›

Đồ án Sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu

pdf 66 trang thiennha21 13/04/2022 3070
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_san_xuat_che_pham_nam_paecilomyces_lilacinus_phong_tru.pdf

Nội dung text: Đồ án Sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SẢN XUẤT CHẾ PHẨM NẤM PAECILOMYCES LILACINUS PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG MELOIDOGYNE SP. GÂY HẠI TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Ts. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện : Đinh Thành Hiếu MSSV: 1311100296 Lớp: 13DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân em dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai – giảng viên Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Đề tài được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Tất cả các số liệu, hình ảnh, các kết quả là nghiên cứu hoàn toàn trung thực. Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu có phát hiện sự gian lận em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Tp. HCM, ngày 26 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Đinh Thành Hiếu i
  3. LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập tại trường đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường. Và đặc biệt, trong học kỳ này. Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của các thầy cô thì em nghĩ bài thu hoạch này của em rất khó có thể hoàn thiện được. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy. Bài báo cáo đồ án tốt nghiệp thực hiện trong khoảng thời gian 3 tháng. Bước đầu đi vào thực tế của em còn hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ. Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô và các bạn học cùng lớp để kiến thức của em trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn. Em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các thầy cô của trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM, đặc biệt là TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường đã tạo điều kiện cho em để em có thể hoàn thành tốt bài báo cáo đồ án tốt nghiệp này. Và em cũng xin chân thành cám ơn các thầy cô ở phòng thí nghiệm, các anh chị, các bạn đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành báo cáo đồ án tốt nghiệp. Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, cũng như là trong quá trình làm bài báo cáo, khó tránh khỏi sai sót đồng thời do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của Thầy/Cô để em học thêm được nhiều kinh nghiệm và áp dụng vào công việc sắp tới. Em xin chân thành cảm ơn ! ii
  4. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1.Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces 4 1.1.1. Phân loại khoa học 4 1.1.2. Đặc điểm sinh thái 5 1.1.3. Các nghiên cứu về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces lilacinus trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng 7 1.1.4. Nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự sản xuất và bảo quản chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 10 1.2.Tổng quan về tuyến trùng 11 1.2.1. Đặc điểm sinh thái 12 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu 19 2.2.Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu 19 2.2.1. Thiết bị - hóa chất 19 2.2.1.1. Thiết bị 19 2.2.1.2. Hóa chất 19 2.2.2. Vật liệu nghiên cứu: 24 2.3.Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1. Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse lilacinus. 24 2.3.2. Quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005) 24 2.3.3. Hoàn thiện quy trình nhân nuôi sản xuất chế phẩm từ nấm Paecilomyces lilacinus 26 2.3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu của cơ chất đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus 26 iii
  5. 2.3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của chất mang đến thời gian tồn trữ chế phẩm 27 2.3.4. Khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne sp của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus trong điều kiện phòng thí nghiệm 28 2.3.4.1. Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) 28 2.3.4.2. Phương pháp khảo sát khả năng ký sinh của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 28 2.3.5. Đánh giá hiệu quả phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. hại cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus ở phạm vi đồng ruộng 29 2.3.5.1. Điều tra mức độ tuyến trùng gây hại cây hồ tiêu 29 2.3.5.2. Đánh giá hiệu lực phòng tuyến trùng Meloidogyne sp. hại cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 29 2.4.Phương pháp xử lý số liệu 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1.Đặc điểm hình thái của các chủng nấm P1 phân lập được 35 3.2.Khảo sát sự ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất đến mực độ bào tử nấm Paecilomyces lilacinus trong quá trình nhân nuôi 36 3.3. Kết quả mật độ chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus khi bảo quản với các chất mang 38 3.4. Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus. 40 3.4.1. Trong điều kiện phòng thí nghiệm 41 3.5. Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus ngoài đồng ruộng 44 3.5.1. Mật số tuyến trùng trong đất 44 3.5.2. Mức độ bị hại và sự phát triển của cây hồ tiêu sau khi xử lý nấm 46 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1.Kết luận 51 4.2.Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 iv
  6. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 52 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 52 TÀI LIỆU INTERNET 53 v
  7. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Bảng Hiệu quả phòng trừ của các chủng nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến trùng hại thực vật. 15 Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Paecilomyces lilacinus. 30 Bảng 3.1. Đánh giá ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất 37 Bảng 3.2. Mật độ bào tử chế phẩm P.lilacinus sau 2 tháng tồn trữ khi được phối trộn với chất mang 39 Bảng 3.3. Tỷ lệ (%) tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị nấm Paecilomyces lilacinus ký sinh. 41 Bảng 3.4. Tỉ lệ trứng tuyến trùng cái bị nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh 44 Bảng 3.5. Mật số tuyến trùng di động trong đất ở vùng rễ cây hồ tiêu của các ciing thức 45 Bảng 3.6. Hiệu lực phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp của nấm Paecilomyces lilacinus 46 Bảng 3.7. Kết quả sử dụng nấm trừ tuyến trùng hại cây hồ tiêu tại xã Ea Nam, huyện Ea H’leo 47 vi
  8. DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces spp 5 Hình 1.2. Đặc điểm vi thể của nấm Paecilomyces lilacinus 6 Hình 1.3. Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces lilacinus 7 Hình 1.4. Vòng đời của tuyến trùng hại rễ 14 Hình 2.1. Phòng ẩm 25 Hình 3.1. Nấm Paecilomyces lilacinus trên môi trường PDA 35 Hình 3.2. Sợi nấm, cành mang bào tử và bào tử của nấm Paecilomyces lilacinus sau khi tái nhiễm và phân lập lại 36 Hình 3.3. Nấm P.lilacinus phát triển trên cơ chất có độ ẩm 40%,80% và 60%. (A: độ ẩm 40%, B: độ ẩm 80%, C: độ ẩm 60%) 38 Hình 3.4. Chế phẩm sau khi được phối trộn với chất mang 40 Hình 3.5. Nấm Paecilomyces lilacinus tấn công con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne sp.; (A, B: con cái tuyến trùng trước khi lây nhiễm nấm; C, E: con cái tuyến trùng bị lây nhiễm nấm được soi dưới kính hiển vi; D, F: con cái và con cái mang túi trứng của tuyến trùng bị nhiễm nấm Paecilomyces lilacinus soi dưới kính hiển vi sau khi nhuộm Methylene blue). 42 Hình 3.6. Trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. bị nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh (mẫu được soi dưới kinh hiển vi khi nhuộm với Cottonblue) 43 Hình 3.7. Sinh viên pha chế phẩm P.lilacinus tưới vào gốc cây hồ tiêu 48 Hình 3.8. Trước và sau khi phun chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 15 ngày 49 Hình 3.9. Sinh viên xem rễ và lấy mẫu đất của cây hồ tiêu để quan sát tuyến trùng 50 Hình3.10. Quan sát trứng Tuyến trùng Meloidogyne spp. bị nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh trong đất cây hồ tiêu được xử lí với chế phẩm 50 vii
