Khóa luận Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium offcinale Kimura et Migo)

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium offcinale Kimura et Migo)

1. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ TUYẾT Tên khóa luận: “NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT ĐIỀU TIẾT SINH TRƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY SINH KHỐI IN VITRO CỦA LAN THẠCH HỘC TÍA (Dendrobium officinale Kimura et Migo)” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: K48 - CNSH Khoa: CNSH & CNTP Khóa học: 2016 - 2020 Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Vũ TS. Nguyễn Văn Hồng Thái Nguyên, năm 2020
2. LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, BanChủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp emđã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium offcinale Kimura et Migo)”. Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệunhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS. Nguyễn Văn Hồng giảng viên Khoa Nông học và thầy giáo TS. Nguyễn Xuân Vũ giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học Côngvà nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đềtài. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗdựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tập thờigian có hạn, trình độ và kỹ năng bản thân còn nhiều hạn chếnênđề tài không thể tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầycôvà các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ, thành công trong cuộc sống. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm Sinh viên thực tập Dương Thị Tuyết
3. DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT BAP : 6-Benzylaminopuri Cs : Cộng sự CT : Công thức CV : Coefficient variance : Hệ số biến động Đ/C : Đối chứng Đtg : Đồng tác giả Kinetin : 6-Furfurylaminopurine GA3 : Gibberellic acid LSD05 : Least significant difference: Giá trị sai khác nhỏ nhất ở mức độ tin cậy 95% MS : Murashige & Skoog’s, 1962 MT : Môi trường NAA : α-Naphthalene acetic acid TN : Thí nghiệm
4. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Thiết bị,dụng cụ nghiên cứu 24 Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày nuôi cấy) Error! Bookmark not defined. Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày nuôi cấy) 34 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía ( sau 30 ngày nuôi cấy) 36 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày nuôi cấy) 38 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày nuôi cấy) 41 Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày nuôi cấy) 44 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng củaồ n ng độ BAP và Kinetin (khi sử dụng phối hợp) kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày nuôi cấy) 46 Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày nuôi cấy) 49 Bảng 4.8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày nuôi cấy) 51 Bảng 4.9 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin (khi sử dụng phối hợp) kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía ( sau 30 ngày nuôi cấy) 53
5. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Hình ảnh cây lan Thạch Hộc Tía 7 Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 26 Hình 4.1: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường nền sau 30 ngày Error! Bookmark not defined. Hình 4.2: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP sau 30 ngày 35 Hình 4.3: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung Kinetin sau 30 ngày 38 Hình 4.4: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP và Kinetin sau 30 ngày nuôi cấy 40 Hình 4.5: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP và NAA sau 30 ngày nuôi cấy 43 Hình 4.6: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung Kinetin và NAA sau 30 ngày cấy 45 Hình 4.7: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP, Kinetin và NAA sau 30 ngày nuôi cấy 47 Hình 4.8: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP và GA3 sau 30 ngày nuôi cấy 50 Hình 4.9: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung Kinetin và GA3 sau 30 ngày nuôi cấy 52 Hình 4.10: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP, Kinetin và GA3 sau 30 ngày nuôi cấy 54
6. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv MỤC LỤC v Phần 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích nghiên cứu 2 1.3. Yêu cầu của đề tài 2 1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Tổng quan về lan Thạch Hộc 4 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc lan Thạch Hộc 4 2.1.2. Đặc điểm hình thái 6 2.2. Giới thiệu về giống lan Thạch Hộc Tía 7 2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố 7 2.2.2. Đặc điểm hình thái 7 2.2.3. Giá trị của lan Thạch Hộc Tía 8 2.3. Nhân giống lan Thạch Hộc Tía 12 2.3.1. Phương pháp nhân giống hữu tính 12 2.3.2. Phương pháp nhân giống vô tính 12 2.4. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 13 2.4.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật 13 2.4.2. Sự phân hoá tế bào 14 2.4.3. Sự phản phân hoá tế bào 14 2.4.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật . 14 2.4.5. Môi trường dinh dưỡng 15 2.5. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu chất điều tiết sinh trưởng trong nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. 18 2.6. Công nghệ sinh khối tế bào thực vật 19 2.6.1. Một số khái niệm cơ bản 19
7. 2.6.2. Ưu điểm của công nghệ sinh khối tế bào thực vật 20 2.6.3. Những khó khăn khi triển khai công nghệ sinh khối tế bào thực vật 21 2.7. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Thạch Hộc Tía 21 Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 24 3.1. Đối tượng, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 24 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 24 3.1.2. Hoá chất sử dụng 24 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 24 3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 24 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu 24 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu. 25 3.2.2. Thời gian nghiên cứu 25 3.3. Nội dung nghiên cứu 25 3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu môi trường nền thích hợp đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Error! Bookmark not defined. 3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số loại Cytokinin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 25 3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng củaự s kết hợp Cytokinin và Auxin ếđ n quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh ốkh i in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 25 3.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng củaự s kết hợp Cytokinin và Gibberellin (GA3) đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh ốkh i in vitro của lan Thạch Hộc Tía 25 3.4. Phương pháp nghiên cứu 26 3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 26 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu 26 3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 26 3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 31 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.Error! Bookmark not defined.
8. 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số loại Cytokinin quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 33 4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 33 4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 36 4.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 38 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Auxin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 41 4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 41 4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 43 4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin (khi sử dụng phối hợp) kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 45 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Gibberellin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 48 4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng củaồ n ng độ BAP kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy tăng sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 49 4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 51 4.4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin (khi sử dụng phối hợp) kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy tăng sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 53 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 5.1. Kết luận 56 5.2. Kiến nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57
9. Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú, từ xa xưa ông cha ta đã có rất nhiều các bài thuốc sử dụng dược liệu để chữa bệnh. Ngày nay, việc sử dụng các loại thực vật cũng như các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật trong công tác phòng trị bệnh, làm thực phẩm chức năng được các nước trên thế giới rất quan tâm. Nhờ có nguồn gốc tự nhiên, cơ thể con người dễ dung nạp, hòa hợp và có những ưu điểm riêng. Hầu hết các vị thuốc trong y học cổ truyền đã được sử dụng từ rất lâu, đều đã được sàng lọc qua nhiều thế hệ [5]. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, những hiểu biết về thành phần hóa học, tác dụng dược lý cũng như cơ chế tác dụng của các loại thảo dược ngày càng được củng cố. Hoa lan là một loài hoa rất được ưu chuộng ở Việt Nam nói riêng và các nước trên thế giới nói chung. Chúng được mệnh danh là nữ hoàng của các loài hoa. Không chỉ ở vẻ đẹp, màu sắc, hương thơm mà còn có giá trị dược liệu. Trong số những loài lan có giá trị dược liệu quý ở Việt Nam, phải kể đến lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium offcinale Kimura et Migo). Lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) hay còn gọi là Thạch hộc thiết bì, Thạch hộc gỉ sắt thuộc chi ThạchHộc, họ lan (Orchidaceae) [4] là một cây dược liệu rất quý, mọc ở vùng cao núi đá, nhiệt đới, á nhiệtđới. Lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium offcinale Kimura et Migo) có nguồn gốc xuất sứ từ rất nhiều nơi đặc biệt vùng Nhiệt Đới và cận Nhiệt Đới. Tạiphân ViệtNam bố chủ yếu ở vùng trung du và miền núi phía Bắc xuất hiện tại các tỉnh như Hòa Bình, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng Lan Thạch Hộc Tía được xếp vào loại cây thuốc giúp đề kháng ung thư vàtăng tuổi thọ [9]. Ngoài ra, lan Thạch Hộc Tía còn là loài cây cảnh, loại thực phẩm tốtcó giá trịkinh tế cao. Lan Thạch Hộc Tía khó sinh sản, mọc chậm, khó trồng.H iện nay, trong quá trình phát triển kinh tế xã hội, đời sống con người càng được
10. nâng cao và nhu cầu sử dụng dược liệu ngày càng gia tăng mà nguồn lan Thạch Hộc Tía không đủ đáp ứng nhu cầu. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy môtếbào thực vật (in vitro) trong nhận giống đã trở nên phổ biến, Nuôi incấy vitro tạo ra những giống cây trông sạch bệnh, chất lượng tốt, đồng đều cao và hệ số nhân lớn trong thời gian ngắn. Bởi vậy, phương pháp nhân giống vô tính in vitro lan Thạch Hộc Tía đã và đang mở ra triển vọng tốt cho việc bảo tồn các loài thực vật quý hiếm và pháttriển các giống lan quý hiếm này. Tuy nhiên, các yếu tố như quang chu kỳ, nhiệt độ,các chất iềuđ tiết sinh trưởng, dịch chiết hữu cơ, thành phần đa lượng hay vi lượng trong môi trường nuôi cấy có vai trò rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Trong đó, các chất điều tiết sinh trưởng ảnh hưởng trực tiếp tớisự sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Xuất phát từ cõ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium offcinale Kimura et Migo)”. 1.2. Mục đích nghiên cứu Xác định được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 1.3. Yêu cầu của đề tài - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ một số loại Cytokinin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. - Xác định được ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Auxin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. - Xác định được ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Gibberellin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Ý nghĩa khoa học của đề tài - Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp xác định được ảnh hưởng của một chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Đây là nguồn dữ liệu khoa học bổ sung cho nhân giống và sản xuất
11. sinh khối lan Thạch Hộc Tía bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Kết quả đề tài cũng góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cây mô lan Thạch Hộc Tía phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo trên đối tượng này trong tương lai. .- Ý nghĩa thực tiễn - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổsungvào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn. - Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiêncứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này. Đề xuất được quy trình nhân nhanh lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium offcinale Kimura et Migo) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, tạo ra sinh khối lan Thạch Hộc Tía góp phần đáp ứng nhu cầu về dược liệu của thị trường đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học.
12. Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về lan Thạch Hộc 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc lan Thạch Hộc 2.1.1.1. Phân loaòi lan Thạch Hộc Theo từ điển Bách khoa dược học của Việt Nam (1999) đã ghi “Thạch Hộc” (Dendrobium nobile Lindt) có tên khác là Kim Thạch Hộc, thuộc chi Thạch Hộc, họ Lan (Orchidaceae) [26]. Lan Thạch Hộc là một cây thảo phụ sinh, mọc bám trên cành cây to hoặc ở vách đáẩ m. Thân dẹt có rãnh dọc chia nhiều đốt, phía cuống thuôn hẹp, phía ngọn dày hơn, màu vàng nhạt. Lá ngắn có bẹ. Hoa màu hồng hoặc trắng pha hồng, mọc thành chùm ngắn ở kẽ những lá đã rụng. Quả dài hình thoi. Các loài Thạch Hộc thường thấy là: - Thạch Hộc Tía (Thiết bì) với đặc trưng vỏ cây có màu xanh tía, là cây thảo bản phụ sinh lâu năm, sống bám vào cây gỗ lớn rừng nguyên sinh có ộđ ẩm cao hoặc ở vách đá ẩm ướt, ưa khí ậh u ẩm và râm mát, có giá trị độc đáo ềv dược phẩm [33]. - Thạch Hộc Lưu tô (đuôi ngựa) phân bố chủ yếu ở Quý Châu, Vân Nam, Quảng Châu ở độ cao 600 - 1.700 m, phụ sinh trên cây gỗ rừng kín hoặc vách đá ẩm ướt, phân bố ở nhiều nước Ấn Độ, Nê Pan, Xích Kim, Bu Tan, Myanma, Thái Lan, Việt Nam. Rất dễ sinh trưởng, mọc nhanh, năng suất cao, cũng có tác dụng nhất định về công năng dược liệu [33]. - Thạch Hộc Kim thoa cũng là cây thảo bản lâu năm, mọc thành bụi, phân bố chủ yếu ở Quý Châu, Tứ Xuyên, Quảng Tây (Trung Quốc), cũng có công dụng làm thuốc chữa một số bệnh [33] - Thạch Hộc Cầu hoa thân đứng hoặc nghiêng, mọc trên cây gỗ rừng độ cao 540-1.800 m, hoa rất đẹp, thường dùng làm cây cảnh [33]. - Thạch Hộc Cổ chùy là cây thảo bản phụ sinh lâu năm, mọc bám vào cây gỗ rừng thường xanh hoặc vách đá rừng thưa, độ cao 500 - 1.600 m, phân bố ở Ấn Độ, Myanma, Thái Lan, Lào, Việt Nam [33].
