›

Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của đèn LED và một số yếu tố giá thể lên khả năng sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro

pdf 138 trang thiennha21 13/04/2022 6190
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của đèn LED và một số yếu tố giá thể lên khả năng sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_anh_huong_cua_den_led_va_mot_so_yeu_to_gia.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của đèn LED và một số yếu tố giá thể lên khả năng sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐÈN LED VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ GIÁ THỂ LÊN KHẢ NĂNG SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY CHUỐI ĐỎ (MUSA ACUMINATA RED DACCA) IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. TRỊNH THỊ LAN ANH Sinh viên thực hiện : PHẠM THỊ NHẢ TRÂN MSSV : 1411100686 Lớp : 14DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2018 i
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài này do chính tôi thực hiện, đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi. Những thông tin tham khảo trong đồ án này đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng. Các kết quả nghiên cứu trong đồ án do tôi thực hiện, phân tích một cách trung trực, khách quan và phù hợp với thực tiễn. Các kết quả này từng được công bố trong bất kì nghiên cứu nào khác. Tp.Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 7 năm 2018 Sinh viên thực hiện Phạm Thị Nhả Trân ii
  3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận của mình, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Viện Khoa học Ứng dụng Hutech, cùng tất cả các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập. Đặc biệt, tôi xin cảm ơn TS.Trịnh Thị Lan Anh người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và động viên cá nhân tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Với những kiến thức này làm nền tảng cho chúng tôi vận dụng vào cuộc sống khi ra trường. Xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ, giúp đỡ, động viên của toàn thể gia đình, bạn bè trong suốt quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp, cũng như trong suốt quá trình học vừa qua. Vì thời gian hạn hẹp, vốn kiến thức còn hạn chế nên cuốn báo cáo này cũng sẽ không tránh khỏi những sai sót. Rất mong sự chỉ bảo và đóng góp của quý thầy cô và các bạn để cuốn báo cáo này hoàn thiện hơn. Xin kính quý Thầy, Cô sức khỏe và thành công trong sự nghiệp đào tạo những thế hệ tri thức tiếp theo trong tương lai. Một lần nữa xin chân thành cảm ơn. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 7 năm 2018 Sinh viên thực hiện Phạm Thị Nhả Trân iii
  4. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC BIỂU ĐỒ x DANH MỤC HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục đích đề tài 3 3. Đối tượng và phạm vi nghên cứu 3 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 3 5. Phương pháp nghiên cứu 4 6. Bố cục đồ án 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Giới thiệu về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 5 1.1.1. Giới thiệu khái quát về phương pháp nuôi cấy mô tế bào 5 1.1.2. Ưu và nhược điểm nuôi cây mô tế bào thực vật 5 1.1.2.1. Ưu điểm 5 1.1.2.2. Nhược điểm 6 1.1.3. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 6 1.1.4. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 7 1.1.4.1. Các khoáng đa lượng 8 1.1.4.2. Các vitamin 9 1.1.4.3. Nguồn carbohydrate 11 1.1.4.4. Nguồn sắt 11 1.1.4.5. pH 12 1.1.4.6. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 12 iv
  5. 1.1.5. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật 19 1.1.5.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trường 19 1.1.5.2. Tạo thể nhân giống in vitro 19 1.1.5.3. Nhân giống in vitro 20 1.1.5.4. Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro 20 1.1.5.5. Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm 20 1.1.5.6. Nhân giống ex vitro 21 1.1.5.7. Cây con trong bầu đất 21 1.1.5.8. Trồng cây ra ruộng 21 1.1.5.9. Chọn lọc cây đầu dòng 21 1.1.6. Các vấn đề liên quan đến in vitro 22 1.1.6.1. Tính bất định về mặt di truyền 22 1.1.6.2. Ảnh hưởng mẫu nuôi cấy 22 1.1.6.3. Sản sinh các chất độc từ mẫu cấy 23 1.1.7. Giới thiệu sơ lược về ánh sáng LED 24 1.1.7.1. Giới thiệu về đèn LED 24 1.1.7.2. Ưu và nhược điểm của đèn LED 25 1.1.7.3. Ảnh hưởng của đèn LED đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 27 1.1.8. Các chất có hàm lượng không xác định bổ sung vào môi trường cấy 28 1.1.8.1. Nước dừa 28 1.1.8.2. Than hoạt tính 29 1.1.9. Giới thiệu sơ lược về giá thể nuôi cấy 29 1.1.9.1. Agar 29 1.1.9.2. Sương sáo 30 1.1.10. Giới thiệu sơ lược về cây chuối 30 1.1.10.1. Sơ lược về cây chuối trên thế giới 30 1.1.10.2. Các phương pháp truyền thống thường được sử dụng trong nhân giống chuối 32 1.1.10.3. Phân loại 32 v
  6. 1.1.10.4. Sơ lược về chuối đỏ 33 1.1.10.5. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô (in vitro) 35 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 37 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 37 2.2. Vật liệu 37 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 37 2.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 37 2.2.3. Môi trường nuôi cấy 37 2.2.4. Điều kiện nuôi cấy trong phòng nuôi cấy in vitro 37 2.2.4. Thiết kế hệ thống LED 38 2.3. Bố trí thí nghiệm 41 2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của agar lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) 41 2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của sương sáo lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) 41 2.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) 42 2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED đơn sắc lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) 43 2.3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED kết hợp lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) 44 2.3.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần của môi trường dinh dưỡng và thời gian bổ sung thêm dinh dưỡng lên khả năng tăng trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) 45 2.3.7. Chỉ tiêu nghiên cứu 46 2.3.8. Thống kê và xử lý số liệu 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của agar lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro 48 vi
  7. 3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của sương sáo lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro 55 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nước dừa lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) 63 3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED đơn sắc lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) 72 3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED kết hợp lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) 80 3.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần của môi trường dinh dưỡng và thời gian bổ sung thêm dinh dưỡng lên khả năng tăng trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ in vitro (Musa acuminata Red Dacca) 88 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 96 4.1. Kết luận 96 4.2. Kiến nghị 96 TÀI LIỆU THAM KHẢO 97 PHỤ LỤC 99 vii
  8. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid deoxynucleotic BA : 6-benzyladenine BAP : N6-benzylaminopurine CNSH : Công nghệ sinh hoc CV% : Hệ số sai dị CAD : Cinnamyl alcohol dehydrogenase CCR : Cinnamoyl CoA redductase CRD : Completely randommized desugin DHSTTV : Chất diều hòa sinh trưởng thực vật ĐC : Đối chứng GA3 : Gibberellic acid IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indol butyric acid LED : Light Emitting Diodes MS : Murashige và skoog NAA : α-naphtaleneacetic acid viii
  9. DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của agar lên sự sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca). Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của sương sáo lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca). Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca). Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của đèn LED lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca). Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng của đèn LED kết hợp lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca). Bảng 2.6. Khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần của môi trường dinh dưỡng và thời gian bổ sung thêm dinh dưỡng lên khả năng tăng trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) Bảng 3.1. Ảnh hưởng của agar đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro Bảng 3.2. Ảnh hưởng của sương sáo đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ in vitro Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ in vitro Bảng 3.4. Ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED đơn sắc đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ in vitro Bảng 3.5. Ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED kết hợp đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ in vitro Bảng 3.6. ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần của môi trường dinh dưỡng và thời gian bổ sung thêm dinh dưỡng lên khả năng tăng trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ in vitro (Musa acuminata Red Dacca) ix
  10. DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của agar đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro trong 8 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của agar lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của agar lên chiều cao cây và đường kính thân của chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của agar lên chiều dài rễ và số rễ của chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của sương sáo đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro trong 8 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của sương sáo lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của sương sáo lên chiều cao cây và đường kính thân của chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của sương sáo lên chiều dài rễ và số rễ của chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro trong 6 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng của nước dừa lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.11. Ảnh hưởng của nước dừa lên chiều cao cây và đường kính thân của chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.12. Ảnh hưởng của nước dừa lên chiều dài rễ và số rễ của chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.13. Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro trong 8 tuần nuôi cấy x
  11. Biểu đồ 3.14. Ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED đơn sắc lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.15. Ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED đơn sắc lên chiều cao cây và đường kính thân của chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi Biểu đồ 3.16. Ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED đơn sắc lên số rễ và chiều dài rễ của chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi Biểu đồ 3.17. Ảnh hưởng của ánh sáng kết hợp đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro trong 6 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.18. Ảnh hưởng của ánh sáng kết hợp lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.19. Ảnh hưởng của ánh sáng kết hợp lên chiều cao cây và đường kính thân của chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi Biểu đồ 3.20. Ảnh hưởng của ánh sáng kết hợp lên số rễ và chiều dài rễ của chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi Biểu đồ 3.21. Ảnh hưởng của kiểu bổ sung thành phần dinh dưỡng và thời gian bổ sung thêm dinh dưỡng đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro trong 6 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.22. Ảnh hưởng của kiểu bổ sung thành phần dinh dưỡng và thời gian bổ sung thêm dinh dưỡng lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.23. Ảnh hưởng của kiểu bổ sung thành phần dinh dưỡng và thời gian bổ sung thêm dinh dưỡng lên chiều dài lá và đường kính lá của chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi Biểu đồ 3.24. Ảnh hưởng của kiểu bổ sung thành phần dinh dưỡng và thời gian bổ sung thêm dinh dưỡng lên chiều cao cây và đường kính thân của chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi Biểu đồ 3.25. Ảnh hưởng của kiểu bổ sung thành phần dinh dưỡng và thời gian bổ sung thêm dinh dưỡng lên số rễ và chiều dài rễ của chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi xi
