mạnh hoạt tính enzyme. Khi nhiệt độ rất cao hay rất thấp so với nhiệt độ thích hợp, thì việc giảm hay tăng nhẹ nhiệt độ cũng làm tăng hoạt tính enzyme protease của chế phẩm thô rất mạnh. Vì vậy ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính enzyme có thể giải thích như sau : Ở nhiệt độ thấp, enzyme chưa thể hiện hết hoạt tính, khi ở nhiệt độ tối ưu enzyme sẽ có hoạt tính tốt nhất, nhưng nếu nhiệt độ quá cao sẽ làm biến tính protease. Như vậy nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzyme protease chế phẩm thô từ nội tạng là 600C. 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hoạt tính enzyme protease chế phẩm thô : Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 3.12 và Hình 3.12 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính protease của chế phẩm thô. Nồng Hoạt tính (U/g) Hoạt tính tương đối (%) độ NaCl Tủa Tủa Tủa Tủa (%) Tủa cồn Tủa cồn muối acetone muối Acetone 1 63,64 56,25 64,08 89,76 78,90 98,93 3 70,90 71,29 64,77 100,00 100,00 100,00 SVTH : Trần Tú Nhi 74 MSSV : 107111115
  76. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 5 69,35 63,80 63,28 97,81 89,49 97,70 7 64,12 57,13 59,52 90,44 80,14 91,89 9 60,29 54,82 58,59 85,04 76,90 90,46 11 59,44 51,28 55,35 83,84 71,93 85,46 13 51,13 50,94 53,02 72,12 71,45 81,86 15 45,98 50,90 52,34 64,85 71,40 80,81 17 43,57 42,95 49,97 61,45 60,25 77,15 19 41,29 37,90 44,71 58,24 53,16 69,03 21 41,09 37,85 42,31 57,95 53,09 65,32 23 38,67 34,72 35,94 54,54 48,70 55,49 25 35,73 32,96 33,90 50,39 46,23 52,34 27 24,65 29,31 30,83 34,77 41,11 47,60 29 5,57 22,53 30,38 7,86 31,60 46,90 SVTH : Trần Tú Nhi 75 MSSV : 107111115
  77. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 120 100 80 Tủa muối 60 Tủa cồn Tủa acetone 40 % hoạtenzyme% tính 20 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 Nồng độ NaCl (%) Hình 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính protease của chế phẩm thô. Kết quả cho thấy : Nồng độ muối ăn có ảnh hưởng mạnh đến hoạt tính protease chế phẩm thô từ nội tạng cá. Ở nồng độ 3% thì hoạt tính enzyme đạt cực đại. Như vậy, muối ăn ở nồng độ thấp 3% có tác dụng hoạt hóa enzyme. Điều này có thể giải thích do NaCl phân ly thành Na+ và Cl-, nên khi ở nồng độ muối thấp, các ion này liên kết với các phần tử mang điện của phân tử protein, làm tăng cường sự tương tác giữa phân tử protein và enzyme. Ở nồng độ muối thấp, lớp vỏ hydrate của phân tử protein cũng chưa bị biến đổi, chưa gây biến tính protein. Mặt khác, các ion này cũng liên kết với các phần mang điện trong phân tử enzyme, làm tăng điện tích của trung tâm này. Kết quả của những biến đổi trên làm tăng cường sự tương tác giữa phân tử enzyme và phân tử protein, làm cho sự phân bố electron trong phân tử protein thay đổi theo chiều hướng làm cho liên kết trong phân tử protein tại điểm tương tác dễ bị cắt đứt hơn. Tuy nhiên, do muối ăn có tính điện ly mạnh nên khi ở nồng độ cao, các ion đã liên kết mạnh với các phân tử nước, và tạo áp suất thẩm thấu lớn, kéo các phân SVTH : Trần Tú Nhi 76 MSSV : 107111115
