Khóa luận Xác định mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ với các giống cam khác bằng chỉ thị phân tử

61 trang thiennha21 13/04/2022 4280

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Xác định mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ với các giống cam khác bằng chỉ thị phân tử", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_xac_dinh_moi_quan_he_di_truyen_cua_cam_bo_ha_voi_c.pdf

Nội dung text: Khóa luận Xác định mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ với các giống cam khác bằng chỉ thị phân tử

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THÁI THÙY Tên đề tài: XÁC ĐỊNH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CAM BỐ HẠ VỚI CÁC GIỐNG CAM KHÁC BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2015 - 2019 THÁI NGUYÊN, 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THÁI THÙY Tên đề tài: XÁC ĐỊNH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CAM BỐ HẠ VỚI CÁC GIỐNG CAM KHÁC BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Lớp : 47 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2015 - 2019 Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Văn Duy TS. Nguyễn Tiến Dũng THÁI NGUYÊN, 2019
i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này tôi nhận được sự chỉ dẫn tận tình của Thầy TS Nguyễn Văn Duy – Trưởng khoa CNSH-CNTP Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên về phương pháp nghiên cứu, phân tích kết quả, và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn và tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: thầy giáo TS. Nguyễn Văn Duy đã tận tình hướng dẫn, trực tiếp chỉ bảo kĩ năng làm việc và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành khoá luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Tiến Dũng và cán bộ phòng thí nghiệm - Thực hành Sinh học phân tử và các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm đã hướng dẫn kĩ năng làm việc, tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện tốt nhất để tôi học tập và nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè những người đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khoá luận. Trong quá trình thực tập, cũng như trong quá trình làm báo cáo thực tập, khó tránh khỏi sai sót. Đồng thời do trình độ lí luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy, cô để bài báo cáo được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Thái Thùy
ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1: các loài cam,quýt có ý nghĩa trong thực tiễn 4 Bảng 2. 2: Thành phần dinh dưỡng của 100 gram cam tươi (Nguồn: Bộ y tế Viện dinh dưỡng, NXB Y học, năm 2007) 6 Bảng 2. 3: Diện tích, sản lượng cam ở Việt Nam(Nguồn: Tổng cục thống kê 2017) 7 Bảng 3. 1: Kết quả thu thập mẫu 16 Bảng 3. 2: Trình tự các mồi ISSR sử dụng 17 Bảng 3. 3: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 17 Bảng 3. 4: Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong đề tài 17 Bảng 4. 1: Hệ số tương đồng di truyền cuả 32 mẫu cam nghiên cứu 37
iii DANH MỤC HÌNH Hình 2. 1: : top 10 nước sản xuất cam lớn nhất thế giới năm 2018/19 (nguồn [5])(đơn vị:nghìn tấn). 7 Hình 3. 1: Minh họa phân đoạn đồng hình, phân đoạn đa hình trong PCR -ISSR 20 Hình 4. 1: kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số của các mẫu cam. 22 Hình 4. 2: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T1 23 Hình 4. 3: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T2 24 Hình 4. 4: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T3 25 Hình 4. 5: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPT-01 26 Hình 4. 6: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPM-13 27 Hình 4. 7: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPG-17 28 Hình 4. 8: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPQ-18 29 Hình 4. 9: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPA-08 30 Hình 4. 10: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPB-18 31 Hình 4. 11: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPA-04 32 Hình 4. 12: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPC-08 33 Hình 4. 13: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPO-04 34 Hình 4. 14: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPG-16 35 Hình 4. 15 sơ đồ mô tả quan hệ di truyền của 32 mẫu cam nghiên cứu (coefficient: hệ số tương đồng di truyền) 38
iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Bp Base pair - Cặp bazơ nitơ cs Cộng sự CTAB Cetyl trimetyl ammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FAO Food and Agriculture Organization ISSR Inter - simple sequence repeat NTSYSpc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction fragment length polymorphism SSR Simple sequence repeat TAE Tris - acetate - EDTA TE Tris – EDTA
v LỜI CẢM ƠN I DANH MỤC BẢNG II DANH MỤC HÌNH III DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT IV PHẦN 1 1 MỞ ĐẦU 1 1.1Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu của đề tài 2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài 2 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2 PHẦN 2 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Tổng quan về cây cam, quýt 3 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại 3 2.1.1.1. Nguồn gốc 3 2.1.1.2. Phân loại 3 2.1.2 Giá trị cây cam, quýt 4 2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam quýt trên thế giới 6 2.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam, quýt trên thế giới 6 2.2.2. Tình hình sản xuất cây cam, quýt ở Việt Nam 7 2.3. Các kĩ thuật sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền 8 2.3.1. kỹ thuật RAPD 8 2.3.1.1. Giới thiệu về kỹ thuật RAPD 8 2.3.2. Kĩ thuật ISSR 9 2.3.2.1. Giới thiệu về kĩ thuật ISSR 9 2.3.3. Một số kĩ thuật khác 10 2.4. Tình hình nghiên cứu về đa dạng di truyền ở cam, quýt trên thế giới và trong nước 11 2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 11
vi 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 13 PHẦN 3 15 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 15 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu 16 3.2. Vật liệu, thiết bị và hóa chất nghiên cứu 16 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu 16 3.2.2. Thiết bị nghiên cứu 17 3.2.3. Hóa chất 17 3.3. Nội dung nghiên cứu 18 3.4. Phương pháp nghiên cứu 18 3.4.1. Phương pháp tách chiết DNA 18 3.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA tổng số 19 3.4.3. Phương pháp RAPD, ISSR 19 3.4.4 Phương pháp phân tích đa hình 20 3.5. Các phương pháp xử lý số liệu 21 PHẦN 4 22 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá cam 22 4.2. Phân tích các phân đoạn DNA đa hình di truyền bằng RAPD, ISSR 22 4.2.1. Phân tích các đoạn DNA đa hình di truyền bằng RAPD với từng mồi. 23 4.3. Xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống camnghiên cứu dựa trên giản đồ phả hệ DNA 36 4.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loài cam dựa trên các giống đã nghiên cứu. 38 PHẦN 5 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 5.1. Kết luận 41 5.2. Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC I 47
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1Đặt vấn đề Cây cam (citrus sinensis (L.) Osbeck) thuộc họ Prtaceae là một trong những loại cây ăn quả lâu năm có hương vị thơm ngon giá trị dinh dưỡng cao được nhiều người ưa chuộng. Trong thành phần quả cam chưa nhiều vitamin như: vitamin A, B1, C, B9; chất xơ, các chất khoáng vi lượng; chứa chất chống oxy hóa có tác dụng lớn trong chống khối u, chống viêm [2]. Một số nghiên cứu của Bùi Huy Đáp (1960)[4], Trần Thế Tục năm 1977 [10], Nguyễn Minh Châu (2009)[2] đã cho thấy, Việt Nam có nguồn gen cây có múi khá đa dạng với nhiều vùng trồng cam nổi tiếng truyền thống như Tuyên Quang (cam sành Hàm Yên), Bắc Giang (cam sành Bố Hạ), Hà Giang (cam sành), Hòa Bình (cam Cao Phong), Nghệ An (cam Vinh), Hà Tĩnh (cam Bù), Yên Bái (cam canh), Cam Bố Hạ từ lâu đã trở thành thương hiệu nổi tiếng được người tiêu dung trong cả nước biết đến và đã từng trở thành một trong những cây kinh tế mũi nhọn của tỉnh Bắc Giang. Tuy nhiên, qua thời gian vùng cam Bố Hạ với những giống cam quý đặc sản đang dần bị thoái hóa và bị mất đi do nhiều nguyên nhân, Nông trường cam Bố Hạ đã bị giải thể. Nhóm nghiên cứu đề tài “Bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen cam Bố Hạ, Bắc Giang” đã điều tra và thu thập được một số cây cam Bố Hạ tại khu vực trồng cam Bố Hạ trước đây. Việc đánh giá đa hình di truyền, xây dựng cây phát sinh chủng loài của các cây cam Bố Hạ này là cần thiết nhằm cung cấp các thông tin, ứng dụng trong công tác nghiên cứu bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen quý này, góp phần vào sự phát triển kinh tế, xã hội của người dân tỉnh Bắc Giang. Hiện nay, một số phương pháp đã được sử dụng rất phổ biến để đánh giá đa dạng di truyền trên cam, quýt như ISSR, SSR, RAPD Đây là cơ sở khoa học và thực tiễn để quan trọng để ứng dụng trong việc xác định mối quan hệ của cam Bố Hạ với các giống cam khác của đề tài:”Xác định mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ với các giống cam khác bằng chỉ thị phân tử”.
2 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Xác định mối quan hệ di truyền giữa cam Bố Hạ, Bắc Giang với một giống cam khác bằng chỉ thị phân tử DNA. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể -Tách chiết được DNA tổng số từ lá cam, quýt đủ điều kiện để thực hiện phản ứng RAPD, ISSR. - Phân tích được các phân đoạn DNA của các giống cam nghiên cứu bằng kỹ thuật RAPD và ISSR. -Phân tích được mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ với các giống cam thu thập dựa triên sơ đồ phả hệ DNA. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về việc ứng dụng chỉ thị phân tử xây dựng cây phát sinh chủng loài cam. - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần bổ sung thêm những tài liệu khoa học, phục vụ cho công tác giảng dạy cũng như nghiên cứu trên cây cam ở nước ta. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Xác định mối quan hệ di truyền cam Bố Hạ với các giống cam khác là cơ sở để thực hiện các biện pháp bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen cam Bố Hạ, khôi phục lại thương hiệu cam nổi tiếng này và góp phần nâng cao đời sống kinh tế, xã hội cho người dân tỉnh Bắc Giang.
3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về cây cam, quýt 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại 2.1.1.1. Nguồn gốc Cây cam đã được biết đến rất lâu khoảng 2200 năm trước công nguyên ở Trung Quốc nhưng một số người lại cho rằng cây cam có nguồn gốc từ dãy Himalayas (Ấn Độ). Cam được trồng phổ biến ở Ấn Độ, sau đó lan rộng về phía đông, và đến cả vùng Đông Nam Á. Vào khoảng thế kỷ thứ 3 trước công nguyên, cây cam được đưa đến Châu Âu và nó lan ra tới cả vùng Địa Trung Hải. Sau đó, cây cam được Columbus mang đến Châu Mỹ. Những năm sau đó, những người làm vườn ở Châu Mỹ và Châu Âu đã đem cây cam đến Châu Úc và Châu Phi. Ngày nay cây cam được trồng rất phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới [9]. Giống Cam ngọt (Citrus sinensis Osbeck) được xác định có nguồn gốc ở miền Nam Trung Quốc, Ấn Độ và miền nam Indonesia. Sau đó được mang đến trồng ở Châu Âu, Địa Trung Hải và Châu Phi vào thế kỷ 13 đến thế kỷ XVII [1]. Giống cam Washington Navel trên thế giới hay có tên gọi cam Navel ở Việt Nam được cho là dạng đột bến tự nhiên từ một giống cam ngọt, giống này được phát hiện ở Bhia Brail, lần đầu tiên được trông ở Úc năm 1928, ở Florida (Mỹ) năm 1835, ở California năm 1970 và nó nổi tiếng ở Washington D.C. Sau đó được trồng khắp các vùng trồng cam, quýt trên thế giới[8]. Theo một số tài liệu nghiên cứu, cam, quýt có nguồn gốc ở miền Nam châu Á, sự lan trải của cam, quýt trên thế giới gắn liền với lịch sử buôn bán đường biển và các cuộc chiến tranh trước đây. 2.1.1.2. Phân loại Cam quýt thuộc: Giới Plantae Bộ Rutales Họ Rutaceae Chi Citrus
4 Được phân chia làm 130 giống (genera) nằm trong các họ phụ khác nhau [9]. Hiện nay có hai hệ thống phân loại đang được nhiều người áp dụng. Theo Tanaka (Nhật Bản) cam quýt gồm 160-162 loài. Tanaka đã quan sát, ghi chép tỉ mỉ đặc điểm hình thái của các giống đã biến dị này và phân chúng thành một loài mới hoặc giống mới có tên khoa học được bắt đầu bằng tên giống hay tên loài đã phát sinh ra chúng và kết thúc bằng chữ ‘Horticuluture” [9]. Swingle lại chia cam quýt ra làm 16 loài [9]. Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn phải sử dụng hệ thống phân loại của Tanaka để gọi tên các giống cam quýt vì bảng phân loại này chi tiết tới từng giống. Theo Tanaka có 10 nhóm quan trọng nhất trong nhóm True citrus group, đây là những loài được trồng phổ biến và có ý nghĩa với con người. Danh sách nhóm quan trọng này được trình bày trong bảng 2.1[9]. STT Tên loài Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt 1 C.sisnensis Osbeck Sweets Orange Cam ngọt 2 C.aurantium L. Sour Orange Cam chua 3 C.reticulata Blanco Mandarin Quýt 4 C.limon Osbeck Lemon Chanh núm 5 C.medica L. Citron Chanh yên 6 C.aurantifolia Swingle Lime Chanh vỏ mỏng 7 C.trifolia L. Trioliate Chanh đắng 8 C.grandis L. Shadock Bưởi 9 C.paradishi L. Pomelo Bưởi chùm 10 C.fortunenna. kumquat Quất Bảng 2. 1: các loài cam,quýt có ý nghĩa trong thực tiễn 2.1.2 Giá trị cây cam, quýt Cam,quýt là một trong những sản phẩm có giá trị và được nhiều người ưa chuộng, nó mang lại nguồn dinh dưỡng quý cho con người. Không chỉ có ý nghĩa về kinh tế, nguồn dinh dưỡng mà cam quýt còn có giá trị cao về dược liệu. Các sản phẩm của cây cam, quýt hiện nay cung cấp cho thị trường trong nước và ngoài nước góp phần vào tăng trưởng nền kinh tế.