  12. DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) Hình 1.2. Cây chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) Hình 2.1. Mô hình thiết kế hệ thống chiếu sáng đèn LED đơn a. Hệ thống chiếu sáng đèn LED trắng; b. Hệ thống chiếu sáng đèn LED vàng; c. Hệ thống chiếu sáng đèn LED xanh; d. Hệ thống chiếu sáng đèn LED đỏ Hình 2.2. Hệ thống chiếu sáng đèn LED đơn sau khi thiết kế và thi công. A. Hệ thống chiếu sáng đèn LED trắng; B. Hệ thống chiếu sáng đèn LED vàng; C. Hệ thống chiếu sáng đèn LED xanh; D. Hệ thống chiếu sáng đèn LED đỏ Hình 2.3. Mô hình hệ thống chiếu sáng LED kết hợp a. 100% LED đỏ (ĐC); b. 50% LED đỏ kết hợp 50% LED vàng; c. 50% LED đỏ kết hợp 50% LED xanh dương; d. 50% LED vàng kết hợp 50% LED xanh dương Hình 2.4. Mô hình hệ thống chiếu sáng LED kết hợp A. 100% LED đỏ (ĐC); B. 50% LED đỏ kết hợp 50% LED vàng; C. 50% LED đỏ kết hợp 50% LED xanh dương; D. 50% LED vàng kết hợp 50% LED xanh dương Hình 3.1. ảnh hưởng của agar lên sự sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy. (A1, A2, A3, A4 tương ứng với nồng độ 6 ,9 , 12, 15 g/l) Hình 3.2. ảnh hưởng của agar lên sự sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy. (A1, A2, A3, A4 tương ứng với nồng độ 6 ,9 , 12, 15 g/l) Hình 3.3. Ảnh hưởng của sương sáo lên sự sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy. (B1, B2, B3, B4, B5 tương ứng với nồng độ 3, 6, 9, 12, 15 g/l) Hình 3.4. Ảnh hưởng của sương sáo lên sự sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy. (B1, B2, B3, B4, B5 tương ứng với nồng độ 3, 6, 9, 12, 15 g/l) viii
  13. Hình 3.5. Ảnh hưởng của nước dừa lên sự sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi cấy. (C0, C1, C2, C3, C4, C5 tương ứng với nồng độ 0, 5, 10, 15, 20, 25%) Hình 3.6. ảnh hưởng của nước dừa lên sự sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi cấy. (C0, C1, C2, C3, C4, C5 tương ứng với nồng độ 0, 5, 10, 15, 20, 25%) Hình 3.7. ảnh hưởng ánh sáng đèn LED đơn sắc lên sự sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy. (D0, D1, D2, D3, D4 tương ứng với loại ánh sáng huỳnh quang, LED trắng, LED đỏ, LED xanh dương) Hình 3.8. ảnh hưởng ánh sáng đèn LED đơn sắc lên sự sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy. (D0, D1, D2, D3, D4 tương ứng với loại ánh sáng huỳnh quang, LED trắng, LED đỏ, LED xanh dương) Hình 3.9. Ảnh hưởng ánh sáng đèn LED kết hợp lên sự sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi cấy. (E0, E1, E2, E3 tương ứng với loại ánh sáng đèn LED đỏ, đèn LED đỏ kết hợp đèn LED xanh dương, đèn LED xanh dương kết hợp đèn vàng, đèn LED đỏ kết hợp đèn LED vàng) Hình 3.10. Ảnh hưởng ánh sáng đèn LED kết hợp lên sự sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi cấy. (E0, E1, E2, E3 tương ứng với loại ánh sáng đèn LED đỏ, đèn LED đỏ kết hợp đèn LED xanh dương, đèn LED xanh dương kết hợp đèn vàng, đèn LED đỏ kết hợp đèn LED vàng ) Hình 3.11. ảnh hưởng của kiểu bổ sung thành phần dinh dưỡng và thời gian bổ sung thêm dinh dưỡng của chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi cấy (F0, F1, F2, F3, F4, F5 tương ứng với thời gian bổ sung thêm dinh dưỡng 0 tuần, 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần Hình 3.12. Ảnh hưởng của kiểu bổ sung thành phần dinh dưỡng và thời gian bổ sung thêm dinh dưỡng của chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi cấy (F0, F1, F2, F3, F4, F5 tương ứng với thời gian bổ sung thêm dinh dưỡng 0 tuần, 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần) ix
  14. MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây chuối được trồng phổ biến trên 100 nước và có diện tích trồng hàng năm khoảng 10 triệu ha sản lượng 88 triệu tấn. Cây chuối được xếp vào 1 trong hơn 130 loại cây ăn quả được đặc biệt quan tâm. Chuối là một loại thực phẩm, đồng thời cũng là một dược liệu thiên nhiên để hỗ trợ cho nhiều căn bệnh. Trong đó chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) đã và đang được ưu tiên đầu tư và phát triển với quy mô lớn trên thế giới. Với những ưu thế vượt trội về mặt chất lượng cũng như hàm lượng dinh dưỡng của chuối đỏ so với các loại chuối khác thì giá trị vượt trội về mặt kinh tế thông qua chế biến và bảo quản xuất khẩu là vô cùng to lớn. Hiện nay trên thế giới chuối đỏ được trồng chủ yếu ở Úc, New Zealand, và nhiều nơi ở quần đảo Thái Bình Dương, đã và đang mạng lại thu nhập ổn định và khả năng phát triển kinh tế cao cho người trồng, ngoài ra ở nước ta tuy đã nắm bắt được xu thế nhưng chuối đỏ vẫn chưa được đầu tư rộng tập trung chủ yếu ở các tỉnh Lâm Đồng, Bình Dương và các tỉnh miền Tây. Tuy rằng chuối đỏ mang lại hiệu quả kinh tế và khả năng phát triển cao nhưng tình hình sản xuất chuối đỏ hiện nay vẫn chưa đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường bởi còn gặp nhiều khó khăn trong việc cải thiện số lượng và chất lượng sản phẩm chuối đỏ. Một trong những nguyên nhân là do lượng giống chưa đáp ứng kiệp như cầu gieo trồng cùng với đó là chất lượng giống chưa đảm bảo. Ngoài ra việc nhân giống theo phương pháp truyền thống (tách chồi) thường sinh trưởng kém, phát triển chậm, cây không đồng đều, lâu thu hoạch thu hoạch không tập trung. Phương pháp nhân giống này thường làm cho cây con bị mắc bệnh virus rất nguy hiểm đến tình trạng thoái hóa giống. Hiện nay người dân thường sử dụng cây con chuối từ phương pháp nuôi cây mô, đặc biệt phổ biến ở những vùng trồng chuối lớn, tập trung. Từ 1 củ chuối thông qua phương pháp nuôi cấy mô có thể sản xuất đạt tới 2000 cây chuối con sạch bệnh và chất lượng cao để trồng ra vườn sản xuất. Trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô 1
  15. cho tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh, đồng đều, thời gian từ lúc trồng đến lúc thu hoạch ngắn. Tính đồng nhất của giống chuối nuôi cấy mô giúp chúng ta có thể điều khiển được thời gian ra hoa về thời gian thu hoạch cũng như tăng năng xuất và chất lượng trái. Thông qua phương pháp nuôi cấy mô người ta tạo ra một cây con sạch bệnh, đặc biệt với các bệnh do virus gây ra. Theo tổng kết của các nhà khoa học và thực tế sản xuất ở một số địa phương cho thấy trồng chuối cấy mô sạch bệnh có khả năng tăng năng xuất từ 15 – 20%. Một trong số những biện pháp nhân giống in vitro trên chuối giúp phát triển bộ rễ và các chỉ tiêu sinh trưởng của cây trước khi đem ra vườn ươm là bước khá quan trọng để đạt được tỷ lệ sống cao. Ánh sáng là một trong những yếu tố quan trọng trong sự sinh trưởng của thực vật bao gồm cả bộ rễ. Đèn LED có nhiều ưu điểm hơn với kích thước, thể tích nhỏ, tuổi thọ cao, vùng quang phổ có thể kiểm soát được, ít hao tốn điện năng và ít tỏa nhiệt. Trong khi đó, đèn huỳnh quang trong nuôi cấy mô chiếm nhiều không gian, tuổi thọ thấp, có những vùng quang phổ không cần thiết. Tuy nhiên ứng dụng khoa học kỹ thuật vào ngành công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam vẫn còn bị bỏ ngỏ. Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về ứng dụng của đèn LED trong đời sống nói chung và ứng dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nói riêng. Nhưng các ứng dụng vẫn chưa được triễn khai đại trà và áp dụng rộng rãi. Với mục đích đưa các ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phát triễn nông nghiệp bền vững, vừa tăng năng suất cây trồng, tiết kiệm chi phí tối đa có thể mà vẫn đảm bảo chất lượng, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của đèn LED và một số yếu tố giá thể lên khả năng sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro”. 2
  16. 2. Mục đích đề tài Khảo sát các yếu tố giá thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) và nghiên cứu ảnh hưởng của hệ thống đèn LED đến quá trình sinh trưởng từ mẫu cấy chồi. Từ đó tìm ra các yếu tố thích hợp cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro. 3. Đối tượng và phạm vi nghên cứu Đối tượng nghiên cứu là chồi chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) đươc sử dụng làm nguồn mẫu để nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố giá thể và hệ thống đèn LED đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát ảnh hưởng của agar lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) - Khảo sát ảnh hưởng của sương xáo lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) - Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) - Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED đơn sắc lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) - Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED kết hợp lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) - Khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần của môi trường dinh dưỡng và thời gian bổ sung thêm dinh dưỡng lên khả năng tăng trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca). 3
  17. 5. Phương pháp nghiên cứu - Nghiên cứu lý thuyết: thu thập, phân tích, tổng hợp tài liệu là sách chuyên ngành, tập chí chuyên ngành, các công trình nghiên cứu, các bài báo khoa học trong và ngoài nước. - Nghiên cứu thực nghiệm: tiến hành bố trí thí nghiệm để khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố giá thể và hệ thống đèn LED. Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên. Các nghiệm thức được lập lại 3 lần, ghi nhận kết quả trung bình. Các số liệu sao khi thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.1 và chương trình MicroSoft Excel 2010. 6. Bố cục đồ án Đồ án tốt nghiệp bao gồm các chương sau: - Chương 1: Tổng quan tài liệu - Chương 2: Vật liệu và phương pháp - Chương 3: Kết quả và thảo luận - Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4
  18. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1. Giới thiệu khái quát về phương pháp nuôi cấy mô tế bào Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một thuật ngữ được dùng một cách rộng rãi để nói về việc mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng. Mục đích chung của nuôi cấy mô tế bào thực vật là sử dụng các điều kiện như: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, để điều khiển quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu và yêu cầu đặt ra. Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả nhất quá trình phát triển hình thái ở nhiều loài thực vật. Phương pháp này giúp mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế sinh tổng hợp các chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý dinh dưỡng ở tế bào thực vật và nhiều vấn đề sinh học khác, Tất cả dạng nuôi cấy mô đều được tiến hành qua hai bước: - Các phần của thực vật hoặc một cơ quan thực vật nào đó được tách ra khỏi phần còn lại. Đó là sự tách rời tế bào, mô hay cơ quan đang tương tác lẫn nhau trong một tổ chức thực vật nguyên vẹn. - Các phần tách ra nói trên phải đặt trong môi trường thích hợp để nó có thể biểu lộ hết bản chất hoặc khả năng đáp ứng của nó. 1.1.2. Ưu và nhược điểm nuôi cây mô tế bào thực vật 1.1.2.1. Ưu điểm - Phương pháp in vitro có khả năng hình thành được số lượng lớn cây giống từ một mô, cơ quan của cây với kích thước nhỏ khoảng 0,1 – 10 mm. Trong khi đó các 5
  19. phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo thành cây giống, ít nhất phải sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5 – 20 cm. - Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo ra sẽ không nhiễm bệnh từ môi trường bênh ngoài. - Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng lớn cây giống sạch virus. - Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, theo ý muốn. - Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn. - Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu sự chi phối của điều kiện ngoại cảnh, mùa vụ. - Cây giống in vitro chưa có nhu cấu sử dụng thì có thể bảo quản được trong thời gian dài ở điều kiện in vitro. 1.1.2.2. Nhược điểm - Mặc dù hệ số nhân giống cao nhưng cây giống tạo ra có kích thước nhỏ và đôi khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn. - Nhân giống trên môi trường agar thì giá thành vẫn còn cao và thời gian dài. - Cần trang thiết bị hiện đại, kĩ thuật viên có tay nghề cao. - Quy trình nhân giống phức tạp. - Giới hạn của sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống do cây con tạo ra thường đồng nhất về mặt di truyền. 1.1.3. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm: - Cấy cây: nuôi cấy cây non và cây lớn hơn. 6