  78. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến tử nước khỏi liên kết với phân tử protein (enzyme và phi enzyme), phá vỡ lớp vỏ hydrate bao quanh phân tử protein, làm cấu trúc không gian bậc cao của phân tử mất đi, phân tử protein duỗi ra, bị biến tính, kết tủa, làm hoạt tính enzyme giảm đi. Protein cơ chất cũng bị biến tính, khó bị thủy phân. So sánh với kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt tính protease có nguồn gốc thực vật như bromelin, papain, protease từ vi sinh vật, từ nội tạng động vật máu nóng hay protease của chính cơ thịt cá, protease của nội tạng cá có khả năng chịu muối tốt hơn. Ở nồng độ muối 6 – 7%, hoạt tính protease của nội tạng cá vẫn còn 80 – 90% so với hoạt tính cực đại nhưng đối với các protease từ các nguồn khác đã gần như không còn khả năng hoạt tính. 3.3.4 Xác định độ bền nhiệt của enzyme protease chế phẩm thô: Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 3.13 và Hình 3.13 Bảng 3.13 Độ bền nhiệt của protease chế phẩm thô. Thời Hoạt tính (U/g) Hoạt tính tương đối (%) gian (phút) Tủa Tủa Tủa Tủa Tủa muối Tủa cồn cồn acetone muối Acetone 0 50,03 58,24 34,78 100,00 100,00 100,00 10 48,85 50,02 33,84 97,64 85,89 97,30 20 48,8 46,68 31,68 97,54 80,15 91,09 30 43,73 44,69 27,36 87,41 76,73 78,67 40 42,61 43,77 26,69 85,17 75,15 76,74 SVTH : Trần Tú Nhi 77 MSSV : 107111115
  79. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 50 42,44 41,82 22,74 84,83 71,81 65,38 60 40,81 40,04 22,36 81,57 68,75 64,29 70 40,07 32,55 21,22 80,09 55,89 61,01 120 100 80 Tủa muối 60 Tủa cồn Tủa acetone 40 % hoạtenzyme% tính 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Thời gian ( phút) Hình 3.13 Độ bền nhiệt của protease chế phẩm thô Nhìn chung, protease từ nội tạng kém bền với nhiệt. Ở 600C hoạt tính protease giảm dần theo thời gian giữ nhiệt. Có thể giải thích là khi ủ ở nhiệt độ tối thích, hệ enzyme protease nội tạng hoạt tính mạnh, có thể thủy phân lẫn nhau, làm biến đổi cấu trúc không gian cũng như độ dài mạch polypeptide dẫn đến giảm dần hoạt tính. Như vậy, quá trình tách chiết và thu nhận enzyme từ nội tạng phải luôn tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp, thao tác nhanh thì mới thu được enzyme có hoạt tính cao. Quá trình bảo quản chế phẩm thô enzyme cũng phải luôn duy trì ở nhiệt độ thấp mới có thể bảo tồn được hoạt tính enzyme. SVTH : Trần Tú Nhi 78 MSSV : 107111115
  80. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của một số kim loại, chất đặc hiệu nhóm đến hoạt tính protease chế phẩm thô : Tiến hành bổ sung các ion kim loại : Mn2+, CN, Cu2+, Hg, Zn2+, Ba2+, Mo, Fe2+, Ca2+, EDTA, Pb2+, Mg sao cho nồng độ ion kim loại trong hỗn hợp là 10-3 M, ủ hỗn hợp 15 phút ở 300C. Xác định hoạt tính protease. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.14 và Hình 3.14 Bảng 3.14 Ảnh hưởng của các ion kim loại và chất đặc hiệu nhóm đến hoạt tính protease của chế phẩm thô. Hoạt tính (U/g) Hoạt tính tương đối (%) Dung môi (10-3 M) Tủa Tủa Tủa Tủa Tủa Tủa Acetone muối cồn acetone muối cồn H2O 47,20 60,97 56,24 100,00 100,00 100,00 Mn 54,95 64,21 56,58 116,43 105,31 100,59 CN 44,43 40,81 37,67 94,14 66,93 66,98 Cu 50,34 44,99 35,94 106,66 73,78 63,90 Hg 43,62 36,11 29,40 92,42 59,22 52,27 Zn 33,34 47,72 22,86 70,64 78,27 40,64 Ba 35,72 47,61 36,82 75,68 78,08 65,48 Mo 39,29 33,55 24,18 83,24 55,02 42,99 SVTH : Trần Tú Nhi 79 MSSV : 107111115