5 Giá trị dinh dưỡng: Quả cây có múi có rất nhiều chất dinh dưỡng nên giá trị sử dụng rất cao. Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng Nước 88,8 g Vitamin E 0,18 mg Năng lượng 38 KJ Beta - caroten 71 µg Protein 0,9 g Alpha - caroten 11 µg Lipid 0,1 g Beta - cryptoxanthin 116 µg Glucid 8,3 g Lutein + Zeaxanthin 129 µg Celluloza 1,4 g Purin 19 mg Tro 0,5 g Lysin 43 mg Đường tổng số 9,35 g Methionin 12 mg Canxi 34 mg Tryptophan 6 mg Sắt 0,4 mg Phenylalanin 30 mg Magie 10 mg Threonin 12 mg Mangan 0,52 mg Valin 31 mg Phospho 23 mg Leucin 22 mg Kali 108 mg Isoleucin 23 mg Natri 4 mg Arginin 52 mg Kẽm 0,22 mg Histidin 12 mg Đồng 140 µg Cystin 10 mg Vitamin C 40 mg Tyrosin 17 mg Vitamin B1 0,08 mg Alanin 51 mg Vitamin B2 0,03 mg Acid aspartic 114 mg Vitamin PP 0,2 mg Acid glutamic 99 mg Vitamin B5 0,25 mg Glycin 83 mg Folat 30 µg Prolin 46 mg Vitamin H 0,89 µg Serin 23 mg
6 Bảng 2. 2: Thành phần dinh dưỡng của 100 gram cam tươi (Nguồn: Bộ y tế Viện dinh dưỡng, NXB Y học, năm 2007) Giá trị kinh tế: Cây ăn quả có múi là một trong những loại cây lâu năm, nhanh cho thu hoạch. Một số giống cho thu hoạch ngay ở năm thứ 2. Ở nước ta, năng suất trung bình của cam, quýt ở thời kỳ 8 tuổi có thể đạt tới 16 tấn/ha. Cây cam, quýt có thể sống và cho thu hoạch quả trong vòng 15-30 năm nên mang lại giá trị kinh tế cao [9]. Giá trị dược liệu và công nghiệp: Ở nhiều nước, người ta dùng các loại quả thuộc cho Citrus làm thuốc chữa bệnh. Thế kỷ XVI, người Trung Quốc và người Ấn Độ đã dùng quả cam quýt để phòng ngừa bệnh dịch hạch, chữa bệnh phổi và bệnh chảy máu dưới da. Ở Mỹ, vào những năm 30 của thế kỷ XX, các thầy thuốc đã dùng quả cam quýt kết hợp với insulin để chữa trị bệnh đái tháo đường. Ở nước ta, nhân dân đã dùng cây ăn quả có múi để phòng và chữa trị một số bệnh từ lâu [9]. Giá trị về môi trường sinh thái: Trong quá trình sinh sống, các loại cam, quýt tiết ra oxy trong không khí làm không khí trở nên trong lành. Trong những chừng mực nhất định các chất bay hơi từ cây cam, quýt có tác dụng diệt một số loài vi khuẩn làm cho không khí trở nên sạch hơn, môi trường sống của con người tốt hơn. Cam, quýt trồng trên các đồi đất bên cạnh việc cho quả còn có tác dụng phủ xanh đất, giữ nước ngăn cản dòng chảy mạnh trên mặt đất sau các trận mưa lớn, do đó có ý nghĩa lớn trong việc làm giảm quá trình xói mòn, rửa trôi đất. Ở vùng trung du và miền núi cam, quýt được trồng trong các vườn rừng, vườn đồi trong các hệ thống VAC (vườn – ao – chuồng) và VACR (vườn – ao – chuồng – rừng) là phương thức canh tác được áp dụng rộng rãi tại các trang trại nông nghiệp và đã thể hiện nhiều ưu điểm trong việc thực hiện nền nông nghiệp bền vững [9]. 2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam quýt trên thế giới 2.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam, quýt trên thế giới Trong suốt mấy thế kỷ qua, ngành sản xuất cam quýt trên toàn thế giới không ngừng tăng nhanh và mức tiêu thụ quả của thị trường thế giới cũng ngày một cao hơn do trồng cam quýt chóng được thu hoạch và lãi suất luôn cao. Trên Thế giới, sản xuất cây có múi là một ngành lớn với diện tích 3,5 triệu ha và sản lượng 80 triệu
7 tấn/năm, mức tiêu thụ bình quân trên đầu người là 15kg quả/năm. Hiện có 75 nước trồng cam quýt với diện tích và sản lượng tăng đáng kể [9]. Hình 2. 1: : top 10 nước sản xuất cam lớn nhất thế giới năm 2018/19 (nguồn [5])(đơn vị:nghìn tấn). Brazil là nước sản xuất, xuất khẩu trái cam và nước cam hàng đầu trên thế giới, sản xuất khoảng 30% sản lượng của thế giới. 94% sản lượng cam của đất nước này tập trung ở bang Sao Paulo. Năm 2018/19 sản lượng cam của Brazil 16 triệu tấn, tiêu thụ tươi khoảng 5 triệu tấn và tiêu thụ khác khoảng 11 triệu tấn. Tiếp theo là Trung Quốc, EU, ba quốc gia hàng đầu này dự kiến sẽ tiếp tục mở rộng sản xuất nhưng với tốc độ chậm hơn. 2.2.2. Tình hình sản xuất cây cam, quýt ở Việt Nam Nước ta nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển các cây có múi. Trong những năm gần đây Chính phủ, các địa phương, cũng đã có nhiều quan tâm đến sự phát triển của cây cam. Chỉ tiêu Năm 2015 Năm2016 Năm 2017 Diện tích trồng (x1000 ha) 78,5 85,4 97,5 Diện tích cho sản lượng (x1000 ha) 58,4 48,4 64,7 Sản lượng (x 1000 tấn) 758,9 727,4 799,5 Bảng 2. 3: Diện tích, sản lượng cam ở Việt Nam(Nguồn: Tổng cục thống kê 2017)
8 Theo Tổng cục Thống kê, năm 2017 sản lượng cây ăn quả tăng cả về diện tích và sản lượng. Sản lượng cam đạt 772,6 nghìn tấn, tăng 20,4% so với năm trước; bưởi đạt 571,3 nghìn tấn, tăng 13,4%; quýt đạt 175,5 nghìn tấn, tăng 6,3%. Tốc độ và tỷ lệ % tăng trưởng trên thể hiện rõ ưu thế và xu hướng thị trường của cây cam và bưởi. Tuy nhiên, tổng sản lượng quả có múi cả nước mới đạt thấp, khoảng 1.519.400 tấn; tính bình quân đầu người năm 2017 mới đạt trung bình khoảng 16kg (tính trên dân số khoảng 95 triệu người) [14]. 2.3. Các kĩ thuật sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền 2.3.1. kỹ thuật RAPD 2.3.1.1. Giới thiệu về kỹ thuật RAPD Kĩ thuật RAPD được định nghĩa là sự đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên. Chỉ thị phân tử RAPD dựa trên kĩ thuật PCR với sự bắt cặp ngẫu nhiên của các đoạn mồi ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước với mạch khuôn, nhân những đoạn có trình tự bổ sung với trình tự mồi. Mồi sử dụng cho phản ứng RAPD là các mồi ngẫu nhiên có nhiệt độ kéo dài mồi thấp từ 34 - 370C. Mặc dù là mồi ngẫu nhiên nhưng vẫn phải đủ 2 tiêu chí là tỉ lệ G/C tối thiểu là 40% và không có trình tự các base đầu xuôi và ngược giống nhau[7]. Kĩ thuật RAPD gồm 3 bước - Tách chiết DNA tổng số. - Thực hiện phản ứng PCR nhân gene, điện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide. - Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, phân tích nhóm UPGMA, lập sơ đồ cây) các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.Sản phẩm PCR - RAPD thường được điện di trên gel agarose 1,5 - 2% hay điện di trên gel polyacrylamide. 2.3.1.2. Những ưu điểm và nhược điểm của kĩ thuật RAPD so với các kĩ thuật sinh học phân tử khác Ưu điểm: Về mặt kĩ thuật: Kĩ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần thông tin về genome của đối tượng nghiên cứu và có thể ứng dụng cho các loài khác
9 nhau với các mồi chung, thao tác đơn giản và dễ thực hiện, chất lượng. DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao. Thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao [9]. Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp. Kĩ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kĩ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao. Nhược điểm: Với những ưu điểm trên RAPD vẫn còn có những hạn chế nhất định như sản phẩm PCR không ổn định giữa những lần nghiên cứu do đặc điểm của mồi là ngẫu nhiên và ngắn, nhiệt độ bắt mồi thấp, phụ thuộc vào điều kiện phản ứng, đôi khi kết quả không lặp lại được và chỉ tạo ra được các chỉ thị trội do đó không phân biệt được các cá thể đồng hợp với các cá thể dị hợp[7]. 2.3.1.3. Ứng dụng của kĩ thuật RAPD Các nghiên cứu cho thấy kĩ thuật RAPD là một phương pháp rất hiệu quả trong việc phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền loài, lập bản đồ di truyền. Kĩ thuật RAPD cũng được sử dụng để nhận biết và phân loại các giống cây khác nhau, xác định sự đa hình di truyền của các cây tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo, phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các loài hay giữa các cá thể để phục vụ cho công tác lai tạo hoặc phân loại. Chỉ thị RAPD còn là công cụ hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay loài khác nhau. Sun và cs (2003) đã sử dụng 160 mồi RAPD để phân tích tính đa hình DNA của 35 giống lúa mì xuân kháng bệnh FHB (Fusarium hesd blight) và phát hiện ra 3 chỉ thị RAPD liên quan đến tính kháng bệnh FHB[16]. Orozco và cs (1994) đã ứng dụng kĩ thuật RAPD để khảo sát mối quan hệ di truyền và tiến hóa của các giống cà phê được lai tạo từ các loài bố, mẹ ở các vùng sinh thái khác nhau làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mục đích tạo con lai có đặc tính quý[35]. 2.3.2. Kĩ thuật ISSR 2.3.2.1. Giới thiệu về kĩ thuật ISSR Kĩ thuật ISSR được định nghĩa là kĩ thuật dựa trên PCR dùng để nhân đoạn gene nằm giữa hai vùng lặp lại giống hệt nhau và ngược chiều nhau. Kĩ thuật này sử
10 dụng các tiểu vệ tinh như các mồi trong phản ứng PCR với một mồi cho nhiều locus đích để nhân bản chủ yếu các chuỗi lặp lại đơn giản với độ dài khác nhau. Các tiểu vệ tinh sử dụng như mồi trong kĩ thuật ISSR có thể là 2, 3, 4, hoặc 5 nucleotide. Các mồi sử dụng có thể không phải mồi neo hoặc là mồi neo ở đầu 3’ hoặc 5’ với 1 đến 4 nucleotide thoái hóa kéo đến các chuỗi bên cạnh. Kĩ thuật ISSR được sử dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền, nghiên cứu đặc điểm di truyền trong quần thể, lấy dấu di truyền, đánh dấu gene, xác định cây trồng, phân tích nguồn gốc, xác định sự thay đổi genome và đánh giá con lai[7]. Kỹ thuật ISSR có một số lợi thế hơn so với các kỹ thuật khác là có thể phân biệt được các kiểu gen gần và không cần thông tin về trình tự gen của cây nghiên cứu. Giống như RAPD, ISSR là kỹ thuật nhanh, dễ tiến hành. Nó ưu việt hơn RAPD là cho nhiều thông tin và có thể lặp lại ở các thí nghiệm do mồi dài hơn. Nhược điểm chủ yếu của ISSR là tạo ra các chỉ thị trội và sự dị đồng nhất của các sản phẩm nhân bản do sự di chuyển đồng thời [7]. 2.3.3. Một số kĩ thuật khác Kĩ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Kĩ thuật AFLP được sử dụng để phát hiện đa hình DNA. Phân tích AFLP được kết hợp cả RFLP và PCR bằng việc gắn các chuỗi nhận biết vào mồi hay còn gọi là chuỗi tiếp hợp để nhân chọn lọc các phân đoạn DNA được cắt hạn chế. Các cặp mồi thường tạo được từ 50 đến 100 băng trong một phân tích. Số lượng băng phụ thuộc vào số nucleotide chọn lọc trong tổ hợp mồi. Kĩ thuật AFLP cho phép lấy dấu DNA từ bất kì nguồn gốc nào. Kĩ thuật này có một số ưu điểm như: có độ tin cậy và lặp lại cao; không cần thông tin về trình tự DNA của cơ thể nghiên cứu; cho nhiều thông tin do có khả năng phân tích số lượng lớn locus đa hình với một tổ hợp mồi trên một gel và có thể cho thấy các locus đặc thù; các số liệu có thể lưu giữ trong cơ sở dữ liệu để so sánh. Có thể dùng phân biệt các cá thể rất gần nhau, lập bản đồ genome[16]. Kĩ thuật đa hình tiểu vệ tinh được nhân bản ngẫu nhiên (Randomly Amplified Microsatellite Polymorphism - RAMP) Kĩ thuật này sử dụng mồi được đánh dấu chứa đầu 5' neo và đầu 3' lặp lại để nhân DNA genome với sự có mặt hoặc vắng mặt các mồi RAPD. Sản phẩm nhận
