Đồ án Nghiên cứu tuyển chọn một số vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein cao ứng dụng xử lý nước thải giàu đạm

72 trang thiennha21 12/04/2022 7020

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu tuyển chọn một số vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein cao ứng dụng xử lý nước thải giàu đạm", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_nghien_cuu_tuyen_chon_mot_so_vi_khuan_co_hoat_tinh_pha.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu tuyển chọn một số vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein cao ứng dụng xử lý nước thải giàu đạm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài : NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH PHÂN GIẢI PROTEIN CAO ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI GIÀU ĐẠM NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN : CN. NGUYỄN HOÀNG MỸ SINH VIÊN THỰC HIỆN : NGUYỄN PHẠM HUYỀN MSSV : 107111072 LỚP : 07DSH3 TP. HỒ CHÍ MINH, 2011
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1.1 Đặt vấn đề Hiện nay, Việt Nam đang trong công cuộc xây dựng kiến thiết đất nước theo hướng công nghiệp hóa, hiện đại hóa với sự phát triển dân số và tốc độ đô thị hóa cao. Cùng với các ngành nghề khác ngành nuôi trồng và chế biến thủy sản đang giữ vai trò quan trọng trong sự phát triển kinh tế của cả nước. Tuy nhiên, bên cạnh đó cũng gia tăng các vấn đề về môi trường, đặc biệt là ô nhiễm nguồn nước thải từ các nhà máy chế biến. Việc tìm ra phương pháp xử lý nước thải sao cho hiệu quả giảm tình trạng ô nhiễm môi trường đang là vấn đề đang được quan tâm không chỉ của các doanh nghiệp mà cả các nhà quản lý. Xử lý sinh học bằng các chủng vi sinh vật với ưu điểm là phù hợp điều kiện tự nhiên, giảm chi phí năng lượng, hóa chất, đơn giản, có khả năng tận dụng các sản phẩm phụ sau xử lý đang là phương pháp có tiềm năng. Trong đó hoạt động của các vi sinh vật giữ vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng đến hiệu quả xử lý của toàn bộ hệ thống. Trong nước thải thủy sản và chế biến thịt thì một số vi sinh vật có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa nitơ được quan tâm, đặc biệt là vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Các chủng vi sinh vật này đã có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp thực phẩm và được chú ý hơn cả là trong lĩnh vực xử lý nước thải chứa nhiều đạm. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn này được chúng tôi tiến hành trong đề tài: "Nghiên cứu tuyển chọn một số vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein cao ứng dụng trong xử lý nước thải giàu đạm"với mục đích từ nước thải ngành chế biến thủy sản và thịt sẽ tìm ra được các chủng vi sinh vật nâng cao hiệu quả xử lý và góp phần bảo vệ môi trường. 1.2 Ý nghĩa đề tài 1.2.1 Ý nghĩa khoa học Trang 1
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Giúp bổ sung thêm một số chủng vi khuẩn mới phân lập được có hoạt tính protease mạnh có thể ứng dụng vào xử lý nước thải giàu đạm 1.2.2 Ý nghĩa thực tiễn Giúp xử lý nước thải giàu protein đạt hiệu quả, góp phần bảo vệ môi trường ngành thủy sản nói riêng và môi trường nước nói chung. Hình thành một vài chế phẩm sinh học phù hợp xử lý nước thải giàu đạm. 2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Lĩnh vực sử dụng vi sinh vật trong xử lý nước thải hiện nay chưa được nghiên cứu và công bố phổ biến. Tuy nhiên đã có nhiều tài liệu nghiên cứu về enzyme protease và vi sinh vật có khả năng phân hủy protein đặc biệt về vi khuẩn Bacillus. Nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố và biết đến như:  Trên thế giới Năm 2002, B. Aslin, N. Saglam và Y. Beyatli đã nghiên cứu về một số đặc điểm của Bacillus phân lập từ đất. Năm 2005, tác giả S. Sharmin, Md. Towhid Hossain và M.N. Anwar thuộc trường đại học Chittagong đã nghiên cứu các đặc điểm của protease từ Bacillus amovivorus và tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng điều kiện sinh tổng hợp enzyme protease.  Ở Việt Nam Năm 2004, Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Xô đã công bố đề tài về nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease từ một số chủng Baciilus. Tác giả Ngô Tự Thành, Bùi Việt Hà, Vũ Minh Đức và Chu Văn Mẫn đã nghiên cứu về hoạt tính enzyme protease ngoại bào của một số chủng Bacillus mới phân lập và khả năng ứng dụng chúng trong xử lý nước thải. 3. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Phân lập các vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein từ một số nguồn nước thải thủy sản và chế biến thịt. Khảo sát hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn phân lập được. Trang 2
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp tổng hợp tài liệu: Nghiên cứu, thu thập tài liệu tham khảo, tài liệu internet liên quan đến đề tài Phương pháp thực nghiệm:  Phương pháp phân lập các vi khuẩn có khả năng phân giải protein từ một vài nguồn nước thải từ nhà máy chế biến thủy sản và thịt  Phương pháp thử nghiệm sinh hóa các chủng vi khuẩn phân lập được  Phương pháp xác định mật độ tế bào  Phương pháp xác định hoạt độ protease từ vi sinh vật bằng phương pháp Amano  Phương pháp khảo sát hoạt độ protease của các chủng vi khuẩn phân lập được 5. KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC Xác định được các đặc điểm hình thái và sinh hóa của 10 chủng có khả năng phân hủy protein từ nước thải thủy sản và chế biến thịt Xác định được hoạt độ phân giải protease và mật độ tế bào Khảo sát được ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ protease 6. KẾT CẤU CỦA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Lời mở đầu Chương 1: Tổng Quan Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và biện luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị Trang 3
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Trang 4
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền 1.1 Tổng quan về nước thải giàu đạm 1.1.1 Sơ lược về ngành sản xuất có nước thải giàu đạm Nuôi trồng và chế biến thủy hải sản được xem là một trong những ngành công nghiệp mũi nhọn ở Việt Nam. Theo số liệu thống kê của bộ thủy sản, có hơn 1.470.000 hecta mặt nước sông ngòi dùng cho nuôi trồng thủy sản. Ngoài ra còn có hơn 544.500.000 hecta ruộng trũng, 56.200.000 hecta hồ dùng để nuôi cá. Mặt khác, nước ta nằm trong vùng có địa lý thuận lợi với bờ biển dài 3.260 km, vùng biển và thềm lục địa rộng lớn hơn 1 triệu km2 thích hợp cho việc nuôi trồng thủy hải sản có giá trị kinh tế cao. Tổng trữ lượng cá tầng đáy vùng biển Việt Nam có khoảng 1,7 triệu loài, khả năng cho phép khai thác khoảng 1 triệu tấn/năm. Tổng trữ lượng cá tầng trên khoảng 1,2 – 1,3 triệu tấn. Nguồn lợi thủy sản chủ yếu là tôm, cá, có khoảng 3 triệu tấn/năm nhưng hiện nay mới chỉ khai thác hơn 1 triệu tấn/năm. Theo báo cáo của tổng cục thống kê trong 6 tháng đầu năm 2010, xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đạt giá trị 2,047 tỷ USD tăng 17% so với cùng kỳ năm 2009. Trong đó tôm là sản phẩm xuất khẩu chủ lực của chiếm 35% sản lượng xuất khẩu, còn lại là các sản phẩm khác. Bảng 1.1: Sản lượng và kim ngạch xuất khẩu thủy sản giai đoạn 2007 – 6th/2010 Năm Chỉ tiêu 2007 2008 2009 6th/2010 Sản lượng (nghìn tấn) 12 1239 1219 597,9 Kim ngạch (triệu USD) 3760 4510 4251 2047 ( Nguồn: Hải quan Việt Nam - Tổng cục thống kê) Trang 5
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Bảng 1.2: Sản lượng và kim ngạch các mặt hàng thủy sản xuất khẩu giai đoạn 2007 – 6th/2010 Sản lượng (nghìn tấn) Kim ngạch( triệu USD) Mặt hàng 2007 2008 2009 6th/2010 2007 2008 2009 6th/2010 Tôm 160,5 192 209 87,2 1500 1630 1692 718 Cá tra và basa 372 644 608 304 - 1460 1357 653 Loại khác 631,5 403 402 61,9 - 1420 1202 256 (Nguồn: Hải quan Việt Nam-Tổng cục thống kê) Cùng với ngành nuôi trồng và khai thác thủy sản thì ngành chế biến thủy sản đã có nhiều đóng góp trong thành tích chung của ngành thủy sản Việt Nam. Trong những năm gần đây, khoảng 35% đầu ra của sản phẩm thủy sản được sản xuất để xuất khẩu và phần còn lại được bán ra trên thị trường nội địa hoặc ở dạng tươi sống (34,5%), hoặc đã qua chế biến (45,7%) dưới dạng bột cá, nước mắm, cá khô. Bên cạnh sự phát triển của ngành thủy sản thì ngành giết mổ gia súc và chế biến thịt cũng không ngừng lớn mạnh về qui mô cũng như phát triển về kỹ thuật giết mổ và nó thật sự trở thành một ngành công nghiệp. Ở nước ta có thể thấy việc giết mổ gia súc đang diễn ra hết sức phức tạp, manh mún, quy trình kỹ thuật giết mổ từ rất nhỏ đến quy mô lớn dẫn đến chất lượng thịt không đảm bảo không đạt vệ sinh an toàn thực phẩm. Hiện nay thành phố Hồ Chí Minh có 41 cơ sở giết mổ (số liệu đến ngày 13.3.2003), trong đó có 3 cơ sở được phép giết mổ trâu bò, có 7 cơ sở giết mổ có công suất 300-1000 con heo/ ngày đêm. 1.1.2 Tính chất nước thải giàu đạm  Nước thải chế biến thủy sản Nước thải ngành chế biến thủy sản chứa nồng độ các chất hữu cơ gây ô nhiễm cao (các phế phẩm trong và sau chế biến, hóa chất xử lý), nhiều chất có chứa hàm lượng nitrogen liên kết và lưu huỳnh. Các nhà máy chế biến thủy sản đông lạnh thường có lượng nước thải lớn so với các cơ sở chế biến hàng khô, nước mắm, đồ hộp bình quân khoảng 50000m3 ngày. Trang 6
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Giá trị các đặc tính nước thải chế biến thủy sản có phổ phân tán biến động tương đối rộng nhưng chúng đều có đặc điểm chung là phụ thuộc vào loại nguyên liệu, quy trình sản xuất và sản phẩm chế biến. Những yếu tố này quyết định thành phần, đặc tính và mức độ ô nhiễm của cơ sở sản xuất chế biến. Nhìn chung, hàm lượng chất hữu cơ trung bình dao động từ 300-3000 mg/l COD, từ 200-2000 mg/l BOD5, từ 9,5-400 mg/l SS, hàm lượng nitơ tổng số từ 90- 270mg/l, photpho tổng từ 30-90mg/l. Trong đó nước thải có hàm lượng chất hữu cơ cao nhất là nước máu cá và nước dính nhớt từ các cơ sở sản xuất bột cá, COD có thể lên đến 93.000mg/l, BOD5 lên đến 76.000mg/l. Tuy nhiên tùy từng giai đoạn mà các giá trị có sự thay đổi đáng kể, nước thải từ các quá trình rã đông, sơ chế và rửa nguyên liệu cho tới khâu chế biến đồ hộp thủy sản đông lạnh có độ đậm đặc cao và rất cao. BOD từ 1.000-10.0000 mg/l, SS từ 1.000-2.000 mg/l. Nước thải từ quá trình hấp, luộc có hàm lượng BOD từ 10.000- 20.000 mg/l, SS từ 1.000-10.000 mg/l. Nước thải từ quá trình ngâm và để ráo trong sản xuất Jam bông, xúc xích thủy sản có COD từ 1.000-3.000 mg/l, SS từ 500- 2.000 mg/l. Nước thải từ quá trình vệ sinh công nghiệp có COD từ 400-2.000 mg/l BOD từ 10-1.000 mg/l, SS từ 300-3.000mg/l. Sau đây là một số kết quả phân tích thành phần và tính chất nước thải thủy hải sản tham khảo tại một vài nhà máy chế biến thủy sản điển hình. Bảng 1.3: Thành phần và tính chất nước thải tại nhà máy chế biến thuỷ hải sản ở Bà Rịa - Vũng Tàu Chỉ tiêu Mức độ BOD5 1000 – 2000 mg/l Tổng chất rắn lơ lửng 1500 – 2000 mg/l Tổng nitơ 75 – 230 mg/l Tổng photpho 3 – 10 mg/l pH 6,6 – 7, 9 (Nguồn: CEFINEA, 2002) Trang 7