  20. - Cấy phôi: gồm nuôi cấy các phôi cô lập đã trưởng thành và chưa trưởng thành. - Cấy cơ quan: cấy các cơ quan thực vật tách rời. - Cấy mô hoặc mô sẹo: cấy các loại mô tách ra từ một phần nào đó của một cơ quan thực vật. - Cấy tế bào và huyền phù tế bào: cấy tề bào cô lập hoặc cụm tế bào rất nhỏ trong môi trường lỏng. - Cấy tế bào trần: cấy tế bào trần thực vật là nuôi cấy những tế bào không có thành (vách) được dùng trong kỹ thuật di truyền. - Cấy túi phấn (thể đơn bội): cấy túi phấn hoặc những hạt phấn chưa trưởng thành để thu được tế bào đơn bội hay mô sẹo trong kĩ thuật di truyền. 1.1.4. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau: - Các muối khoáng đa lượng và vi lượng - Các vitamin - Các amino acid - Nguồn carbon: một số các loại đường - Các chất điều hoà sinh trưởng - Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, - Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: các loại thạch (agar) Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro. 7
  21. Các nhà khoa học sử dụng các môi trường nuôi cấy rất khác nhau. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố: - Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành phần môi trường. - Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân giống, ) - Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng, ). 1.1.4.1. Các khoáng đa lượng Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng. Ví dụ, Mg là một phần của phân tử diệp lục, Ca là thành phần của màng tế bào, N là thành phần quan trọng của amino acid, vitamin, protein và các acid nucleic. Tương tự, Fe, Zn và Mo cũng là thành phần của một số enzyme. Các môi trường khác nhau có hàm lượng và thành phần chất khoáng khác nhau, ví dụ thành phần và nồng độ khoáng của môi trường White hoặc Knop khá nghèo nàn, nhưng lại rất giàu ở môi trường MS và B5. Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật: - Muối khoáng là các vật liệu (nguồn N, S, P, ) cho sự tổng hợp các chất hữu cơ. Nitơ, lưu huỳnh, phospho là các thành phần không thể thiếu của các phân tử protein, các acid nucleic và nhiều chất hữu cơ khác. Calci và acid boric được tìm thấy chủ yếu ở thành tế bào, đặc biệt là canxi có nhiệm vụ quan trọng giúp ổn định màng sinh học. - Đóng vai trò như một thành phần không thể thiếu của nhiều enzyme (là các cofactor): Magie, kẽm, sắt, và nhiều nguyên tố vi lượng là những phần quan trọng của các enzyme. 8
  22. - Các ion của các muối hoà tan đóng vai trò quan trọng ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá của thực vật. Ví dụ, K và C rất quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc của tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt hoá nhiều enzyme. Trong môi trường, các muối khoáng được chia thành các nguyên tố vi lượng và đa lượng: - Các chất dinh dưỡng đa lượng bao gồm sáu nguyên tố: nitrogene (N), phosphore (P), potasium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg) và lưu huỳnh (S) tồn tại dưới dạng muối khoáng, là thành phần của các môi trường dinh dưỡng khác nhau. Tất cả các nguyên tố này là rất cần thiết cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật. Môi trường nuôi cấy phải chứa ít nhất 25 mmol/l nitrate và potasium. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy nguồn N cung cấp trong môi trường dưới cả 2 dạng nitrate và amonium (2 – 20 mmol/l) là tốt hơn cả. Trong trường hợp chỉ dùng amonium, thì cần phải bổ sung thêm một acid dạng mạch vòng, tricarboxylic acid hoặc một số acid khác nữa (dạng muối), như: citrate, succinate, hoặc malate sao cho mọi ảnh hưởng độc do nồng độ của amonium vượt quá 8 mmol/L trong môi trường được giảm bớt. Khi các ion nitrate và amonium cùng hiện diện trong môi trường nuôi cấy, thì ion sau được sử dụng nhanh hơn. Các nguyên tố chính khác, như: Ca, P, S và Mg, nồng độ thường dùng trong khoảng 1 – 3 Mmol/l (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). 1.1.4.2. Các vitamin Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có sức sinh trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin. Các vitamin là rất cần thiết cho các phản ứng sinh hoá. Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng. Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác 9
  23. nhau. Khi tế bào và mô dược nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng. Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol. Thiamine là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào. Thiamine thường được sử dụng với nồng độ biến thiên từ 0,1 – 10 mg/l. Acid nicotinic và pyridoxine thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng không cấn thiết cho sự tăng trưởng của tế bào nhiều loài thực vật. Acid nicotinic thường được sử dụng với nồng độ 0,1 – 5 mg/l, pyridoxine được sử dụng với nồng độ 0,1 – 10 mg/l. Myo-inositol thường được pha chung với dung dịch mẹ của vitamin. Mặc dù đây là một carbohydrate chứ không phải là vitamin, nó cũng được chứng minh kích thích cho sự tăng trưởng của tế bào đa số loài thực vật. Người ta cho rằng myo-inositol được phân tách ra thành acid ascorbic và peptine và được đồng hóa thành phosphoinositide và phosphatidylinositol có vai trò quan trọng trong sự phân chia tế bào. Myo-inositol thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật ở nồng độ 50 – 5000 mg/l. Các vitamin khác như biotin, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid, vitamin E (tocopherol), riboflavin và p-aminobenzoic acid cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi cấy. Nhu cầu vitamin trong môi trường nuôi cấy nói chung không quan trọng và chúng cũng không cản trở sự tăng trưởng của tế bào. Nói chung các vitamin này được thêm vào môi trường chỉ khi nồng độ thyamine thấp hơn nhu cầu cần thiết hoặc để cho huyền phù tế bào có thể tăng trưởng khi mật độ tế bào khởi đầu thấp. Các vitamin sau đây được sử dụng phổ biến: inositol, thyamine HCl (B1), pyridoxine HCl (B6), nicotinic acid, trong đó vitamin B1 là không thể thiếu và được sử dụng trong hầu hết những môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Linsmaier và Skoog đã khẳng định vitamin B1 là cần thiết cho cho sự sinh trưởng của cây sau khi nghiên cứu kỹ lưỡng về sự có mặt của nó trong môi trường MS. Các tác giả khác cũng khẳng định vai trò rất quan trọng của B1 trong nuôi cấy mô. Inositol thường được nói đến như là một vitamin kích thích một cách tích cực đối với sự 10
  24. sinh trưởng và phát triển của thực vật, mặc dù nó không phải là vitamin cần thiết trong mọi trường hợp. Các vitamin khác, đặc biệt là nicotinic acid (vitamin B3), calci pantothenate (vitamin B5) và biotin cũng được sử dụng để nâng cao sức sinh trưởng của mô nuôi cấy. ảnh hưởng của các vitamin lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác nhau là khác nhau hoặc thậm trí còn có hại (gây độc) (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). 1.1.4.3. Nguồn carbohydrate Nguồn carbohydrate là một thành phần quan trọng trong môi trường nuôi cấy mô. Sự hiện diện của đường trong môi trường cấy là quan trọng cho sự nhân chồi và tăng chiều cao của cây con. Các mẫu nuôi cấy mô thực vật nói chung không thể quang hợp hoặc quang hợp rất thấp do thiếu chlorophyl, nồng độ CO2 và nhiều điều kiện khác. Vì vậy phải đưa thêm hợp chất carbohydrate vào môi trường nuôi cấy và hợp chất carbohydrate được sử dụng phổ biến là đường sucrose. Lý do nó được sử dụng phổ biến là nó ổn định trong hấp khử trùng và được cây sử dụng. Đường succharose vừa là nguồn carbon cung cấp cho mẫu cấy, đồng thời còn tham gia vào điều chỉnh khả năng thẩm thấu của môi trường. Hàm lượng đường cao mô nuôi cấy khó hút được nước. Hàm lượng đường quá thấp là một trong những nguyên nhân gây hiện tượng mộng nước ở mẫu cấy (Debergh, 1991). 1.1.4.4. Nguồn sắt Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelate kết hợp với Na2EDTA. Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng dần ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật. Sắt rất quan trọng trong sinh tổng hợp chlorophyl: trong lá xanh 80% sắt nằm trong lục lạp. Khi thiếu sắt, toàn bộ sắt sẽ tập trung ở lá. Trong lá non, thiếu sắt sẽ dẫn đến sự giảm nhanh nồng độ chlorophyl do quá trình tổng hợp protein bị ngưng lại. Số lượng ribosome cũng giảm mạnh. 11
  25. Thiếu sắt ở rễ kéo theo những thay đổi hình thái. Sự dài rễ giảm nhưng diện tích và số lượng lông rễ tăng (Trần Văn Minh, 1999). 1.1.4.5. pH pH của môi trường là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định của pH môi trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. Ngoài ra sự bền vững và hấp thụ một loạt các chất phụ thuộc vào pH môi trường. Sự hấp thụ các hợp chất sắt cũng phụ thuộc vào pH môi trường. pH của đa số môi trường đều được chỉnh giữa 5,5 – 6 trước khi hấp khử trùng. pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng (Nguyễn Như Khanh, 1990). 1.1.4.6. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Chất điều hoà sinh trưởng thực vật có tên khoa học là phytohormone. Đây là những sản phẩm bình thường của quá trình sống ở thực vật, được tham gia vào điều khiển quá trình trao đổi chất và các quá trình hình thành mới các cơ quan ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây. Những phytohormone hiện nay được biết nhiều nhất là auxin, gibberrellin, cytokinin, acid abscisic và ethylene. Với một hàm lượng rất ít các chất điều hoà sinh trưởng đã có khả năng gây nên tác động làm thay đổi những đặc trưng về hình thái sinh lý của thực vật và chúng có thể di chuyển trong cây được. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đã có mặt cùng lúc nhiều chất điều hoà sinh trưởng khác nhau nhưng với tỷ lệ rất khác nhau. a. Nhóm Auxin Auxin (2,4-D) là loại phytohormone được xác định đầu tiên, được tổng hợp ở hầu hết các mô thực vật và có hoạt tính mạnh. Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non, từ tryptophan được tổng hợp trong lá trưởng thành dưới ánh sáng. Sau đó, auxin di chuyển xuống rễ và tích tụ trong rễ. Trong quá trình phát sinh hình thái, sự di chuyển của auxin có vai trò trong 12
  26. việc thiết lập tính hữu cực của cơ quan thực vật và tác động theo nồng độ trong sự phát sinh cơ quan. Các auxin có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp, thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, đặc biệt là 2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo rễ, Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: - Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu. - Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy. - Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy. - Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh. Đặc tính của auxin: Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Auxin có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào. Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch dẫn. Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin được khái quát dưới đây: - Kích thích phân chia và kéo dài tế bào. - Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên. Ưu thế chồi đỉnh làm ức chế sinh trưởng của chồi nách. Nếu ngắt bỏ chồi đỉnh sẽ dẫn đến sự phát chồi nách. Nếu thay thế vai trò của chồi đỉnh (đã bị ngắt bỏ) bằng một lớp chất keo có chứa IAA thì chồi nách vẫn bị ức chế sinh trưởng. 13
  27. - IAA đóng vai trò kích thích sự phân hoá của các mô dẫn. - Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ trong nuôi cấy mô. - Auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường. - Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus). - Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp). Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi. 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối với môi trường tạo và phát triển callus (Dương Công Kiên, 2003). b. Nhóm cytokinin Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô. Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2- furfurylamino)-1-H-purine-6- amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2- butanylamino) purine (zeatin). Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo. Nói chung, chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng. Một số hợp chất được phát hiện trong thời gian gần đây có hoạt tính giống cytokinin là N,N’-diphenylurea (DPU), thidiaziron, N-2-chloro-4-puridyl-N phenyl urea (CPPU) và một số dẫn xuất khác của diphenyl urea. Hiệu quả đặc biệt của các hợp chất gốc urea lên sự sinh trưởng của mô thực vật cần phải được nghiên cứu thêm. Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi cấy. Đối với sự phát sinh phôi, để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi 14