13. 2.1.1.2. Nguồn gốc lan Thạch Hộc Thuộc lớp một lá mầm: Họ: Orchidales Họ phụ: Epiendroideae Tông: Epidendreae Giống: Dendrobium Họ Orchidales có khoảng 50 chi, 25.000 loài, chiếm vị trí thứ hai sau họ Cúc trong ngành thực vật hạt kín và là họ lớn nhất trong ngành một lá mầm. Các loài trong ngành này phân bố rất rộng, do dó hình thái cấu tạo cũng hết sức đa dạng và phức tạp [11]. Theo Huỳnh Văn Thới (2005) [23], tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Grec Dendron nghĩa là cây gỗ và bios là tôi sống, Dendrobium là giống phụ sinh, sống trên cây gỗ. Có người gọi là Hoàng Lan, có người gọi là Đăng Lan, Dendrobium có trên 1.600 loài và chia thành 2 dạng chính: + Dạng đứng (Dendrobium phalaenopsis) thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm và rất siêng ra hoa: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên. + Dạng thòng (Dendrobium nobile) chị khí hậu mát mẻ: Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp vàng Ở Việt Nam, Dendrobium có đến 100 loài, xếp trong 14 tông được phân biệt bằng thân (giả hành), lá và hoa [11]. Khu phân bố của lan Thạch Hộc thường ở Nam Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Malaixia, Việt Nam và nhiều nước vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, thường gặp mọc trên cây gỗ trong rừng ở độ cao 600-2400 m. Thạch Hộc sinh trưởng trong môi trường tự nhiên với độ ẩm khoảng 70%, lượng mưa khoảng 900 – 1.500 mm, nhiệt độ từ 12 – 18ºC. Do đó nó thường tập trung ở các phần dốc núi râm mát, độ ẩm cao và các vách đá chua [18]. Hiện nay trên khắp thế giới có khoảng 1400 loài Lan, ở Trung Quốc có khoảng 81 loài. Trong chi Thạch Hộc cũng có rất nhiều loài được dùng để chữa bệnh. Tại Trung Quốc, chi Thạch Hộc có khoảng 12 loài phụ và 14 loài chính, trong đó có tới
14. 11 loài được xem là dược liệu quý. Đặc biệt, Thạch Hộc Tía là loài được đánh giá cao nhất và cũng có giá trị kinh tế lớn nhất. Cây Thạch Hộc ở Việt Nam được phát hiện nhiều nhất ở khu vực rừng Quảng Trị, Quảng Nam - Đà Nẵng, Gia Lai, Lâm Đồng [18]. Ở Việt Nam họ lan có nhiều loài, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam, nhiều loài đãị b tuyệt chủng hoặc bị đe dọa tuyệt chủng cần được nhân giống để bảo tồn và phát triển loài lan đó. Dendrobium officinale Kimura et Migo loài lan Thạch Hộc Tía phân bố ở vùng trung du miền núi phía bắc, Việt Nam đang được nghiên cứu nhân giống và nuôi trồng để làm thuốc. 2.1.2. Đặc điểm hình thái Ở Việt Nam các loài lan Thạch Hộc rất đa dạng về hình dáng, tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái chung như sau: Cây Thạch Hộc hay hoàng thảo - Dendrobium nobile Lindl là một loài cây phụ sinh trên những cành cây cao, thân mọc thẳng đứng cao độ 0,3 - 0,6m, thân hơi dẹt, phía trên hơi dày hơn, có đốt dài 2,5-3cm, có vân dọc [21]. Rễ: Thuộc họ sống phụ sinh, treo lơ lửng trên các cây thân gỗ khác. Các loại thân gỗ nạc dài, ngắn, mập hay mảnh mai đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày. ặĐ c biệt đối với lan công nghiệp (nuôi cấy mô) người ta thường sử dụng một số giá thể nuôi như: Dớn, than củi, Rễ làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng, chúng được bao bởi lớp mô hút dày, ẩm. Bao gồm: Những lớp tế bào chết chứa đầy không khí, do đó nó ánh lên màu xámạ b c. Với lớp mô xốp đó ễr có khả năng hấp thu nước mưa chảy dọc dài trên vỏ cây, lấy nước lơ lửng trên không khí [27]. Thân: Thân hơi dẹt, có rãnh dọc, phía trên hơi dày hơn, cóố đ t dài 2,5 - 3,0cm, có vân dọc. Thân Thạch Hộc Tía có màu tía, thân các Thạch Hộc khác có màu xanh [27]. Lá: Lá hình thuôn dài, phía cuống tù, gần như không cuống, ở đầu hơi cuộn hình nón, dài 12cm, rộng 2-3cm trên có 5 gân dọc [27]. Hoa: Cụm hoa mọc thành chùm 2 - 4 hoa trên những cuống dài 2 – 3cm. Hoa đẹp, to, màu hồng hay điểm hồng. Cánh môi hình bầu dục nhọn, dài 4 – 5cm, rộng 3cm cuộn thành hình phễu trong hoa, ở nơi họng hoa điểm màu tía [27].
15. Quả: Quả nang hơi hình thoi, khi khô ựt mở theo các rãnh dọc. Hạt nhiều. Cây ra hoa tháng 3 - 4, có quả vào tháng 5 - 6. Loài này mọc hoang ở khắp các miền rừng núi các tỉnh miền Bắc, thường được trồng để làm cảnh vì dáng câyẹ đ p, hoa đẹp [27]. 2.2. Giới thiệu về giống lan Thạch Hộc Tía 2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố Cây Thạch Hộc Tía có tên khoa học là Dendrobium officinale Kimura et Migo, có tên gọi khác là Thạch hộc thiết bì, Hắc tiết thảo, Thiết bì lan là cây thảolâunăm thuộc chi Thạch Hộc, họ Lan (Orchidaceae) [5] phân bố tự nhiên chủ yếu ở vùng rừng có độ cao 1.000 - 3.400m so với mực nước biển, thường phụ sinh vào cây gỗ hoặc vách đá có mọc rêu dưới tán rừng. Trong điều kiện môi trường tự nhiên với độ ẩm 70%, nhiệt độ không khí bình quân năm 12 - 18 độ C, lượng mưa 900 - 1.500mm, thường tập trung sống ở phần dốc núi râm mát, độ ẩm cao và vách núi đá. CâyThạch Hộc Tía phân bố ở Việt Nam, Lào, Trung Quốc, Myanmar và nhiều nước nhiệt đới, cận nhiệt đới. Hình 2.1: Hình ảnh cây lan Thạch Hộc Tía Tại Việt Namphân bố chủ yếu ở vùng trung du và miền núi phíaxuất Bắc, hiện tại các tỉnh như Hòa Bình, Lào Cai, Hà Giang, CaoBằng 2.2.2. Đặc điểm hình thái Cây Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) là một loài cây phụ sinh trên những cành cây cao, thân mọc thẳng đứng cao độ 0,3 - 0,6 m, thân hơi dẹt, phía trên hơi dày hơn, có đốt dài 2,5 – 3cm, có vân dọc. Theo Trần Văn Bảo (1999) một số Dendrobium lá có ở các mầm non, là loại chóng tàn chúng vàng úa và
16. rụng vào mùa thu, thân phì to giống như củ không có lá là nơi dự trữ năng lượng. Lá hình thuôn dài, phía cuống tù, gần như không cuống, ở đầu hơi cuộn hình nón, dài 12 cm, rộng 2 – 3cm trên có 5 gân dọc [3]. Cụm hoa mọc thành chùm 2 - 4 hoa trên những cuống dài 2 – 3cm. Hoa đẹp, màu vàng có điểm hồng nhưng nhỏ. Cánh môi hình bầu dục nhọn, dài 4 – 5cm, rộng 3 cm cuộn thành hình phễu trong hoa, ở nơi họng hoa điểm màu tía. Theo Dương Công Kiên (2006), quả chứa 10.000-100.000 hạt đôi khi đến 3 triệu hạt có kích thước rất nhỏ nên phôi hạt chưa phân hóa. Quả nang hơi hình thoi, khi khô tự mở theo các rãnh dọc. Hạt nhiều, cây ra hoa tháng 3 - 4, có quả vào tháng 5 - 6. Loại này được nghiên cứu nhân giống nhằm mục đích làm thuốc, làm cảnh vì có dáng cây và hoa rất đẹp [10]. 2.2.3. Giá trị của lan Thạch Hộc Tía 2.2.3.1. Thành phần hóa học Thạch Hộc Tía làm thuốc có nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học quý. Trong Thạch Hộc (Dendrobium nobile) có chất nhầy và một chất alkaloit gọi là dendrobin khoảng 0,3%, có công thức thô C16H25O2. Theo báo cáo của Viện nghiên cứu y học, hệ dược học (Bắc Kinh, 1958) thì trong Thạch Hộc Tía giàu polysacarit, alkaloit, các acid amine và nhiều chất khoáng kali, canxi, magie, mangan, đồng, titan và nhiều nguyên tố vi lượng, trong đó polysacarit chiếm 22%, hàm lượng các acid amine như glutamic, asparagic, glucin chiếm tới 35% tổng lượng acid amine. Ngoài ra Thạch Hộc Tía còn có những hợp chất đặc thù như phenanthryn, bibenzyl, keton, ester và các chất nhầy, hợp chất amidon. Trong thân Thạch Hộc Tía có hàm lượng alkaloit sinh học chiếm tới 0,3%, trong đó những chất amine đã được giám định cấu trúc gồm dendrobine, dendramine, nobilonine, dendrin, 6-hydroxy-dendroxine, shiunin, shihunidine và muối amoniac N-methyl-dendrobium, 8-epidendrobine, các chất này có vị hơi đắng [07]. 2.2.3.2. Công dụng dược lý chủ yếu của lan Thạch Hộc Tía Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Thạch Hộc Tía tốt cho bổ âm sinh dịch, chữa chứng hỏa hư, trị đau dạ dày, đau thượng vị, bồi bổ đôi mắt. Ngoài ra, nó còn có tác dụng chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn
17. mạch máu và kháng đông máu, được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng, làm các bài thuốc và ặđ c biệt là chữa bệnh tiểu đường, cao huyết áp [16]. Các nghiên cứu gần đây khẳng định giá trị dược học của loài dược thảo này về khả năng kháng khuẩn, chống oxy hóa, tăng cường hệ miễn dịch, ức chế tế bào ung thư . Những thành phần có tác dụng dược lý tốt của tiên thảo Thạch Hộc bao gồm: polisaccarit, alkaloid, axit amin, nguyên tố vi lượng và các hợp chất phenanthrene. Tiên thảo Thạch Hộc có tác dụng dược tính phổ biến: tăng cường sức miễn dịch cơ thể, kháng ưng thư, trống Oxy hóa, chống lão hóa, khống chế ngưng kết tiểu cầu, giúp dãn nở mạch máu, xúc tiến bài tiết dịch tiêu hóa, giảm lipids, giảm đường huyết và hạ nhiệt, giảm đau. Loại dược liệu có tác dụng thần kỳ này đang ngày được sự quan tâm và coi trọng của con người. Từ xa xưa, Thạch Hộc Tía đã trở thành thảo mộc quý của Trung Quốc mà chỉ các gia đình có nhiều tiền mới được dùng. Trẻ con mới sinh của nhà giàu được uống bát nước đầu tiên là bát nước Thạch Hộc, người sắp qua đời cũng được uống nước Thạch Hộc, nên nước Thạch Hộc Tía được gọi là nước cứu mệnh. Từ thời Đường, Tống về sau, Thạch Hộc được làm cống phẩm đối với nhà vua. Hiện nay, lan Thạch Hộc Tía chỉ có Trung Quốc đang phát triển, tuy nhiên sản lượng đưa ra thị trường còn rất khiêm tốn, sau mấy năm nữa sản lượng có thể tăng lên nhiều, giá bán có thể giảm xuống, nhưng hiệu quả vẫn cao hơn nhiều so với nhiều cây trồng khác. Ở Trung Quốc đã có nhiều sản phẩm thuốc từ Thạch Hộc bán ra thị trường trong và ngoài nước, đặc biệt là xưởng thuốc Kim Năng ở Nam Kinh tỉnh Giang Tô, trải qua 15 năm nghiên cứu bào chế, được thuốc tiêm: “Mạch lộ ninh”, từ năm 1982 đến nay được đánh giá là thuốc điều trị có hiệu quả đối với bệnh cứng hóa động mạch, viêm màng não. Xưởng thuốc này cũng đã cho ra đời các loại thuốc tiêm, thuốc uống, viên nang đều mang tên “Mạch lộ ninh”. Cùng với sản phẩm thảo dược truyền thống làm từ Thạch Hộc là “Phong đấu Thạch Hộc” được coi là tuyệt phẩm của thảo dược [24].