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Bảng 1.4: Thành phần và tính chất nước thải nhà máy chế biến thuỷ hải sản Ngô Quyền - Kiên Giang Nước thải Nước thải Nước thải Nước thải cống xả Chỉ tiêu chế biến chế biến phân xưởng Đơn vị phân xưởng mực tôm đông lạnh đông lạnh pH 6,62 7,32 7,14 7,08 TDS mg/l 1440 1160 1640 1410 Độ đục PTU 121 92 242 152 Độ màu Pt-Co 1674 852 2273 1600 P - PO4 mg/l 21,01 12,56 3,75 12,44 SS mg/l 9,5 55 36 32 N-amoni mg/l 165,19 76 52,71 98 Coliform MPN/100ml 1000 1100 19000 - COD mg/l 893 336 230 1200 (Nguồn: CEFINEA, 2002) Bảng 1.5: Đặc trưng thành phần và tính chất nước thải nhà máy chế biến thuỷ sản Đặc trưng ô Quy chuẩn Việt Nam STT Hàm lượng nhiễm 11:2008, loại B 1 BOD5 300-2000 50 2 COD 500-3000 80 3 SS 200-1000 100 4 pH 6,5-7,5 5,5-9 5 N 50-200 60 6 P 10-100 - (Nguồn: CEFINEA, 2002) Trang 8
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền  Nước thải chế biến thịt Ngoài các cơ sở chế biến thủy sản thì các cơ sở giết mổ, chế biến thịt cũng thải ra môi trường một lượng lớn nước thải có nồng độ ô nhiễm tương đối cao như BOD5 từ 2.500-7.400 mg/l, COD từ 2.400-9.600mg/l. Mặt khác nước thải của cơ sở chế thịt thường chứa một lượng lớn vi sinh vật. Nếu không có biện pháp xử lý thì rất dễ gây ô nhiễm bởi các vi sinh vật gây bệnh, gây ngộ độc nguồn nước sử dụng. Ngoài ra ngành giết mổ là một ngành đòi hỏi sử dụng nước rất nhiều, hầu như các công đoạn xử lý nguyên liệu đều có nhu cầu dung nước như khâu rửa sơ bộ nguyên liệu, khâu làm rã nước đá đông lạnh, khâu xử lý nguyên liệu, khâu chế biến. Nước thải của công nghiệp chế biến thịt gần giống như nước thải sinh hoạt nhưng có mức độ ô nhiễm cao hơn nhiều, với nồng độ dầu, mỡ, axit béo rất cao, ngoài ra còn có chất tẩy rửa lông. Bảng 1.6: Đặc trưng thành phần tính chất nước thải chế biến thịt STT Thông số Đơn vị Hàm lượng 1 pH - 5,3-8,9 2 Độ dẫn điện - 2,8-6,1 3 Clo mg/l 1,1-390 4 Chất rắn qua lọc - 160-580 5 BOD5 mg/l 1500-7400 6 COD mg/l 2400-9600 7 Chất béo - 115-300 8 Axit hữu cơ - 61-350 9 Nitơ amon mg/l 230-1120 10 H2S - 0-20 11 Tổng P mg/l 1,6-53 12 Độ cứng - 35,6-125 13 Độ kiềm - 30-70 Trang 9
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền 1.1.3 Ảnh hưởng nước thải giàu đạm đến môi trường Hiện nay tình trạng xả thải từ các cơ sở sản xuất thủy sản và thịt chưa qua xử lý hoặc xử lý chưa đạt tiêu chuẩn đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường xung quanh, làm mất khả năng tự làm sạch của nguồn nước, ảnh hưởng đến sức khỏe của người dân và đến sự phát triển bền vững của đất nước. Đối với nước ngầm tầng nông, nước thải chế biến thuỷ sản có thể thấm xuống đất và gây ô nhiễm nước ngầm. Các nguồn nước ngầm nhiễm các chất hữu cơ và vi sinh vật gây bệnh rất khó xử lý thành nước sạch cung cấp cho sinh hoạt. Đối với các nguồn nước mặt, các chất ô nhiễm có trong nước thải chế biến thuỷ sản, thit sẽ làm suy thoái chất lượng nước, tác động xấu đến môi trường và thủy sinh vật. Các chất hữu cơ trong nước thải như cacbonhydrat, protein, chất béo khi xả vào nguồn nước làm giảm nồng độ oxy hòa tan trong nước do vi sinh vật sử dụng oxy hòa tan để phân hủy các chất hữu cơ. Nồng độ oxy hòa tan dưới 50% bão hòa có khả năng gây ảnh hưởng tới sự phát triển của tôm, cá. Oxy hòa tan giảm không chỉ gây suy thoái tài nguyên thủy sản mà còn làm giảm khả năng tự làm sạch của nguồn nước, dẫn đến giảm chất lượng nước sinh hoạt và công nghiệp. Các chất rắn lơ lửng làm cho nước đục hoặc có màu, hạn chế độ sâu tầng nước được ánh sáng chiếu xuống, gây ảnh hưởng tới quá trình quang hợp của tảo, rong rêu Chất rắn lơ lửng cũng là tác nhân gây ảnh hưởng tiêu cực đến tài nguyên thủy sinh đồng thời gây tác hại về mặt cảm quan (tăng độ đục nguồn nước) và gây bồi lắng lòng sông, cản trở sự lưu thông nước và tàu bè. Nồng độ các chất nitơ, photpho cao gây ra hiện tượng phát triển bùng nổ các loài tảo, đến mức độ giới hạn tảo sẽ bị chết và phân hủy gây nên thiếu hụt oxy. Ngoài ra, các loài tảo nổi trên mặt nước tạo thành lớp màng khiến ánh sáng không tới được các lớp nước bên dưới, cản trở quá trình quang hợp của các thực vật tầng dưới bị ngưng trệ. Tất cả các hiện tượng trên gây tác động xấu tới chất lượng nước, ảnh hưởng tới hệ thuỷ sinh, nghề nuôi trồng thuỷ sản, du lịch và cấp nước. Trang 10
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Hình 1.1: Hiện trạng ô nhiễm nước thải thủy sản chưa qua xử lý (Nguồn: Khoa học và đời sống) 1.1.4 Sự tăng trưởng của vi sinh vật trong nước thải giàu đạm Sự sinh trưởng của vi sinh vật bao gồm sự tăng kích thước, số lượng tế bào, phát triển tăng sinh khối của quần thể vi sinh vật.Trong nước thải và các công trình xử lý nước thải, sự sinh trưởng cũng là sự tăng số lượng tế bào và sự thay đổi kích thước tế bào. Kích thước tế bào dao động xung quanh một giá trị trung bình thì việc tính số lượng tế bào cũng phản ánh được sự tăng sinh khối của vi sinh vật. Các vi sinh vật trong nước thải chủ yếu là vi khuẩn dị dưỡng, có thể đồng hoá các chất hữu cơ trong nước thải (BOD) làm nguồn dinh dưỡng. Ngoài ra, các + 3- chất dinh dưỡng cần thiết khác là nguồn nitơ (NH4 ) và nguồn photpho (PO4 ), các nguyên tố khoáng khác như K, Mg, Ca, và các nguyên tố vi lượng (sắt, đồng, kẽm, mangan). Các chất khoáng và vi lượng này thường rất phong phú trong nước thải sinh hoạt. Các nguyên tố C, N, P cần cho sinh trưởng của vi khuẩn thường theo tỉ lệ BOD : N : P = 100 : 5 : 1. Trong quá trình xử lý nước thải công nghiệp, nhiều trường hợp phải bổ sung các nguồn N và P từ bên ngoài nhằm đảm bảo quá trình sinh trưởng phát triển của vi sinh vật hoặc phải khử trước các kim loại nặng gây độc hại cho tế bào vi sinh vật. Vi sinh vật sinh sản chủ yếu bằng cách phân chia tế bào, quá trình sinh sản phụ thuộc vào điều kiện môi trường. Khi môi trường cạn kiệt các chất dinh dưỡng, pH và nhiệt độ thay đổi khả năng sinh sản sẽ bị ngừng lại. Trang 11
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Hình 1.2: Quá trình sinh trưởng của vi sinh vật (1): Giai đoạn thích nghi (2): Giai đoạn tăng trưởng logarit (3): Giai đoạn giảm tốc (4): Giai đoạn ổn định (5): Giai đoạn suy vong Quá trình sinh trưởng chia làm 5 giai đoạn:  Giai đoạn thích nghi Vi khuẩn vào môi trường chưa phát triển ngay mà còn cần một thời gian làm quen với môi trường, cần cảm ứng sinh tổng hợp các enzyme thích hợp với cơ chất.  Giai đoạn tăng trưởng logarit Vi sinh vật phát triển theo hàm logarit và tốc độ tăng trưởng riêng đạt giá trị cực đại. Trong suốt thời kỳ này các tế bào phân chia theo tốc độ xác định bởi thời gian sinh sản, khả năng thu nhận và đồng hóa thức ăn.  Giai đoạn giảm tốc Trong giai đoạn này, cơ chất dinh dưỡng trong môi trường đã giảm dần. Trong một số trường hợp, phát triển chậm dần là do trong môi trường tích tụ các sản phẩm ức chế được sinh ra trong quá trình chuyển hoá chất trong tế bào vi khuẩn.  Giai đoạn ổn định Trang 12
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Mật độ tế bào đạt tới giá trị cực đại, sự sinh trưởng dừng lại ngay cả khi tế bào vẫn còn hoạt động chuyển hoá nào đó.  Giai đoạn suy vong Ở giai đoạn này các chất dinh dưỡng đã hết. Mật độ tế bào giảm do các tế bào già chết và tỉ lệ chết cứ tăng dần lên. Tế bào vi khuẩn bị phân huỷ nội sinh hoặc hô hấp nội bào và bị tự phân (autoliz). Các giai đoạn này diễn ra trong môi trường ở cả điều kiện hiếu khí và kị khí. Giá trị của các thông số phụ thuộc vào các loài vi sinh vật, hàm lượng cơ chất và nhiệt độ, pH của môi trường.[2], [7] 1.1.5 Các vi sinh vật tham gia quá trình xử lý nước thải giàu đạm Theo Nguyễn Đức Lượng (2003), các chất nhiễm bẩn chủ yếu là các chất hữu cơ hòa tan. Ngoài ra còn có các chất hữu cơ ở dạng keo và phân tán nhỏ ở dạng lơ lửng. Các dạng này tiếp xúc với bề mặt vi khuẩn bằng cách hấp phụ hay keo tụ sinh học, sau đó sẽ xảy ra quá trình đồng hóa hay dị hóa. Phương pháp xử lý sinh học nước thải dựa trên cơ sở hoạt động của vi sinh vật phân hủy các chất hữu cơ nhiễm bẩn trong nước. Do vậy điều kiện đầu tiên và vô cùng quan trọng là nước thải phải là môi trường sống của của quần thể vi sinh vật phân hủy các chất hữu cơ có trong nước thải. Quá trình làm sạch nước thải nhờ vi sinh vật gồm 3 giai đoạn: (i) Các chất hữu cơ tiếp xúc với bề mặt tế bào vi sinh vật (ii) Khuếch tán và hấp thụ các chất ô nhiễm nước qua màng bán thấm vào trong tế bào vi sinh vật (iii) Chuyển hóa các chất này vào trong nội bào để sinh năng lượng và tổng hợp vật liệu mới cho tế bào vi sinh vật. Trong nước thải, thành phần của các chủng vi sinh vật hầu hết là hoại sinh và dị dưỡng trong đó đa số là các vi khuẩn hiếu khí, kị khí hoặc kị khí tùy tiện như các vi khuẩn: Bacillus, Alcahgenes, flavobacterium, Cytophag, Micrococcus, Lactobacillus, Achromobacter. Các giống này thường gặp hầu hết ở các loại nước thải, chúng có thể đồng hóa được mọi chất hữu cơ kể cả các chất hữu cơ tổng hợp như polyvinyl alcohol – PVA và sống khá lâu trong môi trường nước. Trong đó Trang 13
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền giống Bacillus phân hủy được nhiều dạng các hợp chất hữu cơ, đặc biệt là protein và tinh bột nhờ hệ enzyme đa dạng và khả năng thích nghi cao. Các giống Alcaligenes và Flavobacterium cũng khá quan trọng gần như hai giống trên, ở nơi nào có sự phân hủy của protein là có hai giống này. A: Vi khuẩn Flavobacterium B: Vi khuẩn Bacillus C: Penicillium D: Aspergillus oryzae Hình 1.3: Một số vi sinh vật trong nước thải giàu đạm Vi khuẩn Bacillus là trực khuẩn gram dương, đứng riêng rẽ hoặc kết thành dạng chuỗi. Có khả năng tạo enzyme protease và amylase, có khả năng sinh bào tử Trang 14
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền và sống hiếu khí ( hoặc kỵ khí tùy tiện ). Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp là 350C đến 400Ctối đa tới 600C. Ở pH dưới 6,5 chúng ngừng phát triển. Bên cạnh đó nhiều vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc có enzyme protease đều phân hủy được protein như Streptomyces, Actinomyces, nhiều loài nấm mốc thuộc giống Aspergillus, Penicillium.[2], [6] 1.2 Tổng quan về quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ giàu đạm nhờ vi sinh vật 1.2.1 Quá trình amon hóa Trong nước và trong đất luôn luôn tồn tại nhiều xác động thực vật. Xác động vật và thực vật chứa rất nhiều hợp chất hữu cơ chứa nitơ. Các hợp chất hữu cơ thường không được thực vật sử dụng trong quá trình trao đổi chất, thực vật chỉ có thể sử dụng các hợp chất vô cơ dạng hòa tan. Do đó các hợp chất hữu cơ khi thải vào môi trường nước nếu không được vi sinh vật phân hủy thành các hợp chất vô cơ hòa tan sẽ không được thực vật sử dụng. Như vậy một mặt vi sinh vật như một sinh vật làm sạch môi trường ô nhiễm bởi các chất hữu cơ chứa nitơ, một mặt như một tác nhân trung gian chuyển hóa các hợp chất khó tiêu đối với thực vật này thành các chất dễ tiêu cho thực vật sử dụng. Các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ trong môi trường nước còn bị phân hủy bởi các động vật khác. Tuy nhiên sự phân hủy này xảy ra chủ yếu là do vi sinh vật. Vi sinh vật đóng vai trò quyết định trong quá trình chuyển hóa protein thành các hợp chất vô cơ. Như vậy quá trình amon hóa là quá trình phân giải các chất hữu cơ chứa nitơ và giải phóng ammoniac. a. Quá trình phân giải ure Ure là sản phẩm của quá trình trao đổi chất của con người và động vật. Ure chủ yếu có trong nước tiểu của người và động vật. Ngoài ra ure được đưa vào môi trường nước nhiều từ việc sử dụng phân bón hóa học. Thực vật hầu như hoàn toàn không có khả năng sử dụng ure trực tiếp. Chính vì thế chúng cần chuyển hóa thành muối amon. Vi khuẩn tham gia quá trình chuyển hóa này gồm các giống thuộc Urebacterium. Hầu hết chúng thuộc họ Cocoaceae và Bacilacaea . Cụ thể chúng bao gồm các loài như: Sarcina hansenii, Bacillus pasteurii, Proteus vulgaris. Trang 15