  28. và chồi nách. Vấn đề quan trọng không kém là nồng độ của hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng này. Chẳng hạn 2,4-D cùng với BA ở nồng độ 5,0 ppm kích thích sự tạo thành callus ở Agrostis nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích tạo chồi mặc dù trong cả 2 trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1. Cơ chế hoạt động của cytokinin là chưa được biết rõ ràng mặc dù có một số kết quả về sự có mặt của các hợp chất mang hoạt tính cytokinin trong RNA vận chuyển (transfer RNA). Các cytokinin cũng có hoạt tính tổng hợp RNA, tăng hoạt tính enzyme và protein trong các mô nhất định. - Kinetin được phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc nucleic acid mới sau khi khử trùng ở nhiệt độ cao hay đun sôi. Trong cơ thể sống không có kinetin tồn tại, sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy, nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kích thích quá trình phân chia tế bào (do đó có tên là kinetin) ở các mô không phân hóa. Trong tự nhiên cũng tồn tại một hormone phân bào khác, Letham là người đầu tiên đã phân lập, tinh chế và cho kết tinh thành công hormone phân bào tự nhiên đó từ nội nhũ đang ở dạng sữa của hạt ngô. Hợp chất cytokinin tự nhiên đó được gọi là zeatin. - Tương tự các cytokinin khác, zeatin cũng là một dẫn xuất của adenin. Trong thực tiễn nuôi cấy mô người ta chỉ dùng zeatin trong những trường hợp đặc biệt vì giá thành rất đắt, thường thay thế zeatin bằng kinetin hoặc một sản phẩm tổng hợp nhân tạo khác, đó là: - BAP: Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền vững hơn zeatin dưới tác động của nhiệt độ cao. BAP có khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao đổi chất. Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v.v, Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ. 15
  29. Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như sau: - Kích thích phân chia tế bào - Tạo và nhân callus - Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô - Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh - Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào - Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - Ức chế sự hình thành rễ - Ức chế sự kéo dài chồi - Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục (Dương Công Kiên, 2003). c. Gibberellin Gibberellin được phát hiện vào những năm 1930. Lịch sử phát hiện nhóm hormone này bắt đầu từ 1895 khi người Nhật nói về bệnh lúa von. Năm 1926, xác định được bệnh đó là do loài nấm Gibberella fujikuroi gây ra. Đến những năm 30, mới phân lập và tinh chế được hoạt chất, được gọi là gibberellin. Mãi sau chiến tranh thế giới thứ II năm 1950, người Anh và người Mỹ mới biết đến công trình này của người Nhật. Tới nay, người ta đã phát hiện được trên 60 loại thuộc nhóm gibberellic acid. Loại gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô thực vật là GA3. Trong đời sống thực vật gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi, sinh lý phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật. 16
  30. Nhưng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật tác dụng của gibberellic acid chưa thật rõ ràng. Nhiều tác giả có sử dụng và coi đó là thành phần không thể thiếu của một loại môi trường chuyên dụng nào đó. Trong số hơn 20 chất thuộc nhóm gibberellin, GA3 là chất được sử dụng nhiều hơn cả trong thực tiễn. GA3 kích thích kéo dài chồi và nảy mầm của phôi vô tính. So với auxin và cytokinin, gibberellin hiếm khi được dùng. GA3 có tính hoà tan trong nước. Gibberellin có các chức năng cơ bản sau: - Các mô phân sinh trẻ, đang sinh trưởng, các phôi non, tế bào đầu rễ, quả non, hạt chưa chín hoặc đang nảy mầm đều có chứa nhiều gibberellic acid. - Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, ví dụ kéo dài than và đòng lúa sau khi phun GA3, kéo dài đốt thân. Các cây lùn thường bị thiếu gibberellin. - Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống, ví dụ phá ngủ khoai tây sau thu hoạch. - Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi. Năm đầu thân mầm nằm in, sau mùa đông mầm hoa kéo dài đốt rất nhanh và phân hoá hoa. - Ức chế sự hình thành rễ bất định. - Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm, giúp tiêu hoá các chất dự trữ trong nội nhũ để nuôi mầm cây. - Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ). - Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn. - Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt. - Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi. 17
  31. d. Abscisic acid ABA thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ nghỉ của chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa, đóng khí khổng. ABA còn có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy ABA được đưa vào môi trường nuôi cấy và mang lại hiệu quả nhất định. Trong nuôi cấy mô và tế bào, ABA có tác dụng tạo phôi vô tính, kích thích sự chín của phôi, kích thích sự phát sinh chồi ở nhiều loài thực vât. Các tác dụng cơ bản của ABA là: - Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả. - ABA thường được sản sinh khi có các yếu tố ức chế cây trồng như mất nước và nhiệt độ thấp đóng băng. - Tham gia vào sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy mầm của hạt. - Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để kiểm soát sự kéo dài thân cành. - Gây ra sự đóng khí khổng. e. Ethylene Các chức năng cơ bản của Ethylene: - Gây già hoá lá, kích thích sự rụng lá và quả. - Làm chín quả. - Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng, lão hoá, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh. - Điều khiển sự chín của một số loại quả. 18
  32. - Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây. Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, dứa, một số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene. - Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá. 1.1.5. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật Nhân giống cây trồng thường trải qua các bước sau: - Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng - Tạo thể nhân giống in vitro - Nhân giống in vitro - Tái sinh thành cây hoàn chỉnh in vitro - Chuyển cây ra vườn ươm để thuần hóa - Tạo cây con bầu đất - Đưa các cây ra đồng ruộng - Chọn lọc cây dòng đầu 1.1.5.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trường Mẫu được nuôi cấy thường ở giai đoạn non, quá trình phân chia và phân hóa mạnh. Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng ở hầu hết các loại cây trồng. Ngoài ra , chồi đỉnh và chồi non của hạt mới nảy mầm cũng được sử dụng. Đỉnh sinh trưởng nhỏ được tách bằng kính lúp. Môi trường được sử dụng rộng rãi trong nhân giống hiên nay là môi trường MS. Đối với mẫu dễ bị hóa nâu môi trường thường bổ sung thêm than hoạt tính ngâm mẫu với hỗn hợp ascorbic acid và citric acid (25 – 150 mg/l). 1.1.5.2. Tạo thể nhân giống in vitro Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo ra thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi (multiple shoot) và thể cắt (cutting) đốt ngoài ra còn có tiền củ (protocorm). Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên và cây trồng. Tuy nhiên có những 19
  33. cây trồng không có khả năng nhân giống người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi bằng mô sẹo. Để tạo thể nhân giống trong môi trường thường bổ sung cytokinin, Auxin, GA3 và các chất hữu cơ khác. 1.1.5.3. Nhân giống in vitro Là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nuôi cấy kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được nhanh chóng. Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn. 1.1.5.4. Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân lá và rễ chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh nhằm đảm bảo sức sống khi ra môi trường ngoài. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy tương tự với quá trình nuôi cấy ngoài tự nhiên, một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro. Thường dùng các nhóm chất thuộc nhóm Auxin kích thích tạo rễ. 1.1.5.5. Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ. Khi chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác cây con dễ bị mất nước, mau bị héo. Để tránh tình trạng này vườn ươm nuôi cấy mô phải mát, cường độ ánh sáng thấp, nhiệt độ không khí mát, độ ẩm cao, cây con thường được cấy trong luốn ươm có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp giữ được ẩm. Trong những ngày đầu cần được phủ bằng nilon để giảm quá trình thoát hơi nước. Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần lụi đi rễ mới xuất hiện. Cây con thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ. 20
  34. 1.1.5.6. Nhân giống ex vitro Cây con sau khi chuyển ra luống ươm hay cấy vào bầu đất sau 7 – 8 ngày thì bắt đầu ra rễ. Sau đó phun dinh dưỡng với hỗn hợp N, P, K (1 g/l cho mỗi loại). Tuy nhiên trong quá trình nhân giống in vitro có nhiều tốn kém thì cây con được sử dụng như là cây mẹ và được tiếp tục nhân giống trên luống ươm. Điều kiện nhân giống trên luống ươm phải tiếp tục đảm bảo cây mẹ ở trạng thái tốt nhất bằng cách giảm dinh dưỡng, duy trì độ ẩm cao, nhiệt độ không khí thấp, hệ số nhân giống trên luống ươm càng cao giúp cho việc giảm giá thành có ý nghĩa. 1.1.5.7. Cây con trong bầu đất Cây con từ ống nghiệm hay được nhân giống trên luống ươm được cấy trên luống đất 15 – 20 ngày cho cây ra rễ và phát triển khỏe, sau đó được cấy vào bầu đất (cây chuối). Bầu đất có cơ chất xốp đầy đủ các chất dinh dưỡng tỉ lệ đất với phân là bằng nhau, ngoài ra hàng tuần được phun dinh dưỡng khoáng 1 – 2 lần/tuần thường phun khoáng có tỷ lệ N-P-K là 20-20-20. Thời gian cây con ở giai đoạn bầu đất phụ thuộc đặc điểm cây trồng 2,5 tháng (cây chuối). Cây bầu đất được đặt ở nơi có ánh sáng, độ ẩm cao, nhiệt độ không khí mát mẻ để cây phát triển nhanh và khỏe. 1.1.5.8. Trồng cây ra ruộng Cây con sau khi đạt được kích thước về chiêu cao, số lá, đường kính thân thích hợp sẽ được chuyển ra đất trồng ở đồng ruộng. Duy trì độ ẩm cao trong giai đoạn này giúp cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên, các nhân tố nông học khác được tác động giống như cây trồng tập quán. 1.1.5.9. Chọn lọc cây đầu dòng Là vấn đề quan trọng đối với cây ăn trái nhằm tạo ra một quần thể đồng đều có năng suất cao và ổn định. Những cây được chọn đầu dòng được đưa vào nhân giống trở lại bằng nuôi cấy mô. 21
  35. Hiện tại công nghệ nhân giống được ứng dụng nhiều trong kinh tế để giải quyết nhu cầu về giống cho sản xuất, giống cho cây lâm nghiệp, trồng rừng, rau, ngũ cốc, cây ăn trái, hoa, cây dược liệu. 1.1.6. Các vấn đề liên quan đến in vitro 1.1.6.1. Tính bất định về mặt di truyền Mặc dù kỹ thuật nhân giống vô tính được sử dụng nhằm mục đích tạo ra quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp này cũng tạo ra những quần thể biến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô sẹo và nuôi cấy tế bào đơn. Những biến dị này được nghiên cứu vận dụng vào cải thiện giống cây trồng nhưng rất ít những biến dị có lợi được báo cáo. Tần số biến dị hoàn toàn khác và không lặp lại. Nuôi cấy mô sẹo và tế bào đơn có sự biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh. Cây trồng biến dị tế bào soma qua nuôi cấy thường là biến dị về chất lượng, số lượng và năng suất, biến dị này không di truyền. Nguyên nhân biến dị chưa được làm sáng tỏ nhưng chủ yếu là do những biến đổi trong vật chất di truyền như đứt gãy, chuyển đoạn DNA hoặc đảo đoạn. Những nguyên nhân gây biến dị soma là: - Kiểu di truyền - Thể bội: cây đa bội thể tần số biến dị cao hơn so với cây nhị bội - Số lần cấy truyền: số lần cấy truyền càng cao thì tần số biến dị càng lớn - Loại mô Biện pháp khắc phục - Hạn chế số lần cấy chuyền - Thay nguồn mẫu mới 1.1.6.2. Ảnh hưởng mẫu nuôi cấy Các nhân tố khi chọn mẫu cấy bao gồm kiểu gene, cơ quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giải đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu: 22