  9. MỞ ĐẦU Hồ tiêu là một trong những cây trồng công nghiệp xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Do giá trị xuất khẩu cao nên diện tích hồ tiêu ngày càng tăng. Tuy nhiên, hiện nay hồ tiêu bị gây hại nặng bởi nhiều loài dịch hại. Trong đó, đáng kể nhất là tuyến trùng Meloidogyne sp. Biện pháp hóa học đã và đang được áp dụng để quản lý các loài dịch hại này nhưng hiệu quả không cao và nguy cơ tồn lưu hóa chất trong sản phẩm cũng là vấn đề đáng quan tâm. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu ở các nước trên thế giới đã cho thấy việc sử dụng các loại nấm Paecilomyces lilacinus cho hiệu quả cao trong phòng trừ tuyến trùng gây hại (Burges H. D., 1998; Butt T. M và Copping L., 2000). Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về loài nấm có ích này vẫn còn khá hạn chế. Tại trường đại học công nghệ thành phố Hồ Chí Minh, Phùng Lê Kim Yến (2014) đã phân lập được chủng nấm Paecilomyces lilacinus có khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne gây hại hồ tiêu và bước đầu đã đánh giá được những điểm sinh học của loài tuyến trùng này (Lê Trần Quang Huy, 2015, Phan Ánh Ngân, 2016). Tuy nhiên, vẫn còn nhiều vấn đề về nhân sinh khối chủng nấm này và đánh giá khả năng ký sinh của chế phẩm trên đồng ruộng vẫn chưa tiến hành được.Xuất phát từ tình hình trên, sinh viên tiếp tục với đề tài “Sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu”. Tính cấp thiết của đề tài Hồ tiêu được xem là một trong những cây trồng chủ lực chính của Việt Nam. Hồ tiêu (piper nigrumL.) được xem là “vua của các loại gia vị” và trở thành sản phẩm nông nghiệp quan trọng nhất của Việt Nam. Hiện nay, diện tích trồng hồ tiêu của Việt Nam đã hơn 100.000 ha (theo Hiệp hội hồ tiêu, 2016), tập trung ở các tỉnh Đắc Lắc, Gia Lai, Bình Phước, Đồng Nai và Bà Rịa, Vũng Tàu. Tuy nhiên, sản xuất hồ tiêu tại tất cả các vùng trồng tiêu chính trong cả nước đang chịu tổn thất đáng kể do bệnh vàng lá chết chậm mà một trong những nguyên nhân gây bệnh chủ yếu là tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne incognita ( Đào Thị Lan Hoa và ctv, 2003; Trình, 2010). 1
  10. Ngoài gây hại trực tiếp đến sinh trưởng, phát triển của cây trồng, tuyến trùng còn tạo điều kiện cho các loài nấm như Pythium, Fusảium, Phytopthora xâm nhiễm và gây hại cho cây trồng. Biện pháp phòng trừ tuyến trùng hiện nay là sử dụng các loại thuốc hóa học đặc hiệu như Marshal, Oncol, Nokaph, Tervigo và Vimoca (Đỗ Thị Kiều An và ctv, 2015). Tuy thuốc hóa học có làm mật số tuyến trùng nhưng các loại thuốc hóa học lại gây ra tác động xấu đối với môi trường, để lại tồn dư trong nông sản, tăng tính kháng của sâu bệnh làm cho việc phòng trừ trở nên khó khăn hơn. Vì vậy, hiện nay, các tác nhân sinh học là một trong những hướng tiềm năng trong việc phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu. Trên thế giới hiện nay có rất nhiều nghiên cứu sử dụng tác nhân sinh học để phòng trừ tuyến trùng. Đặc biệt, nấm Paecilomyces lilacinus được xem là một trong những tác nhân có khả năng phòng trừ tuyến trùng hiệu quả cao nhất (Burges H. D., 1998; Butt T. M và Copping L., 2000). Tuy nhiên ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về nấm Paecilomyces spp vẫn còn hạn chế. Xuất phát từ tình hình trên, sinh viên chọn đề tài: “Sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu” Mục đích nghiên cứu Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm phòng trừ tuyến trùng hại cây hồ tiêu từ nấm Paecilomyces lilacinus và xác định hiệu quả phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. của chế phẩm Paecilomyces lilacinus. 2
  11. Nội dung đề tài Khảo sát độ ẩm thích hợp để nhân sinh khối chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus. Khảo sát chất mang phối trộn phù hợp để bảo quản chế phẩm từ nấm Paecilomyces lilacinus. Đánh giá khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne của chế phẩm Paecilomyces lilacinus trong điều kiện phòng thí nghiệm. Đánh giá khả năng trừ tuyến trùng hại hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus trên đồng ruộng. 3
  12. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces 1.1.1. Phân loại khoa học Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Paecilomyces Loài: Paecilomyces lilacinus Chi Paecilomyces do Bainier mô tả vào 1907, sau đó được nhiều tác giả chấp nhận chi mới này và bổ sung nhiều loài mới. Chuyên luận về chi nấm này của Samson (1974) chấp nhận 16 loài đã mô tả, đồng thời tổ hợp mới 9 loài và đề nghị 6 loài mới, tất cả tập hợp trong 2 nhóm loài. Nhóm loài thứ nhất là nhóm loài Paecilomyces có các giai đoạn bào tử túi thuộc các chi Byssochlamys Westling, Talaromyces C.R.Benjamin và Thermoascus Miehe, gồm các loài ưa nhiệt ôn hòa (mesophile), chịu nhiệt và ưa nhiệt, có khuẩn lạc màu nâu vàng hay các màu nâu khác. Nhóm loài thứ hai là nhóm loài Isarioides gồm các loài không có giai đoạn bào tử túi, ưa nhiệt ôn hòa và có khuẩn lạc màu tím hồng, màu lục và màu vàng. Nhiều loài trong nhóm hai này ký sinh gây bệnh côn trùng. Theo điều tra của bộ Nông nghiệp Ấn Độ, chủng nấm Paecilomyces sp. an toàn với động vật máu nóng, không gây ngộ độc qua đường hô hấp, không gây độc khi nuốt phải. 4
  13. Paecilomyces lilacinus: Được tìm thấy đầu tiên trong trứng tuyến trùng vào năm 1966 và sau này được phát hiện ký sinh trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita ở Peru. Hiện tại, có thể phân lập loài nấm này ở trong đất và thỉnh thoảng là ở cả trong côn trùng. Đường kính khuẩn lạc dao động trong khoảng 5 - 7cm trong 14 ngày ủ ở nhiệt độ phòng 270C ± 20C. Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu hồng khi sinh bào tử. Sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể hình bình cổ hẹp với số lượng lớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài. Các thể bình phình ra ở phần gốc và thon nhỏ lại ở cổ. Bào tử trần hình elip đến hình thoi (Samson, 1975). 1.1.2. Đặc điểm sinh thái Khuẩn lạc của nấm Paecilomyces lilacinus có thể ở dạng thảm nhung, dạng bó sợi, có màu trắng, hồng nhạt, màu tím đinh hương (nên còn được gọi là nấm tím), màu nâu vàng, màu nâu xám, thỉnh thoảng có màu lục nhạt (tùy loài). Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces spp. (Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp) 5
  14. Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, gốc cuống dạnh bình phình to, phía trên nhỏ và uốn cong. Cuống bình thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều. Bào tử phân sinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Trần Văn Mão, 2002). Hình 1.2. Đặc điểm vi thể của nấm Paecilomyces lilacinus (Nguồn: Được tìm thấy đầu tiên trong trứng tuyến trùng vào năm 1966 và sau này được phát hiện ký sinh trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita ở Peru. Hiện tại, có thể phân lập loài nấm này ở trong đất và thỉnh thoảng là ở cả trong côn trùng. Đường kính khuẩn lạc dao động trong khoảng 5 - 7cm trong 14 ngày ủ ở nhiệt độ phòng 27oC. Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu hồng khi sinh bào tử. Sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể hình bình cổ hẹp với số lượng lớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài. Các thể bình phình ra ở phần gốc và thon nhỏ lại ở cổ. Bào tử trần hình elip đến hình thoi (Samson, 1975). 6
  15. Hình 1.3. Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces lilacinus 1.1.3. Các nghiên cứu về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces lilacinus trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng Nấm gây bệnh cho tuyến trùng và tuyến trùng là một tác nhân sinh học quan trọng trong việc khống chế tuyến trùng và tuyến trùng gây hại. Vai trò trấn áp những trận dịch lớn do tuyến trùng gây hại của các chủng nấm ký sinh được trình bày rất rõ trong nhiều công trình của các tác giả trên thế giới: V.P. Paspelop (1932- 1940), Dusky S.R. (1959), Tanada I. (1959 -1964), Hall I. M. (1964) (dẫn theo Nguyễn Ngọc Tú, 1997). Đây là một nhân tố hữu dụng trong hệ thống quản lý sâu hại tổng hợp IPM (Gillespie; Rombach và CS., 1986). Trên thế giới, việc sử dụng nấm ký sinh gây bệnh để phòng trừ sinh học đối với các loài tuyến trùng và tuyến trùng đã được quan tâm nghiên cứu từ đầu thế kỷ 19. Nhiều loài nấm có khả năng nhiễm và tiêu diệt trứng tuyến trùng. Hầu hết các loài nấm này có cơ chế hoạt động là hoại sinh và xâm nhập vào trứng gây chết. Các loài nấm ký sinh trứng tuyến trùng bao gồm Paecilomyces, Pochonia và Verticilium. Paecilomyces lilacinus và Pochonia chlamydosporiaare cho hiệu quả 7