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Cơ chế chuyển hóa của chúng như sau: CO + H2O CO + 2NH3 (NH4)2CO3 (NH4)2CO3 2 NH3 + CO2 + H2O b. Quá trình amon hóa protein Trong các nguồn nước luôn xảy ra quá trình amon hóa protein nhờ các vi khuẩn amon hóa có enzyme protease ngoại bào phân hủy protein thành các hợp chất đơn giản hơn là polypeptide, oligopeptide. Qúa trình này có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí. * Cơ chế : Nhóm vi sinh vật phân hủy protein có khả năng tiết ra enzyme protease bao gồm proteinase và peptidase. Enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide tạo sản phẩm là axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin. Dưới tác dụng của enzyme proteinase phân tử protein sẽ được phân giải thành các polypeptide và oligopeptide. Các chất này hoặc tiếp tục phân hủy thành các axit amin nhờ enzyme peptidase ngoại bào hoặc được tế bào vi khuẩn hấp thụ rồi sau đó được phân hủy tiếp thành các axit amin trong tế bào. Một phần các axit amin được tế bào vi khuẩn sử dụng để tổng hợp protein tạo sinh khối. Một phần các axit amin theo các con đường phân giải khác nhau để sinh NH3, CO2 và các sản phẩm trung gian khác. Với các protein có chứa S, nhờ enzyme desulfurase của nhóm vi khuẩn lưu huỳnh và các nhóm dị dưỡng hiếu khí khác, sẽ bị phân hủy tạo H2S, scatol, indol hay mercaptan .[7], [8] 1.2.2 Enzyme protease của vi sinh vật Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để Trang 16
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm ), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp, làm sạch môi trường Trong đó, lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng. Ưu điểm lớn nhất của protease từ vi sinh vật là phong phú về chủng loại, có tính đặc hiệu rộng rãi, cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. Tuy nhiên, hệ protease vi sinh vật lại phức tạp, bao gồm nhiều enzyme giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Đối với sinh lý của vi sinh vật, protease đóng vai trò rất quan trọng. Có 2 loại protease là protease ngoại bào và protease nội bào với các chức năng như sau : Protease ngoại bào của vi sinh vật tham gia các quá trình phân giải ngoại bào các protein để tạo ra các axit amin. Các axit amin này sẽ được đưa vào trong tế bào tham gia tổng hợp sinh khối hoặc cũng có thể bị phân giải để giải phóng năng lượng và sản phẩm bậc 2. Hình 1.4: Quá trình phân giải protein ngoại bào Protease nội bào của vi sinh vật tham gia quá trình cải biến protein, enzyme, tạo ra các quá trình cung cấp năng lượng, vật liệu xây dựng, và sự tạo thành bào tử của vi sinh vật. Protease nội bào có thể tham gia vào việc hoàn thiện các chuỗi polypeptide đã được tổng hợp như: tách gốc, tách một số gốc axit amin khỏi đầu N của chuỗi polypeptide đã được tổng hợp. Protease nội bào tham gia phân hủy các protein nội bào không còn tác dụng trong quá trình sinh lý của vi sinh vật. Trang 17
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Hình 1.5: Quá trình hoạt động protease nội bào 1.2.3 Các vi sinh vật tham gia quá trình amon hóa protein Bảng 1.7: Một số vi sinh vật tham gia quá trình amon hóa protein Nhóm vi sinh Kiểu gây thối Dạng phân hủy vật Kị khí (yếm khí) Hiếu khí Bacillus putrificus Bacillus pyocyaneum Phân hủy protein Bacillus histolytics Bacillus mensentericus Bacillus coligenes Nhóm các vi Bacillus ventriculosus sinh vật có Phân hủy peptide Bacillus orbiculus enzyme đơn Bacillus faccalis Phân hủy axit Algaligenes amin Proteus zenkirii Bacillus perfrigenes Streptococus Phân hủy protein Bacillus sporogenes Straphylococus Proteus vulgaris Nhóm các vi Bacillus bifidus sinh vật có Phân hủy peptide Bacillus acidophilus enzyme hỗn Bacillus butyricus hợp Bacillus lactic aerogen Phân hủy axit Bacillus aminophilus amin Bacillus coligenes Trang 18
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Vi sinh vật tham gia quá trình phân giải protein rất đa dạng. Chúng thuộc các vi sinh vật hiếu khí, yếm khí và hiếu khí tùy tiện được trình bày ở bảng 1.7 [2], [8] 1.3 Tổng quan về các phương pháp sinh học xử lý nước thải 1.3.1 Mục đích của quá trình xử lý nước thải Mục đích quan trọng nhất của quá trình xử lý nước thải là làm giảm hàm lượng chất hữu cơ hoặc loại bỏ những chất ô nhiễm vi lượng khó phân hủy sinh học và có thể gây độc. Mục đích thứ hai là loại bỏ hoặc giảm bớt chất dinh dưỡng N và P để hạn chế ô nhiễm cho nguồn nước nhận và nước ngầm nếu nước thải được đổ ra đất. Mục đích thứ ba là làm bất hoạt những vi sinh vật gây bệnh, virus và các ký sinh trùng có trong nước thải. Một cách tổng quát, xử lý sinh học có thể chia thành hai nhóm phương pháp lớn: - Nhóm các phương pháp hiếu khí: sử dụng những vi sinh vật hiếu khí hoạt động trong điều kiện cung cấp oxy. - Nhóm các phương pháp kỵ khí: sử dụng những vi sinh vật kỵ khí hoạt động trong điều kiện không có oxy. 1.3.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình xử lý sinh học Cơ sở lý thuyết của các phương pháp xử lý sinh học là quá trình chuyển hóa vật chất, quá trình tạo cặn lắng và quá trình tự làm sạch nguồn nước của các vi sinh vật có trong tự nhiên nhờ khả năng chuyển hóa được rất nhiều nguồn cơ chất khác nhau có trong nước thải. Các chất hữu cơ hòa tan, các chất keo và các chất phân tán nhỏ trong nước thải tiếp xúc với tế bào vi sinh vật, sau đó các quá trình chuyển hóa vật chất diễn ra với ba giai đoạn chính: (i) chuyển các vật chất ô nhiễm từ pha lỏng tới bề mặt tế bào vi sinh vật, (ii) khuếch tán từ bề mặt tế bào qua màng bán thấm do sự chênh lệch nồng độ bên trong và bên ngoài tế bào, (iii) chuyển hóa các chất trong tế bào vi sinh vật, sản sinh năng lượng và tổng hợp tế bào mới. Trong các nguồn nước luôn xảy ra quá trình amon hóa chất hữu cơ nhờ các vi khuẩn amon hóa có enzyme protease ngoại bào phân hủy protein thành các hợp Trang 19
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền chất đơn giản hơn là polypeptide, oligopeptide. Các chất này hoặc tiếp tục phân hủy thành các acid amin nhờ enzyme peptidase ngoại bào hoặc được tế bào vi khuẩn hấp thụ rồi sau đó được phân hủy tiếp thành các acid amin trong tế bào. Một phần các acid amin được tế bào vi khuẩn sử dụng để tổng hợp protein tạo sinh khối. Một phần các acid amin theo các con đường phân giải khác nhau để tạo ra NH3, CO2 và các sản phẩm trung gian khác. Với các protein có chứa sulfure, nhờ enzyme desul- furase của nhóm vi khuẩn lưu huỳnh và các nhóm dị dưỡng hiếu khí khác, sẽ bị phân hủy tạo thành H2S. Theo con đuờng thủy phân trong điều kiện hiếu khí, các vi khuẩn, Bacillus, Pseudomonas, Actinomyces, và các loài nấm men chuyển hóa nhanh tinh bột thành đường. Sản phẩm đường này một phần bị phân hủy thành CO2 cùng các sản phẩm khác, một phần được chuyển hóa tiếp tục theo các quá trình trao đổi chất khác trong tế bào. Đối với cellulose, Cytophase và Sporocytophaga là hai loài có khả năng phân hủy trong điều kiện hiếu khí mạnh nhất, tiếp theo là các loài Pseudomonas, Vibrio, Myxobacterium, Actinomyces Sản phẩm của quá trình phân hủy này là các loại đường. Trong bùn lắng, quá trình phân hủy cellulose kỵ khí chủ yếu bởi Clos- tridium tạo thành các sản phẩm etanol, acid formic, acid lactic và CO2. Có rất nhiều loài phân hủy chất béo. Quan trọng nhất là các loài, Vibrio, Bacillus, Sarcine, Pseudomonas Sản phẩm thủy phân là glycerin và acid béo nhờ enzyme lipase nội bào và ngoại bào. Sau đó, glycerin và acid béo lại được chuyển hóa thành nhiều sản phẩm khác. Cùng với vai trò chuyển hóa vật chất, vi sinh vật còn tham gia tạo cặn lắng. Nhờ quá trình sinh trưởng lơ lửng hoặc bám dính của vi sinh vật, các hạt chất bẩn nhỏ liên kết lại thành các hạt chất bẩn lớn hơn và tăng cường quá trình sa lắng. Nấm sợi và vi khuẩn có tiên mao là các loài đóng vai trò tạo cặn lắng nhiều nhất. Trong nước thải, vi sinh vật luôn có mối quan hệ rất phức tạp. Quan hệ cạnh tranh quyết định thành phần vi sinh vật. Quan hệ con mồi – săn mồi ảnh hưởng số lượng vi sinh vật. Quan hệ cộng sinh, hỗ trợ lẫn nhau trong quá trình chuyển hóa Trang 20
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền vật chất làm phong phú và đa dạng cho hệ vi sinh vật trong nước thải. Các mối quan hệ này quyết định khả năng, tốc độ và hiệu quả xử lý chất ô nhiễm của vi sinh vật. 1.3.3 Các quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học Xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học là dựa trên hoạt động sống của vi sinh vật có khả năng phân hóa các hợp chất hữu cơ và các công trình thường được áp dụng như sau: Bùn hoạt tính chủ yếu là vi khuẩn hiếu khí hoạt động trong điều kiện hiếu khí, cần có oxy. Và quá trình phân huỷ chất hữu cơ dựa vào sự tiếp xúc của chất hữu cơ với tế bào sinh vật (bông bùn) chuyển động lơ lửng trong nước thải, diễn ra quá trình tăng trưởng lơ lửng. Màng sinh học gồm hệ vi sinh vật tuỳ tiện: ở màng hiếu khí, phần ngoài màng là vi khuẩn hiếu khí, ở giữa là các vi khuẩn tuỳ tiện và trong cùng là các vi khuẩn kị khí, ở màng kị khí gồm các vi khuẩn kị khí chủ yếu và một số ít là tuỳ nghi. Và quá trình phân hủy chất hữu cơ của màng sinh học dựa vào cơ chế hấp phụ các thành phần hữu cơ trong nước thải một cách cố định, diễn ra quá trình tăng trưởng dính bám.[6], [8] 1.4.3.1 Sinh trưởng lơ lửng – bùn hoạt tính Bùn hoạt tính là tập hợp các vi sinh vật khác nhau chủ yếu là vi khuẩn, kết lại thành bông với trung tâm là các hạt chất rắn lơ lửng trong nước. Các bông này có màu vàng nâu, dễ lắng, có kích thước từ 3 – 150 μm. Các chất keo dính trong khối nhầy của bùn hoạt tính hấp phụ các chất lơ lửng, vi khuẩn, các chất màu, mùi, trong nước thải. Do vậy hạt bùn sẽ lớn dần và tổng lượng bùn cũng tăng dần lên, rồi từ từ lắng xuống đáy. Kết quả là nước sáng màu, giảm lượng ô nhiễm, các chất huyền phù lắng xuống cùng với bùn và nước sẽ được làm sạch. Khi cân bằng dinh dưỡng cho vi sinh vật trong nước thải cần quan tâm tới tỉ số BOD5 : N : P = 100 : 5 : 1 hoặc 200 : 5 : 1 trong các công trình xử lý hiếu khí. Khi cân bằng dinh dưỡng người ta có thể dùng NH4OH, ure và các muối amon làm nitơ và các muối phosphat, supephosphat làm nguồn phospho. Trang 21