18. 2.2.3.3. Giá trị sử dụng của Thạch Hộc Tía Giá trị của Thạch Hộc có 2 loại công năng chủ yếu: - Làm thuốc: Thạch Hộc Tía có giá trị độc đáo và công năng bảo vệ sức khỏe, đã trở thành sản phẩm bổ dưỡng từ lâu đời. Nghiên cứu về dược lý hiện đại, Thạch Hộc Tía có tác dụng chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn mạch máu và kháng đông máu, được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng và làm các bài thuốc, các lang y từ xưa đã sử dụng Thạch Hộc trong các vị thuốc chữa ho, đầy hơi, hư lao, người gầy mòn những bài thuốc đó đã được đúc rút từ nhiều kinh nghiệm và được áp dụng để chữa bệnh hiệu quả như: Sử dụng 6g Thạch Hộc làm một vị chủ đạo trong thang thuốc chữa ho, đầy hơi với liều lượng ngày uống 3 lần; cũng sử dụng 6g Thạch Hộc trong thang thuốc chữa chứng hư lao, người gầy mòn. Thanh nhiệt bảo tân thang: Thạch Hộc tươi 12g, sinh địa tươi 12g, mạch đông tươi 12g, thiên hoa phấn 12g, tang diệp 8g, sắc uống. Có thể dùng Thạch Hộc 15g, sắc uống. Trị chứng bệnh nhiệt phạm đến tân dịch, môi khô, miệng khát. Thạch Hộc 40g, thục địa 50g, khiếm thực 40g, hoài sơn 30g, tang thầm 20g, tỳ giải 20g. Mát dạ dày, chống nôn: Trị chứng dạ dày nóng, nôn mửa, chân răng sưng, trong miệng loét, dùng “Thạch Hộc thanh vị thang”: Thạch Hộc 12g, phục linh 12g, quất bì 8g, chỉ xác 8g, biển đậu 12g, hương nhu 8g, đơn bì 12g, xích thược 12g, cam thảo 4g, sắc uống khi nước thuốc còn nóng. Trị chứng sốt âm ỉ sau khi lên sởi, nôn mửa. Thạch Hộc Tía có thể dùng đơn độc hoặc phối trộn với các dược liệu khác, đã có hơn 100 bài thuốc từ Thạch Hộc được thị trường đón nhận. Trong dược điển có đề cập đến nhiều loài Thạch Hộc nhưng tốt nhất vẫn là Thạch Hộc Tía [08]. - Làm thực phẩm: Cách sử dụng làm thực phẩm có nhiều cách như nấu súp với hồng sâm, với bách sa sâm lợi phổi sinh tân. Ngoài ra có thể nấu cháo Thạch Hộc, trà Thạch Hộc và nhiều món ăn khác. Những năm gần đây công năng làm thực phẩm chức năng đã được khám phá thêm, là sản phẩm thiên nhiên an toàn và bổ dưỡng. Thạch Hộc Tía có vị hơi ngọt hơi đắng vào kinh phế, vị, thận, công năng tư âm, thanh nhiệt, chỉ khát, hư hao, gầy yếu, miệng khô [07].
19. Trong Thạch Hộc Tía có nhiều hợp chất có giá trị dược lý. Sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại, trong Thạch Hộc Tía đã phân lập được 72 hợp chất đơn thể, trong đó đã giám định được 63 hợp chất và phát hiện thêm 18 hợp chất mới gồm các loại: Hợp chất loại Bibenzil và các dẫn xuất gồm 27 loại: Thạch Hộc Tía (gọi tắt là THT) A, THT.B, THT.C, THT.D, THT.E, THT.S, THT.G, THT.H, THT.I, THT.J, THT.K, THT.L, THT.M, THT.N, THT.O, THT.P, THT.Q, v.v. Hợp chất Phenol có 12 loại; hợp chất Lignanoid có 4 loại; hợp chất lacton có 2 loại; hợp chất dihydroflavon có 2 loại; các hợp chất khác có 16 loại và 18 hợp chất mới. Giám định hoạt tính kháng oxy hóa và kháng ubướu, đã phát hiện phần lớn các hợp chất loại bibenzil đều có hoạt tính kháng oxy hóa, có 2 loại hợp chất Bibenzil có hoạt tính kháng u bướu [07]. 2.2.3.4. Giá trị kinh tế của lan Thạch Hộc Tía. Thạch Hộc Tía trồng một lần có thể thu hoạch 6 năm, đầu tư ban đầu không quá lớn mà đến năm thứ 2 có thể thu hồi vốn, từ năm thứ 3 có lãi. Trong điều kiện thâm canh, năng suất tươi khoảng 5 tấn/ha/năm với giá bán khoảng 3 triệu đồng/kg, doanh thu đạt 15 tỷ đồng/ha/năm. Thị trường tiêu thụ là khả quan, nếu chế biến sâu, thị trường càng lớn và hiệu qủa càng cao, bao gồm thị trường nội địa, thị trường Đông Nam Á, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và châu Âu, châu Mỹ. Thạch Hộc chế biến thành phong đấu, giá xuất khẩu vào những năm 80 thế kỷ trước đạt mức 3.000USD/kg. Ở Đài Loan giá phong đấu từ 1.000 - 3.000USD/kg. Giá phong đấu hảo hạng cực kỳ đắt, ở thị trường Trung Quốc khoảng 30 đến 60 triệu VNĐ/kg. Giá 1 cây Thạch Hộc tươi 3 tuổi có giá 25.000 VNĐ – 35.000 VNĐ, 1 ha trồng 1 triệu cây thạch hộc, có thể thu được 25-30 tỷ trong 3 năm. Ở thị trường Trung Quốc giá phong đấu Thạch Hộc cao cấp là 60 triệu đồng/kg [6]. 2.2.3.5. Thị trường cây Thạch Hộc Tía Thạch Hộc Tía đã được sản xuất nhưng với quy mô rất nhỏ, không đáp ứng được nhu cầu của thị trường trong nước. Hàng năm các công ty sản xuất dược phẩm nước ta phải nhập hoàn toàn nguyên liệu lan Thạch Hộc Tía từ Trung Quốc với giá thành không hề rẻ. Bên cạnh đó một số lượng lớn lan Thạch Hộc Tía cũng được tư
20. thương đưa vào thị trường tự do nhưng không kiểm soát được chất lượng và nguồn gốc gây thiệt hại cho người tiêu dùng. Do đó, nhu cầu của thị trường về lan Thạch Hộc Tía là rất lớn. Việc trồng lan Thạch Hộc Tía có thể tiến hành ở các vùng sâu, vùng xa. Chi phí đầu tư ban đầu không lớn, rủi ro ít mang lại hiệu quả sản xuất khá cao (khoảng 30%), người dân có thể tận dụng lao động lúc nông nhàn, kể cả người già, trẻ em cùng tham gia. Cây Thạch Hộc Tía sinh trưởng nhanh, thân to mập, sau trồng 1,5 đến 2 năm có khả năng cho thu hái sản phẩm đạt năng xuất cao và chất lượng tốt. Trên thị trường, thân cây tươi lan Thạch Hộc thiết bì có giá bán khoảng 3 triệu đồng/kg và giá bán 1 cây Thạch Hộc Tía tươi 3 tuổi có giá 25.000 VNĐ – 35.000 VNĐ, 1 ha trồng trên 500.000 cây Thạch Hộc thiết bì có thể thu được 15 tỷ đồng/3 năm [6]. 2.3. Nhân giống lan Thạch Hộc Tía 2.3.1. Phương pháp nhân giống hữu tính Cơ chế sinh sản hữu tính của lan Thạch Hộc cũng giống như một số loài cây khác, bao gồm: Quá trình hình thành giao tử và thụ tinh khi hạt phấn chín tiếp xúc với núm nhụy nhờ côn trùng hay con người. Núm nhụy tiết ra các hoocmon sinh trưởng nhờ vậy mà hạt phấn có thể nảy mầm được. Sau đó, hạt phấn này theo trục hợp nhụy xuống bầu noãn để tinh tử kết hợp với tế bào trứng tạo nên hợp tử. Bầu noãn lớn dần lên, cánh hoa và đài hoa héo đi, quả dần dần được lớn từ bầu noãn trương phồng [2]. 2.3.2. Phương pháp nhân giống vô tính Nhân giống vô tính là quá trình nuôi cấy thực vật trong các điều kiện tự nhiên. Bao gồm các phương pháp sau: + Phương pháp cơ học (chiết ngọn, xiết ngọn) Khi cây đạt đến một kích thước mong muốn, ta sẽ cắt phần ngọn có rễ đem trồng vào chậu mới. Khi cắt, dụng cụ phải được khử trùng bằng nhiệt, sau đó bôi vadolin có trộn zineb, sơn hoặc vôi vào vết cắt để tránh nhiễm trùng và cuối cùng thay chậu cho cây.