  16. ký sinh trứng tuyến trùng tốt nhất. Paecilomyces lilacinus được chứng minh kiểm soát thành công tuyến trùng sần rễ, M. javanica và M. incognita trên cà chua, cà tím và các loài rau khác (Cayrol et al, 1989; Verdejo – Lucas et al, 2003; Goswami và Mittal, 2004; Van Damme et al, 2005; Goswami et al., 2006; Haseeb và Kumar, 2006). Huma Abbas , Nazir Javed , Sajid Aleem Khan , Muhammad Kamran , Muhammad Atiq (2016) thực hiện nghiên cứu sử dụng nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng sần rễ trên cây cà tím. Thí nghiệm này được thực hiện trong điều kiện nhà lưới vào 7 ngày đã chứng minh được rằng, Paecilomyces lilacinus có khả năng làm giảm số lượng lớn tuyến trùng và có khả năng thay thế cho các loài thuốc hóa học phòng trừ tuyến trùng. Trong những thập kỷ 60 đến 80 của thể kỷ trước, việc nghiên cứu nuôi cấy các nấm ký sinh gây bệnh cho tuyến trùng và tuyến trùng hại đã được phát triển rất mạnh mẽ nhưng chủ yếu là nấm Metarhizium và Beauveria. Trong đó phải kể đến các công trình nghiên cứu của Muller Cogler E. (1961), Hall I. M. (1963- 1964), Camera J. W., Mac Bain (1963 - 1967), Madelin M. F. (1965 - 1966), Ignoffo C. M. (1977), H.D Burges và CS. (1982), N. K. Maniania và CS. (1984) (theo Nguyễn Ngọc Tú và CS.,1997), Ferron P. (1978). Các công trình đã tập trung nghiên cứu rất tỉ mỉ về phương pháp để nhân giống, các môi trường dinh dưỡng, các thiết bị nuôi cấy, phương pháp thu bào tử từ sinh khối nấm, tạo chế phẩm sinh học và sử dụng chúng để phòng trừ sâu hại và tuyến trùng trên đồng ruộng. Trong những năm gần đây, một số các công trình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm kí sinh tuyến trùng. Các chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm ký sinh có một vai trò quan trọng trong việc phòng chống sâu hại cây trồng, đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con người (Noris và CS., 2002). Alamgir Khan, Kleith L. Williams, Helena K.M. Nevalainen (2004) thực hiện nghiên cứu về ảnh hưởng của enzyme protease và chitinase từ nấm Paecilomyces 8
  17. lilacinus trên cấu trúc vỏ và sự nở của tuyến trùng Meloidogyne javanica. Một serine protease và một enzyme được chuẩn bị từ 6 chitinase, được tách chiết và tinh sạch từ môi trường nuôi cấy lỏng chủng nấm Paecilomyces lilacinus 251, tấn công vào các trứng tuyến trùng Meloidogyne javanica để nghiên cứu hiệu quả của các loại enzyme đến cấu trúc vỏ trứng. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử chứng minh rằng enzyme protease và chitinase đã làm thay đổi lớn cấu trúc của vỏ trứng khi chúng tấn công riêng lẻ hoặc kết hợp với nhau. Dưới tác động protease lên vỏ trứng, lớp lipid biến mất và lớp chitin mỏng hơn. Khi sử dụng chitinase có lớp không bào lớn, lớp viteline bị chia ra và mất đi tính toàn vẹn của nó. Những thay đổi lớn trên lớp vỏ trứng xảy ra do ảnh hưởng khi kết hợp enzyme protease và chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. Lớp chitin bị thủy phân và lớp vitelline mất đi tính vẹn toàn. Hiệu lực của enzyme chitinase và protease từ nấm Paecilomyces lilacinus khi sử dụng riêng rẻ hoặc kết hợp cũng cho kết quả làm giảm sự nở của con cái tuyến trùng M. javanica. Nghiên cứu chỉ ra rằng một số tuyến trùng đã nở khi được tiếp xúc với enzyme của nấm sẽ có sự hiện diện của enzyme chitinase từ nấm Paecilomyces lilacinus giữ lại hoạt động của chúng dưới sự hiện diện của protease nội sinh. Mendoza A.R.,R.A.Sikora,vàS.Kiewnick. (2007) đã thực hiện nghiên cứu về sự ảnh hưởng của Paecilomyces lilacinus chủng 251 lên kiểm soát sinh học tuyến trùng Radopholus similis ở cây chuối. Khả năng nâng cao hiệu quả diệt tuyến trùng của chủng nấm đã được chứng minh. Sự tương quan đáng kể giữa liều dùng và nồng độ để kiềm hãm R. similis đã được xác định. Ở nồng độ 6 × 106 cfu/g đất khô được xem là liều dùng tối ưu của P. lilacinus. Tác giả chứng minh rằng P. lilacinus là tác nhân kiểm soát sinh học hiệu quả chống lại R. similis và cũng là nhân tố quan trọng trong việc kiểm soát tuyến trùng trên cây chuối. Năm 2006, M. Nasr Esfahani và B. Ansari Pour nghiên cứu hiệu quả của nấm Paecilomyceslilacinus trong kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne javanica và ảnh hưởng của nấm đến sự phát triển của cây cà chua trong điều kiện nhà kính. Kết quả chứng minh rằng P. lilacinus cải thiện sự phát triển cây trồng và làm giảm đáng kể 9
  18. số lượng tuyến trùng và trứng tuyến trùng khi bị nhiễm M. Javanica như tác nhân gây bệnh làm rễ sần to. Nấm sẽ đạt hiệu quả cao nhất khi nấm và tuyến trùng được nhiễm đồng thời hoặc nấm được nhiễm trước và tuyến trùng nhiễm sau. Tuyến trùng đã trưởng thành bị tấn công hoặc bị chết đều có sự hiện diện của sợi nấm trên cơ thể chúng. Cheu Guan Pau và cộng sự (2012) đã phân lập được 10 chủng nấm Paecilomyces lilacinus từ đất vườn trồng 2 loại tiêu đen ở Sarawark có thể phòng trừ tuyến trùng gây sần rễ. Sau quá trình nghiên cứu, thí nghiệm đã chỉ ra rằng cả 10 chủng nấm nêu trên đều có khả năng phòng trừ tuyến trùng với mật độ bào tử 105 bào tử / ml. Hiện nay, có rất nhiều nơi trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm từ nấm Paecilomyces vào trong thực tiễn đời sống. Một số sản phẩm phòng trừ tuyến trùng đã được thương mại hóa như nemaxxion biol do công ty Greencorp,2014 sản xuất lên men lỏng, bao gồm các loại vi khuẩn và nấm (Bacillus subtilis, Trichoderma spp. và Paecilomyces spp.) hay REM G cũng là một sản phẩm phòng trừ tuyến trùng bao gồm các chủng nấm Arthrobotrys spp., Mycorrhia (Glomus spp.), Dactyllela spp., Paecilomyces lilacinus, và các loại vi khuẩn (B. spp) và (Pseudomonas spp.), sản phẩm được bổ sung enzyme chitinolytic, protease và enzyme lipolytic nhằm phá vỏ thành tế bào của tuyến trùng. Các sản phẩm này có hiệu lực cao trên cây cà chua ở vùng Souss – Massa Draa ở Morocco. 1.1.4. Nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự sản xuất và bảo quản chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus Nấm phát triển thích hợp ở ẩm độ cao (Trần Văn Mão, 2002). Ẩm độ cao sẽ rất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, tuy nhiên ẩm độ thấp sẽ có lợi cho duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm Paecilomyces sp. có khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm độ từ 0 – 34% hơn là khi ẩm độ 75%. Theo M. Nagesh và cộng sự (2007), thí nghiệm về sự tương quan giữa lượng nước bổ sung vào khối lượng hạt lúa mì (cơ chất rắn ban đầu) với tỉ lệ 1,0 :1,0 ; 10
  19. 1,5 :1,0 ; 2,0 :1,0 (v/w) ảnh hưởng đến phát triển sợi nấm và sản xuất bào tử của nấm kí sinh tuyến trùng Paecilomyces lilacinus PDBC PL55 và Pochonia chlamydosporia PDBC PC57. Sự bổ sung nước vào cơ chất sẽ làm tăng độ ẩm cơ chất, sẽ gây ảnh hưởng đến thời gian hình thành sợi nấm và số lượng bào tử thu hoạch được trong 1 chu kỳ sản xuất. Độ ẩm cơ chất ban đầu càng cao ( 74-76%) sẽ khiến cho thời gian để sấy khô cơ chất kéo dài tới 8-9 ngày để hạn chế sự nhiễm khuẩn tới độ ẩm thích hợp (15-18%). Lượng nước tối ưu bổ sung vào cơ chất ban đầu cho sự sản xuất bào tử cho 2 chủng nấm P.lilacinus và P.chlamydosporia là 1:1. 1.2. Tổng quan về tuyến trùng Tuyến trùng ký sinh thực vật có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những vết thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman và et al., 1997). Tổn hại về mặt kinh tế từ 40%- 50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấn công bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry, 1997). Bởi vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng, nên các nhà nông thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra. Thiệt hại do tuyến trùng gây ra đặc biệt leo thang vào những mùa mưa, trong đó những thành viên thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua là bị ảnh hưởng nhiều. Ở vùng Botswana, những cây thương mại thuộc họ cà được trồng suốt năm trong nhà kính. Những rối loạn sinh lý ở cây do tuyến trùng gây ra thường được quan sát trên cây họ cà (Nilsson, 1972). Tuyến trùng hại rễ là một loài sống ký sinh thực vật, thuộc chi Meloidogyne. Người ta ước tính rằng tuyến trùng hại rễ Meloidogyne spp. gây tổn hại 20% - 50% sản lượng cà chua (Nilsson, 1972). Chúng tồn tại trong đất ở những vùng có khí hậu nóng bức hay có mùa đông ngắn. Có khoảng 2000 loài thực vật có thể bị nhiễm tuyến trùng hại rễ và chúng gây mất mát 5% sản lượng thực vật trên toàn cầu mỗi năm. Ấu trùng của chúng xâm nhiễm vào rễ cây, hình thành những nốt sần ở rễ, đồng thời chúng làm mất khoáng chất của cây và khả năng quang hợp. Khi chúng 11