11 được phân tách trên gel polyacrylamide biến tính. Do mồi lặp lại được đánh dấu nên chỉ có sản phẩm của mồi neo được xác định. Nhiệt độ bắt cặp của mồi neo thường cao hơn mồi RAPD 10 - 15oC. Vì vậy, ở nhiệt độ bắt mồi cao chỉ có mồi neo được kéo dài hiệu quả. Ở các chu kì PCR với nhiệt độ bắt mồi thấp, cả hai mồi neo và mồi RAPD đều kéo dài. Do đó, chương trình PCR được thiết lập sao cho có sự chuyển giữa nhiệt độ bắt mồi cao xuống thấp trong quá trình phản ứng. Hầu hết các phân đoạn nhận được chỉ với các mồi RAMP sẽ biến mất khi có các mồi RAPD và các mẫu băng khác nhau nhận được bởi cùng một mồi RAMP và các mồi RAPD khác nhau cho thấy các mồi RAPD cạnh tranh với mồi RAMP trong chu kì nhiệt độ bắt mồi thấp. RAMP được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở một số loài cây như lúa mạch[35]và đào[37] Kĩ thuật đa hình độ dài các chuỗi đơn giản (Single Sequence Length Polymorphism - SSLP) Là kĩ thuật chỉ thị tạo các chuỗi lặp lại với độ dài khác nhau nằm giữa hai gene. Các chuỗi có độ dài khác nhau là do số lượng trình tự lặp lại trong chuỗi khác nhau do trong quá trình trao đổi chéo không cân hoặc do sự giảm nucleotide trong quá trình sao chép. Cả hai quá trình này đều có thể dẫn đến giảm hoặc tăng số lượng đơn vị lặp lại trong genome. Sự khác nhau về độ dài của SSLP được sử dụng để đánh giá sự thay đổi di truyền giữa các cá thể trong loài. Kĩ thuật SSLP được tiến hành bằng các cặp mồi đặc hiệu nhân bản các chuỗi đơn giản nằm giữa hai gene, sản phẩm PCR được phân tách trên gel polyacrylamide [7]. 2.4. Tình hình nghiên cứu về đa dạng di truyền ở cam, quýt trên thế giới và trong nước 2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tính đa dạng di truyền của chi Citrusbằng các chỉ thị sinh học phân tử trên thế giới. Abkenar và cs (2003) sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đặc điểm phân tử và khoảng cách di truyền giữa các loài Citrus ở Nhật. Đối tượng nghiên cứu gồm 31 loài Citrus khác nhau, trong đó có 6 loài cam chua, 4 loài “Yuzu” và 21 loài họ hàng. Sử dụng 27 mồi kết quả có 108 chỉ thị được tạo thành, 76 chỉ thị là đa hình, trung bình là 2,8 chỉ thị trên một mồi. Cây phân loại cho thấy các loại cam chua rất
12 khác với các loài “Yuzu” và họ hàng của chúng. Các loài “Yuzu” có mối quan hệ gần gũi nhau, tuy nhiên sự đa dạng di trền ở các loài khá cao, biểu lộ các nguồn gốc khác nhau của chúng. Trong nghiên cứu này, một số mồi RAPD có thể giúp phân biệt giữa các loại cây trồng gần gũi như OPA-17, OPE-20 chỉ có ở “Kabosu” mà không có ở “Aka Kabosu”, mồi OPA-20, OPB-05 và OPE-16 phân biệt các cây chỉ có ở “Aka kabosu” mà không có ở “Kabosu” [15]. Dehesdtani và cs (2007) đánh giá đa dạng di truyền của các cây cam ngọt (Citrus sinensis Navel) trồng ở Mazandaran (Iran) bằng chỉ thị RAPD với 21 mồi ngẫu nhiên và 52 mẫu lá của các cây có ba hình thái quả khác nhau là: vỏ nhẵn, vỏ nhám và nửa nhám. Bốn mồi đã tạo ra các băng đa hình có tính lặp lại. Trong số các băng tạo ra từ 4 mồi có 70,13% là băng đa hình, sự đa hình di truyền cao nhất là ở nhóm vỏ nhẵn và vỏ nhám [20]. C. Martasari, Karsinah và Reflinur (2012) đã nghiên cứu mô tả 20 giống Siam của Indonesia từ 9 tỉnh bởi hình thái học và các dấu hiệu ISSR. Kết quả cho thấy có sự khác nhau về hình dạng, màu sắc, độ dầy của vỏ và hương vị của quả chín. Sơ đồ cây được tạo ra từ các băng DNA cho thấy một sự thoái hóa của 20 giống Siam đã chia thành bốn nhóm. Nhóm A bao gồm 9 giống (Lumajang, Banjar 2, Candi, Tulungagung, Mamuju, Tapin và Ponorogo). Nhóm B có 5 giống (Batola, Tlekung, Pontianak 2, Bangkinang và Madu). Nhóm C hình thành bởi 1 giống duy nhất là Banyuwangi. Nhóm cuối cùng D có 5 giống (Jember, Kintamani, Pati, Jambi, Banjar 2). Mỗi nhóm có sự giống nhau hình thái và quả [29]. Năm dòng khác nhau của loài cam chua (Citrus aurantium L.) biểu hiện những khác biệt có ý nghĩa về hình thái học đã được xác định bằng các chỉ thị phân tử phát triển từ kĩ thuật PCR là ISSR và RAPD. De Pasquale và cs (2006) đã phân tích các mẫu nghiên cứu với 11 mồi ISSR và 6 mồi RAPD (OPH04, OPAT14, OPH15, OPM04, OPO14 và OPN14)[22]. Naz và cs (2014) đã tiến hành nghiên cứu tính chất phân tử và mối quan hệ di truyền giữa các giống Citrus khác nhau ở Pakistan. Mối quan hệ di truyền giữa 17 giống cam, quýt thương mại quan trọng, bao gồm những giống địa phương và một số giống lai đã được đánh giá bằng kỹ thuật RAPD với 15 mồi được lựa chọn trong số 25 mồi. Tổng số 188 băng với 153 băng đa hình, trung bình 13 băng mỗi mồi. Hệ
13 số Jaccard đã được sử dụng để phân tích sự tương đồng di truyền hoặc không giống nhau giữa các giống. Cây phân loại đã tách 17 giống cam quýt thành 4 cụm chính, giá trị tương đồng di truyền quan sát thấy là 0,66 với hai giống Kinnow và kinnow không hạt (Mandarin), và hai giống Meiwa và Marumi (quất) cho thấy giá trị khác biệt tối đa (0,85). Sự khác biệt về di truyền giữa các giống cam quýt cao nghiên cứu này cho thấy rằng chúng không có nguồn gốc tương tự nhau [33]. Hai chỉ thị phân tử RAPD và SSR đã được M. Lamine et al. (2015) sử dụng để đánh giá tính đa dạng di truyền của mười chín giống cam ngọt Tunisia. Cây phát sinh chủng loài cho thấy rằng tất cả các mẫu nghiên cứu đã được phân biệt với mức độ phân lớp khác nhau trong các cụm. Những kết quả này sẽ có ý nghĩa đối với việc tạo ra và bảo tồn giống của Maltaise [26]. Ebtsam M. Hamza (2013) đánh giá đa dạng di truyền của một số giống cây Citrus ở Ai Cập dựa vào chỉ thị microsatellite và RAPD. Kết quả phân tích chứng minh sự tương đồng di truyền và mối quan hệ giữa 5 giống thuộc Citrus[24]. 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Nguyễn Văn Giang và cs (2013) đã nghiên cứu đa dạng di truyền ở cây khoai môn - sọ sử dụng 5 chỉ thị RAPD và 5 chỉ thị SSR với 60 mẫu giống khoai môn - sọ được thu thập tại các địa phương khác nhau. Sáu mươi mẫu giống khoai môn - sọ được phân thành 12 nhóm với hệ số tương đồng là 0,8. Kết quả trong nghiên cứu này có thể sử dụng trong công tác bảo tồn cũng như lai chọn tạo giống khoai môn sọ mới [23] Vũ Huyền Trang và cs năm 2014 sử dụng chỉ thị phân tử ISSR để đánh giá đa dạng quần thể dó bầu (Aquilaria crassna Pierre). Trong nghiên cứu này, 91 mẫu dó bầu được thu thập tại các tỉnh phía Bắc và Nam Việt Nam. Kết quả phân tích thu được 2 nhóm chính với hệ số tương đồng Jaccard nằm trong khoảng 0,34 - 0,92, hệ số sai khác di truyền quần thể Nei Gst = 0,3324 và hệ số trao đổi gene quần thể (gene flow) Nm = 1,0044. Các kết quả được phát hiện có ý nghĩa cho công tác chọn, tạo giống và bảo tồn giống sau này[8]. Vũ Văn Hiếu và cs (2015) đã phân tích đa dạng di truyền của các giống cam Sành tại Hà Giang. Trong nghiên cứu này, sử dụng hai chỉ thị di truyền RAPD và ISSR. Kết quả đã chỉ ra 25 mồi RAPD và 5 mồi ISSR sử dụng đều cho đa hình
14 (chiếm 100%), tuy nhiên số băng đa hình trên từng mẫu cho sự biến động lớn. Hệ số tương đồng di truyền của 39 dòng cam sành dao động trong khoảng 0,62 - 0,98. cây phân loại di truyền chia các giống cam nghiên cứu thành 5 nhóm chính[5]. Tính đa dạng sinh học của các loài cây có múi ở Gò Quao (Kiên Giang) đã được Nguyễn Hữu Hiệp và cs (2004) nghiên cứu dựa vào các đặc điểm hình thái và phân tử. Các đặc điểm về hình thái học cho thấy cây có múi tại Gò Quao, Kiên Giang chia làm 5 nhóm bao gồm: bưởi, cam, quýt, chanh và hạnh. Chỉ thị phân tử chia thành 4 nhóm: bưởi, cam - quýt, chanh và hạnh. Kết quả phân tích cho thấy khoảng cách di truyền giữa các nhóm biến động từ 0 - 43%[6]. Trần Thị Việt Tanh và cs (2018) tiến hành phân tích đa dạng di truyền quần thể cá Đối Mục (Mugil Cephalus L.) ở Việt Nam bằng chỉ thị SSR đã xác định tính đa dạng di truyền cao của cá Đối mục Việt Nam trên cơ sở phân tích 12 locus microsatellite (SSR) theo đó đã ghi nhận được tổng số 35 allele cho tất cả các locus nghiên cứu, 10/12 locus cho kết quả đa hình, chỉ số PIC trung bình cho từng chỉ thị là 0,2889 (0,0289-0,5918). Hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho) khác nhau giữa các khu vực: Vịnh Bắc bộ là 0,951, miền Trung là 0,929, miền Nam là 0,947. Trong khi giá trị hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He > 0,5) các chỉ số dao động giữa từng khu vực Vịnh Bắc Bộ (0,508), khu vực miền Trung (0,525) và khu vực miền Nam (0,518). Mặt khác hệ số sai khác di truyền giữa các khu vực (Fst) là 0,0216, điều này cho phép nhận định mức độ đa dạng di truyền quần thể cá Đối mục Việt Nam giữa các khu vực là chưa đáng lo ngại về vấn đề suy thoái nguồn gen[10]. Nguyễn Thị Hường; Nguyễn Văn Việt; Phạm Quang Trung; Trần Việt Hà (2018) với đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền của một số dòng trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) bằng kỹ thuật RAPD”đã phân tích đa dạng di truyền của 10 mẫu trà hoa vàng Tam Đảo bằng 15 mồi RAPD cho thấy: Tổng số băng thu được là 635 trong đó có 212 phân đoạn RAPD đa hình. Hệ số tương đồng di truyền Jaccard giữa 10 hệ gen nghiên cứu thu được từ 15 mồi RAPD dao động từ 0,73 đến 1,0. Trong đó, mẫu số CtHN9 có mức đa dạng cao nhất trong 10 mẫu Trà hoa vàng nghiên cứu, đây là nguồn gen tốt phục vụ cho công tác bảo tồn và phát triển loài Trà hoa vàng Tam Đảo[1].