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Các nguyên tố vi lượng: K, Mg, Ca, S, Fe, Mn, Zn đều cần cho vi sinh vật nhưng ở trong nước thải thường có đủ mặt các chất này và không cần phải bổ sung thêm. Thiếu các nguyên tố dinh dưỡng sẽ kìm hãm sinh trưởng và ngăn cản các quá trình oxi hoá - khử trong tế bào vi sinh vật, làm giảm khả năng phân huỷ chất hữu cơ có trong nước thải: + Nếu thiếu nitơ (dạng NH4 là nguồn dinh dưỡng của vi sinh vật) lâu dài sẽ làm cho vi sinh vật không sinh sản, tăng sinh khối, ngoài ra còn cản trở quá trình hoá sinh làm cho bùn hoạt tính khó lắng, trôi theo nước ra khỏi bể lắng. Nếu thiếu phospho sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật sợi phát triển như Nocar- dia hay Microthrix gây sự cố bung bùn trong bùn hoạt tính, làm cho quá trình lắng chậm và giảm hiệu suất oxi hoá các chất hữu cơ của bùn hoạt tính. Số lượng vi khuẩn trong bùn hoạt tính dao động trong khoảng 108 đến 1012 trên 1mg chất khô (chất rắn tách ra từ bùn hoạt tính bằng cách lọc hoặc ly tâm ở 100oC). Phần lớn chúng là Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus, Flavobacterium, Bacillus, Alcaligenes. Các vi khuẩn tham gia quá trình chuyển hoá NH3 thành N2 thấy có mặt trong bùn như Nitromonas, Nitrobacter, Acinetobacter, Hyphomycrobium,Thiobacillus Trong khối nhầy ta thấy có loài Zooglea, đặc biệt là Z.ramizoga rất giống Pseudomonas. Chúng có khả năng sinh ra một bào nhầy chung quanh tế bào. Bao nhầy này là một polyme sinh học, thành phần là polysaccarit, có tác dụng kết các tế bào vi khuẩn lại thành hạt bông. Trong bùn hoạt tính ta còn thấy các loài nguyên sinh động vật. Chúng đóng vai trò khá quan trọng trong bùn. Chúng cũng tham gia phân huỷ các chất hữu cơ ở điều kiện hiếu khí, điều chỉnh loài và tuổi quần thể vi sinh vật trong bùn, giữ cho bùn luôn luôn hoạt động ở điều kiện tối ưu. Động vật nguyên sinh ăn các vi khuẩn già hoặc đã chết, tăng cường loại bỏ vi khuẩn gây bệnh, làm đậm đặc màng nhầy nhưng lại làm xốp khối bùn, kích thích vi sinh vật tiết enzyme ngoại bào để phân huỷ các chất hữu cơ nhiễm bẩn và làm kết lắng bùn nhanh. Trong bùn hoạt tính thấy có đại diện của 4 lớp Protozoa là Sarcodina, Mastogophora, Ciliata và Suctoria. Hay gặp Trang 22
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền nhất là giống Amoeba thuộc lớp Sarcodina. Các loài Cladocera thì lọc các tế bào vi khuẩn và cả chất hữu cơ chết, lọc tảo sợi, có ích trong việc làm giảm độ đục của nước thải sau xử lý. Người ta lấy chỉ tiêu Protozoa để xác định chất lượng bùn hoạt tính, bùn có chất lượng cao thì cứ 1 triệu tế bào vi khuẩn phải có 10 – 15 protozoa. 1.4.3.2 Sinh trưởng dính bám – màng sinh học Trong dòng nước thải có những vật rắn làm giá mang, các vi sinh vật (chủ yếu là vi khuẩn) sẽ dính bám trên bề mặt. Trong số các vi sinh vật có những loài sinh ra các polysaccharide có tính chất như là các chất dẻo (gọi là polyme sinh học), tạo thành màng – màng sinh học. Màng này cứ dày dần thêm và thực chất đây là sinh khối vi sinh vật dính bám hay cố định trên các chất mang. Màng này có khả năng oxy hoá các chất hữu cơ có trong nước thải khi nước chảy qua hoặc tiếp xúc với màng, ngoài ra màng này còn khả năng hấp phụ các chất bẩn lơ lửng hoặc trứng giun sán Như vậy, màng sinh học là tập hợp các loài vi sinh vật khác nhau, có hoạt tính oxy hoá các chất hữu cơ có trong nước khi tiếp xúc với màng. Màng này dày từ 1 – 3mm và hơn nữa. Màu của màng thay đổi theo thành phần của nước thải từ màu vàng xám đến màu nâu tối. Trong quá trình xử lý, nước thải chảy qua lớp vật liệu lọc có thể cuốn theo các hạt của màng vỡ với kích thước 15 – 30 mm có màu sáng vàng hoặc nâu. Các công trình xử lý nước thải ứng dụng màng sinh học trên để loại bỏ các chất hữu cơ nhiễm bẩn ra khỏi nước thải. Cơ chế hoạt động của các công trình dựa trên lớp vật liệu lọc, tạo thành giá đỡ để hình thành màng sinh học. Vật liệu lọc có thể được thí nghiệm đơn giản với cát, sỏi được xếp như sau: ở dưới cùng là các lớp sỏi cuội đã rửa sạch có kích thước nhỏ dần theo chiều cao của lớp lọc, ở lớp trên được trải lớp cát vàng hạt to rồi đến nhỏ. Nước thải đã được lọc qua lớp màng sinh học sẽ thấm qua lớp cát nhỏ trên cùng rồi thấm dần qua lọc. Màng này được tạo thành từ hàng triệu đến hàng tỉ tế bào vi khuẩn, các vi sinh vật khác và có cả động vật nguyên sinh. Trang 23
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Màng sinh học trong các công trình lọc sinh học chủ yếu là các vi khuẩn hiếu khí, nhưng thực ra phải coi đây là hệ tuỳ tiện, màng còn có các vi khuẩn tuỳ tiện và kị khí. Ở ngoài cùng lớp màng là lớp hiếu khí, rất dễ thấy các loài trực khuẩn Bacillus. Lớp trung gian là các vi khuẩn tuỳ tiện như Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium, Micrococcus và cả Bacillus. Lớp sâu bên trong màng là kị khí, có vi khuẩn kị khí khử lưu huỳnh và khử nitrat là Desulfovibrio. Phần dưới cùng của lớp màng là lớp quần thể vi sinh vật với sự có mặt của động vật nguyên sinh và một số vi sinh vật khác. Các loài này sử dụng một phần màng sinh học làm thức ăn tạo thành các lỗ nhỏ của màng trên bề mặt chất mang. Quần thể vi sinh vật của màng sinh học có tác dụng như bùn hoạt tính. 1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học Nồng độ chất hữu cơ: chất hữu cơ có trong nứơc thải phải là cơ chất dinh dưỡng nguồn cacbon và năng lượng cho vi sinh vật. Các hợp chất hidrocacbon, protein, lipit hoà tan thường là cơ chất dinh dưỡng rất tốt cho vi sinh vật. COD/BOD ≤ 2 hoặc BOD/COD ≥ 0,5 mới có thể đưa vào xử lí sinh học (hiếu khí), nếu COD lớn hơn BOD nhiều lần, trong đó gồm có xenlulozơ, hemixenlulozơ, protein, tinh bột chưa tan thì phải qua xử lý sinh học kị khí. Và tỉ tệ chất hữu cơ của nước thải đầu vào các công trình xử lý sinh học theo tỉ số sau BOD5 : N : P = 100 : 5 : 1 hoặc 200 : 5 : 1 trong xử lý kéo dài. Nếu trong các công trình bùn hoạt tính, thiếu nitơ lâu dài, ngoài sự cản trở tạo tế bào mới và bùn, cản trở quá trình trao đổi chất của vi sinh vật và còn làm cho bùn khó lắng, các hạt bông trôi nổi làm cho nước khó trong. Thiếu phospho tạo sự phát triển của vi khuẩn dạng sợi, là nguyên nhân chính làm cho bùn phồng lên, khó lắng. Để cân đối dinh dưỡng có thể dùng các muối amon và phosphat như urê hay supephosphat vào nước thải để tăng nguồn N và P. Cần loại bỏ bớt các chất hữu cơ khó phân huỷ trong nước thải đầu vào như : lignin, kitin , có thể loại bỏ hiệu quả các chất trên ở giai đoạn xử lý hoá lý . pH của nước thải : có ảnh hưởng đến các quá trình hoá sinh của vi sinh vật. Quá trình tạo màng sinh học, quá trình tạo bùn và lắng. pH thích hợp cho vi khuẩn Trang 24
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền sinh trưởng và phân huỷ hiệu quả chất hữu cơ từ 6.5 – 8.5, tốt nhất là 7.5, pH > 9 hoặc pH Ag >Cu >Hg >Co >Ni >Pb >Cr3+ >V >Cd >Zn >Fe Muối của các kim loại này ảnh huởng nhiều tới đời sống của vi sinh vật, nếu quá nồng độ cho phép, các vi sinh vật không thể sinh trưởng được và có thể bị Trang 25
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền chết. Như vậy, không thể tiến hành xử lý sinh học. Nồng độ muối của chúng thấp sẽ làm giảm tốc độ làm sạch nước, vì các kim loại trên cũng là những chất vi lượng cần cho vi sinh vật. Hàm lượng oxy trong nước thải: đối với các công trình xử ký hiếu khí như aerotank, điều kiện đầu tiên để đảm bảo cho aerotank có khả năng oxy hoá các chất hữu cơ với hiệu suất cao là phải đảm bảo cung cấp đủ lượng oxy mà chủ yếu là oxy hoà tan trong môi trường lỏng một cách liên tục, đáp ứng đầy đủ nhu cầu hiếu khí của vi sinh vật trong bùn hoạt tính. Lượng oxy có thể được coi là đủ khi nước thải ra khỏi bể lắng 2 có nồng độ oxy hoà tan DO = 2 mg/l. Còn đối với bể lọc sinh học làm việc trong điều kiện thoáng khí, ngoài việc cấp oxy cho vi sinh vật ở màng sinh học hoạt động, thoáng khí còn có tác dụng loại ra khỏi lọc các khí tạo thành do quá trình phân huỷ chất hữu cơ có trong nước, như CO2 và có thể có cả CH4, H2S Và đối với các công trình xử lý kị khí, lại đòi hỏi nước thải có hàm lượng oxy hoà tan thấp, cho vi sinh vật kị khí hoạt động hiệu quả trong điều kiện không có oxy. Hệ thống xử lý: chế độ thuỷ động như bơm, các thiết bị thông khí nhằm cung cấp oxy hoà tan cho các công trình xử lý hiếu khí như aerotank, bể lọc sinh học. Để đáp ứng nhu cầu oxy hoà tan trong aerotank người ta thường chọn giải pháp là khuấy cơ học (khuấy ngang, khuấy đứng), thổi và sục khí bằng hệ thống phân tán khí thành các dòng, hoặc tia lớn nhỏ khác nhau, và kết hợp nén khí với khuấy đảo. Đối với bể lọc sinh học, để thông khí người ta dùng quạt gió thổi vào khoảng trống ở đáy bể và không khí từ đó đi lên qua các khe của lớp vật liệu lọc. Trang 26
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Trang 27
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền 2.1 Thời gian và địa điểm 2.1.1 Thời gian Đề tài được thực hiện từ tháng 1 măm 2011 đến tháng 6 năm 2011 2.1.2 Địa điểm  Địa điểm lấy mẫu - Mẫu 1: Công ty cổ phần thủy sản số 4, số 320 Hưng Phú, Phường 9, Quận 8, Tp HCM. - Mẫu 2: Công ty thủy sản khu công nghiệp Đức Hòa, Long An - Mẫu 3: Công ty kỹ nghệ Vissan 420 Nơ Trang Long, Phường 13, Quận Bình Thạnh, Tp HCM.  Địa điểm thực hiện thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm khoa Môi trường và Công nghệ sinh học Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP. HCM. 2.2 Dụng cụ và hóa chất 2.2.1 Dụng cụ - Ống nghiệm - Đĩa petri - Autoclave - Pipet, micro pipet - Bếp đun - Cốc thủy tinh 2.2.2 Hóa chất - Môi trường phân lập Môi trường dinh dưỡng có nguồn protein (NA) Môi trường ding dưỡng (NB) Môi trường có sổ sung gelatine (NG) - Môi trường thử nghiệm sinh hóa Môi trường Simon citrate agar Môi trường canh Trypton Trang 28
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Môi trường MR-VP broth Môi trường Nitrate broth Môi trương Ure broth Môi trường có bổ sung tinh bột ( NT) 2.3 Phương pháp nghiên cứu Đề tài bao gồm các bước chính như sau: Lấy mẫu nước thải giàu protein ở một số cơ sở thủy sản Bước 1 và chế biến thịt Bước 2 Phân lập các vi khuẩn phân giải protein từ nước thải trên môi trường đặc trưng Bước 3 Xác định các đặc điểm hình thái Bước 4 Xác định khả năng phân hủy protein của các chủng vi khuẩn phân lập được Bước 5 Xác định đặc điểm sinh hóa và bước đầu định danh Bước 6 Xác định hoạt độ protease và mật độ tế bào Bước 7 Khảo sát hoạt độ phân giải protein ở một số điều kiện Hình 2.1: Nội dung nghiên cứu Trang 29
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu Mẫu được lấy tại các bể thu gom nước thải trước khi xử lý cho vào bình thủy tinh đã được khử trùng đưa về phòng thí nghiệm tiến hành phân lập trong 24 giờ. 2.3.2 Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy protein. Nước thải thủy sản, thịt Cấy trang trên môi trường NA Cấy ria tạo khuẩn lạc riêng rẽ Thuần nhất các khuẩn lạc Nhuộm gram, nhuộm bào tử (-) loại (+) (-) Xác định khả năng phân hủy loại protein ( +) (+) Xác định các đặc điểm sinh hóa Dự đoán chủng vi khuẩn phân lập được Tổng hợp kết quả Hình 2.2: Trình tự phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy protein Trang 30