  20. xâm nhiễm vào cây con thì kết quả chắc rằng cây đó sẽ chết, còn nếu nhiễm vào cây đã trường thành thì chỉ làm giảm năng suất của cây đó. 1.2.1. Đặc điểm sinh thái Meloidogyne thuộc nhóm động vật kí sinh cây trồng, chúng phân bố khắp thế giới và gần như kí sinh ở tất cả thực vật bậc cao. Chúng sống và sinh sản trong các tế bào sống bị biến đổi của rễ thực vật. Vì tạo nên những vết sưng trên rễ nên người ta gọi chúng là tuyến trùng sần rễ. Chúng có khả năng sinh sản và phát triển rất nhanh làm cho cây trồng bị thiệt hại nặng nề. Theo phân loại của Goldi (1887, có chỉnh sửa vào năm 2000), Meloidogyne spp. có các đặc điểm như sau: Đối với con cái trưởng thành thì có hình tròn hay quả lê, màu trắng, ít vận động, không có giai đoạn u nang. Có kim chích nhỏ và mảnh, thường dài từ 12 - 15 µm. Lỗ bài tiết nằm trước tới khoảng giữa khối tròn, thường chỉ sau kim chích. Sáu tuyến trực tràng lớn tiết các chấ đặc sệt để bảo quản trứng và đẻ trứng ra ngoài. Con đực trưởng thành có hình giống con giun, dài đến 2 mm, đuôi xoắn và tròn, phát triển qua các lần biến thái trong rễ. Có kim chích nhỏ nhưng mảnh, dài 18 – 25µm. Tuyến hầu nằm ở phần bụng đến ruột. Gai nhỏ và mảnh, thường dài 25 – 33µm, ống dẫn dài từ 7 – 11µm. Có một tinh hoàn. Ấu trùng: Trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra ngoài trong một bọc gelatine (gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt hay bên trong của nốt sần rễ. Tuyến ký sinh thực vật có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những vết thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman et al., 1997). Tổn hại về mặt kinh tế từ 40% - 50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấn công bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry, 1997). Bởi vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng, nên các nhà nông thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra. Thiệt 12
  21. hại do tuyến trùng gây ra đặc biệt leo thang vào những mùa mưa, trong đó những thành viên thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua là bị ảnh hưởng nhiều. Ở vùng Botswana, những cây thương mại thuộc họ cà được trồng suốt năm trong nhà kính. Những rối loạn sinh lý ở cây do tuyến trùng gây ra thường được quan sát trên cây họ cà (Nilsson, 1972). Người ta ước tính rằng tuyến trùng hại rễ Meloidogyne spp.gây tổn hại 20%- 50% sản lượng cà chua (Nilsson, 1972) Trong khi ở Việt Nam thì tiêu có lượng xuất khẩu tiêu lớn nhất thế giới. Do đó, cây tiêu đóng một vai trò quan trọng trong nền kinh tế của đất nước. Nhưng hiện nay, có nhiều loại bệnh hại làm giảm năng suất của tiêu đó là bệnh sần rễ do tuyến trùng Meloidogyne gây ra. Chúng phá hoại bộ rễ, tạo nhiều vết thương làm cho các loài vi nấm, vi khuẩn có hại xâm nhập và gây bệnh dễ dàng hơn. Do đó, việc tìm hiểu và phòng trừ bệnh hại cho tiêu rất quan trọng. Khi bị tuyến trùng gây hại, cây ngừng sinh trưởng, lá vàng, ra hoa và đậu quả kém. Đặc biệt, khi quan sát dưới rễ sẽ thấy có những nốt sần xuất hiện, nếu bệnh quá nặng cây sẽ chết. Bệnh sần rễ không chỉ biểu hiện ở những cây lá vàng mà còn cả những cây xanh tươi do bệnh mới phát triển ở giai đoạn đầu, rễ vẫn vận chuyển nước và khoáng chất được. Sự phát triển của bệnh trải qua 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: tuyến trùng mới xâm nhập vào rễ và tạo nốt sần, lúc này rễ chưa bị ảnh hưởng nhiều, rễ vẫn còn màu sáng. Giai đoạn 2: rễ bị đổi màu, chức năng vận chuyển nước và chất dinh dưỡng bị ảnh hưởng. Rễ bị tổn thương và tạo cơ hội cho các vi sinh vật tấn công gây nhiều bệnh khác cho cây. Giai đoạn 3: rễ bị đổi màu đen và chức năng vận chuyển đã không còn. Có 29 loài thuộc các họ khác nhau có mặt trên các vùng trồng tiêu của Việt Nam. Trong đó, chủ yếu và phổ biến nhất là chi Meloidogyne.(Trịnh Thị Thu Thủy và cộng sự, 2007). 13
  22. Hình 1.4. Vòng đời của tuyến trùng hại rễ (Nguồn: www.apsnet.org) Trước đây, việc kiểm soát tuyến trùng hại thực vật chủ yếu dựa vào các hóa chất diệt tuyến trùng, sức đề kháng của kí chủ thực vật và luân canh cây trồng. Mặc dù có nhiều thành công trong nghiên cứu kiểm soát tuyến trùng bằng phương pháp sinh học trong suốt 20 năm qua, đến nay nó vẫn ít được áp dụng. Hầu hết các sản phẩm có chứa độc tố được ly trích từ vi sinh vật và chỉ một vài sản phẩm có chứa vi sinh vật hữu hiệu (Dong và Zhang, 2006). Dưới đây là một số nghiên cứu về hiệu quả phòng trừ tuyến trùng của nấm kí sinh trứng trong những năm 1991 - 1996: 14
  23. Bảng 1.1. Bảng Hiệu quả phòng trừ của các chủng nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến trùng hại thực vật. Hiệu quả phòng trừ của Nấm Tuyến trùng nấm đối với tuyến trùng Tác giả (năm) hại thực vật Giảm số lượng tuyến Stephan et al. P.lilacinus M. javanica trùng gây hại dưa leo. (1991) M.incognita Giảm số lượng tuyến Vicente et al. P.lilacinus R.reniformis trùng gây hại dưa hấu. (1991) Xử lý nấm có hiệu quả tốt Walia et al. P.lilacinus M.javanica cho sự phát triển của đậu (1991) bắp. Bón vào đất 2g/chậu trước Zaki và P.lilacinus M.javanica khi chủng tuyến trùng cho Maqbool hiệu quả tốt nhất. (1991) Trộn vào hạt giống với M.incognita liều trung bình và cao làm Khan et al. P.lilacinus acrita giảm đáng kể sự hư hại (1992) của bộ rễ. Loài nấm này là một trong Marban- Meloidogyne những sinh vật đất tự P.marquandii Mendoza và spp. nhiên góp phần kiểm soát cs (1992) tuyến trùng. Xử lý hạt đậu đũa bằng Siddiqui và P.lilacinus M.incognitarace nấm cho hiệu quả diệt Mahmood 15
  24. 3 tuyến trùng tốt hơn so với (1992a) xử lý bằng ascorbic acid. P.lilacinus gây ra sự giảm mật độ tuyến trùng nhiều Siddiqui và P.lilacinus M. hơn so với B. Mahmood B. licheniforrnis incognitarace 3 licheniforrnis trên đậu (1992b) đũa. Có sự giảm số lượng nốt sần, khối trứng và mật độ Pandey và P.lilacinus M.incognita tuyến trùng trong đất Trivedi (1992) trồng nhiều loại thực vật khi xử lý với nấm. Khi phun chế phẩm lên Siddiqui và M.incognita P. lilacinus gốc tiêu làm tăng số lượng Mahmood R.reniformis và cân nặng chùm quả. (1993) Xử lý nấm có hiệu quả P.lilacinus M.incognitarace hơn so với B.subtilis trong Zaki (1994) B.subtilis 3 việc giảm số lượng tuyến trùng trên đậu đũa. Liều lượng tốt nhất để Walters và P.lilacinus M.javanica kiểm soát tuyến trùng là 4 Barker (1994) gam/kg đất. P.lilacinus Nấm kiểm soát tuyến Siddiqui và R.reniformis trùng hiệu quả cả trong Mahmood điều kiện nhà lưới và (1995b) 16
  25. đồng ruộng. P. lilacinus kiểm soát P. lilacinus tuyến trùng không hiệu Heterodera Siddiqui et al. P. quả bằng P. cajani (1996) chlamydosporia chlamydosporia trên pigeonpea. P.lilacinus kết hợp với P. P. chlamydosporia và Siddiqui et chlamydosporia M. javanica T. harzianum làm giảm al.(1996) T. harzianum mật độ tuyến trùng trên đậu đũa. P.chlamydosporium kết P. Siddiqui và hợp với T.harzianum và chlamydosporia Mahmood H. cajani Glomus mosseae làm T.harzianum (1996) giảm tuyến trùng hiệu quả Glomus mosseae nhất trên pigeonpea. Theo R.P. Esser và N.E.El-Gholl(1998) thì Paecilomyces spp. có khả năng gây ảnh hưởng và kí sinh trên con cái và trứng tuyến trùng. Nấm này cũng là tác nhân kiểm soát sinh học đáng kể theo nhiều khám phá trước đây vào năm 1979 và hiện nó đang được chú ý vì là "tác nhân kiểm soát sinh học có tiềm năng tuyệt vời trong đất nông nghiệp ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới". Loài Paecilomyces spp. ký sinh tuyến trùng sẽ tiếp cận với kí chủ thông qua một số con đường như: sợi nấm sẽ bám váo lớp vỏ keo của tuyến trùng hoặc thâm nhập thông qua phần hậu môn và cổ tử cung của tuyến trùng. Mặt khác, sợi nấm cũng có thể phân nhánh và bám vào bề mặt của trứng tuyến trùng. 17
  26. Theo một báo cáo gần đây của Gortari et al. (2008) thì Paecilomyces lilacinus là một loài vi nấm có khả năng ký sinh trứng của tuyến trùng trong điều kiện in vitro. Hai chủng ngoài tự nhiên P. lilacinus LPSC # 876 và P. Lilacinus LPSC # 44 được phân lập từ đất trong tại công viên trung tâm của thành phố La Plata và trên một cánh đồng nông nghiệp ở Argentina cho thấy, các chủng nấm Paecilomyces sp. có khả năng ký sinh trên trứng của T. cannis. Theo kết quả thực nghiệm của tác giả thì tỷ lệ ký sinh trứng T. cannis của 2 chủng nấm P. lilacinus LPSC 876 và P. lilacinus LPSC 44 lần lượt là 65,6% và 63,2%. Còn theo Claire Vidal et al. (1998), điều kiện thích hợp cho sự xâm nhiễm của Paecilomyces fumosoroseus với ký chủ tối ưu ở điều kiện nhiệt độ từ 22-330C và độ ẩm từ 68% - 100% (với tỷ lệ ký sinh là trên 70% sau một tuần gây nhiễm). 18