21. + Phương pháp kích thích tố Một số loại kích thích tố được dùng có hiệu quả rõ rệt và nhanh chóng tới sự mọc chồi các loài lan. Có thể phun 2 lần cách nhau 5 ngày để có kết quả chắc chắn. Chất được dùng thuộc nhóm cytokinin (BAP, Kinetin) với hàm lượng 5ppm. + Phương pháp tạo cây con trên phát hoa Sau khi cây lan trổ hoa, cắt bỏ phần ngọn phát hoa chỉ để lại 4 mắt phía gốc rồi bôi Ianilin có bổ sung thêm acid cinnamic 50mg/ml + BAP 5mg/ml. Sau 4-8 tuần, cây con sẽ mọc ở vị trí mắt và rễ được tạo ra khi cây con lớn dần. Lúc này có thể cắt phát hoa và đem trồng cây con trong chậu. Về mặt lý luận sinh học cơ bản: đã ởm ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống. Thực tế đã cho phép chúng ta tách và nuôiấ c y trước hết là mô phân sinh (meristem) rồi từ đó cho ra nhómế t bào không chuyên hoá gọi là mô sẹo (callus) và từ mô sẹo thì có thể kích thích tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh. Về mặt thực tiễn sản xuất: Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng quý, có giá trị kinh tế cao. Ngoài ra, bằng phương pháp này chỉ sau thời gian ngắn chúng ta có thể tạo được sinh khối lớn có hoạt chất sinh học được tạo ra vẫn giữ nguyên được hoạt tính của mình. 2.4. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.4.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật Gottlieb Haberlandt (1902) nhà thực vật học người Đức là người đầu tiên khởi xướng ý tưởng nuôi cấy mô – tế bào thực vật. Ông đưa giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách“ Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời”. Theo ông, mỗi tế bất kì của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thànhmột cơ thể hoàn chỉnh [21]. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêngrẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thuận lợi, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành mộtcáthể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào và là cơ sở lý luậncủaphương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
22. 2.4.2. Sự phân hoá tế bào Sự sinh trưởng của tế bào gồm hai giai đoạn: Giai đoạn phân chia tế bào vàgiai đoạn dãn của tế bào. Trong hai giai đoạn này tế bào chưa có những đặc trưngriêng về cấu trúc và chức năng [21]. Sau đó, các tế bào bắt đầu phân hoá thành các mô chuyên hoá để đảm nhậncác chức năng khác nhau, các tế bào trong giai đoạn này có đặc trưng riêng về cấu trúc và chức năng [21]. Có thể nói rằng sự phân hoá tế bào là sự chuyển tế bào phôi sinh thành cáctế bào mô chuyên hoá [21]. 2.4.3. Sự phản phân hoá tế bào Sự phản phân hoá tế bào là quá trình ngược lại với sự phân hoá tế bào.Cáctế bào đã phân hoá trong các mô chức năng không mất đi khả năng phân chia của mình, trong những điều kiện thích hợp, chúng có thể quay lại đóng vai trò như các môphân sinh và có khả năng phân chia để tạo ra các tế bào mới[21]. 2.4.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.4.4.1. Vật liệu nuôi cấy Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô – tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá ), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm ), các cơ quan dự trữ (củ, thân, rễ ). Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau, trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương pháp phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hoá chấtcó khả năng tiêu diệt vi sinh vật. Hoá chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện:Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu. Hiệu quả vôtrùng
23. tuỳ thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật của hoá chất. Một số hoá chất thường được sử dụng hiện nay đểvôtrùngmẫulà: Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaClO-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2- thuỷ ngân clorua, chất kháng sinh(gentamicin, ampixilin ). 2.4.4.2. Điều kiện nuôi cấy - Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấy được tiến hành trong điều kiện vô trùng gồm buồng cấy vô trùng, các dụngcụ cấy vô trùng và môi trường cấy vô trùng nhằm đảm bảo mẫu cấy sẽ không bịnhiễm vi sinh vật. Để tạo điều kiện vô trùng, buồng cấy phải dùng đèn tử ngoại chiếu trong 30 phút sau đó được lau sạch bằng cồn 90°, dụng cụ và môi trường nuôi cấy thường được khử trùng ở 121°C trong 25-30 phút. - Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định về ánh sáng và nhiệt độ. 2.4.5. Môi trường dinh dưỡng Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ phận, các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫucấy và mục đích nuôi cấy như duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh[23]. Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồmcác thành phần chính sau: 2.4.5.1. Nguồn Cacbon Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro không cón khả năng tự dưỡng do không tiến hành quang hợp đầy đủ. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôicấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn Cacbon cung cấp cho môi trường nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là saccharose với hàm lượng từ20- 30g/l. Ngoài ra còn có thể sử dụng các loại đường khác như fructose, rafinose, sorbitol, glucose, maltose, lactose những loại đường này chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt.
24. 2.4.5.2. Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng Các chất vô cơ bao gồm thành phần khoáng đa lượng và khoáng vi lượng có trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng như là thành phần cơ bản để tổng hợp chất hữu cơ [23]. Các dạng ion của muối khoáng đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hoà áp suất thẩm thấu và điện thế màng. - Nguyên tố đa lượng: Quan trọng nhất là các nguyên tố: N, P, K, Mg, Ca, Na, S [12]. - + Nitơ: Thường được sử dụng ở dạng NO3 hoặc NH4 , hầu hết các loại thực vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hoá và tổng hớp nên các sản phẩm hữucơ. Phospho: Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có tác dụngnhư hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường. Kali: Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O Canxi: Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O Magie: Sử dụng chủ yếu là MgSO4 Lưu huỳnh: Chủ yếu là SO4 - Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni các nguyên tố vi lượng bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế bào nuôi cấy [12]. 2.4.5.3. Vitamin Hầu hết các tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp vitamin nhưng không đủ về lượng nên cần bổ sung, nhất là nhóm vitamin B [12]. - Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid [12]. - Vitamin B6 (Pyridocinen): Là coenzzyme quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất [12]. - Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp [12. - Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hyđratcacbon [12].
25. 2.4.5.4. Các chất hữu cơ tự nhiên - Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin. - Dịch thuỷ phân casein: Chứa nhiều amino acid. - Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B. - Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, khoai tây, nước ép chuối xanh . 2.4.5.5. Các thành phần khác - Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm một số chất hữu cơ như acid hữu cơ, acid béo, cùng một số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấp một số chất dinh dưỡng cho tế bào, mô nuôi cấy [12]. - Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức chế sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Ngoài ra, có thể sử dụng một số chất chống oxy hoá khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascorbic [12]. 2.4.5.6. pH của môi trường Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡng của mẫu từ môi trường nuôi cấy. Đa số pH của môi trường được điều chỉnh trong khoảng từ 5,5-6,0. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm do mẫu nuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ. 2.4.5.7. Các chất điều hoà sinh trưởng Các chất điều hoà sinh trưởng được chia thành 2 nhóm đó là: Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm chất ức chế sinh trưởng. Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật,nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng. - Nhóm Auxin: Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật. Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất. Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách). Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ. Ngoài ra, auxin còn tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm sự rụng lá [8].
26. - Nhóm Cytokinin: Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đỏi chất. Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bênvàức chế ưu thế đỉnh. Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin. Ngoài ra cytokinin còn làm chậm sự già hoá [8]. - Nhóm Gibberellin: Giberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hoá phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tếbào, tăng kich thước của chồi nuôi cấy [8]. 2.5. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu chất điều tiết sinh trưởng trong nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật. Hiệuquả của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điều hoà sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy. Dựa vào hoạt tính sinh lý có thể phân chất điều hoà sinh trưởng làm 2nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm ức chế sinh trưởng. Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường đượcsử dụng. - Nhóm Auxin: Được phát hiệ lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch, Sau đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này. Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong phấn hoa. Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật. Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu làtính hướng sáng và hướng đất. Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách). Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễphụdo auxin kích thích sự phân chia của tế bào trụ bì– nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ biểu bì, Ngoài ra, auxin còn tác động đến việc hìnhthành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm sự rụng lá [8].
27. Các auxin thường được sử dụng là: NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA (các auxin tự nhiên). Hoạt tính của các chất này được xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA, 2,4D. IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân huỷ trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy môi. NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên chất 2,4D làchất dễ gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus [8]. - Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích. Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ của hạt ngô non. Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim. Zeain có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn. Trong thục vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh. Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đỏi chất. Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạorễ, ngược lại sẽ hình thành chồi. Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ứcchếưu thế đỉnh. Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin. Ngoài ra cytokinin còn làm chậm sự già hoá [8]. Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng phổ biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin vơi tỷ lệ thích hợp có khảnăng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea - Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu từ dịch tiết của nâm bởi các nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Giberellin được tổng hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Giberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hoá phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kich thước của chồi nuôi cấy.GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất [8]. 2.6. Công nghệ sinh khối tế bào thực vật 2.6.1. Một số khái niệm cơ bản Sinh khối tế bào thực vật là kỹ thuật nuôi cấy và tạo khối lượng lớn tếbàothực vật trong môi trường dinh dưỡng phù hợp và điều kiện nuôi cấy vô khuẩn mà không cần thâm canh gieo trồng. Các tế bào khi nuôi cấy vẫn giữ nguyên được các đặctính