  81. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Fe 26,06 39,71 21,07 55,22 65,13 37,46 Ca 40,00 45,58 22,10 84,75 74,75 39,30 EDTA 31,65 28,99 30,59 67,05 47,54 54,40 Pb 34,96 32,76 22,08 74,07 53,73 39,26 Mg 31,91 30,82 61,79 67,61 50,55 109,87 140 120 100 80 Tủa muối Tủa cồn 60 Tủa acetone % hoạt tính enzyme hoạttính % 40 20 0 H2O Mn CN Cu Hg Zn Ba Mo Fe Ca EDTAPb Mg Hình 3.14 Ảnh hưởng của các ion kim loại và chất đặc hiệu nhóm đến hoạt tính protease của chế phẩm thô. Kết quả thực nghiệm cho thấy : Các ion kim loại đều có ảnh hưởng đến hoạt tính protease chế phẩm thô. Tất cả các chất thêm vào trong quá trình ủ làm giảm (ức chế) hay tăng (kích thích) hoạt tính protease nội tạng. Trong đó Mn, Cu, Mg có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme. Tuy nhiên mức độ tăng lên không nhiều, chỉ cao hơn mẫu đối chứng 5 – 15%. Bên cạnh đó, các kim loại như Pb, Fe, Zn lại làm giảm hoạt tính của enzyme. SVTH : Trần Tú Nhi 80 MSSV : 107111115
  82. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến 3.4 TINH SẠCH CHẾ PHẨM ENZYME THÔ BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL : Kết quả của quá trình tinh sạch chế phẩm enzyme thô bằng sắc ký lọc gel được thể hiện ở Hình 3.15 , Hình 3.16 và Hình 3.17 Sắc ký dùng để tinh sạch enzyme dùng : - Gel Sephadex G - 50 - Cột 50 x 1,5 cm - Thể tích mẫu : 1 ml - Tốc độ dòng chảy : 0,14 ml /phút - Phân đoạn 2ml - Đo OD ở bước sóng 280 nm Hình 3.15 Sắc ký tủa ethanol SVTH : Trần Tú Nhi 81 MSSV : 107111115
  83. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Hình 3.16 Sắc ký tủa acetone SVTH : Trần Tú Nhi 82 MSSV : 107111115
  84. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Hình 3.17 Sắc ký tủa muối (NH4)2SO4 Dựa vào sắc ký đồ, ta thu được kết quả sau :  Ở sắc ký tủa muối, ta thu được 3 peak : Peak 1 gồm phân đoạn 17 – 22, peak 2 gồm phân đoạn 23 – 31, peak 3 gồm phân đoạn 43 – 61.  Ở sắc ký tủa cồn, ta thu được 3 peak : Peak 1 gồm phân đoạn 17 – 22, peak 2 gồm phân đoạn 23 – 32, peak 3 gồm phân đoạn 43 – 60.  Ở sắc ký tủa acetone, ta thu được 3 peak : Peak 1 gồm phân đoạn 17 – 22, peak 2 gồm phân đoạn 23 – 31, peak 3 gồm phân đoạn 38 – 61. Qua đó ta có thể xác định được kết quả của quá trình tinh sạch enzyme protease từ nội tạng. Kết quả của quá trình tinh sạch được thể hiện qua Bảng 3.15 SVTH : Trần Tú Nhi 83 MSSV : 107111115
  85. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng CN. Đỗ Thị Tuyến Bảng 3.15 Kết quả tinh sạch enzyme protease. Tổng Tổng Độ tinh hàm HTR Hiệu Enzyme hoạt tính sạch lượng (U/mg) suất (%) (U) (lần) (mg) Trước sắc ký 223,529 1401,592 6,27 1 100 Cồn 46,44 753,3 16,22 2,59 53,75 Sau sắc Acetone 43,84 632,47 14,43 2,30 45,13 ký Muối 56,65 621,05 10,96 1,75 44,31 Qua bảng số liệu kết quả tinh sạch protease. Các giá trị tổng hàm lượng và hoạt tính của các mẫu được quy đổi về cùng thể tích dịch chiết thô ban đầu. Cụ thể hàm lượng và hoạt tính được xét ở đây là tính trong 20 ml dịch chiết thô ban đầu. Khi tính toán ta gộp chung kết quả của ba peak vào để tính tổng hàm lượng và tổng hoạt tính. Kết quả như sau : Sau quá trình tinh sạch enzyme protease bằng sắc ký lọc gel, ta thấy hoạt tính riêng của enzyme tăng lên rất nhiều. Hoạt tính riêng khi tủa enzyme bằng ethanol là tăng cao nhất 2,59 lần, khi tủa bằng acetone tăng lên 2,30 lần, cuối cùng là khi tủa bằng muối amoni sulphate tăng lên 1,75 lần so với sản phẩm thô ban đầu. Hiệu suất thu hồi enzyme cũng khá đạt, trong đó hiệu suất thu hồi enzyme tốt nhất là khi tủa bằng ethanol, cho hiệu suất thu hồi là 53,75%, kế đến là khi tủa bằng acetone 45,13%, và cuối cùng là khi tủa bằng muối amoni sulphate với hiệu suất thu hồi là 44,31%. SVTH : Trần Tú Nhi 84 MSSV : 107111115