  27. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm của trường từ tháng 2/2017 đến tháng 7/2017 2.2. Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Thiết bị - hóa chất 2.2.1.1. Thiết bị Nồi hấp khử trùng Que cấy điểm Đèn cồn Ống nghiệm Kính hiển vi quang học Dao cấy Dụng cụ đục lỗ thạch 5mm Đĩa petri Micropipet Erlen 2.2.1.2. Hóa chất Dịch TCA 5% Lugol Cồn 960, 700 CaCl2 Methylene blue Lactocotton phenol blue MgSO4.7H2O K2HPO4 KNO3 NaCl FeSO4.7H2O Glucose Pepton NaNO3 KCl 19
  28. 2.2.2. Vật liệu nghiên cứu: Chủng nấm Paecilomyces lilacinus P1 được phân lập và lưu trữ tại phòng thí nghiệm trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Hutech. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse lilacinus. Chuẩn bị môi trường PDA có bổ sung 0,1 g / l chloramphenicol, hấp khử trùng rồi phân phối đều ra các đĩa Petri vô trùng. Cấy nấm vào giữa đĩa Petri môi trường, dùng kim hút đặt 8 tuyến trùng cái (trứng) xung quanh vị trí cấy nấm, cách tâm đĩa 2cm. Đặt đĩa Petri trong tủ ủ với nhiệt độ 25 ± 2 0C. Theo dõi sự xâm nhiễm của nấm vào cơ thể tuyến trùng sau 2, 4, 6, ngày cấy nấm, tiến hành thu con cái tuyến trùng chết trong đĩa nấm nghi nhiễm Paecilomyces lilacinus. Phân lập lại: Dùng đũa thủy tinh vô trùng nghiền mẫu với 10 ml nước cất vô trùng. Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-6 và tiến hành trãi đĩa trên môi trường PDA. Làm thuần: dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó làm nguội và chấm nhẹ vào điểm có bào tử đặc trưng của nấm Paecilomyces sp và không bị nhiễm tạp sau đó cấy 3 điểm nhẹ lên bền mặt môi trường. Để đĩa môi trường cấy phân lập trong phòng thí nghiệm 2 – 3 ngày, thấy khuẩn lạc đặc trưng của nấm xuất hiện thì tiến hành cấy tách ra các đĩa môi trường khác nhau để làm thuần chủng. 2.3.2. Quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005) a) Quan sát hình thái khuẩn lạc Quan sát hình thái đại thể các chủng nấm bằng việc mô tả đặc điểm tản nấm của chúng khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng. Các chủng nấm phân lập được sẽ được cấy điểm trên tâm đĩa môi trường PDA và được ủ 2 tuần. 24
  29. Quan sát mô tả các đặc điểm: Kích thước tản nấm để biết tốc độ phát triển; dạng sợi nấm, màu sắc tản nấm mặt trước và mặt sau; màu sắc của môi trường do sắc tố nấm sợi tạo ra; thời gian hình thành bào tử trong thời gian nuôi ủ. b) Quan sát hình thái vi thể nấm sợi dưới kính hiển vi (phương pháp phòng ẩm) Phương pháp làm phòng ẩm: Chuẩn bị một đĩa môi trường PDA và một đĩa petri vô trùng nuôi cấy chứa: mảnh giấy lọc, hai thanh đũa tre đặt trên giấy lọc, lame và lamelle đặt lên trên hai thanh đũa tre. Sử dụng dao mổ vô trùng cắt một khối thạch (1cm x 1cm) từ đĩa môi trường PDA chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuôi cấy. Dùng dây cấy đã khử trùng, lấy sinh khối nấm Paecilomyces sp. cấy vào 4 mặt bên của khối thạch. Sau đó đậy lamelle lên trên khối thạch. Nhỏ nước cất vô trùng cho ướt toàn bộ giấy thấm trong đĩa. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử xảy ra (thường là 2 – 3 ngày). Hình 2.1. Phòng ẩm 25
  30. Mẫu quan sát được chuẩn bị bằng cách lấy lamelle ra khỏi khối thạch đặt lên một lame sạch có sẵn một giọt Methylene blue. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần và mô tả đặc điểm: Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn; hình dạng cuống bào tử; đặc điểm hình dạng, màu sắc, kích thước bào tử 2.3.3. Hoàn thiện quy trình nhân nuôi sản xuất chế phẩm từ nấm Paecilomyces lilacinus 2.3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu của cơ chất đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus Thí nghiệm được thực hiện hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại (LLL), mỗi lần nhắc là một bịch PE chứa 500 g gạo tấm, lượng nước bổ sung vào lần lượt 180 ml, 280 ml, 380 ml, 480 ml, 580 ml tương ứng với các độ ẩm 40%, 60%, 80%, 100%, 120%. Thành phần nuôi cấy bao gồm: gạo tấm, pH 6.0, lượng giống bổ sung là 20 ml giống 14 ngày tuổi. Lượng nước bổ sung vào môi trường theo tỷ lệ VH2O / Khối lượng cơ chất (v/w) như sau: Công thức 1: 40% Công thức 2: 60% Công thức 3: 80%; Công thức 4: 100% Công thức 5: 120%.  Tiến hành thí nghiệm Giống nấm gốc được nuôi trong đĩa môi trường PDA ( dịch khoai tây 200 g/l, agar 20 g/l, D-glucose 20 g/l ). Sau đó, cứ 1 đĩa nấm được nuôi trong môi trường PDA được chuyển sang erlen chứa 100 ml nước cất đã được hấp tiệt trùng. Xác định mật độ dịch huyền phù bào tử nấm trong erlen bằng phương pháp cấy trang 26
  31. trên môi trường PDA. Sau khi xác định được mật độ bào tử nấm, dịch huyền phù bào tử nấm được hiệu chỉnh về nồng độ 107 bào tử / ml. Lấy 100 g gạo tấm đem sấy khô ở 105oC trong 24 giờ để xác định hàm lượng nước ban đầu của gạo. Sau khi đã xác định được độ ẩm ban đầu của cơ chất, cân 200 gr gạo vào mỗi bịch PE, bổ sung lượng nước theo các công thức mang hấp khử trùng bằng nồi hấp Autoclave (1210C , 1 atm, 20 phút), để nguội. Hút 20ml dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ 107 bào tử / ml, cấy vào 200g cơ chất gạo, sao cho mật độ cấy giống ban đầu là 106 bào tử / g cơ chất. Ủ nấm trong điều kiện nhiệt độ phòng để nấm phát triển, thời gian lên men 14 ngày.  Chỉ tiêu theo dõi: Mật độ bào tử/ g cơ chất sau 14 ngày nuôi cấy Xác định mật độ bào tử sau khi nuôi cấy Sử dụng phương pháp cấy trang để xác định được mật độ bào tử nấm phát triển trong mỗi nghiệm thức. Cân 10 gr ngẫu nhiên chứa sinh khối đã phát triển của nấm P.lilacinus, nghiền nhuyễn, sau đó cho vào 90 ml nước cất đã hấp tiệt trùng chứa trong erlen và lắc đều 15 phút. Hút 1 ml dung dịch đã lắc vào 9 ml nước muối sinh lý đã hấp tiệt trùng, tiếp tục hút 1 ml sang các ống còn lại cho đến nồng độ pha loãng 10-10. Hút 1 μl vào đĩa petri chứa môi trường PDA và tiến hành cấy trang. Đĩa đã được cấy được đem đi ủ ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 2 ngày ủ. 2.3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của chất mang đến thời gian tồn trữ chế phẩm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 2 công thức, sử dụng 2 loại chất mang thường dung trong bảo quản chế phẩm bào tử nấm Công thức 1: Phối trộn với cao lanh Công thức 2: Phối trộn với bột bắp 27
  32. Mỗi công thức sẽ được lặp lại 3 lần, mỗi lần nhắc là một túi chứa 100 g sản phẩm, bao gồm chế phẩm thô phối trộn với chất mang, sao cho mật độ trong chế phẩm ban đầu đạt ít nhất 1x109 bào tử/g. Chỉ tiêu theo dõi: Sau mốc 60 ngày sẽ xác định mật độ bào tử ở mỗi công thức bằng phương pháp cấy trang trên môi trường PDA. 2.3.4. Khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne sp của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus trong điều kiện phòng thí nghiệm 2.3.4.1. Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) Trứng và con cái Meloidogyne spp. được tách ra từ rễ cây tiêu thu ở tỉnh Đăk Lăk và Bình Phước. Mẫu rễ lấy về được rửa sạch dưới vòi nước chảy, để trên giấy thắm khô tự nhiên. Sau đó, dùng dao cấy nhọn tách từ từ phần rễ dưới ánh đèn sáng và bắt con cái, túi trứng trong nốt sần. Con cái có màu trắng đục, hình quả lê, kích thước tùy vào con to nhỏ khác nhau, thường dài khoảng 0,6 – 0,7 mm, rộng 0,4 – 0,5 mm. Túi trứng có màu hơi vàng nâu, hình bầu dục với kích thước tương đương với kích thước con cái. 2.3.4.2. Phương pháp khảo sát khả năng ký sinh của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus Tiến hành nuôi cấy huyền phù bào tử nấm Paecilomyces lilacinus trên các đĩa Petri môi trường PDA. Sau 5 ngày nuôi cấy nấm Paecilomyces lilacinus trên môi trường PDA tiến hành cấy tuyến trùng cái Meloidogyne sp. (8 tuyến trùng cái/ 1 đĩa) vào mép khuẩn lạc nấm Paecilomyces lilacinus Tiến hành thí nghiệm trong thời gian 5 ngày. Bố trí thí nghiệm gồm 1 đĩa lặp lại 6 lần Sau mỗi ngày, thu kết quả thí nghiệm bằng cách dùng nước cất vô trùng cho vào các đĩa Petri rồi dùng kim mũi mác thu tuyến trùng cái. Quan sát sự lây nhiễm 28