15 Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 32 mẫu cây có múi được sử dụng trong đề tài được trình bày trong bảng 3.1 dưới đây. STT Tên mẫu Ký hiệu Địa điểm lấy mẫu 1 Cam sành Bố Hạ số 1 A 2 Cam Sành Bố Hạ số 2 B Huyện Yên Thế - 3 Cam Sành Bố Hạ số 5 C Tỉnh Bắc Giang 4 Cam chanh Bố Hạ CBH 5 Quýt sen QS 6 Cam V2 V2 Trường Đại học Nông 7 Chấp CH Lâm – Đại học Thái Nguyên 8 Cam Vinh CV 9 Cam chanh CC 10 Cam chín sớm, ít hạt BH BH 11 Quýt ngọt QN 12 Quýt Ôn Châu QO 13 Cam Xã Đoài-Cao Phong CP 14 Cam Xã Đoài-Nghệ An NA Trung tâm Nghiên 15 Cam C36 C36 cứu và Phát triển cây có múi – Viện nghiên 16 Chín muộn V2 CN cứu Rau Quả Trung 17 Chín sớm CS Ương. 18 Cam canh C2 19 Cam sành Hà Giang HG 20 Cam ruột đỏ cara Cr
16 21 Cam Sành Hàm Yên So2-1 S2-1 22 Cam Sành Hàm Yên So3-1 S3-1 23 Cam Sành Hàm Yên So14-2 S14-2 24 Cam Sành Hàm Yên So12-2 S12-2 Thu tập tại Trung tâm 25 Cam Sành Hàm Yên So13-3 S13-3 cây ăn Quả Hàm 26 Cam Sành Hàm Yên So1-5 S1-5 Yên, Tuyên Quang được lưu giữ tại 27 Cam Sành Hàm Yên So20-3 S20-3 Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái 28 Cam Sành Hàm Yên So4-4 S4-4 Nguyên 29 Cam Sành Hàm Yên So9-2 S9-2 30 Cam Sành Hàm Yên So17-2 S17-2 31 Cam Sành Hàm Yên So19-3 S19-3 32 Cam sành CS 1-1 CS1-1 Bảng 3. 1: Kết quả thu thập mẫu 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu Ứng dụng chỉ thị phân tử, xác định mối quan hệ di truyền cam Bố Hạ với một số giống được trồng phổ biến ở Việt Nam 3.2. Vật liệu, thiết bị và hóa chất nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu Các mồi sử dụng nghiên cứu được thiết kế dựa trên nghiên cứu của tác giả Oliveira E.C và cs năm 2010 [34] và được đặt sản xuất tại doanh nghiệp công nghệ sinh học Hàn Quốc Macrogen. Thông tin của mồi được trình bày trong bảng 3.2: STT Kí hiệu mồi Trình tự (5’ - 3’) Giá trị Tm (oC) 1 ISSR - T1 (GT)6CC 43,7 2 ISSR - T2 (CT)6TG 40,8 3 ISSR - T3 (AC)6CG 43,7 4 OPT - 01 GGGCCACTCA 34,0 5 OPA - 04 AATCGGGCTG 32,0 6 OPO - 04 AAGTCCGCTC 32,0 7 OPA - 08 GTGACGTAGG 32,0 8 OPC - 08 TGGACCGGTG 34,0 9 OPM - 13 (GGT)2 CAAG 32,0 10 OPG - 16 AGCG(TCC)2 34,0 11 OPG - 17 ACGACC(GA)2 32,0
17 12 OPB - 18 C(CA)2GCAGT 32,0 13 OPQ - 18 GGGCCACTCA 34,0 Bảng 3. 2: Trình tự các mồi ISSR sử dụng 3.2.2. Thiết bị nghiên cứu Các thiết bị được thống kê trong bảng 3.3. STT Tên thiết bị Nguồn gốc xuất xứ 1 Bộ điện di Scie - Plas Ltd - Anh 2 Máy chụp gel Gel logic 1500 - Kodak - 4 Máy đo pH F - 51 BW - horiba - Japan 5 Nồi hấp khử trùng HV - 110 - Hirayama - Japan 6 Cân điện tử TE214S – Startorius, Đức 7 Máy ly tâm Eppendorf - CHLB Đức 8 Tủ lạnh -200C;-800C Super freezer Eco 130 - Ficchetti - Italia 9 Máy vontex Vontex Genius3 - IAKGenmany/China 10 Máy spindown E - centrifuge - Wealtex - Taiwan/USA 11 Bể ủ nhiệt Techne - OSI 12 Bộ cối chày sứ Việt Nam 13 Máy PCR Amplied Biosystems USA/Singapore Bảng 3. 3: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 3.2.3. Hóa chất Các hóa chất chuyên dụng sử dụng cho phân tích sinh học phân tử đều ở dạng tinh khiết. Danh mục các hóa chất được trình bày trong bảng 3.4. STT Tên hóa chất Hãng sản xuất 1 Proteinase K Thermo scientific 2 Ethanol Merck 3 Chloroform Merck 4 Isoamin alcohol Merck 5 Tris Base Merck 6 Acid Acetic Merck 7 EDTA Merck 8 Loading Dye Merck 9 Agarose Bio neer 10 Ethidium bromide Merck 11 β - Mecapton ethanol Merck 12 Isopropanol Thermo scientific 13 Taq polymerase 1U/µl Thermo scientific 14 Buffer Taq polymerase Thermo scientific 15 NaCl Fermentas 16 dNTPs Thermo scientific 17 DNA ladder 1kb Thermo scientific Bảng 3. 4: Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong đề tài
18 3.3. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Thu thập mẫu cam thuộc các giống khác nhau và tách chiết DNA tổng số. Nội dung 2: So sánh cam Bố Hạ với các giống cam thu thập bằng chỉ thị phân tử. Nội dung 3: Xác định mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ với các giống cam thu thập. 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Phương pháp tách chiết DNA Các mẫu lá cam được tách chiết DNA tổng số dựa trên phương pháp của Dolye và Dolye (1987) có biến đổi nhỏ để phù hợp với phòng thí nghiệm. Các bước tiến hành cụ thể như sau: Bước 1: Cân 0,5g lá rửa sạch bằng nước, cắt nhỏ. Bước 2: Bổ sung 1000 µl dung dịch CTAB, nghiền nhỏ và cho vào ống eppendorf 1,5 mL Bước 3: Ủ mẫu trong ở 65oC trong 30 phút. Bước 4: Bổ sung 500 µl dung dịch CIAA. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Bước 5: Chuyển dung dịch pha trên sang ống eppendorf 1,5 mL mới, vô trùng. Bước 6: Bổ sung 50 µl CH3COONa và 500 µl dung dịch isopropanol, đảo trộn đều sau đó ủ ở -20oC trong ít nhất 2 giờ. Bước 7: Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút. Thu tủa dưới đáy ống. Bước 8: Bổ sung 1000 µl etanol 70% lạnh, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ hoàn toàn etanol. Bước 9: Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng (khoảng 15 phút), bổ sung 50 µl dung dịch đệm TE 1X, ủ ở 70oC trong 10 phút để hòa tan DNA. Bảo quản dung dịch DNA ở -20oC. Dung dịch DNA tổng số được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0% và được xác định hàm lượng bằng phương pháp quang phổ hấp phụ.
19 3.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA tổng số - Phương pháp điện di trên gel agarose Các bước của phương pháp điện di được tiến hành như sau: + Chuẩn bị gel + Cân 1,0g agarose cho vào 100ml dung dịch TAE 1X, đun sôi trong lò vi sóng sao cho agarose tan hoàn toàn. + Để gel nguội đến 60oC, đổ gel vào khuôn đã cài sẵn lược và đợi cho gel đông lại. + Nhấc lược ra khỏi bản gel và đặt bản gel vào bể điện di. + Đổ dung dịch đệm TAE 1X vào bể điện di sao cho ngập bản gel. + Tra mẫu điện di và chạy điện di + Trộn đều 5,0µl dung dịch DNA với 1,0µl dung dịch DNA loadign dye và chuyển vào giếng trên gel agarose. + Cài đặt chương trình điện di ở hiệu điện thế 100 V, 100 mA, trong 30-35 phút. + Nhuộm gel + Bản gel được lấy ra khỏi bể điện di và nhuộm với dung dịch ethidium bromide trong 15 phút ở nơi tránh ánh sáng. + Soi và chụp ảnh bản gel bằng máy chụp ảnh gel dưới ánh sáng tia tử ngoại. - Phương pháp quang phổ hấp phụ Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số trên máy quang phổ Bio- mate 3 ở bước sóng 260nm và 280nm. Hàm lượng và độ tinh sạch của DNA trong dung dịch tách chiết được tính bằng công thức: + Hàm lượng DNA (ng/µl) = OD260 x 50 x hệ số pha loãng + Độ tinh sạch DNA = OD260/OD280 Trong đó: OD260: chỉ số đo được ở bước sóng 260nm. OD280: chỉ số đo được ở bước sóng 280nm. 3.4.3. Phương pháp RAPD, ISSR. Phản ứng RAPD, ISSR được tiến hành với các mồi ngẫu nhiên theo phương pháp của S.K. Malik và cộng sự (2010) [34]. Thành phần của mỗi phản ứng PCR bao gồm như sau:
20 PCR 10x buffer: 5,0 µl MgCl2 (25mM): 3,0 µl dNTPs (2,5mM): 3,5 µl Primer (10µM): 2,0 µl Taq DNA polymerase (5U/µl): 0,4 µl DNA khuôn: 5,0 µl H2O : 31,1 µl Điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: - Giai đoạn biến tính ban đầu: 94oCtrong 5 phút - Giai đoạn khuếch đại gồm 40 chu kỳ gồm 3 bước sau: + Biến tính: 94oC trong 30 giây + Gắn mồi: 35-40oC trong 30 giây + Kéo dài mồi: 72oC trong 1,0 phút - Giai đoạn kéo dài cuối cùng: 72oC trong 3 phút - Ủ bảo quản ở 4oC cho đến khi lấy sản phẩm - Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2,0%. 3.4.4 Phương pháp phân tích đa hình Các sản phẩm PCR – RAPD sau khi được khuếch đại và điện di trên gel agarose sẽ cho xuất hiện các băng sáng, tập hợp băng giống nhau ở tất cả các mẫu được coi là phân đoạn đồng hình, trường hợp khác: Băng sáng ở mẫu này nhưng không xuất hiện ở mẫu khác được gọi là phân đoạn đa hình (hình 3.1). Tỷ lệ xuất hiện đa hình càng cao thì tính đồng dạng di truyền càng thấp. Hình 3. 1: Minh họa phân đoạn đồng hình, phân đoạn đa hình trong PCR - ISSR
21 3.5. Các phương pháp xử lý số liệu Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn DNA khi điện di sản phẩm PCR-RAPD, PCR-ISSR của các giống cam với các đoạn mồi để làm cơ sở cho sự phân tích bằng phần mền số liệu theo quy ước: Số 1: Xuất hiện phân đoạn DNA Số 0: Không xuất hiện các phân đoạn DNA. Các số liệu này được xử lý trên máy tính theo chương trình NTSYSpc phiên bản 2.1 để xác định quan hệ di truyền của các giống loài ở mức độ phân tử.