28. vốn có ban đầu, đặc biệt là các hoạt chất hay các chất chuyển hóa thứ cấp sinhratừ các tế bào gần như được giữ nguyên [13]. Nguyên tắc của công nghệ sinh khối dựa trên cơ sở tính toàn năng (totipotent) và tính biệt hóa của một số tế bào thực vật.Khi được đưa vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện thích hợp, các tế bào thực vậtcó thể phát triển thành một cơ quan, một cây hoàn chỉnh hoặcmột khối lượng lớn dòng tế bào đó. Dựa trên cơ sở đó, công nghệ nuôi cấy mô thực vật có thể tạo racâytừ đỉnh sinh trưởng được tách ra. Sau đó, cây được nhân nhanh tạo ra nhiều mầm cây con, từ đó có thể kích thích tạo rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh.Người ta nuôi cấy tạo mô sẹo (callus) từ một mô bất kì của cây. Sau đó, biệt hóa thành môsinh trưởng, tạo mầm, tạo rễ và cuối cùng cũng phát triển thành một cây mới hoàn chỉnh [15]. Khác với nuôi cấy mô, công nghệ sinh khối tế bào thực vật không nuôi cấytạo ra cây hoàn chỉnh mà chỉ nuôi các tế bào để tạo ra sinh khối và có thể sửdụngcho chiết tách các hoạt chất sinh học. Quá trình này cũng bắt đầu từ việc tạo ra callustừ những mô khác nhau của thực vật. Sau đó, chúng được làm mất tính biệt hóa vàđược thuần hóa trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Cuối cùng là tăng khối lượng trên hệ thống bình nuôi cấy (bioreactor). Trong quá trình tạo sinh khối tế bào thực vật,đặc tính của tế bào được giữ nguyên như ban đầu. Các quá trình sinh học của tếbàovẫn xảy ra như đối với tế bào khi còn tồn tại trong cây tự nhiên, trong đó có việc tổnghợp và tích lũy hoạt chất [28]. 2.6.2. Ưu điểm của công nghệ sinh khối tế bào thực vật Công nghệ sinh khối tế bào thực vật không chịu tác động của các yếu tố tựnhiên như địa lý, khí hậu, thổ nhưỡng, bệnh dịch, thiên tai do toàn bộ quy trình tạo sinh khối được tiến hành trong phòng thí nghiệm hoặc nhà máy. Điều này giúp khắcphục được ảnh hưởng bất lợi của điều kiện tự nhiên tới năng suất, chất lượng sản phẩmvà loại bỏ được yếu tố thời vụ như khi gieo trồng nên giúp chủ động được nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất [12]. Thời gian sản xuất nguyên liệu theo công nghệ sinh khối tế bào rút ngắn hơn nhiều so với gieo trồng tự nhiên. Giai đoạn nghiên cứu từ khi tiến hành tạo callus (giai đoạn đầu tiên của quy trình) đến việc nuôi cấy trong môi trường lỏng phải mất khá nhiều thời gian. Tuy nhiên, sau khi đã lựa chọn được điều kiện,
29. môi trường nuôi cấy thì thời gian cho sản xuất một mẻ sinh khối thường khoảng từ 15 - 50 ngày. Như vậy, thời gian đã rút ngắn rất nhiều so với trồng cây ngoài tự nhiên nên chủ động được nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất. Theo Guilk và cs (2006) trong nghiên cứu xây dựng quy trình tạo sinh khối dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don.) sản xuất alcaloid nhân indole, thời gian cho 1 mẻ nuôi cấy sản phẩm là 20 ngày [28]. Trong khi sản xuất sinh khối thông đỏ Châu Âu (Taxus baccata) cần thời gian thích hợp cho 1 chu kỳ nuôi cấy trong môi trường lỏng là 28 ngày [31]. Chất lượng của sản phẩm sản xuất theo công nghệ sinh khối tế bào thực vật rất ổn định. Vì các yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ oxy hòa tan, thành phần môi trường, cường độánh sáng đều được kiểm soát chặt chẽ đảm bảo cho tế bào phát triển tốt, hàm lượnghoạt chất ổn định. Do đó, sản phẩm thu được có chất lượng ổn định đáp ứng được yêu cầu sản xuất theo tiêu chuẩn GMP [14], [29]. Trong quá trình tạo sinh khối tế bào thực vật, có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp để các hoạt chất có hàm lượng caohơn so với nuôi trồng ngoài tự nhiên. Khosroushahi [31] khi nuôi cấy tế bào thông đỏ đã tối ưu điều kiện và môi trường nuôi cấy. Kết quả hàm lượng paclitaxel đã cải thiện rất nhiều so với ban đầu. Đối với các dược liệu quý hiếm sản xuất theo công nghệnày thì giá thành sản xuất sẽ thấp hơn. Vì trong thờigian ngắn có thể tạo ra một khối lượng lớn sản phẩm trong khi chi phí cho nuôi cấy thấp [13], [29]. 2.6.3. Những khó khăn khi triển khai công nghệ sinh khối tế bào thực vật Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào, đó là thành phầnmôi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, ánh sáng, nồng độ oxy hòa tan, pH môi trường và đặc điểm cấu tạo của hệ thống bình nuôi cấy). Chi phí đầu tư dây truyền sảnxuất tốn kém do đặc thù của nuôi cấy tế bào thực vật khác với nuôi cấy nấm vàvikhuẩn nên hệ thống các bình nuôi cấy (bioreactor) cần phải thiết kế riêng cho phù hợpvới từng loại tế bào [30]. Hàm lượng các hoạt chất trong sinh khối tế bào còn thấp, đặc biệt là với các tế bào có nhiều nhóm hoạt chất cùng tồn tại thì việc kích thíchtăng riêng rẽ hàm lượng từng nhóm chất rất khó khăn [37]. Những khó khăn trên đang được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu khắc phục. 2.7. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Thạch Hộc Tía
30. Thông thường Dendrobium officinale Kimura et Migo có thể được nhân giống bằng gieo trồng hạt hay tách cây con đã trưởng thành ra khỏi cây mẹ. Tuy nhiên, các phương pháp này cho hiệu quả nhân giống thấp nên không đáp ứng nhucầu của thị trường. Vì vậy, phương pháp nuôi cấy môtế bào thực vật cho phép tạo ra một lượng lớn cây con trong thời gian ngắn đã trở thành một giả pháp lý tưởng đểđápứng nhu cầu của thị trường. Năm 1999, Mai Thị Tâm và cs nghiên cứu trên giống lan Dendrobium E.R. Đối tượng nghiên cứu là chồi và quả của giống Dendrobium E.R, tạo ra nguồn vật liệu khởi đầu là protocorm. Môi trường cơ bản là VW có cải tiến với 1% sacarose, 15% nước dừa và các hàm lượng khác nhau của BA. Kết quả cuối cùng tìm ra đượccác môi trường thích hợp cho quá trìnhtạo nguồn vật liệu khởi đầu, quá trình nhân nhanh tạo cây hoàn chỉnh [15]. Theo Hoàng Thị Nga và cs (2008) [17], xây dựng quy trình nhân nhanh giống địa lan Hồng Hoàng (Cymbidium iridioides) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào đã cho kết quả các chồi non có kích thước từ 4-6cm hoặc hạt được sử dụng làm mẫu cấy, môi trường để khởi động mẫu cấy là: MS + saccarose 20g/l + agar 0,65g + BA 1,5ppm (hoặc 2 ppm Kinitine/l), để gieo hạt là: MS + sacarose 10g/l + pepton 1g + than hoạt tính 1g/l + agar 6,5g/l. Môi trường thích hợp để nuôi cấy lát mỏng đã xác định là: MS + 1 ppm K + sacarose 20g/l + Kinitine 1 ppm (hoặc BA 0,5 ppm) + agar 6,5g/l. Nghiên cứu đã xác định được môi trường tối thích để tạo cây hoàn chỉnh là MS + than hoạt tính 0,1g/l+ sacarose 25g/l. Năm 2013, Vũ Ngọc Lan và cs, nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan bản địa Dendrobium nobile Lindl (Thạch hộc) nhằm bảo tồn và phát triển loài lan quý thuộc chi Hoàng thảo, có giá trị thẩm mỹ dược liệu cao, đang có nguy cơ tuyệt chủng. Kết quả cho thấy nguyên liệu sử dụng thích hợp là quả lan 5 tháng tuổi, môi trường gieo hạt là MS + ND 100 ml + saccarose 10 g/l + agar 6,0 g/l môi trường. Trong nhân in vitro, môi trường nhân nhanh protocom tối ưu là KC + ND 100 ml + sacarose 10 g/l + agar 6,0 g/l môi trường; nhân nhanh cụm chồi tốt nhất là MS + ND 100ml/l + sacarose 10 g/l +
31. agar 6,0 g/l môi trường. Môi trường tối ưu tạo cây hoàn chỉnh là RE + sacarose 10g/l + THT 0,6 g/l, cường độ chiếu sáng 2300 lux [11]. Nguyễn Thị Sơn và cs (2014) [10], đã nghiên cứu và nhân giống in-vitro Lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium oficinale Kmura et Migo) thành công và cho ra một số kết quả sau: Kết quả nhân giống bằng gieo hạt Nguyễn Thị Sơn và cs đã nghiên cứu và đưa ra kết luận rằng môi trường W + 10g sucrose/lít môi trường + 6g agar/lít môi trường + 10% ND là môi trường thích hợp nhất cho sự nảy mầm của hạt lan D. officinale Kimuraet Migo. Kết quả nhân giống bằng phương pháp nhân nhanh cụm chồi qua nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh cụm chồi các tác giả đã đưa ra môi trường nuôi cấy được lựa chọn trong nhân nhanh cụm chồi Lan D. officinale Kimura et Migo. là môi trường MS + 20g sucrose + 10% nước dừa + 6g agar/lít môi trường. Theo Trịnh Thị Thúy An và Đtg (2017) đã nghiên cứu môi trường cơ bản MS + sucrose 30 g/l + agar 9 g/l + nước dừa 100 ml/l và bổ sung BAP 0,25 mg/l thích hợp cho khả năng tạo protocorm và phát sinh chồi của Thạchlan Hộc Tía. Môi trường cơ bản MS + sucrose 30 g/l + agar 9 g/l + nước dừa 100 ml/l và bổ sung NAA 0,9 mg/l thích hợp cho khả năng tạo rễ của lanThạch Hộc Tía [1].
32. Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Giống lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) được thu thập từ rừng tự nhiên của tỉnh Cao Bằng. - Vật liệu: Chồi lan Thạch Hộc Tía được tái sinh từ hạt. 3.1.2. Hoá chất sử dụng - Môi trường MS. - Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy gồm: Đường sucrose, agar. - Một số chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm Auxin (NAA),nhóm Cytokinin (BAP, Kinetin ) và nhóm Gibberellin (GA3) 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu Bảng 3.1. Thiết bị,dụng cụ nghiên cứu Thiết bị Dụng cụ Cân phân tích Pank Máy khuấy từ Dao kéo Máy đo PH Đèn cồn Lò vi sóng Cốc đong, ống đong Nồi hấp vô trùng Bình tam giác Tủ sấy Đĩa (hạt đậu, peptri) Hệ thống giàn đèn Chun nịt Máy cất nước Túi nilon Box cấy vô trùng Giấy thấm Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên Phòngcứu của Công nghệ Tế bào, Viện Khoa học Sự sống. 3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu
33. - Nghiên cứu được tiến hành với một sốmột số chất điều tiết sinh trưởng sinh trưởng (BAP, Kinetin, NAA, GA3) nhằm xác định ảnh hưởng của chúng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu. - Địa điểm: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào của Viện Khoa học Sự sống. 3.2.2. Thời gian nghiên cứu - Thời gian: từ 2/2020– 7/2020. 3.3. Nội dung nghiên cứu 3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số loại Cytokinin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khốiin vitro của lan Thạch Hộc Tía. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khốiin vitro của lan Thạch Hộc Tía. 3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Auxin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khốiin vitro của lan Thạch Hộc Tía. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin (khi sử dụng phối hợp) kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. 3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng củaự s kết hợp Cytokinin và Gibberellin (GA3) đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh ốkh i in vitro của lan Thạch Hộc Tía. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khốiin vitro của lan Thạch Hộc Tía.
34. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin (khi sử dụng phối hợp) kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khốiin vitro của lan Thạch Hộc Tía. 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro Sử dụng các môi trường Murashige and Skoog, 1962 (MS) có bổ sung 30g/l Sucarose + 5g/l agar, các chất BAP, Kinetin, NAA,GA 3 (mg/l) có hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm, pH=5,6-5,8. Môi trường nền = MS + 30g/l Sucarose + 5g/l agar. Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng bổ sung vào môi trường (MT) nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm. Bình tam giác, dung tích 250ml Thể tích MT nuôi cấy trong mỗi bình nuôi cấy là 75 ml/bình. Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1atm trong 15 phút. 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
35. Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi côngthức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy3 bình, mỗi bình 6 mẫu. Sau khi cấy song đưa mẫu vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ phòng từ 220C – 25oC, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux, độ ẩm: 60 – 65% quang chu kì 16h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu. 3.4.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số loại Cytokinin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Các thí nghiệm tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng củamột số loại cytokinin tới khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Trong đó, môi trường nền sử dụng chung cho các công thức là: - Môi trường nền = Môi trường MS + 30g/l Sucrose + 5g/l agar. - Môi trường nền được bổ sung BAP, Kinetin với nồng độ khác nhau trong từng công thức thí nghiệm. - Chồi lan Thạch Hộc Tía có kích thước tương đồng sau khi cấy trên môi trường nền thích hợp sẽ được chuyển sang môi trường bổ sung cytokinin (BAP, Kinetin), sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp. Tiến hành theo dõi, quansát sự sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Thí nghiệm gồm các công thức sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + 0,0 mg/l BAP CT 2: MT nền + 0,5 mg/l BAP CT 3: MT nền + 1 mg/l BAP CT 4: MT nền +1,5 mg/l BAP CT 5: MT nền + 2 mg/l BAP Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Thí nghiệm được bố trí như sau:
36. CT 1 (Đ/c): MT nền + 0,0mg/l Kinetin CT 2: MT nền + 0,5mg/l Kinetin CT 3: MT nền + 1mg/l Kinetin CT 4: MT nền + 1,5mg/l Kinetin CT 5: MT nền + 2mg/l Kinetin Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng củanồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + 0,0mg/l BAP + 0,0mg/l Kinetin CT 2: MT nền + 0,3mg/l BAP + 0,5mg/lKinetin CT 3: MT nền + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/lKinetin CT 4: MT nền + 0,5mg/l BAP + 0,5mg/lKinetin CT 5: MT nền + 1mg/l BAP + 1mg/lKinetin 3.4.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Auxin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Thí nghiệm 1, 2, 3 xác định được nồng độ thích hợp nhất của nồng độ BAP, Kinetin và BAP kết hợp với Kinetin bổ sung vào môi trường nuôi cây. Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Auxin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Các thí nghiệm tiến hành như sau: Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Các công thức thí nghiệm gồm: CT 1 (Đ/c): MT nền 1 + 0,0mg/l NAA CT 2: MT nền 1+ 0,5mg/l NAA CT 3: MT nền 1 + 1mg/l NAA CT 4: MT nền 1 + 1,5mg/l NAA
37. CT 5: MT nền 1 + 2mg/l NAA MT nền 1: MT MS + 30 g/l saccarose + 5 g/l agar + BAP ( (nồng độ BAP thích hợp nhất ở thí nghiệm 1) Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng củanồng độ Kinetin kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Các công thức thí nghiệm gồm: CT 1 (Đ/c): MT nền 2 + 0, 0mg/l NAA CT 2: MT nền 2 + 0,5mg/l NAA CT 3: MT nền 2 + 1mg/l NAA CT 4: MT nền 2 + 1,5mg/l NAA CT 5: MT nền 2 + 2mg/l NAA MT nền 2: MT MS + 30 g/l saccarose + 5 g/l agar + Kinetin (nồng độ Kinetn thích hợp nhất ở thí nghiệm 2) Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng củanồng độ BAP và Kinetin (khi sử dụng phối hợp) kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Các công thức thí nghiệm gồm: CT 1 (Đ/c): MT nền 3 + 0,0mg/l NAA CT 2: MT nền 3 + 0,5mg/l NAA CT 3: MT nền 3 + 1mg/l NAA CT 4: MT nền 3 + 1,5mg/l NAA CT 5: MT nền 3 + 2mg/l NAA MT nền 3: MT MS + 30 g/l saccarose + 5 g/l agar + BAP và Kinetin (nồng độ BAP + Kinetin thích hợp nhất ở thí nghiệm 3) 3.4.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Gibberellin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
38. Đề tài thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của việc sử dụng phối hợp của cytokinin và gibberellin (GA3) đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối. Sử dụng môi trường có nồng độ Cytokinin thích hợp đến khả năng sinh trưởng của cây lan Thạch Hộc Tía in vitro ở thí nghiệm 1, 2, 3 và bổ sung GA3 với các nồng độ khác nhau tùy theo công thức thí nghiệm . Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Các công thức thí nghiệm gồm: CT 1 (Đ/c): MT nền 1 + 0,0mg/l GA3 CT 2: MT nền 1+ 0,5mg/l GA3 CT 3: MT nền 1 + 1mg/l GA3 CT 4: MT nền 1 + 1,5mg/l GA3 CT 5: MT nền 1 + 2mg/l GA3 MT nền 1: MT MS + 30 g/l saccarose + 5 g/l agar + BAP ( (nồng độ BAP thích hợp nhất ở thí nghiệm 1) Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với GA3 đếnquá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Các công thức thí nghiệm gồm: CT 1 (Đ/c): MT nền 2 + 0,0mg/l GA3 CT 2: MT nền 2 + 0,5mg/l GA3 CT 3: MT nền 2 + 1mg/l GA3 CT 4: MT nền 2 + 1,5mg/l GA3 CT 5: MT nền 2 + 2mg/l GA3 MT nền 2: MT MS + 30 g/l saccarose + 5 g/l agar + Kinetin (nồng độ Kinetn thích hợp nhất ở thí nghiệm 2) Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng củanồng độ BAP và Kinetin( khi sử dụng phối hợp) kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
39. Các công thức thí nghiệm gồm: CT 1 (Đ/c): MT nền 3 + 0,0mg/l GA3 CT 2: MT nền 3 + 0,5mg/l GA3 CT 3: MT nền 3 + 1mg/l GA3 CT 4: MT nền 3 + 1,5mg/l GA3 CT 5: MT nền 3 + 2mg/l GA3 MT nền 3: MT MS + 30 g/l saccarose + 5 g/l agar + BAP và Kinetin (nồng độ BAP + Kinetin thích hợp nhất ở thí nghiệm 3) 3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu * Các chỉ tiêu theo dõi được thu thập sau 30 ngày nuôi cấy, bao gồm các chỉ tiêu: Tổng chồi thu được Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng chồi nuôi cấy Biến động chiều cao trung bình (cm) = Chiều cao đại diện của cụm chồi thu được – Chiều cao ban đầu Biến động số lá trung bình (lá)= Số lá thu được – Số lá ban đầu Biến động khối lượng trung bình (cm) = Khối lượng thu được – Khối lượng ban đầu * Phương pháp theo dõi trong nuôi cấy mô Khi lấy mẫu ra khỏi bình in vitro, rửa sạch agar và tiến hành đo đếm các chỉ tiêu theo dõi: chiều cao chồi, số lá, khối lượng mẫu, chất lượng mẫu. - Chiều cao mẫu (cm): đo từ gốc đến vút chồi (chồi đại diện). - Khối lượng mẫu (g): mỗi công thức trong từng thí nghiệm cân nhanh 10 cây để so sánh. - Số lượng lá (lá): đếm sốlá trên mỗi cây sau khi lấy ra khỏi bình nuôi cấy. - Chất lượng mẫu: quan sát bằng mắt thường và so sánh các mẫu với nhau, đánh giá cây theo tiêu chí: +++ Chồi tốt: thân mập, lá màu xanh đậm ++ Chồi trung bình: thân bình thường, lá màu xanh non. + Chồi kém: thân gầy, lá màu xanh nhạt, vàng hoặc chồi dị dạng.
40. * Phương pháp xử lý số liệu - Các số liệu được tính toán bằng phần mềm Excel 2010. - Để xác ịđ nh được sai khác giữa các công thức thí nghiệm quá trình xử lý số liệu được thực hiện trên máy tính bằng phần mềm SAS 9.1 và giá trị trung bình được so sánh theo phương pháp Duncan ớv i P < 0,05.
41. Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số loại Cytokinin quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Một trong những ưu điểm của phương pháp nhângiống in vitro so với các phương pháp nhân giống khác là có hệ số nhân cao. Vì vậy có thể coi đây là giaiđoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống. Trong kỹ thuật nhân giống in vitro, các chất điều tiết sinh trưởng có vai trò vô cùng quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát triển của lan Thạch Hộc Tía, vì vậy việc nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều tiết sinh trưởng có ý nghĩa quan trọng trong quá trình nuôi cấy mô cây lan Thạch Hộc Tía. Trên cơ sở tham khảo các công trình trước đây đã nghiên cứu trên một số đối tượng lan Thạch Hộc khác, chúng tôi chọn môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường MS bổ sung vitamin, đường, agar và các chất kích thích sinh trưởng với các nồngđộ khác nhau để nghiên cứu công thức tốt nhất tới sinh trưởng in vitro của lan Thạch Hộc Tía. - Bổ sung BAP, Kinetin với các nồng độ khác nhau trong từng công thức thí nghiệm. Sau khi gieo hạt thành công, chồi tái sinh được cấy chuyển sang cácmôi trường nuôi cấy, sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp. Tiến hành theo dõi, quan sát sự sinh trưởng của chồi. 4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. BAP (6-Benzylaminopurin) là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong môi trường nuôi cấy mô nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gâytạo phôi vô tính, tăng cườngphát sinh chồi phụ. Thí nghiệm được thực hiện nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh của lan Thạch Hộc Tía. Kết quả của thí nghiệm sau 30 ngày theodõi được thể hiện trong bảng 4.1.
42. Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày nuôi cấy) Biến Tổng Biến Biến động Nồng Hệ số động số mẫu động khối Chất CT độ nhân lá nuôi chiều cao lượng lượng BAP chồi trung cấy trung trung chồi (ml/l) (lần) bình (mẫu) bình (cm) bình (g) (lá) 1(ĐC) 0 54 1,56c 1,97d 3,67e 0,43c + 2 0,5 54 2,37b 2,62b 4,22c 0,66b ++ 3 1 54 3,11a 3,79a 5,56a 0,80a +++ 4 1,5 54 2,26b 2,50bc 4,64b 0,62b ++ 5 2 54 1,56c 2,17cd 3,89d 0,51c + LSD05 0,19 0,34 0,17 0,08 CV (%) 4,54 6,84 2,06 7,16 Ghi chú: +++ Chồi tốt: thân mập, lá màu xanh đậm. ++ Chồi trung bình: thân bình thường, lá màu xanh non. + Chồi kém: thân gầy, lá màu xanh nhạt, vàng hoặc chồi dị dạng. a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cậy P < 0,05 theo phương pháp Duncan Sau 30 ngày theo dõi, ở chỉ tiêu hệ số nhân chồi với giá trị LSD05 là 0,19, hệ số nhân chồi của các công thức tăng theo nồng độ. Khi tăng nồng độ BAP từ0– 1 mg/l tương ứng từ CT1 đến CT3, hệ số nhân chồi tăng từ 1,56 lần lên 3,11 lần , đặc biệt là công thức CT3 ở nồng độ 1 mg/l cho hệ số nhân cao nhất đạt3,11 lần. Tuy nhiên khi tăng nồng độ từ 1,5 – 2 mg/l hệ số nhân chồi lại giảm từ 2,26 mg/l ở CT4 xuống 1,56 mg/l ở CT5. Về chỉ tiêu biến động chiều cao trung bình với giá trị LSD05 đạt 0,34, ta nhận thấy khi bổ sung BAP với nồng độ từ 0,5 – 2mg/l chiều cao của mẫu cũng tăng lên cao hơn CT đối chứng. Trong đó, cao nhất là CT3 với biến động chiều cao trung bình là 3,79cm và thấp nhất là CT5 chỉ đạt 2,17cm so với CTĐC (1,97cm) sai khác này không có ýĩ ngh a ở độ tin cậy 95%. Về biến động số lá trung bình của mẫu, theo kết quả nghiên cứu ở bảng 4.1 cho thấy: Biến động số lá trung bình ở các CT thí nghiệm đều cao hơn so với CT đối chứng (đạt từ 3,89 – 5,56 lá) ở mức tin cậy 95%. Khi sử dụng nồng độ BAP ở nồng
43. độ 1mg/l thì biến động số lá trung bình đạt cao nhất 5,56 lá. Khi không sử dụng BAP chỉ đạt 3,67 lá. Biến động về biến động khối lượng trung bình của CT3 (0,80g) lớn hơn CTĐC và các CT còn lại, Tiếp theo là CT2 và CT4 biến động biến động khối lượng trung bình đạt lần lượt là 0,66g và 0,62g, tuy nhiên 2CT này sai khác không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Thấp nhất là CT5 với biến động khối lượng trung bình chỉ đạt 0,51g so với CTĐC (0,43g) sự sai khác không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Chất lượng chồi ở CT3 đạt tốt, chồi cao, mập lá xanh đậm., CT2 và CT4 đạt chất lượng chồi trung bình, cây thấp hơn và nhỏ hơn, chất lượng chồi thấp nhất là ở CT5 và CTĐC. Mai Thị Tâm, Vũ Thị Thu Hiền, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Trường Sơn (1999), đã kết luận nồng độ BAP thích hợp nhất cho nhânnhanh giống lan Dendrobium E.R là MS bổ sung 1mg/l BAP [20]. So sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với kết quả nghiên cứu của tác giả trên thấy kết quả nghiên cứu của tôi hoàn toàn tương đồng, điều này cho thấy môi trường MS bổ sung 1mg/l BAP cho kết quả phù hợp nhất đối với khả năng sinh trưởng củalan Thạch Hộc Tía so với các nồng độ ở các công thức khác trong thí nghiệm. Kết quả thu được hệ số nhân chồilà 3,11 lần, biến động chiều cao trung bình mẫu đạt 3,79cm,bi ến động biến động số lá trung bình và khối lượng đạt lần lượt là5,56 lá và 0,80g. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Hình 4.1: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP sau 30 ngày nuôi cấy.