  36. - Kiểu gene: ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy, số chồi tạo ra được, sự khác nhau về tăng sinh chồi, sự khác nhau về khả năng phát sinh phôi. - Chọn cơ quan: hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng nuôi cấy in vitro. - Tuổi và sinh lý: tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa tế bào. Tùy vào đối tượng cây thì có tuổi sinh lý khác nhau. - Sức sống của mẫu: mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in vitro. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để lại virus sản xuất ra cây sạch bệnh. 1.1.6.3. Sản sinh các chất độc từ mẫu cấy Hiện tượng mẫu hóa nâu hay bị đen làm chết mẫu hay làm giảm sự tăng trưởng. Nguyên nhân của hiện tượng này là do mẫu cấy có chứa nhiều tannin hay hidroxyphenol có nhiều trong mô già hơn mộ sẹo Một số biện pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu: - Tách các phần tử phenol ra khỏi môi trường. - Bổ sung chất khử redox (oxidation-redution) phenol vào môi trường. - Ngăn chặn sự hoạt động của enzyme phenolase. - Giảm sự phenol có sẵn trong mẫu bằng môi trường lỏng giống môi trường rắn. - Mẫu chuẩn bị có vết cắt nhỏ, để ngoài vài giờ trước khi cấy, hay nơi cấy trong môi trường không có ánh sáng. Than hoạt tính được đưa vào môi trường để hấp thụ chất kiềm hãm phenol, ngăn chặn quá trình hóa nâu hay đen, đặc biệt có hiệu quả trên cây chuối nồng độ thường là 0,2 g/l. Tuy nhiên than hoạt tính sẽ làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thụ chất kích thích sinh trưởng và các chất khác. Polyvinylpyrolidone (PVP) một chất thuộc loại polyamide, hấp thụ phenol qua vòng hydrogene, ngăn chặn sự hóa nâu, hiệu quả phụ thuộc vào loại cây trồng khác. 23
  37. Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxi hóa vào môi trường ngăn chặn sự oxi hóa phenol. Chất khử thường dùng: vitamin C, acid citric, L- cystein, mecaptoethanol. Phương pháp quan trọng là phối hợp vitamin C và acid citric. Phương pháp khắc phục: - Sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô sẹo. - Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng. - Ngâm mẫu vào dung dịch vitamin C và acid citric vài giờ trước khi cấy. - Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, O2 thấp không có đèn 1 – 2 tuần chuyển mẫu từ môi trường có nồng độ chất kích thích sinh trưởng thấp sang môi trường có nồng độ cao. 1.1.7. Giới thiệu sơ lược về ánh sáng LED Trong thời gian gần đây, nhiều nhà nghiên cứu rất quan tâm đến việc sử dụng các nguồn ánh sáng nhân tạo (đèn compact, đèn LED) tiết kiệm điện năng trong nuôi cấy mô và đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể, trong đó đặc biệt là nguồn ánh sáng đơn sắc từ đèn LED (Light Emitting Diodes) đang được quan tâm. Do quan phổ đèn LED gần trùng với quan phổ hấp thụ của các diệp lục tố có ở cây trồng nên các loại cây trồng có thể hấp thụ tối đa để chuyển hóa năng lượng đèn LED thành năng lượng tế bào, trong khi hiệu suất sử dụng của cây đối với năng lượng ánh sáng mặt trời và các nguồn ánh sáng trắng của đèn huỳnh quang chỉ vào khoảng 35%. 1.1.7.1. Giới thiệu về đèn LED LED (viết tắt của Light Emitting Diode, có nghĩa là Diode phát quang), là các diod có khả năng phát ra ánh sáng nhìn thấy hay tia hồng ngoại, tử ngoại. Công nghệ LED công nghệ chiếu sáng bằng 2 điện cực với sự hỗ trợ của các vật liệu bán dẫn và công nghệ nano. Cũng giống như diod, LED được cấu tạo từ 1 khối bán dẫn loại p ghép với một khối bán dẫn loại n. Trong hai khôi bán dẫn, một khối chứa các 24
  38. điện tử điện tích âm và khối còn lại mang những lỗ trống điện tích dương. Khi chứng gặp nhau, các điện tích âm và dương kết hợp với nhau, tạo ra các electron giải phóng năng lượng dưới dạng lượng tử ánh sáng. Đèn LED (khác với bóng LED) được định nghĩa là tổ hợp bóng LED. Một bộ đèn LED gồm nhiều diod phát sáng thật nhỏ. Chúng phát ra những chùm sáng có độ dài sóng rất hẹp chứ không bao quát và dư thừa dẫn đến sự phát nóng như ánh sáng trắng của đèn cao áp vẫn được dùng trong chiếu sáng cây trồng. Đèn LED không sử dụng nguồn điện 2 chiều 220V thông thường mà chỉ sử dụng nguồn điện 1 chiều với hiệu điện thế nhỏ nên thường có bộ lọc và bộ điều khiển đi kèm. Hiện tượng biến điện bằng ánh sáng Round phát hiện đầu tiên vào năm 1907 ở phòng thí nghiệm Marconi. Ông đã dùng một dây dẫn và tinh thể Silic các-bua (SiC). Đến năm 1962, LED đầu tiên phát ra ánh sáng có thể nhìn thấy là loại LED đỏ, do Nick Holonyak, Jr. phát hiện ra khi đang làm việc cho công ty General Electric. Đến năm 1968, LED rất đắt tiền khoảng 200 USD mà lại ích ứng dụng. Năm 1968, công ty Monsanto là công ty đầu tiên sản xuất LED hàng loạt dùng gali asen phosphorus (GaAsP). Bốn năm sau, George Craford đã phát minh ra LED vàng đầu tiên và đã cải thiện độ sáng lên 10 lần cho LED đỏ cũng như LED đỏ-cam. Đèn LED thực sự được thương mại hóa thành công vào năm 1970 khi công ty Fairchild Semiconductorbán ra thị trường 5 xu Mỹ cho mõi bóng LED. 1.1.7.2. Ưu và nhược điểm của đèn LED Đèn LED có nhiều ưu điểm như tiết kiệm công suất từ 90% so với đèn sợi đốt và 50% so với bóng đèn compact. Một bóng đèn LED công suất 5W có thể cho ánh sáng tương đương với một bóng đèn thông thường công suất 20W. Lượng nhiệt sinh ra trong quá trình hoạt động của đèn LED cũng thấp hơn rất nhiều (gần như không đáng kể) so với các loại bóng đèn thông thường hiện nay. Ưu điểm đặc biệt được quan tâm nhiều nhất là tính năng an toàn của đèn LED, không độc hại, thân thiện với môi trường. Khi hoạt động không sinh ra các tia hồng 25
  39. ngoại hay tia cực tím. Bất kì sự chấn đọng nhẹ hay va chạm nào thì dây tóc của bóng đèn huỳnh quang có thể đứt dẫn tới tình trạng cháy nổ nhưng LED do cấu tạo ăn toàn và nhỏ dọn không dễ dàng bị phá hủy và hư hỏng. LED còn an toàn hơn cho người sử dụng về lâu dài và an toàn môi trường do không chứa thủy ngân. Ánh sáng LED liên tục và không nhấp nháy như bóng đèn huỳnh quang. Thời gian bật và tắt cực kì nhanh chóng kể từ khi có tác động (micro giây). Bên cạnh đó đèn LED còn những ưu điểm khác: - Tuổi thọ đèn cao, khoảng 35.000 đến 50.000 giờ lớn hơn nhiều lần so với bóng đèn huỳnh quang và sợi đốt. - Kích thước của bóng đèn LED rất nhỏ. Vì vậy có thể bố trí dễ dàng. - Đèn LED có thể phát ra màu sắc như ý muốn mà không cần bộ lọc màu theo phương pháp truyền thống. Màu sắc của đèn phụ thuộc vào chất liệu làm ra nó. Ví dụ như đèn LED màu đỏ được làm từ các thành phần hóa học như nhôm, gali, asen. Đèn LED màu trắng được tạo ra bằng cách bao phủ một lớp phosphorus màu vàng bên ngoài đèn LED xanh da trời. - Độ sáng tối: đèn LED có thể dễ dàng điều chỉnh độ sáng tối bằng phương pháp điều chế chế độ rộng xung hoặc tăng giảm dòng điện tác động. Bên cạnh ưu điểm trên thì đèn LED cũng có một số nhược điểm nhỏ như sau: - Trên cơ sở chi phí đầu tư ban đầu, bóng đèn LED hiện đắt hơn. - Khoảng cách chất lượng của các loại đèn LED trên thị trường quá xa nhau. Nhiều người sử dụng bóng đèn LED bị nhằm lẫn về chất lượng của bóng đèn LED. Mua phải bộ đèn có chíp LED kém chất lượng, dẫn đến bóng đèn LED giảm độ sáng nhanh và đổi sang màu ánh sáng khác sau một thời gian ngắn sử dụng chỉ khoảng 2 tháng). - Phần lớn hiệu xuất bóng đèn LED phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường xung quanh của môi trường hoạt động, gây ảnh hưởng đến các thiết bị đèn LED tác động lên. 26
  40. Với những ưu điểm trên, đèn LED có thể sử dụng thay thế dần cho đèn huỳnh quang. Những thiết kế với những phong cách khác nhau đã và đang biến đèn LED là một thiết bị chiếu sáng đáng được lựa chọn cho không gian sống của mỗi gia đình và các công trình xây dựng. 1.1.7.3. Ảnh hưởng của đèn LED đến nuôi cấy mô tế bào thực vật Ánh sáng là một trong những yếu tố quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển trực tiếp của thực vật. Ánh sáng tham gia và nhiều quá trình sinh lý của thực vật, trong đó có quá trình quang hợp, ngoài ra còn có quang phát sinh hính thái, tính hướng sáng. Mức độ ảnh hưởng của yếu tố ánh sáng tới thực vật phụ thuộc vào cường độ, chất lượng và thời gian chiếu sáng (Dương Tấn Nhựt, 2011). Ở một số nghiên cứu khác cho thấy ánh sáng có ảnh hưởng lớn đến đặc tính của cây trồng như kích thước, kết cấu, hình ảnh màu sắc lá, thời gian ra hoa, hương vị của quả (Eskins et al.,1996), trọng lượng khô, chiều cao cây, độ dài của lá và số lượng lục lap trong mỗi tế bào. Ánh sáng đỏ có vai trò quan trọng trong quang hợp và tổng hợp tinh bột của thực vật, ánh sáng xanh lại thể hiên vai trò trong hình thành chlorophyl, phát triển lục lạp, đóng mở khí khổng và quang phát sinh hình thái (Akoyunoglou và Anni, 1984). Hiện nay, đèn huỳnh quang đang được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Tuy nhiên, ánh sáng trắng tạo ra từ đèn huỳnh quang là một tổ hợp ánh sáng có các bước sóng khác nhau từ 380 – 800 nm, trong số các bước sóng này có những bước sóng thực vật không có khả năng sử dụng hoặc gây tổn thương đến thực vật (Dương Tấn Nhựt và Nguyễn Bá Nam, 2009). Ngoài ra đèn huỳnh quang còn gây ra hiện tượng tỏa nhiệt cao trong quá trình vận hành, không có lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chi phí bảo trì cho đèn huỳnh quang cao, tốn kém, tuổi thọ thấp. Để khắc phục các nhược điểm trên, nhiều nhà nghiên cứu rất quan tâm đến việc sử dụng các nguồn ánh sáng nhân tạo (đèn compact, đèn LED) trong nuôi cấy mô và đạt nhiều thành tựu đáng kể, trong đó đặc biệt là nguồn chiếu sáng đơn sắc từ đèn LED. Do quang phổ đèn LED gần trùng với quang phổ hấp thụ 27
  41. của diệp lục tố có ỏ cây trồng nên các loại cây trồng có thể hấp thụ tối đa để chuyển hóa năng lượng ánh sáng đèn LED thành năng lượng tế bào, trong khi hiệu suất sử dụng của cây đối với năng lượng ánh sáng mặt trời và các nguồn ánh sáng trắng của đèn huỳnh quang chỉ vào khoảng 35%. Tuy nhiên, ánh sáng là nhân tố quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, do đó ần khảo sát kỹ lưỡng ảnh hưởng của ánh sáng LED đến thực vật trước khi ứng dụng trên quy mô lớn. Theo Tanaka và cộng sự (1988), đèn LED có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng lá, hàm lượng chlorophull, khối lượng chồi và rễ của cây địa lan nuôi cấy in vitro. Tương tự, kết quả nghiên cứu của Lian và cộng sự (2002) cho thấy ảnh hưởng của LED xanh, LED đỏ, LED xanh kết hợp với LED đỏ lên sự tái sinh chồi từ vẫy củ Liliumoriental hydrib ‘Pesaro’. Ngoài ra, nhiều kết quả khả quan khi ứng dụng hệ thống chiếu sáng đơn sắc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được ghi nhận ở một số đối tượng như bạch đàn, hồ điệp, chuối, lan ý, dâu tây, (Dương Tấn Nhựt, 2011). Nghiên cứu của Yanaagi (2006) và Stutte (2009) cho thấy quang phổ đèn LED ứng dụng cho cây trồng chủ yếu dựa trên kiến thức về quang phổ hấp thụ của chất diệp lục tố a (tại 430 và 662 nm), chất diệp lục tố b (tại 153 và 642 nm), phytochrome hấp thụ vùng áng sáng đỏ (tại cực điểm 660 nm) và phytochrome hấp thụ vùng ánh sáng hồng ngoại (tại cực điểm 730 nm) (Yanagi et al., 2006; Stutte, 2009). Theo Kim và cộng sự, các vùng quang phổ khác nhau của đèn LED còn tác động đến sự sinh trưởng của chồi, sự kéo dài cuả đốt thân, tốc độ quang hợp và đặc biệt là khí khổng của cây Cúc in vitro. 1.1.8. Các chất có hàm lượng không xác định bổ sung vào môi trường cấy 1.1.8.1. Nước dừa Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô là của Van Overbeek và cộng sự (1941,1942). Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận. Nước dừa 28