22 Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá cam Để thực hiện việc xác định đa hình di truyền các giống cam thu thập bằng chỉ thị phân tử DNA, nhiệm vụ đầu tiên là phải tách chiết được DNA tổng số của các mẫu đủ về nồng độ và độ sạch. Để tách chiết DNA tổng số, chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết bằng hóa chất với đệm CTAB theo phương pháp của Doyle và cs năm 1987 [32] thêm với một số thay đổi nhỏ phù hợp với phòng thí nghiệm khoa CNSH - CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Sản phẩm tách chiết DNA tổng số được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,0%. Kết quả điện di thể hiện trong hình 4.1 dưới đây: Hình 4. 1: kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số của các mẫu cam. (Đường chạy từ 1-32 lần lượt là các mẫu mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 3.1) Kết quả thể hiện trên hình 4.1cho thấy, các băng DNA tổng số rõ nét, gọn, cường độ sáng cao, không có các băng phụ chứng tỏ dung dịch DNA tách chiết có hàm lượng cao, chất lượng DNA tốt, DNA không bị đứt gãy, toàn đáp ứng được các các nghiên cứu tiếp theo. 4.2. Phân tích các phân đoạn DNA đa hình di truyền bằng RAPD, ISSR Để đánh giá đa dạng di truyền trên cam quýt, phương pháp RAPD đã được sử dụng rất phổ biến [22,25,28,36,18]. Một số nghiên cứu gần đây đã sử dụng kết hợp chỉ thị RAPD và chỉ thị ISSR trong việc phân tích đa dạng di truyền [23], [27], [31] để làm tăng độ chính xác trong các phân tích này. Trong đề tài này tôi đã sử dụng 10 mồi RAPD ngẫu nhiên ký hiệu lần lượt là OPA - 08, OPB - 18, OPC - 08, OPG - 16, OPG - 17, OPM - 13, OPA - 04, OPQ -
23 18, OPT - 01 và 3 mồi ISSR ký hiệu lần lượt là T1,T2,T3. Kết quả phân tích đang dạng di truyền các mẫu cam quýt trong đề tài nghiên cứu cụ thể như sau: 4.2.1. Phân tích các đoạn DNA đa hình di truyền bằng RAPD với từng mồi.  MỒI ISSR-T1 Hình 4. 2: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T1 Chú thích: Giếng 1: QS Giếng 9: C Giếng 17: V2 Giếng 25: S13-4 Giếng 2: BH Giếng 10: CV Giếng 18: V2-1 Giếng 26: S1-5 Giếng 3: Cr Giếng 11: CC Giếng 19: CS Giếng 27: S20-3 Giếng 4: CH Giếng 12: C2 Giếng 20: NA Giếng 28: S4-4 Giếng 5: A Giếng 13: C36 Giếng 21: S2-1 Giếng 29: S9-2 Giếng 6: B Giếng 14: QO Giếng 22: S3-1 Giếng 30: S17-2 Giếng 7: CS1-1 Giếng 15: QN Giếng 23: S14-2 Giếng 31: S19-3 Giếng 8: CBH Giếng 16: CP Giếng 24: S12-2 Giếng 32: HG Kết quả điện di sản phẩm PCR của 32 mẫu nghiên cứu với mồi ISSR T1 cho thấy có 4 phân đoạn DNA được khuếch đại, với kích thước dao động trong khoảng từ 500bp-1000bp. Ở phân đoạn 500bp, các mẫu đều được khuếch đại, ở phân đoạn 750 có 21 mẫu được khuếch đại. Ở phân đoạn 1000bp có 19 mẫu được khuếch đại. Ở phân đoạn 1500 có 3 mẫu được khuếch đại. Từ kết quả thu được nhận thấy mồi T1 thể hiện tính đa hình cao với các mẫu nghiên cứu  MỒI ISSR-T2
24 Hình 4. 3: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T2 Chú thích: Giếng 1: QS Giếng 9: C Giếng 17: V2 Giếng 25: S13-4 Giếng 2: BH Giếng 10: CV Giếng 18: V2-1 Giếng 26: S1-5 Giếng 3: Cr Giếng 11: CC Giếng 19: CS Giếng 27: S20-3 Giếng 4: CH Giếng 12: C2 Giếng 20: NA Giếng 28: S4-4 Giếng 5: A Giếng 13: C36 Giếng 21: S2-1 Giếng 29: S9-2 Giếng 6: B Giếng 14: QO Giếng 22: S3-1 Giếng 30: S17-2 Giếng 7: CS1-1 Giếng 15: QN Giếng 23: S14-2 Giếng 31: S19-3 Giếng 8: CBH Giếng 16: CP Giếng 24: S12-2 Giếng 32: HG Kết quả điện di sản phẩm PCR của 32 mẫu nghiên cứu với mồi ISSR T2 cho thấy có 6 phân đoạn DNA được khuếch đại với kích thước từ 250bp-1500bp . Ở phân đoạn 250bp có 1 mẫu được khuếch đại(1). . Ở phân đoạn 300bp có 10 mẫu được khuếch đại (1,2,9,10,11,14,15,16,17,18). . Ở phân đoạn 500bp có 13 được khuếch đại (4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,31,32). Ở phân đoạn 700bp có 22 mẫu được khuếch đại (1,2,3,9,14,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31). Ở phân đoạn 750bp có 21 mẫu được khuếch đại(2,8,9,12,14,20,25,26,27,28,29). Ở phân đoạn 1300bp có 2 mẫu được khuếch đại (22,23). Ở phân đoạn 1500bp có 2 mẫu được khuếch đại (22,23).  MỒI ISSR-T3
25 Hình 4. 4: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T3 Chú thích: Giếng 1: QS Giếng 9: C Giếng 17: V2 Giếng 25: S13-4 Giếng 2: BH Giếng 10: CV Giếng 18: V2-1 Giếng 26: S1-5 Giếng 3: Cr Giếng 11: CC Giếng 19: CS Giếng 27: S20-3 Giếng 4: CH Giếng 12: C2 Giếng 20: NA Giếng 28: S4-4 Giếng 5: A Giếng 13: C36 Giếng 21: S2-1 Giếng 29: S9-2 Giếng 6: B Giếng 14: QO Giếng 22: S3-1 Giếng 30: S17-2 Giếng 7: CS1-1 Giếng 15: QN Giếng 23: S14-2 Giếng 31: S19-3 Giếng 8: CBH Giếng 16: CP Giếng 24: S12-2 Giếng 32: HG Kết quả điện di sản phẩm PCR của 32 mẫu nghiên cứu với mồi ISSR T3 cho thấy có 12 phân đoạn DNA được khuếch đại với kích thước từ 300bp-2200bp. Ở phân đoạn 2200bp có 1 mẫu được khuếch đại (21). Ở phân đoạn 2000bp có 3 mẫu được khuếch đại (12,18,21). Ở phân đoạn 1700bp có 9 mẫu được khuếch đại (21,25,26,27,28,29,30,31,32). Ở phân đoạn 1500bp có 3 mẫu được khuếch đại (1,21,32). Ở phân đoạn 1300bp có 2 mẫu được khuếch đại (25,26). Ở phân đoạn 1000bp có 11 mẫu được khuếch đại (1,6,7, 9,10,11,13,14,15,18,30). Ở phân đoạn 750bp có 1 mẫu được khuếch đại (29). Ở phân đoạn 650bp có 2 mẫu được khuếch đại (2,7). Ở phân đoạn 500bp có 10 mẫu được khuếch đại (8,9,10,11,12,13,14,15,16,29). Ở phân đoạn 450bp có 2 mẫu được khuếch đại (4,5). Ở phân đoạn 300bp có 5 mẫu được khuếch đại (1,2,17,18,19).
26  MỒI OTP-01 Hình 4. 5: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPT-01 Chú thích: Giếng 1: QS Giếng 9: C Giếng 17: V2 Giếng 25: S13-4 Giếng 2: BH Giếng 10: CV Giếng 18: V2-1 Giếng 26: S1-5 Giếng 3: Cr Giếng 11: CC Giếng 19: CS Giếng 27: S20-3 Giếng 4: CH Giếng 12: C2 Giếng 20: NA Giếng 28: S4-4 Giếng 5: A Giếng 13: C36 Giếng 21: S2-1 Giếng 29: S9-2 Giếng 6: B Giếng 14: QO Giếng 22: S3-1 Giếng 30: S17-2 Giếng 7: CS1-1 Giếng 15: QN Giếng 23: S14-2 Giếng 31: S19-3 Giếng 8: CBH Giếng 16: CP Giếng 24: S12-2 Giếng 32: HG Kết quả điện di sản phẩm PCR của 32 mẫu nghiên cứu với mồi OPT-01 cho thấy có 11 phân đoạn DNA được khuếch đại với kích thước từ 250bp-2000bp. Ở phân đoạn 2000bp có 3 mẫu được khuếch đại (10,11,22). Ở phân đoạn 1300bp có 2 mẫu được khuếch đại (2,3). Ở phân đoạn 1000bp có 4 mẫu được khuếch đại (1,8,9,13). Ở phân đoạn 900bp có 7 mẫu được khuếch đại (1,2,3,4,6,12,21). Ở phân đoạn 800bp có 5 mẫu được khuếch đại (7,8,29,29,32). Ở phân đoạn 750bp có 6 mẫu được khuếch đại (1,13,14,16,17,18). Ở phân đoạn 700bp có 3 mẫu được khuếch đại (10,11,12). Ở phân đoạn 650bp có 9 mẫu được khuếch
27 đại (13,14,15,21,23,24,26,27,28). Ở phân đoạn 550bp có 6 mẫu được khuếch đại (8,9,29,30,31,32). Ở phân đoạn 400bp có 6 mẫu được khuếch đại (13,14,15,16,17,18). Ở phân đoạn 250bp có 6 mẫu được khuếch đại (1,12,15,16,17,18).  MỒI OPM-13 Hình 4. 6: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPM-13 Chú thích: Giếng 1: QS Giếng 9: C Giếng 17: V2 Giếng 25: S13-4 Giếng 2: BH Giếng 10: CV Giếng 18: V2-1 Giếng 26: S1-5 Giếng 3: Cr Giếng 11: CC Giếng 19: CS Giếng 27: S20-3 Giếng 4: CH Giếng 12: C2 Giếng 20: NA Giếng 28: S4-4 Giếng 5: A Giếng 13: C36 Giếng 21: S2-1 Giếng 29: S9-2 Giếng 6: B Giếng 14: QO Giếng 22: S3-1 Giếng 30: S17-2 Giếng 7: CS1-1 Giếng 15: QN Giếng 23: S14-2 Giếng 31: S19-3 Giếng 8: CBH Giếng 16: CP Giếng 24: S12-2 Giếng 32: HG Kết quả điện di sản phẩm PCR của 32 mẫu nghiên cứu với mồi OPM-13 cho thấy có 11 phân đoạn DNA được khuếch đại với kích thước từ 250bp-1600bp. Ở phân đoạn 1600bp có 2 mẫu được khuếch đại (13,15). Ở phân đoạn 1200bp có 2 mẫu được khuếch đại (13,14).Ở phân đoạn 1000bp có 2 mẫu được khuếch đại (3,15). Ở phân đoạn 800bp có 5 mẫu được khuếch đại (9,20,22,23,29).Ở phân đoạn 750bp có 10 mẫu được khuếch đại (1,2,3,6,7,8,10,15,31,32). Ở phân đoạn 700bp có 7 mẫu được khuếch đại (9,10,11,12,13,14,15). Ởphân đoạn 650bp có 6 mẫu được khuếch đại (4,5,10,11,13,20). Ở phân đoạn 550bp có 8 mẫu được khuếch đại
28 (2,3,6,7,16,17,18,19). Ở phân đoạn 500bp có 11 mẫu được khuếch đại (1,2,4,6,7,8,9,10,11,12,14). Ở phân đoạn 450bp có 12 mẫu được khuếch đại (1,3,4,6,7,8,9,10,11,12,13,14). Ở phân đoạn 300bp có 12 mẫu được khuếch đại (2,3,4,7,8,9,10,26,27,28,29,30). Ở phân đoạn 250bp 15 mẫu được khuếch đại (1,2,3,4,5,11,12,14,16,17,18,22,23,24,25).  MỒI OPG-17 Hình 4. 7: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPG-17 Chú thích: Giếng 1: QS Giếng 9: C Giếng 17: V2 Giếng 25: S13-4 Giếng 2: BH Giếng 10: CV Giếng 18: V2-1 Giếng 26: S1-5 Giếng 3: Cr Giếng 11: CC Giếng 19: CS Giếng 27: S20-3 Giếng 4: CH Giếng 12: C2 Giếng 20: NA Giếng 28: S4-4 Giếng 5: A Giếng 13: C36 Giếng 21: S2-1 Giếng 29: S9-2 Giếng 6: B Giếng 14: QO Giếng 22: S3-1 Giếng 30: S17-2 Giếng 7: CS1-1 Giếng 15: QN Giếng 23: S14-2 Giếng 31: S19-3 Giếng 8: CBH Giếng 16: CP Giếng 24: S12-2 Giếng 32: HG Phân tích tương tự như các mồi ở trên ta thấy mồi OPG-17 cho thấy có 12 phân đoạn DNA được khuếch đại với kích thước từ 250bp-3000bp Ở phân đoạn 3000 có 4 mẫu được khuếch đại (1,20,31,32). Ở phân đoạn 2000 có 2 mẫu được khuếch đại (20,31). ở phân đoạn 1500 có 2 mẫu được khuếch đại (14,20). ở phân đoạn 1300 có 3 mẫu được khuếch đại (3,13,20). ở phân đoạn 1000 có 7 mẫu được khuếch đại (1,6,7,8,13,15,20). ở phân đoạn 900 có 2 mẫu được