44. 4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Cũng như BAP, Kinetin (6-furfurolaminopurrine) là một chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong nuôi cấy mô - tế bào nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặctừ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ [7]. Do vậy, chúng tôi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung kinetin vào môi trường nuôicấy nhằm đánh giá ảnh hưởng của kinetin đến khả năng sinh trưởng và tích lũys inh khốiin vitro của lan Thạch Hộc Tía. Kết quả thí nghiệm sau 30 ngày theo dõi được trình bày trong bảng 4.2. Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía ( sau 30 ngày nuôi cấy) CT Nồng Tổng Hệ số Biến Biến Biến Chất độ mẫu nhân động động số động lượng Kinetin nuôi cấy chồi chiều lá khối chồi (mg/l) (mẫu) (lần) cao trung lượng trung bình trung bình (lá) bình (g) (cm) 1(ĐC) 0 54 1,56c 1,97c 3,70d 0,42e + 2 0,5 54 2,30b 2,69b 4,26c 0,74c ++ 3 1 54 2,78a 3,84a 5,89a 1,04a +++ 4 1,5 54 2,15b 2,60b 4,85b 0,90b ++ 5 2 54 1,48c 2,22c 4,07c 0,63d + LSD05 0,22 0,25 0,25 0,10 CV (%) 5,61 7,26 2,90 6,96 Ghi chú: +++ Chồi tốt: thân mập, lá màu xanh đậm. ++ Chồi trung bình: thân bình thường, lá màu xanh non. + Chồi kém: thân gầy, lá màu xanh nhạt, vàng hoặc chồi dị dạng. a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cậy P < 0,05 theo phương pháp Duncan
45. Sau 30 ngày theo dõi, ở chỉ tiêu hệ số nhân chồi với giá trị LSD05 là 0,22, hệ số nhân chồi của các công thức tăng theo nồng độ. Khi tăng nồng độKinetin từ 0 – 1 mg/l tương ứng từ CT1 đến CT3 , hệ số nhân chồi tăng từ 1.48 lần lên 2,78 lần, đặc biệt là công thức CT3 ở nồng độ 1mg/l cho hệ số nhân cao nhất đạt 2,78 lần. Tuy nhiên khi tăng nồng độ từ 1,5 – 2mg/l hệ số nhân chồi lại giảm từ 2,15 lần ở CT4 xuống 1,48 lần ở CT5. Về chỉ tiêu biến động chiều cao trung bình với giá trị LSD05 đạt 0.36, ta nhận thấy khi bổ sung Kinetin với nồng độ từ 0,5 – 2mg/l biến động chiều cao trung bình cũng tăng lên cao hơn CTĐC. Trong đó, cao nhất là CT3 với biến động chiều cao trung bình là 3,84cm và thấp nhất là CT5 chỉ đạt 2,22cm so với CTĐC (1,97cm) sai khác này không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Về biến động số lá trung bình, theo kết quả nghiên cứu ở bảng 4.2 cho thấy: Biến động số lá trung bình ở các CT thí nghiệm đều cao hơn so với CT đối chứng (đạt từ 3,70 – 5,89 lá) ở mức tin cậy 95%. Khi sử dụng nồng độ Kinetin ở nồng độ 1 mg/l thì biến động số lá trung bình đạt cao nhất 5,89 lá. Khi không sử dụng Kinetin biến động số lá trung bình của mẫu chỉ đạt 3,70 lá. Biến động khối lượng trung bình mẫu của CT3 (1,04g) lớn hơn CTĐC và các CT còn lại, Tiếp theo là CT4 biến động khối lượng trung bình đạt 0,90g, rồi đến CT2 (0,74g). Thấp nhất là CT5 với khối lượng đạt 0,63g so với CTĐC (0,42g) sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Chất lượng chồi ở CT3 đạt tốt, chồi cao, mập lá xanh đậm., CT2 và CT4 đạt chất lượng chồi trung bình, cây thấp hơn và nhỏ hơn, chất lượng chồi thấp nhất là ở CT5 và CT ĐC. Môi trường MS bổ sung 1mg/l Kinetin cho kết quả phù hợp nhất cho sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía.
46. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Hình 4.2: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung Kinetin sau 30 ngày 4.1.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày nuôi cấy) Biến Tổng Nồng Nồng Hệ số Biến động mẫu Biến động Chất CT độ độ nhân động số khối nuôi chiều cao lượng BAP Kinetin chồi lá trung lượng cấy trung chồi (mg/l) (mg/l) (lần) bình (lá) trung (mẫu) bình (cm) bình(g) 1(ĐC) 0 0 54 1,56d 1,97c 3,70d 0,41e + 2 0,3 0,5 54 2,31c 3,80a 4,63b 0,65c ++ 3 0,5 0,3 54 2,78b 2,43b 5,44a 0,58d + 4 0,5 0,5 54 3,34a 3,93a 5,30a 0,94a +++ 5 1 1 54 2,94b 3,71a 4,04c 0,86b ++ LSD05 0,21 0,22 0,22 0,07 CV (%) 4,25 3,75 2,56 5,02 Ghi chú: +++ Chồi tốt: thân mập, lá màu xanh đậm. ++ Chồi trung bình: thân bình thường, lá màu xanh non. + Chồi kém: thân gầy, lá màu xanh nhạt, vàng hoặc chồi dị dạng. a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cậyP < 0,05 theo phương pháp DuncanỞ chỉ tiêu hệ số nhân chồi với giátrị LSD05 đạt 0,21, cặp CT3
47. và CT5 có sự sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, các công thức khác có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Khi bổ sung BAP từ 0 - 1mg/l, Kinetin từ 0 - 1mg/l vào môi trường nuôi cấy ta thấy có ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh chồi lan Thạch Hộc Tía. Khi tăng nồng độ BAP và Kinetin từ 0 - 0,5mg/l hệ số nhân chồi có xu hướng tăng, cụ thể là hệsố nhân chồi tăng từ 1,56 lần (CT1) đến 3,34 lần (CT4). Trong thí nghiệm này nồng độ BAP và Kinetin 0,5mg/l cho hệ số nhân cao nhất là 3,34 lần. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ BAP và Kinetin lên 1, mg/l hệ số nhân giảm dần, CT5 với hệ số nhân là 2,94lần chỉ thấp hơn CT4. Về chỉ tiêu biến động chiều cao trung bình với giá trị LSD 05 đạt 0,22, ta nhận thấy khi bổ sung BAP và Kinetin với nồng độ từ 0,3– 1mg/l biến động chiều cao trung bình của chồi cũng tăng lên cao hơn CTĐC. Trong đó, có CT2, CT4 và CT5 với biến động chiều cao trung bình lần lượt là 3,80cm, 3,93cm và 3,71cm, sai khác này không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. CT3 đạt 2.43cm cao hơn so với CTĐC (1,97cm) Về biến động số lá trung bình, theo kết quả nghiên cứu ở bảng 4.3 cho thấy: Biến động số lá trung bình ở các CT thí nghiệm đều cao hơn so với CT đối chứng (đạt từ 4,04 – 5,44 lá) ở mức tin cậy 95%. Khi sử dụng nồng độ BAP và Kinetin ở nồng độ 0,5 mg/l thì số lá ạđ t cao nhất 5,44 lá. Khi không sử dụng BAP và Kinetin biến động số lá trung bình chỉ đạt 3,70 lá. Biến động khối lượng trung bình ở CT4 (0,94g) lớn hơn CTĐC và các CT còn lại. Thấp nhất là CT3 với khối lượng đạt 0,58g so với CTĐC (0,41g) tất cả các công thức đều có sự khác ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Chất lượng chồi ở CT4 đạt tốt, chồi cao, mập lá xanh đậm, CT2 và CT5 đạt chất lượng chồi trung bình, cây thấp hơn và nhỏ hơn, chất lượng chồi thấp nhấtlàở CT3 và CTĐC. Có thể thấy, CT4 với nồng độ BAP và Kinetin (0,5mg/l) cho chất lượng chồi tốt. Như vậy CT4 là CT bổ sung BAP kết hợp Kinetin với nồng độ phù hợp với quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía hơn các CT cònạ l i.
48. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Hình 4.3: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP và Kinetin sau 30 ngày nuôi cấy * So sánh ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Công thức tốt nhất trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh ốkh i in vitro của lan Thạch Hộc Tía là CT3 với hệ số nhân 3,11 lần, biến động chiều cao trung bình chồi đạt 3,79cm, biến động số lá trung bình và khối lượng đạt lần lượt là 5,56 lá và 0,80g, chất lượng chồi tốt. Công thức tốt nhất trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh ốkh i in vitro của lan Thạch Hộc Tía là CT3 với hệ số nhân 2,78 lần, biến động chiều cao trung bình chồi đạt 3,84cm, biến động số lá trung bình và khối lượng đạt lần lượt là 5,89 lá và 1,04g, chất lượng chồi tốt. Công thức tốt nhất trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh ốkh i in vitro của lan Thạch Hộc Tía là CT4 với hệ số nhân 3,34 lần, biến động chiều cao trung bình chồi đạt 3,93cm, biến động số lá trung bình và khối lượng đạt lần lượt là 5,44 lá và 0,94g, chất lượng chồi tốt. Dựa vào kết quả trên đưa đến kết luận môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BAP và 0,5 mg/l Kinetin phù hợp hơn với quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía hơn hai công thức của hai thí nghiệm còn lại. Để khảo sát được khoảng rộng hơn nên chúng tôi sử dụng cả 3 CT có kết quảtốt nhất của 3 TN1 , 2, 3 để dùng cho các nghiên cứu sau về lan Thạch Hộc Tía.
49. 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Auxin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích sự ra rễ, trái lại đẩy mạnh sự biệt hóa chồi, ở tỷ lệ trung bình thì hình thành mô sẹo. Để nghiên cứu nhân nhanh nhằm thu được các chồi có chất lượng tốt cho giai đoạn tiếp theo, chúng tôi tiến hành phối hợp hai nhóm cytokinin (BAP, Kinetin kết quả thu được từ thí nghiệm 1, 2, 3) và auxin ( NAA) với các nồng độ khác nhau. 4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Từ kết quả thí nghiệm 1, môi trường MS 1mg/l BAP cho kết quả tốt hơn các CT còn lại, do đó chúng tôiử s dụng môi trường MS bổ sung 1mg/l BAP kết hợp với NAA ở các nồng độ khác nhau. Kết quả được thể hiện dưới bảng 4.4: Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày nuôi cấy) Biến Biến Biến động Tổng động Nồng Nồng Hệ số động khối mẫu chiều Chất độ độ nhân số lá lượng CT nuôi cao lượng BAP NAA chồi trung trung cấy trung chồi (mg/l) (mg/l) (lần) bình bình (mẫu) bình (lá) (cm) (g) 1(ĐC) 0 54 3,06b 3,78b 5,63b 0,81b +++ 2 0,5 54 3,54a 3,93a 6,04a 0,99a +++ 3 1 1 54 2,94b 3,69b 5,22c 0,81b ++ 4 1,5 54 2,77c 3,48c 4,94d 0,85b ++ 5 2 54 2,65c 3,48c 4,70e 0,81b + LSD05 0,14 0,10 0,22 0,07 CV (%) 2,48 1,44 2,23 4,25 Ghi chú: +++ Chồi tốt: thân mập, lá màu xanh đậm. ++ Chồi trung bình: thân bình thường, lá màu xanh non. + Chồi kém: thân gầy, lá màu xanh nhạt, vàng hoặc chồi dị dạng. a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tinP cậy < 0,05 theo phương pháp Duncan
50. Khi bổ sung BAP 1,0mg/l, NAA từ 0 - 2mg/l vào môi trường nuôi cấy ta thấy có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Khi tăng nồng độ NAA từ 0 - 0,5mg/l hệ số nhân chồi có xu hướng tăng, cụ thể là hệ số nhân chồi tăng từ 3,06 lần (CTĐC) đến 3,54 lần (CT2). Trong thí nghiệm này nồng độ NAA 0,5mg/l cho hệ số nhân cao nhất là 3,54 lần. Tuy nhiên, nồng độ NAA từ 1 – 2,0mg/l hệ số nhân giảm dần từ CT3 (2,94 lần), CT4 (2,77 lần) và thấp nhất là CT5 (2,65 lần), Cả 3 CT này đều cho hệ số nhân chồi thấp hơn CTĐC. Về biến động chiều cao trung bình của chồivới giá trị LSD05 đạt 0,10, cặp CT1 - CT3 và cặp CT4 - CT5 sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. CT2 cóbiến động chiều cao trung bình cao nhất đạt 3,93cm. Các CT còn lại có biến động chiều cao trung bình thấp hơn CTĐC. Về biến động số lá trung bình, theo kết quả nghiên cứubảng ở 4.4 cho thấy: Khi sử dụng nồng độ NAA ở nồng độ 0,5 mg/l thì số lá đạt cao nhất6,04 lá, cao hơn khi chỉ bổ sung 1mg/l BAP mà không bổ sung NAA biến động số lá trung bình chỉ đạt 5,63 lá. Tuy nhiên khi tăng nồng độ từ 1 - 2mg/l NAA biến động số lá trung bình lại giảm theo nồng độ tăng, cụ thể CT3 (1mg/l) đạt 5,22 lá, CT4 (1,5mg/l) đạt 4,94 lá, CT5 chỉ đạt 4,70 lá. Các CT sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Về biến động khối lượng trung bình với giá trị LSD05 là 0,07, CT2 cho kết quả tốt nhất là 0,99g. Các CT còn lại sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Về chất lượng chồi, CTĐC và CT2 cho chất lượng chồi tốt, CT3 và CT4 cho chất lượng chồi trung bình, còn CT 5 cho chất lượng chồi kém. Theo Nguyễn Thị Sơn và đtg (2014), Môi trường tối ưu cho nhân nhanh chồiin vitro cây lan Thạch Hộc thiết bì là MS bổ sung 1 mg/l BAP và 0,4mg/l NAA với hệ số nhân là 8,5 chồi/mẫu và chiều cao chồi là 1,68cm [19]. Như vậy CT2 với nồng độ 1mg/l BAP và 0,5mg/l NAA cho kết quả tốt hơn các CT còn lại. Đồng thời nhìn vào bảng kết quả ta thấy, Khi bổ sung 0,5mg/l NAA chồi sinh trưởng tăng nhanh hơn về chiều cao, số lá và khối lương tươi, tuy nhiên khi bổ sung NAA với hàm lượng cao hơn lại gây ức chế cho sự sinh trưởng của lan Thạch Hộc Tía.
51. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Hình 4.4: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP và NAA sau 30 ngày nuôi cấy. 4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Dựa trên kết quả thí nghiệm 2, chúng tôi thấy môi trường MS bổ sung 1mg/l Kinetin cho kết quả đối với khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tíat ốt hơn cáccông thức còn lại, do đó chúng tôi sử dụng môi trường MS bổ sung 1mg/lKinetin kết hợp với NAA với các nồng độ từ 0,5mg/l đến 2mg/l và tiến hành theo dõi các chỉ tiêu đánh giá trong vòng 30 ngày. Kết quả theo dõi được thể hiện dưới bảng 4.5.
52. Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày nuôi cấy) Biến Biến Biến động Tổng động Nồng Nồng Hệ số động khối mẫu số lá Chất độ độ nhân chiều lượng CT nuôi trun lượng Kinetin NAA chồi cao trung cấy g chồi (mg/l) (mg/l) (lần) trung bình (mẫu) bình bình (cm) (lá) (g) 1(ĐC) 0 54 2,78b 3,84a 5,85a 1,05a +++ 2 0,5 54 2,89a 3,88a 6,00a 1,03a +++ 3 1 1 54 2,63c 3,68b 5,22b 0,85b ++ 4 1,5 54 2,51d 3,61bc 5,13c 0,87b + 5 2 54 2,44d 3,56c 5,22c 0,78c + LSD05 0,10 0,07 0,26 0,06 CV (%) 2,06 1,00 2,50 3,22 Ghi chú: +++ Chồi tốt: thân mập, lá màu xanh đậm. ++ Chồi trung bình: thân bình thường, lá màu xanh non. + Chồi kém: thân gầy, lá màu xanh nhạt, vàng hoặc chồi dị dạng. a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tinP cậy < 0,05 theo phương pháp Duncan Từ bảng 4.5 cho ta thấy, khi kết hợp Kinetin (1mg/l) với NAA với nồng độ từ 0 – 2mg/l, sau 30 ngày theo dõi ở chỉ tiêu hệ số nhân chồi với giá trị LSD05 là0,10 hệ số nhân chồi của các công thức có nồng độ NAA khác nhau thì cóhệsố nhân chồi khác nhau. Hệ số nhân chồi đạt cao nhất ởCT2 (2,89 lần) và thấp ở CT4 (2,51 lần) và CT5 (2,44 lần) sự sai khác của 2 CT này không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Về biến động chiều cao trung bình tăng sau nuôi cấy, theo kết quả nghiên cứu ở bảng 4.5 cho thấy: CT1(ĐC) và CT 2 cho kết quả biến động chiều cao trung bình của chồi lần lượt là 3,84cm và 3,88cm cao hơn các CT còn lại. Khi tăng nồng độ từ 1-2mg/l NAA biến động chiều cao trung bình của chồi giảm dần khi nồng độ tăng
53. dần, cụ thể CT3 (1mg/l) đạt 3,66cm, CT4 (1,5mg/l) đạt 3,61cm, CT5 chỉ đạt 3,56cm. Các CT sai khác không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Về biến động số lá trung bình, với giá trị LSD05 đạt 0,13 ta thấy CT1 (ĐC) và CT 2 cho kết quả biến động số lá trung bình lần lượt là 5,85 lá và 6,00 lá cao hơn các CT còn lại. Khi tăng nồng độ từ 1-2mg/l NAA biến động số lá trung bình giảm, cụ thể CT3 (1mg/l) đạt 5,22 lá, CT4 (1,5mg/l) đạt 5,13 lá, CT5 (2mg/l) đạt 5,22 lá. Về biến động khối lượng trung bình với giá trị LSD05 là 0,08, CT5 cho kết quả thấp nhất là 0,76g. Các CT còn lại sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Về chất lượng chồi CT1 (ĐC) và CT2 cho chất lượng chồi tốt nhất, CT3 cho chất lượng chồi trung bình và CT4, CT5 cho chất lượng chồi kém. Như vậy có thể thấy, CT1 (ĐC) và CT2 là hai công ứth c tốt nhất trong thí nghiệm này. Cả 2 công thức đều cho chiều cao, số lá, khối lượng và chất lượng chồi tốt, CT 2 cho hệ số nhân chồi cao hơn CTĐC. Từ kết quả đó đưa ra ếk t luận, môi trường MS bổ sung 1mg/l Kinetin + 0,5mg/l NAA phù hợp nhất trong thí nghiệm này. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Hình 4.5: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung Kinetin và NAA sau 30 ngày cấy 4.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin (khi sử dụng phối hợp) kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
54. Từ kết quả thí nghiệm 4, môi trường MS bổ sung 0,5mg/l BAPvà0,5mg/l Kinetin cho kết quả nhân nhanh tốt hơn các CT còn tlại, ừ cơ sở đó, thí nghiệm nàysử dụng môi trường MS bổ sung 0,5mg/l BAP và 0,5mg/l Kinetin kết hợp với NAA với các nồng độ khác nhau. Kết quả được thể hiện dướibảng 4.6 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin (khi sử dụng phối hợp) kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày nuôi cấy) Biến Biến Biến Nồng Tổng động Nồng Hệ số động động độ BAP mẫu khối Chất độ nhân chiều số lá CT và nuôi lượng lượng NAA chồi cao trung Kinetin cấy trung chồi (mg/l) (lần) trung bình (mg/l) (mẫu) bình bình (lá) (g) (cm) 1(ĐC) 0 54 3,37b 3,94a 5,56a 0,95a +++ 2 0,5 54 3,22c 3,79cd 5,26b 0,91a ++ 3 0,5:0,5 1 54 3,43a 3,88ab 5,19b 0,93a +++ 4 1,5 54 3,22c 3,84bc 4,89c 0,89a ++ 5 2 54 3,20c 3,74d 4,74c 0,76b + LSD05 0,05 0,05 0,18 0,08 CV (%) 0,85 0,74 1,84 4,52 Ghi chú: +++ Chồi tốt: thân mập, lá màu xanh đậm. ++ Chồi trung bình: thân bình thường, lá màu xanh non. + Chồi kém: thân gầy, lá màu xanh nhạt, vàng hoặc chồi dị dạng. a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tinP cậy < 0,05 theo phương pháp Duncan Qua 30 ngày nuôi cấy, hệ số nhân chồi đạt được ở các công thức thí nghiệm có sự sai khác ở mức ý nghĩa 95%, biến động từ 3,20 lần đến 3,43 lần. Trong đó,môi trường MS bổ sung 0,5mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin + 1 mg/l NAA (công thức 3) cho hệ số nhân chồi đạt cao nhất(3,43 lần), tiếp theo đến các công thứcCTĐC (3,37 lần). CT2 (3,22 lần), CT4 (3,22 lần) và CT5 (3,20), tuy nhiên sự sai khác của 3 CT này không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%.
55. Tương tự với chỉ tiêu hệ số nhân chồi, các chỉ biếntiêu về động chiều cao trung bình, số lá và khối lượng cũng cho kết quả tương tự, cụ thể như sau: Về biến động chiều cao trung bình, theo kết quả nghiên cứubảng ở 4.6 cho thấy: CT1 (ĐC) và CT 2 cho kết quả biến động chiều cao trung bình lần lượt là 3,94cm và 3,88cm cao hơn các CT còn lại. Khi tăng nồng độ từ 1-2mg/l NAA biến động chiều cao trung bình giảm dần khi nồng độ tăng dần, cụ thể CT3 (1mg/l) đạt 3,66 cm, CT4 (1,5mg/l) đạt 3,61cm, CT5 chỉ đạt 3,56cm. Các CT sai khác không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Về biến động số lá trung bình, với giá trị LSD05 đạt 0,18 ta thấy CT1(ĐC) cho kết quả biến động số lá trung bình là 5,56 lá cao hơn các CT còn lại. Khi tăng nồng độ từ 0,5-2mg/l NAA biến động số lá trung bình giảm, cụ thể CT2 (0,5mg/l) đạt 5,26 lá, CT3 (1mg/l) đạt 5,19 lá, CT4 (1,5mg/l) đạt 4,89 lá, CT5 (2mg/l) đạt 4,79 lá. Về khối lượng chồi với LSD05 đạt 0,08, ta thấy CT5 là thấp nhất chỉ đạt 0,76g, các CT còn lại sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Về chất lượng chồi CT1(ĐC) và CT3 cho chất lượng chồi tốt nhất, CT2 và CT4 cho chất lượng chồi trung bình và CT5 cho chất lượng chồi kém. Như vậy có thể thấy, CT1(ĐC) là công thức tốt nhất trong thí nghiệm này. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Hình 4.6: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP, Kinetin và NAA sau 30 ngày nuôi cấy
56. * So sánh ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Auxin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Công thức tốt nhất trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với NAA đến quátrình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía là CT2 (1mg/l BAP + 0,5mg/l NAA) với hệ số nhân 3,54 lần,biến động chiều cao trung bình chồi đạt 3,93cm, biến động số lá trung bình và khối lượng đạt lần lượt là 6,04 lávà 0,99g, chất lượng chồi tốt. Công thức tốt nhất trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinhkhối in vitro của lan Thạch Hộc Tía là CT2 (1mg/l Kinetin + 0,5mg/l NAA) với hệ số nhân 2,89 lần, biến động chiều cao trung bình chồi đạt 3,88cm, biến động số lá trung bình và khối lượng đạt lần lượt là 6,00 lá và 1,03g, chất lượng chồi tốt. Công thức tốtnhất trong thí nghiệm nồng độ BAP và Kinetin (khi sử dụng phối hợp) kết hợp vớiNAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía là CTĐC với hệ số nhân 3,37 lần,biến động chiều cao trung bình chồi đạt 3,94cm,biến động số lá trung bình và khối lượng đạt lần lượt là 5,56 lá và 0,95g, chất lượng chồi tốt. Với mục đích vừa tăng hệ số nhân chồi, vừa tăng chiều cao, số lá, khối lượng và chất lượng chồi, ta kết luận CT2 (1mg/l BAP + 0,5mg/l NAA) của thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía cho kết phù hợp hơn hai công thức của hai thí nghiệm còn lại. 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Gibberellin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Sau khi chồi được nhân lên kín bề mặt môi trường và đã sử dụng gần hết môi trường, ta phải cấy chuyển sang môi trường phát triển chồi. Ở giai đoạn này tiếp tục sử dụng môi trường MS bổ sung nồng độ một số chất của nhóm cytokinin và gibberellin để tăng sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Sử dụng môi trường có nồng độ Cytokinin thích hợp ở thí nghiệm 1 (MT nền + 1mg/l BAP), TN 2 (MT nền + 1mg/l BAP), TN 3 (MT nền + 0,5mg/l BAP + 0,5mg/l Kinetin) và bổ sung GA3 với các nồng độ khác nhau.