  42. đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996). Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây. Nước dừa thường được lấy từ quả của các giống và cây chọn lọc để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Nước dừa được một số công ty hoá chất bán dưới dạng đóng chai sau chế biến và bảo quản. Thông thường nước dừa được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh. Tồn dư protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có thể dẫn tới kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh. Chất cặn có thể được lọc bỏ hoặc để lắng dưới đáy bình rồi gạn bỏ phần cặn. Nước dừa thường được sử dụng ở nồng độ từ 5 đến 20 % (Trần Văn Minh, 1999). 1.1.8.2. Than hoạt tính Bổ sung than hoạt tính vào trong môi trường nuôi cấy sẽ có lợi ích và có tác dụng khử độc. Khi bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy thì sẽ kích thích sự tăng trưởng và biệt hóa phong lan, hành, cà rốt, cà chua, cây trường xuân nhưng lại có tác dụng cản đối với thuốc lá, đậu nành, trà mi. Than hoạt tính nói chung ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng hoặc làm đen môi trường. Người ta cho rằng tác dụng cản sự tăng trưởng của mô cấy khi có sự hiện diện của than hoạt tính trong môi trường là do nó hút chất điều hòa sinh trưởng có trong môi trường. NAA, kinetine, IAA, BAP, 2-iP liên kết với than hoạt tính. Khả năng kích thích sự tăng trưởng của than hoạt tính là do nó kết hợp với các hợp chất phenol độc tiết ra trong thời gian nuôi cấy. Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 05 – 3% (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). 1.1.9. Giới thiệu sơ lược về giá thể nuôi cấy 1.1.9.1. Agar 29
  43. Agar thường được sử dụng hơn cả vì nó trơ không chịu tác dụng nhiều của các phản ứng hóa học, tính ổn định cao và giá cũng tương đối rẻ. Agar được trích từ tảo và được dùng để chuẩn bị môi trường đặc hay môi trường bán lỏng để nuôi cấy mô thực vật. Agar tan ở 100oC và đông đặc ở 45oC. Độ cứng của agar quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và nồng độ pH của môi trường nuôi cấy. Nồng độ agar thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật là 6 – 8 g. Nồng độ agar sử dụng sẽ ảnh hưởng đến thế năng nước trong môi trường nuôi cấy, độ cứng của môi trường, sự sinh trưởng của mẫu cấy như sự thừa nước và hoạt động của cytokinin trong môi trường có agar. Độ tinh khiết của agar trong môi trường nuôi cấy rất quan trọng. Người ta đã chứng minh được rằng trong agar có chứa Ca, Mg, K, Na và sự tha agar trong môi trường cấy rất quan trọng. 1.1.9.2. Sương sáo Cây sương sáo còn gọi cây thạch đen hay lương phấn thảo, cỏ cổ tích, có tên khoa học Mesona chinensis Benth. Đây là một loại dược liệu cũng là thực phẩm quan trọng, có tổng hàm lượng polyphenol tổng, hàm lượng tanin và pectin chiếm trên 50%. Từ lâu người ta đã biết sử dụng cây sương sáo để tạo nên những thực phẩm ngon, bổ và thanh nhiệt như thạch sương sáo, trà thảo mộc, Trong đông y, cây sương sáo có tính mát, hàn, vị ngọt nhẹ được dùng làm thuốc chữa cảm mạo, viêm khớp cấp, mát thận, viêm khớp, huyết áp cao, đái tháo đường, đau cơ, 1.1.10. Giới thiệu sơ lược về cây chuối 1.1.10.1. Sơ lược về cây chuối trên thế giới Chuối phát triển đầu tiên là ở New Ghinea (Simonds, 1966) sau đó chuyển đến Châu Á – Thái Bình Dương (từ 4000 năm trước công nguyên). Sự mô tả về chuối một cách rõ ràng và sớm nhất là do người Hy Lạp cổ xưa thực hiện năm 325 trước công nguyên trong cuộc hành trình của Alexander đến Ấn Độ (Rcynolds 1927, Kervegant, 1935). Sau đó khoảng 100 năm sau công nguyên, 30
  44. người Ả Rập đã thống trị mảnh đất từ Ấn Độ - Tây Ban Nha (Kinder và Hilgemann, 1974). Chuối lại được quan tâm và phát triển nhất là chuối ăn tươi và ăn luộc đã được đưa đến Bắc Phi và phát triển rộng ở đây, mặc dù mảnh đất này rất khô cằn (Rcynolds, 1927) đã đưa vào những hóa thạch, các bức vẽ trên các hàng động cho rằng chuối cũng đã trồng và phát triển được 15 thế kỷ ở Châu Phi. Trong đó, Đông Phi chủ yếu trồng 2 loại chuối có kiểu gen AA và AAA. Vùng gần xích đạo hơn phát triển chủ yếu chuối ăn luộc mang kiểu gen AAB. Vansina (1984, 1990) đã giải thích về sự xuất hiện hai loài chuối có kiểu gen AAB ở Châu Phi và cả ở Ấn Độ là một phần do sự thích nghi về khí hậu song chủ yếu là nhu cầu cấp bách về lương thực ở những nước này. Đến thế kỷ thứ X do ảnh hưởng của nền văn minh Ả Rập, mối quan hệ giữa các nước này được mở rộng, thời kỳ này chuối là mặt hàng được trao đổi mạnh nhất trên thương trường cả ở những nước xa như Trung Quốc (Davidson, 1974). Người ta cho rằng, chuối được di trồng đến Châu Mỹ nhờ người Bồ Đào Nha từ thế kỷ 14, và sau đó phát triển mạnh vào năm 1607 (Kenvegent, 1935). Trong thời gian gần đây sự thu thập nguồn gene và phổ biến các giống chuối có chất lượng ngày một lan rộng, hơn nữa chuối đã được đưa ra thị trường làm mặt hàng xuất khẩu chính, điều này đã gây ra sự chú ý đầu tư của các nhà khoa học về năng suất và chất lượng của các giống chuối ngày này. Chuối đã được phát triển rộng khắp trên thế giới, không chỉ nó quan trọng do việc xuất khẩu mà còn ở sự đa dạng về hình dáng và chủng loại. Như vậy, chuối trồng đã có 1 quá trình phát triển lịch sử lâu dài, đầu tiên là những cây hoang dại rải rác ở New Ghinea, sau đó được thuần hóa và lan rộng, nhờ dân chúng và các nhà thám hiểm, các cuộc chinh chiến, Ở Châu Á chuối đã xuất hiện từ 4000 năm trước công nguyên. Chính vì vậy, có thể nói chuối có nguồn gốc từ Châu Á, điều này không những thể hiện ở sự phát triển mạnh của chuối ăn tươi và chuối ăn luộc do thích hợp khí hậu mà còn ở sự đa dạng các chủng loại chuối: ở Philippin có 80 loài, Malaysia 32 loài, New Ghinea 54 loài, Ấn Độ 57 loại, 31
  45. 1.1.10.2. Các phương pháp truyền thống thường được sử dụng trong nhân giống chuối a. Nhân giống bằng hạt Bước 1: ngâm hạt giống vào nước 2 sôi 3 lạnh từ 24 – 36 giờ. Bước 2: gieo hạt giống vào đất khoảng 0,6 cm. Đặt ở nơi có nhiều ánh sáng trực tiếp, lấp đất lại, tưới nước hằng ngày. b. Tách chồi non từ cây mẹ Trên cây mẹ chọn những cây con 4 – 6 tháng tuổi có 3 đến 4 lá thật, cao 1 đến 1.2 m tách ra và đem trồng mới. Khi trồng có thể cắt thân giả cách cổ thân 20cm hoặc có thể trồng cả thân nhưng cắt bớt lá. c. Nhân giống bằng củ - Chẻ làm 6 đến 8 miếng, mõi miếng có một mầm tốt. - Xử lý thuốc xác khuẩn rồi đem ươm bằng cách áp mặt cắt bằng phẳng xuống dưới đất ẩm đã được xử lý. - Một số chồi sẽ phát triển sau 6 đến 8 tháng bứng lên đem trồng. 1.1.10.3. Phân loại Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Liliopsida Bộ: Zingiberales Họ: Musaceae Chi: Musa Loài: Acuminata Red Dacca Hình 1.1. Chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) 32
  46. 1.1.10.4. Sơ lược về chuối đỏ a. Hiệu quả kinh tế Chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) là có nguồn gốc ở Ấn Độ và Đông Nam Á. Bên cạnh đó, chuối đỏ còn được trồng nhiều ở Úc, New Zealand và nhiều nơi trong quần đảo Thái Bình Dương. Chuối đỏ có màu đỏ, da tím, khi chuối chín có màu đỏ tươi, thịt có màu kem hồng nhạt. Chiều cao tối đa của cây có thể đạt 3 – 4 m. Sau 12 – 18 tháng cây mới trổ hoa, ra quả. Trung bình một buồng có trên dưới 10 nải. Thời gian từ khi trổ cờ đến lúc quả chín khoảng 5 tháng, cây sinh trưởng khoẻ, ít sâu bệnh. Những buồng chuối nặng khoảng 250 – 300 kg. Chuối đỏ có giá có giá từ 200 – 300 nghìn đồng/nải. Cao hơn hẳn so với chuối thường và được nhiều người ưa chuộng. Theo nông dân thì việc trồng chuối đỏ bằng hạt nhiều rủi ro hơn là bằng cây cấy mô do yêu cầu khắt khe về quy trình ươm, kỹ thuật tưới, chăm sóc, chưa kể đến thời tiết, thổ nhưỡng mỗi vùng cũng cần phù hợp. Hiện vì có quá nhiều người tìm mua, đặt mua mà chưa có hàng nên giống chuối đỏ đã tăng 30 – 40% so với trước. Từ nhu cầu đó của người nông dân chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng nhân nhanh in vitro chồi chuối đỏ. Hình 1.2. Cây chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) 33
  47. a. Công dụng chuối đỏ - Đối với sức khỏe Chuối đỏ không chỉ cung cấp nguồn vitamin dòi giào cho cơ thể mà chuối đỏ còn đem lại sự mịn màng cho làn da và sức khỏe mạnh cho đôi mắt, đồng thời chuối có tác dụng hạ huyết áp. Ăn chuối đỏ thường xuyên còn có tác dụng chóng rụng tóc, vỏ chuối cũng là một vị thuốc. Chuối có tác dụng thanh nhiệt, nhuận tràng, giải độc. Chủ yếu dùng cho bệnh nhân thể nóng, khát nước, táo bón, chảy máu trĩ, cao huyết áp. Ngoài ra, loại quả này có tác dụng kích thích hệ miễn dịch, tạo ra INF (chất có tác dụng tiêu diệt các tế bào khác thường sinh ra bệnh ung thư). Chuối đỏ còn có tác dụng giúp giảm béo vì chuối có hàm lượng tinh bột cao nên dễ gây no bụng, vì khi tinh bột được hấp thụ vào cơ thể và chuyển hóa thành đường cần một khoảng thời gian nhất định, nên năng lượng không bị tích trữ trong cơ thể quá nhiều. Chính vì lý do này, chuối đỏ đã được các nhà khoa học xếp vào nhóm thực phẩm giảm béo hiệu quả. Giảm lượng cholesterol trong máu, trong thân chuối đỏ có một chất có thể khống chế được cholesterol trong máu. Chuối còn chữa bệnh cao huyết áp cho người cao huyết áp. Chuối giúp điều trị loét đường tiêu hóa trong quả chuối đỏ chứa có một chất có tác dụng kích thích sinh sản các tế bào niên mạc dạ dày để bảo vệ thành dạ dày nên hạn chế được khả năng chảy máu dạ dày. Chuối còn điều trị bệnh mẫn ngứa da và cắt cơn ho. - Công dụng làm đẹp Tác dụng của chuối trong làm đẹp rất nhiều và đa dạng. Nếu ăn chuối đem lại các lợi ích về sức khỏe thì việc áp dụng cách chăm sóc da và tóc từ chuối sẽ giúp bạn bảo vệ và làm đẹp rất tốt. Chuối vô cùng tốt cho tóc và da của bạn vì nó có đặt tính giữ ẩm tự nhiên. Chuối rất giàu khoáng chất và vitamin (vitamin E, A, B VÀ C) giúp chăm sóc da khỏe mạnh và phục hồi tóc hư tổn. Chuối rất giàu kali và các loại dầu tự nhiên, 34
  48. khiến nó trở thành một chất làm mềm tuyệt vời. Trytophan có trong chuối là một acid amin có tác dụng hoàn hảo trong chăm sóc sắc đẹp. 1.1.10.5. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô (in vitro) a. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô trên thế giới Rodriguez - Enriquez và cộng sự (1987) cho biết từ một chồi chuối ban đầu qua cầy chuyển liên tiếp có thể sinh sản và duy trì được 3 năm trong ống nghiệm. Weathers và cộng sự (1988) đã đề xuất phương pháp nuôi cấy mô chuối cải tiến trong hệ phun mù. Các mô hoặc tế bào chuối nuôi cấy được đặt trên giấy lọc bằng vật liệu trơ sinh học, vô trùng và được phun dung dịch dinh dưỡng qua hệ thống phun mù để vừa điều chỉnh độ ẩm vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây. Kết quả cho thấy, chuối non mọc tốt hơn, các mô hoặc tế bào chuối tái sinh cao hơn 4 – 6 tuần, số lượng chồi lớn hơn 3 – 20 lần, chu kỳ nhân ngắn hơn 20 – 50% và chất lượng cây tốt hơn so với đối chứng (nghiên cứu trên môi trường agar thường). Theo Kawit – Wanichkul và cộng sự (1993) cho rằng môi trường tốt nhất để nhân giống chuối nuôi cấy mô là môi trường MS có bổ sung 15% nước dừa, 1 g/lít than hoạt tính và 10 mg/l BAP, pH 5,6 và nồng độ agar là 0,5%. Mô phân sinh chuối sẽ phát triển thành cây con trong 2 tháng. Và ông cũng cho rằng hỗn hợp bụi xơ dừa + cát + phân + compost + đất (tỷ lệ 1:1:1:0,5:0,5) là môi trường tốt nhất cho cây chuối nuôi cấy mô bén rễ, cứng cây, các tác giả cũng kết luận thời gian để vườn ươm tốt nhấ là 7 tuần, nếu để quá lâu khi đưa cây ra ngoài đồng ruộng cây sẽ mọc chậm. b. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô ở Việt Nam Đoàn Thị Ái Thuyền và cộng sự (1993) đã đưa ra quy trình nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô bao gồm 5 công đoạn chính sau: đưa mẫu vào nuôi cấy, tạo và nhân nhanh chồi chuối, tạo rễ cây, ươm chuối trong vườn ươm, bầu 35
  49. chuối và trồng ra sản xuất. Và cũng cho biết cây chuối nuôi cấy mô ở vườn ươm 60 – 70 ngày (luống ươm 30 – 40 ngày và bầu đất 30 ngày) thì được xuất vườn, khi đó cây cao 40 – 40 cm. Đỗ Năng Vịnh và cộng sự (1994) cho biết, tỷ lệ tái sinh phụ thuộc vào giống chuối, các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy và dao động từ 68,42 – 92,31 %. Hệ số của chuối tiêu cao nhất khi bổ sung BAP từ 7 – 9 mg/l. Nước dừa không biểu hiện ảnh hưởng đến chuối tiêu nhưng có ảnh hưởng tốt tới hệ số nhân của chuối rừng ở lượng 10% khi có mặt BAP với lượng 7 mg/l. Tác giả Đỗ Đăng Vịnh (1996) còn cho biết môi trường MS chứa thiamin HCl 2 mg/l, nước dừa 10% và BAP 5 mg/l là thích hợp nhất. Thời gian cấy chuyển chồi tối ưu là 4 tuần, mật độ 5 cụm chồi/bình (mỗi cụm 2 – 3 chồi) sẽ cho hệ số nhân từ 2,5 – 3,0 lần/tháng. 36