29 khuếch đại (1,15). ở phân đoạn 750 có 6 mẫu được khuếch đại (1,2,3,4,5,15). ở phân đoạn 700 có 18 mẫu được khuếch đại (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,23,25,29,30). ở phân đoạn 650 có15 mẫu được khuếch đại (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,13,14,15,31,32). ở phân đoạn 500 có 32 mẫu được khuếch đại (từ 1 đến 32). ở phân đoạn 450 có 12 mẫu được khuếch đại (1,2,3,4,5,6,7,8,10,11,13,14). ở phân đoạn 250 có 30 mẫu được khuếch đại ( từ 1 đến 30)  MỒI OPQ-18 Hình 4. 8: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPQ-18 Chú thích: Giếng 1: QS Giếng 9: C Giếng 17: V2 Giếng 25: S13-4 Giếng 2: BH Giếng 10: CV Giếng 18: V2-1 Giếng 26: S1-5 Giếng 3: Cr Giếng 11: CC Giếng 19: CS Giếng 27: S20-3 Giếng 4: CH Giếng 12: C2 Giếng 20: NA Giếng 28: S4-4 Giếng 5: A Giếng 13: C36 Giếng 21: S2-1 Giếng 29: S9-2 Giếng 6: B Giếng 14: QO Giếng 22: S3-1 Giếng 30: S17-2 Giếng 7: CS1-1 Giếng 15: QN Giếng 23: S14-2 Giếng 31: S19-3 Giếng 8: CBH Giếng 16: CP Giếng 24: S12-2 Giếng 32: HG Phân tích tương tự như các mồi ở trên ta thấy mồi thấy có 11 phân đoạn DNA được khuếch đại với kích thước từ 250bp-1500bp Ở phân đoạn 1500 có 17 mẫu được khuếch đại (1,2,3,4,5,6,12,13,21,22,23,24,25,26,27,28,29). ở phân đoạn 1300 có 17 mẫu được
30 khuếch đại (1,2,3,4,5,6,12,13,21,22,23,24,25,26,27,28,29). ở phân đoạn 1000 có 17 mẫu được khuếch đại (1,2,3,4,5,6,12,13,21,22,23,24,25,26,27,28,29). ở phân đoạn 800 có 2 mẫu được khuếch đại (1,30). ở phân đoạn 750 có 3 mẫu được khuếch đại (1,10,11). ở phân đoạn 700 có 7 mẫu được khuếch đại (1,10,11,15,19,20,31). ở phân đoạn 600 có 8 mẫu được khuếch đại (1,8,10,11,14,20,31,32). ở phân đoạn 500 có 13 mẫu được khuếch đại (1,7,8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,20,). ở phân đoạn 450 có 10 mẫu được khuếch đại (1,7,8,10,11,13,14,18,20,31). ở phân đoạn 300 có 4 mẫu được khuếch đại (1,10,11,18). ở phân đoạn250 có 2 mẫu được khuếch đại có 1 mẫu (1,10).  MỒI OPA-08 Hình 4. 9: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPA-08 Chú thích: Giếng 1: QS Giếng 9: C Giếng 17: V2 Giếng 25: S13-4 Giếng 2: BH Giếng 10: CV Giếng 18: V2-1 Giếng 26: S1-5 Giếng 3: Cr Giếng 11: CC Giếng 19: CS Giếng 27: S20-3 Giếng 4: CH Giếng 12: C2 Giếng 20: NA Giếng 28: S4-4 Giếng 5: A Giếng 13: C36 Giếng 21: S2-1 Giếng 29: S9-2 Giếng 6: B Giếng 14: QO Giếng 22: S3-1 Giếng 30: S17-2 Giếng 7: CS1-1 Giếng 15: QN Giếng 23: S14-2 Giếng 31: S19-3 Giếng 8: CBH Giếng 16: CP Giếng 24: S12-2 Giếng 32: HG Phân tích tương tự như các mồi ở trên ta thấy mồi thấy có 10 phân đoạn DNA được khuếch đại với kích thước từ 250bp-1500bp
31 Ở phân đoạn 1500 có 6 mẫu được khuếch đại (25,27,28,29,30,31). ở phân đoạn 1300 có 7 mẫu được khuếch đại (14,25,26,27,30,31,32). ở phân đoạn1000 có 22 mẫu được khuếch đại (2,3,4,5,6,7,8,9,12,13,14,15,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32). ở phân đoạn 750 có 15 mẫu được khuếch đại(1,4,5,6,7,8,11,15,20,21,28,29,30,31,32). ở phân đoạn 700 có 4 mẫu được khuếch đại (11,19,23,24). ở phân đoạn 600 có 4 mẫu được khuếch đại (1,11,14,15). ở phân đoạn 500 có 12 mẫu được khuếch đại (1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,20,21). ở phân đoạn400 có 14 mẫu được khuếch đại (1,5,6,7,8,11,13,14,16,17,20,21,23,24). ở phân đoạn 300 có 7 mẫu được khuếch đại (1,6,7,8,11,23,24). ở phân đoạn250 có 3 mẫu được khuếch đại (1,16,17).  Mồi OPB-18 Hình 4. 10: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPB-18 Chú thích: Giếng 1: QS Giếng 9: C Giếng 17: V2 Giếng 25: S13-4 Giếng 2: BH Giếng 10: CV Giếng 18: V2-1 Giếng 26: S1-5 Giếng 3: Cr Giếng 11: CC Giếng 19: CS Giếng 27: S20-3 Giếng 4: CH Giếng 12: C2 Giếng 20: NA Giếng 28: S4-4 Giếng 5: A Giếng 13: C36 Giếng 21: S2-1 Giếng 29: S9-2 Giếng 6: B Giếng 14: QO Giếng 22: S3-1 Giếng 30: S17-2 Giếng 7: CS1-1 Giếng 15: QN Giếng 23: S14-2 Giếng 31: S19-3 Giếng 8: CBH Giếng 16: CP Giếng 24: S12-2 Giếng 32: HG Phân tích tương tự như các mồi ở trên ta thấy mồi thấy có 14 phân đoạn DNA được khuếch đại với kích thước từ 250bp-3000bp
32 ở phân đoạn 3000 có 10 mẫu được khuếch đại (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28). ở phân đoạn2500 có 11 mẫu được khuếch đại (29,20,21,23,24,25,27,27,30,31,32). ở phân đoạn2200 có 9 mẫu được khuếch đại (19,20,21,22,23,24,25,26,27). ở phân đoạn 1800 có 14 mẫu được khuếch đại (19,20,21,22,23,24,25,26,27). ở phân đoạn 1500 có 17 mẫu được khuếch đại (2,3,6,7,11,12, 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,32). ở phân đoạn 1200 có 15 mẫu được khuếch đại (1,2,3,7,8,11,12,13,14,15,23,24,30,31,32). ở phân đoạn1000 có 4 mẫu được khuếch đại (16,7,11,12). ở phân đoạn 750 có 5 mẫu được khuếch đại (9,17,30,31,32). ở phân đoạn700 có 6 mẫu được khuếch đại (7,8,13,14,15,18). ở phân đoạn 600 có 1 mẫu được khuếch đại (8). ở phân đoạn 500 có 10 mẫu được khuếch đại (4,5,7,9,10,15,25,26,27,32). ở phân đoạn 450 có 3 mẫu được khuếch đại (1,4,5). ở phân đoạn 300 có 1 mẫu được khuếch đại (16). ở phân đoạn 250 có 1 mẫu được khuếch đại (1)  MỒI OPA-04 Hình 4. 11: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPA-04 Chú thích: Giếng 1: QS Giếng 9: C Giếng 17: V2 Giếng 25: S13-4 Giếng 2: BH Giếng 10: CV Giếng 18: V2-1 Giếng 26: S1-5 Giếng 3: Cr Giếng 11: CC Giếng 19: CS Giếng 27: S20-3 Giếng 4: CH Giếng 12: C2 Giếng 20: NA Giếng 28: S4-4 Giếng 5: A Giếng 13: C36 Giếng 21: S2-1 Giếng 29: S9-2 Giếng 6: B Giếng 14: QO Giếng 22: S3-1 Giếng 30: S17-2
33 Giếng 7: CS1-1 Giếng 15: QN Giếng 23: S14-2 Giếng 31: S19-3 Giếng 8: CBH Giếng 16: CP Giếng 24: S12-2 Giếng 32: HG Phân tích tương tự như các mồi ở trên ta thấy mồi thấy có 13 phân đoạn DNA được khuếch đại với kích thước từ 250bp-2000bp ở phân đoạn 2000 có 7 mẫu được khuếch đại (3,12,13,14,30,31,32). ở phân đoạn1500 có 4 mẫu được khuếch đại (8,27,28,29). ở phân đoạn1300 có 5 mẫu được khuếch đại (9,10,12,13,14). ở phân đoạn1000 có 16 mẫu được khuếch đại (1,2,3,4,5,6,7,12,13,14,21,22,23,24,25,26). ở phân đoạn 800 có 4 mẫu được khuếch đại (8,12,13,14). ở phân đoạn 750 có 19 mẫu được khuếch đại (1,4,5,8,12,13,14,15,16,17,18,19,20,27,28,29,30,31,32). ở phân đoạn 700 có 6 mẫu được khuếch đại (9,10,13,14,18,19). ở phân đoạn 600 có 15 mẫu được khuếch đại (1,4,5,6,7,8,9,10,13,15,16,17,30,31,32). ở phân đoạn 550 có 7 mẫu được khuếch đại (1,21,22,23,24,25,26). ở phân đoạn 500 có 17 mẫu được khuếch đại (1,4,5,6,7,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29). ở phân đoạn 400 có 16 mẫu được khuếch đại (4,5,6,7,15,16,17,21,22,23,24,25,26,27,28,29). ở phân đoạn 300 có 8 mẫu được khuếch đại (6,7,21,22,23,24,25,26). ở phân đoạn 250 có 1 mẫu được khuếch đại (1).  MỒI OPC-08 Hình 4. 12: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPC-08 Chú thích: Giếng 1: QS Giếng 9: C Giếng 17: V2 Giếng 25: S13-4 Giếng 2: BH Giếng 10: CV Giếng 18: V2-1 Giếng 26: S1-5 Giếng 3: Cr Giếng 11: CC Giếng 19: CS Giếng 27: S20-3
34 Giếng 4: CH Giếng 12: C2 Giếng 20: NA Giếng 28: S4-4 Giếng 5: A Giếng 13: C36 Giếng 21: S2-1 Giếng 29: S9-2 Giếng 6: B Giếng 14: QO Giếng 22: S3-1 Giếng 30: S17-2 Giếng 7: CS1-1 Giếng 15: QN Giếng 23: S14-2 Giếng 31: S19-3 Giếng 8: CBH Giếng 16: CP Giếng 24: S12-2 Giếng 32: HG Phân tích tương tự như các mồi ở trên ta thấy mồi thấy có12 phân đoạn DNA được khuếch đại với kích thước từ 250bp-3000bp ở phân đoạn 3000 có 7mẫu được khuếch đại (21,22,24,26,28,29,32). ở phân đoạn2000 có 6 mẫu được khuếch đại (19,20,21,22,28,29). ở phân đoạn 1500 có 11 mẫu được khuếch đại (2,3,12,13,119,20,23,24,26,27,29,32). ở phân đoạn 1300 có 4 mẫu được khuếch đại (11,12,13,29). ở phân đoạn 1000 có 13 mẫu được khuếch đại (1,2,3,5,6,7,14,16,17,19,20,30,32). ở phân đoạn 800 có 3 mẫu được khuếch đại (4,5,7). ở phân đoạn 750 có 9 mẫu được khuếch đại (1,6,7,8,10,11,16,17,18). ở phân đoạn 700 có 5 mẫu được khuếch đại (7,8,9,10,14).ở phân đoạn 650 có 1mẫu được khuếch đại (1). ở phân đoạn 550 có 10 mẫu được khuếch đại (1,4,5,8,9,10,11,14,16,17). ở phân đoạn 400 có 5 mẫu được khuếch đại (4,5,11,15,16). ở phân đoạn 250 có 1 mẫu được khuếch đại (1).  MỒI OPO-04 Hình 4. 13: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPO-04 Chú thích: Giếng 1: QS Giếng 9: C Giếng 17: V2 Giếng 25: S13-4 Giếng 2: BH Giếng 10: CV Giếng 18: V2-1 Giếng 26: S1-5 Giếng 3: Cr Giếng 11: CC Giếng 19: CS Giếng 27: S20-3