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải pro- tein được tiến hành trình tự theo các bước ở hình 2.2. 2.3.2.1 Phương pháp phân lập các vi khuẩn phân giải protein từ nước thải trên môi trường đặc trưng Môi trường NA là môi trường có chứa nguồn C, N cơ bản và một lượng pro- tein làm chất cảm ứng cho vi sinh vật phân giải protein phát triển. Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy protein bằng cách sau: Mẫu nước thải lấy từ nhà máy thủy sản và chế biến thịt được xử lý bằng cách đun ở 800C trong 15 phút. Sau đó tiến hành pha loãng ở ba độ pha loãng khác nhau 10-1, 10-2, 10-3 và cấy trang trên môi trường dinh dưỡng NA bổ sung 2% agar ủ 24 giờ ở 370C. Sau đó tiến hành cấy ria từng loại khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường dinh dưỡng đến khi thu được các khuẩn lạc thuần nhất. 2.3.2.2 Phương pháp xác định các đặc điểm hình thái Mỗi loài vi khuẩn đều có các đặc điểm mang tính chất đặc trưng về hình dáng, kích thước, khả năng di động, sự hình thành bào tử, sinh sản. Vì vậy muốn phân lập được chủng vi khuẩn mong muốn cần tiến hành xác định các đặc điểm trên bằng các phương pháp ở bảng 2.1. Bảng 2.1: Các phương pháp xác định hình thái vi khuẩn STT Tên thử nghiệm Thuốc nhuộm Kết quả Tím tinh thể, lugol, Gram dương: màu tím 1 Nhuộm Gram fucshin Gram âm: màu hồng Tế bào màu hồng 2 Bào tử Malichite, fucshin Bào tử màu lục 2.3.2.3 Phương pháp xác định khả năng phân hủy protein Để xác định khả năng phân hủy protein chúng tôi tiến hành song song 2 phương pháp: Kiểm tra lượng NH3 sinh ra và khả năng tan chảy gelatine. Trang 31
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền  Xác định khả năng tạo thành NH3 Nguyên tắc: NH3 là sản phẩm quá trình phân hủy protein. Để xác định khả năng tạo thành 0 NH3 vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường NB ở 37 C trong 24 giờ. Kết quả được ghi nhận dựa trên phản ứng màu đặc trưng của NH3 sinh ra trong quá trình phân giải protein với thuốc thử Nessler. Độ màu phụ thuộc hàm lượng NH3 sinh ra và có dãy biến thiên màu từ vàng đến vàng nâu sậm. Cách tiến hành: - Cấy 1ml dịch tăng sinh sau 24 giờ vào ống nghiệm chứa môi trường NB, ủ 370C trong 24 giờ - Nhỏ 1 giọt thuốc thử Nessler vào 1ml dịch tăng sinh - Nếu xuất hiện kết tủa màu vàng nâu là phản ứng dương tính - Ghi nhận độ màu của phản ứng  Thử nghiệm gelatine Nguyên tắc: Một số vi sinh vật có thể tổng hợp được nhóm enzyme protease ngoại bào có khả năng xúc tác sự thủy phân của gelatine thành polypeptide và axit amin. Để nhận biết khả năng phân hủy gelatine của vi sinh vật, cơ chất này được bổ sung vào môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật có khả năng phân giải protein sẽ làm tan chảy môi trường trong ống thạch sâu. Cách tiến hành: Chuẩn bị môi trường NG có chứa 5% gelatine trong các ống nghiệm, tiến hành cấy một lượng sinh khối vi khuẩn phân lập được vào các ống trên đem ủ 370C trong 48 giờ. Trước khi quan sát cho mẫu vào tủ lạnh 40C trong 30 phút. Nếu vi khuẩn phân giải gelatine thì gelatine bị phân hủy này dù ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ 200C vẫn không đông. Thực hiện ủ song song một ống môi trường đối chứng không được cấy vi sinh vật. Trang 32
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Đọc kết quả: trong ống thạch sâu, thử nghiệm là dương khi môi trường bị tan chảy, thử nghiệm là âm tính khi môi trường vẫn đông đặc. 2.3.2.4 Phương pháp xác định các đặc điểm sinh hóa Bảng 2.2: Các thử nghiệm sinh hóa xác định vi sinh vật Thử STT Môi trường Thuốc thử Kết quả (+) Kết quả (-) nghiệm Vi khuẩn mọc NA 0,5% Vi khuẩn chỉ mọc 1 Di động - lan rộng quanh agar theo vết cấy vết cấy 2 Catalase NA 2 % agar H2O2 Có sủi bọt Không sủi bọt Sunfanilamide 0,2% và Môi trường có Môi trường không 3 Nitrate Nitrat broth Nnapthylenedi- hồng đổi màu amin hydro- chloride Bề mặt môi Bề mặt môi Canh Tryp- 4 Indol Kovac’s trường xuất trường xuất hiện ton hiện vòng đỏ vòng vàng Môi trường có Môi trường có 5 Urease Urea broth - màu đỏ hồng màu tím Voges- MR - PV KOH, - naph- Môi trường có Môi trường có 6 proskauer broth tol màu đỏ màu đồng Simmon Môi trường có Môi trường có 7 Citrate - citrate agar màu xanh lam màu xanh lục Môi trường có Môi trường không 8 Manitol - - màu vàng đổi màu Có vòng sáng Không có vòng 9 Tinh bột NT Lugol xung quanh sang xung quanh Trang 33
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền vết cấy vết cấy Dựa vào cơ sở định danh chi Bacillus của Bergey ( Phụ lục 1), chúng tôi tiến hành thực hiện các phản ứng sinh hóa được trình bày ở bảng 2.2 2.3.3 Phương pháp xác định hoạt độ phân giải protease và mật độ tế bào  Xác định hoạt độ phân giải protease theo phương pháp Amano Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất casein bởi enzyme. Sau đó bất hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng acid tricloaxetic. Định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, kết quả phân tích dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine. Đơn vị hoạt độ protease là lượng enzyme trong 1 phút ở 370C chuyển hóa được một lượng casein tương đương với một micromol tyrosine . Cách tiến hành - Chuẩn bị dung dịch casein 1%  Lập đường chuẩn tyrozine - Dung dịch tyrozine tiêu chuẩn: Cân chính xác 10 mg tyrozine tinh khiết hòa tan trong một ít dung dịch HCl 0,1M cho vào bình định mức 100ml và thêm dung dịch HCl 0,1M vào cho tới vạch. Sau đó pha thành các nồng độ sau Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Nồng độ tyrozine (µmol/ml) 0 10 20 30 40 50 Dung dịch tyrozine (ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 HCl 0,1M (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Dung dịch Na2CO3 0,4M (ml) 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử folin (ml) 1 1 1 1 1 1 Trang 34
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Song song thao tác trên, tiến hành ống đối chứng nhưng thay dung dịch tyrozine bằng 1ml HCl 0,1M và thao tác làm tương tự. Sau đó lập đường chuẩn tyrozine với trục hoành là µmol tyrozine , trục tung là giá trị OD  Xác định hoạt độ phân giải protease Cách tiến hành: Hoạt độ phân giải của enzyme được khảo sát ở 370C và pH=7 Cho 1ml cơ chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ 370C trong 10-15 phút. Sau thời gian ủ cho 1ml dịch enzyem đã ly tâm vào lắc đều. Đem ủ hổn hợp này ở 370C trong 60 phút. Sau đó cho vào 2ml dung dịch tricloaxetic 0,4M để ngừng phản ứng. Để ổn định 25 phút và lọc để loại tủa. Cho 5ml Na2CO3 vào 1ml dịch lọc, thêm 1ml folin, lắc đều và để yên ở 370C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh đem đo ở bước sóng 660nm. Mẫu đối chứng: lấy 1ml nước cất thay cho 1ml enzyme và tiến hành các bước tương tự. Tính toán kết quả Một đơn vị hoạt tính enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra lượng amino axit tương ứng với 100µg tyrosine trong 1ml dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm Trong đó Am: giá trị đo OD của mẫu A0: giá trị đo OD của đối chứng F: Hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosine và độ hấp thụ ở bước sóng 660 N: hệ số pha loãng Trang 35
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền 1/100 hệ số chuyển đổi  Xác định mật độ tế bào Nguyên tắc: Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc tạo thành bởi các vi khuẩn sống trong điều kiện sinh trưởng thuận lợi . Sinh khối vi khuẩn sau ly tâm được pha loãng vào một thể tích nhất định sau đó cấy trang lên môi trường thạch trong đĩa petri và đếm số khuẩn lạc trên đĩa. Cách tiến hành:  Bước 1: Pha loãng mẫu Sinh khối sau ly tâm ở 72 giờ được pha pha loãng thành các nồng độ 10-1 10-2, , 10-6 theo sơ đồ. 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Ống sinh khối 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml ban đầu và 9ml nước muối pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6  Bước 2: Trải đĩa Từ dung dịch pha loãng ở trên ta hút 0,1 ml ở nồng độ pha loãng cần thiết cho vào các đĩa có chứa sẵn môi trường nuôi cấy, dùng que trang trang cho đến khi khô mặt thạch. Sau đó đem ủ các đĩa ở 370C trong 24 giờ. Mỗi độ pha loãng lặp lại 2 lần.  Bước 3: Đếm các khuẩn lạc thuần khiết trên mỗi đĩa. Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu được tính từ số khuẩn lạc đếm được của mỗi độ pha loãng. Trang 36
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Trong đó: Ai : là số khuẩn lạc trung bình trên đĩa Di : là độ pha loãng V : là thể tích cho vào mỗi đĩa (ml) Mật độ tế bào trung bình MI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau. [10], 2.3.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme protease Môi trường dịch tăng sinh được điều chỉnh pH nuôi cấy ở pH 3, pH 5, pH 7, pH 9 bằng dung dịch NaOH 1M hoặc HCl 1M. Sau đó cấy 1ml dịch vi khuẩn vào mỗi ống nghiệm tương ứng với khoảng pH đã nêu, ủ 24 giờ ở 370C. Tiến hành ly tâm thu dịch enzyme để xác định hoạt tính Môi trường NB pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 24h, 370C Ly tâm thu dịch trong Xác định hoạt độ Hình 2.3: Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease 2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme protease Vi khuẩn được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ bình thường (370C), sau 24 giờ nuôi cấy đem ly tâm thu dịch trong. Sau đó xác định hoạt độ enzyme bằng cách cho enzyme xúc tác với cơ chất ở các nhiệt độ khác nhau là 300C, 370C, 400C, 500C, Trang 37
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền 600C, trong cùng một pH (pH tối ưu xác định ở thí nghiệm trên). Ở nhiệt độ nào hoạt độ của enzyme cao nhất thì đó là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme . ChChủngủng vi vikhu khuẩn ẩn Tăng sinh trên môi trường NB Tăng sinh trêntrên môi trường NA ủ 24h, 370C LyD tâmịch thuenzyme dịch enzyme protease T=30 T=37 T=40 T=50 T=60 Xác định hoạt độ Hình 2.4: Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease Căn cứ vào kết quả xác định hoạt độ của các chủng sau 24 giờ nuôi cấy để xác định khoảng pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt độ enzyme protease cao nhất. Trang 38
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Trang 39
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải protein 3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường NA Phân lập là quá trình tách riêng vi sinh vật từ mẫu hoặc từ quần thể ban đầu để thu nhận giống ở dạng thuần khiết. Tùy vào mục đích và đối tượng phân lập mà cần các loại môi trường khác nhau. Do đó việc lựa chọn môi trường phân lập đóng vai trò rất quan trọng quyết định hiệu quả phân lập. Môi trường NA là môi trường đặc trưng chỉ chứa protein là nguồn cacbon và năng lượng duy nhất chỉ những vi sinh vật có hệ enzyme protease có khả năng phân hủy protein mới có thể phát triển trên môi trường này. Nhiều vi khuẩn có hệ enzyme protease phong phú và có khả năng thích nghi cao phần lớn đều thuộc chi Bacillus. Mặt khác các vi khuẩn này có nhiều ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực xử lý nước thải và cho hiệu quả xử lý rất cao. Do đó trong quá trình phân lập chúng tôi tập trung vào các loài thuộc chi này. Dựa vào hệ thống phân loại của Bergey(1989), đặc trưng đầu tiên của Bacillus là trực khuẩn, gram dương, sinh bào tử. Vì thế trước khi phân lập, các mẫu nước thải đều được đun 800C trong 15-30 phút để diệt các tế bào sinh dưỡng. Sau khi đun, mẫu được cấy trên môi trường NA bằng phương pháp cấy trang. Căn cứ vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc, đã chọn lựa được 30 chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường chứa protein là nguồn cacbon duy nhất. Hầu hết các khuẩn lạc đều có hình dạng và kích thước khác nhau. Để có cơ sở tuyển chọn chúng tôi tiến hành xác định các đặc điểm hình thái của chúng. 3.1.2 Kết quả xác định các đặc điểm hình thái  Kết quả nhuộm gram Trang 40