  33. nấm Paecilomyces lilacinus trên tuyến trùng cái bằng cách làm tiêu bản nhuộm với cotton blue và soi dưới kính hiển vi. 2.3.5. Đánh giá hiệu quả phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. hại cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus ở phạm vi đồng ruộng  Mục đích: xác định hiệu quả phòng trị tuyến trùng hại hồ tiêu trên đồng ruộng của chủng nấm Paecilomyces lilacinus.  Thí nghiệm được thực hiện tại xã Ea nam huyện Ea H'leo, tỉnh Đắc Lắc. Khảo nghiệm được bố trí trên những khu vực trồng cây tiêu đang có biểu hiện bị tuyến trùng gây hại ở cấp 2 (>1/3-<2/3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán cây bị vàng, cành bị khô). Các điều kiện trồng trọt như đất đai, phân bón, mật độ cây, chế độ chăm sóc được tiến hành đồng đều ở trên mọi ô khảo nghiệm và phù hợp với tập quán canh tác của địa phương. 2.3.5.1. Điều tra mức độ tuyến trùng gây hại cây hồ tiêu Cách lấy mẫu đất: Mỗi công thức chọn cố định 3 cây để lấy mẫu đất bằng cách đào xung quanh vùng gốc cây 50 cm, sâu 15 cm. Mỗi cây lấy 3 điểm theo hình tam giác đều mà gốc cây là trung tâm. Trộn tất cả các mẫu của 3 cây trong cùng 1 công thức lại cùng với nhau, sau đó lấy ra 1 mẫu đựng trong bao nilon dán nhãn để phân tích. Phương pháp xác định tuyến trùng trong đất: Cân 10 gam đất hòa tan trong 100 ml nước sau đó dùng phương pháp lọc rây và lọc tinh. 2.3.5.2. Đánh giá hiệu lực phòng tuyến trùng Meloidogyne sp. hại cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus Phương pháp bố trí: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 2 công thức, mỗi công thức chọn 12 cây có tỷ lệ bị hại ở cấp 2 (Theo QCVN 01 - 172 : 2014/BNNPTNT) để tiến hành thí nghiệm. 29
  34. Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Paecilomyces lilacinus. Nghiệm thức Công thức Liều dùng NT1 Không sử dụng chế phẩm Thực hiện chế độ tưới tiêu bình thường,5 lít nước/trụ/ngày. NT2 Phun chế phẩm nấm Chế phẩm từ nấm Paecilomyces Paecilomyces lilacinus được pha loãng với nước nồng độ 106 bào tử / ml, tưới đều vào các gốc tiêu. Phương pháp xử lý: Đào rãnh xung quanh gốc cây (cách gốc 20cm), sau đó tưới chế phẩm vào rảnh với liều lượng 100g chế phẩm/9 lít nước/1 gốc. Sau khi xử lý chế phẩm dưới gốc, cả 2 lô thí nghiệm được tiếp tục chế độ tưới tiêu bình thường và lấy kết quả sau 15 ngày xử lí. Sau 15 ngày, mẫu đất được lấy cố định trên 3 cây tiêu cố định. Mỗi công thức theo dõi trên 5 cây tiêu.  Chỉ tiêu theo dõi: Cấp hại của cây tiêu trước và sau khi phun. Mật độ tuyến trùng trong đất xung quanh rễ tiêu Cấp độ bị hại của cây tiêu được đánh giá theo QCVN 01 - 172 : 2014/BNNPTNT Cấp 1 (nhẹ): ≤1/3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán cây bị vàng, cành bị khô. Cấp 2 (trung bình): >1/3 -<2/3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán cây bị vàng, cành bị khô. Cấp 3 (nặng): ≥2/3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán cây bị vàng, cành bị chết khô 30
  35. Phương pháp xác định mật độ tuyến trùng trong đất xung quanh rễ tiêu Mẫu đất được đem về và được cân 10 gram mẫu, được đem đi hòa tan với 100 ml nước trước khi thực hiện Bộ dụng cụ để thực hiện loại bỏ và lọc lấy tuyến trùng bằng các lưới lọc có kích thước khác nhau. 31
  36. Lọc mẫu qua các màng lọc để thu kết quả Tuyễn trùng sẽ được giữ lại trên màng lọc và được xác định bằng cách đếm trên màn/bằng kính hiển vi 32
  37. Đếm mật độ tuyến trùng và quan sát hình thái trên kính hiển vi Đếm mật độ tuyến trùng Meloidogyne spp. trong mẫu đất ở thời điểm trước khi xử lí và sau khi xử lí 15 ngày. Hiệu lực của chế phẩm được tính bằng công thức Henderson – Tilton (1955) × Hiệu lực (%) = (1 + ) × 100 × Trong đó: Ta: Mật độ tuyến trùng của lô thí nghiệm sau xử lí. Tb: Mật độ tuyến trùng của lô thí nghiệm trước xử lí. Ca: Mật độ tuyến trùng của lô đối chứng sau xử li. Cb: Mật độ tuyến trùng của lô đối chứng trước xử lí. 33
  38. 2.4. Phương pháp xử lý số liệu Dùng phần mềm SAS 9.4 và Excel 2016 để xử lý số liệu có được. Tiến hành xử lý số liệu thống kê trong SAS 9.4 (Statistical Analysis System) theo trình tự: - Xử lý số liệu của kết quả nghiên cứu - So sánh các tham số đặc trưng của hai hay nhiều kết quả nghiên cứu. Phép phân tích phương sai ANOVA và giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD với độ tin cậy 95%. 34
  39. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng nấm P1 phân lập được Sử dụng nguồn nấm Paecilomyces lilacinus của Phan Ánh Ngân (2016), sinh viên tiến hành nhiễm lại trên con cái và trứng tuyến trùng, theo dõi trong phòng thí nghiệm Từ những cá thể con cái và trứng bị nghi ngờ bị chết do nhiễm nấm Paecilomyces lilacinus, sinh viên đã tiến hành phân lập lại và sau 7 ngày nuôi cấy, trên môi trường PDA đã xuất hiện tản nấm có màu trắng xốp sau sang màu hồng rồi màu hồng tím như hình Hình 3.1. Nấm Paecilomyces lilacinus trên môi trường PDA Quan sát dưới kính hiển vi dưới vật kính dầu phóng đại 1000x, sinh viên nhận thấy sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể bình hình cổ hẹp với số lượng lớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài. Các thể bình phình ra ở phần gốc và thon nhỏ lại ở cổ. Bào tử trần hình elip đến hình thoi. 35
  40. Hình 3.2. Sợi nấm, cành mang bào tử và bào tử của nấm Paecilomyces lilacinus sau khi tái nhiễm và phân lập lại Điều này trùng khớp với mô tả của Bainer (1907), Trần Văn Mão (2002) và Phan Ánh Ngân (2016). Trên những cơ sở trên, có thể khẳng định chủng nấm này là loài Paecilomyces lilacinus và được dùng cho những thí nghiệm trong đồ án này. 3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất đến mực độ bào tử nấm Paecilomyces lilacinus trong quá trình nhân nuôi Theo Phan Ánh Ngân (2016), môi trường gạo tấm và ngô mảnh là thích hợp nhất cho chủng nấm Paecilomyces lilacinus phát triển. Về chi phí nguyên liệu, giá thị trường của ngô mảnh là 11000 đồng/kg, đắt hơn so với gạo tấm là 9000 đồng/kg. Xét về tính kinh tế khi sản xuất ở quy mô lớn, sử dụng môi trường gạo tấm sản phẩm sẽ có giá thành giảm hơn đáng kể. Vì vậy, sinh viên lựa chọn gạo tấm để làm môi trường nhân nuôi nấm cho các thí nghiệm tiếp theo. Độ ẩm cơ chất ảnh hưởng rất lớn tới mật độ bào tử sau khi nhân nuôi, nếu độ ẩm quá thấp, sẽ làm gạo bị khét trong khi hấp khử trùng, không cung cấp đủ nước cho nấm sinh trưởng và phát triển. Ngược lại khi độ ẩm quá cao, môi trường bị nhão và dính bết lại, hạn chế sự trao đổi oxy của nấm với môi trường bên ngoài. Do đó, 36
  41. thí nghiệm này nhằm mục đích xác định lượng nước bổ sung thích hợp cho quy trình nhân nuôi nấm Paecilomyces lilacinus Bảng 3.1. Đánh giá ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất Độ ẩm Mật độ bào tử (bt/g) 40% 1,47 × 1010 c 60% 3,39 × 1010 a 80% 2,10 × 1010 b 100% 1,19 × 1010 c 120% 0,29 × 1010 d LSD 0,01 0,1533 CV (%) 2,22814 Ghi chú: a, b, c, d là chỉ số thể hiện sự sai khác khi xử lí số liệu thống kê bằng phần mềm SAS 9.4. Trong đó, các công thức có chỉ số giống nhau thì sự sai khác không có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 95%. Những công thức có chỉ số khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa về mặt xử lí thống kê ở mức 95%. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1 cho ta thấy, ở độ ẩm 60%, mật độ bào tử của nấm P.lilacinus đạt được tốt nhất với 3,00 × 1010 bào tử /g. Nhìn bề ngoài, các nghiệm thức có độ ẩm 40% và 80%, có thể thấy mật độ bào tử phát triển khá tốt nhưng thực chất ở phía bên trong cơ chất, nấm không sử dụng hết cơ chất để tăng mật độ bào tử như ở nghiệm thức có độ ẩm 60%. 37
  42. A B C Hình 3.3. Nấm P.lilacinus phát triển trên cơ chất có độ ẩm 40%,80% và 60%. (A: độ ẩm 40%, B: độ ẩm 80%, C: độ ẩm 60%) 3.3. Kết quả mật độ chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus khi bảo quản với các chất mang Việc lựa chọn chất mang thích hợp có ảnh hưởng rất lớn đến việc bảo quản và duy trì hiệu lực của nấm trên đồng. Chế phẩm thô sau khi lên men cần có quy trình bảo quản thích hợp để tồn trữ lâu dài để sử dụng. Sinh viên thực hiện thí nghiệm này nhằm mục đích tìm ra loại chất mang phù hợp để lưu trữ và bảo quản chế phẩm nấm lâu dài. Mật độ bào tử chế phẩm nấm ban đầu được phối trộn đều như nhau ở 38
  43. cả 2 loại chất mang là 3,39x1010 bào tử / g. Sau đó cho 100 gram nấm P.lilacinus trộn với 900 gram chất mang để được mật độ phối trộn ban đầu là 3,39x109 bào tử / g. Sau các mốc thời gian bảo quản, lấy mỗi lần nhắc của các công thức ra một lượng chế phẩm là 10g, sau đó pha loãng và đem đi cấy trang để đếm số bào tử sống ở mỗi công thức. Kết quả thí nghiệm được trình bày bằng bảng dưới đây: Bảng 3.2. Mật độ bào tử chế phẩm P.lilacinus sau 2 tháng tồn trữ khi được phối trộn với chất mang Nghiệm thức Mật độ bào tử 15 ngày 30 ngày 60 ngày ban đầu Bột bắp 3,39x109 3,25x109 a 3,07x109 a 2,72x109 NS Cao lanh 3,39x109 3,20x109 a 2,97x109 b 2,64x109 NS Tỷ lệ hao hụt ở bột bắp 0% 4,2% 9,5% 19,8% Tỷ lệ hao hụt ở cao lanh 0% 5,7% 11,9% 22.2% 39