35 Giếng 4: CH Giếng 12: C2 Giếng 20: NA Giếng 28: S4-4 Giếng 5: A Giếng 13: C36 Giếng 21: S2-1 Giếng 29: S9-2 Giếng 6: B Giếng 14: QO Giếng 22: S3-1 Giếng 30: S17-2 Giếng 7: CS1-1 Giếng 15: QN Giếng 23: S14-2 Giếng 31: S19-3 Giếng 8: CBH Giếng 16: CP Giếng 24: S12-2 Giếng 32: HG Phân tích tương tự như các mồi ở trên ta thấy mồi thấy có12 phân đoạn DNA được khuếch đại với kích thước từ 250bp-3000bp ở phân đoạn 3000 có 9 mẫu được khuếch đại (1,11,19,21,22,26,29,30,32).ở phân đoạn 1500 có 10 mẫu được khuếch đại (1,6,10,11,16,17,18,19,21,22). ở phân đoạn 1300 có 9 mẫu được khuếch đại (1,6,7,10,12,18,21,22,25,26). ở phân đoạn 1000 có 8 mẫu được khuếch đại (1,10,18,19,20,21,22,25). ở phân đoạn 800 có 4 mẫu được khuếch đại (1,27,29,30). ở phân đoạn 750 có 11 mẫu được khuếch đại (1,2,7,8,9,12,13,18,24,25,26). ở phân đoạn 700 có 8 mẫu được khuếch đại (2,3,6, 8,9,12,13,18). ở phân đoạn 650 có 4 mẫu được khuếch đại (1,2,8,9). ở phân đoạn 550 có 1 mẫu được khuếch đại (3). ở phân đoạn 500 có 8 mẫu được khuếch đại (2,3,4,5,7,8,9,18). ở phân đoạn 450 có 6 mẫu được khuếch đại (1,2,3,7,8,9). ở phân đoạn 300 có 1 mẫu được khuếch đại (18).  MỒI OPG-16 Hình 4. 14: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPG-16 Chú thích: Giếng 1: QS Giếng 9: C Giếng 17: V2 Giếng 25: S13-4 Giếng 2: BH Giếng 10: CV Giếng 18: V2-1 Giếng 26: S1-5
36 Giếng 3: Cr Giếng 11: CC Giếng 19: CS Giếng 27: S20-3 Giếng 4: CH Giếng 12: C2 Giếng 20: NA Giếng 28: S4-4 Giếng 5: A Giếng 13: C36 Giếng 21: S2-1 Giếng 29: S9-2 Giếng 6: B Giếng 14: QO Giếng 22: S3-1 Giếng 30: S17-2 Giếng 7: CS1-1 Giếng 15: QN Giếng 23: S14-2 Giếng 31: S19-3 Giếng 8: CBH Giếng 16: CP Giếng 24: S12-2 Giếng 32: HG Phân tích tương tự như các mồi ở trên ta thấy mồi cho thấy có13 phân đoạn DNA được khuếch đại với kích thước từ 250bp-3000bp. Ở phân đoạn 3000 có 6 mẫu được khuếch đại (21,27,29,30,31,32). Ở phân đoạn 1500 có 9 mẫu được khuếch đại (22,23,24,25,26,29,30,31,32). Ở phân đoạn 1200 có 6 mẫu được khuếch đại (9,27,29,30,31,32). Ở phân đoạn 1000 có 3 mẫu được khuếch đại (30,31,32). Ở phân đoạn 900 có 8 mẫu được khuếch đại (9,10,11,12,29,30,31,32). Ở phân đoạn 750 có 21 mẫu được khuếch đại (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,15,16,17,18,19,20,27,29,30,31,32). Ở phân đoạn 650 có 13 mẫu được khuếch đại (1,2,4,5,6,7,8,9,10,29,30,31,32). ở phân đoạn 550 có 11 mẫu được khuếch đại (1,2,4,5,6,7,8,9,10,31,32). ở phân đoạn 500 có 21 mẫu được khuếch đại (1,2,4,5,6,7,8,9,10,13,15,16,17,18,19,20,22,23,24,25,26). ở phân đoạn 450 có 15mẫu được khuếch đại (1,2,4,5,6,7,8,9,10,13, 22,23,24,25,26). ở phân đoạn 400 có 15 mẫu được khuếch đại (1,2,4,5,6,7,8,9,10,13, 22,23,24,25,26). ở phân đoạn 300 có 15 mẫu được khuếch đại (1,2,4,5,6,7,8,9,10,13, 22,23,24,25,26). ở phân đoạn 250 có 15 mẫu được khuếch đại (1,2,4,5,6,7,8,9,10,13, 22,23,24,25,26) 4.3. Xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống camnghiên cứu dựa trên giản đồ phả hệ DNA. Từ kết quả phân tích đa hình di truyền dựa trên chỉ thị phân tử RAPD và ISSR ở trên, chúng tôi tổng hợp các phân đoạn sản phẩm PCR của các mẫu cam phân tích (bảng phụ lục I). Từ bảng tổng hợp trên, sử dụng phần mềm NTSYSpc phiên bản 2.1 chúng tôi xây dựng được bảng hệ số tương đồng di truyền và cây phát sinh chủng loài của các mẫu cam phân tích sau:
37 S2- S3- S14- S12- S13- S1- S20- S4- S9- S17- S19- CS1- MẪU QS CV V2 CHB CH A B D HG Cr C36 QO QN B1 CP NA CN CS C2 CC 1 1 2 2 4 5 3 4 2 2 3 1 QS 1,00 CV 0,73 1,00 V2 0,67 0,86 1,00 CBH 0,66 0,78 0,79 1,00 CH 0,66 0,76 0,75 0,9 1,00 A 0,67 0,79 0,77 0,81 0,81 1,00 B 0,67 0,76 0,74 0,77 0,78 0,89 1,00 D 0,64 0,73 0,71 0,73 0,74 0,81 0,83 1,00 HG 0,63 0,76 0,78 0,74 0,75 0,75 0,76 0,81 1,00 Cr 0,67 0,75 0,75 0,78 0,77 0,8 0,78 0,81 0,83 1,00 C36 0,64 0,72 0,74 0,76 0,73 0,75 0,75 0,74 0,77 0,84 1,00 QO 0,63 0,73 0,74 0,73 0,75 0,72 0,73 0,74 0,76 0,78 0,81 1,00 QN 0,59 0,67 0,7 0,69 0,71 0,69 0,73 0,72 0,74 0,75 0,76 0,82 1,00 B1 0,63 0,74 0,75 0,74 0,74 0,73 0,73 0,75 0,78 0,81 0,79 0,81 0,84 1,00 CP 0,67 0,72 0,74 0,74 0,78 0,75 0,76 0,76 0,79 0,8 0,78 0,77 0,79 0,79 1,00 NA 0,69 0,75 0,79 0,73 0,77 0,74 0,74 0,73 0,76 0,77 0,77 0,78 0,77 0,78 0,84 1,00 CN 0,66 0,76 0,78 0,76 0,78 0,75 0,75 0,72 0,77 0,77 0,76 0,79 0,76 0,77 0,82 0,97 1,00 CS 0,63 0,74 0,76 0,73 0,76 0,74 0,74 0,74 0,77 0,77 0,75 0,76 0,76 0,77 0,82 0,88 0,89 1,00 C2 0,63 0,76 0,79 0,73 0,77 0,79 0,75 0,73 0,77 0,78 0,78 0,77 0,74 0,76 0,82 0,84 0,85 0,86 1,00 CC 0,63 0,75 0,78 0,73 0,77 0,78 0,76 0,74 0,77 0,77 0,78 0,75 0,74 0,75 0,82 0,82 0,82 0,82 0,91 1,00 S2-1 0,61 0,73 0,74 0,74 0,76 0,77 0,73 0,69 0,73 0,74 0,74 0,73 0,71 0,74 0,76 0,77 0,78 0,75 0,83 0,83 1,00 S3-1 0,61 0,72 0,74 0,76 0,78 0,76 0,71 0,68 0,73 0,76 0,74 0,71 0,71 0,72 0,77 0,77 0,78 0,76 0,82 0,81 0,86 1,00 S14-2 0,61 0,73 0,74 0,74 0,77 0,76 0,72 0,68 0,74 0,74 0,72 0,73 0,7 0,73 0,77 0,76 0,77 0,75 0,82 0,81 0,85 0,9 1,00 S12-2 0,64 0,75 0,76 0,75 0,79 0,76 0,74 0,7 0,75 0,74 0,72 0,74 0,72 0,76 0,77 0,8 0,79 0,76 0,83 0,82 0,86 0,88 0,93 1,00 S13-4 0,61 0,72 0,74 0,76 0,79 0,75 0,72 0,68 0,75 0,74 0,71 0,74 0,7 0,73 0,76 0,78 0,79 0,77 0,83 0,82 0,85 0,87 0,89 0,92 1,00 S1-5 0,62 0,72 0,74 0,75 0,78 0,73 0,73 0,69 0,75 0,73 0,71 0,73 0,69 0,73 0,76 0,76 0,77 0,75 0,82 0,81 0,84 0,85 0,87 0,92 0,93 1,00 S20-3 0,62 0,75 0,76 0,75 0,78 0,76 0,76 0,73 0,77 0,77 0,73 0,76 0,73 0,77 0,78 0,78 0,79 0,77 0,85 0,85 0,86 0,82 0,84 0,87 0,9 0,89 1,00 S4-4 0,62 0,75 0,76 0,76 0,78 0,77 0,77 0,75 0,77 0,75 0,74 0,76 0,73 0,76 0,77 0,79 0,79 0,77 0,82 0,82 0,85 0,81 0,81 0,85 0,85 0,85 0,92 1,00 S9-2 0,64 0,73 0,75 0,73 0,75 0,74 0,73 0,73 0,77 0,74 0,74 0,74 0,72 0,74 0,75 0,78 0,77 0,76 0,79 0,8 0,81 0,8 0,78 0,79 0,81 0,81 0,86 0,89 1,00 S17-2 0,65 0,75 0,78 0,76 0,76 0,77 0,75 0,74 0,78 0,77 0,75 0,74 0,74 0,77 0,79 0,8 0,81 0,76 0,78 0,79 0,81 0,75 0,76 0,75 0,77 0,77 0,84 0,84 0,85 1,00 S19-3 0,64 0,75 0,77 0,76 0,78 0,77 0,74 0,75 0,77 0,77 0,77 0,75 0,74 0,77 0,81 0,79 0,79 0,78 0,81 0,81 0,79 0,75 0,75 0,78 0,78 0,76 0,82 0,83 0,81 0,9 1,00 CS1-1 0,64 0,74 0,77 0,75 0,79 0,76 0,76 0,75 0,77 0,77 0,76 0,76 0,72 0,76 0,78 0,79 0,79 0,77 0,8 0,82 0,81 0,76 0,74 0,77 0,78 0,78 0,82 0,83 0,83 0,88 0,91 1,00 Bảng 4.1 : Hệ số tương đồng di truyền cuả 32 mẫu cam nghiên cứu
38 4.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loài cam dựa trên các giống đã nghiên cứu. Hình ảnh cây phát sinh chủng loài cam. Hình 4. 15 sơ đồ mô tả quan hệ di truyền của 32 mẫu cam nghiên cứu (coefficient: hệ số tương đồng di truyền)
39 Cây phân loại hình 4.15 được tạo ra khi phân tích 32 mẫu nghiên cứu với 10 mồi RAPD và 3 mồi ISSR cho thấy hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu cam nghiên cứu dao động trong khoảng từ 0,64 – 1,00; chứng tỏ rằng các mẫu cam có sự đa hình cao về mặt di truyền. Sơ đồ trên cho thấy 32 mẫu cam được chia làm 2 nhóm chính: Nhóm I: là mẫu đối chứng chấp (CH), mẫu này nằm riêng biệt so với các mẫu còn lại. Khoảng cách di truyền với nhóm II là 0,36. Nhóm II: gồm 31 mẫu. Trong nhóm này lại tiếp tục chia làm 2 nhóm phụ, bao gồm: Nhóm phụ I: bao gồm 14 mẫu cam, quýt được chia tiếp thành 2 cụm (cụm 1 và cụm 2). Có sự sai khác di truyền là 0,26 (hệ số tương đồng di truyền của 2 cụm là 0,74). Cụm 1 bao gồm cụm 1a và cụm 1b. Cụm 1a gồm 2 cụm là cụm 1a-1 và cụm 1a-2. Trong đó : + Cụm 1a-1 gồm 3 mẫu (QS,QO,QN), đây đều là các mẫu quýt. Trong đó 2 mẫu QS và QO có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,94. Hệ số tương đồng của QN với 2 mẫu quýt này là 0,80. + Cụm 1a-2 bao gồm 5 mẫu (C36,CS,V2,V2-1,CP,NA). Trong đó 2 mẫu (V2,V2- 1) có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 1,00 chính tỏ 2 mẫu cam này là một. Mẫu cam C36 và CS có hệ số tương đồng di truyền là 0,93. Mẫu cam CP,NA có hệ số tương đồng di truyền là 0,88. Cụm 1b gồm cụm 1b-1 và cụm 1b-2, trong đó: + Cụm 1b-1 gồm 9 mẫu cam (cam sành Hàm Yên So ) có hệ số tương đồng di truyền với cụm 1b-2 (cam sành Hàm Yên So ) là 0,79. Cụm 2 gồm 2 mẫu (BH,Cr) hệ số tương đồng di truyền của 2 mẫu này là 0,85. Đây là mẫu cam không hạt. Mẫu cam BH cũng là mẫu cam chín sớm và có hệ số tương đồng di truyền với mẫu cam CS và C36 (CS và C36 là mẫu cam chín sớm) là 0,845. Nhóm phụ II: bao gồm 8 mẫu cam được chia tiếp thành 2 cụm (cụm 3 và cụm 4) có sự sai khác di truyền là 0,27 (hệ số tương đồng di truyền của 2 nhóm phụ là 0,73).
40 Cụm 3 bao gồm 7 mẫu là (A,B,C,CBH,CS1-1, CV,CC,C2). Trong đó, 2 mẫu cam (A,B) và 2 mẫu (CV, CC) có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,90. CS1-1 có hệ số tương đồng di truyền với mẫu cam A,B là 0,84. CBH có hệ số tương đồng di truyền với mẫu CV,CC là 0,83. Cụm 4 có 1 mẫu duy nhất là C2 ( cam chanh). Từ kết quả trên cho thấy cam chanh Bố Hạ với cam sành Hàm Yên-Tuyên Quang thuộc hai nhánh phát sinh chủng loài khác nhau, nhưng lại có quan hệ gần gũi với nhau ( hệ số tương đồng di truyền là 0,75). Điều đó chứng tỏ cam sành Hàm Yên và cam chanh Bố hạ có thể có quan hệ gần gũi. Cam Vinh và cam Chanh trồng tại Thái Nguyên và cam chanh Bố Hạ có hệ số tương đồng di truyền cao 0,83 ( tương ứng là 83%). Kết quả này cho thấy cam Vinh trồng tại Thái Nguyên có nguồn gốc xuất sứ gần nhau họăc là con lai của cam Bố Hạ với một loại cam khác.