  50. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 11/2016 cho đến tháng 7/2018 tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật, Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, Trường Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu - Đối tượng được sử dụng trong nghiên cứu này là cây chuối đỏ (Musa acuminata) in vitro được cung cấp từ Viện Công Nghệ Ứng Dụng Bến Tre. - Nguồn mẫu là các chồi chuối đỏ in vitro có chiều cao từ 2 – 3 cm và có 2 cặp lá. 2.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị - Thiết bị: tủ cấy vô trùng, hồi hấp khử trùng Autolave, máy đo pH, cân phân tích, máy lạnh, các giàn kệ có gắn đèn huỳnh quang, tủ sấy, tủ lạnh, - Dụng cụ: dao cấy, đèn cồn, đĩa petri, bình erlen, bình thủy tinh 500 ml, pipette, - Hóa chất: môi trường khoáng đa lượng – vi lượng MS. Vitamin như thiamine, nicotinic acid, myo – inositol. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: BA; NAA. Hóa chất khử trùng mẫu vật: cồn 70%, xà phòng, chlorine và các chất khác như: đường glucose, agar, nước dừa tươi, 2.2.3. Môi trường nuôi cấy Môi trường được sử dụng là môi trường MS cơ bản của Murashige và Skoog (1962). 2.2.4. Điều kiện nuôi cấy trong phòng nuôi cấy in vitro - Thời gian chiếu sáng: 16 h/sáng, 8 h/tối. 37
  51. - Cường độ chiếu sáng: 2500 lux. - Nhiệt độ: 25 ± 2oC. - Độ ẩm trung bình: 80 – 100 % (tùy vào điều kiện nuôi cấy). Thời gian chiếu sáng và độ ẩm môi trường còn thay đổi tùy thuộc vào mục đích và điều kiện thí nghiệm. 2.2.4. Thiết kế hệ thống LED Hình 2.1. Mô hình thiết kế hệ thống chiếu sáng đèn LED đơn a. Hệ thống chiếu sáng đèn LED trắng; b. Hệ thống chiếu sáng đèn LED vàng; c. Hệ thống chiếu sáng đèn LED xanh; d. Hệ thống chiếu sáng đèn LED đỏ 38
  52. A B C D Hình 2.2. Hệ thống chiếu sáng đèn LED đơn sau khi thiết kế và thi công. A. Hệ thống chiếu sáng đèn LED trắng; B. Hệ thống chiếu sáng đèn LED vàng; C. Hệ thống chiếu sáng đèn LED xanh; D. Hệ thống chiếu sáng đèn LED đỏ 39
  53. Hình 2.3. Mô hình hệ thống chiếu sáng LED kết hợp a. 100% LED đỏ (ĐC); b. 50% LED đỏ kết hợp 50% LED vàng; c. 50% LED đỏ kết hợp 50% LED xanh dương; d. 50% LED vàng kết hợp 50% LED xanh dương A B C D Hình 2.4. Mô hình hệ thống chiếu sáng LED kết hợp A. 100% LED đỏ (ĐC); B. 50% LED đỏ kết hợp 50% LED vàng; C. 50% LED đỏ kết hợp 50% LED xanh dương; D. 50% LED vàng kết hợp 50% LED xanh dương 40
  54. 2.3. Bố trí thí nghiệm 2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của agar lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) Mục tiêu: xác định nồng độ agar thích hợp lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ in vitro. Vật liệu thí nghiệm: cây chuối đỏ in vitro nằm trong bình mô. Có khoảng 3 – 4 cây/bình. Mỗi cây có chiều cao 2 – 3 cm, có 2 cặp lá, thân cây màu đỏ. Tiến hành: các cây chuối đỏ in vitro trong bình mô được cấy vào các chai môi trường thí nghiệm (1 chồi/chai). Thí nghiệm được bổ sung lượng agar với các tỷ lệ khác nhau (bảng 2.1) Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của agar lên sự sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca). Nghiệm thức Nồng độ agar (g/l) A1 6 A2 9 A3 12 A4 15 Tiến hành thu kết quả sau 8 tuần nuôi cây. 2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của sương sáo lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) Mục tiêu: xác định nồng độ sương sáo thích hợp lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ in vitro. Vật liệu thí nghiệm: cây chuối đỏ in vitro nằm trong bình mô. Có khoảng 3 – 4 cây/bình. Mỗi cây có chiều cao 2 – 3 cm, có 2 cặp lá, thân cây màu đỏ. Sương sáo được sử dụng là sương sáo đen dạng bột trong thực phẩm. 41
  55. Tiến hành: các cây chuối đỏ in vitro trong bình mô được cấy vào các chai môi trường thí nghiệm (1 chồi/chai). Thí nghiệm được bổ sung lượng sương sáo với các tỷ lệ khác nhau (bảng 2.2) Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của sương sáo lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca). Nghiệm thức Nồng độ sương sáo (g/l) B1 3 B2 6 B3 9 B4 12 B5 15 Tiến hành thu kết quả sau 8 tuần nuôi cây. 2.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) Mục tiêu: xác định nồng độ nước dừa thích hợp lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ in vitro. Vật liệu thí nghiệm: cây chuối đỏ in vitro nằm trong bình mô. Có khoảng 3 – 4 cây/bình. Mỗi cây có chiều cao 2 – 3 cm, có 2 cặp lá, thân cây màu đỏ. Tiến hành: các cây chuối đỏ in vitro trong bình mô được cấy vào các chai môi trường thí nghiệm (1 chồi/chai). Thí nghiệm được bổ sung lượng nước dừa với các tỷ lệ khác nhau (bảng 2.3) 42
  56. Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca). Nghiệm thức Nồng độ nước dừa (%) C1 0 C2 5 C3 10 C4 15 C5 20 C6 25 Tiến hành thu kết quả sau 6 tuần nuôi cây. 2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED đơn sắc lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) Mục tiêu: xác định loại đèn LED thích hợp lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ in vitro. Vật liệu thí nghiệm: cây chuối đỏ in vitro nằm trong bình mô. Có khoảng 3 – 4 cây/bình. Mỗi cây có chiều cao 2 – 3 cm, có 2 cặp lá, thân cây màu đỏ. Tiến hành: các cây chuối đỏ in vitro trong bình mô được cấy vào các chai môi trường thí nghiệm (1 chồi/chai). Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường có nồng độ agar tốt nhất theo kết quả thí nghiệm 1 và nồng độ nước dừa tốt nhất theo kết quả thí nghiệm 3 (bảng 2.4). 43
  57. Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của đèn LED lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca). Nghiệm thức Nguồn sáng D0 (ĐC) Huỳnh quang D1 LED trắng D2 LED đỏ D3 LED xanh D4 LED vàng Tiến hành thu kết quả sau 8 tuần nuôi cây. 2.3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED kết hợp lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) Mục tiêu: xác định loại đèn LED kết hợp thích hợp lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ in vitro. Vật liệu thí nghiệm: cây chuối đỏ in vitro nằm trong bình mô. Có khoảng 3 – 4 cây/bình. Mỗi cây có chiều cao 2 – 3 cm, có 2 cặp lá, thân cây màu đỏ. Tiến hành: các cây chuối đỏ in vitro trong bình mô được cấy vào các chai môi trường thí nghiệm (1 chồi/chai). Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường có nồng độ agar tốt nhất theo kết quả thí nghiệm 1 và nồng độ nước dừa tốt nhất theo kết quả thí nghiệm 3 (bảng 2.5). 44
  58. Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng của đèn LED kết hợp lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca). Nguồn sáng LED kết hợp tỷ lệ Nghiệm thức 50:50 Eo(ĐC) 100% đỏ E1 Đỏ -xanh E2 Xanh – vàng E3 Đỏ - vàng Tiến hành thu kết quả sau 6 tuần nuôi cây. 2.3.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần của môi trường dinh dưỡng và thời gian bổ sung thêm dinh dưỡng lên khả năng tăng trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) Mục tiêu: xác định kiểu bổ sung dinh dưỡng thích hợp lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ in vitro. Vật liệu thí nghiệm: cây chuối đỏ in vitro nằm trong bình mô. Có khoảng 3 – 4 cây/bình. Mỗi cây có chiều cao 2 – 3 cm, có 2 cặp lá, thân cây màu đỏ. Tiến hành: các cây chuối đỏ in vitro trong bình mô được cấy vào các chai môi trường thí nghiệm (1 chồi/chai). Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường có nồng độ agar tốt nhất theo kết quả thí nghiệm 1 và nồng độ nước dừa tốt nhất theo kết quả thí nghiệm 3 (bảng 2.6). Lượng agar trong môi trường ban đầu khoảng 60 ml, lượng môi trường lỏng bổ sung vào sau khoảng 30 ml. 45
  59. Bảng 2.6. Khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần của môi trường dinh dưỡng và thời gian bổ sung thêm dinh dưỡng lên khả năng tăng trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) Nghiệm thức Môi trường Thời gian bổ sung Không bổ sung thêm môi trường F0(ĐC) 1 lớp agar (đối chứng) trên lỏng Bổ sung 1 lớp dinh dưỡng lỏng F1 2 lớp dưới agar bên trên cùng lúc trên lỏng Bổ sung 1 lớp dinh dưỡng lỏng F2 1 lớp dưới agar bên trên sau 1 tuần nuôi cấy trên lỏng Bổ sung 1 lớp dinh dưỡng lỏng F3 1 lớp dưới agar bên trên sau 2 tuần nuôi cấy trên lỏng Bổ sung 1 lớp dinh dưỡng lỏng F4 1 lớp dưới agar bên trên sau 3 tuần nuôi cấy trên lỏng Bổ sung 1 lớp dinh dưỡng lỏng F5 1 lớp dưới agar bên trên sau 4 tuần nuôi cấy Tiến hành thu kết quả sau 6 tuần nuôi cây. 2.3.7. Chỉ tiêu nghiên cứu - Trọng lượng tươi (g) - Trọng lượng khô (g) - Chiều dài lá (cm) - Chiều cao cây (cm) - Chiều dài rễ (cm) - Đường kính thân (cm) - Số rễ (rễ) - Đặc điểm bên ngoài 46
  60. 2.3.8. Thống kê và xử lý số liệu Tiến hành bố trí thí nghiệm theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm MicroSoft Excel 2013® và phần mềm xử lý số liệu SAS 9.1. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các số liệu trung bình có cùng ký tự a, b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b, ) chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. 47
  61. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của agar lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro Hiện nay agar được sử dụng có vai trò như giá thể trong nuôi cấy in vitro do nó ổn định trong tất cả điều kiện nhiệt độ, không bị phân hủy bởi enzyme thực vật và giữ cây đứng vững trong môi trường nuôi cấy. Ở thí nghiệm này, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của agar đến sự sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) ở các nồng độ khác nhau (6, 9, 12, 15 g/l). Chồi chuối đỏ in vitro cao 2 – 3 cm, có 2 cặp lá dùng làm mẫu cấy để thực hiện thí nghiệm. Sau 1 tuần nuôi cấy mẫu cấy không có nhiều sự khác biệt về hình thái. Sau 3 tuần nuôi cấy các mẫu cấy bắt đầu phát triển. Sau 6 tuần, kích thước của mẫu cấy tăng dần theo thời gian nuôi cấy nhờ nuôi trong điều kiện ánh sáng liên tục. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát agar ở các nồng độ khác nhau nhằm tìm ra nồng độ thích hợp cho sự tăng trưởng tạo cây hoàn chỉnh ở chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca). Đến tuần thứ 8 các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Các kết quả thí nghiệm được thu và trình bày ở bảng 3.1; đồ thị 3.1 và hình 3.1, hình 3.2. 48
  62. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của agar đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro Đường Trọng Trọng Chiều Chiều Chiều Số rễ kính NT lượng lượng dài lá cao cây dài rễ (rễ) Đặc điểm bên ngoài thân tươi (g) khô (g) (cm) (cm) (cm) (cm) Thân vươn thẳng, cây to, lá khỏe, rễ a a a a a a a A1 10,923 0,906 9,73 11,97 26,77 1,06 24,33 dài và nhiều. Phát triển đều. Thân phát triển bình thường, lá khỏe, b b b b b b b A2 7,586 0,736 7,57 7,50 22,10 0,75 20,00 phát triển đều. Thân phát triển bình thường, lá xanh bc c bc bc c b c A3 6,206 0,540 6,47 6,03 18,93 0,77 15,67 nhạt và nhỏ. c c c c c c d A4 4,613 0,420 5,43 4,97 16,73 0,65 11,33 Thân còi, lá nhỏ, lá vàng. *Ghi chú: trong cùng một cột các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a,b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ có sự sai khác thống kê với p<0,01. 49
  63. Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của agar đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro trong 8 tuần nuôi cấy 50
  64. Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của agar lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của agar lên chiều cao cây và đường kính thân của chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 51
  65. Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của agar lên chiều dài rễ và số rễ của chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 52
  66. Hình 3.1. ảnh hưởng của agar lên sự sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi A1 A2 cấy. (A1, A2, A3, A4 tương ứng với nồng độ 6 ,9 , 12, 15 g/l) A3 A4 53
  67. Hình 3.2. ảnh hưởng của agar lên sự sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy. (A1, A2, A3, A4 A1 A2 tương ứng với nồng độ 6 ,9 , 12, 15 g/l) A3 A4 54