  44. Hình 3.4. Chế phẩm sau khi được phối trộn với chất mang Do những khó khăn của phòng thí nghiệm, nên sinh viên chỉ mới theo dõi thời gian bảo quản đến 60 ngày. Kết quả cho thấy, sau khi bảo quản trong vòng 2 tháng ở nhiệt độ phòng, lượng bào tử sống ở 2 loại chất mang đều bị giảm nhẹ so với ban đầu. Lượng bào tử sống giảm từ 19,8 – 22,2% tương ứng với chất mang là bột bắp và cao lanh. Số liệu ở bảng 3.2 cũng cho thấy, không có sự sai khác về mật độ bào tử ở các chất mang là cao lanh và bột bắp. 3.4. Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus. Chủng nấm Paecilomyces lilacinus ban đầu đã được chứng minh có khả năng ký sinh trên tuyến trùng bởi Phùng Lê Kim Yến (2014) Phan Ánh Ngân (2016). Vậy chế phẩm của nấm có thể tiêu diệt được tuyết trùng hay không? Để trả lời câu hỏi này, sinh viên tiến hành đánh giá hiệu quả phòng trừ của chế phẩm đối với tuyến trùng Meloidogyne được phân lập từ rễ cây hồ tiêu. Do kết quả duy trì hiệu lực của 2 loại chất mang (bôt bắp và cao lanh) sau 2 tháng bảo quản là như nhau nên sinh viên chọn công thức có cơ chất là cao lanh để đem đi đánh giá hiệu lực diệt trừ tuyên trùng Meloidogyne sp. trong phòng thí nghiệm và trên đồng. Kết quả được trình bày lần lượt như sau: 40
  45. 3.4.1. Trong điều kiện phòng thí nghiệm Bảng 3.3. Tỷ lệ (%) tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị nấm Paecilomyces lilacinus ký sinh. Thời gian Tỉ lệ tuyến trùng cái bị lây nhiễm sau lây nấm Paecilomyces lilacinus (%) nhiễm Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3 Đĩa 4 Đĩa 5 Đĩa 6 Trung bình (ngày) (%) 1 37,5 37,5 25,0 25,0 37,5 25,0 31,25 2 50,0 62,5 50,0 37,5 50,0 50,0 50,00 3 75,0 75,0 75,0 62,5 62,5 75,0 70,83 4 87,5 75,0 87,5 75,0 75,0 87,5 81,25 5 87,5 100 100 87,5 87,5 100 93,75 Kết quả thí nghiệm ở bảng 3.18 cho thấy, chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus. có khả năng ký sinh con cái tuyến trùng cao. Tỷ lệ nấm Paecilomyces lilacinus. ký sinh con cái tuyến trùng cao nhất ở thời điểm 5 ngày sau khi cho lây nhiễm (đạt đến 93,75% sau 5 ngày lây nhiễm) 41
  46. A B C D E F Hình 3.5. Nấm Paecilomyces lilacinus tấn công con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne sp.; (A, B: con cái tuyến trùng trước khi lây nhiễm nấm; C, E: con cái tuyến trùng bị lây nhiễm nấm được soi dưới kính hiển vi; D, F: con cái và con cái mang túi trứng của tuyến trùng bị nhiễm nấm Paecilomyces lilacinus soi dưới kính hiển vi sau khi nhuộm Methylene blue). 42
  47. Hình 3.6. Trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. bị nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh (mẫu được soi dưới kinh hiển vi khi nhuộm với Cottonblue) Qua kết quả quan sát sự lây nhiễm của tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bởi nấm Paecilomyces lilacinus cho thấy sợi nấm Paecilomyces lilacinus ký sinh bao phủ khắp các phần cơ thể tuyến trùng cái. Sự xâm nhập của nấm Paecilomyces lilacinus đã được ghi nhận trong bài báo của tác giả Morgan-Jone et.al (1984), nấm Paecilomyces lilacinus tấn công tuyến trùng cái qua các phần bị trầy xướt, qua hậu môn hoặc âm đạo của tuyến trùng cái. Tuy nhiên một số tác giả khác như Jatala (1986) lại giải thích rằng nấm Paecilomyces lilacinus tấn công cơ thể tuyến trùng cái Meloidogyne sp. chỉ qua những chổ mở của cơ thể. Khi quan sát sự lây nhiễm trên trứng tuyến trùng, nấm Paecilomyces lilacinus cho thấy mạng lưới sợi nấm phân nhánh đến nhiều trứng. Phần cuối của hệ sợi có 1 cấu trúc sợi sắt nhọn được xem như là giác bám giúp bám vào vỏ trứng tuyến trùng. Những trứng bị nấm Paecilomyces lilacinus tấn công có biểu hiện bị teo lại (do áp lực của mạng lưới sợi nấm). Đây là phương pháp xâm nhập vật chủ bằng cơ học (theo giải thích của tác giả Holland et al., 1999). Khi sợi nấm chạm vào bề mặt trứng, nó phản ứng tiếp xúc bằng cách hình thành những giác bám. Sau đó, dùng chất dính kết giúp cho việc kết nối nấm và vật chủ. (Lopez-Llorea et. al, 2002). 43
  48. Bảng 3.4. Tỉ lệ trứng tuyến trùng cái bị nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh Thời gian Tỉ lệ tuyến trùng cái bị lây nhiễm sau lây nấm Paecilomyces lilacinus (%) nhiễm Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3 Trung bình (ngày) (%) 1 12,5 12,5 12,5 12,50 2 25,0 25,0 12,5 20,83 3 37,5 25,0 25,0 29,16 4 62,5 50,0 50,0 54,16 5 87,5 75,0 75,0 79,16 Kết quả ở bảng cho thấy nấm Paecilomyces lilacinus có khả năng kí sinh trên trứng tuyến trùng Meloidogyne sp. với tỉ lệ lên đến 79,16% sau 5 ngày cấy lên trên môi trường PDA có nấm Paecilomyces lilacinus. Điều này hoàn toàn trùng khớp với nghiên cứu của Hussein H. M. Al Ajrami và cộng sự (2016) khi chứng minh rằng tỉ lệ kí sinh trên trứng của nấm Paecilomyces lilacinus rất cao trước khi có sự có mặt của trứng tuyến trùng khi thực hiện thí nghiệm. 3.5. Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus ngoài đồng ruộng Chế phẩm Paecilomyces.lilacinus phối trộn với cơ chất là cao lanh có mật độ 4x109 bào tử / g được chuyển đến vườn trồng tiêu thuộc xã Ea Nam, huyện Ea H’leo, tỉnh Đắk Lắc để thử nghiệm. Sau 15 ngày thử nghiệm, quan sát sự chuyển biến về cấp hại của cây trong vườn hồ tiêu ở các nghiệm thức thí nghiệm cũng như theo dõi mạt số tuyến trùng trong đất. Số liệu được trình bày cụ thể như sau: 3.5.1. Mật số tuyến trùng trong đất Trước khi xử lí bằng chế phẩm, tất cả các cây tiêu đều có hiện tượng cây bị vàng lá, rễ có nốt sưng Theo các tác giả, đây chính là bệnh do tuyến trùng Meloigogyne sp. gây ra (Phạm Văn Biên và CTV, 2003; Nguyễn Thơ, 2008). Kết 44
  49. quả quan sát tuyến trùng di động trong đất ở vùng rễ cây hồ tiêu cho thấy trong đất ở công thức đối chứng và công thức tưới nấm đều có tuyến trùng di động với mật số khoảng 8,5 con/10g đất và không có sự khác nhau về mật số tuyến trùng di động giữa 2 công thức vào thời điểm trước khi tưới nấm. Bảng 3.5. Mật số tuyến trùng di động trong đất ở vùng rễ cây hồ tiêu của các ciing thức Mật độ tuyến trùng trong đất trước xử lý (con / 10g) Tưới nước Tưới nấm Mẫu 1 8,67 ± 1,15 8,33 ± 1,53 Mẫu 2 7,67 ± 1,53 9,00 ± 2,00 Mẫu 3 9,33 ± 1,53 8,33 ± 0,58 TB 8,56 8,55 Tuy nhiên, sau khi phun 15 ngày, mật số tuyến trùng di động trong đất ở công thức xử lý nấm giảm hẳn so với trước khi xử lý và giảm hẳn so với đối chứng của nông dân. Điều nay cho thấy, chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus có khả năng tiêu diệt tuyến trùng di động của loài Meloidogyne sp. gây bệnh trên cây hồ tiêu. Số lượng tuyến trùng di động bị giảm, một phần do tác động trực tiếp của nấm Paecilomyces lilcinus lên tuyến trùng di đông, mặt khác nấm Paelomuces lilacinus còn làm giảm khả năng nở của trứng (Buha and Khan,, 2016). Kết quả này cũng trùng với nhiều nghiên cứu của các tác giải ngoài nước về khả năng phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne của nấm Paecilomyces lilacinus. Đánh giá hiệu quả phòng trừ tuyến trùng di động (Juvenile) loài Meloidogyne sp. gây hại trên cây cà chua trong điều kiện nhà kính, Esfahani và Ansaribour (2006) cho biết, nấm Paecilomyes 45
  50. lilacinus có khả năng phòng từ tuyến trùng di động, giảm khă năng nở của trứng và kích thích sự phát triển của cây. Thử nghiệm hiệu lực phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne trong đất trồng cà chua, Purah và Khan (2016) cho biết, chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus có thể làm giảm từ 25-86% số tuyến trùng có trong đất. Do thời gian và điều kiện có hạn nên sinh viên chỉ phun có 01 lần và theo dõi trong vòng 15 ngày. Hiệu lực phòng trừ tuyến trùng di động của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus P1 đạt được 57,7% sau khi tưới 15 ngày. Bảng 3.6. Hiệu lực phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp của nấm Paecilomyces lilacinus Mật độ tuyến trùng (con / 10g đất) Hiệu lực Công thức Trước tưới Sau tưới 15 ngày (%) Đối chứng 9,11 ± 0,69 7,83 ± 0,29 - Paecilomyces sp 8,56 ± 0,38 3,11 ± 0,38 57,70 3.5.2. Mức độ bị hại và sự phát triển của cây hồ tiêu sau khi xử lý nấm Số liệu ở bảng 3.19 cho thấy, trước khi tiến hành thí nghiệm, các trụ tiêu ở các công thức đối chứng của nông dân và công thức tưới nấm đều bị tuyến trùng gây hại khá nặng, hơn 1/3 số lá bị vàng (hình 3.21), theo QCVN 01 – 172 : 2014/BNNPTNT, toàn bộ các cây thí nghiệm đều bị hại ở cấp 2 (< 1 / 3 - < 2 / 3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán cây bị vàng. Sau 15 ngày thí nghiệm, các cây tiêu của công thức tưới nấm không có biểu hiện vàng thêm mà còn có xu hướng xanh trở lại, cấp hại cũng chỉ ở mức cấp 2. Trong khi đó, công thức đối chứng đã có 60% cây bị chết. Đánh giá hiệu quả phòng trừ tuyến trùng gây sần rễ Meloidogyne sp hại cây hồ tiêu,Jonathan et al (2010) , Elvira et al (2009) cũng cho biết, ngoài khả năng gây chết tuyến trùng, nấm 46