41 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Đã tách chiết DNA tổng số từ các mẫu cam thu thập, dung dịch DNA tách chiết có chất lượng tốt, hàm lượng cao, đủ điều kiện thực hiện các nghiên cứu về sinh học phân tử. Đã so sánh cam Bố Hạ với các giống cam khác bằng việc sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên RAPD và 3 mồi ISSR. Kết quả đều cho thấy tính đa hình di truyền cao trong các mẫu phân tích Đã đánh giá hệ số di truyền và xây dựng cây phát sinh chủng loài của các mẫu cam phân tích. - Hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu cam dao động trong khoảng từ 0,64 – 1,00. Từ sơ đồ cây phân loại cho thấy 32 mẫu cam được chia thành 2 nhóm chính với hệ số sai khác về di truyền. Nhóm I: là mẫu đối chứng chấp (CH), mẫu này nằm riêng biệt so với các mẫu còn lại. Khoảng cách di truyền với nhóm II là 0,36. Nhóm II: gồm 31 mẫu. Trong nhóm này lại tiếp tục chia làm 2 nhóm phụ, bao gồm: Nhóm phụ I: bao gồm 14 mẫu cam, quýt được chia tiếp thành 2 cụm (cụm 1 và cụm 2). Có sự sai khác di truyền là 0,26 (hệ số tương đồng di truyền của 2 cụm là 0,74). Cụm 1 bao gồm cụm 1a và cụm 1b. Cụm 1a gồm 2 cụm là cụm 1a-1 và cụm 1a-2. Trong đó : + Cụm 1a-1 gồm 3 mẫu (QS,QO,QN), đây đều là các mẫu quýt. Trong đó 2 mẫu QS và QO có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,94. Hệ số tương đồng của QN với 2 mẫu quýt này là 0,80. + Cụm 1a-2 bao gồm 5 mẫu (C36,CS,V2,V2-1,CP,NA). Trong đó 2 mẫu (V2,V2- 1) có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 1,00 chính tỏ 2 mẫu cam này là một. Mẫu
42 cam C36 và CS có hệ số tương đồng di truyền là 0,93. Mẫu cam CP,NA có hệ số tương đồng di truyền là 0,88. Cụm 1b gồm cụm 1b-1 và cụm 1b-2, trong đó: + Cụm 1b-1 gồm 9 mẫu cam (cam sành Hàm Yên So ) có hệ số tương đồng di truyền với cụm 1b-2 (cam sành Hàm Yên So ) là 0,79. Cụm 2 gồm 2 mẫu (BH,Cr) hệ số tương đồng di truyền của 2 mẫu này là 0,85. Đây là mẫu cam không hạt. Nhóm phụ II: bao gồm 8 mẫu cam được chia tiếp thành 2 cụm (cụm 3 và cụm 4) có sự sai khác di truyền là 0,27 (hệ số tương đồng di truyền của 2 nhóm phụ là 0,73). Cụm 3 bao gồm 7 mẫu là (A,B,C,CS1-1,CBH,CV,CC,C2). Trong đó, 2 mẫu cam (A,B) và 2 mẫu (CV, CC) có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,90. CS1-1 có hệ số tương đồng di truyền với mẫu cam A,B là 0,84. CBH có hệ số tương đồng di truyền với mẫu CV,CC là 0,83. Cụm 4 có 1 mẫu duy nhất là C2 ( cam chanh). 5.2. Kiến nghị Tiếp tục kết hợp một số kỹ thuật phân tích quan hệ di truyền khác như SSR, RFLP, để xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống cam để nhằm đạt được kết quả tin cậy cao hơn. .
43 TÀI LIỆU THAM KHẢO I.Tiếng Việt 1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Nghiên cứu đa dạng di truyền của một số dòng trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) bằng kỹ thuật RAPD. 2. Nguyễn Minh Châu (2009), Giới thiệu các giống cây ăn quả phổ biến ở miền Nam, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 3. Đường Hồng Dật (2003), Cam, chanh, quýt, bưởi và kỹ thuật trồng, NXB Lao động -xã hội. 4. Bùi Huy Đáp (1960), Cây ăn quả nhiệt đới, 1, Nxb Nông thôn. 5. Vũ Văn Hiếu, Nông Thị Huệ, Nguyễn Thị Oanh, Ninh Thị Thảo, Vũ Quang Sáng, Nguyễn Thị Phương Thảo (2015), “Phân tích đa dạng di truyền của các mẫu giống cam sành tại Hà Giang bằng chỉ thị RAPD và ISSR”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 13(6), 867 – 875 6. Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Nhân Dũng, Đặng Thanh Sơn, Nguyễn Văn Được (2004), “Đa dạng sinh học của giống cây có múi ở huyện Gò Quao, tỉnh Kiên Giang”, TC Khoa học - Trường Đại học Cần Thơ, 1, 111 – 121 7. Nguyễn Đức Thành (2014), “Các kĩ thuật chỉ thị DNA trong nghiên cứu và chọn lọc thực vật”, Tạp chí sinh học, 36(3), 265 - 294. 8. Vũ Huyền Trang, Hoàng Đăng Hiếu, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà (2014), “Đánh giá đa dạng quần thể dó bầu (Aquilaria crassna Pierre) tại Việt Nam bằng chỉ thị phân tử ISSR”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 30(4), 58 – 65 9. Hoàng Ngọc Thuận (2004), Kỹ thuật chọn tạo và trồng cây cam quýt, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 10. Trần Thế Tục (1967), Điều tra cây ăn quả, NXB Nông thôn. 11. Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam, Đánh giá đa dạng di truyền quần thể cá Đối Mục (Mugil Cephalus L.) ở Việt Nam bằng chỉ thị SSR 12. .
44 II. Tiếng Anh 13. continuing-to-expand/. 14. 15. Asadi Abkenar, and Isshiki S (2003), Molecular characterization and genetic diversity among Japanese acid citrus (Citrus spp.) based on RAPD markers, The Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 78(1), 108-112. 16. Beedanagari SR, Dove SK, Wood BW, and Conner PJ (2005), “A first link- age map of pecan cultivars based on RAPD and AFLP markers”, Theor. Apll. Genet, 110(6), 1127 – 1137. 17. Cheeng H. Y., Yang W. C., Hsiao J. Y. (2001), “Genetic diversity and rela- tionship among peach cultivars based on random amplified microsatellite polymorphism (RAMP)”, Bot. Bull. Acad. Sin., 42, 201 - 206. 18. Constantinos Tripolitsiotis, Nikoloas Nikoloudkis, Arthanasios Linos, Mari- anna Hagidimmitriou (2013), “Molecular Characterization and Analysis of the Greek Citrus Germplasm”, Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj - Napoca, 41(2), 463 - 471. 19. Davies, and F S (1986), The navel orange Rep., J. Janick (ed.). AVI Press, Westport, Conn., In: Hort Reviews. 20. Dehesdtani A, Kazemitabar S K, and Rahimian H (2007), Assessment of Genetic Diversity of Navel Sweet Orange Cultivars Grown in Mazandaran Province Using RAPD Markers, Asian Journal of Plant Sciences, 6(7), 1119 – 1124. 21. De Pasquale F, Siragusa M, Abbate L, Tusa N, De Pasquale C, Alonzo G (2006), “Characterization of five sour orange clones through molecular mark- ers and leaf essential oils analysis”, Scientia Horticulturae, 109, 54 - 59.) 22. Dehesdtani A, Kazemitabar SK, Rahimian H (2007), “Assessment of genetic diversity of navel sweet orange cultivars grown in Mazandaran province us- ing RAPD markers”, Asian Journal of Plant Sciences, 6(7), 1119 – 1124 23. De Pasquale F, Siracuga M, Abbate L, Tusa N, De Pasquale C, and Alonzo G (2006), Characterization of five sour orange clones through molecular mark-
45 ers and leaf essential oils analysis, Scisentia Horticulturae, 109(1), 54 - 59. 36. De Pasquale F, Siragusa M, Abbate L, Tusa N, De Pasquale C, Alonzo G (2006), “Characterization of five sour orange clones through molecular mark- ers and leaf essential oils analysis”, Scientia Horticulturae, 109, 54 - 59.) 24. Ebtsam M Hamza (2013), “Genetic Diversity of Some Citrus Varieties Based on Microsatellite and RAPD Molecular Markers in Egypt”, World Journal of Agricultural Sciences, 9(4), 316 – 324. 25. Helvécio Della Coletta Filho, Marcos Antonio Machado, M. Luiza P.N. Tar- gon and Jorgino Pompeu Jr. (2000), “The use of random amplified polymor- phic DNA to evaluate the genetic variability of Ponkan Madarin (Citrus Re- ticulata Blanco) accessions”, Genetics and Molecular Biology, 23(1), 169 - 172. 26. Lamine M., A. Chebaane, A. Milki (2015), “Genetic diversity analysis in Tu- nisian Maltaise orange (Citrus sinensis L.)”, Journal of New Sciences, 14(2), ISSN, 2286 – 5314. 27. Lamyaa M. Sayed, M. F. Maklad (2015), “Molecular characterization and genetic diversity of some egyptian citrus cultivars using RAPD and ISSRs markers”, Egypt. J. Genet. Cytol., 44, 387 - 403. 28. Madhumathi C., Purushotham K., Chandhrasekhar R., Gopal K., Sekhar M.R., Shankar T.G. (2016), “Assessment of molecular diversity in Elite Sweet Orange (Citrus sinensis L. Osback) accessions using RAPD markers”, Electronic journal of Plant Breeding, 7(2), 332 - 340. 29. Martasari C., Karsinah and Reflinur (2012), “Characterization of Indone- sian‘Siam’ cultivar (Citrus nobilisLour.) by morphological and ISSR mark- ers”, ARPN Journal of Agricultural and Biological Science,7, 830 - 835. 30. Maya M.A., M.G. Rabbani, M.G. Mahboob and Y. Matsubara (2012), “Assessment of Genetic Relationship among 15 Citrus Fruits Using RAPD”, Asian Journal of Biotechnology, 4(1), 30 - 37. 31. Mirko Siragusa, Fabio De Pasquale, Loredana Abbate, and Nicasio (2006), “Identification of Sour Orange Accessions and Evaluation of Their Genetic Variability by Molecular Marker Analyses”, HortScience, 41(1), 84 - 89.
46 32. Nagai, and Tanigawa K O (1928), On Citrus pollination, Procthird, Pan - pacific.Sci.Cong.2(2023 - 2029) 33. Naz S, Shahzadi K, Rashid S, Saleem F, Zafarullah A, and Shabbir Ahmad (2014), Molecular characterization and phylogentic relationship of different Citrus varieties of Pakistan, The Journal of Animal & Plant Sciences, 24(1), 315 – 320. 34. Oliveira E.C., Amaral Júnior A.T., Gonçalves L.S.A., Pena G.F., Freitas Júnior S.P., Ribeiro R.M., Pereira M.G. (2010), “Optimizing the efficiency of the touchdown technique for detecting inter-simple sequence repeat markers in corn (Zea mays)”, Genetic and Molecular Research, 9(2), 835 - 842. 35. Sanchez de la Hoz M. P., Davila J. P., Loarce Y., Ferrer E.( 1996), “Simple sequence repeat primers used in polymerase chain reaction amplifications to study genetic diversity in barley”, Genome, 39, 112 – 117. 36. . Shahzadi K., S.Naz và Ilyas (2016), “Genetic diversity of Citrus germplasm in Pakistan based on Random Amplyfied Polymorphic DNA (RAPD) mark- ers”, The Journal of Animal & Plant Sciences, 26(4), 1094 - 1100. 37. Wu K. S., Jones R., Danneberger L., Scolnik P. (1994), “Detection of mi- crosatellite polymorphism without cloning.”, Nucleic Acids Res., 22, 3257 - 3258.
47 PHỤ LỤC I S2- S3- S14- S12- S13- S1- S20- S4- S9- S17- S19- CS1- MẪU QS CV V2 CBH CH A B D HG Cr C36 QO B1 QN CP NA CN CS C2 CC 1 1 2 2 4 5 3 4 2 2 3 1 1500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mồi 1000 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 T1 760 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 750 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 500 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1300 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mồi 750 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 T2 700 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 500 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 300 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1700 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1500 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 Mồi T3 1300 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 750 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 650 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 450 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 300 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1000 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 900 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 800 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 OPT- 750 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 01 700 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 650 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 550 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 400 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 250 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1600 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1000 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 OPM- 800 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 13 750 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 700 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 650 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 550 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
48 450 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 400 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 300 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 250 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 2000 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1500 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1300 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1000 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 OPG- 900 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 17 750 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 700 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 650 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 500 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 450 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 250 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1300 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1000 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 800 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 750 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 OPA- 08 700 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 600 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 500 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 450 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 300 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 250 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1300 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1000 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 750 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 OPQ- 700 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 18 600 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 500 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 400 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 300 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 250 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 2500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 OPB- 18 2200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1800 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1500 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1
49 1200 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1000 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 750 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 700 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 600 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 500 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 450 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 300 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 250 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2000 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1500 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1300 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1000 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 800 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 750 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 OPA- 04 700 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 600 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 550 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 500 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 400 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 300 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 250 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 2000 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1500 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1300 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1000 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 OPC- 800 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 08 750 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 700 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 650 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 550 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 400 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 250 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3000 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1500 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1300 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 OPO- 1000 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 04 800 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 750 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 700 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 650 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
50 550 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 500 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 450 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 300 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1550 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1000 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 900 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 750 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 OPG- 16 650 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 550 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 500 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 450 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 400 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 300 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 250 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ký hiệu: số 1: xuất hiện băng vạch Số 0: không xuất hiện băng vạch