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Mục đích phân lập là tập trung vào các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein, mà trong đó chiếm ưu thế là chủng Bacillus. Bacillus là trực khuẩn, gram dương, có bào tử, có vài loài gram âm nhưng không đóng vai trò quan trọng. Vì vậy, dựa vào các đặc điểm hình thái này có thể loại bỏ các chủng vi khuẩn mà hình thái của chúng khác với hình thái của chủng Bacillus bằng phương pháp nhuộm gram. Bảng 3.1: Kết quả nhuộm gram của các chủng vi khuẩn Hình thái Kết quả Kết quả Hình thái M1 M6 Vi khuẩn hình Vi khuẩn hình que, dài thon, que, thon, ngắn xếp chuỗi M2 M7 Vi khuẩn hình Vi khuẩn hình que, tế bào que ngắn, nhỏ V1 M3 Vi khuẩn hình Vi khuẩn hình que, xếp chuỗi que, tế bào nhỏ đơn xếp chuỗi Trang 41
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền M4 V2 Vi khuẩn hình Vi khuẩn hình que que, ngắn Vi khuẩn hình Vi khuẩn hình que,tế bào dài, que, xếp chuỗi thon M5 V3 Dựa vào hình thái quan sát được dưới kính hiển vi chúng tôi chọn được 10 chủng vi khuẩn, 7 chủng phân lập từ nước thải thủy sản được ký hiệu M1 đến M7 và 3 chủng phân lập từ nước thải chế biến thịt được ký hiệu V1 đến V3. Kết quả nhuộm gram được trình bày ở bảng 3.1  Kết quả nhuộm bào tử Sự hình thành bào tử là hình thức đổi mới tế bào khi vi khuẩn sống trong môi trường bất lợi không phù hợp cho việc sinh trưởng, phát triển bình thường của chúng. Một số vi khuẩn như Bacillus và Clostridium có khả năng tạo thành bào tử và chúng tồn tại trong môi trường thiếu dinh dưỡng, nhiệt độ cao. Vì vậy, việc đun mẫu nước thải trước khi tiến hành phân lập cùng với việc nhuộm bào tử, nhằm khẳng định chắc chắn những chủng vi khuẩn phân lập được đều sinh bào tử giống với đặc điểm của chủng Bacillus. Tiến hành nhuộm bào tử đối với 10 chủng trực khuẩn gram dương phân lập được và kết quả là cả 10 chủng vi khuẩn đều sinh bào tử. Như vậy bước đầu cả 10 chủng chúng tôi phân lập được đều mang đặc điểm của Bacillus. Trang 42
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Hình 3.1: Kết quả nhuộm bào tử của chủng M1 3.1.3 Kết quả xác định khả năng phân hủy protein  Khả năng tạo thành NH3 Các vi khuẩn phân giải chất hữu cơ có chứa nitơ có khả năng tiết enzyme protease phân giải protein vào môi trường, thủy phân protein thành các amino axit. Khi đó, vi khuẩn sử dụng các amino axit này trong quá trình dị hóa và đồng hóa. Các sản phẩm đặc trưng của quá trình phân giải protein là NH3 và H2S. Dựa trên những phản ứng màu, phản ứng kết tủa của NH3 trong quá trình phân giải protein với thuốc thử Nessler để xác nhận sự có mặt của NH3 trong các quá trình này. Màu sắc tạo thành tùy thuộc lượng NH3 có trong mẫu thử, NH3 càng nhiều tủa tạo thành có màu càng đậm dần. [3],[4] - Màu vàng nhạt – ít NH3 (+) - Màu vàng sậm – nhiều NH3 (+ +) - Màu nâu – rất nhiều NH3(+ + + ) Sau 24 giờ nuôi cấy, cả 10 chủng vi khuẩn đều cho phản ứng màu dương tính với thuốc thử Nessler, trong đó chủng M5, V2, V3 có màu nâu sậm hơn cả, chủng M1 có màu vàng nhạt so với các chủng còn lại được thể hiện ở hình 3.2 Hình 3.2: Khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ của các chủng vi khuẩn Trang 43
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền thứ tự từ trái đến phải M1-V3 Phản ứng với Phản ứng với Chủng Chủng thuốc thử Nessler thuốc thử Nessler M1 + M6 + + M2 + + M7 + + M3 + + V1 + + M4 + + V2 + + + M5 + + + V3 + + +  Khả năng phân hủy gelatine Gelatine là một dạng protein có kích thước phân tử lớn, vi sinh vật muốn sử dụng các protein này như một nguồn cung cấp năng lượng hay vật liệu xây tổng hợp các thành phần khác của tế bào, chúng phải có khả năng tổng hợp enzyme protease ngoại bào. Dựa vào đặc điểm này chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng tan chảy gelatine trong môi trường thạch sâu đối với 10 chủng vi khuẩn phân lập được. Kết quả thử nghiệm tất cả 10 chủng vi khuẩn phân lập được đều làm tan chảy gelatin sau 24giờ nuôi cấy. [3] Hình 3.3: Kết quả thử nghiệm gelatine của 10 chủng vi khuẩn 3.1.4 Kết quả xác định các đặc điểm sinh hóa và bước đầu định danh Bảng 3.2: Kết quả thử nghiệm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Thử Ký hiệu chủng vi khuẩn Trang 44
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền nghiệm M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 V1 V2 V3 Di động + + + + + + + + + + Catalase + + + + + + + + + + VP - - - - + + + + + + Indol - - - - - - - - - - Urease - - - - - - - - - - S.citrate + - - + + - + + - + Nitrate + + + + - - + + + + Tinh bột - - + + - - + + + + Manitol - - - + - - - + + + NaCl 7% - - - - - + + - - + Để có cơ sở bước đầu định danh 10 chủng vi khuẩn này, chúng tôi tiến hành một số thí nghiệm sinh hóa kết quả được trình bày ở bảng 3.2. Các kết quả thử nghiệm sinh hóa được mô tả bằng hình ảnh ở hình 3.4 A: Thử nhiệm Indol B : Thử nghiệm ure C: Thử nghiệm S.citrate D: Thử nghiệm VP Trang 45
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền E: Thử nghiệm Nitrate F: Thử nghiệm Manitol Hình 3.4: Kết quả một số thử nghiệm sinh hóa của 10 chủng Dựa trên kết quả phân tích các đặc điểm hình thái và phản ứng sinh hóa có được chúng tôi tiến hành so sánh với hệ thống phân loại của Bergey và bước đầu định danh các chủng vi khuẩn như sau: [3], [4], [9]. Theo hình thái quan sát dưới kính hiển vi chúng tôi phân làm 2 nhóm Nhóm І: Các vi khuẩn có bào tử không phồng lên rõ rệt bao gồm chủng M2, M4, M6, M7, V1, V3 Căn cứ vào kết quả sinh hóa chủng M2 khi quan sát dưới kính hiển vi có đường kính thể sinh dưỡng nhỏ hơn 0,9µm, có khả năng phân hủy gelatine mạnh. Mặt khác khi tiến hành nuôi cấy trong môi trường có chứa NaCl tăng dần chúng không phát triển ở nồng độ muối 7%. Do đó chúng tôi dự đoán đây là chủng Bacillus badius. Chủng M4 có đường kính thể sinh dưỡng lớn hơn 0,9µm, có khả năng sinh manitol, đồng thời có hệ enzyme phân hủy tinh bột nên đây có thể là chủng Bacillus megaterium. Chủng M6 có đường kính thể sinh dưỡng nhỏ hơn 0,9µm. Chúng có thể tồn tại trong môi trường chứa NaCl 7% nhưng chủng vi khuẩn này không có hệ enzyme thủy phân tinh bột đồng thời không tạo thành nitrite từ nitrate, căn cứ vào đặc điểm trên chúng tôi dự đoán đây là chủng Bacillus pumilus. Tương tự chủng M7, V3 cũng có đường kính thể sinh dưỡng nhỏ hơn 0,9µm, chúng có hệ enzyme thủy phân tinh bột và quan trọng là chúng phát triển được trên môi trường chứa 7% NaCl, có khả năng tạo thành nitrite từ nitrate. Từ những thông Trang 46
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền tin trên chúng tôi chỉ có thể dự đoán đây là Bacillus licheniformis nếu chúng phát triển được ở điều kiện kỵ khí có pH 5,2 và tạo thành khí từ nitrate. Ngược lại là chủng Bacillus subtilis. Vì thí nghiệm vừa nêu chúng tôi không có điều kiện thực hiện nên không có cơ sở xác định. Cuối cùng ở nhóm này thì chủng V1 cũng có đường kính thể sinh dưỡng nhỏ hơn 0,9µm, chúng không có khả năng phát triển trên môi trường chứa 7% NaCl,và khả năng phân hủy gelatine yếu nên chúng tôi nhận định đây là chủng Bacillus coagulans Nhóm ІІ: Các vi khuẩn có bào tử phồng lên rõ rệt bao gồm chủng M1, M3, M5, V2 Đầu tiên chủng M1 không có khả năng thủy phân tinh bột nhưng chúng có thể tạo thành nitrite từ nitrate, có phản ứng dương tính với thí nghiệm catalase. Từ các đặc điểm trên có thể nhận định dây là chủng Bacillus pasteurri. Chủng M3 có hệ enzyme thủy phân tinh bột nhưng không tạo thành indol. Chúng tôi cho rằng đây là chủng Bacillus stearothermophilus nếu chủng này phát triển được ở 650C và là chủng Bacillus circulans khi không phát triển được ở 650C. Chủng M5 có tế bào phồng lên rõ rệt nhưng chúng không có khả năng phân hủy tinh bột, đồng thời không phát triển được trên môi trường chứa 10% NaCl , do đó dự đoán đây là chủng Bacillus sphaericus. Cuối cùng thì chủng V2 có đặc điểm gần giống các chủng khác cũng có khả năng phân hủy tinh bột có sinh manitol dự đoán đây là chủng Bacillus polymyxa. Như vậy bước đầu có thể xác định 10 chủng phân lập được là các loài Bacillus được tóm tắt ở bảng 3.3 Bảng 3.3: Kết quả dự đoán các loài Bacillus phân lập được Ghi chú Chủng Kết quả dự đoán (thí nghiệm cần thực hiện thêm) M1 B. pasteurii M2 B. badius M3 B.stearothermophilus Nuôi ủ ở 650C ( phát triển ) Trang 47
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền B. circulans Nuôi ủ ở 650C (không phát triển) M4 B. megaterium M5 B. sphaericus M6 B. pumilus B. licheniformis Nuôi ủ ở điều kiện kỵ khí, pH<5,2 ( phát triển) M7 B. subtilis Nuôi ủ điều kiện kỵ khí, pH<5,2 (không phát triển) V1 B. coagulans V2 B. polymyxa B. licheniformis Nuôi ủ ở điều kiện kỵ khí, pH<5,2 ( phát triển) V3 B. subtilis Nuôi ủ điều kiện kỵ khí, pH<5,2 (không phát triển) 3.2 Kết quả xác định hoạt độ phân giải protease và mật độ tế bào  Hoạt độ phân giải protease Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học khác nhau. Mỗi enzyme xúc tác cho một phản ứng nhất định, hoạt độ xúc tác của enzyme càng mạnh lượng cơ chất bị chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm phản ứng được tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. Vì vậy việc xác định hoạt độ phân giải của enzyme protease nhằm định lượng hoạt tính enzyme của các chủng phân lập được. Dịch nuôi cấy 10 chủng sau 24, 48, 72, 96 giờ sẽ được ly trích loại bỏ sinh khối tế bào và xác định hoạt độ phân giải bằng phương pháp Amano. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4 [7], [9]. Bảng 3.4: Hoạt độ phân giải protease của 10 chủng vi khuẩn Chủng Hoạt tính enzyme (U/ml) STT vi khuẩn 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 1 M1 0,67 0,69 0,78 0,70 2 M2 0,79 0,82 0,85 0,76 3 M3 0,62 0,65 0,7 0,67 4 M4 0,73 0,76 0,82 0,77 Trang 48
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền 5 M5 0,8 0,82 0,9 0,84 6 M6 0,67 0,69 0,75 0,65 7 M7 0,76 0,79 0,83 0,74 8 V1 0,62 0,67 0,78 0,7 9 V2 0,75 0,79 0,85 0,75 10 V3 0,77 0,8 0,87 0,73 Theo kết quả bảng 3.4 cho thấy tất cả 10 chủng vi khuẩn phân lập được đều có hoạt độ phân giải protease tăng dần theo thời gian nuôi cấy và cho kết quả cao nhất là ở 72 giờ. Vượt quá thời gian này hoạt độ enzyme sẽ giảm. Trong đó chủng M5 có hoạt độ phân giải mạnh nhất (0,9 U/ml) ngược lại thấp nhất là chủng M3 (0,7 U/ml). Tuy nhiên mức độ tăng hoạt độ protease giữa các chủng không giống nhau như chủng V1 có mức độ tăng cao nhất 20% từ 0,62 U/ml ở 24 giờ đến 0,78 U/ml sau 72 giờ, và chủng M2 có mức độ tăng thấp nhất 7% so với ở 24 giờ. Trang 49
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Trang 50
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Hình 3.5: Hoạt độ phân giải enzyme protease của 10 chủng  Xác định mật độ tế bào Việc xác định mật độ tế bào nhằm thiết lập mối tương quan giữa hoạt độ enzyme và số lượng tế bào có trong dịch nuôi cấy. Về mặt lý thuyết xác định mật độ tế bào phải tương ứng với từng thời gian đo hoạt tính, tuy nhiên vì điều kiện thời gian có hạn nên chúng tôi chỉ thực hiện xác định mật độ tế bào tại thời điểm có hoạt độ cao nhất là 72 giờ. Sinh khối sau ly tâm được pha loãng với nước muối sinh lý đến độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6, mỗi độ pha loãng được lặp lại 2 lần. Kết quả được trình bày ở hình 3.6.[9] Bảng 3.5: Kết quả xác định mật độ tế bào STT Chủng vi khuẩn Mật độ tế bào (cfu/ml) 1 M1 0,66x108 2 M2 0,93x108 3 M3 0,78x108 4 M4 3,9x108 5 M5 1,9x108 6 M6 1,3x108 7 M7 1,1x108 8 V1 3,1x108 9 V2 1,4x108 10 V3 1,7x108 Trang 51