  51. Paecilomyces lilacinus còn kích thích sự phát triển của cây hồ tiêu, giúp cây phát triển và giúp tăng năng suất của cây trồng. Có lẽ nhờ vậy, mà cây hồ tiêu ở công thức phun nấm, phát triển tốt hơn hẳn so với trước khi xử lý và tốt hơn so với những cây còn lại của công thức đối chứng. Tuy chưa đủ thời gian để đánh giá đầy đủ hiệu quả của thí nghiệm, nhưng kết quả bước đầu cho thấy, trên điều kiện đồng ruộng, nấm Paecilomyces lilacinus cho hiệu quả khống chế tuyến trùng gây hại hồ tiêu tốt hơn so với đối chứng phun thuốc hóa học của nông dân (bảng 3.12) Bảng 3.7. Kết quả sử dụng nấm trừ tuyến trùng hại cây hồ tiêu tại xã Ea Nam, huyện Ea H’leo Cấp hại của Cấp hại của Tỷ lệ (%) Công Biện pháp xử lý cây tiêu trước cây tiêu sau cây bị chết thức tưới tưới 15 ngày Đối Không sử dụng 60 2 3 chứng chế phẩm 4 x106 bào tử/ml 2, cây có biểu 0 Tưới và tưới 8 lít mỗi 2 hiện xanh hơn nấm trụ. trước phun 47
  52. Hình 3.7. Sinh viên pha chế phẩm P.lilacinus tưới vào gốc cây hồ tiêu 48
  53. Hình 3.8. Trước và sau khi phun chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 15 ngày 49
  54. Hình 3.9. Sinh viên xem rễ và lấy mẫu đất của cây hồ tiêu để quan sát tuyến trùng Hình 3.10. Quan sát trứng Tuyến trùng Meloidogyne spp. bị nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh trong đất cây hồ tiêu được xử lí với chế phẩm 50
  55. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận - Đã hoạt hóa thành công chủng nấm Paecilomyces lilacinus p1 bằng cách lây nhiễm trên tuyến trùng Meloidogyne sp.gây nốt sần rễ cây hồ tiêu và phân lập lại. - Độ ẩm của cơ chất gạo tấm là 60%, thích hợp nhất cho nấm phát triển, - Sau 2 tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng trên nền chất mang là bột bắp và bột cao lanh, số lượng bào tử của nấm giảm tương ứng là 19,8 và 22%. Không có sự sai khác rõ về sự suy giảm bào tử giữa 2 loại chất mang. - Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus P1 ký sinh 93,75% tuyến trùng Meloidogyne cái ở 5 ngày sau khi phơi nhiễm và tỉ lệ trứng bị chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh lên đến 79,16% sau 5 ngày phơi nhiễm. - Trên đồng ruộng, sau khi tưới 15 ngày, chế phẩm Paecilomyces lilacinus p1 làm giảm 57,7% số tuyến trùng di động so với đối chứng của nông dân . - Sau 15 ngày tưới nấm Paecilomyces lilacinus p1 cây tiêu bị hại có biểu hiện xanh tốt trở lại, trong khi đối chứng đã có 60% cây bị chết. 4.2. Kiến nghị Xác định LD50 và LC50 của nấm Paecilomyces lilacinus trên tuyến trùng, xác định liều lượng sử dụng trong công tác bảo vệ thực vật sao cho hiệu quả và tiết kiệm. Thử nghiệm diện rộng hiệu lực diệt trừ tuyến trùng của nấm Paecilomyces lilacinus. Có thể sử dụng kết hợp nấm Paecilomyces lilacinus với nấm Trichoderma harzianum hoặc với nano đồng hoặc các loại thuốc trừ sâu. 51
  56. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Thị Mai Châm (2014). Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp. trên cây hồ tiêu. Lê Trần Quang Huy (2015). Đánh giá khả năng kí sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại cây trồng của chủng nấm Paecilomyces sp. Bùi Cách Tuyến – Lê Đình Đôn. Cây hồ tiêu Bệnh hại và biện pháp phòng trừ. Nhà xuất bản nông nghiệp. Lê Hữu Phước (2009). Phân lập và chọn môi trường nhân sinh khối ba loài nấm ký sinh tuyến trùng Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok, Beauveria bassiana (Bals.) Vuill và Paecilomyces spp. trên nhóm rau ăn lá ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Trần Văn Mão (2002). Sử dụng côn trùng và vi sinh vật có ích. Tập II. Hà Nội: Nhà xuất bản Nông Nghiệp. TÀI LIỆU TIẾNG ANH Gortari, M. C., 1,3 Galarza, B. C., 1,3 Cazau, M. C.2 and Hours, R. A (2008). Comparison of the biological properties of two strains of Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson associated to their antagonistic effect onto Toxocara canis eggs. Hussein H. M. Al Ajrami, Dr. Abboud Y. El Kichaoui, Dr. Kamal J. Elnabris, 2016. Evaluation the Effect of Paecilomyces lilacinus as a Biocontrol Agent of Meloidogyne javanica on Tomato in Gaza Trip. Huma Abbas , Nazir Javed , Sajid Aleem Khan , Muhammad Kamran , Muhammad Atiq, 2016. Exploitation of Nematicidal Potential of Paecilomyces lilacinus against Root Knot Nematode on Eggplant. 52
  57. M. Nars Esfahani and B. Ansari Pour, 2006. The effects of Paecilomyces lilacinus on the Pathogenesis of Meloidogyne Javanica and Tomato plant growth parameters. Nilsson (1972). A report to the goverment of Botswana on Plant Diseases. Food and Agriculture Organization (FAO) of The United Nations. Rome. R. Segers, T.M. Butt, J.H. Carder, J.N. Keen, B.R. Kerry, J.F. Peberdy. (1998) The subtilisins of fungal pathogens of insects, nematodes and plants: distribution and variation, Mycological Research, 395-402. R. P. Esser and N. E. El-Gholl, 1993. Paecilomyces lilacinus, a fungus that parasitizes nematode eggs. SamsonR. A. (1974) Paecilomyces and some allied Hyphomycetes, Studies in Mycology, 1 –199. TÀI LIỆU INTERNET - Wikipedia. Paecilomyces lilacinus, - Bainier, Paecilomyces spp - a.org/wiki/Purpureocillium&prev=search - - 53
  58. PHỤ LỤC A. XỬ LÝ THỐNG KÊ A1. Khảo sát ảnh hưởng của chất mang đến thời gian tồn trữ chế phẩm sau 15 ngày B. ‘KET QUA MAT DO SAU THOI GIAN XU LY’ The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MOITRUONG 2 BB15NGAY CL15NGAY Number of Observations Read 6 Number of Observations Used 6 54
  59. ‘KET QUA MAT DO SAU THOI GIAN XU LY’ The ANOVA Procedure Dependent Variable: MATDO Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1 2.9746467E15 2.9746467E15 2.16 0.2157 Error 4 5.5107999E15 1.3777E15 Corrected Total 5 8.4854466E15 R-Square Coeff Var Root MSE MATDO Mean 0.350559 1.149364 37117381 3229383838 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F MOITRUONG 1 2.9746467E15 2.9746467E15 2.16 0.2157 55
  60. ‘KET QUA MAT DO SAU THOI GIAN XU LY’ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for MATDO Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 1.378E15 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 8.41E7 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N MOITRUONG A 3251649831 3 BB15NGAY A A 3207117845 3 CL15NGAY 56
  61. A2. Khảo sát ảnh hưởng của chất mang đến thời gian tồn trữ chế phẩm sau 30 ngày ‘KET QUA MAT DO SAU THOI GIAN XU LY’ The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MOITRUONG 2 BB30NGAY CL30NGAY Number of Observations Read 6 Number of Observations Used 6 57
  62. ‘KET QUA MAT DO SAU THOI GIAN XU LY’ The ANOVA Procedure Dependent Variable: MATDO Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1 1.6191449E16 1.6191449E16 35.54 0.0040 Error 4 1.8223132E15 4.5557831E14 Corrected Total 5 1.8013763E16 R-Square Coeff Var Root MSE MATDO Mean 0.898838 0.707063 21344280 3018725589 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F MOITRUONG 1 1.6191449E16 1.6191449E16 35.54 0.0040 58
  63. ‘KET QUA MAT DO SAU THOI GIAN XU LY’ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for MATDO Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 4.556E14 Critical Value of t 4.60409 Least Significant Difference 8.02E7 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N MOITRUONG A 3070673398 3 BB30NGAY B 2966777779 3 CL30NGAY A3 Khảo sát ảnh hưởng của chất mang đến thời gian tồn trữ chế phẩm sau 60 ngày MẬT ĐỘ BAO QUẢN TRÊN CAO LANH VÀ BỘT BẮP SAU 2 THÁNG The SAS System The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MATDO 2 BOTBAP CAOLANH Number of Observations Read 6 Number of Observations Used 6 59
  64. The SAS System The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1 9.3112948E15 9.3112948E15 0.34 0.5903 Error 4 1.0906336E17 2.726584E16 Corrected Total 5 1.1837466E17 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.078660 6.143272 165123712 2687878788 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F MATDO 1 9.3112948E15 9.3112948E15 0.34 0.5903 60
  65. The SAS System The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 2.727E16 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 3.74E8 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N MATDO A 2727272727 3 BOTBAP A A 2648484848 3 CAOLANH 61
  66. The SAS System The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 2.727E16 Critical Value of t 4.60409 Least Significant Difference 6.21E8 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N MATDO A 2727272727 3 BOTBAP A A 2648484848 3 CAOLANH 62