  68. Nhận xét và thảo luận: Dựa vào kết quả bảng 3.1, biểu đồ 3.1 và hình 3.1, hình 3.2 cho thấy trong thí nghiệm trên, nồng độ agar 6 g/l là tốt nhất cho sự tăng trưởng và phát triển chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca). Nghiệm thức A1 cho tốt nhất về mọi chỉ tiêu. Trọng lượng tươi: ở nồng độ 6 g/l agar cho trọng lượng tươi cao nhất là (10,923 g) và giảm dần ở các nghiệm thức khi tăng nồng độ agar. Nghiệm thức A4 cho trọng lượng tươi thấp nhất (4,613 g) khác biêt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Trọng lượng khô: ở nồng độ 6 g/l agar cho trọng lượng khô cao nhất là (0,9067 g). Trọng lượng khô giảm dần khi tăng nồng độ agar. Thấp nhất ở nghiệm thức A4 15 g/l agar (0,420 g), khác biệt có ý nghĩa thống kê. Chiều dài lá: nồng độ agar bổ sung nghiệm thức 1 là tốt nhất cho sự phát triển chiều dài lá (9,73 cm). Trong khi nghiệm thức số 4 chiều dài lá chỉ có (5,43 cm) khác biệt có ý nghĩa thống kê. Nghiệm thức số 1 cho sự hình thành và phát triễn rễ với 24 (rễ) và dài khoảng 26 (cm) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Khả năng hình thành rễ có sự khác biệt lớn giữa các nghiệm thức lên sự hình thành và phát triển của rễ khi nồng độ agar tăng. Nồng độ agar trong nghiệm thức số 1 là tốt nhất cho sự phát triển của chiều cao cây (11,97 cm) khác biệt có mức ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Càng tăng nồng độ agar thì chiều cao cây càng giảm. Đo đó ta thấy, nồng độ agar bổ sung vào môi trường nuôi cấy 6 g/l là thích hợp cho sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro. 3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của sương sáo lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro Ở thí nghiệm này chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ sương sáo lên sự tăng trưởng tạo cây hoàn chỉnh của cây chuối đỏ in vitro ở các nông độ khác 55
  69. nhau (3, 6, 9, 12, 15 g/l). Chồi chuối đỏ in vitro cao 2 – 3 cm, có 2 cặp lá dùng làm mẫu cấy để thực hiện thí nghiệm. Sau 1 tuần nuôi cấy mẫu cấy không có nhiều sự khác biệt về hình thái. Sau 3 tuần nuôi cấy các mẫu cấy bắt đầu phát triển. Sau 6 tuần, kích thước của mẫu cấy tăng dần theo thời gian nuôi cấy nhờ nuôi trong điều kiện ánh sáng liên tục. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát sương sáo ở các nồng độ khác nhau nhằm tìm ra nồng độ thích hợp cho sự tăng trưởng tạo cây hoàn chỉnh ở chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca). Đến tuần thứ 8 các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Các kết quả thí nghiệm được thu và trình bày ở bảng 3.2. 56
  70. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của sương sáo đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ in vitro Đường Trọng Trọng Chiều Chiều Chiều kính Số rễ NT lượng lượng dài lá cao cây dài rễ Đặc điểm bên ngoài thân (rễ) tươi (g) khô (g) (cm) (cm) (cm) (cm) B1 3,497c 0,361c 5,53c 6,77d 5,40c 0,83b 16,67b Thân còi, lá nhỏ, lá vàng, rễ ít và kém phát triển. B2 5,765b 0,607b 7,27b 10,73c 19,77ab 0,78b 18,33b Thân phát triển bình thường, thân to, lá khỏe, phát triển đều. B3 8,211a 0,795a 8,53a 15,03a 23,53a 0,89a 24,67a Thân vươn thẳng, cây to, lá khỏe, rễ dài và nhiều. Phát triển đều. B4 6,083b 0,560b 6,93b 13,17ab 20,83ab 0,78b 14,67bc Thân phát triển bình thường, lá khỏe, phát triển đều. B5 4,969bc 0,486bc 5,7c 11,7bc 18,10b 0,74b 10,67c Thân phát triển bình thường, lá xanh nhạt và nhỏ. *Ghi chú: trong cùng một cột các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a,b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ có sự sai khác thống kê với p<0,01. 57
  71. Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của sương sáo đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro trong 8 tuần nuôi cấy 58
  72. Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của sương sáo lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của sương sáo lên chiều cao cây và đường kính thân của chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 59
  73. Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của sương sáo lên chiều dài rễ và số rễ của chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 60
  74. B1 B2 B3 B4 B5 Hình 3.3. Ảnh hưởng của sương sáo lên sự sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy. (B1, B2, B3, B4, B5 tương ứng với nồng độ 3, 6, 9, 12, 15 g/l) 61
  75. B1 B2 B3 B4 B5 Hình 3.3. Ảnh hưởng của sương sáo lên sự sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ in vitro sau 8 tuần nuôi cấy. (B1, B2, B3, B4, B5 tương ứng với nồng độ 3, 6, 9, 12, 15 g/l) 62
  76. Nhận xét và thảo luận: Dựa vào số liệu thu thập được bảng 3.2 từ thí nghiệm này, tôi có những nhận xét sau: Trọng lượng tươi và trọng lượng khô: ở nồng độ 9 g/l sương sáo cho trọng lượng tươi và trọng lượng khô cao nhất (8,211 g và 0,795 g) khác biệt có ý nghĩa thống kê so vói các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức 1 cho trọng lượng tươi và trọng lượng khô thấp nhất (3,497 g và 0,361 g) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Chiều dài lá tăng dần từ nồng độ sương sáo 3 – 9 g/l. Cao nhất ở nghiệm thức số 3 với nồng độ sương sáo là 9 g/l (8,53 cm). Ở nồng độ sương sáo từ 12 – 15 g/l chiều dài lá giảm dần. Thấp nhất ở nhiệm thức 1 (5,53 cm) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức 3. Việc thay đổi nồng độ sương sáo có ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triễn của rễ. Số lượng rễ nhiều nhất và rễ dài nhất ở nghiệp thức số 3 với nồng độ sương sáo là 9 g/l (23,53 rễ và 24,67 cm) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Chiều cao cây tăng dần ở các nồng độ 3 – 9 g/l sương sáo. Cao nhất ở nghiệm thức số 3 với nồng độ sương sáo là 9 g/l (15,03 cm) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Thấp nhất ở nghiệm thức số 1 là (6,77 cm). Từ kết quả tổng hợp cho thấy, sương sáo cũng có tác động tích cực đến sự phát triển in vitro chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) về trọng lượng tươi, trọng lượng khô, chiều dài lá, chiều cao cây, số rễ và chiều dài rễ. Tuy nhiên việc thay đổi sương xáo chỉ hiệu quả ở nồng độ trong khoảng 6 – 12 g/l. Cho kết quả tốt nhất ở nồng độ 9 g/l. Tóm lại, trong thí nghiệm nồng độ 9 g/l sương sáo là thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro. 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nước dừa lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) Theo Jacob (1993) sự hình thành mô sẹo là phản ứng tăng sinh hỗn lộn của mô bị thương trong điều kiện có tác nhân kích thích giúp hình thành mô sẹo. Chất điều hòa sinh trưởng là một yếu tố quan trọng tác động lên quá trình này. Nhưng ngoài 63
  77. chất điều hòa sinh trưởng thì nước dừa cũng được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996). Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây. Ở thí nghiệm này chúng tôi nghiêm cứu ảnh hưởng của nước dừa lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) ở các nồng độ khác nhau (0, 5, 10, 15, 20, 25 %) Chồi chuối đỏ in vitro cao 2 – 3 cm, có 2 cặp lá dùng làm mẫu cấy để thực hiện thí nghiệm. Sau 1 tuần nuôi cấy mẫu cấy không có nhiều sự khác biệt về hình thái. Sau 3 tuần nuôi cấy các mẫu cấy bắt đầu phát triển. Sau 6 tuần, kích thước của mẫu cấy tăng dần theo thời gian nuôi cấy nhờ nuôi trong điều kiện ánh sáng liên tục. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát nước dừa ở các nồng độ khác nhau nhằm tìm ra nồng độ thích hợp cho sự tăng trưởng tạo cây hoàn chỉnh ở chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca). Các kết quả thí nghiệm được thu và trình bày ở bảng 3.3. 64
  78. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ in vitro Trọng Trọng Chiều Chiều Đường Số rễ Chiều dài NT lượng tươi lượng cao cây dài rễ kính thân (rễ) Đặc điểm bên ngoài lá (cm) (g) khô (g) (cm) (cm) (cm) C0 2,153d 0,214d 3,80e 6,27d 6,80c 0,70e 7,33d Thân còi, lá nhỏ vàng, rễ kém phát triển. Thân phát triển bình thường, lá xanh nhạt, vàng C1 3,230cd 0,331cd 4,73ed 7,80cd 7,53c 0,79de 9,33d và nhỏ. Thân phát triển bình thường, lá xanh nhạt và C2 3,923bc 0,410bc 6,87bc 9,27c 8,00c 0,92c 15,00bc nhỏ. C3 4,966b 0,505b 8,30ab 11,13b 9,47b 1,11b 19,00b Thân vươn thẳng, lá khỏe, phát triển đều. Thân vươn thẳng, cây to, lá khỏe, rễ dài và C4 9,469a 0,892a 9,70a 14,73a 11,8a 1,42a 25,67a nhiều. Phát triển đều. Thân phát triển bình thường, lá khỏe, phát triển C5 4,353bc 0,423bc 6,00cd 8,77c 7,57c 0,87cd 10,67cd đều. *Ghi chú: trong cùng một cột các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a,b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ có sự sai khác thống kê với p<0,01. 65
  79. Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự phát triển tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro trong 6 tuần nuôi cấy 66
  80. Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng của nước dừa lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi cấy Biểu đồ 3.11. Ảnh hưởng của nước dừa lên chiều cao cây và đường kính thân của chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi cấy 67
  81. Biểu đồ 3.12. Ảnh hưởng của nước dừa lên chiều dài rễ và số rễ của chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi cấy 68
  82. C0 C1 C2 C3 C4 C5 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nước dừa lên sự sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi cấy. (C0, C1, C2, C3, C4, C5 tương ứng với nồng độ 0, 5, 10, 15, 20, 25%) 69
  83. C0 C1 C2 C3 C4 C5 Hình 3.6. ảnh hưởng của nước dừa lên sự sinh trưởng và phát triển của cây chuối đỏ in vitro sau 6 tuần nuôi cấy. (C0, C1, C2, C3, C4, C5 tương ứng với nồng độ 0, 5, 10, 15, 20, 25%) 70
  84. Nhận xét và thảo luận: Dựa vào số liệu thu thập được từ thí nghiệm này, tôi có nhận xét sau: Trọng lượng tươi và trọng lượng khô: ở nghiệm thức số 4 cho trọng lượng tươi và trọng lượng khô cao nhất (9,469 g và 0,892 g) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức đối chứng cho trọng lượng tươi và trọng lượng khô thấp nhất (2,153 g và 0,214 g) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Chiều dài lá: hàm lượng nước dừa có ảnh hưởng nhiều đến sự phát triển của chiều dài lá ở các nghiệm thức so với nghiệm thức đối chứng. Lá dài nhất ở nghiệm thức số 4 với hàm lượng nước dừa 20% (9,70 cm) khác biệt có ý nghĩa thống kê với các nghiệm thức còn lại. Và chiều dài lá thấp nhất ở nghiệm thức đối chứng vớii hàm lượng nước dừa 0% (3,80 cm). Chiều cao cây và đường kính thân: tăng dần ở nồng độ từ 0 – 20 %. Cao nhất ở nghiệm thức số 4 với hàm lượng nước dừa 20% (14,73 cm và 1,42 cm). Ở hàm lượng nước dừa 0% thì chiều cao cây và đường kính thân thấp nhất (6,27 cm và 0,70 cm) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Hàm lượng nước dừa ở nghiệm thức 4 cho số rễ nhiều nhất và dài nhất (25,67 rễ và 11,8 cm) khác biệt có ý nghãi thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Ở các nghiệm thức còn lại lại không cho thấy khả năng phát triển cao so với nghiệm thức đối chứng. Từ kết quả bảng 3.3 cho thấy, nước dừa có tác động tích cực đếm sự phát triển in vitro chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) về trọng lượng tươi, trọng lượng khô, chiều dài lá, chiều cao cây, số rễ và chiều dài rễ. Cho kết quả tốt nhất ở hàm lượng 20% nước dừa. Tóm lại, trong thí nghiệm này việc bổ sung 20% nước dừa là thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro. 71
  85. 3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED đơn sắc lên sự sinh trưởng tạo cây hoàn chỉnh giống chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) Sự phát triển của ngành công nghiệp chiếu sang, do vậy ánh sáng đèn LED đang được quan tâm, và đặc biệt được chú trọng trong phạm vi nhân giống tế bào thực vật. So với đèn huỳnh quang thì đèn LED có nhiều ưu điểm hơn thể tích và kích thước nhỏ, tuổi thọ cao và vùng quang phổ được kiểm soát (Bula et al., 1991; Brown et al., 1995). Với những ưu điểm trên, đèn LED có thể thay thế dần đèn huỳnh quang như nguồn chiếu sáng trong vi nhân giống (Tamulaitis et al., 2005). Ở thí nghiệm này chúng tôi tiến hành ngiên cứu ảnh hưởng của đèn LED có màu sắc khác nhau (huỳnh quang, trắng, vàng, xanh dương, đỏ) đến khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca) in vitro. Chồi chuối đỏ in vitro cao 2 – 3 cm, có 2 cặp lá dùng làm mẫu cấy để thực hiện thí nghiệm. Sau 1 tuần nuôi cấy mẫu cấy không có nhiều sự khác biệt về hình thái. Sau 3 tuần nuôi cấy các mẫu cấy bắt đầu phát triển. Sau 6 tuần, kích thước của mẫu cấy tăng dần theo thời gian nuôi cấy nhờ nuôi trong điều kiện ánh sáng liên tục. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của đèn LED đơn sắc ở các nồng độ khác nhau nhằm tìm ra nồng độ thích hợp cho sự tăng trưởng tạo cây hoàn chỉnh ở chuối đỏ (Musa acuminata Red Dacca). Đến tuần thứ 8 các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Các kết quả thí nghiệm được thu và trình bày ở bảng 3.4. 72