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Hình 3.6: Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn Theo kết quả hình 3.6 cho thấy sau 72 giờ nuôi cấy mật độ tế bào đạt trung bình là 1,68x108 (cfu/ml). Trong đó thấp nhất là chủng M1(0,66x108 cfu/ml) và cao nhất là chủng M4 (3,9x108 cfu/ml). Đặc biệt là chủng V1 và M4 có số lượng tế bào vượt trội hơn 8 chủng còn lại. Khi vi sinh vật phát triển được trong môi trường thích hợp, quá trình phân hủy cơ chất và tổng hợp sản phẩm của tế bào diễn ra mạnh mẽ. Cùng với sự gia tăng số lượng, kích thước tế bào thì lượng enzyme tiết ra cho quá trình chuyển hóa cũng gia tăng. So sánh với kết quả hoạt tính enzyme, chúng tôi nhận thấy chủng có hoạt độ cao nhất là M5 (0,9 U/ml) và mật độ tế bào là 1,9x108 (cfu/ml). Còn chủng M4 có mật độ tế bào cao nhất nhưng hoạt tính enzyme chỉ đạt 0,82 (U/ml). Riêng chủng V1 hoạt độ chỉ đạt 0,78 (U/ml) nhưng mật độ tế bào lại khá cao (3,1x108 cfu/ml). Như vậy, các chủng có mật độ tế bào thấp nhưng hoạt độ enzyme cao chứng tỏ hệ enzyme protease mạnh, khả năng tổng hợp và sản xuất enzyme là tương đối cao, thích nghi với nguồn cơ chất trong môi trường. Các chủng có mật độ tế bào cao nhưng có hoạt tính enzyme thấp cần có các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo nhằm nâng cao khả năng phân hủy cơ chất của chúng. Mặt khác, để khảo sát mật độ tế bào có tăng sau các thời gian ủ và xác định thời điểm mật độ tế bào tối ưu thì phải Trang 52
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền tiến hành khảo sát mật độ tế bào ở 24, 48, 72, 96 giờ nuôi cấyđể có thêm cơ sở kết luận. 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme protease Enzyme rất nhạy với pH của môi trường. pH thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng enzyme. Mỗi enzyme thích hợp với một vùng pH nhất định. Do đó chúng tôi tiến hành xác định pH tối ưu cho hoạt độ phân giải protease ở các khoảng pH khác nhau cụ thể ở pH 3, pH 5, pH 7, pH 9. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.6 [7] Bảng 3.6: Kết quả ảnh hưởng của pH đến hoạt đô enzyme protease STT Chủng Hoạt tính enzyme (U/ml) vi khuẩn pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 1 M1 0,6 0,63 0,68 0,52 2 M2 0,65 0,67 0,82 0,69 3 M3 0,63 0,66 0,78 0,57 4 M4 0,7 0,77 0,82 0,69 5 M5 0,65 0,72 0,87 0,76 6 M6 0,65 0,72 0,79 0,66 7 M7 0,53 0,65 0,81 0,62 8 V1 0,52 0,69 0,73 0,54 9 V2 0,56 0,65 0,81 0,7 10 V3 0,69 0,72 0,83 0,75 Qua kết quả ở bảng 3.6 ta thấy pH tối ưu cho hoạt động của protease của hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập được là pH=7. Ở pH thấp hay cao hơn pH tối ưu, hoạt tính enzyme đều giảm.Ở pH tối ưu thì chủng M5 có hoạt độ protease mạnh nhất 0,87 U/ml và chủng M1 có hoạt độ phân giải protease yếu nhất 0,68 U/ml. Tuy nhiên tỷ lệ tăng hoặc giảm của từng chủng không giống nhau điển hình chủng Trang 53
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền M5 ở pH 9 có hoạt độ giảm 13% so với hoạt độ ở pH tối ưu. Riêng chủng V1 ở pH 9 hoạt độ protease giảm mạnh nhất 27% so với ở pH tối ưu. Trang 54
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Hình 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme protease Từ các kết quả phân tích trên cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập được có pH tối ưu khá thống nhất với kết quả của Vũ Ngọc Bội (2004) khi nghiên cứu quá trình thủy phân cá bằng Enzyme protease từ Bacillus subtilis có khoảng pH hoạt động thích hợp 5,5 -7,0. Mặt khác trong 10 chủng vi khuẩn chúng tôi phân lập được thì M7 và V3 có khả năng là Bacillus subtilis nên kết quả trên cũng phù hợp. Đối với nước thải thủy sản và thịt, pH đầu vào thường dao động trong khoảng 6,5-7,5. Nên các chủng vi khuẩn phân lập được có khoảng pH 7 sẽ thích hợp cho việc ứng dụng xử lý nước thải. Vì khi bổ sung các chủng vi sinh vật này vào các công trình xử lý nước thải chúng sẽ rút ngắn được thời gian thích nghi và phát triển nhanh dần dẫn đến hiệu quả xử lý sẽ cao. 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme Nhiệt độ là một yếu tố vật lý có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme, chúng liên quan đến khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất. Mỗi enzyme chỉ hoạt động trong một khoảng nhiệt độ nhất định, khoảng nhiệt độ này không làm Trang 55
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền cho protein bị biến tính, mất hoạt tính sinh học. Khi hoạt độ của enzyme đạt giá trị cao nhất thì nhiệt độ đạt giá trị tối ưu. Do đó chúng tôi tiến hành xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động protease từ 300C đến 600C ở cùng điều kiện pH tối ưu.[7] Bảng 3.7: Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme protease STT Chủng vi Hoạt tính enzyme (ĐVHT/ml) khuẩn 300C 370C 400C 500C 600C 1 M1 0,55 0,69 0,71 0,99 0,78 2 M2 0,7 0,82 0,95 1,13 0,8 3 M3 0,6 0,73 0,76 0,69 0,63 4 M4 0,68 0,79 0,82 0,95 0,78 5 M5 0,71 0,86 1,00 1,15 0,88 6 M6 0,64 0,79 0,85 0,92 0,61 7 M7 0,52 0,79 0,84 0,95 0,78 8 V1 0,52 0,73 0,87 0,76 0,69 9 V2 0,63 0,75 0,82 1,13 0,9 10 V3 0,81 0,82 0,96 1,01 0,7 Từ bảng 3.7 cho thấy enzyme protease hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 500C. Vượt quá nhiệt độ này hoạt độ enzyme giảm và đặc biệt giảm mạnh ở nhiệt độ cao hơn 500C do sự biến tính protein. Trong đó chủng M5 có hoạt độ phân giải protease mạnh nhất( 1,15 U/ml) và chủng M3 có hoạt độ protease thấp so với các chủng còn lại. Tuy vậy mức độ tăng giảm giữa các chủng không đồng đều nhau như ở 600C chủng V3 có hoạt độ protease giảm thấp nhất 14% so với hoạt độ pro- tease ở 500C nhưng chủng M2 lại giảm mạnh nhất 34% so với hoạt độ protease ở nhiệt độ tối ưu. Riêng chủng M3, V1 lại có hoạt độ protease cao nhất ở 400C. Điều này cũng hợp lý vì mỗi enzyme hoạt động ở một nhiệt độ nhất định. Trang 56
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Trang 57
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Hình 3.8: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme protease Từ kết quả phân tích trên cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập được có nhiệt độ tối ưu là 500C. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Đặng Văn Hợp (2000) về enzyme protease tách chiết từ Aspergillus oryzae A4 cũng hoạt động tốt nhất ở 500C. Tuy nhiên kết quả trên lại thấp hơn kết quả nghiên cứu của Vũ Ngọc Bội về enzyme protease từ Bacillus subtilis S5 có nhiệt đô hoạt động tối ưu là 550C.[1] Trang 58
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trang 59
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền 4.1 Kết luận - Từ mẫu nước thải của nhà máy thủy sản và chế biến thịt cá đã phân lập được 10 chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy protein. Dựa vào các kết quả nhuộm gram, bào tử và các đặc điểm sinh hóa bước đầu đã định danh được 10 chủng vi khuẩn phân lập thuộc chi Bacillus trên cơ sở hệ thống phân loại của Bergey. - Đã xác định được hoạt độ phân giải protease của các chủng vi khuẩn trên bằng phương pháp Amano thu được các chủng M2, M5, M4, V2, V3 có hoạt độ phân giải hơn các chủng còn lại. Hoạt độ phân giải protease của hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập được đều tăng theo thời gian nuôi cấy, kết quả cho cao nhất khi nuôi cấy trong 72 giờ - Tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease, cụ thể là khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ. Kết quả khảo sát cho thấy ở pH=7 các chủng vi khuẩn cho hoạt độ phân giải protease cao nhất, vượt quá nhiệt độ này hoạt độ phân giải giảm. Và nhiệt độ tối ưu cho hoạt độ phân giải protease là 500C. 4.2 Kiến nghị - Do thời gian tiến hành thí nghiệm có hạn nên đề tài chỉ mới dừng lại ở việc phân lập các chủng vi khuẩn trong điều kiện nuôi cấy tĩnh. Một số hướng tiếp theo mà đề tài có thể được nghiên cứu hoàn thiện hơn như: - Tiếp tục phân lập thêm các chủng vi sinh vật mới có khả năng phân hủy protein cao từ các nguồn nước thải khác như chế biến sữa, đường. - Tiếp tục thực hiện các thí nghiệm tiếp theo để định danh chính xác hơn 10 chủng vi khuẩn phân lập được và có cơ sở khoa học trong việc giải thích hoạt tính. - Cần nghiên cứu thêm ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt độ phân giải của enzyme để xác định điểu kiện tối ưu nhất cho việc nuôi cấy tạo chế phẩm . - Cần xác mật mật độ tế bào ở các thời điểm đo hoạt tính 24, 48, 72, 96 giờ nhằm xác định mối tương quan giữa mật độ tế bào và hoạt độ phân giải protease. Trang 60
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Vũ Ngọc Bội, Nghiên cứu quá trình thủy phân protease cá bằng enzyme protease từ Bacillus subtilis S5, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố HCM. [2]. Đỗ Hồng Lan Chi, Lâm Minh Triết, Vi sinh môi trường . Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [3]. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự ,(1976) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập ІІ . Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, 1976 [4]. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập ІІІ. Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, 1978 [5]. Trần Liên Hà, Đặng Ngọc Sâm “Phân lập và tuyển chọn Bacillus để xử lý nước hồ ô nhiễm” , Viện CNSH – CNTP, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội [6]. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Thị Thùy Dương,(2003), Công nghệ xử lý nước thải. Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. [7]. Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, (2004), Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ chí Minh. [8]. Lương Đức Phẩm, Công nghệ xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học. Nhà xuất bản Giáo dục. [9]. Nguyễn Đức Lượng, (2006), Thí nghiệm vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [10]. Trần Linh Thước và cộng sự, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm, mỹ phẩm. Nhà xuất bản Giáo dục [11]. S.Sharmin, Md Towhid Hossain and M.N. Anwar (2005), Isolation and characterization of a Protease Producing bacteria Bacillus amovivorus and Op- timization of Some Factors of culture Condition for Protease Production, Jomal of Biologycal Scences 5. [12]. Do Thi Bich Thuy, Tran Thi Xo, Production, purification and application of protease from Bacillus subtilis, Joumal of Agricultural Science and Technol- ogy Trang 61
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền PHỤ LỤC 1. Bảng hệ thống phân loại của Bergey (1989) Thể mang bào tử không phình lên rõ rệt. Bào tử hình elip, hình viên trụ tròn đầu. Bào tử có màng mỏng, gram dương. A Nguyên sinh chất của tế bào còn non khi phát triển trên thạch glucose có không bào nếu nhuộm nhạt. Đường kính của thể sinh dưỡng là 0,9µm hay lớn hơn. 1- Tạo thành acid từ manitol, không tạo thành acetylmethyl carbinol B.megaterium 2- Không tạo thành acid từ manitol, tạo thành acetylmethyl carbinol a- Hoại sinh một vài nòi gây bệnh nhẹ b- Khi phát triển trên thạch không có dạng rễ cây, thường di động B.cereus bb- Khi phát triển trên thạch có dạng rễ cây, thường không di động B.cereus var mycodes aa - Gây bệnh b- Gây bệnh than, không di động B.anthracsis bb- Gây bệnh ở một số côn trùng, thường di dộng B.thuringiensis B Nguyên sinh chất của tế bào còn non khi phát triển trên thạch glucose, không có dạng không bào nếu nhuộm nhạt. Đường kính của thể sinh dưỡng nhỏ hơn 0,9µm 1- Trên môi trường thạch glucose phát triển tốt hoặc tốt hơn trên môi trường thạch khô đậu tương. a- Phát triển được trên môi trường chứa 7% NaCl b- Thủy phân tinh bột tạo thành nitrite từ nitrate c- Trong môi trường canh thang glucose phát triển tốt trong điều kiện kỵ khí pH của dịch nuôi cấy 5,2 hay thấp hơn. Tạo thành khí từ nitrate dưới điều kiện kỵ khí, kiềm tính Trang 62
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền B.licheniformis cc- Mọc yếu nếu có trong canh thang glucose dưới điều kiện kỵ khí, pH của dịch nuôi cấy trên 5,2. Không tạo thành khí nitrate dưới điều kiện kỵ khí kiềm tính B.subtilis d- Tạo thành sắc tố đen chỉ trên môi trường chứa cacbohydrat B.subtili var.aterrimus dd- Tạo thành sắc tố đen chỉ trên môi trường chứa tyrosine B.subtili var .niger bb- Không thủy phân tinh bột, không tạo thành nitrite từ nitrate B.pumilus aa- Không phát triển trên môi trường chứa 7% NaCl b- Đồng hóa glucose. Nếu có thủy phân gelatine thì cũng yếu B.coagulans bb- Không đồng hóa glucose, thủy phân gelatine mạnh B.badius 2- Phát triển trên môi trường thạch glucose không tốt bằng trên môi trường thạch. Nếu có phát triển trên môi trường thạch khô đậu tương thì cũng yếu a- Thủy phân casein, không có men urease B.firmus aa- Không thủy phân casein, có men urease B.lentua Thể mang bào tử phình lên rõ rệt, bào tử hình elip, ít khi hình viên trụ, tròn ở đầu. Màng bào tử dày và dễ nhuộm màu.Gram thay đổi A- Tạo thành khí từ carbohydrate 1- Tạo thành acetylmethyl carbinol , không tạo thành dextrin tinh thể từ tinh bột B.polymyxa Trang 63
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền 2- Không tạo thành acetylmethyl carbinol, tạo thành dextrin tinh thể từ tinh bột B.macerans B- Không tạo thành khí từ carbohydrate 1- Hoại sinh, sinh trưởng trên môi trường thông thường a-Thủy phân tinh bột b-Tạo thành indol và acetyimethyl carbinol B.alvei bb- Không tạo thành indol và acetylmethyl carbinol c-Sinh trưởng ở 650C B.stearothermophilus cc- Không sinh trưởng ở 650C B.circulans aa- Không thủy phân tinh bột b- pH của dịch nuôi cấy trong canh thang glucose thấp hơn 8.0. Sinh trưởng trên môi trường glucose trong điều kiện kỵ khí c- Tạo thành indol, tạo thành acid từ glucose và manitol khi môi trường có muối amonium là nguồn nitơ B.laterosporus cc- Không tạo thành indol, không sinh trưởng trên môi trường chứa carbohydrat với nguồn nitơ là muối amonium B.pulvifacien bb- pH trên môi trường glucose là 8.0 hay cao hơn, không phát triển trên môi trường canh thang glucose trong điều kiện kỵ khí Bbrevis 2- Ký sinh, không phát triển trên môi trường thông thường a- Gây ra thối trứng ở ong mật B.larvae aa- Gây ra bệnh sữa ở cánh cứng Nhật Bản Typ A-21 B.popilliae Typ B-22 B.lenti Trang 64
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Thể mang bào tử phình lên rõ rệt, bào tử hình cầu hoặc gần với hình cầu, gram thay đổi A- Phát triển trên môi trường thông thường ở pH 6.0, không nhất thiết phát triển trên môi trường urea hoặc kiềm tính 1- Thủy phân tinh bột, phát triển trên môi trường chứa 10% NaCl B.pantothenticus 2- Không thủy phân tinh bột, không phát triển trên môi trướng chứa 10% NaCl B.sphaericus B- Không phát triển trong môi trường thông thường ở pH 6.0, nhất thiết phát triển ở môi trường urea hay kiềm tính B.pasteurii 2. Các môi trường sử dụng trong quá trình phân lập vi khuẩn * Môi trường dinh dưỡng có nguồn protein (NA) : Peptone : 1g Meat extract : 0.3g NaCl : 0.5g Nước cất : 100ml Agar : 2% * Môi trường dinh dưỡng (NB) : Peptone : 1g Cao thịt : 0.3g NaCl : 0.5g Nước cất : 100ml * Môi trường dinh dưỡng bổ sung gelatine (NG) Gelatin : 5g Pepton : 0.5g Nước cất :100ml Trang 65
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Môi trường dinh dưỡng bổ sung 1% tinh bột (NT) Tinh bột : 1g Pepton : 0.5g NaCl : 0.5g Nước cất : 100ml 3. Xác định hình thái khuẩn lạc  Nhuộm Gram * Nguyên tắc : Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iôt mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau. + Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram dương. + Loại phức chất thứ hai không còn giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram âm. * Tiến hành : Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến - Tạo vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24h) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính. - Cố định vết bôi: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. - Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. - Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. - Nhỏ cồn 96o, giữ khoảng 30 giây, rửa nước, thấm khô. - Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fucshin trong 30 giây, rửa nước, thấm khô. - Soi kính: 100x với dầu soi kính. Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ.  Nhuộm bào tử * Nguyên tắc : Trang 66
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Sự hình thành bào tử là một hình thức đổi mới tế bào khi gặp những điều kiện không thuận lợi trong chu trình sống. Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử : dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit. Trước hết xử lý để tế bào chất của bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất tế bào đi và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất của tế bào bắt màu phân biệt. * Tiến hành : Sử dụng phương pháp Schaeffer-Fulton - Tạo vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24h) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính. - Cố định vết bôi: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. - Nhuộm bằng dung dịch lục Malachite trong 10 phút, rửa nước, thấm khô - Nhuộm lại bằng dung dịch Fucshin trong 30 giây, rửa nước, thấm khô. - Soi kính: 100x với dầu soi kính. Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ. 4. Các thử nghiệm sinh hóa đối với các chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein  Thử nghiệm catalase * Nguyên tắc : Enzyme catalase chỉ hiện diện ở các tế bào vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp hiếu khí. Catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ của phân tử có độc tính cao này trong tế bào. Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí. * Tiến hành : - Nhỏ trực tiếp H2O2 3-10% lên khuẩn lạc trên thạch đĩa Kết quả (+) : hiện tượng sủi bọt Kết quả (–) : không sủi bọt  Thử nghiệm khả năng di động Trang 67
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền * Nguyên tắc : Vi sinh vật di động nhờ cấu trúc protein gọi là tiên mao. Khả năng di động có thể được quan sát dựa vào sự tăng trưởng và di động của vi sinh vật vào bên trong môi trường thạch mềm. * Tiến hành : - Sử dụng môi trường NA 0,5 % agar - Cấy đâm sâu vi khuẩn vào môi trường thạch bán lỏng, ủ 37oC 1-3 ngày. Kết quả (+) : Vi khuẩn mọc lan rộng quanh vết cấy. Kết quả (–) : Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy.  Thử nghiệm citrate * Nguyên tắc : Một số vi sinh vật sử dụng nguồn citrate như là nguồn cacbon duy nhất để thu lấy năng lượng và vật chất. Vi sinh vật sử dụng citrate sinh ra CO2 làm kiềm hóa môi trường, vi sinh vật sử dụng muối ammonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa môi trường. Sự tăng giá trị pH được biểu thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường * Tiến hành : - Cấy ria vi khuẩn vào môi trường thạch nghiêng Simmon citrate agar, ủ 37oC 24 – 48h. Kết quả (+) : môi trường chuyển sang màu xanh dương Kết quả (–) : môi trường chuyển giữ nguyên màu xanh lục  Thử nghiệm khả năng sinh indol * Nguyên tắc : Tryptophan là một axit amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật có hệ emzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng giữa phân từ này với thuốc thử chứa p- dimethylaminobenzaldehyde (p-DMAB). Nhân pyrol của indol chứa nhóm –CH2 sẽ kết hợp với nhân benzen của p-DMAB tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ. Trang 68
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền * Tiến hành : - Cấy sinh khối vi khuẩn vào môi trường canh trypton, ủ 37oC 24 – 48h - Trước khi quan sát nhỏ 1ml ether lắc đều, sau đó nhỏ 5 giọt thuốc thử Kovacs. Kết quả (+) : xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt. Kết quả (–) : xuất hiện lớp màu vàng trên bề mặt.  Thử nghiệm urease * Nguyên tắc : Một số vi sinh vật tổng hợp enzyme urease xúc tác sự thủy phân urea giải phóng NH3 và CO2. Sự phóng thích NH3 và CO2 làm tăng pH môi trường, được theo dõi qua sự đổi màu của chất chỉ thị pH. * Tiến hành : - Cấy sinh khối vi khuẩn vào môi trường lỏng Urea Broth, ủ 37oC 48h Kết quả (+) : môi trường màu đỏ tím Kết quả (–) : môi trường không đổi màu  Thử nghiệm Voges – Proskauer * Nguyên tắc : Thử nghiệm này nhằm xác định aceton một sản phẩm trung tính trong quá trình lên men glucose, là tiền chất của 2,3-butanediol, vì là tiền chất nên quá trình nuôi cấy tích lũy rất ít, để dễ dàng phát hiện quá trình nuôi cấy thử nghiệm được tiến hành trong điều kiện hiếu khí, sau đó phát hiện aceton trong môi trường bằng thuốc thử α-naphtol trong môi trường kiềm mạnh được tạo ra bằng KOH 40%. * Tiến hành : - Cấy sinh khối vi khuẩn vào môi trường lỏng MR-VP broth, ủ 37oC 24 – 48h - Bổ sung 6 giọi α-napthol và 2 giọt KOH 40% vào môi trường, lắc nhẹ Kết quả (+) : môi trường màu đỏ Kết quả (–) : môi trường màu đồng  Thử nghiệm Nitrate * Nguyên tắc : Trang 69
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Vi sinh vật có khả năng khử nitrate tổng hợp hệ enzyme nitratase xúc tác sự khử nitrate thành nitrite và nitơ phân tử. Hầu hết các vi sinh vật hiếu khí sử dụng nitrate được là các vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, chỉ thực hiện quá trình khử nitrate trong điều kiện không có oxy phân tử. Hoạt tính nitratase được định tính dựa trên sự tạo thành nitrite và sự cạn kiệt nitrate. Nitrite tạo từ nitrate sẽ phản ứng thuốc thử Diphenylamin. * Tiến hành : - Cấy sinh khối vi khuẩn vào môi trường lỏng Nitrat broth, ủ 37oC 24 – 48h - Bổ sung vài giọt thuốc thử Sunfanilamide 0,2% và Nnapthyenediamin hydroclorit. Kết quả (+) : môi trường màu hồng. Kết quả (–) : môi trường không đổi màu. 5. Kết quả dựng đường chuẩn tyrosin và mật độ tế bào  Đường chuẩn tyrosine Trang 70
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền  Kết quả đếm mật độ tế bào ở 72 giờ Mật đô tế bào Mật độ tế bào Chủng Lặp lại Chủng Lặp lại 10-4 10-5 10-6 10-4 10-5 10-6 1 125 211 83 1 192 180 100 M1 M6 2 207 192 60 2 187 170 120 1 58 59 60 1 200 100 100 M2 M7 2 60 95 55 2 198 208 81 1 212 180 150 1 298 200 180 M3 V1 2 200 198 98 2 270 220 150 1 398 350 320 1 67 60 47 M4 V2 2 390 393 380 2 76 54 59 1 269 235 205 1 395 270 100 M5 V3 2 264 248 115 2 310 262 180 Trang 71